KR20100066675A - 4-헥실레조르시놀-1,3-디올을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 4-헥실레조르시놀-1,3-디올(4-hexylresorcinol-1,3-diol)을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항암용 조성물의 유효성분인 4-헥실레조르시놀-1,3-디올(4-hexylresorcinol-1,3-diol)은 세포 수준에서 암세포의 증식을 억제하고 암세포의 아폽토시스 및 분화를 촉진할 뿐만 아니라, 암세포가 이식된 이종이식 동물모델 및 암환자 대상 임상실험에서 종양의 성장을 현저히 억제하는 효능을 나타낸다. 본 발명의 항암용 조성물은 다양한 암세포에 대해 현저한 증식억제 활성을 나타냄으로써 매우 우수한 성능의 항암제로 개발될 수 있다.

4-헥실레조르시놀, Scc-9 세포, 아폽토시스, 항암용 약물

Description

4-헥실레조르시놀-1,3-디올을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물{Composition for Treating or Preventing Cancer Comprising 4-hexylresorcinol-1,3-diol as an Active Ingredient}

본 발명은 4-헥실레조르시놀-1,3-디올(4-hexylresorcinol-1,3-diol)을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다.

다양한 종류의 식물체 및 세균종에서 발견되는 천연 비-이소프레노이드(non-isoprenoid) 지질류인 알킬레조르시놀류(alkylresorcinols)는 비특이적 항-산화제, 항-돌연변이제 및 증식 조절분자로서의 기능(1)을 포함하는 여러 가지 생물학적 기능 때문에 주목을 받아왔다. 상기 지질류의 화학적 유사체들은 명확한 작용기전은 밝혀지지 않았으나 대장암(2), 폐암(3), 췌장암(4), 단핵세포 백혈병, 간암세포신생물 및 순환계 종양에 대한 동물모델에서 항암효능을 발휘하는 것으로 보고되고 있다.

OSCC (Oral Squamous Cell Carcinoma, 구강편평상피세포암)는 일반적인 악성 암의 한 종류인데 최근 고효능 암치료제의 개발에도 불구하고 수십년간 완치율이 향상되지 않았다(6). OSCC의 약물 내성은 OSCC의 이종(heterogeneous) 세포군에 의해 설명될 수 있고, 이는 구역 종양화(field cancerization) 이론과 관련있다(7). 특정의 약물이 활동적으로 증식하는 암세포의 아폽토시스(apoptosis)를 유도하고 아폽토시스를 피한 암세포의 재분화를 유도하는 것과 같은 두가지 기능을 동시에 갖는다면, 이종 OSCC에서의 치료 효과는 분명히 향상될 것이다. 따라서, OSCC의 완치율을 향상시키기 위해 암 분화를 유도함으로써 암을 억제할 수 있는 복귀변이(revertant)유도 화합물을 개발할 필요성이 요구된다.

종양세포에 대한 4-헥실레조르시놀-1,3-디올(4-hexylresorcinol-1,3-diol, 4-HR)의 작용 메카니즘에 대해서는 구체적인 연구 결과가 보고되어 있지 않다. 최근, 미생물에서 4-HR의 화학적 유사체들이 휴지기 포낭(dormant cysts) (8, 9) 및 특정 세균들의 휴지기 포낭-유사 세포에서 발견되었다(10, 11). 상기 자기조절인자들 및 이들의 유사체들인 알킬레조르시놀류(12)를 외부에서 투여하면 실험조건에서의 세균의 휴지기 세포의 형성이 유도되고, 이들이 세균 뿐만 아니라 ras-형질전환된 섬유아세포와 같은 진핵세포에 대해서도 유사한 활성을 나타낸다는 사실(13)이 보고되어 있다. 4-HR이 종양세포의 생리적 상태 및 활성을 변화시켜 종양세포의 성장을 억제할 수도 있다고 예측하는 것은 충분히 타당성이 있다. 진핵세포들이 유사한 화학적 유사체들을 생산할 수 있고 이러한 화학물질들은 미세 주위의 스트레스 상태에서 생존을 돕는다고 믿어지고 있다. 최근, 기아 조건(starving condition)이 암치료에 대한 민감도와 정상세포들의 생존을 증가시킨다고도 보고되 어 있다(14). 따라서, 암세포에서 4-HR 작용 기전은 미생물에서의 생리적 상태 및 활성 조절과 유사하게 암세포의 증식을 억제하는 활성을 나타낼 것으로 예상된다.

따라서, 본 발명자들은 알킬레조르시놀의 잠재적 항-종양 효과 및 다양한 종양에 대한 비-특이적 항종양 효과가 확인된 연구결과들에 기초하여, 4-헥실레조르시놀-1,3-디올(4-hexylresorcinol-1,3-diol, 4-HR)의 암세포에 대한 항암 효능에 대해 연구하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 4-헥실레조르시놀-1,3-디올(4-hexylresorcinol-1,3-diol) 화합물의 암세포에 대한 항암 활성을 확인하고자 연구한 결과, 4-헥실레조르시놀-1,3-디올 화합물이 암세포 수준에서 뿐만 아니라 암세포의 이종이식(xenograft) 동물 모델 및 임상실험에서 암세포의 증식을 억제하고, 암세포의 분화 및 아폽토시스를 촉진한다는 것을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 4-헥실레조르시놀-1,3-디올을 유효성분으로 포함하 는 항암용 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 4-헥실레조르시놀-1,3-디올(4-hexylresorcinol-1,3-diol)을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 4-헥실레조르시놀-1,3-디올(4-hexylresorcinol-1,3-diol) 화합물의 암세포에 대한 항암 활성을 확인하고자 연구한 결과, 4-헥실레조르시놀-1,3-디올 화합물이 암세포 수준에서 뿐만 아니라 암세포의 이종이식(xenograft) 동물 모델 및 임상실험에서 암세포의 증식을 억제하고, 암세포의 분화 및 아폽토시스를 촉진한다는 것을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명 약제학적 조성물의 유효성분인 화합물 "4-헥실레조르시놀-1,3-디올(4-hexylresorcinol-1,3-diol)"은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물로서, 다양한 종류의 식물체 및 세균 종에서 발견되는 천연 비-이소프레노이드 지질류인 알킬레조르시놀류(alkylresorcinols)의 한 종류이다. 이하 본 명세서에서 상기 화합물 "4-헥실레조르시놀-1,3-디올"은 "4-HR"으로도 약칭하여 기재한다.

알킬레조르시놀류 및 이들의 유사체들은 종래부터 비특이적 항-산화제, 항-돌연변이제 및 증식 조절분자로서 기능하는 것으로 알려져 왔다.

본 발명의 항암용 조성물의 유효성분인 4-HR은 본 발명자들에 의해 최초로 암세포의 증식을 억제하고 암세포의 아폽토시스 및 분화를 촉진 및 유도하며 암세포가 이식된 이종이식 동물모델 및 암 환자의 임상실험에서 종양의 성장을 억제하는 등 항암효능을 갖는 것으로 확인되었다.

본 발명의 항암용 조성물에 의해 개선, 예방 또는 치료될 수 있는 암은 특별히 한정되지 않으며, 예컨대 구강암, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암 및 요관암을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 항암용 조성물이 적용될 수 있는 암은 구강암, 위암, 간암 또는 유방암이다.

본 발명의 항암용 조성물은 식품 조성물, 특히 기능성 식품 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한 다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분으로서의 후박나무 추출물 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)을 이용할 수 있다. 식품에 대한 용이한 접근성을 고려한다면, 본 발명의 식품 조성물은 암의 예방 또는 치료에 매우 유용하다.

본 발명의 항암용 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있으며, 이 경우 유효성분으로서의 상기 4-헥실레조르시놀-1,3-디올 화합물 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-200 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명 항암용 조성물의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다.

(i) 본 발명의 항암용 조성물은 공지의 4-헥실레조르시놀-1,3-디올 화합물의 새로운 항암 용도를 제시한다.

(ⅱ) 본 발명 조성물의 유효성분인 4-헥실레조르시놀-1,3-디올 화합물은 암세포의 증식을 억제하면서 암세포의 아폽토시스 및 분화를 촉진하는 효능을 동시에 가짐으로써 강력한 항암활성을 나타낸다.

(ⅲ) 본 발명 조성물의 유효성분 4-헥실레조르시놀-1,3-디올 화합물은 정상세포에서는 증식 억제활성을 나타내지 않으며, 세포 독성이 없는 생체에 매우 안전한 화합물이다.

(ⅳ) 본 발명의 조성물의 유효성분 4-헥실레조르시놀-1,3-디올 화합물은 암환자를 대상으로 한 임상실험결과 아무런 부작용 없이 우수한 항암 활성을 나타내었다.

본 발명의 항암용 조성물의 유효성분인 4-헥실레조르시놀-1,3-디올(4-hexylresorcinol-1,3-diol) 화합물은 세포 수준에서 암세포의 증식을 억제하고 암세포의 아폽토시스 및 분화를 촉진할 뿐만 아니라, 암세포가 이식된 이종이식 동물모델 및 암환자 대상 임상실험에서 종양의 성장을 현저히 억제하는 효능을 나타낸다. 상기 유효성분인 4-헥실레조르시놀-1,3-디올은 다양한 암세포에 대해 현저한 증식억제 활성을 나타냄으로써 매우 우수한 성능의 항암제로 개발될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통 상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험의 재료 및 방법

세포배양 및 MTT 분석

SCC-9 세포를 ATCC(American Type Culture Collection; Manassas, VA)로부터 구입하여, 1％ 페니실린/스트렙토마이신, 섬유아세포성장인자(fibroblast growth factor)-2(100 μg/㎖), 및 10％ FCS(fetal calf serum)를 포함하는 Ham's F12/Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco, BRL, Gaithersburg, MD)에서 컨플루언시(confluency)상태까지 배양하였다. 정상 피부 섬유아세포를 대조군으로 사용하였다. 4-HR (Sigma, St. Louis, MO)를 컨플루언시에 있는 세포에 최종 농도가 각각 1, 5, 및 10μg/㎖이 되도록 첨가하였다.

세포 증식은 공지된 방법(17)에 따라 MTT 분석법을 통해 측정하였다. 간략히 설명하면, 세포를 6-웰 플레이트에 노란색 테트라졸리움 염 3-(4, 5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(MTT) 용액(Cell proliferation kit I; Roche Molecular Biochemicals)과 함께 상온(room temperature, RT)에서 4 시간 동안 인큐베이션하였다. 포마르잔(formazan) 결정을 밤샘 용해시키고 생성물을 Victor Multilabel counter(Perkin-Elmer-Wallac, Freiburg, Germany)를 사용하여 590 nm 에서 흡광도를 측정하여 분광학적으로 정량하였다.

세포독성, 아폽토시스, 및 카스파아제 3/7 분석

세포독성, 아폽토시스 및 카스파아제 3/7 분석은 상업적으로 구입가능한 키트를 사용하여 행하였다.

세포독성 분석은 상업적 시판 키트(CytoTox96^ㄾ, Promega, Madison, WI)를 사용하여 행하였다. 4-HR과 함께 24 시간 인큐베이션한 후에, 상등액을 회수하여 세포독성 분석을 행하였다. 아폽토시스 분석은 키트(annexin V-FITC apoptosis detection kit I, BD biosciences, San Jose, CA)을 사용하여 행하였다. 카스파아제 분석은 상업적 시판 키트(Caspase-Glo^ㄾ 3/7 assay, Promega, Madison, WI)를 사용하여 행하였다. 아폽토시스 분석의 실험 조건은 세포독성 분석에서와 동일한 조건에서 행하였다. 카스파아제 분석은 4-HR 적용 후 30분에서 행하였다. 대조군은 동일한 조건하에서 4-HR이 존재하지 않는 세포 배양을 사용하였다.

공초점 현미경에 의한 칼슘 추적 및 칼슘 채널 길항제 연구

칼슘 추적 분석을 위해, SCC-9 세포를 칼슘-민감성 염료인 fluo-4 AM (Molecular Probes, Eugene, OR)으로 처리하고, 공지된 방법(18)에 따라 레이져 스캐닝 공초점 현미경(Leica Microsystems Heidelberg GmbH, Mannheim, Germany)으로 검사하였다.

세포 아폽토시스 및 증식에 대한 칼슘 채널 길항제 효과도 다음과 같이 측정하였다. 간략히 설명하면, 세포증식에 대한 효과를 평가하기 위해, 노르바스 크(Norvasc) 0.1, 0.5 또는 1 μg/㎖을 배양된 SCC-9 세포에 적용하고, 2 시간 후에 10 μg/㎖의 4-HR을 적용하였다. 대조군은 노르바스크(Norvasc)로 처리하지 않았다. MTT 분석은 4-HR 처리후 24 시간이 되는 시점에서 행하였다. 아폽토시스 분석을 위해, 칼슘 채널 길항제(1 μg/㎖; Norvasc 또는 Diltiazem)를 4-HR를 다양한 농도로 처리하기 전에 SCC-9 세포에 2시간 예비 처리하였다. 카스파아제 3/7 분석은 4-HR 적용 후 30 분이 되는 시점에서 행하였다. 대조군은 칼슘 채널 차단제로 처리하지 않았고, 카스파아제 3/7의 상대 활성은 칼슘 채널 차단제로 처리된 그룹과 비교하였다.

주사 및 투과 전자현미경

SCC-9 세포를 10μg/㎖의 4-HR와 함께 24 시간 배양한 후에 세포배양액의 일정량을 Formvar-코팅된 구리 그리드(또는 노브)위에 놓고, 진공하에서 건조시켜 주사현미경(SEM) 분석용 시료를 준비하였다. SCC-9 세포를 10μg/㎖의 시플라티닌(cisplatinin)의 존재 또는 부존재하에 24 시간 동안 배양한 후 SEM 분석용 시료를 제작하였다. 투과전자현미경(TEM) 분석 전에, 세포들을 300ㅧ g 에서 10 분간 원심분리하여 수집하고, 탈수시킨 후 고정시켰다(19, 20). 시료들을 Spurr (Epon 812) 수지로 중합화시키고, 울트라톰(ultratome)(LEICA, Uppsala, Sweden)상에서 절단하고, lead citrate로 염색한 후, Formvar-코팅된 구리 그리드상에 놓았다. SEM 및 TEM 이미지는 15.0kv의 전압 및 X 7000의 확대도를 갖는 JEOL 전자현미경(Japan)을 사용하여 시각화하였다.

DNA 마이크로어레이, 정량 RT-PCR 및 웨스턴블로팅

DNA 마이크로어레이 분석은 애질런트(Agilent)사의 인간 전체지놈 4 X 44K 칩(Santa Clara, CA) 및 RNA 샘플을 사용하여 지노믹트리(Genomic Tree Co.)사(대전, 한국)에 의뢰해 수행하였다.

총 RNAs는 10μg/㎖의 4-HR의 존재 또는 부존재하에서 12 시간 처리한 후 제조자(Molecular Research Center, Inc. Cincinnati, OH, USA)의 지시에 따른 조건하에서 TRI REAGENT^R 를 사용하여 추출하였다.

정량 RT-PCR을 위해, SCC-9 세포들을 4-HR(10μg/㎖)의 존재 또는 부존재하에서 처리하였다. 총 RNA(1μg)를 ImProm II cDNA 합성 키트(Promega, Madison, Wis.)를 사용하여 cDNA의 제1가닥을 합성하는데 사용하였다. 이후의 단계 및 인볼루크린(involucrin) 및 케라틴(keratin)에 대한 프라이머는 공지된 절차(21, 22)와 동일하다.

웨스턴 블로팅은 공지된 방법(23)에 따라 행하였다. 간략히 설명하면, 각 그룹으로부터의 세포용해물을 10％ 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동하였다. 이어서, 겔을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막상에 전기 블로팅하였다. PBS/0.1％ Tween 20(PBST; Bio-Rad)내의 5％ 비-지방 건조 밀크로 1 시간 블로킹한 후에, 블롯을 PBST내의 0.5％ 밀크로 희석한 케라틴 10, 또는 인볼루크린, 또는 액틴에 대한 제1차 항체로 탐지(25℃에서 1.5 시간)하고, 이어서, HRP-컨쥬게이트된 고우 트(goat) 항-마우스 또는 항-래빗 IgG (1:50,000 희석)로 탐지하였다. 케라틴 10, 인볼루크린 및 액틴에 대한 제1차 항체는 래빗으로부터 얻은 폴리클로날 항체이고, Santa Cruz(Santa Cruz, CA)로부터 구입하였다. 신호는 아머샴 파마시아(Amersham Pharmacia)사(Indianapolis, ID, USA)로부터 구입한 ECL 웨스턴 블로팅 검출시약을 사용하여 화학루미네선스에 의해 검출하였다.

LC/MS/MS에 의한 시료 분석

분석용 2-D 전기영동 및 인-젤(in-gel) 단백질 분해는 Doucette와 Li(24) 및 Gharahdaghi(25)이 기술한 방법에 의해 수행하였다. 최종 트립신-분해된 펩타이드를 0.1％ 포름산의 탈이온수(DW) 7 ㎕에 용해시켰다. DW 및 HPLC-그레이드 아세토니트릴을 사용하여 용출물을 제조하였다. 크로마토그래피에 의한 분리는 Nano LC 1D system(Eksigent Technologies, CA, USA)를 사용하여 수행하였다. 샘플(6 ㎕)를 150 um ㅧ 150 mm 컬럼(Vydac 218MS5, 1515; Grace Vydac, Hesperia, CA, USA)안으로 직접 주입하였고, 120 분간 1??80％ 아세토니트릴(0.1％ 포름산)의 선형 농도구배에 의해 용출시켰다. 융합-실리카 20 μm i.d. 관(tubing)을 전- 및 후-컬럼 액체 연결을 위해 사용하였다.

각각의 분해물로부터 얻어진 스폿은 QqTOF 질량분광기(QSTAR XL, Applied Biosystems/ MDS Sciex, Foster Citys, CA, USA)를 사용하여 직렬 질량분광기 (MS/MS)에 의해 분석하였다. 자동'Rolling Collision Energy'(26)에 대해서는 빌트인(built in) IDA 방법을 사용하였다.

종양 이종이식 모델 및 면역조직화학

종양 이종이식(tumor xenograft) 방법은 종래 보고된 바(27)에 따라 행하였다. 수컷 누드 마우스(BALB/cAnNCrj-nu/nu)를 Charles River Japan Inc.(Shin-Yokohama, Japan)로부터 구입하였다. 20 마리의 마우스에 SCC-9 세포(2.5x10⁶ cells)를 피하 주입하여 종양을 형성시켰다. 대조군(n=6)은 부형제(일반 식염수)를 복강내로 매일 주입하였다. 실험군(n=7)은 SCC-9 세포 접종 후 3 주후에 4-HR(1 μg/체중 g)을 복강내로 매일 주입하였다. 제3의 군(n=7)은 SCC-9 세포들을 주입한 날로부터 3주간 연속적으로 4-HR (10 μg/체중 g)을 복강내로 매일 주입하였다. 모든 마우스들에 대해 종양의 치수를 캘리퍼스(calipers)로 2일 또는 3일 마다 측정하고 종양의 부피를 다음 공식(부피 = a x b²/2, a는 종양의 가장 넓은 너비이고 b는 a에 대해 수직이 되는 너비이다)에 의해 계산하였다. 종양의 무게는 마우스를 희생시킨 시점에서 측정하였다.

면역조직화학은 적출된 종양에 대해 행하였다. 사이토케라틴(cytokeratin) 및 Ki67에 대한 항체(SantaCruz, SantaCruz, CA)를 구입하였다. Ki67 반응성에 대한 면역조직화학은 공개된 문헌(28, 29)에 기재된 바에 따라 행하였다.

제브라피쉬 발생 시스템을 사용한 4-HR의 변이성 테스트

제브라피쉬(Zebrafish) 북(30)에 기재된 바에 따라 제브라피쉬(Danio rerio) 를 14/10 - 명/암 사이클로 28.5℃에서 유지시키면서 사육하였다. 배아의 발생단계를 수정된 후(후-수정) 시간 및 형태적 기준에 의해 결정하였다. 배아는 자연 산란에 의해 얻었다. 수정된 난은 여러 가지 농도(1, 5, 10, 20, 및 100mM)의 4-HR로 처리하였다. 다양한 발생단계의 배아를 해부용(절개용) 현미경하에서 관찰하였다.

구강편평상피세포암의 절제후 4-HR의 임상적 적용

구강편평상피세포암으로 진단된 8명의 환자를 임상실험 대상으로 선별하였다. 실험대상 각 개인에 대해 모두 공지하여 동의를 얻었다. 본 실험에서 사용된 샘플들은 한림대학교 임상실험심사위원회(IRB, Institutional Review Board) 승인을 얻었다. 모든 환자들에게 한 달간 매일 절개후 국부투여에 의해 4-HR(10μg/㎖)을 적용시켰다. 종양의 재발 및 환자 생존율은 임상검사, 이미지스터디(image study) 및 절제생검 등에 의해 평가하였다. 4-HR 국소투여와 관련될 수 있는 가능한 합병증도 평가하였다.

통계

대조군 및 각 실험군 사이의 차이는 독립적 샘플 t-테스트에 의해 비교하였다. 유의한 수준은 p<0.05으로 정하였다.

실험 결과

SCC-9 세포들에 대한 4-HR의 항증식 효과

종양세포 증식에 대해 4-HR의 영향을 테스트하였다. 도 1a에서 나타낸 바와 같이, 4-HR은 5 μg/㎖의 농도에서부터 세포증식을 강하게 억제하였다(p<0.05). 4-HR 적용후 24 시간에서의 대조군에 대한 비교값은 1, 5 및 10 μg/㎖ 에서 각각 55.0 ％, 5.2％, 및 4.7 ％이었다(도 1a 참조). 대조군 및 1 μg/㎖ 4-HR 처리군은 48 및 72 시간에서 연속적인 성장을 보여주었지만, 5 μg/㎖ 및 10 μg/㎖의 4-HR 적용의 경우는 24 시간의 시점에서 관찰한 경우 성장이 관찰되지 않았다(도 1a 참조). 따라서, 세포 증식에 대한 4-HR의 억제효과는 5 μg/㎖의 농도에서부터 관찰되었다(p<0.05). 이와 대조적으로, 4-HR 매개 억제효과는 정상 피부 섬유아세포에서 거의 나타나지 않았다(도 1b 참조). 4-HR 매개 항-증식 효과는 유방암세포(MCF-7, SKBR3), 구강암세포(SCC-KB), 간암세포(HepG2) 및 위암세포(SNU601)을 포함하는 다른 암세포들에서도 관찰되었다(도 1c-1e). 유방암세포들에 대한 4-HR의 억제효과는 에스트로겐 수용체의 존재에 대해 독립적인 것으로 나타났다. 이러한 결과들은 4-HR이 암세포에 대해 선택적인 항-증식 효과를 갖는다는 것을 암시한다.

4-HR은 SCC-9 세포에서 분화를 촉진한다

4-HR이 SCC-9 세포 분화와 관련되어 있는 지를 결정하는 것은 매우 중요하다. 4-HR 매개 유전자 발현 프로파일을 조사하기 위해, 상피세포 분화에 관련된 4-HR에 반응하는 유전자들을 프로테오믹 분석(proteomic analysis)(도 2a) 및 DNA 마이크로어레이 분석(도 2b 및 도 2c)에 의해 스크리닝하였다.

프로테오믹 분석에서, 전기영동 분석 결과 케라틴 1, 케라틴 10 및 히스톤 H2B의 발현은 2-D 젤에서 증가함을 확인하였고, 이를 Q-TOF(Quadrupole-time of flight)분석에 의해 확인하였다(도 2a). DNA 마이크로어레이 분석에서는, 세포분화에 관련된 유전자들(인볼루크린, 케라틴 13, 14, 16, 17, 등)은 4-HR 처리군에서 매우 높게 발현되었다(증가 배율 > 2.0). 흥미롭게도, 히스톤 단백질 패밀리는 DNA 마이크로어레이 분석에서도 상향조절되었다. 칼슘 채널 및 카스파아제에 관련된 유전자들도 상당한 정도로 증가하였다(증가 배율 > 2.0). 그러나, 세포 주기(cell cycle), 세포증식 및 DNA 복제와 관련되는 유전자들은 발현이 감소되었는데(증가 배율 < -2.0), 이는 MTT 분석 결과(도 1)와 일치하는 것이다.

4-HR에 의해 상향조절되는 이들 유전자들 중에서, 케라틴 1, 케라틴 10 및 인볼루크린의 mRNA의 발현이 10 μg/㎖의 4-HR 처리에 의해 증가함을 RT-PCR 및 웨스턴 블로팅에 의해서도 확인하였다(도 2d 및 도 2e). 이들 결과들은 4-HR이 케라틴 및 인볼루크린과 같은 분화 마커의 상향조절과 함께 SCC-9 세포 분화를 가속화시킨다는 것을 암시한다.

4-HR은 SCC-9 세포의 아폽토시스를 유도한다.

4-HR이 아폽토시스에 어떠한 영향을 미치는가에 대해 세포의 생물학적 및 생화학적 분석을 통해 조사하였다.

첫째로, 4-HR 처리 후에 세포의 형태를 측정하였다. 4-HR(10 μg/㎖)은 SCC-9 세포의 크기를 현저히 감소시키는 동시에 둥근 형태로 변화시켰는데, 이러한 변화는 대조군 세포내에서 관찰되지 않았다. 이는 아폽토시스 과정 중에서 형태적 변화를 나타내는 것일 수 있다. 형태적 변화를 보다 상세히 평가하기 위해, 4-HR 처리 후에 세포들을 SEM 및 TEM를 통해 세포를 검사하였다(도 3a). 대조 SEM 및 TEM 검사에 의해 (i) 4-HR (10 μg/㎖)으로 처리된 세포 주위에 시스플라틴(cisplatin) 처리 경우에 나타나는 것들과 유사한 바디(body)들이 나타나고 (ⅱ) 아폽토시스에서 전형적으로 나타나는 특성인, 절단 또는 단편화된 핵, 및 손가락 모양의 외부로 향한 돌출물들이 나타나는 것을 확인하였다. 이와는 대조적으로, 4-HR로 처리되지 않은 세포들은 TEM에서 매끄러운 표면과 온전한 세포질 구조 및 핵을 갖는 것을 확인하였다(도 3a 참조). 실제로 SCC-9 세포는 4-HR(10μg/㎖) 처리에 의해, 아마도 아폽토시스의 가장 큰 특징인 막(membrane)에서의 변화 때문에 프로피듐 요오드(propidium iodide, PI) 및 어넥신 V(annexin V)에 의해 염색 가능하게 됨을 확인하였다(도 3b 참조). 이러한 아폽토시스 변화는 상기 아폽토시스 염색 없이는 4-HR의 1μg/㎖ 농도까지는 관찰되지 않았다.

암 세포의 4-HR 매개 아폽토시스를 추가적으로 확인하기 위해, 카스파아제(caspase)3/7의 효소 활성을 조사하였다. 도 3c에 나타난 바와 같이, SCC-9 세포내에서 4-HR 농도 증가에 따라 효소활성이 선형적으로 증가한 반면(오른쪽 패널), 상기 효소 활성은 정상 섬유아세포에서는 매우 적게 증가되었다(왼쪽 패널). 상기의 결과들은 4-HR이 SCC-9 세포들의 아폽토시스 유도를 매우 선택적으로 일으킨다는 것을 시사한다.

SCC-9 세포에서 4-HR 매개된 효과와 세포내 칼슘농도와의 관계

세포내 칼슘농도가 상피세포의 증식, 분화 및 아폽토시스에서 중요한 인자인 것으로 알려져 있기 때문에, 4-HR 매개된 항-증식성, 재분화(redifferentiation) 및 친-아폽토시스(pro-apoptosis) 효과의 기본이 되는 신호전달 기작을 알아보기 위해 4-HR 처리 후에 SCC-9의 칼슘 흡수능을 조사하였다.

도 4a에서 보여지는 바와 같이, 칼슘 검출 fluo-4 AM 염료로 로딩된 SSC-9 세포의 공초점 현미경 이미지에 의해 검사한 결과, 4-HR(100μM)로 처리된 후에 SCC-9 세포내에서의 칼슘 흡수는 대조군과 비교하여 현저히 증가하였다. 칼슘 유입 역할의 중요성을 확인하기 위해, 노르바스크(Norvasc) 또는 다른 칼슘채널 차단제로 처리한 후에 세포증식 및 아폽토시스를 관찰하였다. 도 4b에서 알 수 있는 바와 같이, 4-HR 매개 항증식 활성이 칼슘채널 차단제에 의해 억제되었다. 세포 증식은 노르바스크의 농도가 증가함에 따라 4-HR만 적용한 경우와 비교하여 거의 2-3배 증가하였다(도 4b). 노르바스크는 SCC-9 세포내에서 4-HR 매개 아폽토시스도 약화시켰다(도 4c). 카스파아제 3/7 활성은 적용되는 4-HR의 농도에 비례하여 증가하였으나, 칼슘채널 길항제를 적용한 후에는 억제되었다(도 4c). 이들 결과들은 4-HR 매개되는 다양한 효과가 세포내 칼슘 농도 증가에 일부 기인하는 것이라는 것을 시사한다.

인 비보 이종종양이식 모델에서 4-HR에 의한 종양 형성 감소 효과

인 비보 모델에서 4-HR의 항종양 효과를 확인하기 위해 다음과 같이 실험을 디자인하였다. SCC-9 세포들을 누드 마우스에 접종하고 SCC-9 세포 매개된 종양을 조직학적으로 분석하였다. 4-HR 처리(10 mg/kg체중)후의 종양조직의 크기는 대조군과 비교하여 상당히 작아졌고(p < 0.05; 도 5a), 대조군 및 실험군 사이의 차이는 21일 시점에서 더욱 두드러졌다. 조직학적 검사에서, 4-HR 처리된 마우스에서 세포질의 단편화, 개별 세포들에서의 염색체 파괴 및 케라틴성 물질로 이루어진 것으로 보이는 명백한 세포간 층 등이 관찰되었다(도 5b, H & E). 이러한 특징들은 SCC-9 매개된 종양 조직에서는 관찰되지 않았다(도 5b). 사이토케라틴은 대조군 그룹과 비교하여 4-HR 처리된 그룹에서 매우 높게 발현되었다(도 5b의 중간 패널). 이러한 결과들은 real-time RT-PCR, 웨스턴 블로팅(도 2e) 및 Q-TOF(도 2a)에 의한 인 비트로 SCC-9 세포 배양 시스템의 결과와 잘 일치하였다. Ki67 포지티브 세포들이, 처리되지 않은 대조군 그룹 보다 4-HR-처리된 그룹에서 더 적은 수로 존재한다는 것은 주목할 만하다(도 5b).

종합하면, 이들 결과들은 이식된 암세포를 갖는 누드 마우스에서 4-HR이 종양세포의 증식을 억제하고 세포 분화를 촉진한다는 것을 명확히 보여준다.

구강편평상피세포암 환자들에 대해 종양 절제후 4-HR의 임상적 적용

4-HR은 독성 없는 항생제 및 항기생충 약물으로도 잘 알려져 있고 국부적용에 대해 FDA 승인이 나 있는 상태이지만, 4-HR의 독성을 제브라 피쉬(zebra fish) 발생 시스템을 사용하여 다시 확인하였다. 도 6에서 보여지는 바와 같이, 4-HR의 저-용량(0.2 mg/㎖, 1mM) 투여는 제브라피쉬의 정상적인 발생에 아무런 영향을 미치지 않았다. 그러나, 4-HR를 고-용량(1 mg/㎖)으로 투여하면 기관(organ) 특이적 결손 없었으나 발생 단계 지체를 나타내었고, 4-HR을 매우 높은 용량(< 4 mg/㎖)으로 투여하는 경우 발생을 완전히 차단하였다. 이러한 결과에 기초하면 4-HR은 넓은 안전 마진을 가지고 있다는 것을 알 수 있으며, 10 μg/㎖을 임상실험 용량으로 선택하였다.

구강편평상피세포암 환자 8명 중에서, 5명은 암세포가 뼈로 전이되어 있었고, 1 개월간 4-HR을 국소 적용하였다(도 7). 병리학적 보고서에 의하면, 2명의 환자에서는 절개 마진에서 암이 없었고, 다른 2명의 환자에서는 종양세포들이 있었으며(도 7), 다른 4명의 환자에서는 분명하지 않았다. 8명의 환자중에서 6명은 PET CT 이미지에서 잔존하는 종양 조직이 거의 없었다(도 8a). 4년 후에, 7명의 환자들은 불완전한 완화 및 재발이 발생하지 않았다(도 7, 도 8a, 도 8b). 7명 환자의 경우에서 1달 간 4-HR을 적용한 후에 다시 절개한 종양 마진을 조직화학염색에 의해 평가하였다(도 8b). 도 8b에 보여지는 바와 같이, 4-HR로 처리된 경우 종양이 형태적 변화를 나타내었고, 인볼루크린 및 케라틴 10의 발현이 증가되었으며, Ki-67은 발현이 감소되었는데, 이러한 결과들은 배양된 SCC-9 및 이식된 암에서 관찰된 것과 유사한 결과이었다. 4-HR과 관련된 합병증은 4-HR로 치료한 모든 환자들에게서 나타나지 않았다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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도 1a-1e는 4-HR의 여러 가지 암 세포의 증식에 대한 영향을 측정한 결과를 보여준다.

도 1a는 4-HR의 SCC-9 세포에 대한 증식억제 효과를 보여주는 결과이다.

도 1b는 정상 피부 섬유아세포에 대한 4-HR의 영향을 보여준다. 정상 피부 섬유아세포에 대해서는 증식 억제 효과가 나타나지 않는다. 도 1a 및 도 1b에서의 실험에서 세포는 접종 후 2 일간 배양하였고, 4-HR로 24, 48, 72 시간 처리하였다. MTT 분석은 실시예의 실험방법에 기재한 바와 같이 지정된 시점에 행하였다.

도 1c는 각각 에스트로겐 수용체 포지티브(+)와 네가티브(-)의 유방암세포주인 MCF-7 및 SKBR3에 대한 4-HR의 증식 억제 효과를 보여준다.

도 1d는 전립선암 세포주인 SCC-KB 세포주에 대한 4-HR의 증식 억제 효과를 보여준다. 4-HR의 항-증식성 효과는 6시간 및 40시간에서 관찰되었다.

도 1e는 각각 위암 및 간암세포주인 SNU601 및 HepG2에서의 4-HR의 증식 억제 효과를 보여준다. 포토그램(photogram)은 4-HR(5μg/㎖)으로 24시간 처리한 후에 얻었다. 실험은 24 웰-플레이트를 사용하여 3회 독립적으로 수행하였다(n=6). 도 1c-1e에서의 결과는 암세포들을 접종하고 각각 기재된 농도의 4-HR로 24시간 처리한 후의 결과이다. MTT 분석은 실험방법에 기재된 바에 따라 수행하였다.

도 1f는 4-HR 화합물의 화학 구조를 보여준다.

도 2a는 2차 겔-전기영동 및 프로테오믹 분석 결과를 보여준다. SCC-9 세포 를 컨플루언시까지 배양하고 4-HR(100 μg/㎖)로 24 시간 처리하였다. 세포 용해물을 2D 겔-전기영동에 의해 분석하였다. 상이 발현 단백질 스폿이 대조군(A, C, E, G) 및 SCC-9 세포(B, D, F, H)로부터 2D-전기영동 사진에서 관찰되었다. 4-HR 처리된 세포내에서 고-발현된 케라틴 1(D), 케라틴 10(F) 및 히스톤 H2B 단백질 (H2BFN)(H)를 QqTOF(quadrupole-time of flight) 질량분광기에 의해 확인하였다. 화살표 1, 2 및 3은 각각 케라틴 1, 케라틴 10, 및 히스톤 단백질 H2BFN을 나타낸다.

도 2b 및 도 2c는 4-HR에 반응하는 유전자를 DNA 마이크로 어레이에 의해 스크리닝한 결과에 관한 것이다. SCC-9 세포들을 컨플루언시(confluency)에 도달할 때까지 배양한 후, 4-HR(10μg/㎖)으로 처리하였다. 4-HR로 처리한 후 12 시간의 시점에서 총 RNA를 분리하였다. DNA 마이크로어레이는 실시예의 실험방법에 기재한 바와 같이 RNA 정량화 이후에 행하였다. SCC-9 세포에 4-HR (10μg/㎖) 처리후 12 시간 후에 현저하게 변화되는 유전자들 중에서 관심의 유전자들을 나타내었다. 대조군에 비해 2배 이상의 발현을 갖는 유전자를 관심의 유전자로 선별하였다. 상향조절 및 하향조절되는 유전자들을 각각 양성(+) 및 음성(-) 배율 비율로 표시하였다. 아폽토시스, 칼슘채널, 카스파아제, 콜라게나아제, 히스톤, 케라틴 관련 유전자들은 4-HR에 의해 상향조절(도 2b)된 반면, 사이클린(cyclin), MAPKs, 폴리머라아제(polymerase), 키나아제(kinase)는 4-HR에 의해 하향조절(도 2c)되었다.

도 2d는 프로테오믹스 및 DNA 마이크로어레이에 의해 선별된 분화 마커인 케라틴 10 및 인볼루크린을 정량 RT-PCR에 의해 정량한 결과를 보여준다. 실시예의 실험방법에서 기재한 바와 같이 정량 RT-PCR을 수행하였다. 대조군인 GAPDH와 비교한 케라틴 10 및 인볼루크린의 비교 활성은 대조군에서 보다 4-HR 처리군(10 μg/㎖)에서 현저하게 높았다.

도 2e는 프로테오믹스 및 DNA 마이크로어레이에 의해 선별된 분화 마커인 케라틴 10 및 인볼루크린을 웨스턴블로팅에 의해 정량한 결과를 보여준다. 4-HR의 농도가 증가함에 따라 사이토케라틴 10 및 인볼루크린의 발현이 증가되었다.

상기 도 2a-2e의 결과들은 4-HR이 SCC-9 세포들의 분화를 촉진한다는 결과를 시사한다.

도 3a-3c는 4-HR 매개 아폽토시스 동안 SCC-9 세포의 형태 및 생화학적 변화를 보여주는 결과이다.

도 3a는 SSC-9 세포를 4-HR (10μg/㎖)의 존재 또는 부존재하에서 24 시간 동안 처리한 후의 세포 형태를 SEM 및 TEM으로 관찰한 결과이다. 4-HR 처리된 세포는 SEM 및 TEM에 의해 둥근형태의 외부로 향한 분엽(lobulation) 및 핵 단편화가 관찰되었다. 시스플라틴 매개된 아폽토시스의 형태는 오른쪽 SEM 사진에서 관찰되었다. 원본 확대 배율은 TEM X 3000이었다.

도 3b는 SCC-9 세포를 DAPI(왼쪽 컬럼) 또는 인 시튜 염색에서 형광을 통해 관찰한 결과를 보여준다(중간 및 오른쪽 컬럼). 4-HR(10 μg/㎖)으로 처리한 세포들은 프로피디움 요오드(propidium iodide, PI) 및 어넥신 V(annexin V)으로 염색할 때 포지티브 염색을 나타내었다(원본 확대배율 X 100).

도 3c는 카스파아제(caspase) 효소의 활성은 SCC-9 세포에서 4-HR 농도 증가에 따라 선형적으로 증가하였으나(오른쪽 패널), 정상 섬유아세포에서는 매우 적게 증가되는 결과(왼쪽 패널)를 보여준다.

도 4a-4c는 SCC-9 세포내 4-HR 매개된 생물학적 영향에서 세포내 칼슘의 중요한 역할을 증명하는 결과를 보여주는 사진들이다.

도 4a는 Ca²⁺-민감성 fluo-4 AM으로 염색한 후에 대조군 및 4-HR 처리된 SCC-9 세포의 공초점 현미경 사진이다. 세포내 칼슘 함량은 4-HR 첨가(10μg/㎖)첨가 후 10 분내에서 증가되었다(원본 확대배율 X 200).

도 4b는 4-HR 매개된 항-증식 효과가 칼슘 채널 차단제의 처리에 의해 약화되는 결과를 보여준다. 세포들은 다양한 농도의 노르바스크(Norvasc)로 2시간 동안 먼저 처리한 후 4-HR (10 μg/㎖)으로 24 시간 동안 처리하였다. 세포 증식은 MTT 분석에 의해 측정하였다.

도 4c는 4-HR 매개된 아폽토시스 효과는 칼슘 채널 차단제 처리에 의해 정지되는 결과를 보여준다. 세포들을 칼슘 채널 차단제로 2시간 동안 먼저 처리한 후 4-HR (1 g/㎖)으로 30 분간 처리하였다. 카스파아제 활성은 생화학 분석법에 의해 측정하였다.

도 5a 및 도 5b에는 4-HR이 누드 마우스에 SCC-9 세포를 주입하여 제조한 종 양의 이종이식 마우스 모델에서의 종양의 형성을 억제하는 결과를 보여준다.

도 5a는 4-HR을 투여하지 않은 동물로부터 적출한 조직(최상위 행의 사진, 대조군), 1 mg/kg체중의 용량으로 4-HR 투여한 조직(중간 행의 사진) 및 10 mg/kg체중의 용량으로 4-HR 투여한 조직(최하위 행의 사진)의 사진을 보여준다. 도 5a에서는 종양 조직 크기의 드라마틱한 변화를 볼 수 있다. 유의한 차이(*p<0.05).

도 5b는 4-HR로 처리되지 않은 대조군 그룹과 4-HR로 처리된 그룹에서 H&E 염색 양상, 사이토케라틴 반응 양상 및 Ki67 세포의 수를 측정한 결과를 보여주는 사진이다. H&E 염색에 의해 대조군 종양 조직내에서는 오직 미분화된 세포와 4-HR(10 mg/kg 체중)로 주입한 마우스로부터의 조직에서의 구강편평상피세포 형태 요소를 갖는 접촉-억제된 세포를 보여준다. 사이토케라틴(cytokeratin)은 대조군 종양 조직내에서는 양성(positive) 반응을 보이지 않았으나, 4-HR(10 mg/kg 체중)으로 처리한 군으로부터의 종양 조직내에서는 강한 양성반응을 보였다. 대조군에서의 Ki67-양성 세포의 수는 4-HR(10 mg/kg 체중)으로 처리된 군 보다 매우 높았다(p<0.05). 원본 확대 배율 X 200.

도 6은 발단 단계에 있는 제브라 피쉬 배아를 이용한 4-HR의 세포독성 테스트 결과를 보여주는 사진이다. 제브라 피쉬 수정난을 수집하고 50 시간 동안 인큐베이션하여 정상 발생 단계를 진행하도록 하였다. 수정후 약 4 시간 정도에서, 발생초기단계의 제브라 피쉬 배아에 대해 4-HR을 여러 가지 농도로 처리하였다. 수정후 50 시간 정도에서 배아의 형태 변화를 절개(해부) 현미경하에서 관찰하였다. 배아의 발생은 4-HR에 의해 약간 지체되었지만, 처리된 배아에서 현저한 형태적 결함은 검출되지 않았다. 그러나, 20 mM 초과 농도로 4-HR을 처리하는 경우 대부분의 배아에서 배아 사멸을 초래하였다.

도 7은 OSCC 환자에게 4-HR을 임상적으로 적용한 임상실험 결과를 요약하여 나타낸 표이다.

도 8a 및 도 8b는 OSCC 환자에 4-HR을 임상적으로 적용하여 종양조직을 절개한 후 조직학적으로 분석한 결과를 보여준다.

도 8a는 PET CT는 환자에게서 설암(tongue cancer)의 절개후 핫 스팟(hot spot)을 보여주는데(before), 이는 4-HR로 국소적으로 처리한 후 사라졌다(after). 한 경우의 환자는 혀의 오른쪽 절개 마진에서 핫 스팟(잠재적인 잔존 종양)을 나타내었다. 수술 후 12개월째 이미지는 혀에서 종양이 없어진 것으로 나타났다.

도 8b는 4-HR으로 1개월간 치료한 후에 절개한 종양 조직의 조직학적 분석결과를 보여준다. 양쪽 샘플에서 병리학적 진단은 구강편평상피세포암이었다. H & E 염색에서 4-HR 처리 후에 더욱 분화된 세포들이 나타났다(패널 a 및 b 참조). 인볼루크린(involucrin) 포지티브 세포들이 주요 종양조직(패널 c)과 4-HR로 국소적으로 적용한 후(패널 d)에 나타났다. 케라틴 10은 주요 조직(패널 e)에서는 나타나지 않았으나, 한 달 정도 후에 샘플에서 약간 발현되었다(패널 f). Ki67은 상피세포의 다층에서 존재하였고(패널 g), 한달 간 4-HR로 처리한 후에 기저층에서만 나타났다(패널 h). 원본 확대 배율 X 100.

Claims (5)

1. 4-헥실레조르시놀-1,3-디올(4-hexylresorcinol-1,3-diol)을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
4. 제 2 항에 있어서, 상기 암은 구강암, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암 및 요관암 중 어느 하나의 암인 것을 특징으로 하는 항암용 약제학적 조성물.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 4-헥실레조르시놀-1,3-디올 화합물은 암세포의 아폽토시스 또는 분화를 촉진하거나 세포내 칼슘 농도를 증가시키는 작용을 하는 것을 특징으로 하는 항암용 약제학적 조성물.

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