KR20100051807A - 이온 교환을 포함하는 2ｓ 카놀라 단백질의 제조방법 - Google Patents
이온 교환을 포함하는 2ｓ 카놀라 단백질의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
2S 카놀라 단백질을 양이온-교환 매체에 결합시킴으로써 2S 카놀라 단백질을 포획하고, 반면 다른 단백질과 불순물은 세척 제거되도록 하는 절차에 의해, 7S 및 12S 카놀라 단백질이 실질적으로 없는, 실질적으로 순수한 2S 카놀라 단백질을 얻는다. 이후 양이온-교환 매체를 적절한 염 고농도에서 식염수에 노출시킴으로써 2S 단백질을 양이온-교환 매체로부터 방출시킨다.
Description
본발명은 이온 교환을 사용하는 것을 포함하는 방법에 의해 실질적으로 순수한 형태로 카놀라 2S 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
2002년 5월 5일에 출원된 미국 특허출원 번호 제 10/137,391호(미국 특허출원 공개 번호 제 20030125526A1호), 2004년 6월 9일에 출원된 제 10/476,230호(미국 특허출원 공개 번호 제 20040254353A1호) 및 대응하는 PCT 공개 번호 제 WO 02/089597호로서, 모두 본 출원인에게 양도되었고, 본명세서에 참고로서 포함된 이들 문헌으로부터, 건조 중량 기준으로 적어도 100 중량%(Nx6.25)의 카놀라 단백질을 생성할 수 있다. 이 방법은 염용액을 사용하여 카놀라 오일 시드밀(seed meal)을 추출하는 단계, 얻어진 수성 단백질 용액을 잔류 오일 시드밀로부터 분리하는 단계, 선택막 기술을 사용하여 이온강도를 실질적으로 일정하게 유지하면서 상기 수성 용액의 단백질 농도를 적어도 약 200 g/L까지 증가시키는 단계, 얻어진 농축 단백질 용액을 냉수 내로 희석시켜 단백질 미셀을 형성하는 단계, 이 단백질 미셀을 침강시켜, 무정형, 점성, 젤라틴성, 글루텐-유사 단백질 미셀 덩어리(PMM)을 형성하는 단계 및 상청액으로부터 킬달 질소(Nx6.25)에 의해 결정되는 적어도 약 100 중량%의 단백질 함량을 갖는 단백질 미셀 덩어리를 회수하는 단계를 포함한다. 회수된 PMM은 건조될 수 있다.
상기한 방법의 한 구체예에서, PMM 침강 단계로부터의 상청액을 처리하여, 습윤 PMM과 상청액으로부터 건조 단백질을 포함하는 단백질 분리체를 회수한다. 이 방법은 먼저 한외여과막을 사용하여 상청액을 농축하고, 농축된 상청액을 습윤 PMM과 혼합하고 이 혼합물을 건조하는 것에 의해 수행될 수 있다. 얻어진 카놀라 단백질 분리체는 적어도 약 90 중량% (Nx6.25), 바람직하게는 적어도 약 100 중량% (Nx6.25)의 순도를 갖는다.
상기한 방법의 또다른 구체예에서, PMM 침강 단계로부터의 상청액을 처리하여, 상청액으로부터 단백질을 회수한다. 이 방법은 먼저 한외여과막을 사용하여 상청액을 농축하고, 농축물을 건조하는 것에 의해 수행될 수 있다. 얻어진 카놀라 단백질 분리체는 적어도 약 90 중량% (Nx6.25), 바람직하게는 적어도 약 100 중량% (Nx6.25)의 순도를 갖는다.
상기한 미국 특허 출원에서 기술된 방법은 본질적으로 배치(batch) 공정이다. 2002년 11월 19일에 출원되어 계류 중인 미국 특허 출원 제 10/298,678호(미국 특허출원 공개 번호 제 20040039174A1호) 및 대응하는 공개 국제 출원 번호 제 WO 03/043439호로서, 모두 본 출원인에게 양도되었고, 본명세서에 참고로서 포함된 이들 문헌에는, 카놀라 단백질 분리체를 제조하는 연속 공정이 기재되어 있다. 이에 따르면, 카놀라 오일 시드밀을 염용액과 연속적으로 혼합하고, 이 혼합물을 관을 통해 운반하면서 카놀라 오일 시드밀로부터 단백질을 추출하여 수성 단백질 용액을 형성하고, 수성 단백질 용액을 잔류 카놀라 오일 시드밀로부터 연속적으로 분리하고, 수성 단백질 용액을 냉수와 연속적으로 혼합하여 단백질 미셀의 형성을 유발하고, 이 단백질 미셀을 연속적으로 방치하면서 상청액을 연속적으로 오버플로우(overflow)시켜 소정량의 PMM을 침강 용기 내에서 축적시킨다. 침강 용기로부터 PMM을 제거하고 건조시킬 수 있다. PMM은 킬달 질소(Nx6.25)에 의해 결정되는 적어도 약 90 중량% (Nx6.25), 바람직하게는 적어도 약 100 중량% (Nx6.25)의 단백질 함량을 갖는다.
상기한 미국 특허 출원 번호 제 10/137,391호 및 10/471,230호에 기술된 바와 같이, 오버플로우된 상청액을 처리하여 이 상청액으로부터 카놀라 단백질 분리체를 회수한다.
카놀라 시드는 약 10 내지 약 30 중량% 단백질을 함유한다고 공지되어 있고, 몇가지 서로 다른 단백질 성분이 확인되었다. 이들 단백질은 서로 다른 침강 계수(S)에 의해 구별된다. 이들 공지 및 확인된 단백질은 크루시페린(cruciferin)으로서 공지된 12S 글로불린, 7S 글루불린 및, 나핀(napin)으로서 공지된 2S 알부민을 포함한다.
카놀라는 유채(rapeseed) 또는 오일시드 평지(oilseed rape)라고도 불리운다.
2003년 8월 25일에 출원되어 계류 중인 미국 특허 출원 제 10/413,371호(미국 특허출원 공개 번호 제 20040034204A1호) 및 2003년 4월 15일에 출원된 미국 특허 출원 제 10/510,766호 및 대응하는 공개 국제 출원 번호 제 WO 03/08876호로서, 모두 본 출원인에게 양도되었고, 본명세서에 참고로서 포함된 이들 문헌에는, 카놀라 단백질 분리체의 조성물 및 상청액-유리 카놀라 단백질 분리체의 조성물이 기재되어 있다. 상청액-유래 카놀라 단백질 분리체는 소량의 7S 단백질과 함께 주로 2S 단백질 및 흔적량의 12S 단백질로 구성된다. 2S 단백질은 저분자량 알부민이다. PMM 생성물은 비교적 소량의 2S 단백질과 12S 단백질과 함께 주로 7S 단백질로 구성된다. 7S와 12S 단백질은 고분자량 글루불린이고, 7S 분자는 12S 단백질의 1/2 분자이다.
상기 문헌에 기재된 바와 같이, 상청액-유래 카놀라 단백질 분리체는
약 60 내지 약 95 중량%의 2S 단백질,
약 5 내지 약 40 중량%의 7S 단백질, 및
0 내지 약 5 중량%의 12S 단백질, 바람직하게는
약 70 내지 약 95 중량%의 2S 단백질,
약 5 내지 약 30 중량%의 7S 단백질, 및
0 내지 약 2 중량%의 12S 단백질:
의 단백질 프로필을 나타낸다.
PMM 카놀라 단백질 분리체는
약 60 내지 약 98 중량%의 7S 단백질,
약 1 내지 약 15 중량%의 12S 단백질, 및
0 내지 약 25 중량%의 2S 단백질, 바람직하게는
약 88 내지 약 98 중량%의 7S 단백질,
약 1 내지 약 10 중량%의 12S 단백질, 및
0 내지 약 6 중량%의 2S 단백질:
의 단백질 프로필을 나타낸다.
주로 2S 단백질로 구성된 상청액-유래 카놀라 단백질 분리체는 주로 7S 단백질로 구성된 PMM-유래 카놀라 단백질 분리체보다 특정 응용용도에서 우수한 기능성을 나타낸다. 선행 출원에서 기술된 방법에서, 상청액-유래 카놀라 단백질 분리체를 생성하기 위해서는, PMM 생성 단계와, 효과적으로 카놀라 단백질을 분획화하기 위한 상청액의 제공 단계를 거칠 필요가 있었다.
2005년 7월 21일에 출원되어 계류 중인 미국 특허 출원 제 11/038,086호(미국 특허출원 공개 번호 제 20050181112A1호)로서 모두 본 출원인에게 양도되었고, 본명세서에 참고로서 포함된 이 문헌에는(WO2005/067729), 막 처리의 전후에, PMM 침전으로부터의 상청액을 열처리하여 7S 단백질을 침전시키고 2S 단백질이 풍부한 단백질을 남기는 공정이 기재되어 있다. 남은 용액을 분무 건조하여 건조 형태로 2S 단백질을 회수할 수 있다.
최소 비율의 7S와 12S 단백질을 갖는 2S 단백질은 비처리된 2S 단백질(산성 pH 값을 포함)보다 용해도가 증가되는 것을 나타내었고, 수성 용액 내 및 소프트 음료와 스포츠 음료에서 투명도 향상을 제공할 수 있어서, 투명한 단백질 강화 음료를 제공한다.
본발명은 이온 교환을 포함하는 택일적 공정을 사용하여 7S와 12S 카놀라 단백질이 실질적으로 없는 실질적으로 순수한 2S 카놀라 단백질을 제조한다.
이온 교환 크로마토그래피에서, 대전된 이온-교환 매체는 동일하게 대전되거나 대전되지 않는 재료와는 결합하지 않은 채 반대로 대전된 분자와 결합하는데 사용된다. 이로 인해, 이온 교환 크로마토그래피는 단백질과 같은 대전된 분자를 정제하기 위한 유용한 도구가 된다. 카놀라 단백질의 두 가지 주요 부류는 서로 상당히 다른 등전점을 갖는다. 7S/12S 글로불린은 약 6 내지 7 범위의 등전점을 갖고, 반면 2S 알부민은 그 값이 대략 11이다. 이 차이를 이용하여 본발명에서 단백질을 이온 교환 크로마토그래피에 의해 서로 분리한다.
2S 단백질을 양이온-교환 매체에 결합시킴으로써 2S 단백질을 포획하고, 반면 다른 단백질과 불순물은 세척 제거되도록 한다. 이후 양이온-교환 매체를 적절한 염 고농도에서 식염수에 노출시킴으로써 2S 단백질을 양이온-교환 매체로부터 방출시킨다.
본발명의 한 양상에 따르면, 카놀라 오일 시드밀로부터의 카놀라 단백질을 용해하여 카놀라 단백질 용액을 형성하는 단계, 이 카놀라 단백질 용액을 잔류 카놀라 오일 시드밀로부터 분리하는 단계, 이 카놀라 단백질 용액을, 다른 카놀라 단백질에 우선하여 2S 카놀라 단백질이 양이온-교환 매체에 결합하는 조건 하에서 양이온-교환 매체와 접촉시키는 단계, 결합된 2S 카놀라 단백질을 비결합 카놀라 단백질과 불순물로부터 분리하는 단계, 및 이 결합된 2S 카놀라 단백질을 양이온-교환 매체로부터 분리하는 단계를 포함하는, 실질적으로 순수한 2S 카놀라 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
상기한 바와 같이, 카놀라 단백질 용액에 대하여 이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 우선적으로 2S 카놀라 단백질을 이온 교환 매체에 결합시키고, 이후 이온 교환 매체로부터 2S 카놀라 단백질을 실질적으로 순수한 형태로 회수한다.
이 공정은 어떠한 편리한 방법으로도 수행될 수 있다. 본발명의 한 바람직한 양상에서, 카놀라 단백질 수용액을, 두 부류의 단백질 모두 양(positive)으로 대전되는 약 5 내지 6의 pH에서 양이온-교환 매체와 접촉시킨다. 양으로 하전이 덜 된 7S/12S 카놀라 단백질뿐만 아니라 시나핀과 같은 불순물의 결합을 제한하기 위한 염 농도를 사용한다.
카놀라 오일 시드밀로부터의 추출에 의해 수성 카놀라 단백질 용액을 가장 편리하게 형성시킬 수 있다. 소정의 식염수 농도와 pH값을 갖는 수성 염용액을 사용하여 추출을 수행하여 2S 단백질이 양이온-교환 매체에 우선적으로 결합하는 것을 보장함에 있어서 효과적이다. 이 염용액은 일반적으로 약 0.25 내지 0.35 M NaCl 범위의 염농도를 가지고 수성 카놀라 단백질 용액의 pH는 약 내지 약 6의 범위 이내이다.
카놀라 오일 시드밀을 소정의 pH 범위 이외에서도 수행할 수 있고 이때 카놀라 단백질 용액의 pH는 필요한 경우 어떠한 편리한 산 또는 염기를 사용하여 약 5 내지 약 6의 pH 범위로 조정할 수 있다.
택일적으로, 낮은 염농도의 식염수 용액을 사용함으로써 카놀라 오일 시드밀로부터 단백질을 추출할 수 있고, 소정의 농도까지 부가적 염을 첨가한다. 그렇지만, 이온 교환에 필요한 농도에서 식염수로 추출을 수행하는 것이 바람직한데, 추출 용액은 형성 직후 2S 카놀라 단백질을 분리하기 위해 양이온-교환 매체에 직접 적용하기 위한 형태이기 때문이다. 따라서, 산화반응이 일어나거나 페놀류가 단백질에 결합할 시간이 거의 없다.
카놀라 단백질 추출 용액을, 수지 비드 또는 막 흡착제의 형태와 같은 어떠한 편리한 형태로 제공되는 양이온-교환 매체에 적용한다. 막 흡착제 내에서, 이온교환 기는 세공막에 결합한다. 수지-충전된 칼럼 대신 막을 사용하여 높은 유속을 사용할 수 있어서 처리속도가 더 빨라진다.
적절한 pH와 염 수준의 존재 하에서 카놀라 단백질 추출 용액을 양이온-교환 매체와 접촉시키면 양으로 하전이 덜 된 7S/12S 단백질에 우선하여 2S 단백질이 흡착되도록 한다. 카놀라 단백질 추출 용액으로부터 양이온-교환 매체를 분리한 후, 수성 카놀라 단백질 식염수 용액보다 더 높은 염농도, 예를 들면 약 0.55 내지 약 0.70 M NaCl을 갖는 수성 식염수 용액과 접촉시켜, 양이온-교환 매체로부터 2S 단백질을 제거할 수 있다.
2S 단백질의 용리 용액은 높은 염농도를 가지고, 단백질의 건조 이전에 투석여과(diafiltration)와 같은 어떠한 편리한 방법으로 탈염된다. 본 공정은 실질적으로 7S/12S 단백질이 없고, 건조 중량 기준으로 적어도 약 100 중량%(Nx6.25)의 단백질 함량을 갖는 고순도 2S 카놀라 단백질 분리체를 제조한다.
카놀라 7S/12S 단백질을 2S 단백질을 분리하기 위해 등전 또는 열 침전을 사용하는 형태와 비교하여, 카놀라 단백질 추출물을 이온 교환 매체와 접촉 후 비변성된 형태의 카놀라 7S/12S 단백질을 회수할 수 있다.
실시예
실시예 1
본 실시예는 양이온 교환 칼럼을 사용하여 실질적으로 순수한 2S 카놀라 단백질의 제조를 예시한다.
(a) 단백질 추출:
22.5 g 밀(meal) 당 대표적으로 150 ml 식염수를 사용하여 카놀라 오일 시드밀의 일련의 15% w/v 추출을 수행하였다. 자기 교반 바를 사용하여 실온에서 30분간 샘플을 교반시켰다. 각각의 예시에서, 10,200g에서 10분간 원심분리에 의해 소비된 밀로부터 추출물을 분리시키고, 이후 25 μm 세공 크기 여과지와 0.45 μm 세공 크기 시린지 여과기를 사용하여 연속 여과하여 더욱 투명화시켰다. 투명화된 추출물의 단백질 함량을 LECO 분석(LECO FP 528 Nitrogen Determinator)을 사용하여 확인하고 단백질 프로필을 사이즈 배제(SEC) HPLC를 사용하여 확인하였다. 다양한 런(run)에서, 식염수 용액 내 염농도는 0.26 내지 0.35 M NaCl로서 다양하다.
추출물 염농도를 조정함으로써, 최초 정제된 추출물의 단백질 함량 및 프로필에 영향을 미쳤다(하기 표 1). 아래에서 보여지는 바와 같이, 높은 염농도는 단백질 수율과 2S 단백질의 추출의 면에서는 바람직하였지만, 분리에 대해서는 나쁜 영향을 미쳤다.
| NaCl 농도(M) | pH | 단백질 농도(%) | 2S로 인한 HPLC 단백질 피크 영역% |
| 0.26 | 5.60 | 2.62 | 결정되지 않음 |
| 0.29 | 5.67 | 2.71 | 결정되지 않음 |
| 0.30 | 5.61 | 결정되지 않음 | 36.9 |
| 0.35 | 5.61 | 2.82 | 37.4 |
(b) 크로마토그래피:
피크 수집이 가능하도록 하면서, GradiFrac LPLC 시스템(Pharmacia Biotech)을 사용하여 작동되는 SP Sepharose XL(20ml)를 사용하는 양이온 교환(CIEX) 크로마토그래피에 샘플을 걸었다. 각 런에서, 10 ml의 정제된 추출물을, 시스템 내 샘플 루프에 의해 칼럼에 적용시켰다. 사용된 식염수 농도에서, 2S 단백질은 칼럼에 결합하였지만, 7S와 12S 카놀라 단백질과 기타 불순물은 칼럼을 통과하였다. 보이드(void) 물질을 포획하고 이후 추출물보다 높은 염농도의 식염수를 칼럼에 적용하여 결합된 2S 단백질을 방출시켰다. 단백질을 가장 잘 분리하고 결합된 물질의 방출을 보장하기 위해, 런을 진행하면서 사용된 염 농도를 조정하였다. 사용된 샘플 GradiFrac 프로그램을 다음 표 2에 나타내었다:
| 부피(ml) | 완충액 내 NaCl 농도(M) | 완충액 유속 (ml/min) | 수집된 최대 부피 분획(ml) | 기능 |
| 0 19.9 | 추출물 추출물 | 5 5 | 0 0 | 칼럼 평형 |
| 20 20 50 119.9 | 샘플 주입 밸브 개방 | a) 샘플 적용 b) 2S 결합 c) 7S/12S 용리 d) 불순물 용리 | ||
| 추출물 | 5 | 25 | ||
| 샘플 주입 밸브 폐쇄 | ||||
| 추출물 | 5 | 25 | ||
| 120 194.9 | 용리액 용리액 | 5 5 | 25 25 | 2S 용리액 |
| 195 254.9 | 1.00 1.00 | 5 5 | 0 0 | 칼럼 청소 |
| 255 355 | 추출물 추출물 | 5 5 | 0 0 | 칼럼 평형 |
주석: 이 방법이 개발됨에 따라 부분 부피에서의 일부 사소한 편차를 사용하였다.
주석: 모든 2S 단백질이 용리 단계에서 방출되었음을 일단 확인하면, 런(run) 사이에 1M NaCl을 사용한 칼럼 청소를 생략하였다.
각각의 날에, 모든 런으로부터의 용리 분획을 조합시키고 런 20 내지 26의 생성물을 제외하고 -60℃에서 동결시켰고, 런 20 내지 26의 생성물은 다음날 탈염용으로 냉장보관하였다. 다음의 표 3은 다양한 제조 런에서 추출과 용리에 사용되는 염 농도를 규정한다.
| 제조 런 | 추출물 내 NaCl 농도(M) | 2S 용리용 NaCl 농도(M) |
| 1 2 3 내지 8 9 내지 13 14 내지 26 | 0.30 0.30 0.35 0.29 0.26 | 0.55 0.60 0.65 0.65 0.65 |
2S 단백질의 추출/단백질 분리와 용리용으로 사용된 염의 농도는 제조 런이 진행됨에 따라 미세 조정되었다. 제 1 런에서, 사용된 염 농도는 0.30M/0.55M이었다. 보이드 재료를 겹치는 이중 피크로서 수집하였고, 제 1 피크는 거의 모든 7S/12S와 소량의 비결합 2S 단백질을 함유하는 것으로 확인되었고, 대부분의 불순물은 시나핀 부분을 제외하고 추출물 내에서 보였다. 이중 피크 중 두번째는 칼럼으로부터 약간 늦게 나왔는데, 상당량의 시나핀과 매우 소량의 단백질과 기타 불순물을 함유하는 것으로 확인되었다. 0.55M NaCl을 사용한 용리로 칼럼으로부터 모든 2S 단백질을 용리하지는 못했는데, 칼럼을 1M NaCl로 세정할 때 상당한 2S 단백질 피크가 얻어졌기 때문이다.
제 2 런에서, 2S 단백질을 더욱 잘 방출하기 위해 용리 염 수준을 0.60M까지 상승시켰다. 이번에는, 칼럼을 세정시 더 작은 2S 단백질 피크가 확인되었다. 제 3 런에서는, 용리 단계를 0.65M NaCl까지 상승시켰고, 이 수준은 칼럼 세정시 보이는 피크를 효과적으로 제거한 것으로 확인되었다. 제 3 시험에서, 두 개의 보이드(void) 피크를 서로 근접시킬 목적으로, 최초 염 수준을 0.35M NaCl로 상승시켰다. 이중 피크 사이의 분리가 감소하였지만, 여전히 이중 피크가 얻어졌다. 또한, 높은 염 농도에서 작업하여, 칼럼에 결합하지 않고 보이드 내에 발견되는 2S 단백질의 양을 증가시켰다.
이후, 최초 염 수준을 0.29M, 이후 0.26M로 감소시켜, 보이드로 손실되는 2S 단백질의 수준을 연속적으로 감소시켰다(하기 표 4). 이렇게 최초 염 수준을 감소시키면 칼럼에 7S/12S 단백질 또는 시나핀이 결합하는 것을 유발할 우려가 있었는데, 이는 2S 용리 단계를 복잡하게 만들기 때문에 매우 바람직하지 못하다. 그렇지만, 0.26M NaCl에서, 2S 단백질은 칼럼에 결합하는 유일한 종이었다.
| NaCl 농도(M) | 피크 면적 2S(개수) |
| 0.26 0.29 0.30 0.35 | 66769 115540 결정되지 않음 224545 |
(c) 용리된 2S 단백질의 탈염:
용리된 2S 단백질의 동결 샘플을 밤새 냉장고 내에 두어 녹였다. 다음날, 여전히 동결된 용기를 따뜻한 수욕 내에 두었고, 수욕 내에서 얼음 결정이 녹을 때까지만 샘플을 데웠다. 모든 녹은 샘플을 이후 25 μm 세공 크기 여과지를 통해 여과하고 하나의 큰 샘플 내로 모았다. 얻어진 2S 단백질 용액을 농축과 Vivaflow 5000 MWCO Hydrosart 한외여과막 단위 상에서의 투과여과에 의해 탈염시켰다. 수집한 2S 단백질 분획의 총부피는 대략 1500 ml이었다. 조합시킨 2S 단백질 용액을 25 내지 30 ml까지 농축시키고, 이후 300 ml의 물을 부가하여 투석여과시켰다. 샘플을 25 내지 30 ml까지 다시 농축시키고, 다시 300 ml의 물을 부가하고 이후 샘플을 다시 농축시켰다. 다음 표 5에 나타낸 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 대략 10 투석여과 부피의 두 단계로 효과적으로 탈염을 수행하였다.
| 2S 샘플 | 조건(mS) | pH | 단백질 농도(%) |
| 조합한 GradFrac 분획 DF1 수 부가 후 DF2 수 부가 후 최종 잔류물 | 49.6 5.68 0.943 결정되지 않음 | 5.83 5.28 4.92 결정되지 않음 | 0.31 결정되지 않음 결정되지 않음 5.84 |
잔류물을 이후 동결건조시켰다.
(d) 최종 생성물:
Minolta CR-310 Chroma Meter를 사용하여 최종 생성물의 건조 색상을 평가하고, 습윤 색상 분석용 용액을 또한 제조하였다. 단백질 분말(0.5g)을 물(10 ml)와 보텍스혼합기를 사용하여 혼합하였다. 샘플을 이후 7800g에서 10분간 원심분리하고(주로 공기를 제거하기 위해) 상청액의 단백질 함량을 LECO에 의해 결정하였다. 상청액의 분취량(8 ml)을 작은 비이커로 옮기고 충분한 물을 부가하여 단백질 함량을 5%로 만들었다. 이후 샘플의 사진을 찍고, 샘플의 분취량을 단백질 프로필 분석(SEC HPLC)용으로 사용하였다. 일분 샘플은 3.5% 단백질로 희석시키고 또다른 사진을 찍었다. 건조 분말의 단백질 함량을 LECO에 의해 시험하였지만 수분 함량 분석을 하기에 충분한 샘플이 얻어지지 않았다. 따라서, 단백질 함량은 습윤 중량 기준으로만 표시하였다.
총 1.63g의 최종 생성물을 이 실험에서 수집하였다. 습윤 기준 분말의 단백질 함량은 105.82%w/w(Nx6.25)이었다. 표준적으로 건조기준으로 표시하면 단백질 함량은 더욱 높다. 재-수화된 생성물의 크로마토그래피 결과, 280 nm에서 검출된 피크 영역의 96.1%가 2S로 인한 것이고, 피크 영역의 3.8%가 프로나핀으로 인한 것이다. 따라서, 피크 영역의 99.9%는 대상 단백질로 인한 것이다. 7S 또는 12S 단백질은 검출되지 않았다.
건조 생성물에 대한 색상 점수를 표 6에 나타낸다.
| 샘플 | L* | a* | b* |
| 2S | 83.05 | -2.61 | 15.49 |
수 내에 재수화된 생성물의 습윤 색상은 녹색 기운을 나타내었고 용액의 투명도는 우수하였다. 7S/12S 단백질이 전혀 없어서, 용액의 투명도는 대부분의 조건에서 상당히 안정적으로 남아있다고 생각된다.
생성물의 수율은 상당히 우수한 것으로 보였다. 분리 조건이 여러번 변경되고, 수지에 대한 불완전한 결합 및 불완전 용리로 인해, 특히 초기 런에서 2S 단백질 손실이 발생한다고 알려져 있어서 대표적인 수율을 계산하는 것이 어려웠다. 마지막 런까지, 모든 2S 단백질을 용리시켰지만 칼럼에 결합하지 않는 소량이 여전히 있었다. 상기한 바와 같이, 초기 염 함량을 감소시키는 것은 다른 종이 칼럼에 결합하는 것을 허용하지 않는다는 조건에서는 이 문제를 해결할 수 있다. 만약 1.63g 2S 단백질을 260 ml(26x10 ml 주사액)의 투명화 추출물로부터 생성하였다고 생각하면, 이것은 1000 L의 투명화 추출물로부터의 6.3 kg 2S로 외삽할 수 있다.
실시예 2
본실시예는 실질적으로 순수한 2S 카놀라 단백질을 제조하기 위해 양이온 교환막을 사용하는 것을 예시한다.
(a) 단백질 추출:
카놀라 오일 시드밀과 식염수를 조합시키고 샘플을 실온에서 자기 교반바를 사용하여 30분간 교반시킴으로써, 300 ml 0.3M NaCl을 사용하여 30g 카놀라 오일 시드밀의 10% w/v 추출을 수행하였다. 이후 10,200g에서 10분간 원심분리시켜 소모된 밀로부터 추출물을 분리하고 25 μm 세공크기 여과지와 1 μm와 0.45 μm 세공크기 필터 디스크를 사용하여 연속 여과에 의해 더욱 투명화시켰다. 추출물의 단백질 프로필을 SEC HPLC에 의해 결정하였다.
추출 용액에 대한 염 수준의 최적 초이스는 실시예 1에서 0.26 M NaCl인 것으로 확인되었다. 이 염 수준은 막 흡착제(데이터가 도시되지 않음)를 사용한 예비 실험에서 처음에 채용되었지만, 소량의 7S/12S 단백질과 일부 시나핀이 막에 결합되어 있는 것으로 확인되었다. 추출물 용액의 염 함량을 0.3 M NaCl로 증가시키는 것은 7S/12S 단백질 결합을 제한하였다. 0.3 M NaCl 추출물의 단백질 프로필은 7S/12S로 인한 단백질 피크 영역이 64.6%이고 2S로 인한 단백질 피크 영역이 35.4%이었다.
(b) 이온 교환:
서로 직렬로 연결된 두 개의 Sartobind S75(Satorius AG, Goettingen, Germany) 강산 양이온 홉착제 막 단위를 사용하여 이온 교환 분리를 수행하였다. 상기 막 단위를 통해 다양한 용액을 밀어내기 위해 연동 펌프를 사용하였다. 표 7에 샘플 분리 프로토콜을 나타낸다.
| 단계 | 용액 | 부피(ml) | 유속(ml/min) |
| 평형 샘플 로딩 막 헹굼 2S 용리 | 0.3 M NaCl 투명화된 추출물 0.3 M NaCl 0.67 M NaCl | 40 10 50 30 | 20 20 20 20 |
이틀 연속의 코스에 걸쳐 대략 32개 런을 완료시켰다. 각 날마다 모든 런으로부터의 용리된 2S 단백질 분획을 수집하고 탈염시까지 냉장시켰다. 보이드/헹굼 및 용리 분획의 단백질 프로필을 SEC HPLC에 의해 송달시켰다.
소량의 2S(단백질 피크 영역의 7.7%)는 아마도 시스템 과다부하로 인해, 보이드 분획으로 손실된 것으로 확인되었다. 생성 런의 첫날, 용리 완충액으로서 0.65M NaCl을 사용하였고, 마지막 날, 막 흡착제를 1M NaCl(40 ml)로 세정하였다. 1M NaCl 용리물을 사용한 막 세정은 어떠한 2S 단백질도 0.65M NaCl에 의해 용리되지 않았음을 나타내었다. 분리 런의 둘째 날, 용리 완충액으로서 0.67M NaCl을 사용하였다. 1M NaCl을 사용한 막 세정은 어떠한 2S 단백질도 방출하지 않아서, 0.67M NaCl이 결합된 모든 2S 단백질을 회수하는데 충분하였음을 나타내었다.
(c) 분리된 2S 단백질의 탈염:
용리된 2S 단백질을 Vivaflow 5000 MWCO Hydrosart 한외여과 막 단위 상에서 농축 및 투석여과에 의해 탈염시켰다. 모든 수집된 2S 단백질 분획의 부피는 대략 1000 ml였다. 이것을 25 내지 30 ml까지 농축하고, 다시 300 ml 물을 가해 투석여과하였다. 이 샘플을 다시 25 내지 30 ml까지 농축하고, 다시 400 ml 물을 가하고 샘플을 다시 재농축하였다. 두번째 투석여과 단계 후, 잔류물을 동결 건조하였다.
전도성 측정기를 사용하여 다양한 샘플의 전도성을 측정하였다. 투석여과의 목적은 샘플의 전도성을 1mS 이하로 감소시키는 것이다.
두 번의 투석여과 단계로 2S 단백질 샘플의 전도성을 효과적으로 감소시켰다(표 8). 한외여과 또는 투석여과 투과물 내에서 어떠한 단백질도 검출되지 않았다.
| 2S 샘플 | 전도성(mS) |
| 용리물 DF1 수 부가후 DF2 수 부가후 최종 잔류물 | 49.8 7.56 0.79 결정되지 않음 |
(d) 최종 생성물:
Minolta CR-310 Chroma Meter를 사용하여 최종 생성물의 건조 색상을 평가하고, 습윤 색상 분석용 용액을 또한 제조하였다. 단백질 분말(0.6g)을 물(10 ml)와 보텍스혼합기를 사용하여 혼합하였다. 샘플을 이후 7800g에서 10분간 원심분리하고 상청액의 단백질 함량을 LECO에 의해 결정하였다. 상청액의 분취량(8 ml)을 작은 비이커로 옮기고 충분한 물을 부가하여 단백질 함량을 5%로 만들었다. 이후 샘플의 사진을 찍고, 샘플의 분취량을 단백질 프로필 분석(SEC HPLC)용으로 사용하였다. 일분 샘플은 3.5% 단백질로 희석시키고 또다른 사진을 찍었다. 건조 분말의 단백질 함량을 LECO에 의해 시험하였지만 수분 함량 분석을 하기에 충분한 샘플이 얻어지지 않았고, 따라서, 단백질 함량은 습윤 중량 기준으로만 표시하였다.
총 1.54g의 최종 생성물을 이 실험에서 수집하였다. 습윤 기준 분말의 단백질 함량은 101.99%w/w(Nx6.25)이었다. 상기에서 언급된 바와 같이, 수분 함량 분석을 하기에 충분한 샘플이 얻어지지 않았고, 따라서, 단백질 함량은 습윤 중량 기준으로만 표시하였다. 재-수화된 생성물의 크로마토그래피 결과, 280 nm에서 검출된 피크 영역의 99.85%가 2S로 인한 것이었다. 7S 또는 12S 단백질은 검출되지 않았다.
막 흡착제 2S에 대해 결정된 건조 색상 점수를 표 9에 나타낸다.
| 샘플 | L* | a* | b* |
| 2S | 84.21 | -2.40 | 15.09 |
수 내에 재수화된 생성물의 습윤 색상 및 투명도는 칼럼 크로마토그래피에 의해 생성된 2S 단백질을 연상시켰다. 7S/12S 단백질이 전혀 없어서, 용액의 투명도는 대부분의 조건에서 상당히 안정적으로 남아있다고 생각된다.
발명의 요약
본 발명의 요약에서, 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 고순도 2S 카놀라 단백질을 회수하는 방법을 제공한다. 본발명의 범위 내에서 변경이 가능하다.
Claims (9)
- 카놀라 오일 시드밀로부터의 카놀라 단백질을 용해하여 카놀라 단백질 용액을 형성하는 단계,
이 카놀라 단백질 용액을 잔류 카놀라 오일 시드밀로부터 분리하는 단계,
이 카놀라 단백질 용액을, 다른 카놀라 단백질에 우선하여 2S 카놀라 단백질이 양이온-교환 매체에 결합하는 조건 하에서 양이온-교환 매체와 접촉시키는 단계,
결합된 2S 카놀라 단백질을 비결합 카놀라 단백질과 불순물로부터 분리하는 단계, 및
이 결합된 2S 카놀라 단백질을 양이온-교환 매체로부터 분리하는 단계를 포함하는, 실질적으로 순수한 2S 카놀라 단백질을 제조하는 방법. - 제 1항에 있어서,
카놀라 오일 시드밀로부터의 카놀라 단백질의 상기 용해는 2S 단백질이 양이온 교환 매체에 선택적으로 결합하는데 유리한 염 농도와 pH 조건 하의 수성 식염수 용액을 사용하여 수행되는 방법. - 제 2항에 있어서,
상기 수성 식염수 용액은 약 0.25 내지 약 0.35 M의 농도와 약 5 내지 약 6의 pH를 가지는 방법. - 제 3항에 있어서,
상기 카놀라 단백질 용액은 약 5 내지 약 6의 pH를 가지는 방법. - 제 1항에 있어서,
상기 양이온-교환 매체는 수지 비드 또는 막 흡착제의 형태인 방법. - 제 1항에 있어서,
상기 결합된 2S 단백질을, 2S 단백질과 상기 양이온-교환 매체 사이의 결합을 해제하기에 충분한 농도의 식염수와 양이온-교환 매체의 접촉에 의해 양이온-교환 매체로부터 분리시키는 방법. - 제 6항에 있어서,
상기 양이온-교환 매체로부터 결합된 2S 단백질을 분리시키는데 사용되는 상기 식염수 용액은 약 0.55 내지 약 0.70 M의 염농도를 가지는 방법. - 카놀라 오일 시드밀을 약 0.25 내지 약 0.35 M의 염화나트륨 농도를 갖는 수성 염 용액과 접촉시켜 약 5 내지 약 6의 pH를 갖는 수성 카놀라 단백질 용액을 형성하는 단계,
상기 수성 카놀라 단백질 용액을 양이온-교환 매체와 접촉시켜, 상기 수성 카놀라 단백질 용액 내에 포함된 2S 카놀라 단백질을, 상기 수성 카놀라 단백질 용액 내에 포함된 7S와 12S 카놀라 단백질을 포함하는 다른 카놀라 단백질보다 우선하여, 또한 상기 수성 카놀라 단백질 용액 내에 포함된 비-단백질 종보다 우선하여 상기 양이온-교환 매체에 결합시키는 단계,
양이온-교환 매체를 세척하여 비결합된 카놀라 단백질과 불순물을 상기 양이온-교환 매체로부터 제거하는 단계,
세척된 양이온-교환 매체를 약 0.55 내지 약 0.70 M의 염화나트륨 농도를 갖는 수성염 용액과 접촉시켜, 결합된 2S 카놀라 단백질을 양이온-교환 매체로부터 분리시키는 단계,
분리된 2S 카놀라 단백질을 수성염 용액으로서 수집하는 단계,
2S 단백질의 수성염 용액을 탈염시키는 단계, 및
2S 단백질을 건조시키는 단계
를 포함하는, 실질적으로 순수한 2S 카놀라 단백질을 제조하는 방법. - 제 8항에 있어서,
상기 양이온-교환 매체는 양이온-교환 기가 세공막에 결합되어 있는 막 흡착제인 방법.
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