KR20100101465A

KR20100101465A - 퇴행성신경질환 진단용 마커

Info

Publication number: KR20100101465A
Application number: KR1020090019968A
Authority: KR
Inventors: 석경호; 조제열; 이호원
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2009-03-09
Filing date: 2009-03-09
Publication date: 2010-09-17

Abstract

본 발명은 퇴행성신경질환의 진단에 사용될 수 있는 바이오마커에 관한 것으로, 구체적으로, 퇴행성신경질환에서 과발현되는 마커 유전자인 NCAM-120(120kDa isoform precursor of neural cell adhesion molecule 1), α-디스트로글리칸(α-dystroglycan), NPR(neuronal pentraxin receptor)의 발현량을 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정하는 제제를 포함하는 퇴행성신경질환 진단용 조성물 및 이를 이용하여 퇴행성신경질환을 진단하는 방법에 관한 것이다.

퇴행성신경질환, 알츠하이머병, 파킨슨병, NCAM-120, α-디스트로글리칸, NPR

Description

퇴행성신경질환 진단용 마커{Biomarkers for Diagnosis of Neurodegenerative Diseases}

본 발명은 퇴행성신경질환의 진단에 사용될 수 있는 바이오마커에 관한 것으로, 구체적으로, 퇴행성신경질환에서 과발현되는 마커 유전자인 NCAM-120, α-디스트로글리칸, NPR의 발현량을 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정하는 제제를 포함하는 퇴행성신경질환 진단용 조성물 및 이를 이용하여 퇴행성신경질환을 진단하는 방법에 관한 것이다.

알츠하이머병(Alzheimer's disease; AD) 및 파킨슨병(Parkinson's disease; PD)과 같은 퇴행성신경 질환은 일차적으로 임상소견에 의해 진단되고, 제한된 실험실에서의 분석과 기능적 신경영상화(neuroimaging) 분석에 의해 뒷받침된다. AD는 가장 대표적인 신경퇴행성 질환으로, 세포내 신경섬유매듭(neurofibrillary tangle), 세포외 노인성 반점(senile plaque)과 시냅스 결실을 특징으로 한다. AD 환자의 수는 2001년 약 2천4백만 명에서 2040년 약 8천1백만 명으로 급격하게 증가할 것으로 예상되었다(Ferri et al. 2005, Lancet 366(9503), 2112-2117). PD는 가장 일반적인 연령과 관련된 운동 장애이고 두 번째로 가장 연령과 관련된 퇴행성신경 질환으로, 흑색질내 도파민성 신경의 느린 퇴행 및 세포질내 루이체(Lewy body) 함입 구조물의 형성을 나타낸다.

현재까지 AD 또는 PD에 대해 신뢰할 수 있는 진단 검사는 없다. 환자의 임상 증상이 일상생활에 영향을 미칠 때에는, 이미 신경세포가 비가역적으로 손상되어 있어 질환의 개선이 불가피하다. 따라서, AD 및 PD의 진단과 의학적 관리를 보조할 수 있는 바이오마커가 요구된다. 종래 바이오마커의 발굴에 있어 강력하게 추적된 두 영역은 신경영상화와 CSF, 혈장 및 소변과 같은 생체 플루이드에서의 생화학적 마커이다. CSF는 뇌의 세포외 공간과 직접 접촉하기 때문에 환자 뇌의 생화학적 변화는 CSF에 잘 반영된다. 따라서, CSF에서의 단백질 분석은 진단학적으로 중요하다. 퇴행성신경질환과 관련된 몇 개의 바이오마커가 동정되었고, AD의 경우에는 APP(amyloid precursor protein), 카텝신 B 전구체(cathepsin B presursor) 및 β-피브리노겐과 비타민 D-결합 단백질(Vitamin D-binding protein) 또는 세룰로플라스민(ceruloplasmin) 등이 있고, PD의 경우에는 크로모그라닌 B(chromogranin B)와 세룰로플라스민(ceruloplasmin) 또는 아포리포프로테인 H 등이 있다. 최근, 혈장의 신호전달 단백질이 AD와 대조군을 구분하는데 이용되었다(Ray et al. 2007, Nat. Med. 13(11), 1359-1362). 그러나, 이렇게 동정된 마커는 단독 또는 조합으로도 민감도 및 특이성이 통상의 임상적 용도를 만족하기에는 불충분하였다(Knopman et al. 2001, Neurology 56(9), 1143-1153). 따라서, 임상적으로 유용한 신규 바이오마커의 발굴이 절실한 실정이다.

본 발명자는 정상인과 퇴행성신경질환 환자에서 얻은 CSF(cerebrospinal fluid) 단백질을 프로테옴 분석한 결과, NCAM-120, α-디스트로글리칸, NPR이 정상인에 비해 퇴행성신경질환 환자에서 유의적으로 과발현되어 상기 유전자들이 퇴행성신경질환 진단에 이용 가능함을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 한 목적은 NCAM-120, α-디스트로글리칸 또는 NPR의 발현량을 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정하는 제제를 포함하는 퇴행성신경질환 진단용 조성물은 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 생물학적 시료의 NCAM-120, α-디스트로글리칸 또는 NPR의 발현 수준을 측정하여 퇴행성신경질환을 진단하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명에서는, 퇴행성신경질환 환자에서 얻은 생물학적 시료에서 정상인에 비해 특이적으로 과발현되는 단백질들을 스크리닝하여, NCAM-120, α-디스트로글리칸, NPR를 퇴행성신경질환 진단 마커로 확보하였다.

구체적으로, 본 발명에서는 정상인, 알츠하이머병(Alzheimer's Disease, AD) 또는 파킨슨병(Parkinson's Disease, PD) 환자에서 얻은 CSF(cerebrospinal fluid) 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고 인-겔 트립신 소화한 후 LC-MS/MS 분석을 수행하였다. 분석 결과, NCAM-120(120kDa isoform precursor of neural cell adhesion molecule 1), α-디스트로글리칸(α-dystroglycan), NPR(neuronal pentraxin receptor)이 정상인에 비해 AD 또는 PD 환자에서 유의적으로 과발현됨을 확인하였다(실시예 2-1).

또한, 정상인, AD 또는 PD 환자에서 얻은 CSF 단백질을 2차원 전기영동으로 분석하고, LC-MS/MS 분석을 통해 정상인과 AD 환자 간에 발현 수준이 상이한 단백질을 동정하였다. NPR이 정상인에 비해 AD 환자에서 유의적으로 과발현됨을 확인하였다(실시예 2-2).

아울러, 정상인, AD 또는 PD 환자에서 얻은 CSF에서 NCAM-120, α-디스트로글리칸, NPR의 단백질 수준을 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 상기 단백질들을 분석 대상으로 선별한 이유는 상기 단백질이 반복된 실험에서 일관된 결과를 보여주었기 때문이다. 예상된 바와 같이, NCAM-120, α-디스트로글리칸, NPR은 AD 또는 PD 환자에서 정상인에 비해 유의적으로 과발현되었다. 그런데, NPR은, AD 환자에서는 정상인에 비해 과발현되었지만, PD 환자에서는 정상인과 차이가 없었다. 이로써, NPR는 AD만을 특이적으로 진단하는데 이용 가능함을 유추할 수 있다(실시예 2-3).

추가로, 정상인, AD 또는 MCI(mild cognitive impairment) 환자에서 얻은 혈청(blood serum)에서 NPR의 단백질 수준을 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 그 결과, NPR이 정상인에 비해 AD 및 MCI 환자에서 유의적으로 과발현되었고, AD와 MCI 환자에서 NPR의 혈중 농도가 상이하므로 이 상이함을 기초로 AD와 MCI를 구분할 수도 있었다(실시예 2-3).

따라서, 본 발명은 NCAM-120, α-디스트로글리칸 또는 NPR을 퇴행성신경질환의 바이오마커로서 제공한다. 특히, NPR은 알츠하이머의 바이오마커로서 제공한다.

용어, "퇴행성신경질환"에는 알츠하이머병, 파킨슨병, 루게릭병(Lou Gehrig's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), MCI(mild cognitive disorder), 노인성 치매 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

용어, "퇴행성신경질환의 바이오마커" 또는 "퇴행성신경질환의 마커"란 정상 세포에 비하여 퇴행성신경질환을 가진 세포, 조직 등에서 증가 또는 감소를 보여 퇴행성신경질환을 진단할 수 있는, 유기 생체 분자 물질을 의미하며, 본 발명에서는 NCAM-120, α-디스트로글리칸 또는 NPR의 발현을 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 확인함으로써, 퇴행성신경질환을 진단할 수 있다. 본 발명의 진단에 사용되는 유전자의 종류와 수는 제한되지 않으며, 목적에 맞게 1 이상의 유전자를 적합하게 선택할 수 있다.

하나의 양태로서, 본 발명은 NCAM-120, α-디스트로글리칸 또는 NPR의 mRNA 수준을 측정하는 제제를 포함하는 퇴행성신경질환 진단용 조성물에 관한 것이다.

상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 프라이머 쌍 또는 프로브이다.

구체적으로, 프라이머는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다.

본 발명의 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지는, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제 등과 같은 효소, 33P 등과 같은 방사성 동위원소, 바이오틴 등과 같은 화학그룹 및 형광성 분자를 예로 들 수 있다.

프로브는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있으며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미한다. 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.

당업자는, 공지된 유전자의 핵산 서열로부터, 표적 유전자내 서열간의 혼성화 정도 등의 변수를 고려하여 상기 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 쌍 또는 상기 유전자의 특정 영역을 특이적으로 인지하는 프로브를 디자인할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 NCAM-120, α-디스트로글리칸 또는 NPR의 단백 질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 퇴행성신경질환 진단용 조성물에 관한 것이다.

유전자의 단백질 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 항체로, NCAM-120, α-디스트로글리칸 또는 NPR 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태 및 항체 분자의 기능적인 단편, 예를 들어, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv을 포함한다.

본 발명의 퇴행성신경질환 진단용 조성물은 당분야에서 널리 사용되는 다른 구성 성분 또는 장치를 추가로 포함하여 퇴행성신경질환 진단용 키트로 응용, 제작될 수 있다.

구체적인 예로서, 상기 유전자에 대한 특이적인 프라이머 쌍 및, 추가적으로 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse 억제제, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함하여 RT-PCR용 키트로 제작될 수 있다. 또 다른 예로서, DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 DNA 칩용 키트로 제작될 수 있다.

또 다른 예로서, 상기 유전자의 단백질에 대한 특이적인 항체 및, 추가적으로, 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소 및 그의 기질을 포함하는 ELISA용의 키트로 제작될 수 있다. 또 다른 예로서, 단백질 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 단백질 칩용 키트로 제작될 수 있다.

상기 예시한 키트 외에도, 상기 유전자를 검출할 수 있는 래피드 진단 키트로 제작되는 여러 형태의 진단 키트를 포함한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 생물학적 시료의 NCAM-120, α-디스트로글리칸 또는 NPR의 발현 수준을 측정하여 퇴행성신경질환을 진단하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로는, 유전자의 발현량을 mRNA 또는 단백질 수준에서 검출할 수 있다.

구체적인 양태로서, 본 발명은 NCAM-120, α-디스트로글리칸 또는 NPR에 특이적인 프라이머 쌍 또는 프로브를 사용하여 퇴행성신경질환 의심 환자의 생물학적 시료로부터 상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 퇴행성신경질환 진단방법에 관한 것이다.

상기 방법으로 mRNA 수준을 측정하기 위한 구체적 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법, 노던블랏팅, DNA 칩 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

또 다른 구체적인 양태로서, 본 발명은 NCAM-120, α-디스트로글리칸 또는 NPR의 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 퇴행성신경질환 의심환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성하는 방법으로 단백질 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 퇴행성신경질환 진단방법에 관한 것이다.

상기 방법으로 단백질 수준을 측정하기 위한 구체적 분석 방법으로는, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등의 다양한 ELISA 방법을 포함한다.

진단에 사용되는 생물학적 시료는 특별히 제한되지 않으며, 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액(CSF), 뇨와 같은 시료 등을 포함할 수 있다. 본 발명에서는 뇌척수액 또는 혈청을 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 퇴행성신경질환에 걸리지 않은 시료를 대조군으로 사용하여 시료내의 퇴행성신경질환 의심 환자의 생물학적 시료에서의 유전자 발현량과 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 이는 대조군과 생물학적 시료 간의 발현량의 차이는 절대적 또는 상대적 차이로 비교될 수 있다.

상기 예시한 검출 방법들을 통하여, 퇴행성신경질환 마커 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 정량적으로 분석 가능하고, 이를 통하여 퇴행성신경질환 의심 환자의 퇴행성신경질환 여부를 진단할 수 있다.

본 발명에 의하면, 퇴행성신경질환에서 특이적으로 과발현되는 NCAM-120, α-디스트로글리칸, NPR 유전자의 발현을 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정함으로써 퇴행성신경질환을 간편하고 효과적으로 진단할 수 있다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1>

1-1. 뇌척수액(CSF) 및 혈청 시료

CSF와 혈청 시료는 경북대학교 병원(KNUH)의 신경학과로부터 입수하였다. 총 17개의 CSF 시료를 입수하여 프로테오믹 분석에 이용하였다: 5명의 AD 환자는 71±12(mean±SD)세이었고, 6명의 PD 환자는 66.2±7.7세이었으며, 6명의 정상인은 55.3±12.9세이었다. CSF를 수득하기 위해 L4-L5 척추 사이에서 요추 천자를 시행하였다. 15~20ml의 CSF를 멸균된 스크류 탑(screw top), 리크프루프(leakproof) 시험관에 수집하였다. CSF 시료를 2000g에서 10분 동안 원심분리하여 세포와 불용성 물질들을 제거하였다. 모든 CSF 시료를 육안으로 관찰하여 혈액 오염물이 제거되었는지 확인하였다.

혈청 시료는 웨스턴 블롯 분석에 이용하기 위해 수집하였다. 3명의 정상인 은 62±11.8세이었고, 6명의 MCI(mild cognitive impairment) 환자는 67.7±5.7세이었으며, 7명의 AD 환자는 68.3±2.5세이었다. CSF 및 혈청 시료의 이용은 KNUH 윤리 위원회의 승인을 받았다. AD는 NINCDS-ADRDA(National Institute of Neurologic and Communicative Disorders and Stroke - AD and Related Disorder Association)를 기초로 표준 임상 기준에 따라 진단되었다. PD는 NINDS(National Institute of Neurological Disorders and Stroke) 진단 기준을 기초로 진단하였다(Gelb et al. 1999, Arch Neurol. 56(1), 33-39). 혈액은 뽑아서 실온에 40-50분간 두어 응고되도록 하였다. 그 다음 시료를 3000rpm으로 10분 동안 원심분리하여 잔류하는 응괴/적혈구 및 불용성 물질을 제거하였다. CSF와 혈청 시료는 1ml씩 나누어 사용시까지 -70℃에서 보관하였다.

1-2. 시료 준비

CSF 시료를 -20℃에서 하룻밤동안 TCA(trichloroacetic acid)와 아세톤의 혼합물(아세톤에 녹인 10% TCA 및 10mM DTT)로 침전시켰다. 이렇게 얻은 단백질 침전물을 아세톤에 녹인 20mM DTT로 2회 세척하고 30㎕의 용해 완충액(7M urea, 2M thiourea, 4% CHAPS, 10㎕의 protease inhibitor mix 및 40mM DTT)에서 용해하였다. 단백질의 농도는 Bio-Rad 단백질 측정 키트로 결정하였다. 동량의 3개의 CSF 시료(각각 20㎍)를 초기 LC-MS/MS 및 2-DE 분석에 사용하였다. 추가 분석을 위해 혈청 시료는 용해 완충액으로 희석하였다(1:50).

1-3. 1차원 겔 전기영동(1-DE) 및 쿠사미 염색

1-DE 및 쿠사미 염색은 공지된 바에 따라 수행하였다(Kim et al. 2007, J. Neurochem 103(6), 2640-2650). 즉, CSF 단백질을 환원 SDS 시료 완충액(63mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 10% glycerol, 0.005% bromophenol blue 및 1:20(v/v) β-mercaptoethanol)에 넣고 3분간 끓여주고 10% 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동에 의해 분리하였다. 전기영동 후 쿠사미 브릴리언트 G-250 염색 용액으로 염색하여 단백질을 시각화하였다. 그리고 겔 트립신 소화를 위해 전체 겔 레인을 동일한 크기의 10-15 슬라이스로 잘라내었다.

1-4. 인 겔 트립신 소화

절단된 겔 슬라이스를 0.1M 암모늄 비카르보네이트 및 0.1M 암모늄 비카르보네이트에 녹인 50%(v/v) 아세토니트릴로 세척하여 잔류 SDS와 쿠사미 블루 염료를 완전히 제거하였다. 탈염색된 겔 슬라이스는 아세토니트릴에서 탈수시켜 수축시키고 진공 원심분리기에서 건조시켰다. 수축된 겔 슬라이스내 단백질을 25mM 암모늄 비카르보네이트(pH 8.0)에 녹인 트립신으로 10:1(wt/wt)의 기질/효소의 비율로 처리하여 하룻밤 동안 소화시켰다. 물에 녹인 0.1% 포름산을 첨가하여 효소 반응을 중지시켰다. 겔 슬라이스로부터 펩타이드는 10분간 소니케이션(sonication)으로 추출하였고, 펩타이드를 함유한 상등액을 새로운 시험관에 옮겨놓았다.

1-5. LC-MS/MS(Liquid chromatography and tandem mass spectrometry) 분석

역상 액체 크로마토그래피(reversed phase-liquid chromatography, RP-LC)가 장착된 LC-MS/MS 시스템이 프로테옴 분석에 이용되었다. 상기 시스템은 서베이어 MS 펌프(Surveyor MS pump, Thermo Electron, San Jose, CA), 스파크 자동 샘플러(Spark auto-sampler, EMMEN, The Netherlands) 및 나노스프레이 이온화(nanospray ionization; NSI) 소스가 장착된 핀니간 LTQ 리니어 이온 트랩 질량 스펙트로미터(Finnigan LTQ linear ion trap mass spectrometer, Thermo Electron, San Jose, CA)로 구성되어 있다. 0.1% 포름산 12㎕에 녹인 트립신으로 소화된 펩타이드를 LC-MS/MS 분석을 위해 주입하였다. 우선 펩타이드 농축 및 탈염을 위해 소화된 시료를 펩타이드 캡트랩 카트리지(CapTrap cartirige)에 주입하고, 상기 펩타이드를 역상(reverse phase; RP) 컬럼 상에서 소수성에 따라 분리하기 위해, 5㎛, 직경 300Å의 C18 실리카겔이 하우스 안에 충진되어 있는 RP 컬럼에 로딩하였다(Vawter et al. 1998. Exp. Neurol. 149(2), 424-432). 상기 RP 컬럼은 전자분사(electrospray)용 이온 트랜스퍼 튜브 바로 정면에 설치하였다. 이동상으로는 용액 A(H₂O)와 B(아세토니트릴, ACN)를 각각 사용하였으며, 상기 두 용액은 모두 0.1%(v/v) 포름산을 함유하였다. 유속은 200nL/min으로 유지하였다. 용매 그래디언트는 43분 내에 5% B 용액으로 시작하여 65% B 용액까지 리니어 그래디언트를 수행한 다음 7분간 80% B 용액으로 끌어올린 후 그 다음 10분간 100% A 용액을 사용하였다. 질량 스펙트로미터는 각각의 전체 MS 스캔 후 5개의 MS/MS 스캔이 이루어지는 데이터-의존 모드(m/z 300-1800)로 작동시켰다. 상기 모드에서는 5개의 가장 많은 펩타이드 분자 이온이 35%의 표준화된 충돌 에너지를 이용한 충돌-유도 분리(collision-induced dissociation; CID)를 위한 이전의 스캔으로부터 선별된다. 가열된 모세관의 온도 및 전자분사 전압은 각각 195℃ 및 2.0kV였다.

1-6. 생물정보 분석

모든 MS/MS 데이터를 바이오워크스 소프트웨어(버전 3.2)가 포함된 SEQUEST 알고리즘(Thermo Electron, San Jose, CA)을 이용하여 IPI 인간 단백질 데이터베이스(버전 3.16)에서 검색하였다. 상기 데이터베이스 검색은 시스테인 잔기(57Da) 상의 카르복시아미도메틸레이션(carboxyamidomethylation) 및 메티오닌 잔기(16Da)상의 옥시데이션(oxidation)의 다양한 수식과 펩타이드 질량 오차 2Da 및 단편 질량 오차 1Da를 허용한다. 상기 데이터베이스 검색은 트립신 절단에 의해 생성되는 펩타이드에 한정된다. 상기 SEQUEST 결과를 전하 단계에 대한 Xcorr에 의해 필터링하였다. Xcorr값은 단독으로 이온화된 이온의 경우 1.9, 이중으로 이온화된 이온의 경우 2.2 및 3중으로 이온화된 이온의 경우 3.75와 일치되도록 사용하였다. 델타 Cn ≥ 0.1 및 Rsp ≤ 4 및 확률 점수(Probability score) ≥ 1.0E-3으로 셋팅하였다. 단백질 동정은 해당 펩타이드 동정에 기초한다. 본 실시예에서는 둘 이상의 펩타이드에 의해 동정된 단백질을 양성 동정으로 간주하였다. 단백질 동정 후 각 데이터세트에 대하여 인하우스 분석 프로그램인 ProtAn을 이용하여 공지의 감산 프로테오믹 분석(Oh et al. 2004, Nature 429(6992), 629-635; Dieguez-Acuna et al. 2005, Mol. Cell. Proteomics 4(10), 1459-1470)을 약간 변형하여 수행하였 다.

1-7. 2차원 전기영동(2-DE) 및 단백질 동정

2-DE 분석은 공지된 방법에 따라 수행하였다(Son et al. 2005, Biochem. Pharmacol. 70(4), 590-597). 즉, IEF(isoelectric focusing)를 공지 방법(West et al. 2001, Exp. Eye Res. 73(4), 479-491)을 약간 변형하여 20℃에서 IPGphor/IsoDalt 시스템 (Amershan Biosciences)을 이용하여 실시하였다. IPG 겔 스트립 (Amershan Biosciences)을 60㎍의 단백질을 함유하는 팽윤 용액(7M urea, 2M thiourea, 2% CHAPS, 100mM DTT, 0.5% IPG 완충액 및 bromophenol blue)에서 12시간 동안 20℃에서 재수화하였다. IEF는 200V에서 1시간, 500V에서 1시간, 1000V에서 1시간, 1000V에서 1시간, 8000V에서 30분간, 45000Vh로 진행하였다. 그 후, IPG 스트립을 15 분간 평형 완충액 1(50mM Tris-HCl (pH 8.8), 6M urea, 30% 글리세롤, 2% SDS, 10mg/ml DTT 및 브로모페놀 블루)에서, 그리고 15분간 평행 완충액 2(50mM Tris-HCl (pH 8.8), 6M urea, 30% 글리세롤, 2% SDS, 2% 이오도아세토아미드 및 브로모페놀 블루)에서 평형시켰다. 두 번째 전기영동을 위해 1.5mm의 수직 슬랩 겔(12% SDS PAGE)을 준비한 후 평형시킨 IPG 겔 스트립을 0.5% 아가로스 용액으로 충진된 겔에 위치시켰다. 겔 전기영동을 16℃에서 5mA/cm로 1시간 동안, 그리고 10mA/cm로 브로모페놀 블루가 겔의 바닥에 도달할 때까지 수행하였다. 겔을 50% 메탄올과 12% 아세트산에서 1.5시간 동안 고정하였다. 단백질을 공지된 바(Shevchenko et al. 1996, Anal. Chem. 68(5), 850-858)에 따라 은 염색으로 검 출하였다. 단백질은 전술된 바와 같이 LC-MS/MS로 동정하였다.

1-8. 2-DE 겔 이미지 분석

스캔된 2-DE 겔 이미지는 Melanie 소프트웨어 패키지 v6.0(GeneBio, Geneva, Switzerland)을 이용하여 표준 프로토콜로 분석하였다. 9개의 이미지를 3개의 그룹(대조군, AD 군 및 PD 군)으로 나누어 스팟의 검출과 매칭을 위해 Melanie v6.0에 도입하였다. 자동으로 검출된 스팟은 기계적 결함을 제거하기 위해 수동으로 편집하였다. 일관되게, 각 그룹(대조군, AD 및 PD)별로 3개의 겔에 존재하는 스팟을 조합하여 합성 겔을 제작하였다. 그 다음, 3개의 겔 각각으로부터 유래된 스팟을 합성 겔의 스팟에 매칭하였다. 소프트웨어에 의해 검출된 매칭은 명백히 잘못되거나 잘못된 매칭을 교정하기 위해 수동으로 편집하였다. 각 겔에서 각각의 매칭된 2-DE 스팟의 통합된 광학 밀도(% 부피)는 스프레드시트 파일로 출력되었다. 스팟이 겔에서 검출되지 않았다면, 후속된 통계 분석(Finehout et al. 2007, Ann. Neurol. 61(2), 120-129)에서 제로 백분율 부피를 부여하였다.

1-9. 웨스턴 블롯 분석

CSF 또는 혈청의 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 측정 키트를 이용하여 분석하였다. 각 시료 유래 동량의 단백질을 10% SDS-PAGE에 의해 분리하고 Hybond ECL 니트로셀룰로오스 멤브레인(Amersham Biosciences)으로 전이시켰다. 상기 멤브레인을 5% 스킴 밀크로 블로킹한 후 일차 항체[염소 항-사람 NPR(Santa Cruz Biotech; Santa Cruz, CA), 마우스 항-사람 NCAM-120 (Santa Cruz Biotech), 마우스 항-사람 α-디스트로글리칸(Millipore; Billerica, MA), 마우스 항-사람 세룰로플라즈민(Abcam; Cambridge, UK) 및 마우스 단클론 항-α-투불린(Sigma Chemical Co; St Louis, MO)]와 HRP가 접합된 이차 항체(항-염소, -마우스 IgG; Amersham Biosciences)로 정치 배양한 후 발광성 이미지 분석기(LAS-1000; Fujifilm, Tokyo, Japan)를 이용하여 ECL 검출(Amersham Biosciences)을 수행하였다.

1-10. 세포 배양

사람 U87MG 신경교종 세포주를, 10% FBS, 페니실린-스트렙토마이신(100U/ml, Gibco, Gaithersburg, MD)으로 보충된 DMEM에서 성장 및 유지시켰다. U87MG 세포 (1 x 10⁶/ml)를 100mm 배양 접시에 접종하고 LPS(lipopolysacchride) 또는 IFN(interferon)으로 자극하고 NPR 단백질을 분석하였다. LPS는 Sigma Chemical Co로부터 입수하였다. 재조합 마우스 IFN-γ는 R&D Systems(Minneapolis, MN)로부터 구입하였다. 달리 언급하지 않는 한, 다른 모든 시약은 Sigma로부터 입수하였다.

<실시예 2>

2-1. CSF의 LC-MS/MS 분석

종래에는 CSF에서 바이오마커를 동정하기 위해 LC-MS/MS와 2-DE 분석을 개별적으로 이용하였다. 본 발명에서는 각 방법의 장점을 활용하기 위해 LC-MS/MS와 2-DE를 조합하였다. 정상인(n=3), AD 환자(n=3) 또는 PD 환자(n=3) 유래 총 CSF의 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고, 인-겔 소화시킨 후 LC-MS/MS 분석하였다. 상기 분석을 4회 반복하고, 4회의 실험에서 정상인과 환자간에 일관되게 상이한 수준을 보이는 단백질을 표 1과 표 2에 나열하였다. 모든 단백질은 적어도 2개의 펩타이드를 가지는 기준을 충족하는 것을 기초로 동정되었다. 알부민의 펩타이드 개수가 데이터 표준화에 이용되었다. 동정된 371개의 단백질 중에서 21 및 15개의 단백질이 대조군에 비하여 AD 및 PD의 CSF에서 각각 일관된 차이를 나타내었다. 콘탁틴-1의 이소형 1(isoform 1 of contactin-1), 콘탁틴-2(contactin-2), CNDP1(carnosine dipeptidase 1), NCAM-120(120kDa isoform precursor of neural cell adhesion molecule 1), α-디스트로글리칸(α-dystroglycan), SPARCL1(secreted protein acidic and rich in cysteine-like protein 1 precursor), CLSTN1(isoform 2 of calsyntenin 1) 및 NPR(neuronal pentraxin receptor)는 정상인에 비하여 AD 또는 PD의 CSF에서 유의적인 변화를 보였다. AD에서 높은 수준의 세룰로플라스민(ceruloplasmin)이 발현됨은 공지되어 있다(Loeffler et al. 1994, Alzheimer Dis. Assoc. Disord. 8(3), 190-197).

2-2. 2-DE에 의한 CSF의 분석

총 CSF는 2-DE로 다시 분석하였다. 2-DE 분리 후 스캔된 2-DE 겔 이미지는 Melanie v6.0 소프트웨어를 이용하여 정량적으로 분석하였다. 각 시료의 2-DE 분리는 3회 반복하였고 합성 이미지를 만들어 스팟 강도를 정량 분석하였다. 겔은 검증된 스팟의 총 강도에 따라 표준화되었다 : 멤버 겔(member gel)에 있는 각 스팟의 가공하지 않은 강도를 합성 겔에 포함된 겔에 있는 모든 스팟의 총 강도로 나누었다(Hansson et al. 2004, Proteome Sci. 2(1), 7). LC-MS/MS 분석을 수행하여 정상인과 환자간에 강도가 1.2배 이상 차이가 나는 단백질 스팟을 동정하였다(도 1a). 일부 단백질은 번역후 수식을 반영하여, 다중 스팟으로 나타났다. 정상인에 비해 AD에서 많은 양의 단백질에는 NPR, 테트라넥틴 전구체(tetranectin precursor) 및 AZGP1(α-2-glycoprotein 1 zinc-binding) 등이 있다(표 3). PD에서 보다 많은 양의 단백질에는 SERPINA 12(serpin peptidase inhibitor clade A member 12), 세르핀 펩티다제 억제제(serpin peptidase inhibitor), SERPINA 9(clade A member 9 precursor), 타입 IV 콜라게나제 전구체(type IV collagenase precursor) 및 AZGP1 등이 있다(표 4). 트란스타이레틴 전구체(transthyretin precursor) 및 피브로넥틴 베타 쇄 전구체(fibronectin beta chain precursor)는 PD에서 보다 적은 양을 나타내었다. 이러한 단백질의 대부분은 표 1 및 2의 결과와 일치되는 양적 변화를 보여주었다. NCAM-120 및 α-디스트로글리칸과 같은 매우 높은 분자량의 단백질은 2-DE 분석에서 검출되지 않았다. NPR 스팟을 확대한 2-DE의 이미지를 도 1b에 나타내었다.

2-3. 웨스턴 블랏 분석에 의한 검증

CSF 단백질의 총체적 분석으로부터 수득한 결과를 검증하기 위해, 몇 개의 단백질을 선별하여 웨스턴 블랏 분석을 실시하였다. 정상인(n=4) 또는 환자(AD, n=4; PD, n=5)의 각 CSF를 SDS-PAGE로 분리하고 NCAM-120, α-디스트로글리칸, NPR 및 세룰로플라스민에 대해 프로브하였다. CSF에서 세룰로플라스민의 수준이 퇴행성신경질환에서 증가한다는 것이 알려져 있으므로 비교를 위해 세룰로플라스민의 검출을 수행하였다. 웨스턴 블랏에 의해 정상인에 비해 AD 환자에서 높은 양의 NDR, NCAM-120, α-디스트로글리칸 및 세룰로플라스민이 확인되었다(도 2 및 도 3). 특히, 중요한 것은 NDR을 제외하고, NCAM-120, α-디스트로글리칸 및 세룰로플라스민의 양은 PD의 CSF에서도 증가하였다는 것이다. 이는 CSF에서 NPR의 수준이 AD의 후보 바이오마커일 수 있다는 것을 의미한다(도 2 및 도 3). NPR의 양은 정상인과 PD 환자 간에 유의적인 차이를 보이지 않았다(도 2). 한편, CSF에서 NPR의 변화가 AD의 진행 동안 혈중 NPR 양과 연관이 있는지 여부를 조사하였다(도 4). 혈중 NPR의 수준은 정상인에 비하여 AD 또는 MCI(mild cognitive impairment) 환자에서 유의적으로 증가하였다. 이 결과는 NPR이 AD 환자의 CSF와 혈청 모두에서 증가하므로 특이적인 바이오마커가 될 수 있다는 것을 의미한다. 또한, AD와 MCI간 혈중 NPR 수준에서의 차이는 AD와 MCI를 구별하는데 이용될 수 있다는 것을 지지한다. NPR이 아교세포에서 발현되는지 여부를 조사하였다(도 5). U87MG 사람 아교세포주에서 NPR 단백질 발현 검출은 신경세포 뿐만 아니라 아교세포도 CSF와 혈청에 존재하는 NPR의 세포 소스(source)일 수 있다는 것을 의미한다. NPR 항체의 이용은 ~55kDa의 밴드를 검출하였고, 이는 CSF에 대한 웨스턴 블랏 분석 결과와 일치한다(Cho et al. 2008, Neuron, 57(6), 858-871). 아교세포주에서 단백질 수준은 LPS 또는 IFN-γ로의 자극에 의해 영향을 받지 않았다. α-투불린 검출을 수행하여 시료의 동등한 로딩과 표준화를 재확인하였다.

도 1a는 정상인 또는 AD 환자에서 얻은 CSF를 이용하여 제작된 2-DE 이미지를 나타낸 것이다.

도 1b는 상기 2-DE 이미지 중에서 NPR 스팟을 확대하여 나타낸 것이다.

도 2는 정상인, AD 또는 PD 환자로부터 유래된 CSF 중 NPR의 단백질 수준을 웨스턴 블랏으로 분석하여 나타낸 것이다.

도 3은 정상인, AD 또는 PD 환자로부터 유래된 CSF 중 NCAM-120, α-디스트로글리칸, 세룰로플라스민의 단백질 수준을 웨스턴 블랏으로 분석하여 나타낸 것이다.

도 4는 정상인, AD 또는 MCI 환자로부터 유래된 혈청 중 NPR의 단백질 수준을 웨스턴 블랏으로 분석하여 나타낸 것이다.

도 5는 LPS 및/또는 IFN-γ로 자극받은 아교세포에서 NPR의 단백질 수준을 웨스턴 블랏으로 분석하여 나타낸 것이다.

Claims

NCAM-120(120kDa isoform precursor of neural cell adhesion molecule 1), α-디스트로글리칸(α-dystroglycan) 또는 NPR(neuronal pentraxin receptor) 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 퇴행성신경질환 진단용 조성물.
제 1항에 있어서,

상기 퇴행성신경질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 루게릭병(Lou Gehrig's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), MCI(mild cognitive disorder) 및 노인성 치매로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서,

NPR 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 알츠하이머 진단용 조성물.
제 1항에 있어서,

mRNA 수준을 측정하는 제제가 NCAM-120, α-디스트로글리칸 또는 NPR 유전자에 특이적인 프라이머 쌍 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서,

단백질 수준을 측정하는 제제가 NCAM-120, α-디스트로글리칸 또는 NPR 유전자의 단백질에 특이적인 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
NCAM-120, α-디스트로글리칸 또는 NPR 유전자에 특이적인 프라이머 쌍 또는 프로브를 사용하여 생물학적 시료내 상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 퇴행성신경질환 진단방법.
NCAM-120, α-디스트로글리칸 또는 NPR 유전자의 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 생물학적 시료내 상기 유전자의 단백질 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 퇴행성신경질환 진단방법.
제 6항 또는 제 7항에 있어서,

상기 생물학적 시료는 뇌척수액 또는 혈청을 포함하는 것을 특징으로 하는 진단방법.