KR20100061835A - 광합성 생물에 의한 유기 생산물을 얻는 방법 및 이들의 생산물 및 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 광합성 생물들에 의한 생산물들을 생성하기 위한 조성물 및 방법들을 제공한다. 상기 광합성 생물들은 생산물들의 생산, 분비 또는 생산과 분비 모두를 실현하도록 유전조작된다. 본 방법들 및 조성물들은 특히 석유화학 분야에서 유용하다.

Description

광합성 생물에 의한 유기 생산물을 얻는 방법 및 이들의 생산물 및 조성물{METHODS OF PRODUCING ORGANIC PRODUCTS WITH PHOTOSYNTHETIC ORGANISMS AND PRODUCTS COMPOSITIONS THEREOF}

관련 출원들의 상호참조

본 출원은 미국 가출원 제 60/971,418호, 60/971,412호 (모두 2007년 9월 11일 출원), 60/973,924 (2007년 9월 20일 출원), 및 61/130,892호 (2008년 6월 2일 출원)의 이익을 주장하며, 이들 출원들은 여기에 참조로서 포함된다.

배경기술

오일, 석유화학물질들 및 석유화학물질들의 생산에 유용한 기타 물질들과 같은 석유 제품들은 그 수요가 더욱 증가되고 있다. 오늘날 연료 제품의 대부분은 화석 연료로부터 생성되며, 이들은 유기 물질이 수백만년 동안에 걸친 침전물의 연속적 층에 의해 커버된 결과이기 때문에, 재생가능한 에너지원으로 여겨지지 않는다. 또한, 수입된 미정제 오일에 대한 의존성을 줄이고자 하는 요구가 증가하고 있다. 공해 및 환경 유해성에 대한 대중의 인식도 높아져 왔다. 그 결과, 연료 제품들을 생산하기 위한 대안 방법들에 대한 관심 및 요구가 증가되어 왔다. 따라서, 재생가능하고, 지속가능하며(sustainable) 환경에 대한 해가 적은 연료 제품들을 개발하기 위한 대안 방법들에 대한 절박한 요구가 존재한다.

참조에 의한 포함

본 명세서에서 언급된 모든 간행물들 및 특허 출원들은, 각각의 개별적인 간행물 또는 특허 출원이 특이적 및 개별적으로 참고에 의해 포함되는 것으로 나타낸 것과 같은 동일한 정도로, 여기에 참고로서 포함된다.

발명의 개요

본 발명은 수소 및 탄소 원자를 포함하는 분자, 상기 수소 및 탄소는 조성물 중량의 적어도 80%이고, 조성물 중 δ¹³C 비율은 -32‰미만이다. 어떤 경우에서, 조성물은 이소프렌 단위(isoprene unit)를 더 포함한다. 본원에 설명된 어떤 조성물에 대하여, 수소 및 탄소 원자는 조성물 중량의 적어도 90%이다. 또한, 다른 조성물에서, 수소 및 탄소 원자는 조성물 중량의 적어도 95% 또는 99%이다. 또 다른 조성물에서, 수소 및 탄소 원자는 조성물 중량의 100%이다. 어떤 경우에서, 조성물은 액체이다. 다른 경우에서, 조성물은 연료 첨가제 또는 연료 생산물이다. 어떤 구체예에서, 조성물은 테르펜(terpene)이다. 다른 구체예에서, 조성물은 지방산 또는 지방산 에스테르가 아니다. 어떤 구체예에 있어서, 조성물 중 δ¹³C 비율은 -35‰ 미만 또는 -40‰ 미만이다. 다른 경우에서, 조성물은 옥탄가 85-120을 가진다. 다른 경우에서, 조성물은 90 이상의 옥탄가를 가진다.

또한, 개시된 발명은 수소 및 탄소 원자를 포함하는 분자를 포함하는 조성물을 포함하는 연료 생산물이고, 상기 수소 및 탄소 원자는 조성물 중량의 적어도 80%이며, 조성물 중 δ¹³C 비율은 -32‰ 미만이며, 연료 성분이다. 어떤 경우에서, 연료 성분은 화석 연료, 연료 혼합용 혼합물, 가솔린, 디젤, 에탄올, 제트 연료 또는 이들의 어떤 조합일 수 있는 혼합 연료이다. 또 다른 경우에서, 혼합 연료는 -32‰ 이상의 δ¹³C 비율을 가진다. 본원에서 설명된 어떤 연료 생산물에서, 연료 성분은 MTBE, 항산화제, 정전방지제, 부식 방지제 및 이들의 어떤 조합일 수 있는 연료 첨가제이다. 어떤 경우에서, 조성물은 이소프렌 단위(isoprene unit)를 더 포함한다. 다른 경우에서, 수소 및 탄소 원자는 조성물 중량의 적어도 90%이다. 또 다른 경우에 있어서, 수소 및 탄소 원자는 조성물 중량의 적어도 95% 또는 99%이다. 또 다른 경우에서, 수소 및 탄소 원자는 조성물 중량의 100%이다. 어떤 연료 생산물에 대하여, 조성물 성분은 테르펜(terpene)이다. 어떤 경우에 있어서,조성물은 액체이다. 다른 경우에 있어서, 조성물은 지방산 또는 지방산 에스테르가 아니다. 또 다른 경우에서, 조성물은 메탄이 아니다.

또한, 본 발명은 조성물을 연소시켜 그에 의해 -32‰ 미만의 δ¹³C 비율을 가지는 이산화탄소를 발생시키는 것을 포함하는 이산화탄소를 생성시키는 방법을 추가적으로 제공한다. 어떤 경우에 있어서, 이산화탄소는 -35‰ 미만의 δ¹³C 비율을 가진다. 그외의 경우에 있어서, 이산화탄소는 -40‰ 미만의 δ¹³C 비율을 가진다. 연소 과정은 가솔린 엔진, 디젤 엔진, 또는 제트 엔진 내부에서 실행될 수도 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 상기 방법은 비관다발성 광합성 생물로부터 추출한 조성물을 더 포함한다. 또한, 개시된 방법은 생물에서 효소를 상향 조절하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 상기 효소의 생산물은 상기 조성물이다. 어떤 경우에 있어서, 상기 효소는 생물에서 자연 발생하지는 않는다.

상기 방법에 대한 부가적 방법은 조성물의 δ¹³C 비율의 측정값을 얻고; 측정값을 이용하여 조성물을 표시하는 단계를 포함하는 조성물 표시 방법이다. 몇몇 구체예에 의하면, 표시는 조성물의 δ¹³C 비율을 나타내는 것을 포함하며, 조성물의 δ¹³C 비율의 측정값은 -32‰ 미만이다. 어떤 경우에 있어서, 조성물은 연료 생산물로서, 연료 성분을 포함할 수도 있다.

일 측면에 의하면, 상기 방법은 조성물을 추적하는 과정을 더 포함 수도 있다. 몇몇 실시예에 있어서, 추적 과정은 1) 알려지지 않은 조성물의 탄소 동위 원소비율을 측정치와 비교하고 2) 조성물의 위치를 확인하며 및/또는 3) 컴퓨터 시스템으로 조성물을 모니터링하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명은 제 1 연료 생산물을 발생시키는 생물인 비관다발성 광합성 생물을 성장시키고; 상기 생물을 무기 탄소의 원료와 접촉시키고; 무기 탄소의 원료로부터의 탄소를 -32‰ 미만의 δ¹³C 비율을 가지는 제 1 연료 생산물로 제조하는 것을 포함하는 비관다발성 광합성 생물로부터 연료 생산물을 발생시키는 방법을 제공할 수도 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 무기 탄소의 원료는 ¹³C을 포함하는 이산화탄소 및 ¹²C을 포함하는 이산화탄소를 포함한다. 몇몇 실시예에 의하면, 생물을 무기 탄소와 접촉하는 것은 생물을 무기 탄소의 과잉 원료와 접촉하는 것을 포함한다. 몇몇 실시예에 의하면, 생물은 하나 이상의 효소를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함하며, 상기 효소의 최종 생산물이 제 1 연료 생산물이다. 그외의 실시예에 있어서, 핵산은 이종이다. 제 1 연료 생산물은 생물에서 자연적으로 생산되지는 않는다. 몇몇 실시예에 의하면, 제 1 연료 생산물은 -32‰ 미만의 δ¹³C 비율을 가진다. 다른 실시예에 의하면, 제 1 연료 생산물은 테르펜을 포함한다. 화석 연료 무기 탄소는 -32‰ 이상의 δ¹³C 비율을 가질 수 있다. 어떤 구체예에 있어서, 제 1 연료 생산물은 상기 생물로부터 추출된다. 제 1 연료 생산물은 추적에 적용될 수 있다. 몇몇 구체예에 의하면, 상기 방법은 연료 조성물에 제 1 연료 생산물을 추가하는 것을 더 포함한다. 몇몇 실시예에 의하면, 이러한 방법은 제 1 연료 생산물을 연소시키고, δ¹³C 강화 무기 탄소를 발생시키는 것을 더 포함한다. 몇몇 실시예에 의하면, δ¹³C 강화 무기 탄소는 -32‰ 미만의 δ¹³C 비율을 갖는다.

또한, 본 발명은 조성물 중 δ¹³C 비율의 측정값을 얻어서; 조성물의 δ¹³C 비율을 참조 δ¹³C 비율과 비교하고; 조성물의 δ¹³C 비율이 기준 δ¹³C 비율 미만인 경우 소유자 또는 조성물의 사용자인 개체에 탄소 배출권을 판매하는 것을 포함한다. 몇몇 실시예에 의하면, 기준 δ¹³C 비율은 약 -32‰이다. 상기 방법은 측정값을 사용하여 조성물을 표시하는 것을 더 포함할 수도 있다. 또한, 상기 방법은 조성물을 추적하는 단계를 포함할 수도 있다.

본원에서 설명된 바와 같은 연료 생산물을 발생시키는 방법은 비관다발성 광합성 생물을 성장시키고; 상기 생물과 배연 가스를 접촉시키고; 상기 배연 가스로부터 연료 생산물로 탄소를 통합시키고, 상기 비관다발 광합성 생물로부터 상기 연료 생산물을 추출하는 것을 포함한다. 몇몇 실시예에 의하면, 상기 방법은 유전적으로 생물을 조작하는 단계를 더 포함한다. 다른 실시예에 의하면, 연료 생산물은 생물에서 자연적으로 발현되지 않는다. 연료 생산물은 수소 및 탄소 원자를 포함하는 분자를 포함할 수 있으며, 상기 수소 및 탄소 원자는 생산물 중량의 적어도 90%이며, 조성물 중 δ¹³C 비율은 -32‰ 미만이다. 몇몇 실시예에 의하면, 상기 방법은 연료 생산물을 정제하는 단계를 포함한다. 어떤 경우에 있어서, 정제 단계는 가수 분해, 촉매 분해, 증기 분해, 분해, 분별, 증류, 수소 처리 및 이들의 어떤 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 공정을 포함한다.

본 발명의 신규 특징들(features)은 첨부된 특허청구범위에서 구체적으로 설명된다. 본 발명의 특징들 및 장점들은, 본 발명의 원리들이 사용된, 예시적인 구체예들을 설명하는 하기의 발명의 상세한 설명 및 하기와 같은 첨부 도면을 참조함으로써 더 잘 이해될 것이다:
도 1은 핵산 구조물의 그래픽 도면이다.
도 2는 리모네네 신타제(limonene synthase)로 형질전환된 C. 레인하르드티(C. reinhardtii)의 웨스턴 분석을 나타낸다.
도 3은 리모네네 신타제로 형질전환된 C. 레인하르드티의 가스 크로마토그래피-질량 분석을 나타낸다.
도 4는 FPP 신타제 및 세스퀴테르펜 신타제로 형질전환된 C. 레인하르드티의 웨스턴 분석을 나타낸다.
도 5는 작물 식물, 가스 샘플, 원유 및 조류 샘플을 포함하는 다양한 샘플 화합물 중 δ¹³C 비율을 측정한 실험 결과를 요약한 도면이다.

Ⅰ. 생산물

본 발명은 광합성 생물을 이용하여 생산물을 생산하는 것과 관련되는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 생산물의 예로는 연료 생산물, 향료 생산물 및 살충제 등을 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다. 생산물은 분자 형태로 저장된 에너지를 방출하는 어떤 물질일 수도 있다. 일 실시예에 의하면, 생산물은 유기 분자이다. 또 다른 실시예에 의하면, 생산물은 탄화수소이다. 몇몇 실시예에 의하면, 생산물은 수소를 포함하지 않는다. 몇몇 실시예에서, 생산물은 산소를 포함하지 않는다. 몇몇 실시예에 의하면, 생산물은 항체 또는 단백질을 포함하지 않는다. 몇몇 실시예에서, 생산물은 지방산을 포함하지 않는다.

연료 생산물들의 예들은 석유화학 생산물들 및 그들의 전구체들, 및 석유화학 산업에서 유용할 수 있는 다른 모든 성분들을 포함한다. 연료 생산물들은 예로서, 석유 제품들, 석유 전구체들 및 석유화학물질들 및 그의 전구체들을 포함한다. 연료 또는 연료 생산물들은 보일러, 가마(kiln), 건조기, 또는 노와 같은 연소기 내에서 사용돌 수 있다. 연소기들의 다른 예들은 탈것의 엔진 또는 제너레이터들과 같은 내부 연소 엔진들이며, 이는 가솔린 엔진, 디젤 엔진, 제트 엔진 및 기타를 포함한다. 연료 생산물들은 플라스틱들, 수지들, 섬유들, 엘라스토머들, 윤활제들 및 겔들을 생산하는데 사용될 수도 있다.

여기에서 고려되는 생산물들의 예들은 탄화수소 생산물들 및 탄화수소 유도체 생산물들이다. 탄화수소 생산물은 수소 분자들 및 탄소 분자들로만 이루어지는 것이다. 탄화수소 유도체 생산뭉른 하나 이상의 헤테로원자를 갖는 탄화수소 생산물로, 여기에서 상기 헤테로원자는 수소 또는 탄소가 아닌 임의의 원자이다. 헤테로원자들의 예들은, 이에 제한되지는 않지만, 적어도 50중량%, 60중량%, 70중량%, 80중량%, 90중량% 또는 95중량%의 생산물이 탄소 및 수소로 구성된다. 어떤 구체예에 있어서, 생산물은 탄소 및 수소 원자의 중량으로 100%이다. 어떤 구체예에 있어서, 생산물은 테르펜을 포함한다. 다른 구체예에 있어서, 생산물은 지방산 또는 지방산 메틸 에스테르를 포함한다.

탄화수소 등의 연료 생산물은 일반적으로 액체 석유 가스, 나프타(ligroin),가솔린, 등유, 디젤, 윤활유, 중가스(heavy gas), 코크, 아스팔트, 타르 및 왁스와 같은, 하지만 이에 한정되지는 않는, 원유 또는 석유로부터 추출된 전구체 또는 산물일 수 있다. 예컨대, 연료 생산물은 플라스틱을 만들고 (음식을 하는 등의) 열을 가하는 동안 사용될 수 있는 메탄, 에탄, 프로판 또는 부탄(예컨대, 대략 1-4 탄소) 등의 저가 알칸을 포함할 수도 있다. 또한, 연료 생산물은 나프타, 리그로인 또는 이들의 전구체 등의 대략 5-12 탄소 원자의 탄소 골격을 갖는 분자를 포함한다. 그 외의 연료 생산물은 약 5에서 12 탄소 원자 또는 가솔린 또는 모터 연료로 사용되는 시클로알칸일 수도 있다. 등유 또는 이의 전구체와 같은 탄소가가 대략 10에서 18인 분자 및 방향족체가 연료 생산물이 될 수도 있다. 또한, 연료 생산물은 윤활유로 사용되는 탄소가 12 이상인 분자 또는 이들의 전구체를 포함할 수도 있다. 그 밖의 연료 생산물은 중가스 또는 연료 오일 또는 이들의 전구체, 알칸, 시클로알칸 및 대략 탄소가 20에서 70인 방향족체를 포함한다. 또한, 연료 생산물은 코크, 아스팔트, 타르 및 왁스와 같은 일반적으로 다수의 고리를 포함하는 탄소가 약 70 또는 그 이상인 원유 및 이들의 전구체로부터 다른 잔기들을 포함한다.

각종 연료 생산물들은 다수의 공정들에 의해 최종 사용자를 위한 최종 생산물로 더욱 정련될 수 있다. 정련은 분별증류에 의해 일어날 수 있다. 예로서, 상이한 각종 사슬 길이를 갖는 상이한 탄화수소들의 혼합물과 같은, 연료 생산물들의 혼합물은 분별증류에 의해 각종 성분들로 분리될 수 있다.

정련은 다음 단계들 중 임의의 하나 이상의 단계들을 포함할 수도 있다: 연료 생산물의 크래킹(cracking), 단일화(unifying), 또는 변경. 큰 탄화수소들(예로서, ≥C10)과 같은, 거대 연료 생산물들은 크래킹에 의해 작은 단편들로 분해될 수 있다. 크래킹은, 스팀, 비스브레이킹(visbreaking), 또는 코킹과 같은, 열 또는 고압에 의해 수행될 수 있다. 연료 생산물들은 예로서 중유의 점도를 감소시키는 비스브레이킹에 의해 정련될 수도 있다. 정련은 코킹을 포함할 수도 있으며, 여기에서 무거운 거의 순수한 탄소 잔기가 생산된다. 코킹은, 이에 제한되지는 않지만 제올라이트, 알루미늄 하이드로실리케이트, 복사이트(bauxite), 또는 실리카-알루미나와 같은 촉매들을 사용함에 의해, 크래킹 반응의 속도를 증진시키는 촉매 수단에 의해 수행될 수도 있다. 촉매작용은, 제올라이트와 같은 뜨거운(hot) 촉매가 크래킹 반응의 촉매에 사용될 수 있는 유동성 촉매적 크래킹에 의한 것일 수 있다. 촉매작용은 하이드로크래킹(hydrocracking)에 의해 수행될 수도 있으며, 여기에서 유동성 촉매 크래킹에 비해 저온이 사용되는 것이 일반적이다. 하이드로크래킹은 전형적으로 상승된 부분압의 수소 가스 존재 하에서 일어난다. 연료 생산물들은 촉매적 크래킹에 의해 정련되어 디젤, 가솔린 및/또는 케로센을 생성할 수 있다. 정련은 또한 하이드로트리트먼트(hydrotreatment)를 포함할 수 있다.

연료 생산물들은 그들을 단일화 단계에서 조합함에 의해, 예로서 백금 또는 백금-레늄 혼합물과 같은 촉매들을 사용하여 정련될 수 있다. 단일화 공정은 크래킹에서 사용될 수 있는 부산물인, 수소 가스를 전형적으로 생산한다.

연료 생산물들은 탄화수소들을 보다 작은 분자들로 변경 또는 재배열 또는 재구조화함에 의해 정련될 수도 있다. 촉매적 개질(reforming) 공정에서 일어나는 다수의 화학반응들이 당업자에게 알려져 있다. 일반적으로, 촉매 개질은 촉매 및 높은 수소 분압의 존재하에서 수행된다. 한 일반적인 공정은 알킬화이다. 예로서, 프로필렌 및 부틸렌은 불화수소산 또는 황산과 같은 촉매와 혼합된다.

연료 생산물들은 혼합물 내로 블랜드되거나 조합되어 최종 생산물을 수득할 수 있다. 예로서, 연료 생산물들은 블랜드되어 각종 등급의 가솔린, 첨가제가 있거나 또는 없는 가솔린, 각종 중량 및 등급의 윤활유들, 각종 등급의 케로센, 제트 연로, 디젤 연료, 난방유 및 플라스틱 및 기타 중합체들의 제조를 위한 화학물질들을 형성할 수 있다. 여기 기재된 연료 생산물들의 조성물들은 다른 수단에 의해 생산된 연료 생산물들과 조합 또는 블랜드될 수도 있다.

상기 발명은 수소 및 탄소 원자가 조성물 중 중량이 적어도 80%이고, 조성물의 δ¹³C 비율이 -32‰ 미만인 수소 및 탄소 원자를 포함하는 분자를 포함하는 조성물이다. 몇몇 실시예에 의하면, 상기 성분은 이소프렌 단위를 더 포함한다. 몇몇 실시예에 의하면, 상기 성분은 테르펜을 포함한다. 몇몇 실시예에 의하면, 상기 성분은 중성지방(triglyceride) 또는 지방산을 더 포함한다. 상술한 몇몇 성분에 있어서, 수소 및 탄소 원자는 조성물 중량의 적어도 90%이다. 예컨대, (수소 및 탄소 원자가 중량으로 90% 미만을 갖는) 바이오디젤 또는 지방산 메틸 에스테르는 상기 조성물의 일부분이 아닐 수도 있다. 또한, 다른 조성물에 있어서, 수소 및 탄소 원자는 조성물 중량의 적어도 95% 또는 99%이다. 반면, 다른 조성물에 있어서, 수소 및 탄소 원자는 조성물 중량의 100%이다. 몇몇 실시예에 의하면, 상기 조성물은 액체이다. 그외의 실시예에 의하면, 상기 조성물은 연료 첨가제 또는 연료 생산물이다. 몇몇 실시예에 의하면, 상기 조성물은 테르펜이다. 그 밖의 실시예에 의하면, 상기 조성물은 지방산 또는 지방산 에스테르를 포함하지 않는다. 또 다른 실시예에 의하면, 상기 조성물은 메탄을 포함하지 않는다. 몇몇 실시예에 의하면, 상기 조성물의 δ¹³C 비율은 -35‰ 미만 또는 -40‰,-45‰,-50‰,-55‰ 또는 -60‰ 미만이다. 그 밖의 실시예에 의하면, 상기 성분은 옥탄가 85-120이다. 또한 다른 실시예에 의하면, 상기 성분은 옥탄가 90 이상이다.

탄소 고정은 예컨대 광합성에 의해 구동되는 유기물인 독립 영양 생물의 공정으로서 이에 의해 무기 탄소가 유기 물질로 변환된다. 캘빈 회로는 탄소 고정의 가장 보편적인 방법이다. 고등 식물에서 탄소 고정은 광합성을 하는 동안 일정 타입의 탄소 고정을 포함한다. C3 고정은 무기 탄소를 유기 물질로 제조하는 초기 단계에 캘빈 회로를 이용하는 식물의 프로세서이며, 3-탄소 화합물을 제 1안정 매개체로 형성한다. 대부분의 엽육식물 및 온대지방의 식물은 C3이다. C4 고정은 무기 탄소를 4-탄소 화합물로 통합하는 반응을 하는 캘빈 회로로 시작하는 식물을 포함한다. C4 식물은 특정한 잎 구조를 갖는다. C4 경로는 강렬한 태양이 있는 열대 지방에서 찾을 수 있다. 사탕수수, 옥수수 등의 열대 식물이 C4 식물이며, 많은 엽육식물은 C4식물에 해당한다. 몇몇 식물은 건조한 조건에 대한 적응으로서 클레슐산 대사(CAM)를 이용한다. 밤 동안 기공으로 들어오는 이산화탄소는 유기산으로 전환되고, 기공이 닫혀있는 낮 동안 캘빈 회로에서 이산화 탄소를 배출한다. 다육식물 및 몇몇 선인장류가 CAM식물의 예이다.

또한, 최근에 캘빈 회로에서 탄소를 고정하기 위해 몇몇 독립 영양 미생물에 의해 이용되어지는 것으로 몇몇 다른 선택적인 경로가 알려졌다. 역 크랩스 회로는 시트르산 회로를 역으로 작동하는 것으로서, 예컨대, 몇몇 포토리토오토그래픽 유박테리아(photolithoautotrophic eubacteria) 및 몇몇 케모리토오토트로픽설페이트-환원 박테리아(chemolithoautotrophicsulfate-reducing bacteria)에 의해 이용된다. 환원성 아세틸 CoA 경로는 탄소를 고정하는 방법으로서 메타노제닉 아케박테리아(methanogenic archaebacteria), 아세토제닉(acetogenic) 및 몇몇 설페이트-환원 유박테리아(sulfate-reducing eubacteria)에서 발견되었다. 3-히드록시프로피오네이트 경로는 클로로플레서스(Chloroflexus) 속의 포토리토오토그래픽으로 성장한 유박테리아에서 발견되고, 탄소를 고정하는 방법으로서 어떤 케모리토오토그래픽으로 성장한 아케박테리아에서 수식된 형태로 발견된다.

몇몇 실시예에 의하면, 상술한 생산물(연료 생산물 등)은 무기 탄소원으로부터 유래한 하나 이상의 탄소를 포함한다. 실시예에 의하면, 상술한 바와 같이 생산물의 탄소의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%는 무기탄소원으로부터 유래한다. 무기 탄소원의 예는 이산화 탄소, 탄산염, 중탄산염 및 탄산을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 생산물은 광합성을 하는 동안 고정되는 무기 탄소원으로부터 탄소를 갖는 유기 분자일 수도 있다.

상기 생산물은 탄소 동위원소 분포(CID)에 의해 설명될 수 있다. 분자 레벨에서, CID는 분자 내부에 단일 탄소 원자의 통계적인 가능성이며, 탄소 동위 원소(예컨대, ¹²C, ¹³C, ¹⁴C)에 자연적으로 나타나는 것 중에 하나이다. 생산물의 벌크 레벨에서, CID는 하나 이상의 탄소 원자를 포함하는 화합물에서 자연적으로 나타나는 탄소 동위원소(예컨대, ¹²C, ¹³C, ¹⁴C)와 상당히 관련되어 있을 수도 있다. 각 화석 연료의 CID는 그 원료에 기초하여 다를 수도 있다는 점을 주의하면, CID(fos)(예컨대, 석유, 천연가스 및 석탄 등의 화석 연료 내의 탄소의 CID)는 CID(atm)(예컨대, 현재 대기의 이산화탄소 중 탄소의 CID)와 구별된다. 또한, CID(photo-atm)는 무기 탄소원은 대기 중의 이산화 탄소인 근래의 광합성에 의해 만들어진 탄소 기초 화합물의 CID를 나타낸다. CID(photo-fos)는 실질적으로 모든 무기 탄소원은 화석 연료(예컨대, 석탄, 천연 가스 및/또는 석유)의 연소에 의해 생성된 이산화탄소인 근래의 광합성에 의해 만들어진 탄소 기초 화합물의 CID를 나타낸다.

또한, 정확한 분포는 1) 분자를 생산하는 광합성 생물의 타입 및 2) 무기 탄소원에 의해 특정된다. 이러한 동위 원소 분포는 광합성으로 유래된 연료 생성물의 조성물을 정의하는데 사용될 수 있다.

탄소 동위 원소는 다른 화합물 사이 및 내에서 불균일하게 분포되어 있으며, 상기 동위 원소 분포는 물리적, 화학적, 탄소 전환과 관련된 물질 대사 공정에 관한 정보를 밝혀낼 수 있다. 광합성 생물 조직 내의 ¹²C에 대한 ¹³C의 전체적인 양은 는 대기 이산화탄소 중 탄소보다 적으며, 탄소 동위원소 감소는 광합성 생물 내로 이산화탄소의 통합으로 일어남을 제시한다.

대기의 이산화탄소는 약 1.1%의 비방사성 동위원소 ¹³C 및 98.9%의 ¹²C을 포함한다. 광합성 동안, 식물은 질량차에 의해 구분되는 화학적, 물리적 특성의 작은 차이로 인하여 ¹³C을 구별한다. 몇몇 실시예에 의하면, 이러한 구별은 식물을 다양한 광합성 군으로 지정하는데 사용될 수도 있다. 상기 실시예에 의하면, 이러한 구별은 광합성 생물로부터 추출되는 탄화수소원을 확인하는데 이용된다.

이산화탄소 중 ¹³C의 함량은 다음에 의해 정의된 R비의 고정밀 측정값으로 특별히 고안된 질량 분석계로 결정될 수 있다:

몇몇 실시예에 의하면, 생산물, 광합성 생물 또는 그 외의 물질은 예컨대 연소에 의한 분석 이전에 이산화탄소로 변환할 수 있다. 또 다른 실시예에 의하면, 광합성 생물로부터 추출된 개개의 화합물은 화학적 또는 효소적 분해에 의해 이산화탄소로 변환될 수 있다. 많은 자연 물질에서(예컨대, 식물, 동물 및 미네랄), R은 작은 분산과 편차에서 대략 0.0112이다.

R_sample 값은 δ¹³C 값으로 변환할 수 있다:

δ¹³C = [R_sample/R_standard] - 1 × 1000

상기 R_standard는 사우스 캐롤라이나에 Pee Dee formation으로부터 PDB로 알려진 석회암으로부터 얻어진 이산화탄소의 표준으로 R=0.01124이다. 본원에서 설명되는 것으로서, δ로 표시되는 모든 성분은 PDB에 관한 것이다.

δ¹³C의 단위는 퍼밀(per mil)(‰이라 함)이다. 보다 음성인 δ¹³C은 보다 많은 ¹²C를 갖는 조성물(예를 들어 중량으로 더 가벼움)을 말하며, 보다 양성인 δ¹³C는 ¹³ C를 더 갖는 조성물을 말한다. 대부분의 자연 물질은 PDB 표준보다 더 적은 ¹³C을 포함하고 있어서 음성인 δ¹³C을 갖는다.

수중 광합성 생물에서 측정된 탄소 동위원소 조합은 -11‰ 과 -39‰ 범위일 수 있으며, 수중 식물에서 C3, C4 모두 광합성 경로는 현존한다는 잘못된 인식에 잠재적으로 이를 수 있다. 모델은 수중 광합성 생물 내부에서 탄소 고정의 양을 분석하도록 발전되어 왔다. 일 실시예에 의하면, 조성물은 수중 광합성 생물로부터 추출되고 정제된다. 일 실시예에 의하면, 조성물은 수중 광합성 생물로부터 발생되며, 상기 조성물은 상기 생물로부터 추출되고 연료 생산물은 -32‰ 미만의 δ¹³C을 갖는다.

이산화탄소와 관련된 물리 및 화학적 공정이 ¹³C 을 구별하여 섭취하기 때문에 광합성 생물은 대기보다 더 적은 ¹³C 을 포함한다. 이러한 구별은 ¹³C 이 ¹²C보다 무겁기 때문이며, 조금 더 강한 화학 결합으로 형성될 수 있다. 또한, 질량차에 의해 ¹³CO₂ 의 확산은 ¹²CO₂ 의 확산보다 느릴 수 있다.

수중 광합성 생물의 광합성에서의 확산의 중요성으로 인해, 수중 광합성 생물의 δ¹³C 값은 육상 식물의 광합성보다 이해하기 더 어렵다. 물속에 용해된 무기 탄소의 확산은 공기 중 무기 탄소의 확산보다 더 느린 크기의 순서를 보인다. 예컨대, 수중에서 광합성 생물 무기 탄소 확산은 생물의 동위원소 분류에 한정될 수 있다. 공기 중 이산화탄소의 δ¹³C 값은 비교적 일정하고, 이산화 탄소에 용해된 δ¹³C 값은 변할 수 있지만, 용해된 이산화탄소는 대략 9‰로 용해된 중탄산염과는 다르다. 연구는 혼합과 함께 빠르게 흐르는 흐름 및 혼합과 확산이 아닌 쉽게 이용할 수 있는 무기 탄소원은 수중 광합성 생물의 방사성 분류를 제한하는 속도임을 보여주었다. 그러나, 유속이 느린 물에서, 동위원소 분류는 작아지는 것을 알 수 있었으며, 무기 탄소 확산은 동위 원소 분류를 한정한다는 것을 나타낸다.

또한, 자유 대기 중 동위 원소 성분은 변화하고, ¹³C는 천천히 고갈된다. 점진적인 δ¹³C의 감소는 화석 연료의 인공적인 연소에 기인한다. 1956년부터 1982년까지, 대기 중 이산화탄소의 δ¹³C은 -6.7‰(314ppm에서)로부터 -7.9‰(342ppm에서)까지 감소했다.

일반적으로, 지상 광합성, 탄소 고정에 의해 만들어진 탄소 화합물은 무기 탄소원과 비교하여 ¹²C가 풍부한 CID를 갖는다. 또한, CID(photo-fos)는 CID(photo-atm)보다 더 높은 퍼센트의 ¹²C 를 가질 것이다. 화석 연료원(고대의 광합성으로 ¹²C가 이미 풍부함)을 이용하여 광합성으로부터 만들어진 화합물 내의 탄소는 ¹²C가 훨씬 더 풍부할 것이다.

¹⁴C 는 지구 대기에서 발생한 탄소의 방사성 동위원소이다. ¹⁴C의 반감기는 대략 5,730년이다. 화석 연료 내의 무기 탄소가 수 만년 동안 격리되어 실질적으로 모든 ¹⁴C가 고갈됨으로 인해, 결과적으로 CID(atm)는 CID(fos)보다 훨씬 더 높은 퍼센트의 ¹⁴C를 갖는다. 비슷한 원리에서, CID(photo-atm)은 무기 탄소원 내 ¹⁴C의 차이를 반영하여 CID(photo-fos)보다 훨씬 더 높은 퍼센트의 ¹⁴C 를 갖는다. 따라서, CIS(atm)은 CID(fos)보다 더 높은 백분율의 ¹⁴C를 갖는다.

또한, 화석 연료에서 자연적으로 발생하는 탄화수소 분자가 일반적인 올레핀이 아님에 따라, 탄화수소 분자에서 추출된 석유 내 탄소 입체중심의 분포는 라세미 혼합물에 가깝다.

따라서, 생산물(예컨대, 연료 생산물)은 실질적으로 순수 물질 또는 순수 물질일 수 있으며, 적어도 2개의 탄소 원자, 하나 이상의 탄소-탄소 결합 및 광합성으로 만들어진 물질의 CID 특성을 가지며, 상기 무기 탄소원은 화석 연료이다. 몇몇 실시예에 의하면, 물질은 하나 이상의 이중 결합 및/또는 고유의 입체화학을 가질 수 있으며/비-라세미 혼합물일 수 있다.

생산물은 비관다발성, 진핵 생물성, 광합성 생물 등과 같은 광합성 생물에 의해 자연적으로 발생되지 않은 것일 수 있다. 또한 생산물은 비관다발성, 진핵 생물성, 광합성 생물 등과 같은 재조합 생물에 의해 발생된 것일 수 있다.

몇몇 실시예에 의하면, 생산물은 또한 수소 원자 및 산소, 질소, 및/또는 황 원자 등과 같은 선택적으로 하나 이상의 헤테로 원자를 포함한다. 물질 내의 탄소 원자는 예컨대, 무기원으로부터 탄소 원자(예컨대, 이산화탄소, 탄산염 또는 탄산으로부터)가 광합성을 하는 동안 고정되어 있을 때 발생하는 탄소 동위원소 분류 공정과 일치하는 레벨, ¹²C가 풍부한 동위원소 분포를 가질 수 있다.

따라서, 연료 생산물 등과 같은 생산물은 무기 탄소원(예컨대, 이산화탄소, 탄산염 또는 탄산으로부터), 물 및 전자기 방사선으로부터 직접적으로 합성될 수 있다. 합성은 유전적으로 변형된 비관다발성 광합성 생물에 의해 수행된다. 수식된 생물은 상기 생물에 하나 이상의 이종 핵산을 포함한다. 이종 핵산은 연료 생산물 등과 같은 생산물을 최종 생산물로 하는 효소를 하나 이상 암호화한다. 연료 생산물은 생물에서 자연적으로 생산되는 것은 아니다. 최종 생산물에서 탄소 원자는 적어도 50%, 90% 99% 또는 무기 탄소원(예컨대, 이산화탄소, 탄산염 또는 탄산)으로부터 한정적으로 기인할 수도 있다. 연료 생산물의 합성은 광합성(예컨대, 광 구동 탄소 고정)에 의해 이루어질 수 있다.

광합성을 하는 동안, 무기원으로부터 탄소 원자는 유기 탄소 분자 내로 고정된다. 고정을 수행하는 화학 공정은, 켈빈-벤자민 회로에서 루비스코 효소의 작용과 같이, 일정한 동위원소의 통합을 돕는다. 예컨대, ¹²C는 ¹³C 보다 우선적으로 고정된다. 따라서, 광합성을 통해서 생산된 유기 탄소 분자는 ¹²C가 풍부하다. 이러한 분류 공정에 의해 야기된 동위원소의 분류는 광합성적-구동 분자의 특성이다.

루비스코(루비스코-1,5-비스포스페이트 카르복실라아제/옥시게나아제)는 탄소 고정을 촉진시키는 캘빈 회로 내의 효소이다. 탄소 고정은 대기 이산화탄소의 원자가 수크로오스와 같은 에너지가 풍부한 분자의 형성 생물에 이용될 수 있도록 만들어진 공정이다. 루비스코는 이산화탄소 또는 산소를 가지는 리불로오스-1,5-비스포스페이트의 카복실화 또는 산소화를 촉진시킨다.

루비스코는 지구상에서 가장 풍부한 단백질일 수도 있다. 루비스코는 화학 작용에 의해 촉진되는데, 상기 화학 작용에 의해 무기 탄소가 생물권으로 들어간다. 또한, 루비스코는 고등 식물의 잎에서 가장 풍부한 단백질이다. 일 실시예에 의하면, 상술한 바와 같이 생물은 생물 내의 루비스코의 생산을 조절하도록 유전적으로 변형될 수 있다.

식물, 조류, 시아노박테리아 및 굴광성, 화학합성 독립 영양성 프로테오박테리아에서, 루비스코는 일반적으로 큰 사슬(사이즈가 약 55kDa) 및 작은 사슬(사이즈가 약 13kDa)이라는 두 가지 타입의 단백질 서브 유닛으로 구성된다. 효소 활성 기작 RuBP 결합 사이트는 각 큰 사슬로부터 이합체의 아미노산이 결합 사이트에 도움이 되는 이합체를 형성하는 큰 사슬 내에 위치한다. 전체 8개의 큰 사슬 및 8개의 작은 사슬은 약 540kDa의 거대 복합체를 만든다. 몇몇 프로테오박테리아 및 와편모조류에서 큰 서브유닛으로만 구성되는 효소가 존재할 수 있다. 마그네슘 이온은 효소 활동을 위해 필요로 한다. 효소의 활성에 마그네슘 이온의 정확한 위치는 카바메이트를 형성하는 활성 부위 내 리신에 활성화된 이산화탄소 분자의 첨가와 관련된다. 카바메이트의 형성은 알카리성 pH에서 유리하다. 유체 구획(예컨대, 엽록체의 스트로마) 내의 pH 및 마그네슘 농도는 빛에서 증가한다. 몇몇 실시예에 의하면, 마그네슘 이온은 엽록체 생물이 성장하는 동안 증가될 수 있다.

탄소 고정을 하는 동안, 루비스코에 대한 기질 분자는 RuBP, 기질 이산화탄소(예컨대, 활성 이산화탄소와는 상이함) 및 물이다. 또한, 루비스코는 이산화탄소 기질 대신 산소 분자를 발생하도록 하는 작용을 할 수 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 기질 이산화탄소는 배연 가스로부터의 이산화탄소이다.

이산화탄소가 기질인 경우, 카르복실라아제 반응의 생산물은 3-케토-2-카르복실아라비니톨 1,5-비스포스페이트로 알려진 상당히 불안정한 6-탄소 인산화 중간체이며, 실질적으로 매우 빠르게 두 분자의 글리세레이트 3-포스페이트로 분해된다. 3-포스포글리세르산은 글루코오스 등과 같은 큰 분자를 생산하는데 사용될 수 있다. 산소 분자가 기질인 경우, 산화 효소 반응의 생산물은 포스포 글리세르산 및 3-포스포글리세르산이다. 포스포 글리세르산은 미토콘드리아와 퍼록시좀에 위치하는 효소 및 시토크롬과 관련있는 광호흡이라 불리는 일련의 반응을 시작한다. 이 과정에서, 두 분자의 포스포글리세르산은 한 분자의 이산화탄소와 한 분자의 3-포스포글리세르산으로 변환되고, 캘빈 회로로 다시 들어간다. 상기 경로로 들어간 일부 포스포 글리세르산은 글리신과 같은 다른 분자를 생산하는 식물에 의해 유지될 수 있다. 공기 농도의 이산화탄소 및 산소에서, 반응율은 약 4 내지 1이며, 결과는 오직 3.5 알짜 이산화탄소 고정이다. 따라서, 산소와의 반응을 방지하게 할 수 없는 효소는 많은 식물의 광합성 잠재력을 상당히 감소시킨다. 몇몇 식물, 많은 조류 및 광합성 박테리아는 효소 주변에 이산화탄소의 농도를 증가시키는 수단을 나누고, C4 탄소 고정, 크래슐산 대사를 포함하며, 피레노이드를 이용함으로써 그 한계를 극복한다.

일 실시예에 의하면, 광합성 생물은 루비스코 경로 또는 루비스코 그 자체 내 효소의 생산을 상향 조절하거나 생산을 유전적으로 변형시킬 수 있다. 예컨대, 생물은 상술한 바와 같이 더 낮은 δ¹³C 비율을 갖는 연료 생산물과 같은 유기 생산물을 생산할 수 있다.

몇몇 효소는 1초에 수천 개의 화학 반응을 수행할 수 있다. 그러나, 루비스코는 느리며, 1초에 약 3개의 무기 탄소 분자만을 고정할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 광합성 생물의 고농도의 루비스코로 인해, 최상의 조건하에서 빛이 광합성을 제한하지 않는다면, 루비스코 반응은 이산화탄소 농도를 증가시키는데 긍적적으로 반응하며, 따라서 무기 탄소의 농도는 제한된다. 캘빈 회로의 최종 속도 제한 요소는 특정 다른 요소에 의해 단시간에 개선될 수 없는 루비스코이다. 일 실시예에 의하면, 무기 탄소는 농도가 제한되지 않는 충분히 높은 농도에서 광합성 생물에 제공되며, 루비스코에 의한 탄소 고정이 진행할 수 있다.

몇몇 실시예에 의하면, 루비스코는 RuBP가 밤에 생산되지 않고 캘빈 회로 내의 여러 다른 효소의 조절로 인해 보통 낮에 활성화된다. 또한, 루비스코의 활성은 다양한 방법에서 캘빈 회로의 다른 효소의 경로와 동조된다. 엽록체에 조명을 가하면, 틸라코이드 막을 가로질러 생성되는 양성자 구배로 인해 스트로마의 pH는 7.0으로부터 8.0까지 증가한다. 동시에 마그네슘 이온은 틸라코이드 외부로 이동하며, 엽록체의 스트로마 내부 마그네슘의 농도는 증가한다. 루비스코는 매우 이상적인 pH(마그네슘 이온 농도에 따라 >9.0)를 가지며, 상술한 바와 같이 활성 부위에 이산화탄소 및 마그네슘의 첨가에 의해 활성화된다. 일 실시예에 의하면, 연료 생산물은 조명하에서만 성장되는 생물에 의해 생산될 수 있다. 상기 방법의 다른 실시예에 의하면, 생물의 성장 매체의 pH는 조절될 수 있다.

몇몇 실시예에 의하면, 또 다른 효소, 루비스코 액티바제는 루비스코의 활성 부위 내 카바메이트의 빠른 형성을 하도록 요구된다. 액티바제는 RuBP 기질이 카바메이트가 부족한 활성 부위에 더 강하게 결합하며, 활성 과정을 늦출 수 있다. 이러한 관점에서, 루비스코 액티바제는 촉매 부위로부터 억제성 또는 어떤 시각에서 저장성 RuBP의 방출을 촉진한다. 또한, 루비스코는 밤에 유사체 2-카르복시-D-아라비티놀 1-포스페이트(CA1P) 기질인 식물에 의해 합성되는 경쟁적 저해제에 의해 방해받기 때문에, 액티바제는 몇몇 식물(예컨대, 담배 및 많은 콩류)에서 요구된다. CA1P는 카르바밀화 루비스코의 활성 부위에 단단히 결합되어 촉매 활동을 저해한다. 이러한 관점에서, 또한 루비스코 액티바제는 촉매 부위로부터 CA1P의 방출을 촉진한다. CA1P는 루비스코로부터 방출된 후, 광활성화 CA1P-포스파타아제에 의해 형성된 비저해제로 빠르게 전환된다. 최종적으로, 매번 반응할 때마다, 이산화탄소 또는 산소의 일반적인 반응은 완전하지 않으며, 다른 저해 기질 유사체는 활성 부위에서 형성된다. 다시 한번, 루비스 액티바제는 촉매 부위로부터 이들 유사체의 방출을 촉진하고 촉매적으로 활성 형태로 효소를 유지할 수 있다. 액티바제의 특성은 높은 온도에서 식물의 광합성 잠재력을 제한할 수 있다. 또한, CA1P는 단백질 분해로부터 보호되는 구조에서 루비스코를 유지하는 것을 보여준다. 몇몇 실시예에 의하면, 루비스코 액티바제는 광합성 생물에 의해 상향 조절될 수 있다. 예컨대, 생물은 더 많은 루비스코 액티바제를 생산하기 위해 유전적으로 변형될 수 있다.

루비스코 활성 부위에서 이산화탄소 및 산소는 경쟁하기 때문에, 루비스코에 의한 탄소 고정은 루비스코(예컨대, 엽록체 스트로마)를 함유하는 구획에서 이산화탄소의 농도를 증가함으로써 강화될 수 있다. 일 실시예에 의하면, 연료 생산물을 생산하기 위한 광합성 생물의 변형은 스크로마 내의 이산화탄소의 농도를 증가할 수 있다. 루비스코가 기질로서 산소를 이용하는 경우, 이러한 과정은 고광속(high light flux) 주기 동안 과부하를 방지하기 위한 매커니즘일 수 있다. 예컨대, 이산화탄소에서 산소의 비율이 탄소 대신 고정된 산소인 기준치에 이르는 경우, 밝은 빛에서 광합성 생물은 알짜 탄소 고정은 제로일 수 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 초과 무기 탄소는 빛과 온도는 생물 내의 탄소 고정을 제한하지 않도록 광합성 생물에 제공될 수 있다.

상기 실시예와 같이, 루비스코는 식물 광합성을 제한하는 비율이 종종 있으므로, 광합성 효율은 광합성 생물 내 루비스코 유전자를 루비스코 촉매 활동을 증가 및/또는 산소화 활동을 감소하도록 변형시킴으로써 개선될 수 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 루비스코를 암호화하는 하나의 생물로부터의 이종 핵산은 또 다른 광합성 생물로 변형된다. 예컨대, -32‰ 미만의 δ¹³C 을 갖는 연료 생산물을 생산하기 위하여 생물을 변형하는 것은 루비스코 서브유닛의 발현 레벨이 증가하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 실시예에 의하면, 루비스코의 작은 사슬은 엽록체 DNA로부터 발현될 수 있다. 다른 실시예에 의하면, 루비스코를 암호화하는 핵산은 예컨대, 이산화탄소에 대한 특이성이 증가 또는 탄소 고정의 비율이 증가하도록 변형 또는 수정될 수도 있다.

일 실시예에 의하면, 자연적으로 높은 특이성 값을 갖는 루비스코 변형은, 예컨대 홍조류 갈디에리아 파르티타(galdieria partita)로부터 제한되지 않는다면, 일정량의 탄소 고정으로 연료 생산물의 생산을 위한 광합성 생물로 변형될 수 있다. 예컨대, 생물에서 루비스코 또는 탄소 고정의 특이성을 개선함으로써, 광합성 생물의 광합성 효율 또는 성장을 개선할 가능성도 있다.

일 실시예에 의하면, 수중 광합성 생물은 무기 합성물의 원료와 접촉하며, 상기 생물은 연료 생산물을 생산한다. 무기 탄소원은 화석 연료로부터 기인할 수 있다. 예컨대, 화석 연료의 연소는 수중 광합성 생물에 제공될 수 있는 무기 탄소를 생산할 수 있다. 화석 연료의 산화는 배연 가스를 생산할 수 있다. 배연 가스는, 예컨대, 난로, 오븐, 용광로, 보일러 또는 증기 발생기로부터 배출 가스를 운반하기 위한 파이프 또는 채널인 배연을 통해서 대기에 존재하는 가스이다. 일 실시예에 의하면, 배연 가스는 발전 장치에서 산화 소진 가스를 말한다. 배연 가스의 성분은 연소되는 것에 따라 다르지만, 과잉 산소(또한, 산화 공기로부터 유래한)라라기 보다는 산화 공기, 이산화탄소 및 물로부터 유래한 거의 대부분 질소로 구성된다. 예컨대, 발전소에서 연소된 1톤의 오일 또는 석탄 연료에서, 배연 가스는 3 에서 3.5톤의 이산화탄소를 포함한다. 배연 가스는 대기를 오염시킬 수 있다.

일 실시예에 의하면, 배연 가스는 대기 이산화탄소의 δ¹³C 보다 더 많은 δ¹³C 갖는 이산화탄소를 포함한다. 수중 광합성 생물이 배연 가스와 접촉하는 경우,(예컨대, 바이오 리액터 또는 연못을 통과한 배연 가스를 기포화함으로써) 수중 광합성 생물에 의해 발생되는 유기 탄소는 배연 가스 이산화탄소 δ¹³C에 가까운 값을 갖는다. 그러나, 상술한 바와 같이, 유기 분자 내에 생물의 무기 탄소원에 의한 탄소 고정은 상기 생물 내에 무기 탄소원의 확산에 의해 제한될 수 있다. 생물 내에서 탄소 고정의 확산 제한은 해양 생물종에서 알려질 수 있다. 예컨대, 상기 무기원이 제한되거나 생물 내로 충분히 빠른 비율로 확산되기만 한다면, 생물은 탄소 고정을 하는 동안 ¹³C 보다 ¹²C를 충분히 우선시하지 않을 수도 있다. 루비코스에 의해 이산화탄소를 운반하는 조류는 주변의 이산화탄소 농도(예컨대, Kerb and Raven 1985 Adv. Bot. Res .11:71-123)에 의하여 변하는 동위원소 분류를 나타낸다. 실험에서, 또한 △(종종 0‰에 가까움)로 알려진 작은 동위원소 분류는 이산화탄소가 제한되는 경우에 관찰되고, 20‰ 이상의 분류는 이산화탄소 농도가 높을 경우에 관찰된다. 몇몇 연구에 의하면, 동위원소 분류는 이산화탄소 가용성 차이로 인하여 대부분의 차이와 함께 전체 범위에서 다양할 수 있다.

일 실시예에 의하면, 조류는 대기 무기 탄소원과 접촉하며 성장하며, 약 -13‰의 δ¹³C 갖는 배연 가스를 생산한다. 다른 실시예에 의하면, 조류는 배연 가스 무기 탄소원과 접촉하며 성장하며, 약 -22‰의 δ¹³C 갖는 배연 가스를 생산한다. 반면, 다른 실시예에 의하면, 조류는 확산이 무기 탄소의 탄소 고정을 제한하지 않는 과잉 배연 가스 무기원과 접촉하며 성장하고, 약 -52‰의 δ¹³C 갖는 배연 가스를 생산한다. 일 실시예에 의하면, 과잉 화석 연료 무기 탄소원과 접촉하여 성장한 조류는 약 -32 ‰미만의 δ¹³C 갖는 연료 생산물을 생산한다. 몇몇 실시예에 의하면, 과잉 무기 탄소원은 광합성 생물 내부 탄소 고정의 확산 제한하지 않는 원료이다.

본 발명은 수소 및 탄소 원자를 포함하는 분자를 포함하는 성분을 포함하는 연료 생산물이고, 상기 수소 및 탄소 원자는 조성물 중량의 적어도 80%이며, 상기 조성물의 δ¹³C 비율은 -32‰ 미만이며, 연료 성분이다. 몇몇 실시예에 의하면, 조성물의 δ¹³C 비율은 약 -35‰, -40‰. -45‰, -50-‰, -55‰, 또는 -60‰ 미만이다. 몇몇 실시예에 의하면, 연료 성분은 화석 연료, 가솔린, 디젤, 에탄올, 제트 엔진, 또는 이들의 어떠한 조합일 수도 있는 연료의 혼합물이다. 또한 다른 실시예에 의하면, 혼합 연료는 -32 ‰ 이상의 δ¹³C 비율을 갖는다. 상술한 몇몇 연료 생산물에 대하여, 연료 성분은 MTBE, 항산화제, 정전기 방지제, 부식 방지제 및 이들의 어떠한 조합일 수도 있는 연료 첨가제이다. 몇몇 실시예에 의하면, 조성물은 이소프렌 단위를 더 포함한다. 다른 실시예에 의하면, 구성물은 테르펜을 포함한다. 몇몇 실시예에 의하면, 조성물은 중성지방 또는 지방산을 포함한다. 그 외의 실시예에 의하면, 수소 및 탄소 원자는 조성물 중량의 적어도 90%이다. 예컨대, 지방산 메틸 에스테르 연료 및 바이오 디젤은 중량 단위로 약 89.5% 미만의 수소 및 탄소 성분을 갖는다. 몇몇 실시예에 의하면 조성물은 지방산 또는 지방산 에스테르 또는 메탄이 아니다. 또한 다른 실시예에 의하면, 상기 수소 및 탄소 원자는 조성물 중량의 적어도 95% 또는 99%이다. 반면 다른 실시예에 의하면 상기 수소 및 탄소 원자는 조성물 중량의 100%이다. 몇몇 연료 생산물에 대하여, 조성물은 테르펜이다. 몇몇 실시예에 의하면 조성물은 액체이다.

상술한 바와 같이, 연료 생산물은 조성물과 연료 성분을 혼합함으로써 발생되는 생산물일 수도 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 연료 생산물은 -32‰ 이상의 δ¹³C비율을 갖는다. 다른 실시예에 의하면, 연료 생산물은 -32‰ 미만의 δ¹³C 비율을 갖는다. 예컨대, 생물로부터 추출된 조성물은 상술한 바와 같이 연료 생산물을 생성하기 위하여 정제(예컨대, 분해)하기 전에 연료 성분으로 혼합될 수 있다. 조성물은 상술한 바와 같은 성분일 수 있다. 조성물은 수소 및 탄소 원자가 조성물 중량의 적어도 80%이고 조성물의 δ¹³C 비율이 -32‰ 미만인 조성물을 포함하는 생물로부터 추출되는 오일 성분일 수 있다. 상술한 바와 같이 연료 성분은 화석 연료 또는 연료 생산물을 생성하기 위한 혼합 블렌드일 수 있다. 예컨대, 연료를 블렌딩하기 위한 혼합은 또 다른 탄화수소 혼합으로 연료 생산물을 생성하기 위한 블렌딩에 적합한 탄화수소 혼합일 수도 있다. 예컨대, 경 알칸(light alkane)의 혼합은 일정 타입의 연료로 적합한 확실한 옥탄가는 아니지만, 연료 생산물을 생성하기 위한 고 옥탄 혼합을 갖도록 블렌딩될 수 있다.

일 실시예에 의하면, -32‰ 미만의 δ¹³C 비율을 갖는 조성물은 연료 블렌딩이 연료 생산물을 생성하도록 탄화수소 혼합함으로 블렌딩된다. 몇몇 실시예에 의하면, 조성물 또는 연료 성분은 그 자체로는 연료 생산물로써 적합하지 않지만 이들이 결합하면 연료 생산물을 포함한다. 그외의 실시예에 의하며, 조성물 또는 연료 성분 중 하나 또는 양자 모두는 연료 생산물로서 적합하다. 반면 다른 실시예에 의하면, 연료 성분은 가솔린 또는 제트 연료 등과 같은 현존하는 석유 생산물이다. 반면, 그외 실시예에 의하면, 연료 성분은 바이오 에탄올, 바이오디젤, 바이오가솔린 등과 같은 재생 가능 원료로부터 추출된다.

상술한 본 발명은 조성물을 산화함으로써 -32‰ 미만의 δ¹³C 비율을 갖는 이산화탄소가 발생하는 이산화탄소를 생성하는 방법을 더 제공한다. 몇몇 실시예에 의하면, 이산화탄소는 약 -35‰, -40‰, -45‰, -50-‰, -55‰, 또는 -60‰ 미만의 δ¹³C 비율을 갖는다. 산화 단계는 가솔린 엔진, 디젤 엔진 또는 제트 엔진에서 수행될 수도 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 상기 방법은 비관다발성 광합성 생물로부터 조성물을 추출하는 것을 포함한다. 비관다발 광합성 생물의 예는 조류, 시아노 박테리아 및 선태류를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일 실시예에 의하면, 조성물을 추출하는 것은 수중 광합성 생물로부터 성분을 추출하는 것을 포함한다. 상기 방법은 생물 내의 효소를 상향 조절하는 단계를 더 포함할 수도 있으며, 상기 효소의 생산물은 상기 조성물이다. 몇몇 실시예에 의하면, 효소는 생물 내에서 자연적으로 발생하지 않는다. 예시적인 효소는 본 발명에서 더 논의된다. 또 다른 실시예에 의하면, 예시적인 핵산 배열은 본 발명에서 더 논의된다.

연료 생산물을 생성하는 방법은 비관다발성 광합성 생물을 생육하고; 상기 생물을 배연 가스와 접촉하고; 상기 배연 가스로부터 연료 생산물에 ¹³C를 통합하고; 비관다발성 광합성 생물로부터 상기 연료 생산물을 추출하는 것을 포함한다. 예컨대, 상기 비관다발성 광합성 생물은 바이오 리액터에서 성장할 수 있다. 이와 같은 실시예에 의하면, 생물은 배연 가스(예컨대, 비관다발성 광합성 생물을 성장시키기 위한 액체를 포함하는 바이오 리액터 내에 배연 가스를 기포화함)를 바이오 리액터에 주입함으로써 배연 가스와 접촉할 수 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 상기 비관다발성 광합성 생물은 조류이다. 그 외의 실시예에 의하면, 상기 바이오 리액터는 일반적인 연못이다. 다른 실시예에 의하면 상기 바이오 리액터는 폐쇄적 광반응기이다. 몇몇 실시예에 의하면, 상기 방법은 생물을 유전적으로 변형시키는 단계를 더 포함한다. 생물의 유전적 변형의 예시적인 방법은 본 발명에서 상술한다. 몇몇 실시예에 의하면, 생물을 유전적으로 변형하는 것은 생물 내에 연료 생산물을 생산하는 효소를 상향조절하거나 생산할 수 있다. 그 외 실시예에 의하면, 생물을 유전적으로 변형하는 것은 생물의 성장을 개선할 수 있다. 반면, 다른 실시예에 의하면, 생물의 유전적인 변형은 예를 들면 탄소 고정의 비율 또는 양을 변경해서 생물 내부의 탄소 고정에 영향을 미칠 수 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 연료 생산물은 생물내에서 자연적으로 발생하진 않는다. 연료 생산물은, 수소 및 탄소 원자가 조성물 중량의 적어도 90%이고, 조성물의 δ¹³C 비율이 -32‰ 미만인 수소 및 탄소 원자를 포함하는 분자를 포함할 수도 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 이산화탄소 생성 방법은 상기 연료 생산물을 정제하는 단계를 포함한다. 예시적인 정제 방법은 본 발명에서 상술한다.

또한, 상술한 본 발명은 제 1 연료 생산물을 생산하는 비관다발성 광합성 생물을 생육시키고; 상기 생물을 무기 탄소원과 접촉시키고; 무기 탄소원으로부터 탄소를 -32‰ 미만의 δ¹³C 비율을 갖는 상기 제 1 연료 생산물과 통합하는 것을 포함하는 비관다발상 광합성 생물로부터 연료 생산물을 발생시키는 방법을 제공한다. 몇몇 실시예에 의하면, 무기 탄소원은 ¹³C를 포함하는 이산화탄소 및 ¹²C를 포함하는 이산화탄소를 포함한다. 몇몇 실시예에 의하면, 무기 탄소원은 화석 연료 무기 탄소이다. 그외 실시예에 의하면, 무기 탄소는 -32‰ 이상의 δ¹³C 비율을 갖는다. 몇몇 실시예에서, 생물을 무기 탄소원과 접촉시키는 것은 생물을 과잉 무기 탄소원과 접촉시키는 것을 포함한다. 예컨대, 과잉 무기 탄소는 생물 내의 탄소 고정이 무기 탄소원에 의해 제한되지 않도록 무기 탄소의 양을 설명할 수 있다. 또 다른 실시예에 의하면, 과잉 무기 탄소는 상기 과잉 무기 탄소와 접촉한 생물에 의해 생성되는 연료 생산물의 δ¹³C 비율이 화석 연료의 δ¹³C 비율 미만이 되도록 무기 탄소의 양을 설명할 수 있다. 예컨대, 과잉 무기 탄소로부터 통합되는 무기 탄소를 갖는 연료 생산물의 δ¹³C 비율은 -32‰, -35‰, -40‰, -45‰, -50-‰, -55‰, 또는 -60‰미만일 수 있다.

몇몇 실시예에 의하면, 생물은 효소의 최종 생산물이 제 1 연소 생산물인 하나 이상의 효소를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함한다. 그외 실시예에 의하면, 상기 핵산은 이종이다. 제 1 연료 생산물은 생물에 의해서 자연적으로 생산되지 않을 수도 있다. 몇몇 실시예에 의하면 상기 제 1 연료 생산물은 -32‰ 미만의δ¹³C 비율을 갖는다. 그외 실시예에 의하면, 제 1 연료 생산물은 테르펜을 포함한다. 화석 연료 무기 탄소는 32‰ 이상의δ¹³C 비율을 갖는다. 몇몇 실시예에 의하면, 제 1 연료 생산물은 상기 생물로부터 추출된다. 제 1 연료 생산물은 분해되기 용이할 수도 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 상기 방법은 연료 성분에 제 1 연료 생산물을 첨가하는 것을 더 포함한다. 몇몇 실시예에 의하면, 상기 방법은 상기 제 1 연료 생산물을 산화하고, 무기 탄소를 풍부하게 하는 δ¹³C를 생성하는 것을 더 포함한다. 몇몇 실시예에 의하면, 무기 탄소를 풍부하게 하는 δ¹³C는 -32‰ 미만의δ¹³C 비율을 갖는다. 상술한 방법은 제 2 연료 생산물을 발생시키는 제 2 비관다발성 광합성 생물을 배양하고; 상기 생물을 무기 탄소원과 접촉시켜서, 제 2 연료 생산물 내 탄소가 상기 원료로부터 유래하도록 하며, 상기 무기 탄소는 δ¹³C 강화된 무기 탄소이다. 예컨대, 제 2 연료 생산물 내의 탄소는 무기 탄소원으로부터 탄소를 통합시킨다. 상기 방법은 무기 탄소원으로부터 탄소를 상기 제 2 연료 생산물과 통합하는 것을 포함한다. 몇몇 실시예에 의하면, 상기 제 1 연료 생산물 및 제 2 연료 생산물은, 제 1, 제 2 연료 생산물의 탄소 동위 원소 분배를 제외하면 실질적으로 동일하다. 상기 제 2 연료 생산물은 -35‰, -40‰, -45‰, -50-‰, -55‰, 또는 -60‰ 미만의 δ¹³C 비율를 갖는다.

여기에서 상기 조성물들 및 방법들을 이용하여 생산될 수 있는 탄화수소 및 탄화수소 유도체 생산물들의 예들은 테르펜들 및 그의 유도체들인 테르페노이드들을 포함한다. 본 발명에서 사용되는 것과 같이, 테르펜은 이소프레노이드 또는 테르페노이드와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 테르펜은 이소프렌(C5) 단위들로 이루어진 분자이다. 테르펜은 필수적으로 순수한 탄화수소는 아니다. 테르페노이드(또한 이소프레노이드로 알려짐)는 테르펜으로부터 유래되었지만, 산소, 탄소 골격 재배열 및 알킬화와 같은 이종 원자의 첨가로 수식된다. 설명된 바와 같이, 테르페노이드는 본 발명에서 사용되는 것으로서 용어 테르펜으로 이해될 수 있다. 카로텐 및 산토필과 같은 카르테노이드는 유용한 생산물로서 테르페노이드의 예이다. 스테로이드는 테르페노이드의 다른 예이다.

테르펜의 예들은, 이에 제한되지는 않지만, 헤미테르펜, 모노테르펜, 세스퀘테르펜, 디테르펜, 트리테르펜, 및 테트라테르펜을 포함한다. 본 발명에서 사용되는 것으로서, 용어 헤미테르펜, 모노테르펜, 세스퀴테르펜, 디테르펜, 트리테르펜 및 테트라테르펜은 또한 이소프레노이드와 유사한 구조를 나타낼 수 있다(예를 들어, 세스퀴테르페노이드). 테르펜의 다른 예들은 이에 제한되지는 않지만, 리모넨, 1,8-시네올, α-파이넨, 캄펜, (+)-사비넨, 미르센, 스쿠알렌, 쿠파렌, 피톨, 파네센, 아비에타디엔, 텍사디엔, 파네실 피로포스페이트, 아모르파디엔, (E)-α-비사볼렌, 또는 디아포피토엔, 및 이들의 유도체를 포함한다.

생산된 생산물들은, 형질전환된 숙주 세포 및 생물(들)에 의해 자연적으로 생산 또는 자연적으로 생산되지 않을 수 있다(형질전환의 결과). 생산물은 자연에 존재하지 않는 신규의 분자일 수도 있다. 예로서, 조류에서 자연적으로 생산된 생산물들은 카로티노이드들(예로서, 베타-카로틴)과 같은 테르펜들일 수 있다. 조류에 의해 자연적으로 생산되지 않는 생산물들의 예들은 리모넨과 같은 비-천연 테르펜을 포함한다.

종종 정제 후에 숙주 세포로부터 생산된 몇몇 연료 생산물은, 예컨대 동일한 구조의 석유 화학 제품에 존재하는 것과 동일할 것이다. 몇몇 연료 생산물은 석유 화학 제품에 존재하는 것과 동일하지 않을 수도 있다. 일 실시예에 의하면, 연료 생산물 또는 조성물은 동위원소 분배를 제외하면 석유 화학 제품에 존재하는 것과 동일하다. 예컨대, -32‰ 미만의 δ¹³C 비율을 갖는 것은 화석 연료 석유 화학 제품이 아닌 것으로 여겨지는 반면, 상술한 연료 생산물은 -32‰, -35‰, -40‰, -45‰, -50-‰, -55‰, 또는 -60‰ 미만의 δ¹³C비율을 가질 수 있다. 또 다른 실시예에 의하면, 연료 생산물 또는 조성물은 유사하지만 현존하는 화석 연료 석유 화학 제품과 동일하지 않고, -32‰, -35‰, -40‰, -45‰, -50-‰, -55‰, 또는 -60‰ 미만의 δ¹³C비율을 갖는다. 그러나, 분자가 종래 석유 화학 제품 또는 정제물로 존재하지 않을 수도 있지만, 이는 이들 산업에 여전히 유용할 것이다. 예컨대, 탄화수소는 가솔린의 끓는점 범위 내에서 생산될 수 있고, 상기 탄화수소가 가솔린에서 일반적으로 발생하지 않음에도 불구하고, 가솔린 또는 첨가제로서 사용될 수 있다.

Ⅱ. 생산

본원에서 설명된 어떠한 생산물은 이러한 생물에 의하여 생산물의 생산을 일으키기 위하여 형질전환에 의하여 제조될 수 있다. 상기 생물은 형질전환 이전 또는 후 광합성 특성이 있을 수 있다.

생물

여기에서의 상기 조성물들 및 방법들을 이용하여 형질전환될 수 있는 생물들의 예들은 관다발성 및 비관다발성 생물들을 포함한다. 상기 생물은 원핵성 또는 진핵성일 수 있다. 상기 생물은 단세포 또는 다세포일 수 있다.

비관다발성 광합성 생물들의 예들은, 브리오파이트들(bryophtyes), 마르칸티오파이트들(marchantiophytes) 또는 안토세로토파이트들(anthocerotophytes)을 포함한다. 일부 경우들에서, 상기 생물은 시아노박테리아다. 일부 경우들에서, 상기 생물은 해조류(예로서, 거대해조류 또는 미세해조류)이다. 상기 해조류는 단세포성 또는 다세포성일 수 있다. 일부 경우들에서, 상기 생물은 홍조식물, 녹조식물, 부등편모조식물, 트리보파이트(tribophyte), 회조식물, 클로라크니오파이트(chlorarachniophyte), 유글레나조류, 착편모조식물, 크립토모니드(cryptomonad), 와편모충 또는 식물플랑크톤이다.

예로서, 미세해조류인 클라미도모나스 레인하르티(Chlamydomonas reinhardtii)는 리모넨 신타제를 암호화하는 벡터로 형질전환되어 리모넨을 생산할 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 미세조류는 리모넨 생산성을 향상시키기 위하여 리모넨 신타제 및 단백질을 암호화하는 하나 또는 그 이상의 벡터로 형질전환될 수 있다.

본 발명의 방법들은 미세해조류인, C. 레인하르티를 사용하여 예시된다. 본 발명의 방법에 따른 폴리펩티드 또는 단백질 복합체를 발현하는 미세해조류들의 이용은, 상업적인 것을 포함하는 (시아노테크 사(Cyanotech Corp.); Kailua-Kona HI) 상기 미세해조류들의 큰 개체군들을 성장시킬 수 있어서, 이에 따라 원하는 생산물의 생산 및 원하는 경우 그의 대량 분리를 가능하게 하는 장점을 제공한다. 그러나, 예로서, 단백질 복합체들을 포함하는, 기능성 포유류 폴리펩티드들 임의의 식물의 엽록체들에서 발현하는 능력은 그러한 식물들의 작물들의 생산을 가능하게 하며, 따라서, 그 폴리펩티드들을 대량으로 편리하게 생산하는 것을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명의 방법들은 예로서, 미세해조류 및 거대해조류, 예로서 해양 해조류 및 해초, 토양에서 자라는 식물들을 포함하는, 엽록체들을 갖는 임의의 식물을 사용하여 실시될 수 있다.

"식물"이라는 용어는 색소체들, 특히 엽록체들을 포함하고, 임의의 발생 단계에 있는 임의의 그러한 생물들을 포함하는, 진핵 생물들 또는 식물 세포, 식물 세포 배양물, 식물 기관, 식물 종자 및 묘목을 포함한 식물의 일부를 의미하는 것으로 여기에서 광범위하게 사용된다. 식물 세포는 원형질체 및 세포벽을 포함하는, 식물의 구조적 및 생리학적 단위이다. 식물 세포는 분리된 단세포 또는 배양된 세포의 형태일 수 있거나, 또는 보다 고등 조직된 단위의 일부, 예로서 식물 조직, 식물 기관 또는 식물일 수 있다. 따라서, 식물 세포는 원형질체, 배우자 생성 세포, 또는 전체 식물로 재생될 수 있는 세포 또는 세포들의 모임일 수 있다 이와 같이, 다수의 식물 세포들을 포함하고 전체 식물로 재생가능한, 종자는 본 개시의 목적을 위한 식물 세포로 고려된다. 식물 조직 또는 식물 기관은 종자, 원형질체, 캘러스 또는 구조적 또는 기능성 단위로 조직화되는(organized) 임의의 다른 군들의 식물 세포들일 수 있다. 식물의 특히 유용한 부분들은 수확가능한 부분들 및 자손 식물들의 번식에 유용한 부분들을 포함한다. 식물의 수확가능한 부분은 예로서 식물들, 꽃가루, 묘종, 괴경, 잎, 가지, 과일, 종자, 뿌리 등의 식물의 임의의 유용한 부분일 수 있다. 번식에 유용한 식물의 부분은 예로서, 종자, 과일, 삽목, 묘종, 괴경, 근경 등을 포함한다.

본 발명의 방법은, 안정되게 통합된 폴리뉴클레오티드(Hager 및 Bock, Appl . Microbiol. Biotechnol. 54:302-310, 2000)를 포함하도록 유전학적으로 변경된 엽록체들을 포함하는 식물을 생성할 수 있다. 따라서, 본 발명은 기능성 단백질 복합체를 형성하도록 특이적으로 연합할 수 있는 폴리펩티드들을 포함하는, 하나 이상의 이종성 폴리펩티드들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 엽록체들을 포함하는, 유전형질전환(트랜스플라스토믹: transplastomic) 식물, 예로서 C. 레인하르티를 더 제공한다. 본 발명의 광합성 생물은 생산물을 생성하도록 변경된 적어도 하나의 숙주 세포를 포함한다.

발현 벡터 및 숙주 세포 형질전환

여기에서 상기 생물들/숙주 세포들은 생산물(들)의 생산을 변경하도록, 발현 벡터로 형질전환되어, 예로서 생산물(들)의 생산을 증가시킬 수 있다. 상기 생산물(들)은 그 생물에 의해 자연적으로 또는 자연적으로 생산되지 않을 수 있다.

상기 발현 벡터, 또는 그의 선형화 부분은 하나 이상의 상동성 또는 이종성 뉴클레오티드 서열들(숙주 생물로부터 또는 상이한 생물로부터 유도된) 및/또는 하나 이상의 자가성 뉴클레오티드 서열들(동일한 생물로부터 유도된) 및/또는 상동성 또는 이종성 폴리펩티드들을 암호화하는 것들을, 암호화할 수 있다. 해조류 숙주 세포 내로 형질전환될 수 있는 이종성 뉴클레오티드 서열들의 예들은 세균, 곰팡이 식물, 광합성 세균 또는 기타 해조류들로부터의 유전자들을 포함한다. 해조류의 숙주 세포 내로 형질전환될 수 있는 자가성 뉴클레오티드 서열들의 예들은, 두 개의 포스페이트들을 갖는 이소프레노이드들(예로서, GPP 신타제, FPP 신타제)을 생산하는 단백질들을 암호화하는 유전자들을 포함하는 이소프레노이드 생산 유전자들, 내생의 프로모터들, 및 psbA, atpA, 또는 rbcL 유전자들로부터의 5'UTRs을 포함한다. 일부 경우들에서, 이종성 서열은 두 개의 자가성 서열들 또는 상동성 서열들에 의해 측면근접된다. 상동성 서열들은 숙주 세포에서의 그 서열에 대해 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%의 상동성을 갖는 것들을 포함한다. 일부 경우들에서, 상동성 서열은 두 개의 자가성 서열에 의해 측면근접된다. 제 1 및 제 2의 상동성 서열들은 이종성 서열의, 그 숙주 생물의 게놈 내로의 재조합을 가능하게 한다. 상기 제 1 및 제 2 상동성 서열들은 적어도 100, 200, 300, 400 또는 500 뉴클레오티드들의 길이일 수 있다.

상기 발현 벡터는 형질전환되는 생물에서의 발현에 대해 코돈 바이어스된 뉴클레오티드 서열들을 포함할 수 있다. 당 분야의 숙련자는, 소정의 아미노산을 특정하기 위한 뉴클레오티드 코돈들의 이용에서 있어서, 특정 숙주 세포에 의해 나타내어지는 "코돈-바이어스(codon-bias)"를 잘 알 것이다. 이론에 구속됨이 없이, 숙주 세포가 선호하는 코돈들을 사용함에 의해, 번역 속도는 더 커질 수 있다. 따라서, 숙주 세포에서의 개선된 발현을 위한 유전자를 합성하는 경우, 유전자의 코돈 이용의 빈도가 그 숙주 세포의 선호된 코돈 이용의 빈도에 접근하도록, 그 유전자를 설계하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 코돈들은 일반적으로 A/T가 풍부한 것으로, 예로서, 코돈들의 세번째 뉴클레오티드 위치에서 A/T가 풍부하다. 전형적으로, 상기 A/T 풍부 코돈 바이어스는 해조류에서 사용된다. 일부 구체예들에서, 코돈들의 세번째 뉴클레오티드 위치의 적어도 50%는 A 또는 T이다. 다른 구체예들에서, 코돈들의 세번째 뉴클레오티드 위치의 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 99%는 A 또는 T이다.

유전조작된 해조류 계통의 구축을 위한 한 시도는, 관심 대상의 유전자를 암호화하는 핵산, 전형적으로 전구체를 연료 생산물 또는 연료 생산물의 전구체로 전환시킬 수 있는 효소의 형질전환을 포함한다. 일부 구체예들에서, 형질전환은, 숙주 해조류 세포의 임의의 색소체(예로서, 엽록체) 내로 핵산들을 도입할 수 있다. 형질전환된 세포들은 전형적으로, 외생의 핵산들의 도입 후 선택적 배지 상에 플레이트된다(plated). 이 방법은 스크리닝을 위한 몇몇 단계들을 포함할 수도 있다. 먼저, 외생의 핵산들의 적절한 삽입을 갖는 클론들이 어떤 것인지 결정하기 위하여, 일차 형질전환체들의 스크리닝을 전형적으로 수행한다. 적절한 통합을 나타내는 클론들은 증식되고, 유전적 안정성을 확인하기 위해 재스크리닝될 수 있다. 이러한 방법론은 형질전환체들이 관심대상의 유전자들을 포함함을 확인시켜준다. 많은 경우들에서, 이러한 스크리닝은 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 수행된다; 그러나, 본 기술분야에 알려진 임의의 적절한 다른 기술도 사용될 수 있다. PCR의 많은 다른 방법들이 본 기술분야에 알려져 있다 (예로서, 유전자중합효소법(nested PCR), 실시간 PCR). 그러나 본 기술분야의 숙련자는 기타 PCR 기술들이, 기재된 특정 프로토콜들을 대체하여 사용될 수 있음을 알 것이다. 외생의 핵산들의 적절한 통합을 갖는 클론들에 대한 스크리닝 후, 전형적으로 클론들은 암호화된 단백질의 존재에 대해 스크리닝된다. 단백질 발현 스크리닝은 전형적으로 웨스턴 블롯 분석 및/또는 효소 활성 분석에 의해 수행된다.

본 발명의 방법에 유용한 재조합 핵산 분자가 벡터 내에 포함될 수 있다. 또한, 본 방법이 제 2(또는 그 이상)의 재조합 핵산 분자들을 이용하여 수행되는 경우, 그 제 2의 재조합 핵산 분자도 벡터 내에 포함될 수 있으며, 상기 벡터는, 요구되지는 않지만, 제 1 재조합 핵산 분자를 포함하는 벡터와 동일한 벡터일 수 있다. 상기 벡터는 폴리뉴클레오티드를 엽록체 내로 도입하는데 유용한 임의의 벡터일 수 있으며, 바람직하게는 엽록체 게놈 DNA와 상동성 재조합되기에 충분한 엽록체 게놈 DNA의 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 예로서 엽록체 게놈 DNA의 약 400 내지 1500개 이상의 실질적으로 연속된 뉴클레오티드들을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 엽록체 벡터들 및 벡터로서의 사용을 위한 엽록체 게놈 영역들의 선발 방법은 공지이다 (예로서, Bock, J. Mol. Biol. 312:425-438, 2001; Staub 및 Maliga, Plant Cell 4:39-45, 1992; Kavanagh 등, Genetics 152:1111-1122, 1999, 참조. 이들 각각은 여기에 참고로서 반영된다).

일부 경우들에서, 그러한 벡터들은 프로모터들을 포함한다. 본 발명에 유용한 프로모터는 임의의 공급원으로부터 유래할 수 있다(예로서, 바이러스성, 세균성, 진균성, 원생생물, 동물). 여기 고려된 프로모터들은 광합성 생물들, 비관다발성 광합성 생물들, 및 관다발성 광합성 생물들에 특이적일 수 있다(예로서, 해조류, 꽃이피는 식물들). 여기 사용된 것과 같은, 비관다발성 광합성 생물이라는 용어는 임의의 거시적 또는 미시적 생물이며, 이에 제한되지는 않지만, 해조류, 시아노박테리아 및 광합성 세균을 포함하며, 이는 고등 식물에서 발견되는 것과 같은 관다발 시스템을 갖지 않는다. 일부 경우들에서, 상기 핵산들은 광합성 생물, 예로서 해조류의 프로모터를 포함하는 벡터 내로 삽입된다. 프로모터는 엽록체 및/또는 기타 플라스티드에서의 발현을 위한 프로모터일 수 있다. 일부 경우들에서, 상기 핵산들은 엽록체 기재의 것이다. 여기에서 임의의 상기 핵산들의 엽록체 내로의 삽입에 고려되는 프로모터들의 예들은 미국특허출원 2004/0014174에 개시된 것들을 포함한다. 프로모터는 구조적 프로모터 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 프로모터는 전형적으로 전사의 출발 위치 가까이에 필수 핵산 서열들을 포함한다(예로서, TATA 성분).

C. 레인하르티의 전체 엽록체 게놈은 월드와이드웹(WWW) 상에서, URL 주소 "biology.duke.edu/chlamy_genome/- chloro.html"에서 대중에게 이용가능하다("view complete genome as text file" 링크 및 "maps of the chloroplast genome" 링크 참조), 이들 각각은 여기에 참고로서 반영된다 (J. Maul, J. W. Lilly, 및 D. B. Stern, 간행되지 않은 결과들; Jan. 28, 2002 수정; GenBank 기탁번호 AF396929로 간행됨). 일반적으로, 엽록체 게놈 DNA의 뉴클레오티드 서열은 조절 서열 또는 코딩 서열을 포함하는 유전자, 특히 상동성 재조합인 경우로 인해 파괴된 경우 엽록체 게놈의 복제에 있어서 엽록체에 대해, 또는 엽록체를 포함하는 식물 세포에 대해 해로운 효과를 양산할 수 있는 유전자의 일부가 아니도록 선발된다. 이러한 점에서, C. 레인하르티 엽록체 게놈 서열을 포함하는 상기 웹사이트도 엽록체 게놈의 코딩 및 비-코딩 영역들을 보여주는 지도들(maps)을 제공하며, 따라서 본 발명의 벡터를 구축하는데 유용한 서열의 선발을 용이하게 한다. 예로서, 여기 개시된 실험들에 사용된, 엽록체 벡터인 p322는 약 143.1 kb 위치에서의 Eco (Eco RI) 위치로부터 약 148.5 kb 위치의 Xho (Xho I) 위치까지 뻗어있는 클론이다 (월드와이드웹, URL 주소 "biology.duke.edu/chlamy_genome/chloro.html" 참조, 및 "maps of the chloroplast genome" 링크, 및 "140-150 kb" 링크를 클릭; 월드와이드웹 상 URL 주소 "biology.duke.edu/chlam- y/chloro/chlorol40.html"상에서도 직접 접근가능).

본 발명의 실시에 사용되는 벡터는, 예로서 벡터의 조작을 용이하게 하는 클로닝 위치들, 벡터의 복제를 지시하는 조절 성분들 또는 그 안에 포함된 뉴클레오티드 서열들의 전사, 선발가능한 마커를 암호화하는 서열들 등을 포함하는, 상기 벡터에 바람직한 특징들을 부여하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열들을 포함할 수 있다. 이와 같이, 벡터는, 요구되지는 않지만 이종성 폴리뉴클레오티드가 그 벡터 내로 삽입될 수 있고 원하는 성분에 작동가능하게 연결될 수 있도록 위치될 수 있는, 예로서 다수의 클로닝 위치와 같은 하나 이상의 클로닝 위치들을 포함할 수 있다. 상기 벡터는 원핵생물 기원의 복제(ori), 예로서 대장균 ori 또는 코스미드(cosmid) ori를 포함할 수 있어, 원하는 경우 식물 엽록체에서 뿐만 아니라 원핵생물 숙주 세포에서 벡터의 통과를 가능하게 한다.

조절 성분은, 여기 사용된 용어와 같이, 폴리뉴클레오티드의 전사 또는 번역 또는 그 조절 성분이 작동가능하게 연결된 폴리펩티드의 지역화(localization)를 조절하는 뉴클레오티드 서열을 광범위하게 의미한다. 이에 제한되지는 않지만, 실시예들은 RBS, 프로모터, 증진제(enhancer), 전사 종결제, 개시 (출발) 코돈, 인트론 절제(excision) 및 정확한 리딩 프레임(reading frame)의 유지에 대한 스플라이싱(splicing) 신호, STOP 코돈, 암버(amber) 또는 오커(ochre) 코돈, 및 IRES를 포함한다. 추가적으로, 세포 구역화(compartmentalization) 신호 (예로서, 시토졸, 핵, 엽록체 막 또는 세포막으로 폴리펩티드를 타겟팅하는 서열). 이러한 신호들은 본 기술분야에서 공지이며, 널리 보고되어 있다(예로서, 미국특허 제5,776,689호)

여기에서 임의의 발현 벡터들은 조절 제어 서열을 더 포함한다. 조절 제어 서열은 예로서, 프로모터(들), 작동체(들), 리프레서(들)(repressor(s)), 증진제(들), 전사 종결 서열(들), 번역을 조절하는 서열(들), 또는 숙주 세포와 상용성이고, 본 발명의 핵산 분자들의 발현을 제어하는 기타 조절 제어 서열(들)을 포함할 수 있다. 일부 경우들에서, 조절 제어 서열은 전사의 개시, 연장 및/또는 종결을 제어, 조정, 또는 초래할 수 있는 전사 제어 서열(들)을 포함한다. 예로서, 조절 제어 서열은 생물에서 유전자 또는 유전자 생산물의 전사 및 번역 속도 및/또는 효율을 증가시킬 수 있으며, 여기에서 상기 유전자 또는 유전자 생산물의 발현은 상향조절되어,여기 기재된 생산물의 증가된 생산, 분비 또는 이들 모두를 (직접 또는 간접적으로)초래할 수 있다. 상기 조절 제어 서열은 유전자 또는 유전자 생산물의 안정성을 증가시킴에 의해, 생산물의 생산, 분비 또는 이들 모두의 증가를 초래할 수도 있다.

조절 제어 서열은 자가성 또는 이종성일 수 있으며, 이종성인 경우, 상동성일 수 있다. 상기 조절 제어 서열은 생산물들의 발현 및 생산을 촉진하는 효소들이 하나 이상의 폴리펩티드들 암호화 할 수 있다. 예로서, 이종성 조절 제어 서열은 생물의 동일한 속의 또다른 종들(예로서 해조류 종들)로부터 유래될 수 있고, 해조류에서 신타제를 암호화할 수 있다. 또다른 예에서, 자가성 조절 제어 서열은 발현 벡터가 발현되는 생물로부터 유래될 수 있다.

적용에 따라, 유도성 또는 구조적 발현을 초래하는, 조절 제어 서열들이 사용될 수 있다. 해조류의 조절 제어 서열들이 사용될 수 있으며, 이는 핵, 바이러스성, 염색체외성(extrachromosomal), 미토콘드리아성 또는 엽록체성 기원일 수 있다.

적당한 조절 제어 서열들은 발현되는 뉴클레오티드 서열과 자연적으로 연관된 것들을 포함한다(예로서, 자연에서 해조류 유래의 뉴클레오티드 서열과 작동가능하게 연결된 해조류 프로모터). 적당한 조절 제어 서열들은 발현되는 핵산 분자와 자연적으로 연관되지 않은 조절 제어 서열들을 포함한다(예로서, 또다른 생물 또는 해조류 종들의 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 하나의 종들의 해조류 프로모터). 후자의 조절 제어 서열들은 동일한 종들(즉, 자가성) 내의 또다른 유전자의 발현을 제어하는 서열일 수 있거나, 또는 상이한 생물 또는 종들(즉, 이종성)로부터 유래될 수 있다.

추정의(putative) 조절 제어 서열이 적당한지의 여부를 결정하기 위하여, 추정의 조절 제어 서열은 용이하게 탐지가능한 신호를 생성하는 단백질을 전형ㅈ거으로 암호화하는 핵산에 연결된다. 상기 구축물은 그 후, 표준 기술에 의해 해조류 또는 다른 생물 내로 도입될 수 있고, 그의 발현이 모니터링된다. 예로서, 핵산이 주요한 선발가능한 마커를 암호화한다면, 사용되는 그 해조류 또는 생물은, 그 마커가 내성을 부여하는 화합물의 존재하에 생장할 수 있는 능력에 대해 시험된다.

일부 경우들에서, 조절 제어 서열은 비관다발성, 광합성 생물 내에서 뉴클레오티드 서열의 발현에 대해 적합화된 프로모터와 같은 프로모터이다. 예로서, 상기 프로모터는 해조류 프로모터일 수 있으며, 예로서 U.S. 특허출원공보 제 2006/0234368 및 2004/0014174, 및 Hallmann, Transgenic Plant J. 1:81-98(2007)에 기재된 것과 같다. 상기 프로모터는 엽록체 특이적 프로모터 또는 핵 프로모터일 수 있다. 상기 프로모터는 EF1-α 유전자 프로모터 또는 D 프로모터일 수 있다. 일부 구체예들에서, 신타제는 상기 EF1-α유전자 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 다른 구체예들에서, 상기 신타제는 D 프로모터에 작동가능하게 연결된다.

여기에서 조절 제어 서열들은, 예로서, 코딩 및 비-코딩 영역, 5' 비번역된 영역(예로서, 코딩 영역으로부터 상류(upstream) 영역), 및 3' 비번역된 영역(예로서, 코딩 영역으로부터 하류(downstream) 영역)을 포함하는 각종 위치들에서 발견될 수 있다. 따라서, 일부 경우들에서, 자가성 또는 이종성 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 3' 또는 5' 비번역된 영역들, 하나 이상의 인트론들, 또는 하나 이상의 엑손들을 포함할 수 있다.

예로서, 일부 구체예들에서, 조절 제어 서열은 시클로텔라 크립티카 아세틸-CoA 카르복실라제 5'-비번역된 조절 제어 서열 또는 시클로텔라 크립티카 아세틸-CoA 카르복실라제 3'-비번역된 조절 제어 서열을 포함할 수 있다 (U.S. 특허 제 5,661,017호).

조절 제어 서열은, 단백질 AB 또는 SAA와 같은, 이종성 뉴클레오티드 서열들 및 단백질들의 발현을 촉진하는, 키메라성 또는 융합 폴리펩티드들일 수도 있다. 다른 조절 제어 서열들은 이종성 서열의 번역을 촉진할 수 있는 자가성 인트론 서열들을 포함한다.

여기에서 임의의 발현 벡터들에서 사용된 조절 제어 서열들은 유도성일 수 있다. 프로모터들과 같은 유도성 조절 제어 서열들은, 예로서 빛에 의한 유도될 수 있다. 조절 제어 서열들은 자가조절성일 수도 있다. 자가조절성 조절 제어 서열들의 예들은, 예로서 내생의 ATP 수준에 의해 또는 생물에 의해 생산된 생산물에 의해 자가조절되는 것들을 포함한다. 일부 경우들에서, 상기 조절 제어 서열들은 외생의 약제에 의해 유도될 수 있다. 기타 유도성 성분들은 본 기술분야에서 공지이며, 본 발명의 이용에 적합화될 수 있다

여기 기재된 조절 제어 서열들의 각종 조합들은 본 발명에 의해 구체화될 수 있으며, 본 발명의다른 특징들과 조합될 수 있다. 일부 경우들에서, 발현 벡터는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 조절 제어 서열들을 포함한다. 이러한 서열들은, 예로서 여기에 기재된 생산물의 분비, 생산 또는 이들 모두를 상향조절할 수 있다. 일부 경우들에서, 발현 벡터는, 예로서 생산물의 생산을 상향조절하는 작용을 하는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 조절 제어 서열들을 포함할 수 있다.

벡터 또는 다른 재조합 핵산 분자는 리포터(reporter) 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 기타 선발가능한 마커를 포함할 수 있다. "리포터" 또는 "선발가능한 마커"라는 용어는 탐지가능한 표현형을 부여하는 폴리뉴클레오티드 (또는 암호화된 폴리펩티드)를 의미한다. 리포터는 탐지가능한 폴리펩티드, 예로서 녹색 형광 단백질 또는 루시페라제(luciferase)와 같은 효소를 일반적으로 암호화하며, 이는 적절한 성분(각각 빛 또는 루시페린의 특정 파장)과 접촉시, 눈 또는 적절한 기계를 사용하여 탐지될 수 있는 신호를 생성한다 (Giacomin, Plant Sci. 116:59-72, 1996; Scikantha, J. Bacteriol. 178:121, 1996; Gerdes, FEBS Lett. 389:44-47, 1996; 또한, Jefferson, EMBO J. 6:3901-3907, 1997, fl-glucuronidase 참조). 선발가능한 마커는 일반적으로, 세포 내에 존재 또는 발현된 경우, 예로서 그렇지 않으면 그 세포를 죽일 수 있는 성분의 존재 하에서 성장할 수 있는 능력과 같은, 선택적 장점 (또는 단점)을, 그 마커를 포함하는 세포에 제공하는 분자이다.

선발가능한 마커는 원핵생물 세포들 또는 식물 세포들 또는 상기 마커를 발현하는 이들 모두를 수득하기 위한 수단을 제공할 수 있으며, 따라서 본 발명의 벡터의 성분으로서 유용할 수 있다(예로서, Bock, 상기 참조, 2001, 참조). 선발가능한 마커들의 다른 예들은, 이에 제한되지는 않지만, 대사길항물질(antimetabolite) 내성을 부여하는 것들, 예로서 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 디하이드로폴레이트 리덕타제 (Reiss, Plant Physiol. (Life Sci . Adv.) 13:143-149, 1994); 아미노글리코시즈 네오마이신, 카나마이신 및 파로마이신에 대한 내성을 부여하는 네오마이신 인산전이효소 (Herrera-Estrella, EMBO J. 2:987-995, 1983), 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 하이그로(hygro) (Marsh, Gene 32:481-485, 1984), 세포들이 트립토판 대신 인돌을 사용하는 것을 허용하는 trpB; 세포들이 히스티딘 대신 히스티놀을 사용하는 것을 허용하는 hisD (Hartman, Proc . Natl . Acad . Sci., USA 85:8047, 1988); 세포들이 만노오즈를 사용하는 것을 허용하는 만노오즈-6-포스페이트 이성화제 (WO 94/20627); 오르니틴 디카르복실라아제 저해제인 2-(디플루오로메틸)-DL-오르니틴 (DFMO; McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.)에 대한 내성을 부여하는, 오르니틴 디카르복실라아제; 및 블라스티시딘 S에 대한 내성을 부여하는 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus)로부터의 디아미나제(deaminase) (Tamura, Biosci . Biotechnol . Biochem. 59:2336-2338, 1995)를 포함한다. 추가의 선발가능한 마커들은 제초제 내성을 부여하는 것들, 예로서 포스피노트리신에 대한 내성을 부여하는 포스피노트리신 아세틸전이효소 유전자(White 등, Nucl . Acids Res. 18:1062, 1990; Spencer 등, Theor . Appl . Genet. 79:625-631, 1990), 글리포세이트 내성을 부여하는 돌연변이 EPSPV-신타아제 (Hinchee 등, BioTechnology 91:915-922, 1998), 이미다졸리온 또는 술포닐우레아 내성을 부여하는 돌연변이 아세토락테이트 신타아제 (Lee 등, EMBO J. 7:1241-1248, 1988), 아트라진에 대한 내성을 부여하는 돌연변이 psbA (Smeda 등, Plant Physiol. 103:911-917, 1993), 또는 돌연변이 프로토포르피리노겐 산화효소 (미국특허번호 제5,767,373호 참조), 또는 글루포시네이트와 같은 제초제에 대한 내성을 부여하는 기타 마커들을 포함한다. 선발가능한 마커들은 진핵 세포들 및 테트라사이클린에 대해 디하이드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 또는 네오마이신 내성; 대장균과 같은 원핵생물들에 대해 암피실린 내성; 및 식물들에서 블레오마이신, 젠타마이신, 글리포세이트, 하이그로마이신, 카나마이신, 메토트렉세이트, 플레오마이신, 포스피노트리신, 스펙티노마이신, 스트렙토마이신, 술폰아미드 및 술포닐우레아 내성을 부여하는 폴리뉴클레오티드들을 포함한다 (예로서, Maliga 등, Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995, 39p 참조).

리포터 유전자들은 고등식물들의 엽록체들에 성공적으로 사용되어 왔으며, 높은 수준의 재조합 단백질 발현이 보고되어 왔다. 또한, 리포터 유전자들은 C. 레인하르티의 엽록체에 사용되어 왔지만, 대부분의 경우들에서 매우 적은 양의 단백질들이 생산되었다. 리포터 유전자들은 다수의 생물학적 생물들에서의 유전자 발현을 모니터하는 능력을 크게 개선시킨다. 고등 식물들의 엽록체들에서, β-글루쿠로니다제 (uidA, Staub 및 Maliga, EMBO J. 12:601-606, 1993), 네오마이신 인산전이효소 (nptII, Carrer 등, Mol . Gen . Genet. 241:49-56, 1993), 아데노실-3-아데닐기전이효소 (aadA, Svab 및 Maliga, Proc . Natl . Acad . Sci., USA 90:913-917, 1993), 및 아에쿠오레 빅토리아(Aequorea victoria) GFP (Sidorov 등, Plant J. 19:209-216, 1999)가 리포터 유전자들로서 사용되어 왔다 (Heifetz, Biochemie 82:655-666, 2000). 이들 유전자들 각각은 엽록체 유전자 발현의 유용한 리포터가 될 수 있는 속성들, 예컨대 분석의 용이함, 감도, 또는 원래 위치에서의(in situe) 발현을 검사하는 능력을 갖는다. 이들 연구들에 근거하여, 기타 이종성 단백질들은 고등 식물들의 엽록체에서 발현되어 왔으며, 예로서, 곤충 초식동물들에 대한 내성을 부여하는 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) Cry 톡신들 (Kota 등, Proc . Natl . Acad . Sci ., USA 96:1840-1845, 1999), 또는 인간 소마토트로핀 (Staub 등, Nat . Biotechnol. 18:333-338, 2000), 잠재적 생의약(biopharmaceutical)이 있다. 몇몇 리포터 유전자들은 진핵성 녹색 해조류인 C. 레인하르티의 엽록체에서 발현되어 왔으며, 이는 aadA (Goldschmidt-Clermont, Nucl. Acids Res. 19:4083-4089 1991; Zerges 및 Rochaix, Mol . Cell Biol. 14:5268-5277, 1994), uidA (Sakamoto 등, Proc . Natl . Acad . Sci., USA 90:477-501, 19933, Ishikura 등, J. Biosci . Bioeng. 87:307-314 1999), 레닐라 루시페라아제 (Renilla luciferase) (Minko 등, Mol . Gen . Genet. 262:421-425, 1999) 및 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumanii)로부터의 아미노 글리코시드 인산전이효소인 aphA6 (Bateman 및 Purton, Mol . Gen . Genet 263:404-410, 2000)을 포함한다.

일부 경우들에서, 본 발명의 벡터들은 대장균 또는 S. 세레비시에 기원의 복제와 같은 성분들을 포함할 것이다. 적절한 선발가능한 마커들과 조합된 이러한 특징들은 상기 벡터가 타겟 숙주 세포와 세균 및/또는 효모 세포 사이를 "왕복(shuttled)"하도록 허용한다. 두번째 숙주에서 본 발명의 셔틀 벡터(shuttle vector)를 통행시키는 능력은 벡터의 특징들의 보다 편리한 조작을 가능하게 할 수 있다. 예로서, 벡터 및 관심 대상의 추정적으로 삽입된 폴리뉴클레오티드들을 포함하는 반응 혼합물은 대장균과 같은 원핵생물 숙주 세포들 내로 형질전환되고, 통상의 방법들을 사용하여 증폭 및 수집되고, 삽입물 또는 관심대상의 구축물을 포함하는 벡터들을 동정하기 위해 검사될 수 있다. 바람직한 경우, 상기 벡터는 예로서, 삽입된 폴리뉴클레오티드의 위치 지정된 돌연변이를 수행한 후, 증폭하고, 다시 관심 대상의 돌연변이된 폴리뉴클레오티드를 갖는 벡터들을 선발함에 의해 더욱 조작될 수 있다. 셔틀 벡터는 그 후 식물 세포 엽록체들 내로 도입될 수 있으며, 여기에서 관심 대상의 폴리펩티드는 발현될 수 있으며, 바람직한 경우 본 발명의 방법에 따라 분리될 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 재조합 핵산 분자는 본 기술분야에서 임의의 알려진 방법을 사용하여 식물 엽록체들 또는 핵 내로 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 본 기술분야에서 공지되고 선택된, 부분적으로는 특정 숙주 세포에 기초한, 각종 방법들에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 예로서, 상기 폴리뉴클레오티드는, 입자총을 사용하는 일렉트로포레이션(electroporation) 또는 미세사출(microprojectile) 매개된 (biolistic) 형질전환, 또는 글라스 비드(glass bead)법과 같은 직접적인 유전자 전이 방법, 또는 꽃가루-매개된 형질전환, 리포솜-매개된 형질전환, 상처받거나 또는 효소분해된 미성숙 배(embryos), 또는 상처받거나 또는 효소분해된 배형성 캘러스(embryogenic callus) 를 사용하는 형질전환에 의해 식물 세포 내로 도입될 수 있다 (Potrykus, Ann . Rev . Plant . Physiol. Plant Mol . Biol. 42:205-225, 1991).

플라스티드 형질전환은 폴리뉴클레오티드를 식물 세포 엽록체 내로 도입하기 위한 방법이다 (미국특허번호 제5,451,513, 5,545,817, 및 5,545,818호; WO 95/16783; McBride 등, Proc . Natl . Acad . Sci ., USA 91:7301-7305, 1994). 일부 구체예들에서는, 엽록체 형질전환은 원하는 뉴클레오티드 서열을 측면근접하는 엽록체 DNA의 영역들의 도입을 포함하여, 외생의 DNA의 타겟 엽록체 게놈 내로의 상동성 재조합을 가능하게 한다. 일부 경우들에서, 엽록체 게놈 DNA의 1 내지 1.5kb의 측면근접 뉴클레오티드 서열들이 사용될 수 있다. 이 방법을 사용하여, 스펙티오마이신 및 스트렙토마이신에 대한 내성을 부여하는, 엽록체 16S rRNA 및 rps12 유전자들 내에서의 점 돌연변이들은 형질전환에 대해 선발가능한 마커들로서 이용될 수 있으며 (Svab 등, Proc . Natl . Acad . Sci., USA 87:8526-8530, 1990), 타겟 엽들(leaves)의 100회 충격 당 약 1회의 빈도로, 안정한 호모플라스마성 형질전환체들을 초래할 수 있다.

미세사출 매개된 형질전환도 폴리뉴클레오티드를 식물 세포 엽록체 내로 도입하는데 사용될 수 있다 (Klein 등, Nature 327:70-73, 1987). 이 방법은, 염화칼슘, 스퍼미딘(spermidine) 또는 폴리에틸렌 글리콜을 이용한 침전에 의해 원하는 폴리뉴클레오티드로 코팅된 금 또는 텅스텐과 같은 미세사출물들을 이용한다. 미세사출 입자들은 BIOLISTIC PD-1000 입자 총(BioRad; Hercules Calif.)과 같은 장치를 이용하여 고속으로 식물 조직 내로 가속되었다. 비올리스틱(biolistic) 이용 방법들을 사용하는 형질전환 방법들은 본 기술분야에서 공지이다(예로서, Christou, Trends in Plant Science 1:423-431, 1996, 참조). 미세사출 매개된 형질전환은 예로서 면, 담배, 옥수수, 잡종 포플라 및 파파야를 포함하는 다양한 유전형질전환 식물 종류들을 생성하기 위하여 이용되어 왔다. 밀, 귀리, 보리, 수수 및 벼와 같은 중요한 곡물 작물들은 또한 미세사출 매개된 전달을 이용하여 형질전환되어 왔다 (Duan 등, Nature Biotech. 14:494-498, 1996; Shimamoto, Curr . Opin . Biotech. 5:158-162, 1994). 대부분의 쌍떡잎 식물들의 형질전환은 상기 기재된 방법을 이용하여 가능하다. 외떡잎 식물들의 형질전환은 예로서, 상기 기재된 것과 같은 비올리스틱 이용 방법들, 원형질체(protoplast) 형질전환, 부분적으로 침윤화된 세포들의 일렉트로포레이션, 유리 섬유들을 사용하는 DNA의 도입, 글라스비드 진탕법 등을 사용하여 형질전환될 수도 있다.

형질전환 빈도는 열성 rRNA 또는 r-단백질 항생제 내성 유전자를, 이에 제한되지는 않지만 세균 aadA 유전자를 포함하는 우성의 선발가능한 마커로 대체함에 의해 증가시킬 수 있다 (Svab 및 Maliga, Proc . Natl . Acad. Sci ., USA 90:913-917, 1993). 형질전환이 뒤따르는 약 15 내지 20 세포분열 사이클들이, 일반적으로 동종플라스티드성(homoplastidic) 상태에 도달하는데 요구된다. 본 기술분야의 숙련자에게 있어, 엽록체가 그의 게놈의 다수의 복제물들을 포함할 수 있고, 따라서 "호모플라스마성" 또는 "호모플라스미"라는 용어가, 관심 대상의 특정 자리의 모든 복제물들이 실질적으로 동일한 상태를 의미한다는 것은 명백할 것이다. 여기에서 유전자들이 상동성 재조합에 의해 각 식물 세포 내에 존재하는 원형 플라스티드 게놈의 몇 천개의 복제물들 모두 내로 삽입되는, 플라스티드 발현은 핵-발현된 유전자에 대해 수많은 복제 수 이익을 이용하여 총 가용성 식물 단백질의 10%를 쉽게 초과하는 발현 수준을 가능하게 한다.

어떤 예에 있어서, 본 발명의 방법은 재조합 핵산 분자를 엽록체 내로 도입하므로써 수행될 수 있으며, 여기에서 상기 재조합 핵산 분자는, 적어도 하나의 폴리펩티드 (즉, 1, 2, 3, 4 또는 그 이상)를 암호화하는, 제 1 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예들에서, 폴리펩티드는 제 2, 제 3, 제 4, 제 5, 제 6, 제 7, 제 8, 제 9, 제 10 및/또는 이후의 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된다. 예로서, 생분해 경로 중의 몇몇 효소들은, 직접적으로 또는 간접적으로, 경로의 한 효소에 의해 생산된 산물들이 일단 생산되면, 그 경로의 다음 효소에 근접하도록 연결될 수 있다.

엽록체들의 형질전환에 있어서, 본 발명의 한 큰 장점은 선발가능한 마커 및 하나 이상의 관심 대상의 유전자들을 모두 포함하는 재조합 핵산 구축물의 이용이다. 전형적으로, 엽록체들의 형질전환은, 두 개의 구축물들을 이용한 엽록체들의 공동-형질전환에 의해 수행된다: 하나는 선발가능한 마커를 포함하며, 두 번째 구축물은 관심 대상의 유전자(들)을 포함한다. 이러한 형질전환체들의 스크리닝은, 여러가지 이유로 인해, 힘들고 시간을 많이 소비한다. 먼저, 일부 형질전환된 생물들을 배양하는데 요구되는 시간이 길다. 두 번째로, 형질전환체들은 선발가능한 마커의 존재 및 관심 대상의 유전자(들)의 존재 모두에 대해 스크리닝되어야 한다. 전형적으로, 관심 대상의 유전자(들)에 대한 이차 스크리닝을 서던 블롯(Southern blot)에 의해 수행한다(예로서, PCT/US2007/072465 참조).

엽록체들에서, 유전자 발현의 조절은 일반적으로 전사 후, 종종 번역 개시 동안 일어난다. 이러한 조절은 엽록체 번역 기구 및 핵-암호화된 제어 인자들에 따라 달라진다(Barkan 및 Goldschmidt-Clermont, Biochemie 82:559-572, 2000; Zerges, Biochemie 82:583-601, 2000 참조). 상기 엽록체 번역 기구는 일반적으로 세균에서의 것과 유사하며; 엽록체들은 70S 리보솜들을 포함하고; 5' 캡들(caps)이 결여되고 일반적으로 3' 폴리-아데닐화 테일들(tails)을 포함하지 않는 mRNAs를 갖고(Harris 등, Microbiol. Rev. 58:700-754, 1994); 번역은 엽록체들 및 세균에서 클로람페니콜과 같은 선발 인자(selective agent)에 의해 저해된다.

본 발명의 일부 방법들은, 코딩 서열에 대하여 리보솜 결합 서열(RBS)의 적절한 배치를 이용한다. RBS의 이러한 배치는 식물 엽록체들에서 확고한 번역을 초래한다는 것(미국특허 출원 2004/0014174 참조, 여기에 참고로서 반영됨), 그리고 엽록체들에서 폴리펩티드들의 발현을 이용하는 폴리펩티드들이 핵 유전자로부터 발현된 폴리펩티드들에 의해 전형적으로 횡단되는(traversed) 세포 구역들을 통해 처리되지 않아서, 글리코실화(glycosylation)와 같은 특정의 번역후-변경들이 가해지지 않는 것이라는 것이 이미 알려졌다.

암호화 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 코돈들은 엽록체 코돈 사용을 반영하도록 바이어스될 수 있다. 대부분의 아미노산들은 둘 이상의 상이한 (축퇴(degenerate)) 코돈들에 의해 암호화되며, 각종 생물들이 다른 것에 대해 우선하는 특정 코돈들을 이용한다는 것은 잘 알려져 있다. 이러한 선호적 코돈 사용은, 엽록체에서도 사용되며, 여기에서 "엽록체 코돈 사용"으로 언급된다. 클라미도모나스 레인하르티의 코돈 바이어스는 알려져 있다. 미국 특허출원 2004/0014174 참조. C. 레인하르티에서의 발현에 대해 바이어스된 이소프레노이드 생합성 효소들을 암호화하는 핵산들의 예들을 표 5~8에 제공하였다. 천연 서열들(그 서열이 분리되어지는 생물에서)에 대한 동일성 비율(%)은 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 이상일 수 있다. 본 발명의 일부 벡터들은 표 5에 제공된 핵산들의 하나 이상 및/또는 그에 대해 약 70%의 동일성을 갖는 핵산들을 포함한다.

코돈에 대하여 사용되는 경우, "바이어스된(biased)"이라는 표현은, 폴리뉴클레오티드 내 코돈의 서열이, 그 코돈이 바이어스에 대한 타겟, 예로서 해조류 세포들, 엽록체들 등에서 우선적으로 사용되는 것이 되도록 변경되었다는 것을 의미한다. 엽록체 코돈 사용에 대해 바이어스된 폴리뉴클레오티드는 새로이 합성될 수 있거나, 또는 통상적인 재조합 DNA 기술들을 사용하여, 예로서 위치 지정된 돌연변이(site diercted mutagenesis) 방법에 의해, 하나 이상의 코돈들을 그들이 엽록체 코돈 사용에 대해 바이어스되도록 변경하기 위하여, 유전적으로 변경될 수 있다. 엽록체 코돈 바이어스는, 해조류 엽록체들을 포함하는 상이한 식물들에서, 예로서 담배에 비해, 다양하게 왜곡될 수 있다(skewed). 일반적으로, 선택된 상기 엽록체 코돈 바이어스는 본 발명의 핵산들로 형질전환되는 식물의 엽록체 코돈 사용을 반영한다. 예로서, C. 레인하르티가 숙주인 경우, 상기 엽록체 코돈 사용은 해조류 엽록체 코돈 사용을 반영하도록 바이어스된다(세번째 코돈 위치에서 약 74.6% AT 바이어스).

여기 기재된 임의의 생산물들은 생물을 형질전환하여, 그러한 생물에 의하여 상기 생성물의 생산 및/또는 분비가 일어나도록 하여 제조될 수 있다. 생물은, 형질전환이 그 형질전환된 생물의 광합성 능력이 파괴 또는 감소시키는 경우라 하더라도(예로서, 외생의 해산이 광합성에 요구되는 단백질을 암호화하는 유전자 내로 삽입된다) 광합성 생물로 간주된다.

변형되는 경로

본원의 발현 벡터는 중간체, 생산물, 전구체 및 본원에서 설명된 생산물의 유도체의 생산을 촉진하는 폴리펩티드(들)을 암호화할 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 중간체, 생산물, 전구체 및 이소프레노이드 경로의 유도체의 생산을 촉진하는 폴리펩티드(들)을 암호화할 수 있다.

이소프레노이드 또는 테르페노이드는 테르펜과 관려된 유기 화합물의 군이다. 테르펜은 전형적으로 이소프렌 단위로부터 유래된다. 이소프렌 단위는 5-탄소 단위(C5)이다. 테르펜은 헤미테르펜들(C5), 모노테르펜들(C10), 세스퀘테르펜들(C15), 디테르펜들(C20), 트리테르펜들(C30), 테트라테르펜들(C40), 및 폴리테르펜들(C_n, 여기에서 "n"은 45와 같거나 또는 그 이상이다)과 같은 이소프렌 단위의 군으로 분류된다. 테르펜은 수식(예를 들어, 산화되거나, 메틸 그룹이 제거되는 등)될 수 있는 탄화수소이거나, 이소프레노이드와 같은 테르펜의 유도체를 형성하기 위하여 그것의 탄소 골격이 재배열될 수 있다. 이소프레노이드는 다른 스테로이드 및 지질 등을 포함한다.

테르펜 전구체들은 2개의 경로들에 의해 생성되는 것으로 생각된다. 메발로네이트 경로, 또는 HMG-CoA 환원제 경로는, 이소프레노이드들에 대한 공통된 C5 전구체인 디메틸알릴 피로포스페이트(DMAPP) 및 이소펜틸 피로포스페이트(IPP)를 생성한다. 비-메발로네이트 경로는 DMAPP 및 IPP를 형성하기 위한 대체 경로이다. 상기 DMAPP 및 IPP는 제라닐-디포스페이트(GPP)를 형성하기 위해, 또는 파르네실-디포스페이트(FPP), 제라닐제라닐-디포스페이트(GGPP)와 같은, 이들로부터 다른 높은 이소프레노이드들이 형성되는, 다른 전구체들을 형성하기 위해 축합될 수 있다,

여기에서 발현 벡터는 메발로네이트 경로에서 일정 역할을 갖는, 예로서, 티올라제, HMG-CoA 신타제, HMG-CoA 환원제, 메발로네이트 키나제, 포스포메발로네이트 키나제, 및 메발로네이트-5-피로포스페이트 탈카르복시화제와 같은 폴리펩티드(들)을 암호화할 수 있다. 다른 구체예들에서, 상기 폴리펩티드들은, DOXP 신타제, DOXP 환원제, 4-디포스포시티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨 신타제, 4-디포스포시티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨 키나제, 2-C-메틸-D-에리트리톨 2,4,-시클로디포스페이트 신타제, HMB-PP 신타제, HMB-PP 환원제 또는 DOXP 리덕토아이소머라제와 같은 비-메발로네이트 경로내에서의 효소들이다.

다른 경우들에서, 벡터는 이소프레노이드 경로 내에서, 예로서, 신타제-암호화 서열과 같은, 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상기 신타제는 C10, C15, C20, C30 또는 C40 신타제일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 신타제는 리모넨 신타제, 1,8 시에놀레 신타제, α-파이넨 신타제, 캄펜 신타제, (+)-사비넨 신타제, 미르센 신타제, 아비에타디엔 신타제, 텍사디엔 신타제, 파르네실 피로포스페이트 신타제, 아모르파디엔 신타제, (E)-α-비사볼렌 신타제, 디아포파이톤 신타제 또는 디아포파이토엔 디세투라제이다. 신타제들 및 다른 서열들의 예는 표 1에 설명하였다.

표 1. 신타제의 예

신타제는 β-카리오필렌 신타제, 저마크렌 A 신타제, 8-에피세드롤 신타제, 발렌센 신타제, (+)-δ-카디넨 신타제, 저마크렌 C 신타제, (E)-β-파르네센 신타제, 카스벤 신타제, 베티스피랄디엔 신타제, 5-에피-아리스톨로센 신타제, 아리스톨로셴 신타제, α-후물렌, (E,E)-α-파르네센 신타제, (-)-β-파이넨 신타제, γ-테르파이넨 신타제, 리모넨 사이클라제, 리날룰 신타제, (+)-보르닐 디포스페이트 신타제, 레보피마라디엔 신타제, 이소피마라디엔 신타제, (E)-γ-비사볼렌 신타제, 코팔릴 피로포스페이트 신타제, 카우렌 신타제, 론기폴렌 신타제, γ-후물렌 신타제, δ-셀리넨 신타제, β-펠란드렌 신타제, 테르피놀렌 신타제, (+)-3-카렌 신타제, 신-코팔릴 디포스페이트 신타제, α-테르피네올 신타제, 신-피마라-7,15-디엔 신타제, 엔트-산다아라코피마라디엔 신타제, 스테르네르-13-엔 신타제, E-β-오시멘, S-리날룰 신타제, 제라니올 신타제, γ-테르파이넨 신타제, 리날룰 신타제, E-β-오시멘 신타제, 에피-세드롤 신타제, α-징기베렌 신타제, 구아이아디엔 신타제, 카스카릴라디엔 신타제, 시스-무우롤라디엔 신타제, 아피디콜란-16b-올 신타제, 엘리자베타트리엔 신타제, 산달올 신타제, 패초울올 신타제, 진자놀 신타제, 세드롤 신타제, 스카레올 신타제, 코팔올 신타제 또는 마눌 신타제일 수 있다.

본 발명에 이용되는 경로들은 세포질 내, 색소체(예로서, 엽록체) 내 또는 이들 모두에 존재하는 효소들을 포함할 수 있다. 본 발명의 구체예들의 효소들을 암호화하는 외생의 핵산들은, 그 암호화된 효소가 상기 세포질 내 또는 색소체 내 또는 이들 모두에서 활성이도록, 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 일부 구체예들에서, 하나의 세포내 구역(예로서, 세포질)에 존재하는 자연적으로 발생하는 효소는 상이한 세포내 위치에서 (예로서, 엽록체 내에서), 또는 숙주 세포의 형질전환 후 자연적으로 발생하는 위치 및 자연적으로 발생하지 않는 위치에서 발현될 수 있다.

이러한 개념을 단지 일례로서만 예시하기 위하여, 비관다발성 광합성 미세해조류 종들은 리모넨(특정 화학 및 석유화학 산업들에서 높은 가치를 갖는 분자)과 같은 이소프레노이드를 생산하도록 유전공학적으로 조절될 수 있다. 리모넨은, 수소와 탄소 원자들로만 구성된 순수한 탄화수소인 모노테르펜이다. 리모넨은 클라미도모나스 레인하르티 종들에서는 자연적으로 생산되지 않는다. 이들 미세해조류에서의 리모넨의 생산은, 상기 미세해조류가 엽록체 내에서 이종성 효소 리모넨 신타제를 발현하도록 그 미세해조류를 공학처리함으로써 달성될 수 있다. 리모넨 신타제는 테르펜 전구체 제라닐 피로포스페이트를 리모넨으로 전환할 수 있다. 리모넨과 달리, 제라닐 피로포스페이트는 미세해조류의 엽록체 내에 자연적으로 존재한다. 상기 리모넨 신타제의 발현은 리모넨 신타제를 암호화하는 이종성 유전자를 미세해조류의 엽록체 게놈 내로 삽입함에 의해 달성될 수 있다. 미세해조류의 변경된 계통은 그 후 호모플라스마성으로 되어, 모든 자손들의 엽록체 게놈 내에서 리모넨 유전자가 안정하게 유지될 것이다. 미세해조류는, 삽입된 유전자가 엽록체 게놈의 모든 복제물들에서 존재할 때 유전자에 대해 호모플라스마성이다. 엽록체가 그의 게놈의 다수의 복제물들을 포함할 수 있고, 따라서 "호모플라스마성" 또는 "호모플라스미"라는 용어가, 관심 대상의 특정 자리의 모든 복제물들이 실질적으로 동일한 상태를 의미한다는 것은 명백할 것이다. 여기에서 유전자들이 동종 재조합에 의해 각 식물 세포 내에 존재하는 원형 플라스티드 게놈의 몇 천개의 복제물들 모두 내로 삽입되는, 색소체 발현은 핵-발현된 유전자들에 대해 수많은 복제 수 이익을 이용하여 총 가용성(soluble) 식물 단백질의 10%를 쉽게 초과하는 발현 수준을 가능하게 한다.

발현

엽록체들은 광합성 생물들의 생산성 세포소기관이고, 또한 다량의 단백질 합성 자리이다. 여기에서 임의의 발현 벡터들은 엽록체 발현에 대해 선택적으로 적합화될 수 있다. 고등 식물들로부터의 엽록체 프로모터들의 다수가 Kung 및 Lin, Nucleic Acids Res. 13: 7543~7549 (1985)에 기재되어 있다. 유전자 산물들은 엽록체에서 발현 벡터로부터 발현될 수 있다. 발현 벡터들에 의해 암호화된 유전자 산물들은 엽록체 타겟팅 서열들에 의해 엽록체로 타겟될 수도 있다. 예로서, 발현 벡터 또는 발현 벡터에 의해 암호화된 유전자 산물(들)의 엽록체로의 타겟팅은 조절 제어 서열들 및 연료 분자의 분비를 허용 또는 개선하는 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 서열(들)에 의해 제공되는 효과들을 더욱 증진시킬 수 있다.

여기 기재된 엽록체 타겟팅의 각종 조합들은, 본 발명에 의해 구체화될 수 있으며, 본 발명의 다른 특징들과 조합될 수 있다. 예로서, 테르펜 신타제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 엽록체 타겟팅 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 숙주 세포는 엽록체에 타겟된 리모넨 신타제를 암호화하는 발현 벡터로 형질전환될 수 있으며, 이에 따라 엽록체 타겟팅 서열은 아니지만 리모넨 신타제를 암호화하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 비해 더욱 많은 리모넨 신타제를 생산할 수 있다. 증가된 리모넨 신타제 발현은 보다 적게 생산하는 숙주 세포에 비교시 리모넨을 더욱 많이 생산할 수 있다.

또다른 예에서, 어떤 생물에 의해, 기질들로서 생물에 의해 자연적으로 생산되는 전구체들을 사용함에 의해, 자연적으로 생산되지 않는 생산물(연료 생산물, 향료 생산물, 살충제 생산물)을 생산하는 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터가 엽록체에 타겟된다. 효소를 엽록체로 타겟함에 의해, 그 생산물의 생산은, 그효소가 발현되기는 하지만 엽록체로 타겟되지는 않은 숙주 세포에 비해, 증가될 수 있다. 이론에 구속됨이 없이, 이는 엽록체 내에서 생산된 증가된 전구체들로 인한 것일 수 있으며, 이에 따라 더 많은 생산물이 그 도입된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 효소에 의해 생산될 수 있다.

방법

생산물(예로서, 연료 생산물, 향료 생산물, 살충제 생산물)은 본 발명의 하나 또는 그 이상의 핵산에 의하여 형질전환된 비관다발성 생물을 생장/배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산될 수 있다. 상기 방법은 상기 생물을 형질전환시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 형질전환은 공지되거나 본원에서 설명된 어떠한 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 상기 방법은 상기 생물에 의하여 생산된 생산물을 수거하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본원의 방법은 배연 가스와 같은 무기 탄소원을 생물에 제공하는 단계를 더 포함할 수 있다. 어떤 구체예에 있어서, 무기 탄소원은 생산물(예를 들어, 연료 생산물)을 제조하기 위하여 필요한 모든 탄소를 제공한다. 성장/배양 단계는 미네랄 및/또는 비타민을 갖는 것과 같은 적절한 배지에서 수행되는 것이 바람직하다.

관련된, 하지만 구별되는 한 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 생산물(예를 들어 연료 생산물, 향료 생산물, 살충 생산물)의 생산방법을 제공한다: 광합성 생물을 발현 벡터로 형질전환하고; 그 생물을 생장시키고; 상기 생물에 의해 생산된 생산물을 수집. 상기 발현 벡터는 전형적으로 여기 기재된 유형의 발현 벡터이고, 추가적인 생합성 능력을 생물에 부가하기 위해 또는 생물 내의 기존 생합성 경로를 변경하기 위해, 광합성 생물에 의해 분자의 생산을 증가 또는 가능하게 하는 한 의도로 특이적으로 사용된다.

여기에서 상기 방법들은 연료들, 향료 및 살충제들과 같은 생산물들을 생산하는데 유용한 유전자들을 선발하고, 광합성 생물이 세포를 그러한 유전자(들)로 형질전환하고, 그리고 생산물이 생산되도록 허용하기에 적합한 조건들 하에서 그러한 생물들을 생장시키는 것을 포함한다. 본 발명의 생물들은, 이에 제한되지는 않지만 배치(batch), 페드-배치(fed-batch), 세포 리사이클(cell recycle) 및 연속 발효기들을 포함하는, 기존의 발효 바이오반응기들에서 배양될 수 있다. 또한, 이들은 광바이오반응기들(예로서, US 특허출원공보 제 20050260553; U.S.특허 제 5,958,761; U.S. 특허 6,083,740 참조)에서 배양될 수 있다. 배양은 진탕 플라스크들, 시험관들, 마이크로타이터(microtiter) 접시들, 및 페트리 접시들에서 수행될 수도 있다. 배양은 재조합 세포에 적당한 온도, pH 및 산소 함량에서 실시된다. 그러한 배양 조건들은 충분히 당업자의 지식 내의 것이다.

숙주 생물은 땅, 예로서 매립지들(landfills)에서 생장될 수도 있다. 일부 경우들에서, 숙주 생물(들)은, 에탄올 생산 공장 또는 CO₂를 생성하는 기타 시설들 또는 영역들(예로서, 도시, 고속도로, 등) 가까이에서 길러진다. 이와같이, 여기에서의 방법들은, 여기 기재된 하나 이상의 변경된 생물들을 에탄올 생산 공장 가까이에서 생장시킴에 의해 연료를 만드는 한편, 탄소 배출권을 에탄올 공장 또는 CO₂를 생성하는 기타 시설들 또는 영역들에 판매하기 위한 사업 방법들을 고려한다.

또한, 생물은 야외의 개방된 물, 예컨대 연못, 대양, 바다, 강, 워터베드(waterbeds), 습지 물, 얕은 풀, 호수, 저수지, 등에서 생장될 수 있다. 물에서 생장시키는 경우, 생물들은, 레고와 유사하게 생긴(lego-like) 입자들을 포함하는 할로유사(halo like) 물건(object) 내에 담을 수 있다. 상기 할로 물건은 해조류를 둘러싸고, 이를 개방된 일광하에서 유지하는 한편 물로부터의 영양소들이 보유되는 것은 허용한다.

일부 경우들에서, 생물들은 용기들 안에서 생장될 수 있으며, 여기에서 각 용기는 1 또는 2 또는 복수의 생물들을 포함한다. 상기 용기들은 물 위에 뜨도록 형성될 수 있다. 예로서, 용기는, 그 용기와 그 안의 숙주 생물(들)이 뜨도록 하기 위하여 공기 및 물의 조합으로 충전될 수 있다. 민물(fresh water) 내에서 생장하도록 적합화된 숙주 생물은 따라서 염수(즉, 해수)에서 생장될 수 있으며, 그 반대도 가능하다. 이러한 메카니즘은, 만일 용기에 임의의 손상이 있다면, 생물의 자연적인 사멸을 가능하게 한다.

일부 경우들에서, 복수의 용기들이 상기 기재된 것과 같은 할로 유사 구조 내에 담길 수 있다 예로서, 100, 1,000, 10,000, 100,000 또는 1,000,000 에 이르는 수의 용기들이, 할로-유사 구조의 평방미터 내에 배열될 수 있다.

일부 구체예들에서, 생산물(예로서, 연료 생산물, 향료 생산물, 살충제 생산물)은 생물을 수확함에 의해 수집된다. 생산물은 그 후 생물로부터 추출될 수 있다.

일부 구체예들에서, 생산물의 생산(예로서, 연료 생산물, 향료 생산물, 살충제 생산물)은 유도성이다. 생산물은 예로서, 빛에의 노출에 의해 발현 및/또는 생산되도록 유도될 수 있다. 다른 구체예들에서, 생산물의 생산은 자가조절성이다. 생산물은 피드백 루프(feedback loop)를 이룰 수 있으며, 여기에서 생산물(예로서, 연료 생산물, 향료 생산물, 살충제 생산물)이 일정 수준에 도달하면, 생산물의 발현 또는 분비가 저해될 수 있다. 다른 구체예들에서, 생물의 대사산물의 수준은 생산물의 발현 또는 분비를 저해한다. 예로서, 생산물을 발현 또는 생산하기 위해 증가된 에너지 생산의 결과로 생물에 의해 생산된 내생의 ATP는 생산물의 발현을 저해하기 위한 피드백 루프를 이룰 수 있다. 또 다른 구체에에서, 생산물의 생산은 예로서, 빛 또는 외생의 약제에 의해 유도될 수 있다. 예로서, 숙주 생물에서 생산물의 생산을 초래하기 위한 발현 벡터는 외생의 약제에 의해 활성 또는 비활성화되는 유도성 조절 제어 서열을 포함할 수 있다.

본 발명은 여기 기재된 임의의 연료 생산물들을 만들기 위한, 신규 유전자들/발현 벡터들에 대한 스크리닝 방법에도 관한 것이다. 이러한 방법들은 하기 단계들을 포함한다: (1) 핵산들의 후보 발현 벡터를 광합성 생물 내로 삽입하는 단계; (2) 그로부터 생산된 추정의 연료 생산물을 수집하는 단계; (3) 상기 추정의 연료 생산물을 질량분석분광기에 적용하여 그 추정의 연료 생산물의 특징, 및 연료 생산물로서 사용될 수 있는지의 여부를 결정하는 단계. 일부 구체예들에서, 단계 (2)는 기지의(known) 연료 생산물을 수집하고, 후보 발현 벡터가 그 연료 생산물의 생산 또는 분비를, 후보 발현 벡터가 없는 광합성 생물에 비해 증가시키는지의 여부를 포함할 수 있다.

Ⅲ. 비지니스 방법

또한 본 발명은 조성물의 δ¹³C 비율의 측정값을 얻고, 상기 조성물의 δ¹³C 비율을 참조 δ¹³C 비율과 비교하고, 만약 상기 조성물의 δ¹³C 비율이 참조 δ¹³C 비율보다 적으면, 개체에 탄소배출권을 판매하는 것을 포함하는 탄소배출권을 판매하는 비지니스 방법을 제공한다. 어떤 경우에 있어서, 참조 δ¹³C 비율는 약 -32‰이다. 다른 구체예에 있어서, 참조 δ¹³C 비율은 석유의 최대 δ¹³C 비율이다. 또 다른 예에 있어서, 참조 δ¹³C 비율은 약 -32‰, -35‰, -40‰, -45‰, -50‰, -55‰, 또는 -60‰이다. 상기 방법은 측정값을 사용하여 조성물을 표시하는 것을 더 포함할 수 있다. 상기 방법은 조성물을 추적하는 것을 더 포함할 수 있다.

본 발명은 연료 생산물을 생산하도록 적합화된 유전학적으로 변경된 비관다발성, 광합성 생물을 기르는 당사자에게 탄소 배출권을 제공하는 것을 포함하는 사업 방법도 제공한다. 어떤 경우에, 광합성 생물은 유전적으로 변형된다. 본 발명에 의해 제공된 연료 생산물을 생산하는 방법은 현재 사용되는 방법들에 비해, 가능한 한 친환경적인 방법으로 연료 생산물들을 제공한다. 이와같이, 여기 기재된 방법들 및 조성물들은 탄소 배출권들과 교환되는 사업 방법에서 사용될 수 있다.

탄소 배출권은 일부 관련 주권 주체(이에 제한되지는 않지만 예컨대, 도시(모든 규모 및 유형들의 자치단체들, 법인조직의(incorporated) 또는 법인조직이 아닌 자치단체들 포함), 카운티, 주 또는 도(province), 또는 국가, 및 지역적, 다국적, 또는 UN 또는 유럽연합(EU)과 같은 기타 국제 기구들과 같은 관련 정부 실체들을 포함)에 의해 허용, 공인 또는 인정된 수당(allownce), 허가(permit), 크레딧(credit) 등일 수 있다.

탄소 배출권은 규제당국 또는 행정 실체로부터 실질적으로 직접 수령될 수 있다. 다른 경우들에서, 이들은 간접적으로 수령될 수 있으며, 예로서 여기에서의 방법들 또는 조성물들을 사용하는 실체가 규제 당국으로부터 직접 탄소 배출권을 받을 수 있고, 그 후 그 탄소 배출권을 다른 실체에게 양도(transfer)할 수 있다. 탄소 배출권의 양도는 , 연료 생산물의 생산을 위해 적합화된 유전학적으로 변경된 비관다발성, 광합성 생물을 사용하는 소정의 공정, 생산물과 관련될 수 있다.

예로서, 제 1의 실체는 최종 사용자 이동 플랫폼(platform)에서의 소비를 위해 유통되는 소비제품을 제공하는 것으로 확인될 수 있고, 여기에서 상기 소비제품의 소비 및/또는 생산은 대응하는 결과의 대기배출을(emission) 포함한다. 예로서, 디젤 연료의 소비는 종종 대응 질소 산화물의 환경 방출을 일으키고, 가솔린의 연소는 종종 대응 황산화물의 환경 방출을 일으킨다.

상기 제 1 당사자는 상기 기재된 비관다발성 광합성 생물을 사용하여 그 생산물을 생산하는 방법을 채용할 수 있거나, 또는 상기 기재된 비관다발성 광합성 생물에 의해 생성된 생산물들을 그들의 조성물에서 이용하여 기존의 생성 방법, 예로서 디젤 연료, 가솔린, 제트 연료 등 보다 환경에 해로운 영향을 덜 미치도록 할 수 있다. 따라서, 그 최종 생산물의 환경적 영향을 상쇄시킨다. 제 1 당사자는 그 후 총 배출 감소의 결과로서 탄소 배출권 또는 방출권을 받을 수 있다. 상기 탄소 배출권은 규제당국 또는 행정당국으로부터 수령할 수 있거나, 또는 제 2 당사자로부터 상기 제 1 당사자에게로 양도될 수 있으며, 여기에서 상기 제 2 당사자는 비관다발성 광합성 생물 또는 비관다발성 광합성 생물의 생산물을 제 1 당사자에게 판매하였을 수 있다.

탄소 배출권은 실질 유동 통화 수단과 교환될 수 있다. 예로서, 탄소 배출권은 현금, 수표 등과 같은 현금 균등물과 교환될 수 있다. 탄소 배출권은 지적재산권과 관련된 법적 증서(grant), 예로서 이에 제한되지는 않지만, 양도증(assignment) 또는 면허증과 교환될 수도 있다. 탄소 배출권은 정부 세금 보조금 또는 소정의 시장의 구매자들에게 대한 접근과 교환될 수도 있다. 탄소 배출권은 생물을 기르는 것을 포함하지 않는 것과 같이, 또다른 소 방출 과정의 이용과 교환될 수도 있다. 한 당사자는, 예로서, 한달 또는 일년의 기한 내에 유리될 수 있는 방출의 제한치를 가질 수 있으며, 그 제한치를 넘으면 벌금 및 벌칙(penalties)을 받을 수 있다. 그러나, 탄소 배출권을 갖는 경우, 그 제한치를 넘는 당사자는 벌금 또는 벌칙에 대해 탄소 배출권으로 상계할 수 있거나 또는 그 당사자에 의해 생성된 방출량 결정시 고려할 수 있다.

본 발명의 사업 방법들은 탄소배출권을 판매하는 한편, 연료 생산물, 향료 등과 같은 생산물의 생산과 관련될 수 있다.

본 발명의 비지니스 방법은 향료 및 살충제와 같은 연료 생산물과는 다른 생산물을 판매하는 것을 고려할 수 있다. 탄소 배출권의 사용과 관련된 것들을 포함하는, 연료 생산물들과 관련된 사업 방법들도 기타 유형의 유용한 생산물들 및 물질들의 생산에 관련된다.

본 발명에서 제공되는 추가적인 방법은 조성물의 δ¹³C 비율의 측정값을 얻고, 상기 측정값을 사용하여 조성물을 표시하는 것을 포함하는 조성물을 표시하는 방법이다. 어떤 구체예에 있어서, 상기 표시는 상기 조성물의 δ¹³C 비율을 부여하는 것을 포함한다. 어떤 구체예에 있어서, 상기 표시는 상기 조성물의 δ¹³C 비율을 부여하는 것을 포함하고, 상기 조성물의 δ¹³C 비율의 측정값은 -32‰ 미만이다. 하나의 예에 있어서, 상기 조성물은 연료 성분을 포함할 수 있는 연료 생산물이다. 표시는 상기 조성물에 물리적 표지를 첨가하거나 상기 조성물을 함유하는 포장에 물리적 표지를 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 표시 단계는 컴퓨터 판독가능 표지 및/또는 재생가능한 자원을 부여하는 표지를 포함할 수 있다. 어떤 측면에서, 본 발명에서 설명된 방법은 조성물을 추적하는 단계를 더 포함할 수 있다. 어떤 예에서, 상기 추적은 1) 알려지지 않은 조성물의 탄소 동위원소 비율과 측정값을 비교하고, 2) 상기 조성물의 위치를 확인하고/하거나, 3) 컴퓨터 시스템으로 상기 조성물을 모니터링하는 것을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구체예들이 여기 나타내고 기재되었으며, 그러한 구체예들이 단지 예시적인 목적으로서만 제공된다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명으로부터 벗어나지 않는 각종 변화들, 변경 및 대체는 당업자에게 이제 명백할 것이다. 여기 기재된 본 발명의 구체예들에 대한 각종 대안들이 본 발명의 실시에 사용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다.

실시예 1

C. 레인하르티에서 모노테르펜 신타제의 생산

본 실시예에서, M. 스피카타(M. spicata)로부터의 리모넨 신타제를 암호화하는 핵산들을 C. 레인하르티 내로 도입시켰다. 형질전환 DNA를 도 1a에 도식적으로 나타내었다. 이 경우에서, "형질전환유전자"로 라벨된 구획은 리모넨 신타제를 암호화하는 유전자로, 이는 C. 레인하르티로부터의 psbA 유전자에 대한 5'UTR 및 프로모터 서열 및 C. 레인하르티로부터의 psbA 유전자에 대한 3'UTR에 의해 조절되고, "선발 마커"로 라벨된 구획은 세균으로부터의 카나마이신 내성 암호화 유전자로, 이는 C. 레인하르티로부터의 atpA 유전자에 대한 5' UTR 및 프로모터 서열 및 C. 레인하르티로부터의 rbcL 유전자에 대한 3'UTR 서열에 의해 조절된다. FPP 신타제 형질전환유전자 카세트는, 각각 5' 및 3' 측에 있는 psbA 유전자좌에 측면근접하는 DNA의 서열들과 동일한, "상동성 A" 및 "상동성 B"로 라벨된 구획들을 거쳐 C. 레인하르티의 psbA 유전자좌들로 타겟된다. 이 형질전환 DNA의 구축물 내에서 실시된 모든 DNA 조작들은 본질적으로 Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989) 및 Cohen 등, Meth. Enzymol. 297, 192-208, 1998에 기재된 것과 같다.

이들 시험들에 대해, 모든 형질전환들은 C. 레인하르티 균주 137c(mt+) 상에서 수행되었다. 23℃, 100rpm으로 설정된 회전 진탕기 상에서 450Lux의 일정 조명 하에, TAP 배지(Gorman 및 Levine, Proc . Natl . Acad. Sci., USA 54:1665-1669, 1965, 이는 여기에 참조로서 포함됨) 내에서 0.5 mM 5-플루오로데옥시유리딘 존재하에, 세포들을 후기 로그 상(약 7일)까지 배양하였다. 세포 50ml를, 23℃에서 5분 동안 4,000xg에서의 원심분리에 의해 수확하였다. 상등액을 따라내고, 입자 충격에 의한 이후의 엽록체 형질전환을 위해 4ml TAP 배지에 세포들을 재현탁하였다(Cohen 등, 상기와 같음, 1998). 모든 형질전환들을 카나마이신 선발(100㎍/ml) 하에서 실시하였으며, 여기에서 내성은 도 1a에서 "선발 마커"로 라벨된 구획에 의해 암호화된 유전자에 의해 수여되었다(Chlamydomonas Stock Center, Duke University).

PCR을 사용하여 형질전환된 균주들을 확인하였다. PCR 분석을 위하여, 10⁶ 해조류 세포들(한천 평판 또는 액체 배양)을 10mM EDTA 중에 현탁시키고 95℃에서 10분 동안 가열한 후, 23℃ 가까이로 냉각하였다. 반응 버퍼, MgCl₂, dNTPs, PCR 프라이머쌍(들), DNA 폴리머라제 및 물로 이루어지는 PCR 칵테일을 제조하였다. EDTA 내의 해조류 용균물을 첨가하여 반응용 주형을 제공하였다. 마그네슘 농도는, 첨가된 EDTA 내의 해조류 용균물의 양 및 농도를 보충하기 위하여 변화시켰다. 어닐링 온도 구배들을 사용하여 특정 프라이머쌍들에 대한 최적 어닐링 온도를 결정하였다.

리모넨 신타제 유전자를 포함하는 균주들을 동정하기 위하여, 하나의 프라이머쌍을 사용하였으며, 여기에서 하나의 프라이머는 psbA 5'UTR내의 자리로 어닐링되고, 다른 하나의 프라이머는 리모넨 신타제 코딩 구획으로 어닐링되었다. 바람직한 클론들은, 예측된 크기의 PCR 생산물을 산출하는 것들이다. 내생의 유전자 유전자좌가 전위되는 정도를 결정하기 위하여 (헤테로플라스마성 대 호모플라스마성), 두 세트의 프라이머쌍들로 이루어지는 PCR 반응을 이용하였다(동일한 반응에서). 첫번째 프라이머쌍은 발현 벡터에 의해 타겟된 내생의 유전자좌를 증폭하고, psbA 5'UTR내로 어닐링되는 프라이머 및 상기 psbA 코딩 영역내로 어닐되는 프라이머로 이루어진다. 두번째 프라이머쌍은 발현 벡터에 의해 타겟되지 않는 불변 또는 대조구 영역을 증폭하여, 모든 경우들에서 예측된 크기의 생산물을 생산하여야 한다. 이 반응은 내생의 유전자좌로부터의 PCR 생산물의 부재가 PCR 반응을 저해한 세포성 및/또는 기타 오염원들로 인한 것이 아니라는 것을 확인하여 주는 것이다. 프라이머쌍들의 농도는, 두 반응들 모두가 동일한 시험관 내에서 작용하도록 변화될 수 있으나; 내생의 유전자좌에 대한 쌍이 불변 쌍의 농도의 5배이다. 사용된 사이클 수는, 감도를 증가시키기 위하여, 30 초과이다. 가장 바람직한 클론들은, 불변 영역에 대한 생산물을 산출하지만 내생의 유전자 유전자좌에 대한 것은 아닌 클론들이다. 대조구 영역에 비해 약한 강도의 내생의 유전자좌 생산물들을 제공하는 클론들도 바람직하다.

리모넨 신타제의 발현을 위한 C. 레인하르티 형질전환체들의 배양은, 달리 언급되지 않는 한, 23℃에서, 100rpm으로 설정된 회전 진탕기 상에서 어둠 속에서 액상의 TAP 배지 내에서 실시되었다. 배양물들은 수확하기 전 적어도 48시간 동안, ml당 1x10⁷ 세포들의 밀도로 유지되었다.

리모넨 신타제 유전자가 형질전환된 해조류 세포들에서 리모넨 신타제의 발현을 이끌었는지를 확인하기 위하여, 두 개의 가용성 단백질들을 면역침전시키고 웨스턴 블롯으로 시각화하였다. 간단하게, 500ml의 해조류 세포 배양물을, 4℃에서 15 분동안 4000xg에서 원심분리하여 수확하였다. 상등액을 따라내고, 세포들을 10ml의 용균 버퍼(100 mM Tris-HCl, pH=8.0, 300 mM NaCl, 2% Tween-20)에 재현탁하였다. 세포들을 초음파처리(10x30초, 35% 파워)에 의해 용균시켰다. 용균물을 4℃에서 1시간 동안 14,000xg에서 원심분리함에 의해 청징화하였다. 상등액을 제거하고, 4℃ 에서 10시간 동안, 항-FLAG 항체-접합된 아가로스 수지와 함께 인큐베이션하였다. 수지를 중력 여과에 의해 용균물로부터 분리시키고, 세척 버퍼(100 mM Tris-HCl, pH=8.0, 300mM NaCl, 2% Tween-20)로 3회 세척하였다. 다수의 샘플들로부터의 웨스턴 블롯 결과들은(도 2), 리모넨 신타제가 실제로 생산되었음을 보여준다.

해조류 엽록체 내에서 생산된 리모넨 신타제가 기능성 효소인지의 여부를 결정하기 위하여, GPP로부터의 리모넨 생산을 시험하였다. 간단하게는, 50㎕의 리모넨 신타제-결합된 아가로스(상기 제조된 동일한 샘플들)를 0.33mg/ml GPP와 함께 300㎕의 반응 버퍼(25 mM HEPES, pH=7.2, 100 mM KCl, 10 mM MnCl₂, 10% 글리세롤 및 5 mM DTT) 내에 현탁하고, 유리 바이알로 옮겼다. 반응물을 헵탄으로 오버레이하고, 23℃에서 12시간 동안 인큐베이션하였다. 반응물을 냉각시키고 혼합물을 와동시켜 추출하였다. 0.1mL의 헵탄을 제거하고, 샘플을 기체 GC-MS로 분석하였다. 결과들을 도 5에 나타내었다. 결과들을 도 3에 나타내었다.

처리되지 않은 세포 용균물들로부터의 리모넨 신타제 활성도 시험하였다. 간단하게는, 50mL의 해조류 세포 배양물을, 4℃에서 15분 동안 4000xg에서 원심분리하여 수확하였다. 상등액을 따라내고, 세포들을 0.5mL의 반응 버퍼(25 mM HEPES, pH=7.2, 100 mM KCl, 10 mM MnCl₂, 10% 글리세롤 및 5 mM DTT) 내에 재현탁하였다. 세포들을 초음파처리(10x30초, 35% 파워)에 의해 용균시켰다. 0.33mg/mL의 GPP를 상기 용균물에 첨가하고, 그 혼합물을 유리 바이알로 옮겼다. 반응물을 헵탄으로 오버레이하고, 23℃에서 12시간 동안 인큐베이션하였다. 반응물을 냉각시키고 혼합물을 와동시켜 추출하였다. 0.1mL의 헵탄을 제거하고, 샘플을 GC-MS로 분석하였다. 결과들을 도 3에 나타내었다.

실시예 2

C. 레인하르티에서 FPP 신타제 및 세스퀴테르펜 신타제의 생산

본 실시예에서, G. 갈루스로부터의 FPP 신타제를 암호화하는 핵산들 및 O. 바실리쿰(O. basilicum)으로부터의 징기베렌 신타제를 암호화하는 핵산들을 C. 레인하르티 내로 도입시켰다. 형질전환 DNA를 도 1c에 도식적으로 나타내었다. 이 경우에서, "형질전환유전자 1"로 라벨된 구획은 FPP 신타제를 암호화하는 유전자로, 이는 C. 레인하르티로부터의 psbD 유전자에 대한 5'UTR 및 프로모터 서열 및 C. 레인하르티로부터의 psbA 유전자에 대한 3'UTR에 의해 조절되고, "형질전환유전자 2"로 라벨된 구획은 징기베렌 신타제를 암호화하는 유전자로, 이는 C. 레인하르티로부터의 psbD 유전자에 대한 5'UTR 및 프로모터 서열 및 C. 레인하르티로부터의 psbA 유전자에 대한 3'UTR에 의해 조절되고, "선발 마커"로 라벨된 구획은 세균으로부터의 카나마이신 내성 암호화 유전자로, 이는 C. 레인하르티로부터의 atpA 유전자에 대한 5' UTR 및 프로모터 서열 및 C. 레인하르티로부터의 rbcL 유전자에 대한 3'UTR 서열에 의해 조절된다. 상기 형질전환유전자 카세트는, 각각 5' 및 3' 측에 있는 3HB 유전자좌에 측면근접하는 DNA의 서열들과 동일한, "상동성 C" 및 "상동성 D"로 라벨된 구획들을 거쳐 C. 레인하르티의 3HB 유전자좌로 타겟된다. 이 형질전환 DNA의 구축물 내에서 실시된 모든 DNA 조작들은 본질적으로 Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989) 및 Cohen 등, Meth . Enzymol. 297, 192-208, 1998에 기재된 것과 같다.

이들 시험들에 대해, 모든 형질전환들은 C. 레인하르티 균주 137c(mt+) 상에서 수행되었다. 23℃, 100rpm으로 설정된 회전 진탕기 상에서 450Lux의 일정 조명 하에, TAP 배지(Gorman 및 Levine, Proc . Natl . Acad. Sci., USA 54:1665-1669, 1965, 이는 여기에 참조로서 포함됨) 내에서 0.5 mM 5-플루오로데옥시유리딘 존재하에, 세포들을 후기 로그 상(약 7일)까지 배양하였다. 세포 50ml를, 23℃에서 5분 동안 4,000xg에서의 원심분리에 의해 수확하였다. 상등액을 따라내고, 입자 충격에 의한 이후의 엽록체 형질전환을 위해 4ml TAP 배지에 세포들을 재현탁하였다(Cohen 등, 상기와 같음, 1998). 모든 형질전환들을 카나마이신 선발(100㎍/ml) 하에서 실시하였으며, 여기에서 내성은 도 1c에서 "선발 마커"로 라벨된 구획에 의해 암호화된 유전자에 의해 수여되었다(Chlamydomonas Stock Center, Duke University).

PCR을 사용하여 형질전환된 균주들을 확인하였다. PCR 분석을 위하여, 10⁶ 해조류 세포들(한천 평판 또는 액체 배양)을 10mM EDTA 중에 현탁시키고 95℃에서 10분 동안 가열한 후, 23℃ 가까이로 냉각하였다. 반응 버퍼, MgCl₂, dNTPs, PCR 프라이머쌍(들), DNA 폴리머라제 및 물로 이루어지는 PCR 칵테일을 제조하였다. EDTA 내의 해조류 용균물을 첨가하여 반응용 주형을 제공하였다. 마그네슘 농도는, 첨가된 EDTA 내의 해조류 용균물의 양 및 농도를 보충하기 위하여 변화시켰다. 어닐링 온도 구배들을 사용하여 특정 프라이머쌍들에 대한 최적 어닐링 온도를 결정하였다. FPP 신타제 유전자를 포함하는 균주들을 동정하기 위하여, 하나의 프라이머쌍을 사용하였으며, 여기에서 하나의 프라이머는 psbD 5'UTR내의 자리로 어닐링되고, 다른 하나의 프라이머는 FPP 신타제 코딩 구획으로 어닐링되었다. 징기베렌 신타제 유전자를 포함하는 균주들을 동정하기 위하여, 하나의 프라이머쌍을 사용하였으며, 여기에서 하나의 프라이머는 psbD 5'UTR내의 자리로 어닐링되고, 다른 하나의 프라이머는 징기베렌 신타제 코딩 구획으로 어닐링되었다. 바람직한 클론들은, 두 반응들 모두에서 예측된 크기의 PCR 생산물을 산출하는 것들이다. 내생의 유전자 유전자좌가 전위되는 정도를 결정하기 위하여 (헤테로플라스마성 대 호모플라스마성), 두 세트의 프라이머쌍들로 이루어지는 PCR 반응을 이용하였다(동일한 반응에서). 첫번째 프라이머쌍은 발현 벡터에 의해 타겟된 내생의 유전자좌를 증폭한다. 두번째 프라이머쌍은 발현 벡터에 의해 타겟되지 않는 불변 또는 대조구 영역을 증폭하여, 모든 경우들에서 예측된 크기의 생산물을 생산하여야 한다. 이 반응은 내생의 유전자좌로부터의 PCR 생산물의 부재가 PCR 반응을 저해한 세포성 및/또는 기타 오염원들로 인한 것이 아니라는 것을 확인하여 주는 것이다. 프라이머쌍들의 농도는, 두 반응들 모두가 동일한 시험관 내에서 작용하도록 변화될 수 있으나; 내생의 유전자좌에 대한 쌍이 불변 쌍의 농도의 5배이다. 사용된 사이클 수는, 감도를 증가시키기 위하여, 30 초과이다. 가장 바람직한 클론들은, 불변 영역에 대한 생산물을 산출하지만 내생의 유전자 유전자좌에 대한 것은 아닌 클론들이다. 대조구 영역에 비해 약한 강도의 내생의 유전자좌 생산물들을 제공하는 클론들도 바람직하다.

FPP 신타제 유전자 및 징기베렌 신타제 유전자의 존재가 FPP 신타제 및 징기베렌 신타제 효소들의 발현을 이끌었는지를 확인하기 위하여, 웨스턴 블롯을 수행하였다. 약 1×10⁸ 해조류 세포들을 TAP 한천 배지로부터 수집하고 0.05ml의 용균 버퍼(Bugbuster; Novagen)에 현탁하였다. 용액들을 95℃로 5분동안 가열한 후 23℃로 냉각시켰다. 용균물을 로딩 버퍼(XT 샘플 버퍼; Bio-Rad)와 3:1로 혼합하고, 샘플들을 95℃로 1분 동안 가열하고, 23℃로 냉각하고, 불용성 단백질들을 원심분리하여 제거하였다. 가용성 단백질들을 SDS-PAGE로 분리하고, PVDF 막으로 옮겼다. 막을 23℃에서 30분 동안 TBST + 5% 건조 탈지유로 차단하고, 4℃에서 10시간 동안 항-FLAG 항체(TBST + 5% 건조 탈지유 중에서 1:2,500으로 희석됨) 와 함께 인큐베이션하고, TBST로 3회 세척하고, 23℃에서 1시간 동안 순무-연결 항-마우스 항체(TBST + 5% 건조 탈지유 중에서 1:5,000로 희석됨)와 함께 인큐베이션하고, TBST로 3회 세척하였다. 화학형광 검출로 단백질들을 시각화하였다. 다수의 클론들로부터의 결과들은(도 4), C. 레인하르티 세포들에서의 GPP 신타제 유전자의 발현이 그 단백질을 생산하도록 하였음을 보여준다.

FPP 신타제 및 징기베렌 신타제의 발현을 위한 C. 레인하르티 형질전환체들의 배양은, 달리 언급되지 않는 한, 23℃에서, 100rpm으로 설정된 회전 진탕기 상에서 5,000Lux의 일정 조명 하에서 액상의 TAP 배지 내에서 실시되었다. 배양물들은 수확하기 전 적어도 48시간 동안, ml당 1x10⁷ 세포들의 밀도로 유지되었다.

해조류 엽록체 내에서 생산된 FPP 신타제 및 징기베렌 신타제가 기능성인지의 여부를 결정하기 위하여, DMAPP 및 IPP로부터의 세스퀴테르펜 생산을 시험하였다. 간단하게는, 50mL의 해조류 세포 배양물을, 4℃에서 15분 동안 4000xg에서 원심분리하여 수확하였다. 상등액을 따라내고, 세포들을 0.5ml의 반응 버퍼(25 mM HEPES, pH=7.2, 100 mM KCl, 10 mM MnCl₂, 10% 글리세롤 및 5 mM DTT) 내에 재현탁하였다. 세포들을 초음파 처리(10×30, 35% 파워)에 의해 용균시켰다. 0.33mg/ml의 FPP 신타제를 상기 용균물에 첨가하고, 그 혼합물을 유리 바이알로 옮겼다. 반응물을 헵탄으로 오버레이하고, 23℃에서 12시간 동안 인큐베이션하였다. 반응물을 냉각시키고 혼합물을 와동시켜 추출하였다. 0.1mL의 헵탄을 제거하고, 샘플을 GC-MS로 분석하였다.

실시예 3

배연 가스와 접촉하여 성장한 조류를 포함하는 샘플의 δ ¹³ C 비율 측정

액체 샘플 분석용으로 사용되는 기술은 EA-IRMS(elemental analyser isotope ratio mass spectrometry)이었다. 본 기술에서 샘플과 참조는 주석 캡슐에서 무게를 달고, 봉해지고, Europa Scientific elemental analyser에서 자동-샘플러에 로딩되었다. 다음으로 상기 샘플은 순서대로 1000℃로 유지된 가열로로 떨어뜨릴 수 있으며, 산소의 존재하에서 연소되었다. 상기 주석 캡슐은 상기 샘플의 지역에서 ~1700℃의 온도로 급격하게 연소되었다. 연소된 가스는 연소 촉매(Cr₂O₃), (탄화수소를 산화하기 위한) 산화구리선 및 황과 할라이드를 제거하기 위한 실버울(silver wool)을 거쳐 헬륨 흐름으로 빠져들었다. 결과의 가스 N₂, NO_x, H₂O, O₂ 및 CO₂는 600℃로 유지된 순수한 구리선의 환원 단계를 통하여 빠져들었다. 이것은 어떠한 산소를 제거하고, NO_x종을 N₂로 전환시킨다. 마그네슘 퍼클로레이트 케미칼 트랩(magnesium perchlorate chemical trap)은 물을 제거하기 위하여 사용되었다. 질소와 이산화탄소는 100℃의 일정한 온도로 유지된 충진된 컬럼 가스 크로마토그래피를 사용하여 분리되었다. 결과의 이산화탄소 피크는 이온화되고 가속화되는 Europa Scientific 20-20 IRMS의 이온 소스로 들어간다. 다른 중량의 가스종은 자기장에서 분리되고, 다음으로 CO₂의 방사성동위원소이성질체(isotopomers)를 측정하기 위하여 Faraday cup collector array를 사용하여 m/z 44, 45 및 46에서 동시에 측정되었다. 분석은 배치 공정으로 진행되었으며, 상기 공정에 의하여 참조가 분석되었으며, 여러가지 샘플이 뒤따르고, 다음으로 다른 참조가 이어졌다. 분석용으로 사용된 참조물질은 IR001(Iso-Analytical working standard flour, δ¹³C_VPDB = -26.43‰)을 포함하였다. IAEA-CH-6(IAEA sucrose standard, δ¹³C_VPDB = -10.43‰) 및 IR005(Iso-Analytical working standard beet sugar standard, δ¹³C_VPDB = -26.03‰)이 샘플의 분석 동안 정량 대조군으로 측정되었다. IAEA-CH-6는 International Energy Agency(IAEA)에 의하여 배포된 실험실간 비교 표준(inter-laboratory comparison standard)이다. IA-R001 및 IA-R006은 IAEA-CH-6에 대하여 계측되고, 추적되었다. 탄소 13 분석용으로 사용된 참조 물질은 -28.06‰의 δ¹³C 값 대 PDB를 갖는 Iso-Analytical Mineral Oil standard(IA-R002)를 포함하였다. IA-R002는 -29.81‰의 δ¹³C 값 대 PDB를 갖는 IAEA에 의하여 배포된 NBS-22(Mineral Oil)에 대하여 추적가능하다. IA-R002, IA-R024(Iso-Analytical olive oil standard, -29.27‰의 δ¹³C, NBS-22에 대하여 추적가능) 및 IA-R044(Iso-Analytical corn oil standard, -16.27‰의 δ¹³C, NBS-22에 대하여 추적가능)는 샘플의 각 배치 분석에서 정량 대조군 체크 샘플로서 사용되었다.

이산화탄소 샘플의 분석용으로 사용된 기술은 GC-IRMS(gas chromatography isotope ratio mass spectrometry)이다. 이 기술에서, 샘플의 알리쿼트가 주사기와 바늘을 사용하여 (격막으로 공정된) 가스 백으로부터 취해진다. 상기 가스 샘플은 충진된 컬럼 가스 크로마토그래피(컬럼 타입: Porapak Q, 80/100 메쉬, 6' x 1/4" SS)로 주입되어, 이산화탄소를 분리하고, 40℃의 등온 GC 온도로 유지된다. 컬럼을 통한 흐름 속도는 20psi의 컬럼 압력을 사용하여 약 60ml/분이었다. CO2에 대한 결과의 크로마토그래피 피크는 이온화되고 가속화되는 Europa Scientific 20-20 IRMS의 이온 소스로 들어간다. 다른 중량의 가스종은 자기장에서 분리되고, 다음으로 ¹³C 분석을 위한 중량 44, 45 및 46을 측정하기 위하여 Faraday cup collector array를 사용하여 동시에 측정되었다. 참조 가스(CO₂)의 샘플은 샘플로서 샘플 흐름 경로를 이용하여 GC-IRMS로 주입된다. 샘플 가스의 δ¹³C 값을 결정하는데 사용된 참조 가스는 IA-R060(δ¹³C = -35.63‰ 대 V-PDB)이었다. IA-R060은 IAEA(비엔나)에 의하여 방사성 동위원소 참조 표준으로 배포된 NBS-19(+1.95‰의 δ¹³C 값 대 V-PDB)에 대하여 추적가능하다. IA-R060은 정량 대조군을 위한 샘플과 함께 체크 샘플로서 분석되었다. (사탕무우, 설탕, 올리브 오일, 옥수수 오일, 밀가루 및 사탕수수와 같은) 곡물류 식물, 대기 및 배연 가스와 같은) 가스 샘플 및 비정제 석유 오일을 포함하는 다양한 샘플 화합물의 δ¹³C 비율을 측정하는 실험의 결과. 비교를 위하여, 조류 샘플(대기에서 성장한 조류, 제한된 이산화탄소 배연 가스에서 성장한 조류 및 초과 이산화탄소 배연 가스에서 성장한 조류)의 δ¹³C 비율이 무기 탄소로부터 연료 생산물 또는 본원에서 설명된 조성물과 같은 유기 분자로 탄소의 탄소 고정 통합을 나타내기 위하여 측정되었다. 결과는 도 5에 요약하였다.

대기에서 전형적으로 성장된 곡물류 식물은 -20.02‰의 평균 δ¹³C 비율을 나타내었다. 곡물류 식물의 δ¹³C 비율의 값의 범위는 (설탕에 대하여) 10.43‰부터 (올리브 오일에 대하여) -29.28‰의 범위였다. 곡물류 식물의 다른 δ¹³C 비율은 사탕수수에 대하여 11.66‰, 옥수수 오일에 대하여 -16.22‰, 사탕무우에 대하여 -26.03‰ 및 밀가루에 대하여 -26.47‰을 포함하였다. 이러한 δ¹³C 비율의 전체는 -32‰보다 크다.

비정제 석유 오일 샘플이 9종의 다른 기원으로부터 얻어졌다. 비정제 오일 샘플의 평균 δ¹³C은 -27.76‰이었고, -26.77‰부터 -30.18‰의 범위였다. 이러한 값은 석탄 연료의 δ¹³C의 문헌상 값과 일치한다. 이러한 δ¹³C 값의 전체는 -32‰보다 크며, 따라서, 배연 가스 또는 본원에서 설명된 것과 같은 석탄 연료로부터의 무기 탄소원과 접촉한 (50년 이내의) 최근에 성장한 광합성 생물로부터 추출된 생산물 또는 조성물의 δ¹³C 비율을 나타내지는 않는다.

배연 가스는 도 5에 나타난 바와 같이 -35.92‰의 δ¹³C 비율을 나타내었다. 배연 가스는 석유 또는 석탄 연료 생산물의 연소로부터 일 수 있다. 비교를 위하여, 대기 δ¹³C 비율은 약 -8 내지 -8.5‰로 간주된다.

조류는 광바이오리엑터를 통한 기포 가스에 의하여 성장되었다. 3종의 다른 조류가 성장되었다: 대기와 접촉되어 성장한 1종, 제한된 배연 가스와 접촉되어 성장한 1종 및 초과 배연 가스와 접촉되어 성장한 1종. 예를 들어, 제한된 배연 가스에서 성장한 조류는 배연 가스로부터의 이산화탄소와 함께 가스로 기포를 발생시켰으며, 여기에서 가스 내의 이산화탄소의 양은 대기 (또는 dir 1% 미만)의 이산화탄소의 양과 유사하였다. 예를 들어, 초과 배연 가스에서 성장한 조류는 배연 가스로부터의 이산화탄소를 포함하는 가스로 기포를 발생시켰고, 여기에서 제공된 가스의 이산화탄소의 양은 총 가스의 양의 3~7% (또는 약 5%)였다. 또한, 분리된 장치에서 제한된 배연 가스에서 성장한 조류 및 분리된 장치에서 극도로 초과된 배연 가스에서 성장한 조류의 두 다른 조류 샘플이 분석되었다. 다음으로 조류 샘플들은 건조되고, 본 실시예에서 설명된 것과 같은 샘플의 δ¹³C 비율을 측정하기 위하여 연소되었다.

대기, 제한된 배연 가스 및 초과 배연 가스에서 성장한 조류 샘플의 δ¹³C 비율을 측정한 결과를 도 5에 나타내었다. 대기에서 성장한 조류 샘플은 -12.90‰의 δ¹³C 비율을 나타내었다. 이 결과는 예상되었으며, 설명된 바와 같이, 광합성 생물체가 예를 들어 본원에서 설명된 바와 같이 RuBisCO 효소로 인하여 광합성 동안 ¹³C보다 ¹²C에 대하여 더 선호도를 가질 수 있기 때문이다. 그러므로, 광합성 생물 및 유기 분자는 무기 탄소원의 δ¹³C 비율보다 적은 δ¹³C 비율을 가질 것이 분명하다.

제한된 배연 가스에서 성장한 6종류의 조류가 분석되었고, -22.57‰의 평균 δ¹³C 비율 및 -14.87 내지 -32.03‰의 범위를 가졌다. 오차는 제공된 배연 가스의 양, 배연 가스의 속도, 보다 효율적인 탄소 고정 또는 RuBisCO를 가질 수 있는 조류의 종류 또는 성장 동안 생물에 제공되는 빛의 양에 기인할 수 있다. 실시예에서와 같이, 두 조류 샘플은 -14.87과 -16.28‰의 가장 높은 δ¹³C을 제공하였으며, 이러한 양 샘플은 다른 네 샘플보다 더 많은 비카보네이트와 접촉하여 성장하였다. 비카보네이트는 배연 가스보다 더 큰 δ¹³C 값을 가지며, 또한 조류 대한 무기 탄소원이므로, 상기 값은 이러한 생물에서 비카보네이트 및 배연 가스 양자의 탄소 고정에 의하여 더 낮아질 것이다.

초과 배연 가스에서 성장한 5종류의 조류가 분석되었고, --52.06‰의 평균 δ¹³C 비율 및 -40.65 내지 -55.34‰의 범위를 가졌다. 초과 배연 가스는 석탄 연료의 연소에 의하여 제공된 배연 가스이다. 초과 배연 가스에서 성장한 조류의 δ¹³C 값은 모두 -32‰보다 적었다. 조류 내의 유기 분자들은 배연 가스의 무기 탄소로 고정된 탄소이므로, 상기 분자들은 석유 또는 다른 석탄 연료에서 발견되는 것 보다 더 낮은 δ¹³C 비율인 낮은 δ¹³C 비율을 갖는다. 조성물 및/또는 연료 생산물이 -32‰ (예를 들어, -40.65 내지 -55.34‰)보다 적은 δ¹³C 비율을 포함하는 조류로부터 추출 및 정제될 수 있다. 상기 조성물은 δ¹³C 비율이 알려진 석유의 δ¹³C 비율 및 본 실시예에서 측정된 것과 같은 석유의 δ¹³C 비율보다 적은 것을 제외하고 연료 생산물로서 사용된 석유 조성물과 동일 또는 유사할 수 있다.

Claims (72)

1. 수소 및 탄소 원자를 포함하고, 상기 수소 및 탄소 원자는 조성물 중량의 적어도 80%이고, 상기 조성물의 δ¹³C 비율은 -32‰ 미만인 분자를 포함하는 조성물.
2. 제1항에 있어서, 이소프렌 단위를 포함하는 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 수소 및 탄소 원자는 상기 조성물 중량의 적어도 90%인 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 수소 및 탄소 원자는 상기 조성물 중량의 적어도 95%인 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 수소 및 탄소 원자는 상기 조성물 중량의 적어도 99%인 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 수소 및 탄소 원자는 상기 조성물 중량의 100%인 조성물.
7. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 액체인 조성물.
8. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 연료 첨가제인 조성물.
9. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 연료 생산물인 조성물.
10. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 테르펜 또는 테르페노이드인 조성물.
11. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 지방산이 아닌 조성물.
12. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 지방산 에스테르가 아닌 조성물.
13. 제1항에 있어서, 상기 조성물의 δ¹³C 비율은 -35‰ 미만인 조성물.
14. 제1항에 있어서, 상기 조성물의 δ¹³C 비율은 -40‰ 미만인 조성물.
15. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 옥탄가 85~120을 갖는 조성물.
16. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 옥탄가 90 이상을 갖는 조성물.
17. (a) 수소 및 탄소 원자를 포함하고, 상기 수소 및 탄소 원자는 조성물 중량의 적어도 80%이고, 상기 조성물의 δ¹³C 비율은 -32‰ 미만인 분자를 포함하는 조성물; 및
    (b) 연료 성분을 포함하는 연료 생산물.
18. 제17항에 있어서, 상기 연료 성분은 화석 연료, 연료 블렌딩용 혼합물, 가솔린, 디젤, 에탄올, 제트 연료 및 이들의 어떠한 조합물로 이루어지는 군으로부터 선택된 블렌딩 연료인 연료 생산물.
19. 제18항에 있어서, 상기 블렌딩 연료는 -32‰ 이상의 δ¹³C 비율을 갖는 연료 생산물.
20. 제17항에 있어서, 상기 연료 성분은 MTBE, 항산화제, 정전기 방지제, 부식 방지제 및 이들의 어떠한 조합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 연료 첨가제인 연료 생산물.
21. 제17항에 있어서, 상기 조성물은 이소프렌 단위를 포함하는 연료 생산물.
22. 제17항에 있어서, 상기 수소 및 탄소 원자는 상기 조성물 중량의 적어도 90%인 연료 생산물.
23. 제17항에 있어서, 상기 수소 및 탄소 원자는 상기 조성물 중량의 적어도 95%인 연료 생산물.
24. 제17항에 있어서, 상기 수소 및 탄소 원자는 상기 조성물 중량의 적어도 99%인 연료 생산물.
25. 제22항에 있어서, 상기 수소 및 탄소 원자는 상기 조성물 중량의 100%인 연료 생산물.
26. 제17항에 있어서, 상기 조성물은 테르펜 또는 테르페노이드인 연료 생산물.
27. 제17항에 있어서, 상기 조성물은 액체인 연료 생산물.
28. 제17항에 있어서, 상기 조성물은 지방산이 아닌 연료 생산물.
29. 제17항에 있어서, 상기 조성물은 지방산 에스테르가 아닌 연료 생산물.
30. 조성물의 연소에 의하여 이산화탄소를 생성하고, 상기 이산화탄소는 -32‰ 미만의 δ¹³C 비율을 갖는 이산화탄소의 생성 방법.
31. 제30항에 있어서, 상기 이산화탄소는 -35‰ 미만의 δ¹³C 비율을 갖는 이산화탄소의 생성 방법.
32. 제30항에 있어서, 상기 이산화탄소는 -40‰ 미만의 δ¹³C 비율을 갖는 이산화탄소의 생성 방법.
33. 제30항에 있어서, 상기 연소는 가솔린 엔진에서 수행되는 이산화탄소의 생성 방법.
34. 제30항에 있어서, 상기 연소는 디젤 엔진에서 수행되는 이산화탄소의 생성 방법.
35. 제30항에 있어서, 상기 연소는 제트 엔진에서 수행되는 이산화탄소의 생성 방법.
36. 제30항에 있어서, 비관다발성 광합성 생물로부터 상기 조성물을 추출하는 것을 더 포함하는 이산화탄소의 생성 방법.
37. 제36항에 있어서, 상기 생물에서 효소를 상향조절하는 것을 더 포함하고, 상기 효소의 생산물이 상기 조성물인 이산화탄소의 생성 방법.
38. 제37항에 있어서, 상기 효소는 상기 생물에서 자연적으로 발생하는 것이 아닌 이산화탄소의 생성 방법.
39. (a) 조성물의 δ¹³C 비율의 측정값을 얻고,
    (b) 상기 측정값을 사용하여 상기 조성물을 표시하는 것을 포함하는 상기 조성물의 표시 방법.
40. 제39항에 있어서, 상기 표시는 상기 조성물의 δ¹³C 비율의 측정값을 제공하는 것을 포함하는 표시 방법.
41. 제39항에 있어서, 상기 조성물의 δ¹³C 비율의 측정값은 -32‰ 미만인 표시 방법.
42. 제39항에 있어서, 상기 조성물은 연료 생산물인 표시 방법.
43. 제42항에 있어서, 상기 조성물은 연료 성분을 포함하는 표시 방법.
44. 제39항에 있어서, 상기 표시는 재생가능 자원을 제공하는 것을 포함하는 표시 방법.
45. 제39항에 있어서, 상기 조성물을 추적하는 것을 더 포함하는 표시 방법.
46. 제45항에 있어서, 상기 추적은 미지의 조성물의 탄소 동위원소 비율을 상기 측정값과 비교하는 것을 포함하는 표시 방법.
47. 제45항에 있어서, 상기 추적은 상기 조성물의 위치를 확인하는 것을 포함하는 표시 방법.
48. 제45항에 있어서, 상기 추적은 컴퓨터 시스템으로 상기 조성물을 모니터링하는 것을 포함하는 표시 방법.
49. (a) 제1 연료 생산물을 생성하는 비관다발성 광합성 생물을 생육시키고,
    (b) 무기 탄소원으로 상기 생물을 접촉시키고,
    (c) 무기 탄소원으로부터의 탄소를 제1 연료 생산물에 통합시키는 것을 포함하는 비관다발성 광합성 생물로부터 연료 생산물의 생산 방법.
50. 제49항에 있어서, 상기 무기 탄소원은 ¹³C을 포함하는 이산화탄소 및 ¹²C를 포함하는 이산화탄소를 포함하는 생산 방법.
51. 제49항에 있어서, 상기 생물과 무기 탄소원의 접촉은 상기 생물과 초과 무기 탄소원의 접촉인 것을 포함하는 생산 방법.
52. 제49항에 있어서, 상기 생물은 효소의 최종 생산물이 제1 연료 생산물인 하나 이상의 효소를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 생산 방법.
53. 제52항에 있어서, 상기 핵산은 이종인 생산 방법.
54. 제49항에 있어서, 상기 제1 연료 생산물은 상기 생물에 의하여 자연적으로 생산되는 것이 아닌 생산 방법.
55. 제49항에 있어서, 상기 제1 연료 생산물은 테르펜 또는 테르페노이드를 포함하는 생산 방법.
56. 제49항에 있어서, 상기 무기 탄소는 화석 연료 무기 탄소인 생산 방법.
57. 제56항에 있어서, 상기 화석 연료 무기 탄소는 -32‰ 이상의 δ¹³C 비율을 갖는 생산 방법.
58. 제49항에 있어서, 상기 제1 연료 생산물을 추출하는 것을 더 포함하는 생산 방법.
59. 제58항에 있어서, 상기 제1 연료 생산물을 정제하는 것을 더 포함하는 생산 방법.
60. 제59항에 있어서, 상기 정제는 수소화분해, 촉매성 분해, 수증기 분해, 분해, 분류, 증류, 수소처리 및 이들의 어떠한 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 공정을 포함하는 생산 방법.
61. 제58항에 있어서, 제1 연료 생산물을 포함하는 연료 생산물 및 연료 성분을 제조하는 것을 포함하는 생산 방법.
62. 제49항에 있어서, 제1 연료 생산물을 연소하여 δ¹³C 강화 무기 탄소를 생성하는 것을 더 포함하는 생산 방법.
63. 제62항에 있어서, δ¹³C 강화 무기 탄소는 -32‰ 미만의 δ¹³C 비율을 갖는 생산 방법.
64. (a) 조성물의 δ¹³C 비율의 측정값을 얻고,
    (b) 상기 조성물의 δ¹³C 비율을 참조 δ¹³C 비율과 비교하고,
    (c) 만약 상기 조성물의 δ¹³C 비율이 참조 δ¹³C 비율보다 작으면 탄소 배출권을 상기 조성물의 소유자 또는 사용자인 실체에 판매하는 것을 포함하는 탄소 배출권을 판매하는 비지니스 방법.
65. 제64항에 있어서, 상기 참조 δ¹³C 비율은 약 -32‰인 방법.
66. 제64항에 있어서, 측정값을 사용하여 상기 조성물을 표시하는 것을 더 포함하는 방법.
67. 제64항에 있어서, 상기 조성물을 추적하는 것을 더 포함하는 방법.
68. (a) 비관다발성 광합성 생물을 생장시키고,
    (b) 상기 생물을 배연 가스와 접촉시키고,
    (c) 상기 비관다발성 광합성 생물로부터 연료 생산물을 추출하는 것을 포함하는 연료 생산물의 생산 방법.
69. 제68항에 있어서, 상기 생물을 유전적으로 변형시키는 것을 더 포함하는 방법.
70. 제69항에 있어서, 상기 연료 생산물은 상기 생물에서 자연적으로 발생하는 것이 아닌 방법.
71. 제68항에 있어서, 상기 연료 생산물은 수소 및 탄소 원자를 포함하고, 상기 수소 및 탄소 원자는 조성물 중량의 적어도 90%이고, 상기 조성물의 δ¹³C 비율은 -32‰ 미만인 방법.
72. 제68항에 있어서, 상기 연료 생산물을 정제하는 것을 더 포함하는 방법.

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