KR20100060752A - 꽃가루, 집먼지 진드기 또는 황사에 의한 피부 유해반응을 스크리닝하는 방법 및 이를 조절하는 피부 외용제 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 꽃가루, 집먼지 진드기 또는 황사와 같은 환경유해인자에 의하여 발현량이 변화하는 유전자를 스크리닝함으로써 피부자극을 유도하는데 관여하는 물질 또는 이를 억제하는 물질, 피부 자극을 완화시키는 물질을 스크리닝하는 방법, 및 고련피와 관동화 추출물 중 1종 이상을 유효성분으로 함유하여 꽃가루, 집먼지 진드기 또는 황사에 의한 피부 유해영향을 완화하며 독소를 해독하고 배출하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.
집먼지 진드기(House Dust Mite), 꽃가루(Pollen), 황사(Yellow Sand Dust), 각질세포(각질형성세포, Keratinocyte), 인터루킨, IL-6(인터루킨6), IL-8(인터루킨8), GST(Glutathione-S-Transferase), NQO1(NADPH Quinone Oxidoreductase1), hBD3(human β-defensin 3), 고련피, 관동화, 피부자극
Description
본 발명은 꽃가루, 집먼지 진드기 또는 황사와 같은 환경유해인자에 의하여 발현량이 변화하는 유전자를 스크리닝함으로써 피부자극을 유도하는데 관여하는 물질 또는 이를 억제하는 물질, 피부 자극을 완화시키는 물질을 스크리닝하는 방법, 및 고련피와 관동화 추출물 중 1종 이상을 유효성분으로 함유하여 꽃가루, 집먼지 진드기 또는 황사에 의한 피부 유해영향을 완화하며 독소를 해독하고 배출하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.
피부는 외부 환경에 직접적으로 노출되는 신체 부위로서, 우리 몸의 중요한 기관들을 보호하는 보호막 역할을 할 뿐만 아니라 수분 증발을 조절하고 외부 감염으로부터 몸을 보호하는 역할을 한다. 하지만, 아무리 외부로부터의 바이러스 침투 까지 막아내는 피부일지라도 과도한 자외선이나 오염물질 등에 노출되면 홍반, 부종, 가려움 등의 피부 자극 및 염증 반응을 유발하게 된다. 이러한 환경유해인자에 의한 피부 트러블은 미관상 문제가 될 뿐만 아니라, 염증 반응 과정에서 생성되는 물질들이 부수적으로 피부의 색소 침착을 일으키고, 피부 탄력 섬유의 붕괴를 촉진시켜 피부 주름 증가에까지 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.
집먼지 진드기, 꽃가루는 알레르기 질환을 유발하는 가장 흔한 원인 중의 하나로서 전세계적으로 분포하고 있으며, 통년성 알레르기성 비염, 기관지 천식 등의 호흡기 질환과의 연관성이 주로 보고되어 있다. 집먼지 진드기는 폐의 사람 섬유아세포에서 염증관련 사이토카인(Cytokine) 발현을 증가시켜서 알레르기성 비염의 섬유화과정에 관여한다는 보고가 있다(Yu et al., Messenger RNA Expression of the Cytokine Gene Cluster in Human Fibroblast Activated with House Dust Mite Antigen. J Clinical Otolaryngol 10:224-230, 1999). 꽃가루 역시 다양한 사이토카인 분비를 촉진하여 호흡기 및 피부질환에 관여한다는 보고가 있다(Jenmalm et al., Allergen-induced Th1 and Th2 cytokine secretion in relation to specific allergen sensitization and atopic symptoms in children. Clin Exp Allergy 31(10):1528-35, 2001). 또한 임상적으로 황사바람이 직접 피부에 닿으면 알레르기 반응을 일으켜 접촉성 피부염이 발생하기 쉬우며, 또 건조하고 세찬 황사바람은 피부의 수분을 앗아가 피부건조증, 각질, 가려움증, 황사여드름 및 아토피 등을 유발한다고 알려져 있지만, 황사에 의한 피부 유해영향은 과학적으로 밝혀져 있지 않다.
피부의 최외각층에 존재하는 각질세포(각질형성세포, Keratinocyte)는 섬유아세포, 내피세포 및 진피세포에 주로 있는 면역세포들과 상호작용하여 염증반응의 개시, 조정, 조절에 중요한 역할을 한다. 피하의 염증반응과 관련하여 피부자극은 가장 일반적인 유해효과이며 임상적으로 접촉성 피부염의 70%는 피부자극으로 설명될 수 있다. 홍반, 부종, 균열, 수분손실, 표피탈락, 간지럼증 및 통증은 자극성 또는 알러지성 접촉성 피부염의 대표적 증상들이다. 이것은 세포의 항상성에 이상이 오고 염증반응이 일어나 생기는 증상들이다. 다시 말해, 이러한 증상들은 피부자극에 의해 생겨나는 복잡한 생화학적, 신경과 혈관 세포의 반응들의 연쇄작용에 의한 궁극적 생리학적 소견인 것이다. 알러지 반응과 달리 피부자극은 피부에 대한 직접적인 염증반응으로 시작된다는 점에서 차이가 있다. 그러므로 피부자극은 지엽적으로 일어나며, 비면역성 염증반응으로 자극 후 생겨났다가 수일 내에 사라지는 반응으로 정의할 수 있다.
이에, 본 발명자들은 중요한 환경유해인자인 꽃가루, 집먼지 진드기 또는 황사에 의한 피부유해작용을 밝히기 위해, 피부 조직의 최외각층에 존재하는 각질세포에 상기 환경유해인자를 처리했을 때 발생하는 다양한 생물학적 반응들에 근거한 논리로부터 피부에 대한 유해한 영향을 검증한 결과, 상기 환경유해인자들이 피부각질세포에 작용하여, 전염증성인자이며 건선의 발병 및 진행에 관여하는 인터루킨 6, 인터루킨 8의 발현이 증가할 뿐만 아니라, 또한 독소를 배출하는 효소인 GSTT1과 독소를 해독하는 효소인 NQO1, 자연면역인자인 피부항균펩타이드 hBD3의 발현도 증가함을 발견하였다.
따라서 이를 통해 인터루킨6 또는 인터루킨8의 발현은 감소시키며, GSTT1, NQ01 또는 hBD3의 발현은 증가시키는 물질을 스크리닝함으로써 환경유해인자에 의한 피부 자극을 완화시키는 물질을 효율적으로 스크리닝할 수 있음을 발견하였다.
또한 고련피와 관동화 추출물이 인터루킨6 또는 인터루킨8의 발현은 감소시키고, GSTT1, NQ01 또는 hBD3의 발현은 증가시켜 꽃가루, 집먼지 진드기 또는 황사에 의한 피부 자극을 완화시킬 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 꽃가루, 집먼지 진드기 또는 황사에 의한 피부자극을 유도하는데 관여하는 세포 내 인자 및 이를 억제하는 세포 내 인자를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 꽃가루, 집먼지 진드기 또는 황사에 의한 피부 유해 반응을 조절하는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 고련피와 관동화 추출물 중 1종 이상을 유효성분으로 함유하여 꽃가루, 집먼지 진드기 또는 황사에 의한 피부 유해반응을 조절하는 피부 외용제 조성물을 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1) 시험세포에 세포 내 인자의 발현을 조절하는 후보 물질들을 처리하는 단계; 2) 시험세포에 환경유해인자를 처리하여 환경유해인자에 의한 세포 내 인자의 과발현을 유도하는 단계; 및 3) 상기 2) 단계의 세포에서 환경유해인자에 의한 세포 내 인자의 발현 정도를 측정하는 단계;를 포함하는, 환경유해인자에 의한 피부 자극을 완화시키는 물질을 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 고련피 및 관동화 추출물 중 1종 이상을 유효성분으로 함유하여 피부 유해영향을 완화시키는 피부 외용제 조성물을 제공한다.
본 발명에 의한 방법을 이용함으로써 꽃가루, 집먼지 진드기 또는 황사에 의한 피부 유해작용을 확인하고, 황사로 인한 피부자극에서 중요한 역할을 하는 전염증성인자이며 건선의 발병 및 진행에 중요한 IL-6, IL-8의 유전자 발현을 감소시키는 물질을 효율적으로 스크리닝 할 수 있으며, 또한 독소를 배출하는 효소인 GSTT1 과 독소를 해독하는 효소인 NQO1, 자연면역인자인 피부항균펩타이드 hBD3의 발현을 조절하는 물질도 효율적으로 스크리닝할 수 있다. 또한, 고련피 및 관동화 추출물 중 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 조성물은 꽃가루, 집먼지 진드기 또는 황사로 인한 피부 트러블 방지, 피부 전염증성인자의 감소, 건선의 치료 및 예방의 약학 또는 화장품 조성물로 적용할 수 있다.
피부자극은 지엽적으로 일어나며, 비면역성 염증반응으로 자극 후 생겨났다가 수일 내에 사라지는 반응으로 정의할 수 있다. 꽃가루, 집먼지 진드기 또는 황사에 의한 피부 자극반응도 임상적 보고들을 볼 때 이러한 피부자극반응과 유사한 반응을 일으킬 것으로 예상이 된다.
본 발명에서는 사람정상각질피부세포에 주요한 환경유해인자인 꽃가루, 집먼지 진드기 또는 황사를 처리하고 이에 따른 피부의 유해영향을 밝히기 위해 세포내 기질의 성분을 대상으로 실시간 역전사중합효소 연쇄반응(real time-reverse transcription polymerase chain reaction)을 통하여 환경유해인자에 의한 피부 자극 기전의 해명이나 완화제의 개발에 적합하게 이용할 수 있는 스크리닝 방법 및 환경유해인자에 의한 피부자극 증상의 유도 방법을 개발하였다.
한편, 본 발명에서 사용하는 “세포 내 인자”라는 용어는 환경유해인자에 의하여 정상 각질세포에서보다 그 발현량이 유의적으로 증가된 물질을 일컫는다.
본 발명은 1) 각질세포에 환경유해인자인 꽃가루, 집먼지 진드기 또는 황사를 처리하는 단계; 및 2) 역전사중합효소반응을 통해 정상 각질세포와 비교하여 발현량이 유의적으로 변화된 유전자를 스크리닝하는 단계;를 포함하는, 꽃가루, 집먼지 진드기 또는 황사에 의한 피부 자극을 유도 또는 피부 자극을 완화하는데 관여하는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명에서는 상기 과정을 거쳐 꽃가루, 집먼지 진드기 또는 황사에 의한 피부 자극이 전염증성인자인 IL-6 및 IL-8의 발현량을 증가시키는 것을 확인하였으며, 또한 독소를 배출하는 효소인 GSTT1과 독소를 해독하는 효소인 NQO1, 자연면역인자인 피부항균펩타이드 hBD3의 발현량도 증가시키는 것을 확인하였으나, 이에만 한정되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 피부 자극 억제제를 유효량으로 투여하여 포유류의 각질세포 내에서 환경유해인자인 꽃가루, 집먼지 진드기 또는 황사에 의한 세포 내 인자의 발현을 조절함으로써, 즉 IL-6 및 IL-8의 발현은 억제시키고, GSTT1, NQ01, hBD3의 발현은 증가시킴으로써 환경유해인자로 인한 피부 자극을 완화하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용하는 “피부 자극 억제제”라는 용어는 환경유해인자에 의한 IL-6 또는 IL-8의 활성을 저해하거나, 또는 IL-6 또는 IL-8의 발현을 유도하는 기작에 대하여 길항작용을 함으로써 IL-6 또는 IL-8의 발현을 억제시킬 수 있고, 또한 독소를 배출하는 효소인 GSTT1과 독소를 해독하는 효소인 NQO1, 자연면역인자인 피부항균펩타이드 hBD3의 발현을 유도하여 GSTT1, NQ01, hBD3의 발현량을 증가시킬 수 있는 물질을 의미한다.
상기 포유류는 아토피 피부염, 여드름 또는 건선 등이 생기는 포유류이고, 상기 억제제는 당업계에 잘 알려진 통상적인 투여 경로를 통하여 전신 또는 국소적으로 투여된다.
본 발명은 1) 시험세포에 세포 내 인자의 발현을 조절하는 후보 물질들을 처리하는 단계; 2) 시험세포에 환경유해인자를 처리하여 환경유해인자에 의한 세포 내 인자의 과발현을 유도하는 단계; 및 3) 상기 2) 단계의 세포에서 환경유해인자에 의한 세포 내 인자의 발현 정도를 측정하는 단계;를 포함하는, 환경유해인자에 의한 피부 자극을 완화시키는 물질을 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 1) 단계에서 시험세포는 환경유해인자에 의한 세포 내 인자의 발현을 유도할 수 있는 세포라면 모두 사용이 가능하며, 바람직하게는 각질세포를 사용하나, 이에만 한정되지 않는다. 또한, 세포 내 인자의 발현을 조절하는 후보 물질들을 먼저 처리해야 피부세포에서 작용할 가능성이 있으므로, 바람직하게는 환경유해인자를 처리하기 30분 전에 먼저 처리하는 것이 좋다.
또한 상기 2) 단계에서 발현이 유도되는 환경유해인자에 의한 세포 내 인자 는 세포에 자극을 주는 IL-6 및 IL-8 뿐만 아니라, 자극을 완화시키는 GSTT1, NQ01 및 hBD3을 들 수 있으나, 이에만 한정되지 않는다.
이 때, 환경유해인자의 처리량은 25~50㎍/㎖의 농도 범위가 바람직하다.
또한 상기 3) 단계에서 환경유해인자에 의한 세포 내 인자의 발현 정도는 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 통해 측정하여 확인할 수 있다.
본 발명에서는 상기와 같은 방법들을 통하여 고련피, 관동화 추출물이 피부 자극 인자의 발현을 억제시키고, 피부 유해영향을 억제하는 인자를 발현시킴을 발견하였으나, 이에만 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 환경유해인자에 의한 피부 자극을 완화시키기 위하여 고련피 및 관동화 추출물 중 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물을 제공한다.
고련피는 멀구슬나무과의 멀구슬나무(Melia azedarach L. var. japonica Makino)의 수피 또는 근피를 말하며, 회충, 요충을 제거하고 풍진(風疹)과 개선(疥癬)을 치료한다. 피부습진에도 활용하며 이뇨와 해열작용이 있다. 약리작용으로 촌충구제약 및 회중 등의 장내기생충제거, 트리코모나스질염에 효과가 있음이 보고되었다. 생김새는 구부러진 반관상 또는 관상으로 바깥면은 회갈색이고 세로로 길게 찢어진 무늬와 가로로 된 피목이 있으며, 코르크층을 벗긴 것은 적갈색이다. 꺾은 면은 황백색으로 섬유성이며 질은 단단하나 꺾이기 쉽다. 이 약은 피목이 많은 어 린 나무껍질이 좋다. 다른 이름으로 고련근피, 련피, 련근목피, 금령자(金鈴子) 등이 있다.
관동화(款冬花)는 국화과의 관동(Tussilago farfara L.)의 꽃봉오리를 말하며, 윤폐작용이 있어 진해, 거담, 가래 및 폐결핵, 폐농양에 사용하며 외감성 해수, 천식, 상기도감염증에 사용한다. 약리작용은 호흡기 분비물 증가로 진해작용, 호흡흥분과 광조불안, 혈관수축작용, 소아의 급성기관지염, 기관지천식, 인후통에 효과가 있다고 보고되었다. 생김새는 꽃봉오리가 꽃대 끝부분에 달려 있으며 불규칙한 막대 모양이다. 꽃대에는 엷은 자색의 비늘 모양의 잎이 붙어 있다. 이 비늘잎은 넓은 난형이고 끝이 뾰족하며 약 20 매의 포편으로 이루어져 삼각형과 같은 모양을 이루고 있다. 내면은 백색의 솜털이 있고 설상화와 통상화가 들어 있고, 꽃대를 절단하면 백색의 실 모양의 솜털이 있다. 이 약은 모양이 붓과 같고 기부가 회자색이나 청록색으로 꽃대가 짧은 것이어야 한다. 관동화는 관동(款冬), 과동(顆凍), 관동(款凍), 토해, 동화(冬花), 저동, 찬동(鑽凍), 탁오, 호수(虎須)라고도 한다.
본 발명에서 사용되는 고련피 또는 관동화 추출물은 추출방법이 특별히 한정되지는 않으며, 물 또는 유기용매로 추출물을 수득할 수 있다. 본 발명에서 사용하는 유기용매는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트 및 클로로포름으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으며, 또는 이들 유기용매와 물과의 혼합용매를 사용할 수도 있다. 본 발명에서는 한국식물추출물은행에서 구입한 것을 사용하였다.
상기 방법으로 제조된 고련피 또는 관동화 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 1~30중량%의 양으로 함유된다.
본 발명에 의한 피부 외용제 조성물은 그 제형에 특별히 한정되지는 않으며, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 바디세정제, 염모제, 헤어토닉, 모발영양화장수, 헤어에센스, 헤어세럼, 스칼프트리트먼트, 헤어트리트먼트, 헤어컨디셔너, 헤어샴푸, 헤어로션, 치약, 구강청정제, 정발제, 양모제, 로션, 연고, 젤, 크림, 패취 또는 분무제 등으로 제형화될 수 있다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 하지만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있다.
[실시예 1] 사람 각질 세포에서 꽃가루, 집먼지 진드기 또는 황사에 의한 IL-6, IL-8 유전자의 발현 변화
사람정상각질피부세포(Human epidermal neonatal keratinocyte cells)는 상용적으로 확보되어 권장하는 방법으로, 론자사(Lonza, Inc. 미국 메릴랜드주 워커스빌(Walkersville) 소재)에서 구입하여 계대배양한 후 CO2 배양기(CO2 incubator) 에서 37℃, 5% CO2 조건하에서 세포를 배양하였다. 세포 배양액은 론자사의 지침서에 따라 배양하였다. 500ml의 KBM-2(Clonetics CC-3103) 배지에 KGM-2 불렛 키트(Bullet kit: BPE(Bovine pituitary extract) 2ml, hEGF(human epidermal growth factor) 0.5 ml, 인슐린(Insulin) 0.5 ml, 하이드로코티손(Hydrocortisone) 0.5ml, 트랜스페린(Transferrin) 0.5 ml, 에피네프린(Epinephrine) 0.5 ml, 젠타마이신 설페이트+암포페리신-B(Gentamycin Suflate + Amphofericin-B: GA-1000) 0.5 ml을 첨가하여 사용하였다.
사람 각질세포를 배양한 무처리군(control)과 실험군의 경우 사람 각질세포 배양액에 꽃가루, 집먼지 진드기 또는 황사시료를 첨가하여, 24시간 세포를 배양하였다. 꽃가루, 집먼지 진드기는 COSMO BIO社에서 구입하였고, 황사시료는 황사기간에 경기도 용인에 위치한 태평양기술연구원 옥상에서 포집하였다. 꽃가루, 집먼지 진드기 또는 황사를 각각 25㎍/㎖ 씩 처리하고 24시간 후, 10ml의 인산염 완충액(Phosphate Buffered Saline, PBS)으로 세포를 두 번 세척하고, 트라이졸(Trizol reagent; 인비트로젠(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스배드(Carlsbad) 소재)을 이용하여 세포 내의 전체 RNA (total RNA)를 분리하였다. 분리된 RNA를 키아젠사(Qiagen, 미국 캘리포니아주 발렌시아(Valencia) 소재)의 RNA 키트(Qiagen RNeasy kit)를 사용하여, 한번 더 정제한 후, 애질런트사(Agilent Technologies, 미국 캘리포니아주 산타 클라라(Santa Clara) 소재)의 바이오어낼라이저 2100 모델 기기(Agilent 2100 BioAnalyzer)를 이용하여, RNA의 질(quality)을 확인하였다. 인 비트로젠사의 역전사키트(Superscript Reverse Transcriptase (RT) II kit)를 이용하여 상기 분리된 RNA로부터 cDNA를 합성하였고, 이를 실시간역전사중합효소연쇄반응(real time-reverse transcription polymerase chain reaction, Q-RT-PCR)으로 정량적으로 분석하였다. IL-6(Hs99999032_m1), IL-8(Hs00174103_m1)의 발현 패턴 변화는 어플라이드 바이오시스템사(AppliedBiosystems, 미국 캘리포니아주 포스터시티(FosterCity) 소재)의 택맨 유전자발현시스템 (TaqMan®geneexpressionassaykit)을 이용하여 평가하였으며, 그 결과를 도 1a 및 1b에 도시하였다.
도 1a 및 1b에서 볼 수 있는 바와 같이, 사람정상각질피부세포에서 꽃가루, 집먼지 진드기 또는 황사가 IL-6, IL-8 유전자의 발현을 확연히 증가시킴을 알 수 있다[A: 무처리군, B: 꽃가루(25㎍/㎖) 처리군, C: 집먼지 진드기(25㎍/㎖) 처리군, D: 황사(25㎍/㎖) 처리군].
[실시예 2] 고련피 또는 관동화 처리시 사람 각질 세포에서 꽃가루, 집먼지 진드기, 황사에 의한 전염증인자 발현 억제 확인
사람정상각질피부세포(Human epidermal neonatal keratinocyte cells)는 상용적으로 확보되어 권장하는 방법으로, 론자사에서 구입하여 계대배양한 후 CO2 배양기(CO2 incubator)에서 37℃, 5% CO2 조건하에서 세포를 배양하였다. 세포 배양액은 론자사의 지침서에 따라 배양하였다. 500ml의 KBM-2(Clonetics CC-3103) 배지에 KGM-2 불렛 키트(Bullet kit: BPE(Bovine pituitary extract) 2ml, hEGF(human epidermal growth factor) 0.5 ml, 인슐린(Insulin) 0.5 ml, 하이드로코티손(Hydrocortisone) 0.5ml, 트랜스페린(Transferrin) 0.5 ml, 에피네프린(Epinephrine) 0.5 ml, 젠타마이신 설페이트+암포페리신-B(Gentamycin Suflate + Amphofericin-B: GA-1000) 0.5 ml을 첨가하여 사용하였다.
사람 각질세포를 배양한 무처리군(control)과 실험군의 경우 사람 각질세포 배양액에, 고련피 또는 관동화 추출물(한국식물추출물은행에서 구입) 처리 실험군의 경우 10ppm의 고련피 또는 관동화 추출물을 30분 전처리 후 꽃가루, 집먼지 진드기 또는 황사시료 25μg/ml을 첨가하여 24시간 세포와 함께 배양하였다. 물질 처리 24시간 후, 10ml의 인산염 완충액으로 세포를 두 번 세척하고, 트라이졸(인비트로젠사)을 이용하여 세포 내의 전체 RNA(total RNA)를 분리하였다. 분리된 RNA를 키아젠사의 RNA 키트를 사용하여, 한번 더 정제한 후, 애질런트사의 바이오어낼라이저 2100 모델 기기를 이용하여, RNA의 질(quality)을 확인하였다. 인비트로젠사의 역전사키트(Superscript Reverse Transcriptase (RT) II kit)를 이용하여 상기 분리된 RNA로부터 cDNA를 합성하였고, 이를 실시간역전사중합효소연쇄반응(real time-reverse transcription polymerase chain reaction, Q-RT-PCR)으로 정량적으로 분석하였다. IL-6(Hs99999032_m1), IL-8(Hs00174103_m1)의 발현 패턴 변화는 어플라이드 바이오시스템사의 택맨 유전자발현시스템 (TaqMan®geneexpressionassaykit)을 이용하여 평가하였으며, 그 결과를 도 2a 내지 2c에 도시하였다.
도 2a에서 볼 수 있는 바와 같이, 사람정상각질피부세포에서 꽃가루가 증가시킨 전염증인자이며 건선의 발병과 진행에 중요한 IL-6의 유전자 발현을 고련피가 억제시킴을 알 수 있다[A: 무처리군, B: 꽃가루(25㎍/㎖) 처리군, C: 고련피(10ppm) 처리군, D: 꽃가루(25㎍/㎖) + 고련피(10ppm) 처리군].
또한, 도 2b 및 2c에서 볼 수 있는 바와 같이 사람정상각질피부세포에서 황사가 증가시킨 전염증인자이며 건선의 발병과 진행에 중요한 IL-6와 IL-8의 유전자 발현을 고련피 또는 관동화가 억제시킴을 알 수 있다[A: 무처리군, B: 황사(25㎍/㎖) 처리군, C: 고련피(10ppm) 처리군, D: 황사(25㎍/㎖) + 고련피(10ppm) 처리군, E: 관동화(10ppm) 처리군, F: 황사(25㎍/㎖) + 관동화(10ppm) 처리군].
따라서, 본 실시예의 방법으로 꽃가루, 황사 등에 의한 전염증인자의 생성과 건선의 발병과 진행을 억제시키는 물질을 용이하게 스크리닝할 수 있음을 알 수 있다.
[실시예 3] 고련피 처리시 독소해독 및 배출인자, 자연면역인자인 피부항균펩타이드의 유전자 발현 증가 확인
사람정상각질피부세포(Human epidermal neonatal keratinocyte cells)는 상용적으로 확보되어 권장하는 방법으로, 론자사에서 구입하여 계대배양한 후 CO2 배양기(CO2 incubator)에서, 37℃, 5% CO2 조건하에서 세포를 배양하였다. 세포 배양액은 론자사의 지침서에 따라 배양하였다. 500ml의 KBM-2(Clonetics CC-3103) 배지에 KGM-2 불렛 키트(Bullet kit: BPE(Bovine pituitary extract) 2ml, hEGF(human epidermal growth factor) 0.5 ml, 인슐린(Insulin) 0.5 ml, 하이드로코티손(Hydrocortisone) 0.5ml, 트랜스페린(Transferrin) 0.5 ml, 에피네프린(Epinephrine) 0.5 ml, 젠타마이신 설페이트+암포페리신-B(Gentamycin Suflate + Amphofericin-B: GA-1000) 0.5 ml을 첨가하여 사용하였다.
사람 각질세포를 배양한 무처리군(control)과 실험군의 경우 사람 각질세포 배양액에, 고련피 추출물 처리 실험군의 경우 10ppm의 고련피 추출물(한국식물추출물은행에서 구입)을 첨가하여 24시간 세포와 함께 배양하였다. 고련피 추출물 처리 24시간 후, 10ml의 인산염 완충액으로 세포를 두 번 세척하고, 트라이졸(인비트로젠사)을 이용하여 세포 내의 전체 RNA(total RNA)를 분리하였다. 분리된 RNA를 키아젠사의 RNA 키트를 사용하여, 한번 더 정제한 후, 애질런트사의 바이오어낼라이저 2100 모델 기기를 이용하여, RNA의 질(quality)을 확인하였다. 인비트로젠사의 역전사키트(Superscript Reverse Transcriptase (RT) II kit)를 이용하여 상기 분리된 RNA로부터 cDNA를 합성하였고, 이를 실시간역전사중합효소연쇄반응(real time-reverse transcription polymerase chain reaction, Q-RT-PCR)으로 정량적으로 분석하였다. GSTT1(Hs00184475_m1), NQO1(Hs01045994_m1), hBD3(hs00218678_m1)의 발현 패턴 변화는 어플라이드 바이오시스템사의 택맨 유전자발현시스템(TaqMan®geneexpressionassaykit)을 이용하여 평가하였으며, 그 결과를 도 3에 도시하였다.
도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 고련피 추출물이 사람정상각질피부세포에서 독소를 배출하는 효소인 GSTT1, 독성물질을 해독하는 NQO1, 및 자연면역인자인 피부항균펩타이드 hBD3의 유전자 발현양을 증가시킴을 확인하였다.
따라서, 고련피가 독소해독, 배출 및 자연면역인자의 발현 또한 증가시키는 효과가 있음을 알 수 있다.
[실시예 4] 고련피와 관동화 혼합 처리시 독소해독인자와 자연면역인자인 피부항균펩타이드의 유전자 발현 증가 확인
사람정상각질피부세포(Human epidermal neonatal keratinocyte cells)는 상용적으로 확보되어 권장하는 방법으로, 론자사에서 구입하여 계대배양한 후 CO2 배양기(CO2 incubator)에서, 37℃, 5% CO2 조건하에서 세포를 배양하였다. 세포 배양액은 론자사의 지침서에 따라 배양하였다. 500ml의 KBM-2(Clonetics CC-3103) 배지에 KGM-2 불렛 키트(Bullet kit: BPE(Bovine pituitary extract) 2ml, hEGF(human epidermal growth factor) 0.5 ml, 인슐린(Insulin) 0.5 ml, 하이드로코티손(Hydrocortisone) 0.5ml, 트랜스페린(Transferrin) 0.5 ml, 에피네프린(Epinephrine) 0.5 ml, 젠타마이신 설페이트+암포페리신-B(Gentamycin Suflate + Amphofericin-B: GA-1000) 0.5 ml을 첨가하여 사용하였다.
사람 각질세포를 배양한 무처리군(control)과 실험군의 경우 사람 각질세포 배양액에, 고련피 추출물 처리 실험군의 경우 10ppm의 고련피 추출물(한국식물추출물은행에서 구입), 관동화 추출물 처리 실험군의 경우 10ppm의 관동화 추출물(한국 식물추출물은행에서 구입), 고련피 및 관동화 추출물 동시 처리 실험군의 경우 각각 10ppm의 고련피 및 관동화 추출물을 동량으로 첨가하여 24시간 세포와 함께 배양하였다. 물질 처리 24시간 후, 10ml의 인산염 완충액으로 세포를 두 번 세척하고, 트라이졸(인비트로젠사)을 이용하여 세포 내의 전체 RNA(total RNA)를 분리하였다. 분리된 RNA를 키아젠사의 RNA 키트를 사용하여, 한번 더 정제한 후, 애질런트사의 바이오어낼라이저 2100 모델 기기를 이용하여, RNA의 질(quality)을 확인하였다. 인비트로젠사의 역전사키트(Superscript Reverse Transcriptase (RT) II kit)를 이용하여 상기 분리된 RNA로부터 cDNA를 합성하였고, 이를 실시간역전사중합효소연쇄반응(real time-reverse transcription polymerase chain reaction, Q-RT-PCR)으로 정량적으로 분석하였다. NQO1(Hs01045994_m1), hBD3(hs00218678_m1)의 발현 패턴 변화는 어플라이드 바이오시스템사의 택맨 유전자발현시스템(TaqMan®geneexpressionassaykit)을 이용하여 평가하였으며, 그 결과를 도 4a 및 4b에 도시하였다.
도 4a 및 4b 에서 볼 수 있는 바와 같이, 사람정상각질피부세포에서 독성물질을 해독하는 NQO1, 자연면역인자인 피부항균펩타이드 hBD3의 유전자 발현양이 고련피 추출물, 관동화 추출물을 각각 처리할 경우에도 증가하지만, 고련피와 관동화 추출물을 함께 처리하면, 더욱 증가함을 확인할 수 있다.
따라서, 이를 통해 독소해독인자와 자연면역인자의 발현이 고련피와 관동화 추출물을 동시에 처리하면 상승효과로 인하여 더욱 증가함을 알 수 있다.
도 1a 및 1b는 사람정상각질피부세포에서 집먼지 진드기, 꽃가루 및 황사에 의한 IL-6, IL-8 단백질의 발현을 확인한 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 분석 결과이다.
도 2a 내지 2b는 사람정상각질피부세포에서 꽃가루, 황사에 의해 발현되는 유해인자의 발현을 억제시키는 후보 물질 고련피, 관동화를 처리하여 꽃가루, 황사에 의한 염증유발인자인 IL-6, IL-8 단백질의 발현 억제 정도를 확인한 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 분석 결과이다.
도 3은 사람정상각질피부세포에서 고련피에 의한 독소해독 및 배출인자인 GSTT1, NQO1, hBD3의 발현 증가 정도를 확인한 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 분석 결과이다.
도 4a 및 4b는 사람정상각질피부세포에서 고련피와 관동화의 상승효과에 의한 독소해독 및 배출인자인 NQO1, hBD3의 발현 증가 정도를 확인한 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 분석 결과이다.
Claims (14)
1) 시험세포에 세포 내 인자의 발현을 조절하는 후보 물질들을 처리하는 단계;
2) 시험세포에 환경유해인자를 처리하여 환경유해인자에 의한 세포 내 인자의 과발현을 유도하는 단계; 및
3) 상기 2) 단계의 세포에서 환경유해인자에 의한 세포 내 인자의 발현 정도를 측정하는 단계;
를 포함하는, 환경유해인자에 의한 피부 자극을 완화시키는 물질의 스크리닝 방법.
제 1항에 있어서, 상기 1) 단계에서 시험세포는 각질세포임을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 1항에 있어서, 상기 2) 단계에서 환경유해인자는 꽃가루, 집먼지 진드기 또는 황사임을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 1항에 있어서, 상기 2) 단계에서 환경유해인자의 처리량은 25~50㎍/㎖ 농도 범위임을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 1항에 있어서, 상기 과발현이 유도되는 세포 내 인자는 인터루킨6, 인터루킨8, GSTT1, NQ01 또는 hBD3임을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 1항에 있어서, 상기 3) 단계에서 환경유해인자에 의한 피부 자극 인자의 발현정도는 역전사중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 통하여 측정된 것임을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 의한 방법으로 스크리닝된 물질로서, 환경유해인자에 의한 피부 자극을 완화시키는 물질.
제 7항에 있어서, 상기 스크리닝된 물질은 고련피 또는 관동화 추출물임을 특징으로 하는 환경유해인자에 의한 피부 자극을 완화시키는 물질.
고련피 및 관동화 추출물 중 1종 이상을 유효성분으로 함유하여 피부 유해영향을 완화시키는 피부 외용제 조성물.
제 9항에 있어서, 상기 피부 유해영향은 꽃가루, 집먼지 진드기 또는 황사로 인한 것임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
제 9항에 있어서, 상기 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 1~30중량%의 양으 로 함유됨을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
제 9항에 있어서, 상기 조성물은 IL-6 또는 IL-8의 발현을 억제함을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
제 9항에 있어서, 상기 조성물은 GST, NQO1 또는 hBD3의 발현을 증가시킴을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
제 9항에 있어서, 상기 조성물은 피부의 정상각질세포(Keratinocyte)의 유해영향을 완화하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
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