KR20100089632A - 마이크로스피어와 하이드로겔을 포함하는 서방성 약물전달 복합체 - Google Patents

마이크로스피어와 하이드로겔을 포함하는 서방성 약물전달 복합체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 전달 약물; 및 하이드로겔(hydrogel) 내의 마이크로스피어(microsphere)를 포함하는 서방성 약물전달 복합체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 전달 약물을 포함하는 마이크로스피어를 제공하는 단계; 및 마이크로스피어를 균질로 포함하도록 하여 하이드로겔을 형성하는 단계를 포함하는 서방성 약물전달 복합체의 제조 방법을 제공한다. 본 발명에 따르는 하이드로겔 내의 마이크로스피어를 포함하는 서방성 약물전달 복합체는 치료약물의 장시간 지속방출과 약물의 순차적 전달에 유용하며, 방출약물의 높은 방출 비율 및 지속 방출성, 약물의 효과 유지가 뛰어나다.
서방성 약물전달 시스템, 하이드로겔, 마이크로스피어

Description

마이크로스피어와 하이드로겔을 포함하는 서방성 약물전달 복합체{DRUG DELIVERY SYSTEM FOR SUSTAINED RELEASE COMPRISING MICROSPHERE AND HYDROGEL}
본 발명은 서방성 약물전달 복합체에 관한 것이며, 더 구체적으로는 마이크로스피어와 하이드로겔을 포함하는 서방성 약물전달 복합체에 관한 것이다.
일반적으로 생체 내에 여러 경로로 투여되는 약물은 작용부위에 도달한 약물에 의하여 약효가 발휘되고 질병부위가 아닌 다른 부위로 운반된 약물은 주로 부작용의 원이이 된다. 일반 약물의 약효는 혈중 약물농도에 비례하여 나타나므로 다양한 제제학적 기술을 이용하여 혈중농도 곡선의 모양을 조절한 필요가 있다.
약물전달시스템(drug delivery system) 기술은 치료 부위에 질병 치료 약물을 효율적으로 전달함으로써 약물의 부작용을 줄이고, 약물에 대한 환자의 순응도를 높이며, 효능 및 효과를 극대화할 수 있도록 제형을 설계하고 약물치료를 최적화하는 기술을 총칭한다. 최근 개발이 활발한 약물전달 시스템 기술은 전통적으로 이용되는 정제, 캡슐, 주사제 등의 단순한 제형으로는 성취될 수 없는 다양한 형태의 성능을 발휘하기 위하여 특별히 고안된 제형 설계를 띠며, 대상으로 하는 치료 약물의 범위는 일반적인 화학적 합성 약물을 비롯하여 펩티드, 단백질, DNA를 비롯 한 유전자, 세포 등 다양한 형태의 물질을 포함한다.
특히, 복용 등 투여 후 흡수 부위에서 신속히 녹고 투여부위로부터 이행 속도가 큰 약물은 체내로부터의 손실이 크기 때문에 반복 투여하지 않으면 유효혈중농도를 유지하기 힘들어서 약효가 오래가지 못하는 문제점이 있다. 따라서 이런 약물들을 제제학적으로 디자인하여 약물이 체내에 투여된 후 제제로부터 서서히 방출되게 하여 약물의 혈중 농도를 유효 농도 이상으로 지속적으로 유지하게 하는 서방성 약물전달 시스템이 개발되었다. 이와 같은 서방성 약물전달 시스템은 초기에는 주로 경구 투여에 한정되었으나 이후 경피투여, 경점막투여 및 기타 제제에 이르는 다양한 경로에 대하여 시도되고 있다.
약물전달 시스템은 크게 리포좀, 에멀젼/유성 코어 및 나노/마이크로스피어 제제를 포함하는 미립자 제제; 하이드로겔이나 임플란트를 포함하는 고형 제제; 및 페길레이션 제제 같은 수용성 제제로 나눌 수 있다.
심부전(hear failure), 특히 심근 경색증은 전세계적으로 이환 및 사망의 주요 원인 중 하나이다. 수술은 심근 경색증에 있어서 일반적으로 받아들여지는 하나의 치료 방법이다. 그러나, 수술은 혈전증, 제한된 내구성 및 재수술과 같은 제한을 여전히 갖는다. 최근, 조직 가공 및 약물 전달을 포함하는 다양한 생물의학적 접근법이 심근 경색증 환자를 치료할 목적으로 개발되었다. 예컨대, 줄기 세포 또는 심장 전구 세포, 전사 인자, 유전자 및 단백질을 이용한 다양한 방법들이 심근 세포의 아폽토시스(apoptosis)을 저해하는데 효과적이다.
열 충격 단백질 군의 멤버(member)는 그 분자량에 따라 분류될 수 있다(예컨 대, HSP40, HSP72 및 HSP90). 흥미롭게도, 이 패밀리에 속하는 단백질들은 세포가 열, 허혈(ischemia) 및 자유 라디칼과 같은 환경 스트레스에 노출될 경우 세포 생존율(viability)을 높일 수 있다(I.J. Benjamin, D.R. McMillan, Circ. Res. 83(2), 1998, 117-132.). 저분자량 열 충격 단백질(sHSP) 중 하나인 열 충격 단백질 27(HSP27)은 분자 샤페론 단백질로서 중요한 역할을 수행하며, 항-아폽토시스 성질을 가지고, 가장 중요하게는, 아폽토시스 신호전달 경로(signaling pathway)의 구성성분(component)을 저해한다(S.S. Gordon Ferns, Shahida Shafi, Int. J. Exp. Pathol. 87(4), 2006, 253-274 참조). HSP27 의 항-아폽토시스 성질은 암 치료 뿐만 아니라, 혈관 및 신경 질환의 치료에 유용하다. 이전의 연구는 HSP27 이 저산소 조건 하의 심장 세포에서 또는 허혈/재관류(reperfusion) 동물 모델에서 보호 효과를 가진다는 것을 보여주었다. 그러나, HSP27 의 낮은 세포 막 투과성 및 짧은 반감기는 HSP27 의 체내로의 효율적인 전달을 방해하였다.
이 중 특히 목적에 따라 주사용 제제로 용이하게 사용될 수 있는 고분자 하이드로겔은 주입 및 이식이 용이하고 분해 후 독성이 적은 재료로 이루어져 생체 친화적인 장점이 있으나 다른 제제에 비하여 상대적으로 강한 초기 방출 거동을 보여 서방성으로 제제화하는데 어려움이 있는 단점이 있다.
주사용 제제로 빈번하게 사용되는 또 다른 제제인 나노/마이크로 스피어는 포함 약물을 서서히 방출하는 특성은 우수하지만 대식세포에 의한 식세포작용이 유발되기 쉬워 세포독성 측면에서 단점이 있다.
본 발명은 마이크로스피어와 하이드로겔의 상기와 같은 문제점을 극복하기 위하여 개발된 것으로서, 약물방출 거동을 장시간 조절할 수 있고 두 종류 이상의 서로 다른 약물을 순차적으로 전달시킬 수 있는 서방성 약물전달 시스템을 제공한다.
따라서, 본 발명은 전달 약물; 및 하이드로겔(hydrogel) 내의 마이크로스피어(microsphere)를 포함하는 서방성 약물전달 복합체를 제공한다.
또한, 본 발명은 전달 약물을 포함하는 마이크로스피어를 제공하는 단계; 및 마이크로스피어를 균질로 포함하도록 하여 하이드로겔을 형성하는 단계를 포함하는 서방성 약물전달 복합체의 제조 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 구체예를 통하여 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 한 양태에서는 전달 약물; 및 하이드로겔(hydrogel) 내의 마이크로스피어(microsphere)를 포함하는 서방성 약물전달 복합체를 제공한다. 다른 제제에 비하여 신속한 초기 방출 거동을 보이는 하이드로겔의 제한을 극복하기 위하여, 본 발명자들은 마이크로스피어로부터의 단백질 등의 약물 방출 속도가 겔로부터의 방출 속도보다 훨씬 더 느린 특성이 있는 마이크로스피어를 하이드로겔에 도입하였다.
본 발명자들은 TAT-HSP27, VEGF 등 단백질의 방출 거동이 시간 경과에 따라 어떻게 조절될 수 있는지를 본 발명의 마이크로스피어/하이드로겔 조합 전달 시스템을 사용하여 조사하였다. 방출된 TAT-HSP27 의 생물학적 활성을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 H9c2 세포의 생존율(viability) 및 저산소 조건 하에서 아폽토시스 경로의 차단(blockade)을 시험하였다.
본 발명의 다른 양태에서는 본 발명에 따르는 서방성 약물전달 복합체에서 사용되는 전달 약물이 마이크로스피어 또는 마이크로스피어와 하이드로겔 둘 다에 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 서방성 약물전달 복합체를 제공한다. 본 발명에 따르면 마이크로스피어를 하이드로겔 내에 포함한 약물전달 복합체는 하이드로겔 내의 마이크로스피어의 비율을 조절하여 약물의 서방성, 순차적 방출 거동을 조절할 수 있다. 예를 들어, 하이드로겔에 포함된 약물을 초기에 방출하고 마이크로스피어에 포함된 약물을 서서히 방출하도록 디자인함에 있어서, 각 제제에 포함된 약물 비율과 마이크로스피어와 하이드로겔의 비율을 조절함으로써 이와 같은 효과를 야기할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태에서 마이크로스피어와 하이드로 겔은 중량비로 0.2 내지 5.0 범위일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 마이크로스피어를 이루는 물질의 종류는 제한되지 않으며, 약물전달 시스템에서 사용될 수 있는 어떤 종류의 마이크로스피어도 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 마이크로스피어는 바람직하게는 생체에 해가 최소화된 생분해성 고분자이며, 더 바람직하게는 분자량 10,000 내지 200,000의 생분해성 고분자이다. PLGA와 같은 생분해성 물질이 대표적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 하이드로겔을 이루는 물질의 종류 또한 제한되지 않는다. 약물전달 시스템에서 사용될 수 있는 어떤 종류의 하이드로겔 형성 가능 재료가 본 발명에서 바람직하게 사용된다. 알긴산, 히아우론산, 피브린, 젤라틴, 콜라겐 등이 하이드로겔 형성에 사용되는 대표적인 재료이지만 이에 제한되지 않는 어떠한 재료도 바람직하다. 분자량 5,000 내지 500,000 범위의 하이드로겔 형성 재료가 바람직하다.
또한 본 발명의 다른 양태에서 본 발명에 따르는 서방성 약물전달 복합체의 전달 약물은 화학 약제, 단백질 및 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 제제인 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는 전달 약물은 단백질 제제이다. 세포 침투성 펩티드(cell penetrating peptide; CPP)인 단백질 도입 도메인(protein transduction domain; PTD)은, 그 분자 크기 및 생리화학적 성질을 극복하면서, 다양한 치료학적 단백질 및 펩티드를 세포 막 내로 전달하는 데 유용할 수 있다. HIV 로부터의 TAT(49-57)는, 그 아르기닌-풍부 올리고펩티드 구조에 기인하여, in vitro 및 in vivo 조건 모두에서 카고(cargo)를 직접 도입(transduce) 및 전달(deliver)하는데 효과적인 것으로 나타났다. 실제로, TAT 서열과 융합된 β-갈락토시데이즈는 뇌를 포함하는 다수의 조직에서 강화된 업테이크(uptake)를 보여주었다. 또한, TAT 는 다양한 항-아폽토시스 단백질과 융합되며, 최근 이들 융합 단백질은 허혈성 신경 또는 혈관 질환의 치료 뿐만 아니라, 다른 아폽토시스 질환들을 치료하는데에 사용되어 왔다. HSPs 의 세포보호 효과(cytoprotective effect)는 많은 연구자들에게 관심의 대상이었으며, 이들 단백질의 세포 전달이 다양한 PTD 도메인을 사용하여 종종 시도되었다. 본 발명자들의 선행 연구에서, 본 발명자들은 TAT-HSP27 이 Fas-매개 외인성 아폽토시스 경로를 저해하는 과정에서 관찰된 더욱 우세한(dominant) 보호 효과를 가지면서, 내인성 및 외인성 아폽토시스로부터 심장근육모세포를 보호할 수 있음을 밝혀냈다.
단백질 도입 도메인(PTD)은 '단백질 도입'이라 불리우는 메커니즘을 통하여 단백질이 세포 막을 통과하는 직접 전달에 있어서 유용한 도구이다. 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 가장 통상적인 PTDs 중 하나인 전사 촉진인자(TAT)는 유전자 또는 단백질을 세포막을 통과하여 전달시키는데 효과적이었다(A.D. Frankel, C.O. Pabo, Cell. 55(6), 1988, 1189-1193 참조). 본 발명자들은 이미 재조합 TAT-HSP27 융합 단백질이 저산소-유도 아폽토시스를 예방하는데 있어서 보호 효과를 갖는다는 것을 밝힌 바 있다(C.Y. Tan, "The heat shock protein 27 operates by blocking the mitochondrial-independent/extrinsic pathway of cellular apoptosis", 한양대 석사학위 논문, 2008).
조절된 약물 전달 시스템은 체내에서 최적의 치료학적 수준의 단백질을 유지 하는 데에 유용한 수단을 제공할 수 있다. 비록 TAT-HSP27 이 저산소(hypoxia) 상태에 대한 아폽토시스를 저해하기는 하나, 또한 이는(TAT-HSP27은) 효소에 의한 분해(enzymatic degradation)로 인하여 비교적 단시간 내에 체내로부터 제거될 수 있다. 따라서, 만성 심장 질환의 경우에 있어서, TAT-HSP27 의 반복 투여가 필요할 수 있다. 이러한 이유로, 본 발명자들은 주사가능한 도구로서 폴리(d,l-락티드-co-글리콜리드)(PLGA) 마이크로스피어 및 알기네이트 하이드로겔로 이루어지는 조합 전달 시스템을 제조하였다.
하이드로겔 및 마이크로스피어 각각은 단백질 전달을 포함하는 다수의 약물 전달 적용시 빈번히 사용되어 왔다. 하이드로겔은 용해 또는 해리되지 않고, 높은 물 함량을 유지하는 동안 삼차원 구조를 유지한다. 알기네이트는 Ca2+, Ba2+ 및 Sr2+ 와 같은 2가 양이온과의 결합(conjunction)에 의하여 용이하게 겔을 형성할 수 있으며, 국소 단백질 전달을 위한 주사가능한 운반체(vehicle)로서 널리 사용된다. 그러나, 알기네이트 겔은 초기 단계에서 그 단백질 함유물을 신속하게 방출한다. 본 발명은 이와 같은 하이드로겔의 단점을 보완하기 위하여 서방성을 제공하는 마이크로스피어를 하이드로겔 내에 포함시키는 구성으로 우수한 서방성 효과를 달성한다.
본 발명의 다른 양태에서 전달 약물을 2 종 이상의 서로 다른 약물인 것을 특징으로 하는 서방성 약물전달 복합체를 제공한다. 상기 2 종 이상의 서로 다른 약물은 치료 전략에 따라 특정 치료 부위에 먼저 제공되어야할 약물과 나중에 서서 히 전달되어야 할 약물을 필요에 따라 하이드로겔 또는 마이크로스피어 각각에 로딩하여 제조할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서는 전달 약물을 포함하는 마이크로스피어를 제공하는 단계; 및 마이크로스피어를 균질로 포함하도록 하여 하이드로겔을 형성하는 단계를 포함하는 서방성 약물전달 복합체의 제조 방법을 제공한다. 본 발명에서 사용하는 마이크로스피어 제조 방법은 특정 방법에 국한되지 않는다. 단백질 전달에 사용될 수 있는 마이크로스피어의 종류 및 제조 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명의 방법에 따라 제조되는 마이크로스피어는 당업자에게 마이크로스피어로 인식되는 범위의 입자 크기로 제조된다. 바람직하게는 마이크로스피어의 크기는 2-500 마이크로미터의 지름을 갖는다.
본 발명의 방법에 있어 하이드로겔 형성 단계에서 하이드로겔 내에 전달 약물을 더 포함하도록 하여 하이드로 겔을 형성하는 것이 또한 가능하다.
한편, 본 발명의 방법에서 전달 약물은 서방성 전달이 바람직한 어떤 종류의 약물이어도 무방하다. 본 발명의 방법의 한 구체예에서 전달 약물은 단백질 제제인 것이 바람직하다.
본 발명은 각종 질병 치료에 유용할 수 있는 단백질 제제를 포함하는 약물 전달 주사제 시스템에 관한 것이다. 본 발명에 따르는 하이드로겔 내의 마이크로스피어를 포함하는 서방성 약물전달 복합체는 치료약물의 장시간 지속방출과 약물의 순차적 전달에 유용하며, 방출약물의 높은 방출 비율 및 지속 방출성, 약물의 효과 유지가 뛰어나다.
본 발명은 심근 경색증의 치료에 유용할 수 있는 융합 단백질의 전달을 위한 주사제 시스템에 사용될 수 있다. PLGA 마이크로스피어 및 알지네이트 하이드로겔의 조합은 장시간 동안 TAT-HSP27 의 방출 거동을 조절하는데 유용했다. TAT-HSP27 의 방출 거동은 마이크로스피어와 겔 사이의 혼합 비율을 변화시킴으로써 조절될 수 있었다. 방출된 TAT-HSP27 은 저산소 조건 하에서 배양된 심장근육모세포의 아폽토시스 경로를 저해하는데에 효과적이었다. 융합 단백질의 방출 거동을 조절하는 이러한 접근법은 환자에 대하여 단백질의 불필요한 다중 투여없이, 심근 경색증 뿐만 아니라, 허혈/재관류(reperfusion)의 치료에 있어서 다수의 유용한 적용 분야를 발견할 수 있다.
하기 실시예에 사용된 재료 및 통계 분석방법은 다음과 같았다.
1. 재료
박테리아 발현 벡터 pRSET-A 의 6-His 태그(tag)를 Invitogen사로부터 구입하였다. 고정화된 Ni-친화성 크로마토그래피(IMAC : Immobilized Metal Affinity Chromatography)를 Bio-Rad사로부터 구입하였다. 항-인간 HSP27 항체를 Santa Cruz사로부터 구입하였다. 알긴산 나트륨(sodium alginate)을 FMC biopolymers사로부터 구입하였다(분자량 200,000-300,000). RESOMER® RG 502H (분자량 10,000, 0.16-0.24 dl/g)를 Boehringer Ingelheim사로부터 구입하였다. 폴리(비닐 알콜) (PVA, 분자량 27,000-32,000), 황산칼슘(CaSO4), 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 디메틸 술폭시드(DMSO), 염화코발트(CoCl2) 및 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드(MTT)를 Sigma-Aldrich사로부터 구입하였다. 소듐 아지드(99%, extra pure)를 Acros Organics사로부터 구입하였다. 인산염-완충 식염수 (PBS) 및 둘베코 인산염 완충 식염수(DPBS : Dulbecco's PBS)를 Gibco사로부터 구입하였다. 에틸 아세테이트(EA)를 Wako Pure Chemical Industries사로부터 구입하였다. 수산화나트륨 및 염산을 Duksan Pure Checimal사로부터 구입하였다. 3-(2-벤조티아졸릴)-7-(디에틸아미노)(쿠마린 6)를 Tokyo Kasei사로부터 구입하였다.
2. 통계 분석
모든 데이터는 [평균±표준편차]로서 제시된다. 스튜던트 T 테스트(Student's t-test)로 통계 분석을 수행하였다. * P < 0.05, ** P < 0.01 및 *** P < 0.001 의 값을 통계적으로 유의한 것으로 고려하였다.
이하의 실시예를 통하여 본 발명의 특정 구체예를 설명한다.
본 명세서에서 사용된 용어는 일반적, 사전적 의미로 한정하여 해석되어서는 안되며 본 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위하여 특정 용어의 개념을 적절한 범위 내에서 정의할 수 있다. 본 명세서 또는 당업계 종래 기술을 고려하면 여기에서 개시하는 본 발명의 범위 내에 있는 다양한 균등 또는 변형된 구체예들 또한 당업자에게 자명하다. 이하에 기재하는 구체예는 예시적인 목적으로 기술된 것 일 뿐이며, 본 발명의 범위는 오직 특허청구범위에 의하여만 한정된다.
<실시예>
실시예 1: 융합 단백질의 제조
C.Y. Tan, "The heat shock protein 27 operates by blocking the mitochondrial-independent/extrinsic pathway of cellular apoptosis", Master's degree in Hanyang University, 2008 에 기재된 바에 따라 TAT-HSP27 을 발현 및 정제하였다. 요약하면, 올리고 프라이머(primer) 5'- CAC GAG GAG CGG CAG GAC GAG 및 5'- CAG TGG CGG CAG CAG GGG TGG 를 사용하여 전장 인간 HSP27 cDNA로부터 PCR 증폭을 수행하여 HSP27 코딩 서열을 제조한 후, TAT 올리고뉴클레오티드(TAT GGC AGG AAG AAG CGG AGA CAG CGA CGA CGA)와 상기 PCR 증폭 생성물인 HSP27 코딩 서열을 박테리아 발현 벡터 pRSET-A 내에 6-His 태그(tag)와 프레임에 맞도록 클로닝함으로써 TAT-HSP27 융합 구성체를 제조하였다. E.coli 로부터의 융합 단백질을 고정 Ni-친화성 크로마토그래피(IMAC)를 사용하여 균질성을 나타내도록 정제하고, 투석(dialyzed)하였으며, 제조자 지시에 따라 농축하였다. 정제된 TAT-HSP27 융합 단백질의 존재를 항-인간 HSP27 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅(Western blotting)에 의하여 확인하였다.
HSP27 을 pRSET-A 벡터 내의 TAT 펩티드와 융합(fusion)시켜 세포 막을 효과적으로 통과하도록 한 상기 실험에서, 무변형 HSP27(27kDa)과 비교하여 융합 단백질(TAT-HSP27)이 대략 30 kDa 의 분자량을 갖는 것으로 추정하였으며(도 1a), 인간 HSP27 에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석에 의하여 그 존재(identity)를 확인하였다(도 1b).
실시예 2: TAT-HSP27 함유 마이크로스피어의 제조 및 특성
2.1. TAT-HSP27 함유 PLGA 마이크로스피어의 제조
단백질을 함유하는 마이크로스피어를 제조하는 데에 빈번하게 사용되는 방법인 수중유중수(water-in-oil-in-water : w/o/w) 이중 에멀젼에 기초한 용매 증발/추출 방법을 사용하여 TAT-HSP27-로딩 마이크로스피어를 제조하였다. 요약하면, 1 ㎍/g TAT-HSP27(단백질/PLGA, w/w)을 탈이온수에 용해시키고, PLGA를 EA에 용해하였다. 상기 용액을 탐침형 초음파파쇄기(probe type sonicator)(Branson Disital Sonifier®)를 사용하여 얼음조에서 10초 동안 70 W 아웃풋(output)으로 에멀젼화하였다. 제조된 에멀젼(w/o)을 4% 수성 PVA 용액에 붓고, 이중 에멀젼(w/o/w)을 제조하기 위하여, 균질화기(Ultra-Turrax® T25 basic, IKA®-Werke)를 사용하여 5분 동안 9,000 rpm 으로 다시 에멀젼화하였다. 수득한 이중 에멀젼을 0.4% PVA 수 용액(300 ㎖)에 붓고 기계식 교반기를 사용하여 600 rpm 으로 3 시간 동안 완전히 혼합하여 유기 용매를 증발/추출하였다. 경화된 마이크로스피어를 원심분리한 후, 탈이온수로 5회 세척하여 PVA 를 제거하였다. 헹구어낸 마이크로스피어를 3일 동안 동결건조한 후, 건조기(desiccator)에 저장하였다. 중합체 농도를 변화(5-30%)시킴으로써 상이한 크기를 갖는 다양한 TAT-HSP27-로딩 마이크로스피어를 제조하였다.
2.2. PLGA 마이크로스피어의 특성
입자 카운팅(count) 및 크기 분석기(Z2 Coulter®, Beckman)으로 마이크로스 피어의 크기를 측정하였다. 현탁액을 Isoton®II 희석액으로 희석시키고 마이크로스피어의 평균 직경을 측정하였다. 주사 전자 현미경(scanning electron microscopy)(S-4800 UHR FE-SEM, Hitachi)로 마이크로스피어의 형태를 조사하였다. 탈이온수 중 마이크로스피어의 현탁액(suspension)을 실온에서 알루미늄 홀더(aluminum holder)상에 고정시키고, 밤새 건조한 후, 진공 하에서 백금으로 코팅하였다. 마이크로스피어에 캡슐화된(encapsulated) TAT-HSP27 의 함량을 측정하기 위하여, PLGA 마이크로스피어를 1N NaOH 용액으로 용해시킨 후, 1 N HCl 용액으로 중화시켰다. 얻어진 용액을 0.2 ㎛ 필터(Millipore, USA)를 통과시켜 여과시키고, HSP27 ELISA 분석 키트(Biosource)를 사용하여 TAT-HSP27 함량을 측정하였다. 로딩 효율을 마이크로스피어의 실제 TAT-HSP27 함량과 마이크로스피어에 최초 첨가된 양 사이의 비율로 나타냈다.
마이크로스피어의 평균 직경에 영향을 끼친 공정 변수(variables)는 중합체 농도, 온도, 계면활성제(surfactant) 농도, 상(phase) 부피 및 에멀젼화 방법을 포함한다. PLGA 용액의 상이한 농도를 사용하여 다양한 크기를 갖는 TAT-HSP27-로딩 마이크로스피어를 제조한 후, 마이크로스피어의 평균 직경 및 TAT-HSP27 로딩 함량을 측정한 결과, PLGA 용액의 농도가 증가할수록 PLGA 마이크로스피어의 평균 직경이 증가하였다(도 2a). 5, 10, 20 및 30% PLGA 용액으로 제조된 마이크로스피어는, 각각, 3.8, 5.5, 11.7 및 22.1 ㎛ 의 평균 크기를 가졌다. TAT-HSP27 의 로딩 효율은 중합체 농도에 의하여 유의하게 영향을 받지는 않았다. SEM 으로 PLGA 마이크로 스피어의 형태를 얻었다 (도 2b 및 2c).
실시예 3: 마이크로스피어로 로딩된 하이드로겔의 제조와 단백질 방출
3.1. PLGA 마이크로스피어로 로딩된 알지네이트 하이드로겔의 제조
PLGA 마이크로스피어를 함유하는 알지네이트 용액을 황산칼슘과 가교(cross-linking)시킴으로써, PLGA 마이크로스피어-로딩 알지네이트 겔로 이루어진 조합 전달 시스템을 제조하였다. 20분 후, 겔을 디스크(직경 15 ㎜; 두께 2 ㎜) 형태가 되도록 절단하고 DPBS로 세척하였다. PLGA 마이크로스피어와 알지네이트 겔 사이의 다양한 혼합비율로 겔을 제조하였다. 겔 중 PLGA 마이크로스피어의 분포를 FE-SEM 및 공초점 레이저 주사 현미경(ISS)으로 조사하였다. 알지네이트 겔 중 TAT-HSP27 함량을 HSP27 ELISA 분석 키트(Biosource)를 사용하여 측정하였다. TAT-HSP27-로딩 하이드로겔 디스크를 50 mM EDTA 에 용해시키고 밤새 진탕조(shaking bath)(37℃, 200 rpm)에 위치시켰다. TAT-HSP27 를 함유하는 PLGA 마이크로스피어를 하이드로겔 내에 로딩시키고, 1N NaOH 용액을 상기 용액에 첨가하여 마이크로스피어를 용해시켰다. 로딩 효율을 전체 시스템 내의 실제 TAT-HSP27 함량과 시스템에 최초 첨가된 양 사이의 비율로 나타냈다.
3.2. 시험관 내 단백질 방출
조합 시스템으로부터의 TAT-HSP27 의 방출 거동을 조사하기 위하여, PLGA 마이크로스피어로 로딩된 알지네이트 겔 디스크를 12-웰 조직 배양 플레이트(Coring)에 위치시키고, DPBS 를 첨가하였다(37℃, 5% CO2 환경). 미리 계산된 시간 간격으 로, 상층액을 제거하고 신선한 DPBS로 대체하였다. HSP27 ELISA 분석 키트로 방출된 TAT-HSP27 의 양을 측정하였다.
본 발명자들의 선행 연구에서, 겔 내로 로딩된 PLGA 마이크로스피어의 크기는 마이크로스피어/하이드로겔 조합 시스템으로부터의 모델(model) 단백질의 방출 거동에 유의하게 영향을 끼치지는 않았다. 따라서, 평균 직경 5.5 ㎛ ([PLGA] = 10%)을 갖는 PLGA 마이크로스피어를 선택 및 사용하여 본 실시예에서 융합 단백질의 전달을 위한 조합 시스템을 형성하였다.
알지네이트 하이드로겔 내에서의 PLGA 마이크로스피어의 분포를 조사하였다(도 3). 겔 내에서 마이크로스피어의 균질한 분산(dispersion)이 SEM(도 3a 및 3b) 및 공초점 레이저 주사 현미경(confocal laser scanning microscopy)(도 3c 및 3d)에 의하여 관찰되었다.
마이크로스피어 및 하이드로겔 사이의 혼합 비율을 변화시킴으로써 조합 전달 시스템을 제조하였으며, TAT-HSP27 의 방출 프로파일(profile)을 시험관 내에서 모니터링(monitor)하였다. 비록 상이한 양의 PLGA 마이크로스피어가 알지네이트 겔 내로 로딩되었으나, 겔 형성(gelation) 이전에 TAT-HSP27 을 알지네이트 용액에 첨가하여 조합 시스템(10.6 ㎍/겔 디스크) 내의 TAT-HSP27 의 총양이 일정하도록 유지하였다. TAT-HSP27 의 로딩 효율을 약 80%(표 1)로 유지하였으며, 조합 시스템으로부터의 TAT-HSP27 의 조절된 방출을 3주 동안 얻을 수 있었다(도 4). 크기 및 마이크로스피어 내의 단백질 함량과 무관하게, 마이크로스피어와 하이드로겔 사이의 상대적 비율이 조합 전달 시스템으로부터의 단백질 방출을 조절하는데 있어서 중요 한 인자인 것으로 보인다.
한편, TAT-HSP27 대신 VEGF를 사용하여 동일한 방법으로 시험관 내 방출을 시험한 결과, 유사한 조절된 방출 결과를 얻을 수 있었다(도 5).
Figure 112009006999365-PAT00001
실시예 4: 방출된 단백질의 생물학적 활성
4.1. 심장근육모세포(cardiomyoblast) H9c2 배양
10% 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS)(Hyclone) 및 1% 페니실린(penicillin) 및 스트렙토마이신(streptomycin)이 보충된 DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)(Invitrogen)에서 심장근육모세포(H9c2)를 배양하였다. 모든 실험에 대하여, 2 계대 내지 5 계대의 세포를 사용하였다.
4.2. TAT-HSP27의 생물학적 활성(bioactivity)
시험관 내에서 카스페이즈-3(caspase-3) 활성 및 H9c2 세포의 생존율(viability)을 측정하여 TAT-HSP27의 생물학적 활성(bioactivity)을 측정하였다. Caspase-Glo® 3/7 assay(Promega)로 저산소증에 의하여 유발된 아폽토시스 경로 중 하나인 카스페이즈-3 활성화를 측정하였다. H9c2 세포를 배양하고 흰색 벽의 96-웰 플레이트(SPL Life Sciences) 상에 접종하고, 5% CO2 환경(5×103 세포/웰), 37℃ 인큐베이터에서 12시간 동안 부착하도록 하였다. 세포를 DPBS로 세척하고 300μM CoCl2 로 처리하였다. 24시간 후에, 세포를 DPBS로 다시 세척하고, 신선한 배지를 보충하였다. 다음, 무변형(intact) 또는 방출된 TAT-HSP27 중 어느 하나를 각각의 웰에 첨가하였다(1μM). 24 시간 동안 인큐베이션한 후에, 세포를 DPBS 로 세척하고 200 ㎕ 의 검출 용액(Caspase-Glo® 3/7 시약/완충액 = 1/1, 부피/부피)로 처리하였다. 3시간 후, 각각의 웰로부터의 용액의 발광(luminescence)을 휘도계(luminometer)(Orion II Microplate Luminometer, Berthold Detection System)를 사용하여 측정하였다.
MTT 분석에 의하여 세포 생존율을 평가하였다. H9c2 세포를 96-웰 플레이트 상에 접종하고, 5% CO2 환경 하에서 12시간 동안 37℃ 에서 인큐베이션하였다. 저산소 인큐베이터(1% O2 및 5% CO2)를 사용하여 세포가 저산소 조건 하에 노출된 후에, 무변형 또는 방출된 TAT-HSP27 중 어느 하나를 각각의 웰에 첨가하고, 세포를 24시간 동안 배양하였다. 다음으로, 세포를 DPBS 로 세척하고, 신선 배지(180㎕)와 MTT 용액(20㎕, 0.5 ㎎/㎖)의 혼합 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 세포를 5% CO2 환경 하에서 3시간 동안 37℃ 에서 인큐베이션하였다. DMSO 용액을 첨가하여 포르마잔(formazon) 결정을 용해시키고, 분광광도계(spectrophotometer)(SpectraMax M2e) 로 540 nm 에서 흡광도를 측정하였다.
조합 시스템으로부터의 방출된 TAT-HSP27 의 생물학적 활성이 유지되는지 여부를 조사하기 위하여 화학적 저산소증/허혈성 유사 물질(chemical hypoxia/ischemic mimicking agent)인 염화코발트(CoCl2)로 아폽토시스를 유도하였다. 상기 약제는 외인성 Fas-의존성 아폽토시스 경로를 유도할 수 있으며, 그 후 카스페이즈-3 또는 카스페이즈-3 과 유사한 단백분해효소 중 어느 하나를 활성화시키며, 이는 궁극적으로 카스페이즈 연쇄반응(cascade) 및 최종적으로 아폽토시스의 유도를 일으키게 된다.
무변형 TAT-HSP27 과 비교하여 조합 시스템으로부터 방출된 TAT-HSP27 로 세포를 처리할 경우, 카스페이즈-3 활성화는 놀랍게 억제되며(도 7), 이는 방출된 TAT-HSP27 이 아폽토시스의 억제에 효과적이라는 것을 지시한다. 또한, 본 발명자들은 무변형 TAT-HSP27 과 비교하여 방출된 TAT-HSP27 로 처리된 후, 저산소 조건 하에서 배양된 심장근육모세포의 생존율이 개선될 수 있는지 여부를 시험하였다(도 6). 무변형 및 방출된 TAT-HSP27-처리 세포는 모두 저산소 조건 하에서 80% 이상의 생존율을 나타냈으며, 이는 시험관 내 및 생체 내에서 수행된 선행 연구들과 일치하는 것이었다.
한편, 세포주로서 혈관내피세포인 사람 제대정맥 내피세포(Human umbelical vein endothelial cell: HUVEC)를 사용한 조합 시스템으로 방출된 혈관내피성장인자 (VEGF: vascular endothelial growth factor)의 세포 생존율 비교 실험 결과를 도 8에서 나타낸다. 무변형 단백질과 방출된 단백질 모두에서 유사한 생존율 개선 효과를 관찰할 수 있었다.
실시예 5: 시험관 내 심장근육모세포 증식에 대한 효과
H9c2 세포를 12-웰 플레이트 상에 접종하고, 5% CO2 환경 하에서 12시간 동안 37℃ 에서 인큐베이션하고, 2일 동안 저산소 인큐베이터 내에서 배양하였다. 세포를 DPBS 로 2회 세척하고 신선한 배지를 첨가하였다. 그 후, TAT-HSP27을 함유하는 조합 전달 시스템을 트랜스웰(Corning Incorporated Costar®)의 상층 삽입부(upper insert)에 놓고, 세포를 정상 또는 저산소 인큐베이터 중 어느 하나에서 5일 동안 배양하였다. 각각의 시점에서, 0.05% 트립신(trypsin) 용액을 사용하여 세포를 플레이트로부터 분리(detached)시키고, MTT 분석에 의하여 세포의 수를 계수하였다.
방출된 TAT-HSP27의 치료제로서 효능(efficacy)을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 저산소 조건 하에서 H9c2 의 시험관 내 증식을 조사한 결과는 아래와 같다. 선행 연구들은 HSPs 의 군(family)이 도입될 때, 저산소 조건 하에서의 세포 증식이 회복될 수 있음을 보여주었다. 따라서, 본 실시예에서는 조합 시스템으로부터 TAT-HSP27 이 지속적으로 방출될 때, H9c2 세포의 증식이 회복될 수 있는지 여부를 시험하였다(도 9). 정상산소(normoxic) 조건 하에서 배양된 비처리(non-treated) 세포는 지속적으로(continuously) 성장한 반면, 저산소 조건 하에서의 H9c2 세포의 증식 속도는 아폽토시스때문에 현저히 감소하였다. 정상산소 조건 하에서 단지 조합 시스템(TAT-HSP27 이 아님)으로 배양된 세포의 증식 및 생존율은 유의하게 변화하지 않았으며, 이는 전달 시스템이 H9c2 세포에 대하여 최소 세포독성을 가짐을 시사한다. 세포가 1 μM TAT-HSP27 로 처리될 경우, 저산소 조건 하에서 세포 성장이 회복되었다. 그러나, 그 효과는 단지 짧은 시간 동안만 지속되었으며, 이는 배지 중에 단백분해효소(protease)가 존재하는 경우에 있어서의 TAT-HSP27 의 짧은 반감기 때문인 것으로 여겨진다. 5 μM TAT-HSP27 로 1회 처리한 세포의 성장 속도(0.47±0.07 day-1)는 단백질의 존재와는 무관하게 저산소 조건 하에서 배양된 비처리 세포의 성장 속도(0.43±0.01 day-1)로 유사하였다(표 2).
Figure 112009006999365-PAT00002
놀랍게도, 5 μM TAT-HSP27 이 로딩된 조합 전달 시스템으로 세포가 배양될 경우, 세포 증식이 현저히 강화되었으며, 이는 5일 동안 매일 1 μM TAT-HSP27 로 처리된 세포의 증식 속도와 유사하였다. 세포 성장 속도 (0.60±0.02 day-1)는 매일 1 μM TAT-HSP27 로 처리된 세포의 성장 속도와 상당히 유사하였다(표 2). 선행 연구는 도입 후 심장 내로 균질하게 분산된 TAT 와 융합된 아폽토시스 억제인자가 유용한(valuable) 심장보호 효과를 가짐을 보여주었다. 또한, HIV-1 TAT 에 융합된 재조합 HSP27 은 in vitro 및 in vivo 에서 허혈성 심장 질환의 치료에 유용한 것으로 나타났다. 본 발명자들의 발견은 전달 시스템으로부터의 TAT-HSP27의 방출 거동을 조절하는 것이 저산소 조건 하에서 세포 증식을 조절하는데에 중요한 인자 중 하나이며, 마이크로스피어/하이드로겔 조합 시스템을 사용하여 조절된 방식의 항-아폽토시스 단백질 또는 펩티드의 전달이, 만성 심장 질환의 치료에 있어서 주사제로서의 가능성을 발견할 수 있음을 명백히 시사한다.
유사하게, 세포주로서 혈관내피세포인 사람 제대정맥 내피세포(HUVEC)를 사용한 조합 시스템으로 방출된 혈관내피성장인자(VEGF)의 세포 증식에 대한 영향을 알아보기 위하여 시험관 내 증식 (세포 수 측정)을 조사하였다. 처리하지 않은 대조군, VEGF를 포함하지 않은 조합 시스템 또는 조합시스템 대신 볼루스로 동량 투여한 VEGF에 비하여 현저하게 증가한 수준의 시험관 내 증식을 관찰하였다(도 10).
도 1은 정제된 TAT-HSP27의 (a) SDS-PAGE 분석 겔의 쿠마시블루 염색 결과 사진 및 (b) 사람 HSP27에 대한 폴리클론 항체를 사용한 웨스턴 블롯 결과 사진이다.
도 2의 (a)는 중합체 농도가 PLGA 마이크로스피어의 크기(검은 동그라미) 및 로딩 효율(검은 네모)에 끼치는 영향을 나타내는 그래프이다. 도 2의 (b)와 (c)는 각각 10%와 30% PLGA 용액으로 제조된 PLGA 마이크로스피어의 주사 전자 현미경 영상이다. 눈금 막대 길이는 50 ㎛.
도 3은 알지네이트 하이드로겔 내에 분산된 PLGA 마이크로스피어의 주사전자현미경 영상(a, b) 및 공초점 레이저 주사현미경 영상(c, d) 사진이다. 화살표는 겔 내에 위치하는 PLGA 마이크로스피어를 나타낸다.
도 4는 마이크로스피어/하이드로겔 혼합비에 따른 TAT-HSP27 세포 외 방출 정도를 나타내는 그래프이다. (매체: PBS, 혼합비: 각각 0.0, 1.0, 1.5 마이크로스피어/하이드로겔, w/w)
도 5는 마이크로스피어/하이드로겔 혼합비에 따른 VEGF 세포 외 방출 정도를 나타내는 그래프이다. (매체: PBS, 혼합비: 각각 0.0, 1.0, 1.5 마이크로스피어/하이드로겔, w/w)
도 6은 심근세포주를 이용한 복합시스템에서 방출된 TAT-HSP27의 세포 생존율 비교 그래프이다. 저산소성 환경에서 무변형(intact) 단백질과 복합시스템에서 방출된 단백질을 각각 처리했다.
도 7은 심근세포주를 이용한 복합시스템에서 방출된 TAT-HSP27의 단백질 생활성 비교 그래프이다. 코발트 클로라이드(CoCl2)를 처리하여 외인성 아폽토시스 경로를 유발시킨 후, 저산소성 환경에서 무변형(Intact) 단백질과 복합시스템에서 방출된 단백질을 각각 처리하여 캐스파제-3 활성도를 비교했다.
도 8은 혈관내피세포(HUVEC)를 이용한 복합시스템에서 방출된 VEGF의 세포 생존율 비교 그래프이다. 무변형(Intact) 단백질과 복합시스템에서 방출된 단백질을 각각 처리했다. (EBM-2; no growth factor)
도 9는 심근세포(H9c2)를 이용한, 저산소 조건에서 방출된 TAT-HSP27 존부에 따르는 세포 증식 정도 비교 그래프이다.(**P<0.01, ***P<0.001)
도 10은 혈관내피세포(HUVEC)를 이용한, 방출된 VEGF 존부에 따르는 시험관 내 세포 증식 정도 비교 그래프이다. (대조군 대비 **P<0.01, ***P<0.001, n=6)

Claims (8)

  1. 전달 약물; 및 하이드로겔(hydrogel) 내의 마이크로스피어(microsphere)를 포함하는 서방성 약물전달 복합체.
  2. 제 1 항에 있어서, 전달 약물은 마이크로스피어 또는 마이크로스피어와 하이드로겔 둘 다에 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 서방성 약물전달 복합체.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 마이크로스피어와 하이드로겔은 중량비로 0.2 내지 5.0 범위인 것을 특징으로 하는 서방성 약물전달 복합체.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 전달 약물은 화학 약제, 단백질 및 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 제제인 것을 특징으로 하는 서방성 약물전달 복합체.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 전달 약물을 2 종 이상의 서로 다른 약물인 것을 특징으로 하는 서방성 약물전달 복합체.
  6. a) 전달 약물을 포함하는 마이크로스피어를 제공하는 단계; 및
    b) 마이크로스피어를 균질로 포함하도록 하여 하이드로겔을 형성하는 단계; 를 포함하는 서방성 약물전달 복합체의 제조 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, b) 단계에서 하이드로겔 내에 전달 약물을 더 포함하도록 하여 하이드로 겔을 형성하는 것을 특징으로 하는 서방성 약물전달 복합체의 제조 방법.
  8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 전달 약물은 화학 약제, 단백질 및 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 제제인 것을 특징으로 하는 서방성 약물전달 복합체의 제조 방법.
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