KR20100082126A

KR20100082126A - 암세포의 화합물 또는 방사선에 대한 민감도를 증진시키는 물질의 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR20100082126A
Application number: KR1020090001461A
Authority: KR
Inventors: 김인규; 김태림; 백상기; 김국찬; 정일래; 강세찬; 조은위
Original assignee: 한국원자력연구원
Priority date: 2009-01-08
Filing date: 2009-01-08
Publication date: 2010-07-16
Also published as: KR101061479B1

Abstract

본 발명은 암세포의 화합물 또는 방사선에 대한 민감도를 증진시키는 물질의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 구체적으로 SM22α 단백질은 IGF1Rβ 단백질에 직접 결합하여 이를 인산화시키고, IGF1R 단백질의 인산화는 Ras GTPase 활성을 증가시키는 경로를 경유하여 다양한 스트레스에 대한 저항성과 관련된 Akt 단백질의 인산화를 증가시키므로, 상기 SM22α 단백질과 IGF1Rβ 단백질의 결합을 억제하는 물질을 선별함으로써 암세포의 화합물 또는 방사선에 대한 민감도를 증진시키는 물질을 스크리닝할 수 있는 방법에 관한 것이다.

SM22α, IGF1Rβ, Ras GTPase, Akt, 민감도

Description

암세포의 화합물 또는 방사선에 대한 민감도를 증진시키는 물질의 스크리닝 방법{Method for screening an enhancer of chemical sensitivity or radiosensitivity of cancer cells}

본 발명은 암세포의 화합물 또는 방사선에 대한 민감도를 증진시키는 물질의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 구체적으로 SM22α 단백질과 IGF1Rβ 단백질의 결합을 억제하는 물질을 선별하여 암세포의 화합물 또는 방사선에 대한 민감도를 증진시키는 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

빠른 속도로 성장하는 암세포는 지속적으로 저산소 환경(hypoxic condition)에 노출된다. 이는 조직으로 공급되는 산소(oxygen)의 결핍 또는 부족을 의미하는데, 암세포의 중심부가 주변을 둘러싼 혈관으로부터의 거리가 점차 멀어지기 때문이다(Hockel M, Vaupel P., J Natl Cancer Inst. 93(4): 266-276, 2001). 이러한 기형적인 혈관 시스템 때문에 산소뿐만아니라 영양분 공급까지 극심한 방해를 받게 되는데, 이러한 극심한 저산소 상태(hypoxia)에서 세포는 세포사멸을 선택할지 저 산소 환경에 적응하여 살아남을지를 결정하게 된다. 이러한 환경적 스트레스에 적응하여 살아남은 세포들은, 일정 기간 동안 반복적으로 나타난 저산소 환경에 견디어내는 특징을 가지며 그 결과, 저산소 상태뿐 아니라 전리 방사선(ionizing radiation) 또는 항암제에 의해 나타나는 세포사멸에 대해서도 내성을 갖게된다(Semenza GL. Cancer Cell. 5(5): 405-406, 2004; Song X. et al., Cancer Chemother Pharmacol. 58(6): 776-784, 2006). 신생혈관형성을 자극하는데 필수적인 이러한 암세포의 oxygenation은 현재 수많은 종양 타입에서 방사선치료(radiotherapy)와 다른 항암치료(anti-cancer therapy)에 내성이 생기도록 유도하는 주요 인자로써 인식되고 있다(Moeller BJ, et al., Cancer Cell. 2004; Xu RH, et al., Cancer Res. 65(2): 613-621, 2005). 저산소 환경은 다양한 고형암의 암세포들을 더 악성 종양으로 진행하도록 하여 방사선치료와 화학요법(chemotherapy)에 대한 저항성을 증가시키는 나쁜 예후와 연관이 되어 있다(Johan Bussink, et al., Radiother Oncol. 67(1): 3-15, 2003; Hockel M, et al., Cancer Res. 56(19): 4509-4515, 1996; Vaupel P, Harrison L. 9 Suppl 5: 4-9. Review, 2004).

저산소 환경에서는 암세포 성장, 전이 및 세포사멸과 밀접한 연관이 있고, O₂항상성 조절의 중요인자이자 전사조절인자(transcription factor)인 HIF-1(hypoxia inducible factor 1)의 활성화가 유도된다(Carmeliet P, et al., Nature. 394(6692): 485-490, 1998; Zhong H, et al., Cancer Res. 58(23): 5280- 5284, 1998; Jiang BH, et al., Cancer Res. 57(23): 5328-5335, 1997; Halterman MW, et al., J Neurosci. 19(16): 6818-6824, 1999). HIF-1에 의해 조절되는 기작중 하나는 암세포의 생존과 저항성에 기여함으로써 세포자살(apoptosis)에 의한 세포사멸 과정을 조절하는 것이다. 최근 여러 논문에서, HIF-1이 항세포사멸(anti-apoptotic) Mcl-1 단백질의 발현을 유도하며(Piret JP, et al., J Biol Chem. 280(10): 9336-9344, 2005), BAX와 BH3 전세포사멸 비드(pro-apoptotic bid) 단백질의 발현을 감소시킨다고 보고되었다(Erler JT, et al., Mol Cell Biol. 24(7): 2875-2889, 2004). 반면에, 항세포사멸 단백질(anti-apoptotic protein)인 IAP는 저산소 환경하에 HIF-1에 비의존적인 방식으로 유도될 수 있다는 보고도 있다(Dong Z, et al., J Biol Chem. 276(22): 18702-18709, 2001). 이는 HIF-1 이외의 발현조절인자들 또한 저산소환경에서의 세포생존에 기여하고 있는 뜻으로, AP-1과 SP-1을 포함한 여러 발현조절인자들이 저산소 환경에 의해 활성화됨이 확인되었다(Cummins EP, Taylor CT. Pflugers Arch. 450(6): 363-371. Review. 2005).

지금까지의 연구결과로는 SM22α는 정상적으로 성숙한 척추동물의 평활근 조직에 가장 많이 편재하는 22 kDa의 단백질로서(Lees-Miller, J. P. et al., Biochem. J. 244: 705-709, 1987; Lees-Miller, J. P. et al., J. Biol. Chem. 262: 2988-2993, 1987; Nishida, W. et al., Biochem. Int. 23(4): 663-668, 1991; Nishida, W. et al., Gene 130(2): 297-302, 1993; Shanahan, C. M. et al., Circ. Res. 73(1): 193-204, 1993), 배발생 과정 동안 평활근 분화의 초기 마커 중 하나 인 것으로 알려져 있으며, 기능상으로는 초기 배발생 과정이나 분화과정에서 근육조직의 생성에 중요한 역할을 하는 것으로 추측되고 있다. SM22α는 성인의 혈관과 내장의 평활근 세포에서 풍부하게 발현되는데(Lawson, D. et al., Cell Motil. Cytoskeleton 38: 250-257, 1997; Li, L. et al., Circ. Res. 78: 188-195, 1996), 이외에도 폐, 자궁, 정맥 및 장 등 다양한 조직에서도 높은 수준으로 발현되고 있다. 다양한 암세포에서는 SM22α의 발현 정도가 낮은 수준을 보이고 있으며, 또한 노화된 세포의 발현이 증가되는데 최근 효모(yeast)에서의 연구결과는 SM22α의 증가가 미토콘드리아의 불안정을 유도하여 활성산소종을 발생시켜 세포사멸 및 수명(life span)의 감소를 유도하는 것으로 보고하고 있다(Li, L. et al., Circ. Res. 78(2): 188-195, 1996). 사람의 SM22α cDNA는 세포복제 노화(replicative senescence)에 관계되는 뉴클레오티드들을 연구하는 과정 중에 일부분으로 클로닝되었으며 염색체 11q23.2에 위치해 있는 것이 확인되었다(Camoretti-Mercado, B. et al., Genomics49: 452-457, 1988). 다양한 방법으로 확인한 결과, 젊은 섬유모세포(fibroblasts)에 비해 늙은 섬유모세포에서 현저히 증가함을 관찰하였다.

인슐린 유사 성장인자 Ⅰ 수용체(Insulin-like growth factor-I receptor, IGF-IR)는 네 개의 단위체로 구성된 막통과 수용체 티로신 키나제(transmembrane receptor tyrosine kinase)로써, 정상 인간 조직에서 광범위하게 발현되며 배아발생과 출생후의 성장에 관여한다. IGF-IR는 이황화물(disulfide) 결합으로 연결된 2개의 α 서브유닛(subunits)과 β 서브유닛으로 구성되어 있는데, 세포밖으로 드 러나는 α 서브유닛은 리간드 결합부위를 갖고 있고, β 서브유닛은 막통과부위(transmembrane domain)와 세포 내부로 돌출된 세포질 티로신 키나제(cytoplasmic tyrosine kinase) 부위로 구성되어 있다. IGF-IR은 인슐린 유사 성장인자 Ⅰ(IGF-I)과 IGF-Ⅱ와 같은 유사한 리간드(ligand)에 의해 활성화된다. 리간드가 결합하면 IGF-IR의 내재적인 티로신 키나제 활성을 활성화시켜 트랜스 β 서브유닛(trans-β subunit)이 자가인산화(autophosphorylation)된다. 그 결과, IRS-l/포스파티딜이노시톨 3-키나제(phosphatidylinositol 3-kinase)/AKT/mTOR[라파마이신(rapamycin)의 포유류 표적]/성장 인자 수용체 결합 단백질 2(growth factor receptor binding protein 2)/Sos/Ras/MAPK[미토겐-활성 단백질 키나제(mitogen-activated protein kinase)] 경로를 포함한 신호전달체계가 자극을 받아 활성화된다. IGF-IR가 활성화되는 과정은 세포 증식, 생존, 암화, 전이 및 신생혈관생성등을 유도하는데 관여한다는 것이 확인되었다(LeRoith D, et al., Jr. Cancer Lett 195:127-137, 2003; Ullrich A, et al., Cell 61:203-212, 1990; Pollak MN, et al., Nat Rev Cancer 4:505-518, 2004; Wang Y, et al., Curr Cancer Drug Targets 2:191-207, 2002; Zhang H, et al., Expert Opin Investig Drugs 13:156-159, 2004).

IGF-IR의 작용을 억제하기 위해 항-IGF-IR 항체 또는 안티센스(antisense)-DNA 등의 처리, 우성 음성(dominant negative) IGF-IR의 발현, 소문자 억제제(small-molecule inhibitors) 등을 처리하였을 경우에(Resnicoff M, et al., Cancer Res 54:484-485, 1994; ChernickyCL, et al., Cancer Gene Ther 7:384-395, 2000; Kalebic T, et al., Int J Cancer 76:22-37, 1998; Scotlandi K, et al., Int J Cancer 101-116, 1998; Garcia-Echeverria C. IDrugs 9:41-59, 2006) 인간 종양 이종이식 모델(human tumor xenograft models)에서 암세포의 성장이 감소하는 것이 확인되었다. 또한, 광범위한 고형 종양(solid tumors)과 혈액학적 신생물(hematologic neoplasias)에서 IGF-I, IGF-II 및 IGF-IR의 발현이 증가하는 경향을 보인다(Pollak MN, et al., Nat Rev Cancer 4:505-518, 2004; Wang Y, et al., Curr Cancer Drug Targets 2:191-207, 2002). 이로써 IGF-IR의 활성화 저해는 암세포의 증식을 억제하는 좋은 방법임을 확인할 수 있다. 암세포에서의 IGF-IR의 발현은 나쁜 예후와 밀접한 관련이 있음이 신세포암(renal cell carcinoma)의 경우에 보고되어 있다(Parker AS, et al., Hum Pathol 33:801-805, 2002). 게다가, IGF-IR 신호(signaling)가 EGFR 억제제(inhibitors)를 포함한 다양한 항종양 치료(antitumor therapies)에 대한 저항성 기작과도 연관되어 있음이 보고되어 있다(Chakravarti A, et al., Cancer Res 62:200-207, 2002).

본 발명자들은 이전에 SM22α 단백질이 폐암세포주의 저산소 환경에서 매우 유의성 있게 증가되는 것을 확인하였고, 상기 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 항암제, 및 SM22α 단백질의 발현이 증가된 세포들은 전리방사선(ionizing radiation), 항암제(anticancer drugs) 및 독성 화합물(toxic chemicals) 등에 대한 저항성을 나타내는 것을 확인하여 SM22α 단백질의 발현 또는 활성을 억제하여 방사선 또는 화합물에 의한 암세포의 사멸을 촉진하는 방법을 제시한 바 있다(대한민국 등록번호 제 10-0818047호). 그러나, SM22α 단백질이 어떠한 신호경로를 통하여 방사선 또는 화합물 등의 스트레스에 대한 저항성을 나타내는지는 보고된 바 없다.

이에, 본 발명자들은 SM22α 단백질이 방사선을 포함한 세포사멸을 유도하는 각종 스트레스 저항성을 유도하는 메커니즘을 연구하던 중, SM22α 단백질이 IGF1R 단백질과 직접 결합하여 자발적 인산화(autophosphorylation)를 유도하고, 상기 IGF1R 단백질의 인산화가 Ras GTPase 활성을 증가시키는 경로를 경유하며, 최종적으로 Akt 단백질의 인산화를 유도하여 세포사멸을 유도하는 각종 스트레스들에 대해 저항성을 유도하는 메커니즘을 구명함으로써 SM22α 단백질과 IGF1R 단백질의 결합을 억제하는 물질을 선별하여 스트레스 민감도를 증진하는 물질을 스크리닝하는 방법에 이용하여 암세포 치료과정의 효율성을 높일 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 SM22α 단백질과 IGF1Rβ 단백질의 결합을 억제하는 물질을 선별하여 상기 DNA 손상인자에 대한 암세포의 민감도를 증진시키는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

1) 피검물질 존재하에서 SM22α 단백질을 IGF1Rβ 단백질에 접촉시키는 단계;

2) 상기 SM22α 단백질과 IGF1Rβ 단백질의 결합 수준을 측정하는 단계; 및

3) 상기 결합 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 암세포의 화합물 또는 방사선에 대한 민감도를 증진시키는 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) SM22α 단백질 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 상기 세포주에서 IGF1Rβ 단백질의 인산화 수준을 측정하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 IGF1Rβ 단백질의 인산화 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 암세포의 화합물 또는 방사선에 대한 민감도를 증진시키는 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) SM22α 단백질 과발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 상기 세포주에서 Ras GTPase 활성 수준을 측정하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 Ras GTPase 활성 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 암세포의 화합물 또는 방사선에 대한 민감도를 증진시키는 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은

1) SM22α 단백질 과발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 상기 세포주에서 Akt 인산화 수준을 측정하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 Akt 인산화 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 암세포의 화합물 또는 방사선에 대한 민감도를 증진시키는 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, SM22α는 IGF1Rβ에 결합하여 인산화시키고, Ras GTPase 활성을 증가시키는 경로를 경유하여 Akt 단백질을 인산화시켜 세포의 증식 및 저항성에 관여한다. 또한, 폐암 치료제의 상당부분이 EGFR 저해제로서 많은 폐암세포주가 EGFR 저해제에 의하여 저항성을 나타낸다. 이에, 본 발명은 SM22α의 새로운 Akt 활성 경로를 이용하여 기존의 EGFR 저해제에 저항성을 보이는 폐암세포주의 치료제 개발에 중요한 자료로 이용할 수 있으며, SM22α의 새로운 신호경로를 차단함 으로써 방사선 또는 시스플란틴과 같은 항암제에 대한 폐암세포의 사멸효과의 민감도를 극대화할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 SM22α 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하고, IGF1Rβ(insulin-like growth factor receptor type 1-β) 단백질은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 SM22α 단백질과 IGF1Rβ 단백질의 결합 수준은 이스트 투 하이브리드법(Yeast two-hybrid), 표면 플라스몬 공명법(Surface Plasmon Resonance, SPR), 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석 법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 암세포는 폐암세포인 것인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 저산소 환경을 야기하여 SM22α를 과발현하는 암세포는 모두 해당될 수 있다.

상기 방법에 있어서, 화합물은 시스플라틴(cisplatin) 또는 메나디온(Menadione)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 항암제 또는 독성물질 등을 포함하는 DNA 손상인자(DNA damaging agents)는 모두 해당될 수 있다.

상기 방법에 있어서, 방사선은 감마방사선인 것이 바람직하고, 상기 감마방사선은 선원이 ⁶⁰Co인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명자들은 저산소 환경(hypoxic condition)의 폐암세포에서 발현이 증가된 SM22α 단백질의 기능을 조사하였다. 구체적으로, SM22α 단백질 과발현 벡터 및 SM22α siRNA 듀플렉스 올리고보뉴클레오티드를 각각 폐암세포주에 도입하여 SM22α 단백질의 발현을 조절한 후 폐암세포에 존재하는 다양한 단백질들의 활성을 웨스턴블럿팅 및 면역침강법을 이용하여 분석하였다. 그 결과, SM22α 단백질의 과발현이 IGF1R의 인산화(phosphorylation), RAS GTPase 활성, 및 Akt 인산화를 증가시키는 반면에, SM22α 단백질의 발현 억제가 상기 단백질들의 활성을 저해하였다. 또한, Akt 단백질의 인산화와 관련된 단백질들(PI3K-p110,PTEN, K-RAS)의 발 현은 SM22α 단백질의 발현증감에 관계없음을 확인하였다. 아울러, SM22α 과발현 세포주에서 IGF1R 억제제를 처리함으로써 IGF1R 및 Akt의 인산화가 확연히 감소하는 것을 확인하였다.

기존의 연구에서는 Akt 단백질의 활성화가 PTEN, K-Ras 및 EGF 등의 단백질들이 관여하는 경로를 거치는 것으로 알려져 있으나, 본 발명에서는 SM22α 단백질이 과발현되어 스트레스에 대한 저항성이 유도되는 경우에는 IGF1R의 활성화를 경유하고 Ras GTPase 활성도 증가시키며, 최종적으로 Akt 단백질의 인산화를 유도한다는 것을 알 수 있다.

본 발명자들은 SM22α 단백질이 IGF1Rβ 단백질과 직접적인 상호작용을 하는지 면역침강법을 이용하여 분석하였다. 구체적으로, SM22α 과발현 세포주에 항-IGF1Rβ 항체를 첨가하여 IGF1Rβ 단백질을 잡은 후 상기 단백질과 함께 SM22α 단백질이 검출되는지 확인하였다. 그 결과, SM22α 단백질은 IGF1Rβ 단백질과 세포내에서 연합체로 존재하며 비변성 조건에서 IGF1Rβ 단백질을 특이결합항체로 농축할 경우 같은 분획으로 움직이는 것을 확인하였다. 또한, SM22α의 발현억제에 의해 IGF1Rβ와 SM22α의 직접적인 상호작용이 사라지는지의 여부를 확인하였다. 그 결과, SM22α를 발현 억제시킨 경우에는 IGF1Rβ 농축분획에서 SM22α가 거의 검출되지 않는 것을 확인하였다. 아울러, SM22α 유전자의 점 돌연변이(point mutation)에 의해 IGF1Rβ와 SM22α의 직접적인 상호작용뿐만 아니라 AKT의 인산화도 일어나지 않음을 확인하였다. 그 결과, SM22α 점 돌연변이된 DNA을 과발현시킨 세포주에는 IGF1Rβ가 SM22α와 연합체로 존재하지 않으며 비변성 조건에서 IGF1Rβ를 이에 대한 특이결합항체로 농축할 경우 같은 분획으로 움직이지 않음을 확인하였으며, AKT의 인산화와 IGF1Rβ의 인산화가 일어나지 않음을 확인하였다.

본 발명자들은 SM22α 단백질이 항암제 또는 감마 방사선에 대한 암세포의 민감도에 미치는 영향을 유세포분석법을 이용하여 분석하였다. 구체적으로, SM22α 단백질 과발현 벡터 및 SM22α siRNA 듀플렉스 올리고보뉴클레오티드를 각각 폐암세포주에 도입하여 SM22α 단백질의 발현을 조절한 후 시스플란틴 처리, 메나디온 처리, 및 감마방사선 조사를 각각 수행한 다음, 세포성장 및 세포사멸을 확인하였다. 그 결과, 스트레스 조건을 주었을 경우에 SM22α 단백질의 발현양에 반비례하는 세포사멸의 패턴을 나타내는 것을 확인하였다.

따라서 SM22α 단백질과 IGF1Rβ 단백질의 결합을 억제함으로써 암세포의 화합물 또는 방사선에 대한 민감도를 증진시킬 수 있음을 알 수 있다.

본 발명에서는 SM22α 단백질이 IGF1Rβ 단백질에 직접 결합하여 이를 인산화시키고, Ras GTPase 활성을 증가시키는 경로를 경유하여 다양한 스트레스에 대한 저항성과 관련된 Akt 단백질의 인산화를 증가시키는 것을 확인하였다. 따라서 SM22α 단백질과 IGF1Rβ 단백질의 결합을 억제하는 피검물질을 선별하면 이를 암세포의 화합물 또는 방사선에 대한 민감도 증진용 물질로 이용할 수 있음을 알 수 있다.

또한, 본 발명은

1) SM22α 단백질 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;

상기 방법에 있어서, SM22α 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하고, IGF1Rβ 단백질은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 인산화 수준은 인산화된 IGF1Rβ 단백질에 특이적인 방사선 동위원소 또는 항체를 이용한 분석법을 통해 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 인산화 수준은 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하고, 면역침강법을 이용하여 측정하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 화합물은 시스플라틴(cisplatin) 또는 메나디온(Menadione)인 것이 바람직하나 이에 한저되지 않으며, 항암제 또는 독성물질 등 을 포함하는 DNA 손상인자(DNA damaging agents)는 모두 해당될 수 있다.

본 발명에서는 SM22α 단백질이 IGF1Rβ 단백질을 인산화시키고, 상기 IGF1Rβ 단백질의 인산화가 Ras GTPase 활성을 증가시키는 경로를 경유하여 다양한 스트레스에 대한 저항성과 관련된 Akt 단백질의 인산화를 증가시키는 것을 확인하였다.따라서 IGF1Rβ 단백질의 인산화 정도를 억제하는 피검물질을 선별하면 이를 암세포의 화합물 또는 방사선에 대한 민감도 증진용 물질로 이용할 수 있음을 알 수 있다.

또한, 본 발명은

1) SM22α 단백질 과발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 상기 세포주에서 Ras GTPase 활성 수준을 측정하는 단계; 및

상기 방법에 있어서, SM22α 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 활성 수준은 활성화된 Ras GTPase에 특이적 인 방사선 동위원소 또는 항체를 이용한 분석법을 통해 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 활성 수준은 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하고, 효소면역분석법을 이용하여 측정하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 화합물은 시스플라틴(cisplatin) 또는 메나디온(Menadione)인 것이 바람직하나 이에 한저되지 않으며, 항암제 또는 독성물질 등을 포함하는 DNA 손상인자(DNA damaging agents)는 모두 해당될 수 있다.

본 발명에서는 SM22α 단백질이 IGF1Rβ 단백질을 인산화시키고, Ras GTPase 활성을 증가시키는 경로를 경유하여 Akt 단백질의 인산화를 증가시키는 것을 확인하였다. 따라서 Ras GTPase 활성을 억제하는 피검물질을 선별하면 이를 암세포의 화합물 또는 방사선에 대한 민감도 증진용 물질로 이용할 수 있음을 알 수 있다.

아울러, 본 발명은

1) SM22α 단백질 과발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 상기 세포주에서 Akt 인산화 수준을 측정하는 단계; 및

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 Akt 인산화 수준은 인산화된 Akt 단백질에 특이적인 방사선 동위원소 또는 항체를 이용한 분석법을 통해 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서는 SM22α 단백질이 IGF1Rβ 단백질을 인산화시키고, Ras GTPase 활성을 증가시키는 경로를 경유하여 Akt 단백질의 인산화를 증가시키는 것을 확인하였다. 따라서 Akt 단백질의 인산화를 억제하는 피검물질을 선별하면 이를 암세포의 화합물 또는 방사선에 대한 민감도 증진용 물질로 이용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 무산소(Anoxia) 또는 1% 저산소(Hypoxia) 환경에서 폐암 세포주의 배양

인간의 폐암 세포주인 A549 및 H1299 두 종류 세포[ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA)]들을 각각 100 units/ml 페니실린(penicillin)(SIGMA, USA), 10% 우태아 혈청(Fetal Bovine Serum: Hyclone)을 포 함한 complete RPMI 1640 배지에 3 × 10⁶ 세포/10 ml로 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 동시에 complete RPMI 1640 배지만을 무산소(Anoxia) 또는 1% 저산소(Hypoxia) 환경인 챔버(chamber)에 24시간 이상 방치하여 미리 무산소 또는 1% 저산소 상태로 만들어 놓았다가 전날 접종(plating)해 놓았던 세포들을 무산소 또는 1% 저산소 상태의 배지로 챔버안에서 갈아준 다음, 무산소 또는 1% 저산소 환경인 챔버에서 각각 8, 16 및 24시간 배양하였다. 상기 배양된 세포를 수거할 때에는, 챔버로부터 꺼내어 얼음 위에서 세포를 긁어 모아 세포파쇄 완충액(lysis buffer)을 넣을 때까지의 과정을 매우 빠른 속도로 진행하였다.

<실시예 2> 센스(Sense) SM22α 유전자의 제조 및 형질도입

인간의 SM22α 유전자는 센스(sense) SM22α를 만들기 위해, 프라이머(primer)[HindIII/포워드(forward): 5'-AGCTTAAGCTTGACATGGCCAACAAG-3'(서열번호: 3), BamHI/리버스(reverse): 5'-GCGGATCCTCTCCGCTCTAACTG-3'(서열번호: 4)]로 연쇄 중합반응(PCR)을 통해 636 bp의 센스 SM22α 유전자를 획득하였다. 역전사 반응은 10 mM dNTPs mixture, 5X RT buffer, 0.5 ㎍/㎕ Oligo dT, 열 변성시킨 전체 RNA 4 ㎍(70℃, 10분), 및 200 U/㎕ M-MLV RTase를 각각 넣고 최종 20 ㎕에 맞추어 0.02% 디에틸 피로카보네이트(diethyl pyrocarbonate, DEPC)가 처리된 멸균수로 부피를 맞춘 후 45℃에서 30분 동안 반응시켰다. 94℃에서 다시 5분간 가열한 후 얼음에서 급냉시켜서 M-MLV RTase를 비활성화시켰다.

상기 과정으로 합성된 cDNA 중 1 ㎕를 10X buffer(MgCl₂ free), 2.5mM dNTPs, 10X MgCl₂, 및 Taq DNA polymerase와 각각의 SM22α및 β-actin에 대한 10 pmol 프라이머를 섞어서 다음의 조건에서 증폭하였다. 94℃에서 5분으로 초기 변성(predenature)시킨 후, 94℃에서 1분으로 변성(denaturation), 59℃에서 45초간 풀림(annealing), 72℃에서 45초간 연장(elongation)을 수행하는 조건으로 45회 반복한 다음, 72℃에서 5분 동안 후기 연장(post-elongation)을 수행하였다. 1% 아가로즈 겔(agarose gel) 상에서 전기영동을 통하여 나타난 변화양상을 관찰하였다. 얻어진 센스 SM22α cDNA를 발현벡터인 pcDNA3.1(Invitrogen, USA)의 HindIII와 BamHI 제한효소 부위에 삽입하였으며, 이렇게 제조된 발현벡터를 "pcDNA3.1/SM22α"라 명명하였다. 세포 5×10⁵/2 ml/6 well에 pcDNA3.1/SM22α DNA 4 ㎍을 Lipofectamine 2000(Invitrogen, USA)을 이용해 형질 도입하였다. 안정적으로 발현시키는 세포주(stable cell line)를 구축하는 경우, 센스 SM22α 유전자를 형질 도입한 세포를 500 ㎍/ml G418을 첨가한 배지로 1주간 배양한 후, 96 웰(well)에서 키운 각각 하나의 세포로부터 유래한 클론(clone)들 중에서 SM22α가 가장 많이 발현된 클론을 500 ㎍/ml G418로 선별하였고, 일시적 형질도입(Transient tranfection)의 경우, 형질도입 72시간과 96시간 후 각각 세포를 수거하여 단백질 발현을 관찰하였다.

<실시예 3> SM22α-siRNA 듀플렉스 올리고리보뉴클레오티드(duplex oligoribonucleotides)의 제작 및 형질도입

SM22α 유전자에 대한 siRNA는 invitrogen사에 SM22α유전자의 서열정보를 제공한 후 주문제작서비스(custom service)로 제작한 SM22α stealth-RNA candidate 3종류(25 mer)중 가장 효과적으로 SM22α를 억제하는 후보(645번)를, 세포 2×10⁵에 100 nM을 Lipofectamine RNAi MAX(invitrogen)을 이용해 3일에 걸쳐 3회 형질 도입하였다. SM22α-siRNA 듀플렉스 올리고보뉴클레오티드를 100 units/ml 페니실린-스트렙토마이신 용액(penicillin-streptomycin solution)(Hyclone)이 첨가되지 않은 배지에서 형질 도입한 세포는 4시간 반응 후 100 units/ml 페니실린-스트렙토마이신 용액(Hyclone)를 첨가한 배지로 바꾸어 배양하였다.

SM22α의 발현억제를 위해 사용한 siSM22α 듀플렉스 올리고보뉴클레오티드의 서열

	프라이머 서열 (5' → 3')
645	(RNA)-UUC UUC AUA AAC CAG UUG GGA UCU C (서열번호: 5)
645	(RNA)-GAG AUC CCA ACU GGU UUA UGA AGA A (서열번호: 6)

<실시예 4> IGFIR 억제제(inhibitor)인 AG1024의 처리

SM22α를 과발현시킨 폐암 세포주를 분주하고, 상기 폐암 세포가 배양용기 표면에 흡착이 된 후(약 24시간), 무혈청(serum free) 배지로 갈아 준 다음, IGFIR 억제제(inhibitor)인 AG1024 10 μM을 24시간 동안 처리하였다. 상기 세포들을 수거하여 PBS로 2회 세척한 후, 하기 실험에 사용하였다.

<실험예 1> 웨스턴블럿(western blotting)을 이용한 단백질 발현 확인

폐암세포주에서 SM22α 발현양 및 Akt 인산화 정도를 확인하기 위하여, 다양한 조건의 폐암세포에서 웨스턴 블럿 분석법을 수행하였다.

구체적으로, 분석대상 세포들을 수거하여 PBS로 2회 씻어준 후 단백질 분해효소 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail)[2mM AEBSF, 1mM EDTA, 130μM 베스타틴(Bestatin), 1μM 류펩틴(leupeptin), 14μM E-64, 0.3μM 아프로티닌(Aprotinin)]과 탈인산화효소 억제제(phosphatase inhibitor)(Roche)를 포함한 RIPA[0.5M Tris-HCL, pH7.4, 1.5M NaCl, 2.5% 디옥시콜린산(deoxycholic acid), 10% NP-40, 10mM EDTA] 완충용액에 부유(suspension)시키고, 얼음에 20분간 방치한 후, 빠르게 보르텍싱(vortexing)하는 과정을 연속하여 3회 반복하여 세포 분쇄액을 얻었다. 12000 rpm, 4℃에 20분 동안 원심분리하고, 상층액을 수거한 다음, 다시 12000 rpm, 4℃에 20분 동안 원심분리하여 깨끗한 상층액만을 수거하였다. 상기 상층액에 포함된 단백질양은 로우리 방법(Lowry method)으로 정량하였고, 7.5 ~ 12% 아크릴아마이드 겔(acrylamide gel)로 분리하여 PVDF 막에 옮겼다. 단백질이 옮겨진 막에 1차 항체[anti-SM22alpha(abcam), anti-phospho-Ser⁴⁷³ Akt, anti-Akt, anti-phospho-Tyr¹⁰⁶⁸ EGFR, anti-EGFR, β-actin(Cell Signaling Technology), anti-PI 3-kinase p110, anti-PTEN, anti-K-Ras, anti-phospho-Tyr¹¹⁶¹ IGF-1R, anti-IGF-1R(Santa Cruz Biotechnology, Inc)]를 붙인 후 2차 항체[페록시다아제(peroxidase)가 표지되어 있는 IgG에 대한 항체](anti-mouse IgG HRP-linked antibody, anti-rabbit IgG HRP-linked antibody(Cell Signaling Technology), anti-goat IgG HRP-linked antibody(SIGMA)]를 붙인 후 ECL 탐색 키트(detection kit)를 이용하여 단백질 발현정도를 관찰하였다.

우선, 인간 폐암세포주 A549 및 H1299 세포를 무산소(Anoxia)와 1% 저산소(Hypoxia) 조건에서 각각 8, 16 및 24시간 동안 배양시킨 후, 상기 세포를 수거하여 SM22α의 발현량을 웨스턴 블럿으로 분석하였다. 각 분석시료별 단백질량의 보정을 위하여 액틴(actin)의 발현양을 확인하는 과정을 동시에 진행하였다. 그 결과, 상기 두 폐암세포주 모두에서 무산소 또는 1% 저산소 조건이 오래 지속될수록 SM22α의 단백질 발현이 확연히 증가하는 것을 확인하였다(도 1).

또한, 폐암세포주에서 SM22α유전자 발현정도가 Akt의 인산화 패턴에 미치는 영향을 알아보기 위해, 폐암 세포주인 A549 또는 H1299 세포에 E-pcDNA(V.C.) 또는 SM22α유전자 과발현 벡터(pCDNA/SM22α)를 일시적으로 형질도입한 후 세포내 단백질들의 발현을 웨스턴블럿으로 분석하였다. 그 결과, A549 또는 H1299 세포는 기본적으로 SM22α를 어느 정도 발현하고 있는데, 이들 세포에 SM22α과발현 벡터를 도입한 경우 SM22α의 발현양이 3 ~ 4배 이상 증가하였다. 동시에 Akt 인산화 역시 상당히 증가하는 것을 확인하였다. 그러나 Akt 인산화를 조절하는 것으로 알려진 EGFR의 인산화는 SM22α의 발현양에 영향받지 않는 것을 확인하였다. 그 밖에 Akt 인산화와 관련있는 것으로 보고된 단백질들(PI3K-p110, PTEN 및 K-RAS)은 SM22α의 발현증감에 상관없이 동일한 수준의 발현양을 보임을 확인하였다. 반면에 SM22α 유전자의 발현을 억제하는 siRNA 듀플렉스 올리고보뉴클레오티드(si-SM22α)를 형질도입한 경우에는 Akt의 인산화가 크게 감소하였으나 그 이외의 다른 단백질들은 발현양이 변하지 않음을 확인하였다(도 3 및 도 4).

또한, 폐암세포주에서 SM22α유전자 발현정도가 IGF1R의 인산화 패턴에 미치는 영향을 알아보기 위해, 폐암 세포주인 A549 또는 H1299 세포에 E-pcDNA(V.C) 또는 SM22α과발현 벡터(pCDNA/SM22α)를 형질도입한 후 IGF1R의 인산화 패턴의 변화를 웨스턴 블럿으로 확인하였다. 그 결과, 대조군 세포(E-pcDNA(V.C))에 비해 SM22α의 과발현이 IGF1R의 인산화(p-IGF1Rβ)를 증가시킴을 알 수 있었다(도 7).

아울러, 폐암세포주에서 SM22α 과발현 벡터를 형질도입한 세포주와, IGFIR 억제제인 AG1024 처리한 세포주에서 각각 IGF1R 및 AKT의 인산화패턴의 변화를 웨스턴 블럿으로 확인하였다. 그 결과, 대조군 세포(A549 SM22α(+) 및 H1299 SM22α(+))에 대비하여 AG1024를 처리한 경우, IGF1R의 인산화(p-IGF1Rβ)와 AKT의 인산화(p-AKT)가 감소함을 알 수 있었다. IGFIR 억제제인 AG1024를 처리하였을 때 IGF1R의 인산화(p-IGF1Rβ)와 AKT의 인산화(p-AKT)가 확연히 감소하는 것으로 보아, SM22α, p-IGF1Rβ 및 p-AKT간의 신호기작이 밀접하게 연관되어있음을 알 수 있었다(도 10).

<실험예 2> 크리스탈 바이올렛(Crystal Violet) 염색법 및 유동세포 분석법(Flow Cytometry Assay)을 이용한 세포성장률, 세포사멸 및 세포주기 측정

세포사멸 및 세포주기를 분석하기 위해 유동세포 분석법을 수행하였다.

구체적으로, 5×10⁵세포를 차가운 70% 에탄올 500 ㎕로 부유하여 -20℃에 30분간 두어 세포를 고정시키고 원심분리하여 에탄올을 제거한 다음, PBS로 세척하였다. 그 후 프로피디움 아이오다이드(PI, propidium iodide) 염색시약[PBS, pH 7.4, 0.1% Triton X-100, 0.1 mM EDTA, 0.05 mg/ml RNase A(50units/mg), 50 ㎍/ml 프로피디움 아이오다이드] 500 ㎕를 넣어 4℃에서 1시간 염색한 후 분석하였다.

세포성장률 및 생존세포 확인을 알아보기 위해 크리스탈 바이올렛 염색법을 수행하였다. 구체적으로, 24-웰 플레이트(well plate)에 2×10⁴세포를 각각 분주하고, 다음날 SM22α stealth-RNA 후보 3종류 중 가장 효율이 좋은 SM22α-siRNA 듀플렉스 올리고보뉴클레오티드 645번을 Lipofectamine RNAi MAX(invitrogen)을 이용해 형질 도입하였다. 24시간 후 생존 세포수를 트리판 블루(trypan blue)를 이용하여 카운팅(counting)하였고, 48시간 및 72시간도 같은 방법으로 생존 세포수를 확인하였다. 72시간 째 세포를 크리스탈 바이올렛 시약으로 10분 동안 염색한 후 수차례 PBS로 세척한 다음, 현미경으로 관찰하였다.

SM22α의 발현억제에 따른 세포증식의 감소를 알아보기 위해, SM22α-siRNA 듀플렉스 올리고리보뉴클레오티드 후보 프라이머를 세포 내에 도입한 후, 크리스탈 바이올렛 염색법과 유동세포 분석법을 수행하였다. 그 결과, 대조군(Negative control, N.C) 세포와 비교하여, SM22α를 억제시키는 siRNA 듀플렉스 올리고리보뉴클레오티드를 도입한 A549(A549/SM22α-si) 및 H1299(H1299/SM22α-si) 세포에서 세포 증식이 현저하게 억제되는 것을 확인하였다(도 6).

<실험예 3> 스트레스에 대한 폐암세포주의 민감도 분석

스트레스를 처리한 폐암세포주에서 SM22α 발현량의 변화를 알아보기 위해, 세포를 6 웰 플레이트(well plate)에 웰당 1×10⁶세포로 분주하고, 세포기 배양용기 표면에 흡착시킨 후(약 24시간) 시스플라틴(cisplatin) 및 메나디온(Menadione)을 시간별 및 농도별로 처리하였다. 감마방사선 조사는 T25 플라스크에 1×10⁶ 세포로 분주한 후, 다음날 방사선을 조사하였다. 상기 방사선의 선원은 ⁶⁰Co를 이용하였고 총 선량이 20 Gy(선량률 1.333 Gy/min)가 되도록 조사하였다.

SM22α의 과발현이 시스플라틴 및 메나디온 처리, 및 감마방사선 조사에 대한 민감도에 미치는 영향을 알아보기 위해, A549 세포에 E-pcDNA(V.C.)를 형질도입한 세포 및 SM22α를 과발현시키는 발현벡터(pcDNA3.1/SM22α)를 형질도입한 세포(A549/SM22α(+))에 무처리, 시스플라틴 240 uM을 6시간 처리, 메나디온 100 uM을 24시간 처리, 및 20 Gy의 감마방사선을 72시간 조사한 후 DNA 프로피디움 아이오다이드로 염색한 다음, 상기 <실험예 2>와 같은 유동세포 분석을 실시하여 세포사멸 정도를 측정하였다. 그 결과, 각 스트레스원을 처리하지 않은 상태에서는 자연적인 세포사멸이 0.6%로, 대조군(V.C.)에서는 2.0%가 자연적인 세포사멸하였던 것에 비해 SM22α 과발현 세포에서는 세포사멸이 현저하게 감소하였다.

또한, SM22α의 발현억제가 시스플라틴 및 메나디온 처리, 및 감마방사선 조사에 대한 민감도에 미치는 영향을 알아보기 위해, A549 세포에 SM22α의 발현을 억제시키는 siRNA 듀플렉스 올리고리보뉴클레오티드를 도입한 A549(A549/SM22α-si) 세포에 무처리, 시스플라틴 240 uM을 6시간 처리, 메나디온 200 uM을 6시간 처리, 및 20 Gy의 감마방사선을 48시간 조사한 후 DNA 프로피디움 아이오다이드로 염색한 다음, 상기 <실험예 2>와 같은 유동세포 분석을 실시하여 세포사멸 정도를 측정하였다. 그 결과, 대조군(si-Control) 세포에 비해 SM22α siRNA를 형질도입한 경우에서 자연적인 세포사멸이 5.5%까지 증가하였다. 즉, SM22α가 과발현된 경우에는 세포사멸이 감소하였고, SM22α의 발현이 감소한 경우에는 세포사멸이 증가하였음을 확인할 수 있었다. 이는 SM22α의 발현억제가 폐암세포에서 시스플란틴 처리, 메나디온 처리, 또는 감마방사선 조사에 의한 세포사멸을 더 효과적으로 유도하는 것을 알 수 있다(도 5).

<실험예 4> SM22α와 IGF1Rβ의 직접적인 상호작용 여부 분석

SM22α의 과발현에 의해 인산화가 증가하였던 IGF1Rβ가 SM22α와 직접적인 상호작용을 하는지의 여부를 알아보기 위하여, IGF1Rβ에 대한 면역침강법(immunoprecipitation)을 실시하여 분석하였다.

구체적으로, 4×10⁷개의 세포를 수거하여 PBS로 2회 세척한 후, 단백질 분해효소 억제제 칵테일[2 mM AEBSF, 1 mM EDTA, 130 μM 베스타틴(Bestatin), 1 μM 레우펩틴(leupeptin), 14 μM E-64, 0.3 μM 아프로티닌(Aprotinin)]과 탈인산가수분해효소 억제제(Roche)를 포함한 NP-40 용해 완충용액(lysis buffer)(20 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 10% 글리세롤)로 부유한 세포를, 4℃ 챔버에서 회전자(rotator)에 끼워 30분간 돌려주었다(C1, 25 rpm). 13000 rpm, 4℃에 10분 동안 원심분리하고, 상층액을 수거한 다음, 다시 12000 rpm, 4℃에 10분 동안 원심분리하여 깨끗한 상층액만을 수거하였다. 단백질을 로우리 방법(Lowry method)으로 정량한 뒤, 세포파쇄물 데이타(cell lysate data)로 사용할 단백질은 따로 샘플링(sampling)하여 -80℃에 보관해놓고, 면역침강에 사용할 단백질은 500 ㎍ 이상/700 ~ 1000 ㎕으로 덜고 총 1 ml이 되도록 나머지는 용해 완충용액으로 채웠다. 여기에 면역침강용 항체를 단백질 100 ~ 500 ㎍ 당 1 ~ 2 ㎍씩 넣고 4℃ 챔버에서 회전자에 끼워 2시간 이상 또는 밤새 돌려주었다(C1, 10 rpm). 그런 다음 단백질 A 비드(Protein A beads)(Pierce)를 약 30 ~ 50 ㎕ 넣고 1 ~ 2시간 4℃ 챔버에서 회전자로 돌려주었다. NP-40 용해 완충용액으로 1200 rpm, 3 min, 4℃씩 3회에 걸쳐 세척하였다. 세척 후에는 잔여 완충액을 완전히 제거하고 5×샘플 완충용액(sample buffer)을 20 ㎕ 넣고 끓였다. 얼음에서 식힌 후 원심분리기로 2분간 돌린 후, 상층액만 따서 7.5 ~ 12% SDS-PAGE 법으로 분리하였다. 겔(gel)은 다시 PVDF 멤브레인으로 블럿하고, 단백질이 옮겨진 멤브레인에 1차 항체를 붙인 후 2차 항체[페록시다아제(peroxidase)가 표지되어 있는 IgG에 대한 항체]를 붙인 후 ECL 탐색 키트(detection kit)로 관찰하였다.

우선, 세포파쇄물로 확인한 SM22α 발현량은 A549 세포에 E-pcDNA(V.C.)를 형질도입한 세포에 비해 SM22α를 과발현시키는 발현벡터를 도입한 세포(SM22α(+)72h 또는 SM22α(+)H1) 모두 SM22α의 발현이 3 ~ 4배 이상 증가된 것을 확인할 수 있었다. H1299의 경우도 마찬가지로 SM22α의 발현이 대조군에 비해 현저하게 증가되었다.

또한, 이들에 면역침강용 항-IGF1Rβ 항체를 첨가하여 IGF1Rβ를 잡고 상기 단백질과 함께 SM22α이 검출되는지를 확인하였다. 그 결과, IGF1Rβ가 SM22α와 세포 내에서 연합체로 존재하며, 비변성 조건(nondenaturing condition)의 조건에서 IGF1Rβ를 SM22α에 대한 특이적 결합 항체로 농축할 경우 같은 분획으로 움직임을 확인할 수 있었다. SM22α를 과발현시키지 않은 경우에도 H1299보다 SM22α의 발현량이 큰 A549의 경우에는 소량의 SM22α가 IGF1Rβ 농축 분획에서 검출되었으며, SM22α를 과발현시킨 경우에는 훨씬 많은 양의 SM22α가 확인되었다(도 8).

또한, SM22α의 발현 억제에 의해 IGF1Rβ와 SM22α의 직접적인 상호작용이 사라지는지의 여부를 확인하기 위하여, IGF1Rβ에 대한 면역침강법을 실시한 후 SM22α를 확인하였다. 먼저, 세포파쇄물(cell lysate)로 확인한 SM22α 발현량은 H1299 SM22(+)B2에 비하여 SM22α를 발현억제시킨 경우(SM22αsiRNA 645) SM22α의 발현이 확연히 감소된 상태임을 확인할 수 있었다. 이들에 대하여 면역침강용 항-IGF1Rβ 항체를 첨가하여 IGF1Rβ를 잡고 이 단백질과 함께 SM22α이 검출되는지를 확인하였다. 그 결과, SM22α를 과발현시킨 경우(H1299 SM22(+)B2)에는 IGF1Rβ가 SM22α와 세포내에서 연합체로 존재하며 비변성 조건(nondenaturing condition)의 조건에서 IGF1Rβ를 이에 대한 특이결합 항체로 농축할 경우 같은 분획으로 움직임을 확인할 수 있었다. 그러나 SM22α를 발현억제시킨 경우(SM22αsiRNA 645), IGF1Rβ 농축분획에서 SM22α가 거의 검출되지 않는 것이 확인되었고, H1299 SM22(+)B2에 비하여 SM22α를 발현억제시킨 경우(SM22αsiRNA 645) AKT의 인산화가 확연히 감소된 상태임을 확인할 수 있었다(도 11).

아울러, SM22α 유전자의 점 돌연변이(point mutation)에 의해 IGF1Rβ와 SM22α의 직접적인 상호작용뿐만 아니라 AKT의 인산화도 일어나지 않음을 하였다. 구체적으로, SM22α 유전자에서, 470번째 염기서열 A를 G로 변경하여 AAG가 GAG로 바뀌면서 아미노산 서열이 라이신(Lysine)(Lys, K)에서 글루탐산(Glutamic acid)(Glu, E)으로 변경하였다. 상기 점 돌연변이에 의하여 SM22α의 본래 기능이 사라졌음을 확인하였다. 상기 점 돌연변이가 일어난 SM22α(+) DNA로 transient transfection을 수행한 뒤, IGF1Rβ에 대한 면역침강법을 실시하였다. 면역침강용 항-IGF1Rβ 항체를 첨가하여 IGF1Rβ를 잡고 이 단백질과 함께 SM22α이 검출되는지를 확인하였다. 그 결과, SM22α 점 돌연변이된 DNA을 과발현시킨 경우(SM22(+)mutation)에는 IGF1Rβ가 SM22α와 세포내에서 연합체로 존재하지 않으며 비변성 조건(nondenaturing condition)에서 IGF1Rβ를 이에 대한 특이결합항체로 농축할 경우 같은 분획으로 움직이지 않으며, AKT의 인산화와 IGF1Rβ의 인산화가 일어나지 않음을 확인할 수 있었다(도 12 및 도 13).

<실험예 5> SM22α단백질의 발현과 Ras GTPase 활성화의 연관성 분석

SM22α단백질의 발현과 Ras GTPase 활성화의 연관성을 알아보기 위하여, SM22α 과발현 세포에서 Ras GTPase 활성을 측정하였다. 구체적으로, Ras GTPase 활성은 Upstate에서 판매하는 Ras GTPase Activity ELISA Kit를 사용하여 측정하였다. 약 85 ~ 90% 세포가 플레이트된 10 cm 디쉬에서 배지를 제거한 후, 차가운 PBS로 2번 세척하였다. 1× Mg²⁺ 용해/세척 완충용액(Lysis/Wash buffer) 9.87 ml와 단백질 분해효소 억제제 130 ㎕[1 ㎍/㎕의 류펩틴(leupeptin) 10 ㎕, 1 ㎍/㎕의 아프로티닌(Aprotinin) 10 ㎕, 1 ㎍/㎕ 펩스타틴(Pepstatin) 10 ㎕, 100 mM PMSF 100 ㎕]가 포함된 용해/세척 완충용액 500 μl를 디쉬에 첨가하고 세포를 긁어내었다. 1.5 ml의 튜브로 옮겨 얼음에 15분간 반응시킨 후, 10초 동안 볼텍싱(vortexing)하고, 10초 동안 초음파 분해(sonication)한 다음, 14000 rpm, 10분, 4℃에서 원심분리하여 상층액만 거두어 얻은 단백질을 로우리 방법(Lowry method)으로 정량하였다. 96 웰(glutathione well)을 PBST 세척 완충용액 200 ㎕로 2회 세척한 후, 각 웰에 결합/억제 완충용액(binding/blocking buffer) 49 ㎕, 2 ㎍/㎕의 Raf-1-RBD 1 ㎕을 섞어 총 50 ㎕를 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척 완충용액 200 ㎕ 넣고 60초 동안 흔들었다가 버리고, 200 ㎕ 넣고 2분 동안 흔들었다가 버리고, 200 ㎕ 넣고 3분 동안 흔들었다가 버리고, 200 ㎕ 넣고 4분 동안 흔들었다가 버렸다. 2.5 mg/ml의 HeLa+EGF 자극 세포 추출액(stimulated cell extract) 10 ㎕와 결합/억제 완충용액 40 ㎕를 양성 대조군(positive control)으로 사용하고, Raf-1-RBD로 코팅된 웰에 결합/억제 완충용액만 50 ㎕ 처리한 것을 음성 대조군(Negative control)으로 사용하였다. 각 웰에 세포 파쇄물을 각각 총 10 ~ 100 ㎍씩 넣고 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들면서 반응시켰다. 상기와 동일하게 세척 완충용액으로 반응하지 않은 단백질들을 세척하였다. 1차 항체 용액(primary antibody solution) 50 ㎕를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들면서 반응시켰다. 다시 반응하고 남은 성분들을 상기와 동일한 과정으로 세척한 후 2차 항체 용액(secondary antibody solution) 50 ㎕를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들면서 반응시켰다. 다시 동일한 세척과정을 실시하고 마지막에 최종 세척 완충용액(final wash buffer)을 사용하여 tween-20을 제거하였다. 반응 완충용액(reaction buffer)과 탐색 시료(detection reagent)를 2 : 1로 실온에서 1 ~ 5분간 섞은 화학발광기질(chemiluminescent substrate)을 각 웰마다 50 ㎕씩 첨가하고 50 ~ 60분 내에 루미노미터(luminometer)로 측정하였다.

우선, A549에 SM22α를 일시적으로 과발현시킨 세포(SM22α(+)72h)와 H1299에 SM22α를 과발현시킨 발현이 안정된 세포주(stable cell line)로 구축된 SM22α(+)B2 세포주의 cDNA에 대해 마이크로어레이(microarray)로 분석하였다. 그 결과, 대조군에 비해 상기 두 세포주 모두에서 RasAL1(Ras protein activator like 1) 유전자의 발현이 현저하게 증가한 것을 확인하였다.

또한, RasAL1 유전자 발현의 증가가 암세포의 특징 중에 하나인 Ras GTPase 활성에 영향을 미치는지 알아보기 위하여, 각 세포주에서의 Ras GTPase 활성을 측정하였다. 그 결과, H1299 세포의 경우에는 대조군 세포와 비교하여 H1299/SM22α(+)B1, B2, A1에서 Ras GTPase 활성이 약 2배 정도 증가된 것을 확인하였다. 마찬가지로 A549 세포의 경우에도 대조군 세포와 비교하여 SM22α를 과발현시킨 SM22α(+)96h에서 Ras GTPase 활성이 증가된 것을 확인하였다. 따라서, SM22α의 과발현이 Ras GTPase를 활성화시킨다는 것을 알 수 있다(도 9).

본 발명의 스크리닝 방법은 항암제 또는 방사선 등의 DNA 손상인자에 대한 암세포, 특히 폐암세포의 민감도를 증진시켜 암세포의 세포사멸 효과를 극대화시키는 물질을 선별함으로써 방사선요법 또는 화학요법에 병행하여 항암보조제로 사용함으로써 효과적인 항암치료가 가능하다.

도 1은 폐암세포주인 A549 및 H1299 세포를 무산소(Anoxia) 및 1% 저산소(Hypoxia) 조건에서 각각 8, 16 및 24시간 동안 배양시킨 후, 세포를 수거하여 SM22α의 발현량을 웨스턴 블럿팅으로 확인한 결과를 나타내는 그림이다.

도 2는 폐암세포주인 A549 및 H1299 세포에 도입할 SM22α 발현벡터의 제조과정을 나타내는 그림이다.

도 3은 폐암 세포주인 A549에 E-pcDNA(V.C.) 또는 SM22α 유전자 과발현 벡터(pCDNA/SM22α)를 일시적으로 형질도입한 경우, 및 siRNA 듀플렉스 올리고보뉴클레오티드(duplex oligoribonucleotides)(si-SM22α)를 형질도입한 경우에 세포의 여러 단백질의 발현을 웨스턴블럿으로 분석한 결과를 나타내는 그림이다.

도 4는 폐암 세포주인 H1299 세포에 E-pcDNA(V.C.) 또는 SM22α 유전자 과발현 벡터(pCDNA/SM22α)를 일시적으로 형질도입한 후 세포의 여러 단백질의 발현을 웨스턴블럿으로 분석한 결과를 나타내는 그림이다.

도 5는 SM22α의 발현이 시스플란틴(Cisplatin) 처리, 메나디온(Menadione) 처리, 및 감마방사선 조사 등의 스트레스환경에 대한 세포사멸의 정도에 미치는 영향을 조사하기 위해, 상기 각각의 스트레스 조건을 제시된 시간 및 농도별로 처리하고 DNA 염색시약인 프로피디움 아이오드(propidium iodide)로 염색한 뒤 유세포 분석법으로 분석한 세포사멸 및 세포주기의 변화를 나타내는 그림이다.

도 6은 SM22α의 발현억제에 따른 세포증식의 감소를 알아보기 위하여, SM22α-siRNA 듀플렉스 올리고보뉴클레오티드 후보 프라이머를 세포 내에 도입한 후, 크리스탈 바이올렛(crystal violet) 염색법을 통한 살아 있는 세포수를 나타내는 그림, 및 세포성장곡선[X축: 시간(hour), Y축: 세포수(×10⁴/24 웰)]을 나타내는 그래프이다.

도 7은 폐암세포주인 A549 및 H1299 세포에 E-pcDNA(V.C)와 SM22α과발현 벡터를 각각 형질도입한 후, IGF1R의 인산화 패턴의 변화를 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타내는 그림이다.

도 8은 SM22α의 과발현에 의해 인산화가 증가하였던 IGF1Rβ가 SM22α와 직접적인 상호작용을 하는지의 여부를 알아보기 위해, IGF1Rβ에 대한 면역침강법(immunoprecipitation)을 실시하고 SM22α를 확인한 결과를 나타내는 그림이다.

도 9는 SM22α 단백질의 발현과 Ras GTPase 활성화의 연관성을 알아보기 위해, SM22α 과발현 세포에서 Ras GTPase 활성을 측정한 결과를 나타내는 그림이다.

도 10은 폐암세포주인 A549 및 H1299 세포에 SM22α과발현 벡터를 형질도입한 세포주와, IGFIR 억제제인 AG1024 처리한 세포주에서 각각 IGF1R과 AKT의 인산화패턴의 변화를 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타내는 그림이다.

도 11는 도 8과 반대로, SM22α의 발현억제에 의해 IGF1Rβ와 SM22α의 직접적인 상호작용이 사라지는지의 여부를 확인하기 위하여, SM22α를 발현억제시킨 후 IGF1Rβ에 대한 면역침강법을 실시하여 SM22α의 검출 정도 및 AKT의 인산화 정도를 확인한 결과를 나타내는 그림이다.

도 12는 SM22α의 전체 염기서열에서, 470번째 염기서열 A를 G로 변경한 점 돌연변이(point mutation)의 염기서열을 나타내는 그림이다.

도 13은 SM22α 유전자의 점 돌연변이에 의해 IGF1Rβ와 SM22α의 직접적인 상호작용뿐만 아니라 AKT의 인산화도 일어나지 않음을 확인하기 위해, SM22α 유전자의 470번째 염기서열 A를 G로 변경하여 점 돌연변이가 일어난 SM22α(+) DNA로 transient transfection을 수행한 뒤, IGF1Rβ에 대한 면역침강법을 실시하여 SM22α의 검출 정도 및 AKT의 인산화 정도를 확인한 결과를 나타내는 그림이다.

도 14는 본 발명에서 확인한 SM22α 단백질의 AKT 인산화/활성화 과정의 내용을 총괄한 것으로서, SM22α단백질이 과발현되어 스트레스에 대한 저항성이 유도되는 경우에 AKT 단백질의 인산화/활성화를 유도하는 과정이 IGF1R의 활성화를 경유하고 RasGTPase 활성도 증가시키고 있음을 제시하는 그림이다.

<110> Korea Atomic Energy Research Institute <120> Method for screening an enhancer of chemical sensitivity or radiosensitivity of cancer cells <130> 8p-10-25 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 201 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Asn Lys Gly Pro Ser Tyr Gly Met Ser Arg Glu Val Gln Ser 1 5 10 15 Lys Ile Glu Lys Lys Tyr Asp Glu Glu Leu Glu Glu Arg Leu Val Glu 20 25 30 Trp Ile Ile Val Gln Cys Gly Pro Asp Val Gly Arg Pro Asp Arg Gly 35 40 45 Arg Leu Gly Phe Gln Val Trp Leu Lys Asn Gly Val Ile Leu Ser Lys 50 55 60 Leu Val Asn Ser Leu Tyr Pro Asp Gly Ser Lys Pro Val Lys Val Pro 65 70 75 80 Glu Asn Pro Pro Ser Met Val Phe Lys Gln Met Glu Gln Val Ala Gln 85 90 95 Phe Leu Lys Ala Ala Glu Asp Tyr Gly Val Ile Lys Thr Asp Met Phe 100 105 110 Gln Thr Val Asp Leu Phe Glu Gly Lys Asp Met Ala Ala Val Gln Arg 115 120 125 Thr Leu Met Ala Leu Gly Ser Leu Ala Val Thr Lys Asn Asp Gly His 130 135 140 Tyr Arg Gly Asp Pro Asn Trp Phe Met Lys Lys Ala Gln Glu His Lys 145 150 155 160 Arg Glu Phe Thr Glu Ser Gln Leu Gln Glu Gly Lys His Val Ile Gly 165 170 175 Leu Gln Met Gly Ser Asn Arg Gly Ala Ser Gln Ala Gly Met Thr Gly 180 185 190 Tyr Gly Arg Pro Arg Gln Ile Ile Ser 195 200 <210> 2 <211> 1367 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Lys Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Ser Leu Trp Gly Leu 1 5 10 15 Leu Phe Leu Ser Ala Ala Leu Ser Leu Trp Pro Thr Ser Gly Glu Ile 20 25 30 Cys Gly Pro Gly Ile Asp Ile Arg Asn Asp Tyr Gln Gln Leu Lys Arg 35 40 45 Leu Glu Asn Cys Thr Val Ile Glu Gly Tyr Leu His Ile Leu Leu Ile 50 55 60 Ser Lys Ala Glu Asp Tyr Arg Ser Tyr Arg Phe Pro Lys Leu Thr Val 65 70 75 80 Ile Thr Glu Tyr Leu Leu Leu Phe Arg Val Ala Gly Leu Glu Ser Leu 85 90 95 Gly Asp Leu Phe Pro Asn Leu Thr Val Ile Arg Gly Trp Lys Leu Phe 100 105 110 Tyr Asn Tyr Ala Leu Val Ile Phe Glu Met Thr Asn Leu Lys Asp Ile 115 120 125 Gly Leu Tyr Asn Leu Arg Asn Ile Thr Arg Gly Ala Ile Arg Ile Glu 130 135 140 Lys Asn Ala Asp Leu Cys Tyr Leu Ser Thr Val Asp Trp Ser Leu Ile 145 150 155 160 Leu Asp Ala Val Ser Asn Asn Tyr Ile Val Gly Asn Lys Pro Pro Lys 165 170 175 Glu Cys Gly Asp Leu Cys Pro Gly Thr Met Glu Glu Lys Pro Met Cys 180 185 190 Glu Lys Thr Thr Ile Asn Asn Glu Tyr Asn Tyr Arg Cys Trp Thr Thr 195 200 205 Asn Arg Cys Gln Lys Met Cys Pro Ser Thr Cys Gly Lys Arg Ala Cys 210 215 220 Thr Glu Asn Asn Glu Cys Cys His Pro Glu Cys Leu Gly Ser Cys Ser 225 230 235 240 Ala Pro Asp Asn Asp Thr Ala Cys Val Ala Cys Arg His Tyr Tyr Tyr 245 250 255 Ala Gly Val Cys Val Pro Ala Cys Pro Pro Asn Thr Tyr Arg Phe Glu 260 265 270 Gly Trp Arg Cys Val Asp Arg Asp Phe Cys Ala Asn Ile Leu Ser Ala 275 280 285 Glu Ser Ser Asp Ser Glu Gly Phe Val Ile His Asp Gly Glu Cys Met 290 295 300 Gln Glu Cys Pro Ser Gly Phe Ile Arg Asn Gly Ser Gln Ser Met Tyr 305 310 315 320 Cys Ile Pro Cys Glu Gly Pro Cys Pro Lys Val Cys Glu Glu Glu Lys 325 330 335 Lys Thr Lys Thr Ile Asp Ser Val Thr Ser Ala Gln Met Leu Gln Gly 340 345 350 Cys Thr Ile Phe Lys Gly Asn Leu Leu Ile Asn Ile Arg Arg Gly Asn 355 360 365 Asn Ile Ala Ser Glu Leu Glu Asn Phe Met Gly Leu Ile Glu Val Val 370 375 380 Thr Gly Tyr Val Lys Ile Arg His Ser His Ala Leu Val Ser Leu Ser 385 390 395 400 Phe Leu Lys Asn Leu Arg Leu Ile Leu Gly Glu Glu Gln Leu Glu Gly 405 410 415 Asn Tyr Ser Phe Tyr Val Leu Asp Asn Gln Asn Leu Gln Gln Leu Trp 420 425 430 Asp Trp Asp His Arg Asn Leu Thr Ile Lys Ala Gly Lys Met Tyr Phe 435 440 445 Ala Phe Asn Pro Lys Leu Cys Val Ser Glu Ile Tyr Arg Met Glu Glu 450 455 460 Val Thr Gly Thr Lys Gly Arg Gln Ser Lys Gly Asp Ile Asn Thr Arg 465 470 475 480 Asn Asn Gly Glu Arg Ala Ser Cys Glu Ser Asp Val Leu His Phe Thr 485 490 495 Ser Thr Thr Thr Ser Lys Asn Arg Ile Ile Ile Thr Trp His Arg Tyr 500 505 510 Arg Pro Pro Asp Tyr Arg Asp Leu Ile Ser Phe Thr Val Tyr Tyr Lys 515 520 525 Glu Ala Pro Phe Lys Asn Val Thr Glu Tyr Asp Gly Gln Asp Ala Cys 530 535 540 Gly Ser Asn Ser Trp Asn Met Val Asp Val Asp Leu Pro Pro Asn Lys 545 550 555 560 Asp Val Glu Pro Gly Ile Leu Leu His Gly Leu Lys Pro Trp Thr Gln 565 570 575 Tyr Ala Val Tyr Val Lys Ala Val Thr Leu Thr Met Val Glu Asn Asp 580 585 590 His Ile Arg Gly Ala Lys Ser Glu Ile Leu Tyr Ile Arg Thr Asn Ala 595 600 605 Ser Val Pro Ser Ile Pro Leu Asp Val Leu Ser Ala Ser Asn Ser Ser 610 615 620 Ser Gln Leu Ile Val Lys Trp Asn Pro Pro Ser Leu Pro Asn Gly Asn 625 630 635 640 Leu Ser Tyr Tyr Ile Val Arg Trp Gln Arg Gln Pro Gln Asp Gly Tyr 645 650 655 Leu Tyr Arg His Asn Tyr Cys Ser Lys Asp Lys Ile Pro Ile Arg Lys 660 665 670 Tyr Ala Asp Gly Thr Ile Asp Ile Glu Glu Val Thr Glu Asn Pro Lys 675 680 685 Thr Glu Val Cys Gly Gly Glu Lys Gly Pro Cys Cys Ala Cys Pro Lys 690 695 700 Thr Glu Ala Glu Lys Gln Ala Glu Lys Glu Glu Ala Glu Tyr Arg Lys 705 710 715 720 Val Phe Glu Asn Phe Leu His Asn Ser Ile Phe Val Pro Arg Pro Glu 725 730 735 Arg Lys Arg Arg Asp Val Met Gln Val Ala Asn Thr Thr Met Ser Ser 740 745 750 Arg Ser Arg Asn Thr Thr Ala Ala Asp Thr Tyr Asn Ile Thr Asp Pro 755 760 765 Glu Glu Leu Glu Thr Glu Tyr Pro Phe Phe Glu Ser Arg Val Asp Asn 770 775 780 Lys Glu Arg Thr Val Ile Ser Asn Leu Arg Pro Phe Thr Leu Tyr Arg 785 790 795 800 Ile Asp Ile His Ser Cys Asn His Glu Ala Glu Lys Leu Gly Cys Ser 805 810 815 Ala Ser Asn Phe Val Phe Ala Arg Thr Met Pro Ala Glu Gly Ala Asp 820 825 830 Asp Ile Pro Gly Pro Val Thr Trp Glu Pro Arg Pro Glu Asn Ser Ile 835 840 845 Phe Leu Lys Trp Pro Glu Pro Glu Asn Pro Asn Gly Leu Ile Leu Met 850 855 860 Tyr Glu Ile Lys Tyr Gly Ser Gln Val Glu Asp Gln Arg Glu Cys Val 865 870 875 880 Ser Arg Gln Glu Tyr Arg Lys Tyr Gly Gly Ala Lys Leu Asn Arg Leu 885 890 895 Asn Pro Gly Asn Tyr Thr Ala Arg Ile Gln Ala Thr Ser Leu Ser Gly 900 905 910 Asn Gly Ser Trp Thr Asp Pro Val Phe Phe Tyr Val Gln Ala Lys Thr 915 920 925 Gly Tyr Glu Asn Phe Ile His Leu Ile Ile Ala Leu Pro Val Ala Val 930 935 940 Leu Leu Ile Val Gly Gly Leu Val Ile Met Leu Tyr Val Phe His Arg 945 950 955 960 Lys Arg Asn Asn Ser Arg Leu Gly Asn Gly Val Leu Tyr Ala Ser Val 965 970 975 Asn Pro Glu Tyr Phe Ser Ala Ala Asp Val Tyr Val Pro Asp Glu Trp 980 985 990 Glu Val Ala Arg Glu Lys Ile Thr Met Ser Arg Glu Leu Gly Gln Gly 995 1000 1005 Ser Phe Gly Met Val Tyr Glu Gly Val Ala Lys Gly Val Val Lys Asp 1010 1015 1020 Glu Pro Glu Thr Arg Val Ala Ile Lys Thr Val Asn Glu Ala Ala Ser 1025 1030 1035 1040 Met Arg Glu Arg Ile Glu Phe Leu Asn Glu Ala Ser Val Met Lys Glu 1045 1050 1055 Phe Asn Cys His His Val Val Arg Leu Leu Gly Val Val Ser Gln Gly 1060 1065 1070 Gln Pro Thr Leu Val Ile Met Glu Leu Met Thr Arg Gly Asp Leu Lys 1075 1080 1085 Ser Tyr Leu Arg Ser Leu Arg Pro Glu Met Glu Asn Asn Pro Val Leu 1090 1095 1100 Ala Pro Pro Ser Leu Ser Lys Met Ile Gln Met Ala Gly Glu Ile Ala 1105 1110 1115 1120 Asp Gly Met Ala Tyr Leu Asn Ala Asn Lys Phe Val His Arg Asp Leu 1125 1130 1135 Ala Ala Arg Asn Cys Met Val Ala Glu Asp Phe Thr Val Lys Ile Gly 1140 1145 1150 Asp Phe Gly Met Thr Arg Asp Ile Tyr Glu Thr Asp Tyr Tyr Arg Lys 1155 1160 1165 Gly Gly Lys Gly Leu Leu Pro Val Arg Trp Met Ser Pro Glu Ser Leu 1170 1175 1180 Lys Asp Gly Val Phe Thr Thr Tyr Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val 1185 1190 1195 1200 Val Leu Trp Glu Ile Ala Thr Leu Ala Glu Gln Pro Tyr Gln Gly Leu 1205 1210 1215 Ser Asn Glu Gln Val Leu Arg Phe Val Met Glu Gly Gly Leu Leu Asp 1220 1225 1230 Lys Pro Asp Asn Cys Pro Asp Met Leu Phe Glu Leu Met Arg Met Cys 1235 1240 1245 Trp Gln Tyr Asn Pro Lys Met Arg Pro Ser Phe Leu Glu Ile Ile Ser 1250 1255 1260 Ser Ile Lys Glu Glu Met Glu Pro Gly Phe Arg Glu Val Ser Phe Tyr 1265 1270 1275 1280 Tyr Ser Glu Glu Asn Lys Leu Pro Glu Pro Glu Glu Leu Asp Leu Glu 1285 1290 1295 Pro Glu Asn Met Glu Ser Val Pro Leu Asp Pro Ser Ala Ser Ser Ser 1300 1305 1310 Ser Leu Pro Leu Pro Asp Arg His Ser Gly His Lys Ala Glu Asn Gly 1315 1320 1325 Pro Gly Pro Gly Val Leu Val Leu Arg Ala Ser Phe Asp Glu Arg Gln 1330 1335 1340 Pro Tyr Ala His Met Asn Gly Gly Arg Lys Asn Glu Arg Ala Leu Pro 1345 1350 1355 1360 Leu Pro Gln Ser Ser Thr Cys 1365 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HindIII forward primer for SM22 alpha <400> 3 agcttaagct tgacatggcc aacaag 26 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BamHI reverse primer for SM22 alpha <400> 4 gcggatcctc tccgctctaa ctg 23 <210> 5 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siSM22 alpha duplex oligoribonucleotide <400> 5 uucuucauaa accaguuggg aucuc 25 <210> 6 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siSM22 alpha duplex oligoribonucleotide <400> 6 gagaucccaa cugguuuaug aagaa 25

Claims

3) 상기 결합 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 암세포의 화합물 또는 방사선에 대한 민감도를 증진시키는 물질의 스크리닝 방법.

제 1항에 있어서, 상기 단계 1)의 SM22α 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지고, IGF1Rβ 단백질은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.

제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 결합 수준은 이스트 투 하이브리드법(Yeast two-hybrid), 표면 플라스몬 공명법(Surface Plasmon Resonance, SPR), 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는 스크리 닝 방법.

1) SM22α 단백질 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;

3) 상기 단계 2)의 IGF1Rβ 단백질의 인산화 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 암세포의 화합물 또는 방사선에 대한 민감도를 증진시키는 물질의 스크리닝 방법.

제 4항에 있어서, 상기 SM22α 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지고, IGF1Rβ 단백질은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.

제 4항에 있어서, 상기 단계 2)의 IGF1Rβ 단백질의 인산화 수준은 인산화된 IGF1Rβ 단백질에 특이적인 방사선 동위원소 또는 항체를 이용한 분석법을 통해 측정되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.

제 6항에 있어서, 상기 분석법은 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 수행되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.

1) SM22α 단백질 과발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 상기 세포주에서 Ras GTPase 활성 수준을 측정하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 Ras GTPase 활성 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 암세포의 화합물 또는 방사선에 대한 민감도를 증진시키는 물질의 스크리닝 방법.

제 8항에 있어서, 상기 SM22α 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.

제 8항에 있어서, 상기 단계 2)의 Ras GTPase 활성 수준은 활성화된 Ras GTPase에 특이적인 방사선 동위원소 또는 항체를 이용한 분석법을 통해 측정되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.

제 10항에 있어서, 상기 분석법은 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 수행되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.

1) SM22α 단백질 과발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 상기 세포주에서 Akt 인산화 수준을 측정하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 Akt 인산화 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 암세포의 화합물 또는 방사선에 대한 민감도를 증진시키는 물질의 스크리닝 방법.

제 12항에 있어서, 상기 SM22α 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.

제 12항에 있어서, 상기 단계 2)의 Akt 인산화 수준은 인산화된 Akt 단백질 에 특이적인 동위원소 또는 항체를 이용한 분석법을 통해 측정되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.

제 14항에 있어서, 상기 분석법은 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 수행되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.

제 1항, 제 4항, 제 8항 또는 제 12항에 있어서, 상기 암세포는 폐암세포인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.

제 1항, 제 4항, 제 8항 또는 제 12항에 있어서, 상기 화합물은 시스플라틴(cisplatin) 또는 메나디온(Menadione)인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.

제 1항, 제 4항, 제 8항 또는 제 12항에 있어서, 상기 방사선은 감마 방사선인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.