KR20100092164A - 글리피칸-3 단백질과 특이적으로 결합하는 펩타이드 - Google Patents

글리피칸-3 단백질과 특이적으로 결합하는 펩타이드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 글리피칸-3 와 특이적으로 결합하는 펩타이드에 관한 것으로, 본 발명의 펩타이드는 암 세포에서 과다발현되는 글리피칸-3 와 특이적으로 결합하며, 서열번호 1로 표현되는 아미노산 서열 또는 이의 일부로 구성된다.
글리피칸-3 는 간암, 흑색종, 생식세포종을 포함한 악성 종양에서 과다 발현되므로 본 발명의 펩타이드에 표지를 하여 종양의 진단 및 치료에 이용할 수 있으며, 본 발명의 펩타이드를 이용한 진단법은 종래보다 정확하고 작은 종양까지 진단가능하며, 치료에 이용하는 경우 다른 정상장기에 유해를 끼지지 않으면서 암 세포만 제거할 수 있다.
글리피칸-3, 펩타이드, 간암, 아미노산서열

Description

글리피칸-3 단백질과 특이적으로 결합하는 펩타이드 {A specific peptide targeting glypican-3}
본 발명은 글리피칸-3 단백질과 특이적으로 결합하는 펩타이드에 관한 것으로, 구체적으로는 본 발명은 일부 악성 종양에서 과다 발현되는 글리피칸-3 단백질과 특이적으로 결합하여 다른 정상 장기에 영향을 최소화하면서 해당 악성질환의 진단 및 치료에 이용할 수 있는 글리피칸-3 단백질에 특이적으로 결합하는 펩타이드에 관한 것이다.
간암은 보통 초기단계에서는 증상이 없고 1차 종양은 작을지라도 혈관내 또는 담즙내로 침습하는 경향을 보인다. 그 결과 간암은 보통 어느 정도 진행된 단계에서 발견되고 단지 10 ~ 20%의 초기 간암만이 진단시 제거될 수 있는 상태로 발견된다.
간암의 스크리닝과 진단을 위하여 사용되는 분자 마커는 알파페토프로테인(alphafetoprotein, AFP)이다. 알파페토프로테인은 정상조직에서는 태생기에만 발현하지만, 많은 간암세포에 있어서 발현이 재활성화되는 이른바 암태아성 단백질이라는 것이 보고되어 있다. AFP의 농도는 태어나서 12~18 개월내에 < 10 ng/㎖ 으로 점차 감소한다. 만약 AFP 레벨이 20 ng/㎖ 이거나 더 높으면 간암의 60 ~ 80% 가 진단되지만 종양이 작은 경우 민감도는 상당히 낮아진다.
종양의 크기는 간암의 전파와 전이에 중요한 위험인자이다. 작은 종양을 가진 환자는 더 많은 치료선택이 가능하나 증상을 나타내는 종양은 일반적으로 크기가 크고 완치가 불가능한 경우가 많다. 또한, 현재 사용되는 serological test는 민감성이 낮은 sequential AFP alanaysis 이기 때문에 종양이 작은 경우 발견에 어려움이 있다.
간암 마커로 AFP를 사용할 때 나타나는 다른 문제점은 특이적이지 않다는 것이다. AFP의 상당한 증가는 만성 간질환을 가진 상당수 환자에게서 나타난다. 만성 간염환자의 15~58%, 그리고 간경변환자의 11~47%가 혈청 AFP가 증가한다고 보고되어 있다. 그러므로 간암 환자와 간경변 환자의 혈청내 AFP 레벨이 같은 것은 흔한 일이다. 이는 AFP assay 결과를 해석하는데 혼동을 가져온다. AFP 결과를 신뢰하지 못하므로 대부분의 스크리닝 검사법은 간 종양에 매우 민감한 초음파 검사법을 포함한다. 그러나 초음파 검사법은 특이적이지 않고 병변이 2 cm 보다 작을 때, 간암, 간경변 결절, 이형성결절을 확실히 구분하지 못한다.
간암은 치료법으로 여러가지가 있음에도 불구하고 다른 암에 비해 예후가 좋지 않아서 난치성암으로 알려져 있다. 초기에 발견되는 경우는 수술적 요법으로 완치를 시도해볼 수 있으나, 초기에 발견되는 경우가 드물며, 다발성이며 간 외의 전 이를 포함하고 있어 완치적 수술을 시행할 수 없는 경우가 대다수를 차지하고 있다. 비록 간암의 위치 및 크기가 수술에 적합하다 하더라도 동반된 간질환에 의해 수술적 처치가 불가능한 경우가 적지 않다. 이러한 이유로 인하여 수술이 불가능한 간암의 경우 경동맥 색전술, 경동맥 화학색전술, 경피적 에탄올 주입, 경피적 고주파치료, 경피적 방사성핵종 주입술등의 치료가 시도되고 있으며 제한적인 효과를 나타내고 있는 실정이다. 전신적으로 항암제를 투여하여 치료를 시도한 경우, 부분적인 효과가 나타나기도 하고, 화학요법에 따른 이차적인 부작용으로 더 심한 병증이 발생하기도 한다. 따라서, 간암에 특이적으로 과발현하고 있는 항원을 표적으로 한 특이적 치료법을 개발한다면, 정상장기에 유해를 끼치지 않으면서 암만을 유효하게 배제하는 치료법이 될 가능성이 있다. 또한, 모든 말기의 암환자뿐만 아니라 간기능이 저하되어 다른 치료가 불가능한 암환자에게도 사용가능한 치료법이 될 수 있을 것이다.
상기의 문제점을 해결하고자 본 발명의 목적은 글리피칸-3(glypican-3, GPC-3)가 발현되는 암 세포에 특이적으로 결합하여 종양의 크기나 위치등의 진단 및 암의 치료에 이용될 수 있는 글리피칸-3 단백질과 특이적으로 결합하는 펩타이드를 제공하는 데 있다.
상기의 목적을 달성하고자 본 발명은,
서열번호 1 로 나타내어지는 아미노산 서열로 구성되는 글리피칸-3 단백질과 특이적으로 결합하는 펩타이드를 제공한다.
본 발명은 또한,
서열번호 1 로 나타내어지는 아미노산 서열의 일부로 구성되는 글리피칸-3 단백질과 특이적으로 결합하는 펩타이드를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하고자 본 발명은,
상기 글리피칸-3 단백질과 특이적으로 결합하는 펩타이드를 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은,
상기 글리피칸-3 단백질과 특이적으로 결합하는 펩타이드를 포함하는 체내 영상용 조영제를 포함한다.
상기 진단용 키트 또는 체내 영상용 조영제는 상기 펩타이드가 발색효소, 방사성 동위원소, 발색단(chromophore), 발광물질 및 형광물질로 이루어진 군으로부터 선택된 단독 또는 이들의 혼합물로 표지될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하고자 본 발명은,
상기 글리피칸-3 단백질과 특이적으로 결합하는 펩타이드를 포함하는 암 치료 및 예방용 조성물을 제공한다.
본 발명의 펩타이드는 암 세포에서 발현이 증가하는 글리피칸-3 단백질에 특이적으로 결합하여 글리피칸-3 단백질이 발현되는 종양의 진단 및 치료에 이용할 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 방사성 핵종과 같은 영상신호물질을 표지하여 영상진단용으로 응용이 가능하며, 치료효과 물질을 표지하여 치료에도 적용이 가능하다.
본 발명의 펩타이드는 특이성이 뛰어나 종양의 크기가 작은 경우라도 정확한 진단과 치료적 적용이 가능하다.
또한, 글리피칸-3 단백질은 정상장기에서는 발현이 높지 않아 항암제와 같은 종양치료제를 본 발명의 펩타이드에 결합시켜 치료에 적용하는 경우 종양치료제에 의한 정상장기에 유해성을 크게 감소시킬 수 있다.
이하, 본 발명을 당업자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다.
본 발명은 글리피칸-3(glypican-3, GPC-3) 단백질과 특이적으로 결합하는 펩타이드를 제공한다. 본 발명에서‘특이적’이란 용어는 다른 단백질과는 결합하지 않고 일부 악성 종양의 세포에서 과발현되는 글리피칸-3 단백질만을 표적으로 하여 결합하는 능력을 의미한다. 상기 본 발명의 펩타이드는 종양 세포에서 발현하는 글리피칸-3 단백질에 특이적으로 결합하므로 글리피칸-3 단백질 발현 세포를 선택적으로 발굴가능하며 이를 활용하여 종양의 크기 및 위치 등의 진단 및 치료에 이용될 수 있다. 또한, 간암, 흑색종, 생식세포종, 일부폐암 및 지방육종등에서 과발현되 는 글리피칸-3 에만 특이적으로 결합함으로 보다 정확하게 암을 진단 및 치료할 수 있다.
상기 글리피칸-3 단백질과 결합하는 펩타이드는 서열번호 1 로 표현되는 아미노산 서열로 구성되거나 서열번호 1 로 표현되는 아미노산 서열의 일부로 구성될 수 있다. 도 1 은 서열번호 1 로 표현되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드를 나타낸 것이다.
상기 본 발명의 펩타이드는 서열번호 1 로 표현되는 아미노산 서열 또는 이의 일부 아미노산 서열로 구성되어 글리피칸-3 단백질을 항원으로 인식한다. 따라서, 상기 펩타이드에 진단에 이용될 수 있는 영상신호물질을 표지하거나 항암제를 결합시켜 글리피칸-3 단백질이 과다발현되는 질병의 진단 및 치료에 이용할 수 있다.
상기 글리피칸-3 단백질은 세포 표면에 결합되어 있는 heparan sulfate proteoglycan 이다. 글리피칸-3 단백질은 발생(development)동안의 세포분열이나 그 패턴의 제어에 매우 깊이 관여하고 있음이 알려져 있고, 현재 임상에서 쓰이는 간암 마커인 알파페토프로테인(alphafetoprotein, AFP) 보다 글리피칸-3 단백질이 간암에서 더 많이 발현된다는 보고도 있다. 또한, 글리피칸-3 단백질은 간암뿐 아니라 흑색종, 생식세포 종양, 일부 폐암 및 지방육종등의 암에서도 발현된다.
본 발명은 상기 글리피칸-3 단백질과 특이적으로 결합하는 펩타이드를 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 암 진단용 키트는 글리피칸-3 가 특정암을 진단하는 마커로 이용될 수 있으므로 이와 특이적으로 결합하는 본 발명의 펩타이드를 이용하여 글리피칸-3 를 정량화 할 수 있다.
상기 진단용 키트에 포함되는 글리피칸-3 단백질과 특이적으로 결합하는 펩타이드는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 바람직하게는 발색효소, 방사성 동위원소, 발색단(chromophore), 발광물질 및 형광물질로 이루어진 군으로부터 선택된 단독 또는 이들의 혼합물을 표지로 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 글리피칸-3 단백질과 특이적으로 결합하는 펩타이드를 포함하는 체내 영상용 조영제를 제공한다. 상기 글리피칸-3 단백질과 특이적으로 결합하는 펩타이드에 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 하여 핵의학적 영상을 얻을 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 글리피칸-3 와 특이적으로 결합하는 펩타이드에 발색효소, 방사성 동위원소, 발색단, 발광물질, 형광물질, 산화철, CT 조영제, 탄소 및 금 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택된 단독 또는 이들의 혼합물을 표지하여 핵의학적 영상을 얻을수 있다. 구체적으로 예를 들면, 감마선을 방출하는 Tc-99m, In-111 또는 F-18을 본 발명의 GPC-3 단백질과 결합하는 펩타이드에 표지하여 체내 주입하면 핵의학적 영상으로 종양의 위치 및 크기를 측정할 수 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드에 자기공명영상신호를 발생시키는 산화철을 표지하면 MRI 영상을 얻을 수 있으며, CT 조영제 또는 금 나노입자등에 부착시키면 CT 영상으로 종양의 위치 및 크기를 측정할 수 있게 된다.
본 발명은 상기 글리피칸-3 단백질과 특이적으로 결합하는 펩타이드를 포함하는 암 치료 및 예방용 조성물을 제공한다. 상기 글리피칸-3 단백질과 특이적으로 결합하는 펩타이드에 치료용 핵종등을 표지하여 암 치료에 이용할 수 있으므로 상기 펩타이드를 포함하는 암 치료 및 예방용 조성물의 제조가 가능하다. 구체적으로 예를 들면, 베타선을 방출하는 치료용 핵종인 Y-90, I-131 또는 Re-188 을 이용하면 직접적인 치료효과를 낼 수 있다.
상기 암 치료 및 예방용 조성물은 글리피칸-3 단백질을 발현하는 간암, 흑색종, 생식 세포종, 편평상피 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 백혈병, 림파종, 췌장암 또는 지방육종을 포함하는 다양한 악성 종양의 치료에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 간암, 흑색종 또는 생식 세포종의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 암 치료 및 예방용 조성물은 임상투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 제조가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 통상적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있으며, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 정제, 트로키, 캡슐, 엘릴시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 및 주사제 등으로 다양하게 제형화될 수 있다.
상기 본 발명의 암 치료 및 예방용 조성물의 투여량은 환자의 질환 종류 및 중증도, 연령, 성별, 체중, 약물에 대한 민감도, 현재 치료법의 종류, 투여방법, 표적세포등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
도 2 는 본 발명의 글리피칸-3 단백질과 특이적으로 결합하는 펩타이드 제조 방법을 나타낸다. 도 1 에 의하면, 본 발명의 글리피칸-3 단백질과 특이적으로 결합하는 펩타이드의 제조 방법은 FLAG-GPC-3 발현 벡터 제작단계(S1); FLAG-GPC-3 발현 세포 설립 단계(S2); GPC-3 부착 단백질 분리 단계(S3); 아미노산 서열 분석 단계(S4); 펩타이드 제작 단계(S5); 및 펩타이드의 표지 및 특이성 시험단계(S6)를 포함한다.
상기 FLAG-GPC-3 발현 벡터 제작단계(S1)는 GPC-3 유전자에 p3×FLAG-Tagged vector를 ligation 하여 FLAG-Tagged GPC-3 벡터를 제작하는 단계이다.
상기 FLAG-GPC-3 발현 세포 설립 단계(S2)는 인간 세포주에 상기 S1 단계에서 제작된 FLAG-Tagged GPC-3 벡터를 이입하여 FLAG-GPC-3 발현 세포를 제작하는 단계이다. 상기 인간 세포주는 인간 간암 세포주 또는 인간 신장 세포주등을 사용할 수 있다. 상기 인간 세포주에 상기 FLAG-Tagged GPC-3 벡터를 이입한 후, 항생제등으로 처리하여 항생제에 내성을 가진 FLAG-GPC-3 발현 세포를 제작할 수 있다.
상기 GPC-3 부착 단백질 분리 단계(S3)는 상기 FLAG-GPC-3 발현 세포에서 FLAG 항체를 이용하여 GPC-3-FLAG 단백질만을 분리하고 affinity purification 으로 FLAG 를 제거하여 순수한 GPC-3 단백질을 얻는 단계이다.
상기 아미노산 서열 분석 단계(S4)는 상기 순수한 GPC-3 단백질에 결합되어 있는 리간드를 분리하여 LC-ESI-ms/ms tandem mass spectrometry를 이용하여 상기 순수한 GPC-3 단백질의 아미노산 서열을 분석하는 단계이다.
상기 펩타이드 제작 단계(S5)는 상기 S4 단계에서 분석된 아미노산 서열을 바탕으로 GPC-3 단백질과 특이적으로 결합하는 펩타이드를 선정하는 단계이다.
상기 펩타이드의 표지 및 특이성 시험단계(S6)는 상기 S5 에서 제작된 펩타이드의 GPC-3 와의 특이적 결합여부를 확인하는 단계이다. 상기 S5 에서 선정된 펩타이드에 형광물질을 표지하여 GPC-3 와의 결합반응을 확인할 수 있다. 상기 형광물질로는 FITC 를 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 설명한다. 이는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 세포배양
인간 간암 세포주(HepG2, Huh-7), 흑색종 세포주(SkMel28) 및 신장 세포주(HEK293, Cos-7)는 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)에서 구입을 하여 사용하였다. 세포는 10% 소 태아 혈청(Hyclone, Co.), 1% antibiotic-antimycotic(GIBCO, co.) 이 첨가된 D-MEM 배양액에서 배양을 하였다.
<실시예 2> 글리피칸-3(glypican-3, GPC-3)유전자의 증폭
인간 GPC-3 유전자는 NGIC(Korea unigene)에서 구입을 하였다. 이 유전자는 pDNR-LIB vector(Clonetech, Mountain View, CA, USA)에 삽입이 되어있었고, 우리가 필요로 하는 제한효소 부위인 XbaI 와 EcoRI를 가진 GPC-3 유전자를 얻기 위하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 통해 유전자 증폭을 하였다.
원하는 부위만을 증폭시키기 위한 프라이머의 염기서열은 forward primer 5′-AATTAGAATTCCAGGATGGCCGGGACCGTC-3′(서열번호 8) 이고 reverse primer 5′-TTACTCTAGAGTAGCACATGTGCTGGGCA-3′(서열번호 9) 이다.
<실시예 3> GPC-3 발현 vector의 제조
상기 실시예 2 에서 PCR을 행하여 제조한 GPC-3 산물과 CMV(cytomegalovirus) 프로모터를 포함하는 p3×FLAG-Tagged vector (Sigma-Aldrich, USA)를 ligation 하여 FLAG-Tagged GPC-3 vector를 제작하였다.
<실시예 4> 세포주에 GPC-3 발현 vector 의 도입
상기 실시예 3 에서 제작된 FLAG-Tagged GPC-3 유전자 1㎍ 를 lipofetamine TM 2000 (Invitrogen Co. Carsbad, CA, USA)를 이용하여 인간 간암 세포주(HepG2) 와 신장 세포주(HEK 293) 1×106에 이입시키고 약 2 주간 Geneticin(Invitrogen Co.) 300, 600, 800 ㎍/㎖ 농도로 처리하여 상기 유전자가 도입되어 내성을 나타내는 세포만 증식이 가능하도록 하였다. 이를 HepG2/GPC-3, HEK293/GPC-3 라고 하였다.
<실시예 5> 역 전사효소 중합효소연쇄반응 (Reverse transcriptase-polymerase chain reaction; RT-PCR) 을 통한 HepG2/GPC-3 세포 주의 확인
상기 실시예 4 에서 2주간 Geneticin 을 처리한 세포에 Trizol 시약 (invitrogen Co.)을 사용해 총 RNA를 분리 한 후 M-MuLV 역전사효소(fermamtas Co. EU)를 사용해 cDNA 를 만들었다. 이 cDNA를 주형으로 삼아 p3×FLAG 프라이머로 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행한 후 0.9% agrose gel 에서 전기영동을 하고 브롬화에티디움(EtBr)으로 염색하여 PCR산물을 확인하였다. 양성 대조군으로 GAPDH 프라이머로 PCR을 수행하였다.
<실시예 6> 단백질 발현 확인
간암세포주인 HepG2 및 Huh-7 세포, 흑색종세포주인 SkMel28 세포, 신장세포주인 HEK293 세포와 Cos-7 세포에서 글리피칸-3의 발현 여부를 RTPCR과 western blot으로 확인하였다. 또한, FLAG-Tagged GPC-3 를 인간 간암 세포주인 HepG2 세포에 이입한 후 영구발현 세포로 제작하여 GPC-3 단백질 및 FLAG-Tagged GPC-3 단백질의 발현을 western blot 으로 확인하였다.
GPC-3 단백질의 발현을 알아보기 위하여 다음와 같이 실험하였다. 먼저, 세포를 PBS로 세척 후, 용해용액(50 mM Tris-Cl pH 8.0, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.5% NP-40, 100μM PMSF, 1㎍/㎖ Luepeptin, 1㎍/㎖ Aprotinin, 1mM DTT)을 적당량 넣어서 세포를 용해한다. 30분간 얼음에서 반응시키고 5000rpm으로 30분간 원심분리를 한 후 세포의 단백질을 분리하였다. 9% 아크릴아마이드 겔에 40㎍ 의 단백질을 전기영동 한 후에 니트로셀룰로스 막에 단백질을 이동시켰다. 5% 탈지우유에 blocking을 1시간 실온에서 한 후에 1차 항체 (GPC-3 항체 1: 1000 (biomosaics), p3×FLAG 항체 10㎍/㎖ (SIGMA, co.))와 4℃ 에서 하루 동안 반응을 하였다. TBST 용액에 이 막을 수세한 후에 HRP가 붙어있는 2차 항체와 실온에서 2시간 반응을 하였다. 다시 TBST 용액에 여러 차례 수세를 한 후 ECL로 검침하였다. 그 결과는 도 3 및 도 4 에 나타내었다. 도 3 및 4 에서 베타액틴 및 GAPDH 는 house keeping gene 으로 어느 조건에서나 발현정도가 일정해 control 로 사용하였다.
도 3 은 HepG2 및 Huh-7 세포, 흑색종세포주인 SkMel28 세포, 신장세포주인 HEK293 세포와 Cos-7 세포에서 글리피칸-3 유전자 및 단백질의 발현결과이다. 도 3의 A 는 RTPCR 을 이용하여 GPC-3 유전자 발현여부를 검정한 결과이며, 도 3 의 B 는 Western blot 을 이용하여 GPC-3 단백질의 발현을 알아본 결과이다. 도 3 의 A, B 에 의하면, 간암세포주와 흑색종 세포주에서는 GPC-3 단백질이 발현되고, 신장세 포주에서는 GPC-3 단백질이 발현되지 않음을 확인할 수 있다. 도 3 의 C 에 의하면, 인간 신장 세포주인 HEK293 세포에서 GPC-3 유전자의 이입에 의해 GPC-3 유전자 및 GPC-3 단백질이 발현됨을 확인할 수 있다.
도 4 는 FLAG-Tagged GPC-3 유전자가 영구이입된 인간 간암 세포주인 HepG2 세포에서 FLAG-Tagged GPC-3 단백질의 발현결과이다. 도 4 에 의하면, FLAG-Tagged GPC-3 가 이입된 HepG2 세포주에서만이 FLAG-Tagged GPC-3 유전자가 인간 간암 세포주에서 발현되고 있음을 확인할 수 있다.
<실시예 7> GPC-3 와 특이적으로 결합하는 리간드의 분리 및 분석
7-1. GPC-3 단백질에 특이적으로 결합하는 리간드를 분리하는 과정은 도 5 에 나타내었다. 도 5 에 의하면, GPC-3 발현 세포인 HepG2/GPC-3 의 단백질에서 bead 가 달린 FLAG 항체를 이용하여 GPC-3-FLAG 단백질만을 분리해 낸 다음에 affinity purification으로 FLAG 를 제거하여 순수한 GPC-3 단백질을 얻었다. GPC-3 단백질에 면역침강법을 실시하여 GPC-3 리간드를 확인하였다. 도 6 은 GPC-3 리간드를 전기영동을 통하여 확인한 결과이다.
7-2. 순수한 GPC-3 단백질에 결합되어 있는 ligand를 분리하여 LC-ESI-ms/ms tandem mass spectrometry(도 7) 를 이용하여 sequencing하였다. 분석 결과 56 개의 리간드 단백질을 얻을 수 있었다.
<실시예 8> GPG-3 에 특이적으로 결합하는 펩타이드의 제작
상기 실시예 7 의 LC-ESI-ms/ms tandem mass spectrometry 방법을 이용한 리간드 분석결과를 참조하여 GPC-3 와 특이적으로 결합이 가능한 후보인 BTB/POZ DOMAIN CONTAINING PROTEIN KCTD 5 및 EXTRACELLULAR GLYCOPROTEIN LACRITIN PRECURSOR 아미노산 서열을 이용하여 7 개의 하기와 같이 표현되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드를 형광물질인 FITC 를 붙여 제작하였다.
1 BTB/POZ DOMAIN CONTAINING PROTEIN KCTD 5
B1: FITC-RLNVGGTYFLTTRQ (서열번호 1)
B2: FITC-KELHNTPYGTASEPSEKAKI (서열번호 2)
B3: FITC-KELHNTPYGTASEPSEKA (서열번호 3)
B4: FITC-RCSAGLGALAQRPGSVDSKW (서열번호 4)
B5: FITC-RGGIGAGLGGGLCRR (서열번호 5)
2. EXTRACELLULAR GLYCOPROTEIN LACRITIN PRECURSOR
L1: FITC-KQFIENGSEFAQKL (서열번호 6)
L2: FITC-KSILLTEQALAKA (서열번호 7)
<실시예 9> 본 발명의 펩타이드와 GPC-3 와의 결합반응 확인
상기 실시예 8 에서 합성한 펩타이드를 overlay assay를 실시하였다. 먼저 8-well chamber slide에 인간 간암 세포 (HepG2, Huh-7)와 신장 세포 (HEK293)를 1×105 정도로 배양을 한 후 PBS 로 3분씩 3번 수세한다. 비특이적인 반응을 막기 위 하여 1% BSA가 든 Opti-MEM으로 1시간 동안 반응을 하였다. 다시 3분간 3번 PBS 로 수세 후 10μM의 상기 실시예 8 에서 제작한 peptide와 1시간 동안 반응시켰다. 다시 3분간 3번 PBS 로 수세 후, 에탄올과 아세톤이 2:1로 썩인 고정액으로 3분간 세포를 고정하였다. DAPI가 들어있는 Mounting 용액으로 Mounting을 하였다. 그 결과 는 도 8 내지 10 에 나타내었다.
도 8 은 상기 서열번호 1 의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드(FITC-RLNVGGTYFLTTRQ)를 GPC-3 단백질이 발현되는 간암세포주 (HepG2, Huh-7), 흑색종세포주(SkMel28), GPC-3 유전자가 이입된 인간 신장 세포주(HEK-293 with GPC-3)와 GPC-3 단백질이 발현되지 않는 신장 세포주(HEK-293, Cos-7) 에 overlay 시킨 결과이다. 도 8 에 의하면, GPC-3 단백질이 발현되는 세포주는 모두 FITC 에 의한 형광이 관찰되었으며, GPC-3 단백질이 발현되지 않는 세포는 모두 형광이 관찰되지 않았다.
도 9 는 상기 서열번호 1 의 아미노산 서열의 일부로 구성된 펩타이드(FITC-YFLTTRQ)를 이용하여 GPC-3 단백질이 발현되는 간암세포주 (HepG2), 흑색종세포주(SkMel28), GPC-3 유전자가 이입된 인간 신장 세포주(HEK-293 with GPC-3)와 GPC-3 단백질이 발현되지 않는 신장 세포주(Cos-7) 에 overlay 시킨 결과이다. 도 9 에 의하면, GPC-3 단백질이 발현되는 세포주는 모두 FITC 에 의한 형광이 관찰되었으며, GPC-3 단백이 발현되지 않는 세포는 모두 형광이 관찰되지 않았다.
도 10 은 GPC-3 단백질이 발현되는 인간 간암 세포주인 HepG2 에 상기 서열번호 1 의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드(FITC-RLNVGGTYFLTTRQ)를 FITC가 결 합되지 않은 동일한 펩타이드와 함께 반응시켜 영상을 얻은 결과이다. 도 10 에 의하면, FITC 표지 펩타이드의 결합이 저해되어 형광이 관찰되지 않음을 알 수 있다. 즉, 형광물질을 표지하지 않은 펩타이드와 형광물질을 표지한 펩타이드가 경쟁적으로 GPC-3 단백질에 결합하게 되므로 형광물질 표지 펩타이드의 결합 가능성이 낮아지게 된다. 이로서 상기 서열번호 1 의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드의 GPC-3 에의 특이성을 확인 할 수 있다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 펩타이드는 암 세포에서 과발현되는 GPC-3 단백질과 특이적으로 결합한다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 암의 진단 및 치료에 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드를 이용하여 GPC-3 를 표적으로 한 치료를 행하는 경우 정상장기에 유해를 끼치지 않으면서 암 세포만을 유효하게 배제할 수 있다.
도 1 은 글리피칸-3 와 특이적으로 결합하는 펩타이드 리간드의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 2 는 FLAG-GPC-3 발현 벡터의 제작, 이를 이용한 안정세포주 작성, GPC-3 단백의 분리, GPC-3 특이 리간드의 검색, 해당 리간드를 이용한 GPC-3 단백질의 특이적 검색을 포함한 본 발명의 GPC-3 와 특이적으로 결합하는 펩타이드를 제작하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3 은 간암세포주인 HepG2 및 Huh-7 세포, 흑색종세포주인 SkMel28 세포, 신장세포주인 HEK293 세포와 Cos-7 세포에서 글리피칸-3 유전자 및 단백질의 발현결과이다.
도 4 는 FLAG-Tagged GPC-3 유전자가 영구이입된 인간 간암 세포주인 HepG2 세포에서의 FLAG-Tagged GPC-3 단백질의 발현결과이다.
도 5 는 FLAG 항체-bead 를 이용하여 GPC-3 단백질에 결합되어 있는 리간드를 분리하는 과정을 나타낸다.
도 6 은 면역침강법을 실시하여서 GPC-3 단백질 리간드를 전기영동하여 확인한 결과이다.
도 7 은 LC-ESI-ms/ms tandem mass spectrometry 이다.
도 8 은 서열번호 1 의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드에 FITC를 표지하여 (FITC-RLNVGGTYFLTTRQ) GPC-3 단백이 발현되는 간암세포주 (HepG2, Huh-7), 흑색종세포주(SkMel28), GPC-3 유전자가 이입된 인간 신장 세포주(HEK-293 with GPC- 3)와 GPC-3 단백이 발현되지 않는 신장 세포주(HEK-293, Cos-7) 에 overlay 시킨 결과이다.
도 9 는 서열번호 1 의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드의 서열 일부인 YFLTTRQ로 구성된 펩타이드에 FITC를 표지하여 GPC-3 단백질이 발현되는 간암세포주 (HepG2), 흑색종세포주(SkMel28), GPC-3 유전자가 이입된 인간 신장 세포주(HEK-293 with GPC-3)와 GPC-3 단백이 발현되지 않는 신장 세포주(Cos-7) 에 overlay 시킨 결과이다.
도 10 은 GPC-3 단백이 발현되는 인간 간암 세포주인 HepG2 에 서열번호 1 의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드에 FITC를 표지하여 반응시킬때, FITC가 결합 되지 않은 동일한 펩타이드와 함께 반응시켜 비교한 결과이다.
<110> Kyungpook University <120> A specific peptide targeting glypican-3 <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Arg Leu Asn Val Gly Gly Thr Tyr Phe Leu Thr Thr Arg Gln 1 5 10 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Lys Glu Leu His Asn Thr Pro Tyr Gly Thr Ala Ser Glu Pro Ser Glu 1 5 10 15 Lys Ala Lys Ile 20 <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Lys Glu Leu His Asn Thr Pro Tyr Gly Thr Ala Ser Glu Pro Ser Glu 1 5 10 15 Lys Ala <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Arg Cys Ser Ala Gly Leu Gly Ala Leu Ala Gln Arg Pro Gly Ser Val 1 5 10 15 Asp Ser Lys Trp 20 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Arg Gly Gly Ile Gly Ala Gly Leu Gly Gly Gly Leu Cys Arg Arg 1 5 10 15 <210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Lys Gln Phe Ile Glu Asn Gly Ser Glu Phe Ala Gln Lys Leu 1 5 10 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Lys Ser Ile Leu Leu Thr Glu Gln Ala Leu Ala Lys Ala 1 5 10 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 aattagaatt ccaggatggc cgggaccgtc 30 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 ttactctaga gtagcacatg tgctgggca 29

Claims (8)

  1. 서열번호 1 로 나타내어지는 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 글리피칸-3 단백질과 특이적으로 결합하는 펩타이드.
  2. 서열번호 1 로 나타내어지는 아미노산 서열의 일부로 구성되는 것을 특징으로 하는 글리피칸-3 단백질과 특이적으로 결합하는 펩타이드.
  3. 제1항 또는 제2항의 글리피칸-3 단백질과 특이적으로 결합하는 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 진단용 키트.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 글리피칸-3 단백질과 특이적으로 결합하는 펩타이드가 발색효소, 방사성 동위원소, 발색단, 발광물질 및 형광물질로 이루어진 군으로부터 선택된 단독 또는 이들의 혼합물로 표지되는 것을 특징으로 하는 암 진단용 키트.
  5. 제1항 또는 제2항의 글리피칸-3 단백질과 특이적으로 결합하는 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 체내 영상용 조영제.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 글리피칸-3 단백질과 특이적으로 결합하는 펩타이드가 발색효소, 방사성 동위원소, 발색단(chromophore), 발광물질 및 형광물질, 산화철, CT 조영제, 탄소 및 금 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택된 단독 또는 이들의 혼합물로 표지되는 것을 특징으로 하는 체내 영상용 조영제.
  7. 제1항 또는 제2항의 글리피칸-3 단백질과 특이적으로 결합하는 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료 및 예방용 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 암이 간암, 흑색종, 생식 세포 종양, 편평 상피 폐암 또는 지방 육종인 것을 특징으로 하는 암 치료 및 예방용 조성물.
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