KR20100046203A - 표적화된 에틸렌 신호전달 감소를 통한 곡물 수확량 증가 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물 유전 공학에 관한 것이다. 특히, 에틸렌 저해를 통한 녹색 잎 생산 및 생산성 증가에 관한 것이다. 본 발명의 조성물 및 방법은 에틸렌 신호전달을 방해하는 우성 음성 에틸렌 수용체를 포함한다.

Description

표적화된 에틸렌 신호전달 감소를 통한 곡물 수확량 증가{INCREASING GRAIN YIELD THROUGH TARGETED REDUCTION IN ETHYLENE SIGNALING}

에틸렌은 식물 발생시의 세포예정사 (PCD) 조절 인자로서 알려져 있으며 (문헌 ([Campbell and Drew, Planta 157:350-357 (1983)]; [Drew et al., Planta 147:83-88 (1979)]; [He et al., Plant Physiol. 112: 1679-1685 (1996)])), 곡류 내배유를 발생시킬 때 PCD를 조정하는 역할을 하고; 외인성 에틸렌은 내배유를 발생시킬 때 세포 사멸 프로그램의 개시를 가속화시킬 수 있는 반면, 에틸렌 생합성 또는 인식 저해제는 상기 프로그램을 지연시킨다 (문헌 ([Young et al., Plant Physiol. 119:737-751 (1997)]; [Young and Gallie, Plant Mol . Biol. 39:915-926 (1999)]; [Young and Gallie, Plant Mol . Biol. 42:397-414 (2000)])). 에틸렌은 식물 성장 및 발생의 여러 가지 측면들, 예로서, 과실 발생, 뿌리 및 잎 성장, 및 종자 발아를 조절한다.

에틸렌 인식은 막에 위치하는 수용체를 포함하는데, 아라비돕시스(Arabidopsis)의 경우, 상기 수용체는 ETR1, ERS1, ETR2, ERS2 및 EIN4를 포함한다 (문헌 ([Chang et al., Science 262:539-544 (1993)]; [Hua et al., Science 269: 1712-1714 (1995)], [Hua et al., Plant Cell 10: 1321-1332 (1998)], [Sakai et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 95:5812-5817 (1998)])). ETR1, ETR2 및 EIN4는 N-말단 막투과 에틸렌 결합 도메인 (문헌 [Schaller and Bleeker, Science 270: 1809-1811 (1995)]), 히스티딘 단백질 키나제 도메인, 및 C-말단 수용기 도메인이라는 3개의 도메인으로 구성된다. ERS1 및 ERS2에는 수용기 도메인이 존재하지 않는다. 이들 유전자는 상동성에 기초하여 2개의 서브패밀리로 분류되었는데, 여기서, ETR1 및 ERS1은 하나의 서브패밀리를 구성하고, ETR2, ERS2, 및 EIN4는 남은 다른 하나의 서브패밀리를 구성한다 (문헌 [Hua et al., Plant Cell 10: 1321-1332 (1998)]). ETR1 및 ERS1, 두가지 모두 기능성 히스티딘 키나제 도메인을 함유하고, 히스티딘 잔기를 자가인산화시키는 반면, 나머지 다른 패밀리 구성원에는 히스티딘 키나제 활성에 필요한 특정 잔기가 존재하지 않는다. 그러나, 시험관내 연구는 ETR2, ERS2, 및 EIN4가 세린 및 트레오닌 잔기 상에서 자가인산화할 수 있음을 시사한다 (문헌 [Moussatche and Klee (2004), J. Biol . Chem., 279:48734]).

아라비돕시스에서는 5개의 유전자 유형이 동정된 반면, 옥수수에서는 단지 2개의 에틸렌 수용체 유전자 (즉, ZmETR2 및 ZmERS1)만이 동정되었다 (문헌 [Gallie and Young (2004) Mol Genet Genomics 271: 267-281]). ZmETR2는 ZmETR9 및 ZmETR40이라 명명되는 2개의 변이체를 갖는다. 두 에틸렌 수용체 패밀리 모두의 구성원들은 내배유에 비해 발생 중에 있는 배에서 실질적으로 더 높은 수준으로 발현된다. 이는, 내배유 및 배 각자가 에틸렌 합성에 이바지한다는 사실에도 불구하고, 발생 중에 있는 내배유는 에틸렌-유도성 세포 사멸에 대해 낮은 역치를 보이는 데 반해, 배는 보호되는 이유를 설명한다.

곡류의 내배유는 곡물의 주요 저장 기관으로서의 역할을 하지만, 중기 내지 후기 종자 발생 동안에는 세포 사멸을 겪게 된다. 에틸렌이 발생 중에 있는 내배유에서 세포 사멸의 개시 시간을 조절한다. 에틸렌은 막을 자유롭게 통과할 수 있는 기체이기 때문에 발생 중에 있는 커넬의 모든 기관은 특정 기관에서 생성되어 발생원으로부터 상기 기관까지의 거리만큼만 희박해지는 에틸렌에 노출된다는 것을 예측할 수 있다. 발생 중에 있는 커넬 내의 특정 기관에 대한 세포 사멸을 제한할 수 있는 능력이 에틸렌 생합성 및 인식 기구의 발현에 대한 엄격한 제어를 제안한다.

광합성에 있어 에틸렌의 역할은 분명하지 않다. 광합성은 대개 예를 들어, 가뭄, 오존 노출, 또는 한랭과 같은 스트레스 조건이 있는 동안에는 저해된다 (문헌 ([Flexas and Medrano (2002), Annals Bot. 89: 183-189]; [Chaves et al. (2002), Annals Bot . 89: 907-916]; [Ramachandra et al. (2004), J Plant Physiol. 161: 1189-1202])). 광합성능은 잎 확장시에는 증가하고, 잎 노화 개시 이전의 낮은 수준에 도달할 때까지는 엽령에 따라 감소하게 된다 (문헌 [Gay and Thomas (1995), New Phytol. 130: 159-168]). 노화 프로그램의 개시 및 실행 속도가 잎이 식물에 기여할 수 있는 궁극적인 기여도에 유의적인 영향을 미친다. 이는 특히, 수량성이 조기 잎 노화를 유도하는 열악한 환경 조건하에서는 감소되는 농작물, 예로서, 곡류와 관련이 있다.

에틸렌이 광합성에 대하여 어떤 영향도 미치지 않는다거나, 또는 저해 효과를 갖고 있다고 제안하는 보고를 통해 에틸렌이 광합성에 미치는 영향에 대해서 논란의 여지가 있었다 (문헌 ([Pallaghy and Raschke (1972), Plant Physiol. 49: 275-276]; [Kays and Pallas (1980), Nature 285: 51-52]; [Pallas and Kays (1982), Plant Physiol . 70: 598-601]; [Squier et al. (1985), Environ Sci Technol 19: 432-437]; [Taylor and Gunderson (1986), Merr . Plant Physiol. 86: 85-92]; [Woodrow et al. (1988), Mill . J Exp Bot. 39: 667-684])). 종, 성장 조건, 온전한 잎 대 절개된 잎, 및 사용된 외인성 에틸렌의 농도에서의 차이가 관찰되는 효과상의 변동을 가져올 수 있다. 옥수수에서 에틸렌이 광합성 활성 및 곡물 발생에 미치는 영향을 조사하기 위해 돌연변이체 접근법이 사용되었다 (문헌 [Young et al. (2004), Plant J 40: 813-825]). 본 연구를 통해 저자는, 에틸렌 생산에 결함이 있는 옥수수 돌연변이체의 경우, 엽록소의 양과 CO₂ 동화율이 야생형 식물에 비하여 증가되어 있다는 것을 발견하게 되었다.

에틸렌이 식물 성장과 발생에서 중요한 역할을 하기 때문에 에틸렌 반응 경로에 관여하는 유전자를 동정하는 것이 변경된 에틸렌과 관련된 과정과 관련이 있는 표현형을 가진 식물, 예로서, 녹색 지속성(staygreen) 특징을 갖는 식물을 생성하는데 유용하다. 따라서, 곡류 에틸렌 신호 전달 경로에 관여하는 유전자를 동정하는 것이 요구되고 있다.

본 발명의 간단한 요약

본 발명은 식물의 에틸렌 신호 전달 경로에 영향을 미치는 조성물 및 방법을 제공한다.

본 발명은 우성 음성 에틸렌 수용체 폴리펩티드, 예를 들면, 우성 음성 ZmERS1, ZmETR9, 또는 ZmETR40 (각각 서열 2, 4 및 6으로 제시함)을 코딩할 수 있는 단리된 핵산을 제공한다. 추가로, 본 발명은 이들 각 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 서열 1, 3 및 5)을 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열 1, 3, 및 5와 적어도 90％, 및 더욱 전형적으로 적어도 95％, 99％, 또는 100％의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 본 발명의 몇몇 실시태양에서, 단리된 핵산은 서열 2와 적어도 90％, 더욱 전형적으로 95％, 99％ 또는 100％의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는데, 여기서, 아미노산 65는 시스테인은 아니다. 몇몇 실시태양에서, 서열 2의 아미노산 65는 티로신이다. 몇몇 실시태양에서, 단리된 핵산은 서열 4와 적어도 90％, 더욱 전형적으로 95％, 99％ 또는 100％의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는데, 여기서, 아미노산 102는 시스테인은 아니다. 몇몇 실시태양에서, 서열 4의 아미노산 102는 티로신이다. 몇몇 실시태양에서, 단리된 핵산은 서열 6과 적어도 90％, 더욱 전형적으로 95％, 99％ 또는 100％의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는데, 여기서, 아미노산 102는 시스테인은 아니다. 몇몇 실시태양에서, 서열 6의 아미노산 102는 티로신이다.

몇몇 실시태양에서, 핵산은 ZmERS1 및 ZmETR2의 절단 돌연변이체 (예를 들면, 서열 2의 아미노산 1-110, 또는 서열 4 및 6의 아미노산 1-147을 포함하는 것)를 코딩한다. 그러한 실시태양에서, 절단 돌연변이체는 예를 들어, 서열 2의 1-150, 1-200, 1-250, 1-300, 1-325, 또는 1-350, 또는 서열 4 또는 6의 아미노산 1-200, 1-250, 1-300, 1-350, 또는 1-375와 같이 약간 좀더 길 수 있다.

몇몇 실시태양에서, 우성 음성 에틸렌 수용체 폴리펩티드, 예를 들면, 우성 음성 ZmERS1, ZmETR9, 또는 ZmETR40 (각각 서열 2, 4 및 6으로 제시함)을 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함하는 재조합 발현 카세트를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 핵산은 ZmERS1 및 ZmETR2의 절단 돌연변이체 (예를 들면, 서열 2의 아미노산 1-110, 또는 서열 4 또는 6의 아미노산 1-147을 포함하는 것)를 코딩한다. 추가로, 본 발명은 서열 1, 3, 및 5의 폴리뉴클레오티드 서열, 및 서열 1, 3, 및 5와 적어도 90％, 및 더욱 전형적으로 적어도 95％, 99％, 또는 100％의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.

몇몇 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 우성 음성 에틸렌 수용체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함하는 재조합 발현 카세트를 포함하는 트랜스제닉 식물을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 핵산은 ZmERS1, ZmETR9, 또는 ZmETR40 (각각 서열 2, 4 및 6으로 제시함)을 코딩한다. 다른 실시태양에서, 우성 음성 에틸렌 수용체 폴리펩티드는 서열 2의 아미노산 1-110, 또는 서열 4 또는 6의 아미노산 1-147을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 핵산 서열은 서열 1, 3, 또는 5, 및 서열 1, 3, 및 5와 적어도 90％, 및 더욱 전형적으로 적어도 95％, 99％, 또는 100％의 동일성을 갖는 핵산 서열이다. 몇몇 실시태양에서, 트랜스제닉 식물은 곡류 식물, 예로서, 밀, 벼, 보리, 호밀, 기장, 수수, 또는 귀리이다. 몇몇 실시태양에서, 트랜스제닉 식물은 옥수수이다.

추가의 실시태양에서, 본 발명은 (a) 우성 음성 에틸렌 수용체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 작제물을 도입하는 단계 및 (b) 에틸렌 감수성이 감소된 식물을 선별하는 단계를 포함하는, 식물에서 에틸렌 감수성을 감소시키는 방법을 제공한다. 바람직한 우성 음성 에틸렌 수용체 폴리펩티드는 ZmERS1, ZmETR9, 또는 ZmETR40 (각각 서열 2, 4 및 6으로 제시함)을 포함한다. 다른 실시태양에서, 우성 음성 에틸렌 수용체 폴리펩티드는서열 2의 아미노산 1-110, 또는 서열 4 또는 6의 아미노산 1-147을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 핵산 서열은 서열 1, 3, 또는 5, 및 서열 1, 3, 또는 5와 적어도 90％, 및 더욱 전형적으로 적어도 95％, 99％, 또는 100％의 동일성을 갖는 핵산 서열이다.

또다른 측면에서, 본 발명은 식물에서 녹색 지속성 표현형을 유도하는 방법을 제공한다. 본 방법은 (a) 우성 음성 에틸렌 수용체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 작제물을 도입하는 단계 및 (b) 녹색 지속성 특징을 갖는 식물을 선별하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 에틸렌 수용체 폴리펩티드는 ZmERS1, ZmETR9, 또는 ZmETR40 (각각 서열 2, 4 및 6으로 제시함)을 포함한다. 다른 실시태양에서, 우성 음성 에틸렌 수용체 폴리펩티드는서열 2의 아미노산 1-110, 또는 서열 4 또는 6의 아미노산 1-147을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 핵산 서열은 서열 1, 3, 또는 5, 및 서열 1, 3, 또는 5와 적어도 90％, 및 더욱 전형적으로 적어도 95％, 99％, 또는 100％의 동일성을 갖는 핵산 서열이다. 몇몇 실시태양에서, 식물은 노화 지연, 광합성능 증가 또는 단일 종자 내 존재하는 여러 개의 배에 대해 선별된다.

본 발명의 다른 목적, 이점 및 실시태양은 하기 상세한 설명을 검토함으로써 자명해질 것이다.

도 1: 여러 범위의 ACC 농도에 걸쳐 아라비돕시스에서 돌연변이체 ZmERS1 또는 ZmETR2의 발현에 의해 부여받은 에틸렌 비감수성 정량화. 돌연변이체 ZmERS1 (MS1-11) 또는 ZmETR2 (MT2-9)를 발현하는 종자를 명시된 농도의 ACC 상에서의 발아시키고, 암실에서 5일 동안 성장시켰다. 야생형 종자 (WT)는 대조군으로서 포함하였다.

발명의 상세한 설명

A. 개요

본 발명은 옥수수 식물에서 에틸렌 반응을 저해시킴으로써 상기 식물의 노화를 지연시키는 신규한 방법을 제공한다. 에틸렌 수용체 단백질을 돌연변이화시키는 것 뿐만 아니라, 야생형 또는 돌연변이체 에틸렌 수용체 단백질을 과다발현시킴으로써 노화를 지연시킬 수 있다. 본 발명은 또한 지연된 노화 패턴 또는 특징을 갖는 곡류 식물을 선별하는 방법을 제공한다. 지연된 노화 패턴으로 인하여 곡류 식물의 표현형은 야생형 식물과 비교하여 변경될 것이다. 변경된 표현형으로는 녹색 지속성 특질, 예를 들어, 성장 시기 말기까지 녹색 상태 그대로 유지되는 잎, 광합성능 증가, 가뭄 내성 개선, 사일리지 개선, 곡물 수확량 증가, 및 고밀도 식재에 대한 내성 증가, 및 여러 개의 배를 갖는 커넬을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 따라서, 단독으로 돌연변이화된 에틸렌 수용체 단백질 생산을 통해, 또는 다른 방법과의 조합을 통해 에틸렌 반응을 저해시킴으로써 바이오매스 및/또는 수확량이 증가된 식물을 확인할 수 있다.

B. 정의

"핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드 서열"이라는 어구는 5'에서부터 3' 말단으로 판독되는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 단일 또는 이중-가닥 중합체를 지칭한다. 핵산은 또한 폴리머라제에 의한 올바른 판독을 허용하되, 상기 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 발현은 변경시키지 않는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

"~을 코딩하는 핵산 서열"이라는 어구는 특정 단백질 또는 펩티드의 발현을 지시하는 핵산을 지칭한다. 핵산 서열은 RNA로 전사되는 DNA 가닥 서열과, 단백질로 번역되는 RNA 서열, 이 둘 모두를 포함한다. 핵산 서열은 전장의 핵산 서열과, 전장의 서열로부터 유래된 비-전장의 서열, 이 둘 모두를 포함한다. 서열은 천연 서열 또는 특정 숙주 세포에서 코돈 선호를 제공하기 위해서 도입될 수 있는 서열의 축퇴성 코돈을 포함한다는 것도 추가로 이해하여야 한다.

"프로모터"란 용어는 전사 출발점으로부터 상류 또는 하류에 위치하는 부위 또는 서열 결정기로서, RNA 폴리머라제 및 전사를 개시시키는 기타 다른 단백질의 인식 및 결합에 관여하는 것을 지칭한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시시킬 수 있는 프로모터이다. 그러한 프로모터는 식물 기원일 필요는 없으며, 예를 들면, 식물 바이러스로부터 유래된 프로모터, 예로서, CaMV35S 프로모터가 본 발명에서 사용될 수 있다.

"식물"이란 용어는 전 식물체, 새싹 생장 기관/구조 (예를 들어, 잎, 줄기 및 괴경), 뿌리, 꽃 및 꽃 기관/구조 (예를 들어, 포엽, 꽃받침, 꽃잎, 수술, 심피, 꽃밥 및 밑씨), 종자 (배, 내배유, 및 종피 포함) 및 과실 (다 익은 씨방), 식물 조직 (예를 들어, 관다발 조직, 기본 조직 등) 및 세포 (예를 들어, 공변 세포, 난세포, 모용 등), 및 상기의 자손을 포함한다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 식물 부류는 일반적으로 형질전환 기법에 사용될 수 있는 고등식물 부류부터 하등식물 부류까지 광범위하며, 이는 속씨식물 (단자엽 및 쌍자엽 식물), 겉씨식물, 양치식물, 선태식물, 및 다세포 조류를 포함한다. 이수체, 배수체, 2배체, 반수체 및 반접합체를 비롯한, 다양한 배수성 수준을 갖는 식물을 포함한다.

"숙주 세포"라는 어구는 임의의 유기체로부터 유래된 세포를 지칭한다. 바람직한 숙주 세포는 식물, 세균, 효모, 진균, 곤충 또는 기타 다른 동물로부터 유래된 것이다. 폴리뉴클레오티드 서열을 다양한 유형의 숙주 세포로 도입시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.

폴리뉴클레오티드 서열의 경우, 외래 종으로부터 기원한 것이라면, 또는 동일 종으로부터 기원한 것이라도 인간이 조치를 취함으로써 그의 원래의 형태로부터 변형되었다면, 이는 제2 폴리뉴클레오티드 서열과 "이종성"을 띤다. 예를 들면, 이종성 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터는 프로모터가 유래된 종과는 상이한 종으로부터 유래된 코딩 서열이거나, 또는 동일 종으로부터 유래된 것이라도 임의의 천연적으로 발생된 대립유전자 변이체와는 상이한 코딩 서열을 지칭한다.

개체 식물에 대해 "외인성"인 폴리뉴클레오티드는 유성 교배 이외의 임의의 다른 수단에 의해서 식물 내로, 또는 상기 식물의 선조 세대 내로 도입된 폴리뉴클레오티드이다. 상기를 수행할 수 있는 수단의 예는 하기에 기술되어 있으며, 이는 아그로박테리움-매개 형질전환, 유전자총 방법, 전기천공, 식물체내 기법 등을 포함한다.

본 발명의 특정 폴리펩티드 또는 핵산의 "발현 또는 활성의 증가 또는 증진"이란 폴리펩티드 활성의 증대된 변화를 지칭하는 것이다. 그러한 활성 또는 발현의 증가에 대한 예로는 하기를 포함한다: 폴리펩티드의 활성, 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현이 야생형의 비-트랜스제닉 대조군 식물에서의 수준보다 높게 증가한다 (또는 대조군 식물에서보다는 더욱 장기간 동안 존재한다). 폴리펩티드의 활성, 또는 유전자의 발현이, 그것이 정상적으로는 야생형의 비-트랜스제닉 대조군 식물에서는 검출되지 않는 기관, 조직 또는 세포에 존재한다 (즉, 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현에 대한 공간적인 분포가 변경된다).

본 발명의 폴리펩티드 또는 핵산의 "발현 또는 활성의 감소"란 폴리펩티드의 활성이 감소되었음을 지칭하는 것이다. 그러한 활성 또는 발현의 감소에 대한 예로는 하기를 포함한다: 폴리펩티드의 활성, 또는 유전자의 발현이 야생형의 비-트랜스제닉 대조군 식물에서의 수준 아래로 감소한다.

본원에서 사용되는 바, "생식 구조" 또는 "생식 조직"이란 용어는 과실, 밑씨, 종자, 화분, 꽃, 또는 꽃의 일부분, 예로서, 암술, 수술, 꽃밥, 꽃받침, 꽃잎, 심피, 또는 임의의 배 조직을 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "생장 구조" 또는 "생장 조직"이란 용어는 잎, 줄기, 괴경, 뿌리, 관다발 조직, 또는 뿌리 및 새싹 분열조직을 포함한다.

"발현 카세트"란 숙주 세포 내로 도입되었을 때, 각각 RNA 또는 폴리펩티드로 전사 및/또는 번역되는 핵산 작제물을 지칭한다. 번역되지 않거나, 번역될 수 없는 안티센스 또는 센스 작제물도 명확하게 본 정의에 포함된다.

트랜스진의 발현과, (예를 들어, 안티센스, 또는 센스 억제에 의한) 내인성 유전자의 저해, 두가지 경우 모두에 있어서, 삽입되는 폴리뉴클레오티드 서열이 동일할 필요는 없으며, 상기 서열이 유래된 유전자의 서열과 "실질적으로 동일"할 수 있다는 것을 숙련인은 인지할 것이다. 하기 설명하는 바와 같이, 이들 변이체가 구체적으로 본 용어에 포함된다.

삽입된 폴리뉴클레오티드 서열이 전사되고 번역되어 기능성 폴리펩티드가 생산되는 경우에 있어서, 코돈 축퇴성으로 인해 다수의 폴리뉴클레오티드 서열이 동일한 폴리펩티드를 코딩할 것이라는 것을 숙련인은 인지할 것이다. 이들 변이체가 구체적으로 "본 발명의 유전자로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열"이라는 용어에 포함된다. 추가로, 본 용어는 구체적으로 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 서열과 (하기 기술하는 바와 같이 측정한 바) 실질적으로 동일한 서열 (예를 들어, 전장의 서열), 및 본 발명의 폴리펩티드의 기능을 보유하는 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다.

내인성 유전자의 발현을 저해시키는데 사용되는 폴리뉴클레오티드의 경우에 있어서, 도입되는 서열이 표적 내인성 유전자의 서열과 완벽하게 동일할 필요는 없다. 도입되는 폴리뉴클레오티드 서열은 전형적으로는 표적 내인성 서열과 (하기와 같이 측정한 바) 적어도 실질적으로 동일할 것이다.

두 핵산 서열 또는 폴리펩티드는, 하기 기술하는 바와 같이 두 서열이 최대로 일치하도록 정렬하였을 때에 두 서열 중의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 서열이 각각 동일할 경우, "동일하다"라고 언급한다. "~에 상보적인"이라는 용어는 본원에서 서열이 기준 폴리뉴클레오티드 서열 전체 또는 그 일부와 상보적인 것을 의미하는데 사용된다.

비교를 위해 서열을 최적으로 정렬하는 것은 예로서, 스미스(Smith) 및 워터맨(Waterman) (문헌 [Smith and Waterman, Add . APL . Math. 2:482 (1981)])의 국부 상동성 알고리즘에 의해, 니들만(Needleman) 및 운쉬(Wunsch) (문헌 [Needleman and Wunsch, J. Mol . Biol. 48:443 (1970)])의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 피어슨(Pearson) 및 리프만(Lipman) (문헌 [Pearson and Lipman, Proc . Natl . Acad . Sci. U.S.A. 85: 2444 (1988)])의 유사성 검색 방법에 의해, 이러한 알고리즘의 컴퓨터화된 실행에 의해 (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, 및 TFASTA (위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹(GCG: Genetics Computer Group)의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package))) 또는 검사에 의해 수행될 수 있다.

"서열 동일성(％)"은 비교창 상에서 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하여 측정하는데, 여기서, 비교창 내의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부분은 두 서열의 최적 정렬을 위하여 기준 서열 (부가 또는 결실을 포함하지 않는 것)과 비교하여 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수도 있다. 상기 서열 동일성(％)은 양 서열에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 발생하는 위치의 갯수를 측정하여 매치되는 위치의 갯수를 산출하고, 매치되는 위치의 갯수를 비교창 내의 위치의 총 갯수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 계산한다.

폴리뉴클레오티드 서열의 "실질적인 동일성"이란 용어는, 폴리뉴클레오티드가 우성 음성 에틸렌 수용체 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 서열 1, 3, 또는 5)와 적어도 85％의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다는 것을 의미한다. 별법으로, 동일성(％)은 85％ 내지 100％의 임의의 정수일 수 있다. 대부분의 실시태양은 본원에 기술된 프로그램; 바람직하게는, 하기 기술되는 표준 파라미터를 사용하는 BLAST를 사용하여 기준 서열과 비교하였을 때에 적어도: 85％, 90％, 95％, 또는 99％를 포함한다. 따라서, 본 발명의 방법에 사용되는 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 본원에 개시된 서열과 실질적인 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 두 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질의 상응하는 동일성을 측정하기 위해서는 코돈 축퇴성, 아미노산 유사성, 리딩 프레임 위치 결정 등을 고려함으로써 상기 값을 적절하게 조절할 수 있다는 것을 숙련인은 인지할 것이다.

이러한 목적을 위한 아미노산 서열의 실질적인 동일성은 보통 우성 음성 에틸렌 수용체 폴리펩티드 (예를 들어, 서열 2, 4, 또는 6)와 적어도 90％ 동일한 서열 동일성을 의미한다. 폴리펩티드의 동일성(％)은 90％ 내지 100％의 임의의 정수, 예를 들면, 90％, 95％, 또는 99％일 수 있다. "실질적으로 유사한" 폴리펩티드는 단, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 변화에 의해 달라질 수 있다는 점을 제외하고는, 상기 언급한 바와 같이 서열을 공유한다. 보존적 아미노산 치환이란 유사한 측쇄를 갖는 잔기들의 상호교환가능성을 지칭한다. 예를 들면, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산 군은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신이고; 지방족-하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산 군은 세린 및 트레오닌이고; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산 군은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 군은 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판이고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 군은 리신, 아르기닌, 및 히스티딘이고; 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산 군은 시스테인 및 메티오닌이다. 보존적 아미노산 치환군은 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 아스파르트산-글루탐산, 및 아스파라긴-글루타민을 포함한다.

뉴클레오티드 서열이 실질적으로 동일하다는 것을 나타내는 또다른 지표는 2개의 분자가 서로, 또는 제3 핵산과 엄격한 조건하에서 혼성화하는지 여부이다. 엄격한 조건은 서열에 의존하며, 환경이 다르면 달라질 것이다. 일반적으로, 엄격한 조건은 정의된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 열적 융점 (Tm)보다 약 5℃ 더 낮은 것으로 선택된다. Tm은 표적 서열 중 50％가 완벽하게 매치되는 프로브에 혼성화하는 (정의된 이온 강도 및 pH하의) 온도이다. 전형적으로, 엄격한 조건은, 염 농도는 pH 7에서 약 0.02 M이고, 온도는 적어도 약 60℃ 또는 65℃인 것이 될 것이다.

본 개시 목적을 위해, 혼성화를 위한 엄격한 조건으로는 20분 동안 63℃에서 0.2X SSC 중 적어도 1회 세척하는 조건, 또는 등가인 조건을 포함한다. 중간 정도의 엄격한 조건으로는 20분 동안 적어도 약 50℃, 보통 약 55℃의 온도에서 0.2X SSC 중 적어도 1회 세척 (보통 2회 세척)하는 조건, 또는 등가인 조건을 포함한다.

"에틸렌과 관련된 과정과 관련이 있는 표현형"이라는 어구는 에틸렌에 의해 조정되는 표현형을 지칭한다. 일례의 표현형으로는 녹색 지속성 특질, 예로서, 가뭄 내성 개선, 사일리지 개선, 본 시기 말기까지 녹색 상태 그대로 유지되는 잎, 및 고밀도 식재에 대한 내성 증가를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 에틸렌과 관련된 과정은 예를 들어, 에틸렌 과다생산, 에틸렌의 생산부족, 세포에서 에틸렌에 대한 감수성 증가, 또는 세포에서 에틸렌에 대한 감수성 감소에 의해 조정될 수 있다.

"에틸렌 수용체" 또는 "에틸렌 수용체 단백질"이란 용어는 식물에 존재하는 임의의 에틸렌 수용체 패밀리로부터의 에틸렌 수용체를 지칭한다. 일례로, 아라비돕시스에서 에틸렌 수용체 단백질은 ETR1, ERS1, ETR2, ERS2, 및 EIN4를 포함한다. 지 메이스(Zea mays) 에틸렌 수용체 단백질은 ZmERS1 및 ZmETR2 (ZmETR2 변이체인 ZmETR9 및 ZmETR40 포함)를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "ETR2," "ZmETR2," "ZmETR9" 및 "ZmETR40"은 동의어로 사용될 수 있다. 유사하게, "ERS1" 및 "ZmERS1"은 동의어로 사용될 수 있다.

본 발명의 에틸렌 수용체는 임의의 식물 종으로부터 단리될 수 있고, 예식적인 에틸렌 수용체의 종 상동체를 포함한다. 에틸렌 수용체는 또한 삽입, 결실, 및 점 돌연변이를 비롯한, 천연적으로 발생된 돌연변이 및 유도성 돌연변이를 갖는 단백질도 포함한다.

"우성 음성"이란, 심지어 세포가 이형접합성 (야생형 및 우성 음성)인 경우에도 동일 세포 내의 정상적인 야생형 유전자 생성물의 기능에 악영향을 미치는 유전자 생성물을 지칭한다. 우성 음성 돌연변이체가 발현하게 되면 일반적으로는 정상적인 기능이 감소하게 된다. "우성 음성 에틸렌 수용체"는, 이량체화 도메인은 보존하되, 단백질의 기타 다른 기능성 도메인을 파괴시키거나 절단함으로써 형성될 수 있다. 예를 들면, 에틸렌에 결합하지 않는 에틸렌 수용체 돌연변이체 (본원에서 "비-에틸렌 결합 에틸렌 수용체"로도 명명된다)가 우성 음성 방식으로 작용한다. 본 발명의 비-에틸렌 결합 에틸렌 수용체는 서열 2, 4, 및 6의 폴리펩티드, 및 서열 2의 잔기 65, 또는 서열 4 또는 6의 잔기 102가 시스테인이 아닌 한, 상기 폴리펩티드의 실질적으로 동일한 변이체를 포함한다.

에틸렌 수용체 폴리펩티드는 폴리펩티드의 N 말단에서 이황화 결합을 통해 이량체화된다 (예를 들어, 문헌 [Schaller et al. (1995) J. Biol . Chem. 270: 12526-30] 참조). 에틸렌 수용체의 목적을 위해, "이량체화 도메인"이란 이러한 이량체화를 매개하는 적어도 하나의 N 말단 시스테인 잔기를 지칭하는 것이다. 이량체화에 관여하는 시스테인은 에틸렌 결합을 매개하는 시스테인 잔기(들)와는 별개의 것이다. ZmERS1 중 이량체화 도메인은 서열 2의 아미노산 4 내지 6에서 발견된다. ZmETR9 및 ZmETR40의 이량체화 도메인은 각각 서열 4의 잔기 37 내지 40에, 및 서열 6의 아미노산 38 내지 40에 위치한다.

"에틸렌 결합 도메인"이란 용어는 대략적으로 에틸렌 수용체 폴리펩티드의 N 말단에서 발견되는 막투과 도메인에 상응한다. ZmERS1 중 에틸렌 결합에 관여하는 잔기는 서열 2의 아미노산 20-119에 걸쳐 있다. ZmETR2 중 에틸렌 결합에 관여하는 잔기는 서열 4 및 6의 아미노산 53-156에 걸쳐 있다. 수용체의 에틸렌 결합능은 본원에 기술된 방법을 사용하여 시험할 수 있다.

에틸렌 수용체의 "막투과 도메인" 또는 "막간 부위"라는 용어는 에틸렌 수용체 폴리펩티드의 3 또는 4개의 막에 걸쳐있는 나선에 이르는 부위를 지칭한다. 대개의 막투과 도메인과 같이, 에틸렌 수용체 막투과 도메인도 주로 소수성이다. 대개의 에틸렌 수용체 폴리펩티드에서, 막투과 도메인은 대략적으로 "에틸렌 결합 도메인"에 상응한다. 일례로, ZmERS1 막투과 도메인은 대략적으로 서열 2의 아미노산 20-107에 걸쳐 있다. ZmETR2의 막투과 도메인은 대략적으로 서열 4 및 6의 5-144에 걸쳐 있다.

에틸렌 수용체의 "히스티딘 키나제 도메인" 또는 "키나제 도메인"이란 신호 전달 경로에 관여하는 부위를 지칭하는 것이다. ETR1 및 ERS1 수용체는 에틸렌에 대한 반응으로 상기 부위 중 보존되는 히스티딘 잔기에서 자가인산화된다. 기타 다른 에틸렌 수용체 패밀리 단백질 (ETR2, ERS2, 및 EIN4)에는 히스티딘 키나제 활성에 필요한 잔기가 존재하지 않는다. 그러나, 이들 단백질은 여전히 식물 세포 상에 에틸렌 반응성을 부여할 수 있다.

"C 말단 수용기 도메인"은 오직 ETR1, ETR2 및 EIN4 에틸렌 수용체에서만 발견된다. 수용기 도메인은 키나제 도메인과 조합하여 반응을 조절하는데 중요한 역할을 한다. 키나제 도메인 및 수용기 도메인은 CTR1과 상호작용함으로써 에틸렌 반응성을 조정한다. 일례로, ETR2 중 C 말단 수용기 도메인은 대략적으로 서열 4 및 6의 아미노산 612-767에 걸쳐 있다.

"녹색 지속성"이란 용어는 야생형 식물과 비교하여 성장 시기로 식물 건강 상태를 좀더 늦게까지 유지시켜 줄 수 있는 하이브리드 식물의 능력을 지칭하는 것이다. 녹색 지속성 특질은 곡물 수확량 증가, 광합성능 증가, 가뭄 내성 개선, 사일리지 개선 및 고밀도 식재에 대한 내성 증가와 관련이 있다. 녹색 지속성 표현형은 표준 분석법을 사용함으로써 용이하게 분석할 수 있다. 예를 들면, 암기-유도성 노화 분석법을 사용할 수 있다. 예로서, 분석법은 전형적으로 1주 동안 식물에 그대로 잎을 부착시킨 상태로 잎을 쉬딩(sheathing)하는 것을 포함한다. 빛이 존재하지 않으면 잎 노화가 유도되는데, 이는 본 발명의 식물에서 있어서 대조군과 비교하면 지연될 수 있다.

"광합성능"이란 용어는 빛 에너지를 화학 에너지로 전환시킬 수 있는 식물의 능력을 지칭한다. 광합성능은 예를 들면, 식물 구조재 존재하는 엽록소의 양, 또는 CO₂ 동화량을 측정함으로써 측정될 수 있다. 그러한 기법은 당업계에 공지되어 있다.

"바이오마커"란 관심의 대상이 되는 특질 또는 유전자의 존재를 나타내는 임의의 검출가능한 마커이다. 몇몇 경우에서, 바이오마커란 관심의 대상이 되는 특질 또는 유전자와 연관되어 있거나, 그와 함께 동시에 분리되는 것으로서 용이하게 검출될 수 있는 표현형이다. 예를 들면, 몇몇 바이오마커가 화학적 또는 영양적 스트레스에 대한 내성을 부여한다. 몇몇 실시태양에서, 바이오마커는 용이하게 검출될 수 있는 단백질, 예를 들어, 형광단 또는 유사한 리포터 작제물이다. 몇몇 실시태양에서, 바이오마커는 뉴클레오티드 서열, 예로서, 독특한 제한 부위 또는 용이하게 증폭되는 서열이다. 바이오마커는 트랜스진 또는 내인성 유전자, 예를 들어, 특정 대립유전자의 존재를 나타내는데 사용될 수 있다. 바이오마커의 용도는 당업계에 공지되어 있으며, 기법은 특정 상황에 적합하도록 변형시킬 수 있다.

C. 본 발명의 폴리펩티드의 저해 활성

본 발명은 식물에서 에틸렌 수용체 단백질의 활성을 저해시킴으로써 에틸렌과 관련된 과정을 조정하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명은 에틸렌 수용체를 코딩하는 핵산 서열, 예를 들면, 서열 1, 3, 또는 5의 서열, 그의 변이체, 또는 절단 돌연변이체에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 작제물을 도입하는 단계를 포함하는, 식물에서 에틸렌 수용체 활성을 저해시키는 방법을 제공한다.

몇몇 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드의 비-기능성 또는 우성 음성 돌연변이는 돌연변이화된 우성 음성 폴리펩티드를 코딩하는 트랜스진을 발현시킴으로써 제조될 수 있다. 상기 설명한 바와 같이, 우성 음성 돌연변이체 폴리펩티드는 심지어 세포가 이형접합성 (야생형 및 우성 음성)인 경우에도 동일 세포 내의 정상적인 야생형 유전자 생성물의 기능에 악영향을 미친다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 우성 음성 유전자 생성물은 야생형 유전자 생성물의 동일한 요소들 중 적어도 일부에 기능을 하고, 그와 상호작용하되, 야생형 기능 중 일부 측면을 차단하는 것으로 사료된다.

우성 음성 돌연변이의 일례는 이량체로서 기능성을 띤 단백질이다. 야생형 단백질 중 소수가 비-기능성 단백질에 결합하여 비-기능성 이량체를 형성하기 때문에, 기능성 도메인은 제거하되, 이량체화 도메인은 보유하는 돌연변이가 우성 음성 표현형을 유발한다. 에틸렌 수용체 단백질은 세포 막에서 동종이량체로서 기능을 하기 때문에 상기 모델에 대해 적합화될 수 있다. 따라서, 일례로, 우성 음성 에틸렌 수용체는 이량체화 도메인은 보존하되, 단백질의 기타 다른 기능성 도메인을 파괴시키거나 절단함으로써 형성될 수 있다.

비-에틸렌 결합 에틸렌 수용체는 우성 음성 방식으로 작용한다. 따라서, ZmERS1 또는 ZmETR2의 에틸렌 결합 도메인 중 적어도 하나의 잔기를 파괴시키면 에틸렌 비감수성을 초래할 수 있다. 예를 들면, 본 발명자들은 ZmERS1 중 Cys65, 및 ZmETR2 중 Cys102를 파괴시키면 식물에서 에틸렌 비감수성을 초래할 수 있다는 것을 발견하게 되었다. 에틸렌 결합 도메인 중 다른 잔기, 예를 들어, ZmERS1의 잔기 20-119, 25-36, 또는 61-91 또는 ZmETR2의 잔기 53-156, 58-67, 또는 90-120 중 임의의 것을 파괴시키면 에틸렌 결합은 또한 방해받을 수 있다.

트랜스제닉 식물에서 불활성 표적 유전자를 생산하는데 있어 우성 음성 돌연변이체의 용도는 문헌 [Mizukami et al., Plant Cell 8:831-845 (1996)]에 기재되어 있다. 상기 언급한 바와 같이, 이러한 접근법을 사용함으로써 에틸렌 수용체의 우성 음성 돌연변이체를 식물 내로 도입하여 식물의 에틸렌 감수성을 감소시킬 수 있다. 예를 들면, 변경된 아라비돕시스 ERS 유전자를 사용하여 우성 에틸렌 비감수성을 부여할 수 있다 (문헌 [Hua et al., Science 269: 1712-4 (1995)]). 아라비돕시스 ETR1 돌연변이체 또한 사용되어 왔다 (문헌 ([Wilkinson et al., Nat Biotechnol., 15: 444-7 (1997)] 및 [Chang et al., Science, 262:539-44 (1993)])).

또다른 전략법은 본 발명의 폴리펩티드가 그 자신과 또는 다른 분자들과 상호작용할 수 있는 능력을 저해시키는 것이다. 이는 예를 들면, 특정 항체를 사용함으로써 달성될 수 있다. 예를 들면, 항체의 세포-특이 발현을 사용하여 항체:항원 인식을 통해 기능성 도메인을 불활성화시킬 수 있다 (문헌 [Hupp et al., Cell 83:237-245 (1995)] 참조).

몇몇 실시태양에서, 본 발명은 에틸렌 반응성이 감소된 에틸렌 수용체를 포함한다. 에틸렌 부재하에서 에틸렌 수용체는 에틸렌 반응 경로를 음성적으로 조절한다. 에틸렌 수용체 단백질의 신호전달 하류는, 포유동물 RAF형 세린/트레오닌 키나제와 관련된 에틸렌 반응의 음성 조절인자인 CTR1에 의해 매개된다 (문헌 [Kieber et al., Cell, 72:427-441 (1993)]). 에틸렌 결합으로 CTR-1의 활성은 감소하게 되고, 그 결과, (CTR-1의 하류에 작용하는) EIN2 활성은 증가하게 되며, 최종적으로는 에틸렌 반응성이 증가하게 된다 (문헌 ([Bleeker and Schaller, Plant Physiol., 111:653-660 (1996)]; [Hua and Meyerowitz, Cell, 72:427-441 (1998)])). 따라서, 에틸렌 결합이 음성 수용체 신호전달을 저해하는 것이다.

따라서, 우성 음성 에틸렌 비감수성은 수용체에의 에틸렌 결합을 방해하는 돌연변이에 의해, 또는 CTR-1을 통한 구성적 신호전달을 유발하는 돌연변이에 의해 부여받을 수 있다. 우성 음성 에틸렌에 비감수성인 돌연변이체의 특정 일례는 아라비돕시스 ETR1 유전자의 etr1 -1 돌연변이체이다. 이는 두번째 막투과 부위에, 에틸렌이 수용체에 결합하는 것을 방해하는 Cys→Tyr 돌연변이를 갖는다. 에틸렌 결합을 방해하거나, 심지어 에틸렌의 존재하에서도 CTR-1 신호전달을 허용하는 추가의 에틸렌 수용체 돌연변이체가 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Wang et al. (2006), Plant Cell, 18:3429-3442] 참조).

몇몇 실시태양에서, 에틸렌 수용체 단백질의 절단 돌연변이체는 에틸렌 비감수성을 부여하는데 사용된다. 절단은 에틸렌 수용체의 N-말단 또는 C-말단 종단 상에서, 또는 둘 모두에서 이루어질 수 있다. 일례는 히스티딘 단백질 키나제와 C-말단 수용기 도메인이 존재하지 않는 에틸렌 수용체이다. 또다른 일례는 막투과 부위 다음의, 예를 들면, 대략적으로 서열 2의 잔기 110 또는 서열 4 또는 6의 잔기 147 다음의 세포내 도메인이 존재하지 않는 절단 돌연변이체이다. 이들 절단 돌연변이체는 단독으로 사용될 수 있거나, 에틸렌 반응성을 감소시키는 다른 돌연변이와 함께 조합되어 사용될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 절단 돌연변이체는 예를 들어, 서열 2의 1-150, 1-200, 1-250, 1-300, 1-325, 또는 1-350, 또는 서열 4 또는 6의 아미노산 1-200, 1-250, 1-300, 1-350, 또는 1-375와 같이 약간 좀더 길 수 있다.

부위 지정 돌연변이유발 기법이 본 발명의 뉴클레오티드 서열과 함께 사용될 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., 1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, N.Y.)]의 섹션 15.3에 기재되어 있는 바와 같이, DNA의 제한 엔도뉴클레아제 분해에 이어 결찰을 사용함으로써 에틸렌 수용체의 결실 변이체를 생성할 수 있다. 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌 동일]의 섹션 15.3에 기재되어 있는 바와 같이, 유사한 전략법을 사용하여 삽입 변이체를 작제할 수 있다. 가장 최근에는 문헌 [Zhu et al. (1999), Proc . Natl . Acad . Sci . USA 96:8768-73]에서와 같이, 키메라 RNA/DNA 올리고뉴클레오티드를 사용함으로써 생체내에서 식물 유전자에 돌연변이를 표적화시키는 방법이 고안되었다.

올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발법 또한 본 발명의 치환 변이체를 제조하는데 사용될 수 있다. 이는 또한 본 발명의 결실 및 삽입 변이체를 용이하게 제조하는데에도 사용될 수 있다. 본 기법은 문헌 ([Adelman et al. (1983) DNA 2: 183]; [Sambrook et al., 상기 문헌 동일; "Current Protocols in Molecular Biology", 1991, Wiley (NY), F. T. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. D. Seidman, J. A. Smith and K. Struhl, eds])에 기재되어 있는 바와 같이, 당업계에 잘 알려져 있다.

PCR 기법 또한 표적 뉴클레오티드 서열 내로 돌연변이를 도입시키는데 사용될 수 있다. 예를 들면, PCR 프라이머는 표적화된 서열 내로 삽입, 결실, 또는 점 돌연변이를 도입시키기 위해 디자인될 수 있다. 그러한 방법은 당업계에서 잘 이해되고 있다.

상기 기법들은 식물에서 에틸렌 반응성을 감소시키는 기타 다른 방법들과 조합될 수 있다. 예를 들면, 구체화된 프로모터를 사용함으로써 숙련인은 외인성 에틸렌 수용체 (예를 들어, ERS1, ERS2, ETR1, ETR2, 또는 EIN4)의 발현을 지시할 수 있고, 바람직한 표현형 특징, 예를 들어, 녹색 지속성 특질을 갖는 식물을 생산할 수 있다. 숙련인은 구성적, 유도성, 조직 특이성이든 간에 각종의 공지된 프로모터로부터 선택할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 에틸렌 감수성은 기능성 에틸렌 수용체의 발현을 증가시키는 방법을 사용함으로써 감소된다. 추가의 바람직한 실시태양에서, 에틸렌 감수성은 내인성 에틸렌 수용체의 발현을 감소시키는 방법을 사용함으로써 감소된다. 이러한 방법들은 미국 특허 출원 번호 제10/876,086호 (그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에 상세히 기재되어 있다.

D. 본 발명에 사용되는 핵산 단리

몇몇 실시태양에서, 본 발명은 에틸렌 수용체 단백질을 코딩하는 단리된 핵산, 또는 그의 돌연변이화된 변형물을 제공한다. 단리된 핵산은 에틸렌 수용체 유전자의 야생형 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 90％ 동일하다. 하나의 실시태양에서, 단리된 핵산은 지 메이스 에틸렌 수용체로부터 유래된 서열을 포함한다. 예시적인 실시태양에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 1, 3, 또는 5와 적어도 90％, 및 더욱 전형적으로 95％, 99％, 또는 100％ 동일하다. 다른 실시태양에서, 전장의 에틸렌 수용체 단백질보다 짧은 절단 돌연변이체가 사용될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 절단 돌연변이체는 N 말단 막투과 도메인을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 절단 돌연변이체는 대략적으로 (서열 2의 아미노산 1-110을 코딩하는) 서열 1의 뉴클레오티드 1-330을 포함한다. 또다른 바람직한 실시태양에서, 절단 돌연변이체는 (각각, 서열 4 및 6의 아미노산 1-147을 코딩하는) 서열 3 또는 5의 1-441을 포함한다.

본 발명에 사용되는 핵산을 단리시키는 것은 다수의 기법에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들면, 또다른 식물 종 중의 에틸렌 수용체 유전자에 대해 공지된 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 원하는 식물 종으로부터 유래된 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리 중의 원하는 유전자를 동정할 수 있다. 게놈 라이브러리를 작제하기 위해 예를 들면, 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 무작위 단편화함으로써 큰 게놈 DNA 분절을 생성하고, 벡터 DNA와 결찰시켜 적절한 벡터로 패킹될 수 있는 연쇄체(concatemer)를 형성할 수 있다. 배-특이 cDNA의 라이브러리를 제조하기 위해 배로부터 mRNA를 단리시키고, 상기 mRNA로부터 유전자 전사체를 함유하는 cDNA 라이브러리를 제조한다.

이어서, 클로닝된 에틸렌 수용체 유전자의 서열에 기초한 프로브를 사용하여 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 프로브를 사용하여 게놈 DNA 또는 cDNA 서열과 혼성화시킴으로써 동일하거나 다른 식물 종내 존재하는 상동성 유전자를 단리시킬 수 있다.

별법으로, 관심이 대상이 되는 핵산은 증폭 기법을 사용하여 핵산 샘플로부터 증폭시킬 수 있다. 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기술을 사용하여 mRNA로부터, cDNA로부터, 게놈 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리로부터 직접 유전자 서열을 증폭시킬 수 있다. 예를 들면, 발현시키고자 하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 클로닝하는데, 샘플 중 원하는 mRNA의 존재 여부를 검출하기 위한 프로브로서 핵산을 사용하는데, 핵산의 서열 분석을 위해, 또는 기타 다른 목적을 위해 PCR 및 기타 다른 시험관내 증폭 방법 또한 사용될 수 있다.

식물 조직으로부터 유래된 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 동정하는데 적절한 프라이머 및 프로브는 공지된 에틸렌 수용체 단백질의 서열 비교로부터 생성한다. PCR에 대한 일반적인 개요에 대해서는 문헌 [PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. (Innis, M., Gelfand, D., Sninsky, J. and White, T., eds.), Academic Press, San Diego (1990)]을 참조한다. 증폭 조건은 프라이머의 길이, 프라이머와 표적 서열 간의 동일성 정도, 및 증폭시키고자 하는 표적 서열의 길이를 비롯한 여러 인자에 따라 달라진다. 전형적인 반응 조건은 하기와 같다. 반응 성분: 10 mM 트리스 HCl (pH 8.3), 50 mM 염화칼륨, 1.5 mM 염화마그네슘, 0.001％ 젤라틴, 200 μM dATP, 200 μM dCTP, 200 μM dGTP, 200 μM dTTP, 0.4 μM 프라이머, 및 100 유니트/mL Taq 폴리머라제. 프로그램: 3분 동안 96℃; 45초 동안 96℃, 60초 동안 50℃, 60초 동안 72℃ (30회 반복)에 이어; 5분 동안 72℃.

폴리뉴클레오티드는 또한 기술 문헌에 기재되어 있는 바와 같이, 잘 알려져 있는 기법에 의해 합성될 수 있다. 예를 들어, 문헌 ([Carruthers et al., Cold Spring Harbor Symp . Quant . Biol. 47:411-418 (1982)], 및 [Adams et al., J. Am . Chem. Soc. 105:661 (1983)])을 참조한다. 이어서, 상보성 가닥을 합성하고 적절한 조건하에서 가닥을 함께 어닐링함으로써, 또는 적절한 프라이머 서열과 함께 DNA 폴리머라제를 사용하여 상보성 가닥을 추가함으로써 이중 가닥 DNA 단편을 수득할 수 있다.

본 발명의 유전자 서열은 서열 1, 3, 및 5를 비롯한 핵산 서열, 및 서열 2, 4, 및 6을 비롯한 단백질 서열을 사용한 분석에 의해 동정되고 특징이 규명된 유전자 및 유전자 생성물을 포함한다. 본 발명에 사용되는 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 서열 1, 3, 및 5와 실질적인 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 본 발명에 사용되는 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 서열 2, 4, 및 6과 실질적인 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 코딩하는 것을 포함한다.

일단 상기 기술된 방법을 사용하여 핵산을 단리시키고 나면, 표준 방법을 사용하여 핵산이 에틸렌 수용체 단백질을 코딩하는지 여부를 측정할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 사용하여 녹색 지속성 특질을 갖는 트랜스제닉 식물을 생산할 수 있다. 예를 들면, 서열 2, 4, 또는 6과 동일하거나, 실질적으로 동일한 에틸렌 수용체 폴리펩티드, 또는 그의 절단 돌연변이체의 발현이 증진 또는 증가된 트랜스제닉 식물은 식물 내에서 변경된 에틸렌 과정, 예를 들어, 지연된 노화와 관련이 있는 표현형을 나타낼 것이다.

숙련인은 표준 방법을 사용하여 예를 들면, 에틸렌 수용체 폴리펩티드를 코딩할 것으로 판단되는 추정 핵산 서열의 서열과 에틸렌 수용체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 서열을 비교함으로써 추정 핵산이 실제 에틸렌 수용체 폴리펩티드를 코딩하는지 여부를 측정할 수 있다. 에틸렌 수용체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 예를 들어, 서열 1, 3, 또는 5와 동일하거나, 실질적으로 동일한 서열, 또는 그의 절단 돌연변이체를 포함하는 핵산이 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다.

E. 재조합 벡터 제조

본 발명은 에틸렌 수용체 폴리펩티드 서열을 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함하는 재조합 발현 카세트를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 에틸렌 수용체는 ERS, 예를 들면, 서열 1로 제시되는 ERS1 뉴클레오티드, 또는 서열 1의 절단 돌연변이체이다. 몇몇 실시태양에서, 에틸렌 수용체는 ETR, 예를 들면, 서열 3 또는 5로 제시되는 ETR2 뉴클레오티드, 또는 서열 3 또는 5의 절단 돌연변이체이다.

단리된 서열을 상기 기법에서 사용하기 위해 식물 세포의 형질전환에 적합한 재조합 DNA 벡터를 제조한다. 매우 다양한 고등식물 종을 형질전환시키는 기법은 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌 [Weising et al., Ann . Rev . Genet. 22:421-477 (1988)]과 같은 기술 문헌 및 과학 문헌 상에 기재되어 있다. 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열, 예를 들면, 전장의 단백질을 코딩하는 cDNA 서열은, 의도한 형질전환된 식물의 조직 내에서 유전자로부터 서열의 전사를 지시하는 전사 및 번역 개시 조절 서열과 조합되는 것이 바람직할 것이다.

예를 들면, 과다발현을 위해서는 재생 식물의 모든 조직에서 유전자의 발현을 지시하는 식물 프로모터 단편이 사용될 수 있다. 그러한 프로모터를 본원에서는 "구성적" 프로모터라 지칭하며, 이는 대부분의 환경 조건 및 발생 또는 세포 분화 단계하에서 활성을 띤다.

별법으로, 식물 프로모터는 특정 조직 (조직-특이 프로모터, 기관-특이 프로모터) 또는 특정 환경 조건 (유도성 프로모터)에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현을 지시할 수 있다.

적절한 폴리펩티드 발현을 원하는 경우, 코딩 부위 3'-말단에 위치하는 폴리아데닐화 부위를 포함하여야 한다. 폴리아데닐화 부위는 천연 유전자, 각종 다른 식물 유전자, 또는 T-DNA로부터 유래될 수 있다.

본 발명의 유전자로부터 유래된 서열 (예를 들어, 프로모터 또는 코딩 부위)를 포함하는 벡터는 전형적으로 식물 세포에 선별가능한 표현형을 부여하는 마커 유전자를 포함할 것이다. 예를 들면, 마커는 살생제 내성, 특히, 항생제 내성, 예로서, 카나마이신, G418, 블레오마이신, 하이그로마이신에 대한 내성, 또는 제초제 내성, 예로서, 글리포세이트, 클로로설퍼론 또는 글루포시네이트에 대한 내성을 코딩할 수 있다.

본 발명의 핵산 서열, 예를 들어, 에틸렌 수용체 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 식물 세포에서 재조합적으로 발현되어 내인성 식물 전사 인자의 수준을 증진 및 증가시킨다. 예를 들면, 본 발명의 에틸렌 수용체 핵산 서열은 식물 세포에서 재조합적으로 발현되어 내인성 에틸렌 수용체 폴리펩티드의 수준을 증진 및 증가시킨다. 각종의 상이한 발현 작제물, 예로서, 식물 세포의 형질전환에 적합한 발현 카세트 및 벡터가 제조될 수 있다. 매우 다양한 고등식물 종을 형질전환시키는 기법은 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌 [Weising et al., Ann . Rev . Genet. 22:421-477 (1988)]과 같은 기술 문헌 및 과학 문헌 상에 기재되어 있다. 본 발명에 기술된 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열, 예를 들어, 전장의 에틸렌 수용체 단백질을 코딩하는 cDNA 서열은 의도한 형질전환된 식물의 조직 내에서 전사 시간, 조직 유형 및 수준을 지시하는 시스-작용 (프로모터 및 인핸서) 전사 조절 서열과 조합될 수 있다. 번역 제어 요소 또한 사용될 수 있다.

본 발명은 몇몇 실시태양에서는 식물에서 코딩 서열의 전사를 유도할 수 있는 프로모터에 작동가능하게 연결된, 에틸렌 수용체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 제공한다. 프로모터는 예를 들어, 식물 또는 바이러스 공급원으로부터 유래될 수 있다. 프로모터는 예를 들어, 구성적으로 활성을 띠거나, 유도성, 또는 조직 특이성일 수 있다. 본 발명의 재조합 발현 카세트, 벡터, 트랜스제닉을 작제할 때, 예를 들면, 식물 또는 동물의 조직 중 일부 또는 전체에서 유전자 발현이 차별적으로 이루어질 수 있도록 하기 위해 상이한 프로모터를 선택하여 사용할 수 있다. 전형적으로, 상기 논의된 바와 같이, 본원에 기술되어 있는 배-특이 유전자에 상응하는 게놈 클론의 5' 서열을 분석하여 원하는 프로모터를 동정한다.

1. 구성적 프로모터

예를 들어, 재생 식물의 세포 또는 조직과 같은 모든 형질전환된 세포 또는 조직에서 에틸렌 수용체 단백질을 코딩하는 핵산의 발현을 지시하는 프로모터 단편을 사용할 수 있다. 그러한 프로모터를 본원에서는 "구성적" 프로모터라 지칭하며, 이는 대부분의 환경 조건 및 발생 또는 세포 분화 단계하에서 활성을 띤다. 구성적 프로모터의 예로는, 식물을 감염시키는 바이러스로부터 유래된 것, 예로서, 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 전사 개시 부위 (예를 들어, 문헌 Dagless, Arch . Virol. 142: 183-191 (1997)] 참조); 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 T-DNA로부터 유래된 1'- 또는 2'-프로모터 (예를 들어, 문헌 ([Mengiste (1997) 상기 문헌 동일]; [O'Grady, Plant Mol . Biol . 29:99-108 (1995)]) 참조); 담배 모자이크 바이러스의 프로모터; 피그워트 모자이크 바이러스(Figwort mosaic virus)의 프로모터 (예를 들어, 문헌 [Maiti, Transgenic Res. 6: 143-156 (1997)] 참조); 액틴 프로모터, 예로서, 아라비돕시스 액틴 유전자 프로모터 (예를 들어, 문헌 [Huang, Plant Mol . Biol. 33: 125-139 (1997)] 참조); 알코올 데하이드로게나제 (Adh) 유전자 프로모터 (예를 들어, 문헌 [Millar, Plant Mol . Biol. 31:897-904 (1996)] 참조); 아라비돕시스로부터의 ACT11 (문헌 [Huang et al., Plant Mol . Biol. 33: 125-139 (1996)]), 아라비돕시스 로부터의 Cat3 (진뱅크 번호(GenBank No.) U43147, 문헌 [Zhong et al., Mol . Gen . Genet. 251: 196-203 (1996)]), 브라시카 내퓨스(Brassica napus)로부터 유래된 스테아로일-아실 운반체 단백질을 코딩하는 유전자 (진뱅크 번호 X74782, 문헌 [Solocombe et al., Plant Physiol . 104: 1167-1176 (1994)]), 옥수수로부터 유래된 GPc1 (진뱅크 번호 X15596, 문헌 [Martinez et al., J. Mol . Biol 208:551-565 (1989)]), 옥수수로부터 유래된 GPc2 (진뱅크 번호 U45855, 문헌 [Manjunath et al., Plant Mol . Biol. 33:97-112 (1997)]), 당업자에게 알려져 있는 각종 식물 유전자로부터 유래된 기타 다른 전사 개시 부위를 포함한다. 또한, 문헌 [Holtorf et al., Plant Mol . Biol . 29:637-646 (1995)]을 참조한다.

2. 유도성 프로모터

별법으로, 식물 프로모터는 환경 조건 또는 발생 조건을 변화시키는 영향력하에서 본 발명에 기술된 핵산, 예를 들어, 에틸렌 수용체 단백질을 코딩하는 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 유도성 프로모터에 의해 전사에 영향을 줄 수 있는 환경 조건의 예로는 혐기성 조건, 승온, 가뭄, 또는 빛의 존재 여부를 포함한다. 유도성 프로모터에 의해 전사에 영향을 줄 수 있는 발생 조건의 예로는 노화를 포함한다. 그러한 프로모터를 본원에서는 "유도성" 프로모터라 지칭한다. 예를 들면, 본 발명은 옥수수의 가뭄-유도성 프로모터 (문헌 [Busk (1997) 상기 문헌 동일]); 감자로부터의 한랭, 가뭄, 및 고염 유도성 프로모터 (문헌 [Kirch et al., Plant Mol Biol. 33:897 909 (1997)])를 포함한다. 발생 조건의 예로는 세포 노화 및 배발생을 포함한다. 예를 들면, 본 발명은 아라비돕시스의 노화 유도성 프로모터, SAG12, (문헌 [Gan and Amasino, Science 270: 1986-1988 (1995)]) 및 LEC1 (문헌 [Lotan et al., Cell, 93: 1195-1205 (1998)]), LEC2 (문헌 [Stone et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA 98: 11806-11811 (2001)), FUS3 (문헌 [Luerssen, Plant J. 15:755-764 (1998)]), AtSERK1 (문헌 [Hecht et al., Plant Physiol 127:803-816 (2001)]), 및 AGL15 (문헌 [Heck et al., Plant Cell 7: 1271-1282 (1995)])의 배발생 관련 프로모터를 포함한다.

별법으로, 식물 호르몬, 예로서, 옥신 또는 사이토카인에 노출되었을 때 유도되는 식물 프로모터를 사용하여 본 발명의 핵산을 발현시킨다. 예를 들면, 본 발명은 대두 (글리신 맥스 L.(Glycine max L.))의 옥신 반응 요소 E1 프로모터 단편 (AuxREs) (문헌 [Liu, Plant Physiol. 115:397-407 (1997)]); 옥신-반응성 아라비돕시스 GST6 프로모터 (이는 또한 살리실산 및 과산화수소에도 반응성을 띤다) (문헌 [Chen, Plant J. 10: 955-966 (1996)]); 담배로부터 유래된 옥신-유도성 parC 프로모터 (문헌 [Sakai, Plant Cell Physiol. 37:906-913 (1996)]); 식물 비오틴 반응 요소 (문헌 [Streit, Mol Plant Microbe Interact . 10:933-937 (1997)]); 및 스트레스 호르몬인 아브시스산에 반응성인 프로모터 (문헌 [Sheen, Science 274: 1900-1902 (1996)])를 포함한다. 본 발명은 또한 ARR5 (문헌 [Brandstatter and Kieber, Plant Cell 10: 1009-1019 (1998)]), ARR6 (문헌 [Brandstatter and Kieber, Plant Cell 10: 1009-1019 (1998)]), ARR2 (문헌 [Hwang and Sheen, Nature 413:383-389 (2001)])의 사이토카인 유도성 프로모터, ERF1의 에틸렌 반응성 프로모터 (문헌 [Solano et al., Genes Dev. 12:3703-3714 (1998)]), 및 XVE의 β-에스트라디올 유도성 프로모터 (문헌 [Zuo et al., Plant J 24:265-273 (2000)])를 사용할 수 있다.

예로서, 제초제 또는 항생제와 같이, 식물에 적용될 수 있는 화학 약제에 노출되었을 때 유도되는 식물 프로모터도 사용하여 본 발명의 핵산을 발현시킨다. 예를 들면, 벤젠설폰아미드 제초제 약해방지제에 의해 활성화되는 옥수수 In2 2 프로모터 (문헌 [De Veylder, Plant Cell Physiol. 38:568-577 (1997)]) 뿐만 아니라, 덱사메사손 적용에 의해 유도될 수 있는 글루코코티코이드 수용체 단백질 융합체의 프로모터 (문헌 [Aoyama, Plant J. 11:605-612 (1997)])가 사용될 수 있으며; 상이한 제초제 약해방지제를 적용시키면, 뿌리, 배수 조직, 및 정단 분열조직에서의 발현을 비롯한 별개의 유전자 발현 패턴이 유도된다. 기술된 핵산의 코딩 서열은 또한 예를 들어, 아베나 사티바 L.(Avena sativa L.) (귀리) 아르기닌 데카르복실라제 유전자를 함유하는 트랜스제닉 담배 식물에 대해 기재된 바와 같이 (문헌 [Masgrau, Plant J. 11:465-473 (1997)]), 예를 들면, 테트라사이클린 유도성 프로모터의 제어하에; 또는 살리실산 반응 요소의 제어하에 (문헌 [Stange, Plant J. 11: 1315-1324 (1997)]) 있을 수 있다.

3. 조직-특이 프로모터

별법으로, 식물 프로모터는 특정 조직 (조직-특이 프로모터)에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현을 지시할 수 있다. 조직 특이 프로모터는 식물 발생시 특정 시간에 특정 세포 또는 조직에서만, 예로서, 생장 조직 또는 생식 조직에서만 활성을 띠는 전사 제어 요소이다.

발생학적 제어하의 조직-특이 프로모터의 일례로는 오직 (또는 주로는 오직) 특정 조직, 예로서, 생장 조직, 예를 들어, 뿌리, 잎 또는 줄기, 또는 생식 조직, 예로서, 과실, 밑씨, 종자, 화분, 암술, 꽃, 꽃밥, 또는 임의의 배 조직에서만 전사를 개시하는 프로모터를 포함한다. 생식 조직-특이 프로모터는 예를 들어, 밑씨-특이, 배-특이, 내배유-특이, 주피-특이, 종자 및 종피-특이, 화분-특이, 꽃잎-특이, 꽃받침-특이, 꽃밥-특이 또는 그의 몇몇 조합일 수 있다.

적합한 종자-특이 프로모터는 하기 유전자로부터 유래된 것이다: 옥수수로부터 유래된 MAC1 (문헌 [Sheridan, Genetics 142: 1009-1020 (1996)]); 옥수수로부터 유래된 Cat3 (진뱅크 번호 L05934, 문헌 [Abler Plant Mol . Biol . 22: 10131-10138 (1993)]); 아라비돕시스로부터 유래된 비브파로우스-1(vivparous-1) (진뱅크 번호 U93215); 아라비돕시스로부터 유래된 atmyc1 (문헌 ([Urao, Plant Mol . Biol. 32:571-576 (1996)]; [Conceicao Plant 5:493-505 (1994)])); 브라시카 내퓨스로부터 유래된 napA 및 BnCysP1 (진뱅크 번호 J02798, 문헌 [Josefsson, JBL 26: 12196-12201 (1987)], [Wan et al., Plant J 30: 1-10 (2002)])); 및 브라시카 내퓨스로부터 유래된 napin 유전자 패밀리 (문헌 [Sjodahl, Planta 197:264-271 (1995)]). 과실 특이 프로모터로는 CYP78A9 유전자로부터 유래된 프로모터를 포함한다 (문헌 [Ito and Meyerowitz, Plant Cell 12: 1541-1550 (2000)]).

문헌 [Reiser, Cell 83:735-742 (1995)]에 기재되어 있는 밑씨-특이 BEL1 유전자 (진뱅크 번호 U39944) 또한 사용될 수 있다. 또한 문헌 [Ray, Proc . Natl . Acad. Sci . USA 91:5761-5765 (1994)]를 참조한다. 난세포 및 중심 세포 특이 FIE1 프로모터 또한 유용한 생식 조직-특이 프로모터이다.

꽃받침 및 꽃잎 특이 프로모터 또한 생식 조직-특이 방식으로 본 발명의 핵산을 발현시키는데 사용된다. 예를 들면, 아라비돕시스 꽃 호메오 유전자 APETALA1 (AP1)은 어린 꽃 원기에서 발현되고, 그 이후에는 꽃받침 및 꽃잎으로 국소화되는 추정 전사 인자를 코딩한다 (예를 들어, 문헌 ([Gustafson Brown, Cell 76: 131-143 (1994)]; [Mandel, Nature 360:273-277(1992)]) 참조). 꽃 윤생체에서 꽃받침 및 꽃잎의 정상적인 발생을 위해 필요한 꽃 호메오 유전자인 AP2에 대해 관련된 프로모터 또한 유용하다 (예를 들어, 문헌 ([Drews, Cell 65:991-1002 (1991)]; [Bowman, Plant Cell 3:749-758 (1991)]) 참조). 또다른 유용한 프로모터는, 발현이 꽃받침과 꽃잎 원기 사이의 연접부로 제한되는 것인 아라비돕시스의 비정형 꽃 기관 (ufo) 유전자의 발현을 제어하는 것이다 (문헌 [Bossinger, Development 122: 1093-1102 (1996)).

화분 특이 프로모터는 옥수수에서 동정되었다 (문헌 [Guerrero, Mol . Gen . Genet. 224: 161-168 (1990)]). 특이적으로 화분에서 발현된 기타 다른 유전자는 예를 들어, 문헌 ([Wakeley, Plant Mol . Biol. 37: 187-192 (1998)]; [Ficker, Mol. Gen . Genet. 257: 132-142 (1998)]; [Kulikauskas, Plant Mol . Biol. 34:809-814 (1997)]; [Treacy, Plant Mol . Biol. 34:603-611 (1997)])에 기재되어 있다.

암술 및 장각 종린, 화서 분열조직, 경엽, 및 줄기 및 꽃자루의 유관속계에 특이적인 프로모터로는 FUL 유전자로부터 유래된 프로모터 (문헌 [Mandel and Yanofsky, Plant Cell, 7: 1763-1771 (1995)])을 포함한다. 발생 중에 있는 심피, 태좌, 격벽, 및 밑씨에 특이적인 프로모터 또한 조직-특이 방식으로 LEC2 핵산을 발현시키는데 사용된다. 그러한 프로모터로는 SHP1 및 SHP2 유전자로부터 유래된 프로모터를 포함한다 (문헌 ([Flanagan et al. Plant J 10:343-353 (1996)], [Savidge et al., Plant Cell 7(6):721-733 (1995)])). 꽃밥 타피툼에 특이적인 프로모터는 TA29 유전자로부터 유래될 수 있다 (문헌 ([Goldberg et al., Philos Trans. R. Soc . Lond . B. Biol . Sci . 350:5-17 (1995)]).

기타 다른 적합한 프로모터는 배 저장 단백질을 코딩하는 유전자로부터 유래된 것을 포함한다. 예를 들면, 브라시카 내퓨스로부터 유래된 2S 저장 단백질을 코딩하는 유전자 (문헌 [Dasgupta, Gene 133:301-302 (1993)]); 아라비돕시스로부터 유래된 2s 종자 저장 단백질 유전자 패밀리; 브라시카 내퓨스로부터 유래된 올레이신 20 kD를 코딩하는 유전자 (진뱅크 번호 M63985); 대두로부터 유래된, 올레이신 A를 코딩하는 유전자 (진뱅크 번호 U09118), 및 올레이신 B를 코딩하는 유전자 (진뱅크 번호 U09119); 아라비돕시스로부터 유래된 올레이신을 코딩하는 유전자 (진뱅크 번호 Z17657); 옥수수로부터 유래된 올레이신 18 kD를 코딩하는 유전자 (진뱅크 번호 J05212) (문헌 [Lee, Plant Mol . Biol. 26: 1981-1987 (1994)]); 및 대두로부터 유래된, 황이 풍부한 저분자 단백질을 코딩하는 유전자 (문헌 [Choi, Mol Gen Genet. 246:266-268 (1995)])가 사용될 수 있다. 원하는 유전자 생성물이 과실에 위치하도록 유전자 발현을 지시하는데에는 토마토로부터 유래된 조직 특이 E8 프로모터가 특히 유용하다. 적합한 프로모터는 또한 관다발 조직에서 발현된 유전자로부터 유래된 것, 예로서, ATHB-8, AtPIN1, AtP5K1 또는 TED3 유전자를 포함할 수 있다 (문헌 ([Baima et al., Plant Physiol. 126:643-655 (2001)], [Galaweiler et al., Science 282:2226-2230 (1998)], [Elge et al., Plant J. 26:561-571 (2001)], [Igarashi et al., Plant Mol . Biol. 36:917-927 (1998)])).

과실 숙성, 잎의 노화 및 탈리현상, 및 그보다 정도는 덜 하지만, 꽃의 노화 및 탈리현상 동안에 활성을 띠는 토마토 프로모터가 사용될 수 있다 (문헌 [Blume, Plant J. 12:731-746 (1997)]). 기타 다른 프로모터의 일례로는 암술 특이 염기성 엔도키티나제를 코딩하는 감자 (솔라눔 투베로숨 L.(Solanum tuberosum L.)) SK2 유전자 중의 암술 특이 프로모터 (문헌 [Ficker, Plant Mol . Biol. 35:425-431 (1997)]); 트랜스제닉 알파파의 생장 정단 및 꽃 정단의 상피 조직에서 활성인, 완두콩 (피섬 새티범 cv. 알라스카(Pisum sativum cv. Alaska))으로부터 유래된 Blec4 유전자를 포함한다. 이는 활발하게 성장하는 새싹의 상피층으로 외래 유전자의 발현을 표적화하는데 유용한 도구가 된다.

본 발명의 방법에서 사용되는 핵산을 발현시키는데는 생장 조직, 예로서, 잎, 줄기, 뿌리 및 괴경에서 특이적으로 활성인 다양한 프로모터 또한 사용될 수 있다. 예를 들면, 감자 괴경의 주요 저장 단백질인 파타틴을 제어하는 프로모터가 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 ([Kim, Plant Mol . Biol. 26:603-615 (1994)]; [Martin, Plant J. 11:53-62 (1997)])). 뿌리에서 고도의 활성을 보이는, 아그로박테리움 리조제네스(Agrobacterium rhizogenes) 유래의 ORF13 프로모터 또한 사용될 수 있다 (문헌 [Hansen, Mol . Gen . Genet. 254:337-343 (1997)]). 기타 다른 유용한 생장 조직-특이 프로모터로는 다음을 포함한다: 메이저 타로토란 (콜로카시아 에스쿨렌타 L. 쇼트(Colocasia esculenta L. Schott)) 구경 단백질 패밀리로부터 유래된 글로불린을 코딩하는 유전자인 타린의 타린 프로모터 (문헌 [Bezerra, Plant Mol . Biol. 28: 137-144 (1995)]); 타로토란 구경 발생 동안 활성인 커큘린 프로모터 (문헌 [de Castro, Plant Cell 4: 1549-1559 (1992)]), 및 발현이 뿌리 분열조직 및 미성숙 중심주 부위로 국소화되는, 담배 뿌리 특이 유전자 TobRB7에 대한 프로모터 (문헌 [Yamamoto, Plant Cell 3:371-382 (1991)]).

잎-특이 프로모터, 예로서, 리불로스 비포스페이트 카르복실라제 (RBCS) 프로모터가 사용될 수 있다. 예를 들면, 토마토 RBCS1, RBCS2 및 RBCS3A 유전자는 잎, 및 양지에서 성장한 묘목에서 발현되는데, 오직 RBCS1 및 RBCS2만이 발생 중에 있는 토마토 과실에서 발현된다 (문헌 [Meier, FEBS Lett. 415:91-95 (1997)]). 문헌 [Matsuoka, Plant J. 6:311-319 (1994)]에 기재되어 있는 바와 같이, 거의 전적으로 엽편 및 엽초 중 엽육 세포에서만 고수준으로 발현되는 리불로스 비스포스페이트 카르복실라제 프로모터가 사용될 수 있다. 또다른 잎-특이 프로모터는 광 수확 엽록소 a/b 결합 단백질 유전자 프로모터이다 (예를 들어, 문헌 [Shiina, Plant Physiol. 115:477-483 (1997)]; [Casal, Plant Physiol. 116: 1533-1538 (1998)]) 참조). 문헌 [Li, FEBS Lett. 379: 117-121 (1996)]에 기재되어 있는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) myb-관련 유전자 프로모터 (Atmyb5)는 잎-특이성이다. Atmyb5 프로모터는 발생 중에 있는 잎 모용, 탁엽, 및 어린 로제트 및 경엽의 엽연 상의 상피 세포, 및 미성숙 종자에서 발현된다. Atmyb5 mRNA는 수정과 배 발생의 16-세포기 사이에 출현하며, 이는 핵심 단계 넘어까지 지속된다. 문헌 [Busk, Plant J. 11: 1285-1295 (1997)]에 의해 옥수수에서 동정된 잎 프로모터 또한 사용될 수 있다.

또다른 부류의 유용한 생장 조직-특이 프로모터는 분열조직 (근단 및 정단) 프로모터이다. 예를 들면, 문헌 ([Di Laurenzio, Cell 86:423-433 (1996)]; 및, [Long, Nature 379:66-69 (1996)])에 기재되어 있는 바와 같이, 발생 중에 있는 정단 또는 근단 분열조직에서 활성인, "슈트메리스템리스(SHOOTMERISTEMLESS)" 및 "스케어크로우(SCARECROW)" 프로모터가 사용될 수 있다. 또다른 유용한 프로모터는, 발현이 분열조직 및 꽃 (암술머리 분비 구역, 다 익은 화분 곡물, 자성기 관다발 조직, 및 수정된 밑씨) 조직으로 제한되는, 3 하이드록시 3 메틸글루타릴 조효소 A 리덕타제 HMG2 유전자의 발현을 제어하는 것이다 (예를 들어, 문헌 [Enjuto, Plant Cell. 7:517-527 (1995)] 참조). 옥수수, 및 분열조직 특이 발현을 보이는 기타 다른 종으로부터 유래된 kn1 관련 유전자 또한 유용하다 (예를 들어, 문헌 ([Granger, Plant Mol . Biol. 31:373-378 (1996)]; [Kerstetter, Plant Cell 6: 1877-1887 (1994)]; [Hake, Philos. Trans . R. Soc . Lond . B. Biol . Sci. 350:45-51 (1995)]) 참조). 예를 들면, 아라비돕시스 탈리아나 KNAT1 또는 KNAT2 프로모터가 있다. 정단에서, KNAT1 전사체는 주로 정단 분열조직으로 국소화되고; 새싹 분열조직에서 KNAT1의 발현은 개화 조절시에 감소되고, 화서 줄기 피질로 국소화된다 (예를 들어, 문헌 [Lincoln, Plant Cell 6: 1859-1876 (1994)] 참조).

조직-특이 프로모터가 작동가능하게 연결된 서열의 발현을 표적 조직 이외의 조직에서 유도할 수 있다는 것을 숙련인은 인지할 것이다. 따라서, 본원에서 사용되는 바, 조직-특이 프로모터는 우선적으로는 표적 조직에서의 발현을 유도하지만, 또한 기타 다른 조직에서의 몇몇 발현도 유도할 수 있는 것이다.

또다른 실시태양에서, 본 발명에서 기술된 핵산은 전이 요소를 통해 발현된다. 이를 통해 구성적이지만, 주기적이되 빈번하지는 않은, 구성적으로 활성인 폴리펩티드의 발현이 일어난다. 본 발명은 또한 바이러스로부터 유래된 조직-특이 프로모터의 용도를 제공하는데, 이는 예를 들어, 토바모바이러스 서브게놈 프로모터 (문헌 [Kumagai, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 92: 1679-1683 (1995)]), 감염된 벼 식물의 체관부 세포에서만 오직 복제를 하는 벼 툰그로 간상 바이러스 (RTBV)의 프로모터로서, 강력한 체관부 특이 리포터 유전자 발현을 유도하는 것; 관다발 요소, 잎 엽육 세포, 및 근단에서 활성이 가장 높은 카사바 엽맥 모자이크 바이러스 (CVMV) 프로모터 (문헌 [Verdaguer, Plant Mol . Biol. 31: 1129-1139 (1996)])를 포함할 수 있다.

F. 트랜스제닉 식물 생산

추가의 측면에서, 본 발명은 에틸렌 수용체를 코딩하는 핵산 서열, 예로서, ERS (예를 들면, 서열 1로 제시함), 또는 ETR (예를 들면, 서열 3 또는 5)에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함하는 재조합 발현 카세트를 포함하되, 여기서, 단리된 핵산은 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 90％ 동일한 것인, 트랜스제닉 식물을 제공한다. 별법으로, 단리된 핵산은 서열 1, 3, 또는 5의 절단 돌연변이체이다.

본 발명의 DNA 작제물은 다양한 종래 기법에 의해 원하는 식물 숙주의 게놈 내로 도입될 수 있다. 예를 들면, DNA 작제물은 예로서, 식물 세포 원형질체의 전기천공 및 미세주입과 같은 기법을 사용하여 식물 세포의 게놈 DNA 내로 직접 도입될 수 있거나, DNA 작제물은 예를 들어, DNA 입자 충격법과 같은 유전자총법을 사용하여 식물 조직으로 직접 도입될 수 있다.

미세주입 기법은 당업계에 공지되어 있고, 과학 문헌 및 특허 문헌에 잘 기재되어 있다. 폴리에틸렌 글리콜 침전을 사용하여 DNA 작제물을 도입하는 것은 문헌 [Paszkowski et al. Embo J. 3:2717-2722 (1984)]에 기재되어 있다. 전기천공 기법은 문헌 [Fromm et al. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 82:5824 (1985)]에 기재되어 있다. 유전자총 형질전환 기법은 문헌 [Klein et al. Nature 327:70-73 (1987)]에 기재되어 있다.

별법으로, DNA 작제물은 적합한 T-DNA 측면에 위치하는 부위와 조합되어 종래 아그로박테리움 투메파시엔스 숙주 벡터로 도입될 수 있다. 아그로박테리움 투메파시엔스 숙주의 병원성 기능은 본 식물 세포가 세균에 의해 감염되었을 때에 작제물 및 인접 마커를 식물 세포 DNA 내로 삽입하는 것을 지시할 것이다. 무력화 및 2원 벡터의 사용을 비롯한, 아그로박테리움 투메파시엔스-매개 형질전환 기법도 과학 문헌에 잘 기재되어 있다. 예를 들면, 문헌 ([Horsch et al. Science 233:496-498 (1984)], 및 [Fraley et al. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 80:4803 (1983)] 및 [Gene Transfer to Plants, Potrykus, ed. (Springer-Verlag, Berlin 1995)])을 참조한다.

상기 형질전환 기법들 중 어느 것에 의해 유도된 형질전환된 식물 세포를 배양함으로써 형질전환된 유전자형을 갖고, 이에 따라 예를 들면, 파르네실트랜스퍼라제 활성 감소와 같은 원하는 표현형을 갖는 전체 식물체를 재생시킬 수 있다. 그러한 재생 기법은 조직 배양 성장 배지 중의 특정 식물 호르몬에 의존하며, 전형적으로는 원하는 뉴클레오티드 서열과 함께 도입된 살생제 및/또는 제초제 마커에 의존한다. 배양된 원형질체로부터의 식물 재생은 문헌 ([Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983]; 및 [Binding, Regeneration of Plants , Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985])에 기재되어 있다. 재생체는 또한 식물 캘러스, 외식편, 기관, 또는 그의 일부로부터 수득할 수 있다. 그러한 재생 기법은 일반적으로 문헌 [Klee et al., Ann. Rev, of Plant Phys. 38:467-486 (1987)]에 기재되어 있다.

본 발명의 핵산은 옥수수를 비롯한, 본질적으로 임의의 식물에 원하는 특질을 부여하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 아나카르디움(Anacardium) 속, 아라키스(Arachis) 속, 아스파라거스(Asparagus) 속, 아트로파(Atropa) 속, 아베나(Avena) 속, 브라시카(Brassica) 속, 클라미도모나스(Chlamydomonas) 속, 클로렐라(Chlorella) 속, 시트러스(Citrus) 속, 시트룰루스(Citrullus) 속, 캡시컴(Capsicum) 속, 카르타무스(Carthamus) 속, 코코스(Cocos) 속, 코페아(Coffea) 속, 쿠쿠미스(Cucumis) 속, 쿠쿠르비타(Cucurbita) 속, 시르토미움(Cyrtomium) 속, 다우쿠스(Daucus) 속, 엘라에이스(Elaeis) 속, 프라그리아(Fragaria) 속, 글리신(Glycine) 속, 고시피움(Gossypium) 속, 헬리안투스(Helianthus) 속, 헤테로칼리스(Heterocallis) 속, 호르데움(Hordeum) 속, 히오스키아무스(Hyoscyamus) 속, 렉투카(Lactuca) 속, 라미나리아(Laminaria) 속, 리눔(Linum) 속, 로리움(Lolium) 속, 루피너스(Lupinus) 속, 라이코페르시콘(Lycopersicon) 속, 마크로키스티스(Macrocystis) 속, 말루스(Malus) 속, 마니호트(Manihot) 속, 마조라나(Majorana) 속, 메디카고(Medicago) 속, 네레오키스티스(Nereocystis) 속, 니코티아나(Nicotiana) 속, 올레아(Olea) 속, 오리자(Oryza) 속, 오스먼다(Osmunda) 속, 파니에움(Panieum) 속, 판네세툼(Pannesetum) 속, 페르세아(Persea) 속, 파세오루스(Phaseolus) 속, 피스타키아(Pistachia) 속, 피숨(Pisum) 속, 파이루스(Pyrus) 속, 폴리포디움(Polypodium) 속, 프루너스(Prunus) 속, 프테리디움(Pteridium) 속, 라파누스(Raphanus) 속, 리시누스(Ricinus) 속, 세칼레(Secale) 속, 세네시오(Senecio) 속, 시나피스(Sinapis) 속, 솔라눔(Solanum) 속, 소르굼(Sorghum) 속, 테오브로무스(Theobromus) 속, 트리고넬라(Trigonella) 속, 트리티쿰(Triticum) 속, 비시아(Vicia) 속, 비티스(Vitis) 속, 비그나(Vigna) 속, 및 지(Zea) 속으로부터의 종을 비롯한, 매우 광범위한 식물에 대한 용도를 갖는다.

G. 본 발명의 트랜스제닉 식물 검출

본 발명은 식물에서 에틸렌 수용체 활성을 조정하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 본 방법은 추가로 그의 생식 식물 구조에서 노화가 지연된 표현형을 갖는 식물을 선별하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 생식 구조는 종자이다. 몇몇 실시태양에서, 표현형은 단일 종자 내 존재하는 여러 개의 배이다. 몇몇 실시태양에서, 작제물은 유성 교배에 의해 도입된다.

몇몇 실시태양에서, 스크리닝하는 것은 추가로 원하는 표현형을 갖는 식물을 검출하는 것을 포함한다. 예를 들면, 식물의 광합성 수명이 영향을 받았는지 여부를 측정하기 위해 잎 색깔을 조사할 수 있다. 광합성 생활사가 연장된 식물은 야생형 식물과 비교하였을 때, 녹색으로 지속되는 기간이 더욱 장기화된 잎을 특징으로 한다. 추가로, 잘 알려져 있는 기법을 사용하여 엽록소 수준 및 CO₂ 동화를 측정할 수 있다. 식물 생장 및 생식 구조의 크기를 조사하여 그것이 야생형 식물의 것보다 더 큰지 또는 더 작은지 여부를 측정할 수 있다. 본 발명의 트랜스제닉 식물은 더 큰 과실, 밑씨, 종자, 화분, 배 조직, 꽃, 꽃의 일부분, 예로서, 암술, 수술, 꽃받침, 꽃잎, 심피, 잎, 줄기, 괴경, 뿌리, 관다발 조직, 관다발 이전 조직 또는 뿌리 또는 줄기 분열조직을 가질 수 있다. 가뭄 내성 증가에 대하여 생성된 트랜스제닉 식물을 분석할 수 있다. 가뭄 내성 증가를 분석하는 방법은 공지되어 있으며, 이는 트랜스제닉 식물의 증산 속도, 기공 전도도, 탈리된 잎 분석법에서 수분 손실율을 특정하거나, 잎 팽창압력을 조사하는 것을 포함한다. 증산 속도가 감소된 트랜스제닉 식물은 예를 들면, 증가된 가뭄 내성을 갖는다.

에틸렌 감수성이 감소된 식물은 또한 고밀도로 성장할 수 있는 식물의 능력을 시험함으로써 선별될 수 있다. 이러한 에틸렌 내성 표현형을 갖는 식물은 선별 과정과는 상관없이 고밀도로 식재하는 것이 이롭다. 유사하게, 에틸렌 내성 표현형을 갖는 식물은 선별 과정과는 상관없이 가뭄 조건하에서 식재하는 것이 이롭다.

에틸렌 감수성이 감소된 식물은 또한 바이오마커, 예를 들어, 마커 유전자의 존재 여부를 검출함으로써 선별될 수 있다. 마커 유전자는 일반적으로, 즉시 검출될 수는 없는 녹색 지속성 표현형과 함께 동시에 분리되는 것으로서 용이하게 검출될 수 있는 표현형의 근원이 된다.

에틸렌 감수성은 또한, 배축의 방사상 확장, 뿌리 및 배축 신장 저해, 및 정단 후크 비대 생장을 포함하는, "3중 반응" 표현형으로 관찰될 수 있다 (문헌 [Neljubow (1901), Pflanzen Beih. Bot. Zentralbl., 10: 128-139]). 구성적 에틸렌 신호전달을 유발하는 돌연변이체는 야생형 식물과 비교하여 신장 감소를 특징으로 한다 (문헌 ([Guzman and Ecker (1990), Plant Cell, 2:513-523]; [Kieber et al. (1993) Cell 72:427-441])).

반대로, 에틸렌 비감수성은 암기-유도성의 엽록소 손실 지연 및/또는 식물 크기 증가로 관찰될 수 있다. 에틸렌 비감수성 식물은 심지어 최적의 조건하에서 성장한 야생형 식물, 즉, 폐쇄된 성장 설비에서 축적될 수 있는 미량의 에틸렌도 존재하지는 조건하에서 성장한 야생형 식물과 비교하였을 때에도 크기는 더 클 수 있다. 그러나, 에틸렌 반응은 식물 종 및 환경 조건에 따라 다르다는 것을 당업자는 인지할 것이다. 녹색 지속성 표현형은 편리하에 표준 분석법을 사용함으로써 분석할 수 있다. 예를 들면, 암기-유도성 노화 분석법을 사용할 수 있다. 예로서, 분석법은 전형적으로 1주 동안 식물에 그대로 잎을 부착시킨 상태로 잎을 쉬딩하는 것을 포함한다. 빛이 존재하지 않으면 잎 노화가 유도되는데, 이는 본 발명의 식물에서 있어서 대조군과 비교하면 지연될 수 있다.

예를 들어, 식물내 트랜스제닉 작제물, 또는 트랜스제닉 핵산 또는 단백질 서열 상에 삽입된 리포터 유전자와 같은 바이오마커의 발현을 검출하는 것과 같이, 트랜스제닉 식물을 검출하는 생화학적 수단 또한 잘 알려져 있다. 예를 들어, 노던 블롯, PCR, 웨스턴 블롯, 및 활성 분석법과 같이, mRNA 및 단백질을 검출하고 정량하는 수단이 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 발현 카세트를 식물 내로 도입한 후, 식물을 트랜스진 존재 여부에 대해 스크리닝하고, 근교계 또는 잡종계로 교배시킨다. 이어서, 자손 식물을 트랜스진 존재 여부에 대해 스크리닝하고, 자가-수분시킨다. 자가-수분된 식물로부터의 자손을 성장시킨다. 생성된 트랜스제닉 식물을 변경된 에틸렌-관련 과정과 관련이 있는 표현형 특징들, 예를 들어, 녹색 지속성 특질 또는 노화 지연과 관련이 있는 특징들 중 임의의 것에 대하여 조사할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 방법을 사용하여 본 발명에 기술된 핵산 또는 단백질의 저해는 생장 또는 생식 식물 구조의 세포에서 노화를 지연시킬 수 있다.

본원에 기술된 실시예 및 실시태양은 단지 예시 목적이며, 이러한 견지에서 다양한 수정 또는 변형이 당업자에게 제안될 것이며, 이는 본 출원의 정신 및 범위와, 첨부된 특허청구범위의 범주 내에 포함되어야 한다는 것을 이해하여야 한다. 본원에서 인용된 모든 출원, 특허, 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다.

실시예

하기에 간략히 기술되어 있는 방법에 표준 방법을 사용하였다.

실시예 1: 지 메이스에서의 아라비돕시스 etr1 -1 발현이 에틸렌 반응을 지연시킨다

작제물 디자인 및 식물 형질전환

아라비돕시스 etr1-1 돌연변이체는 앞서 기술된 바 있다. 이는 에틸렌 비감수성을 유발하는 우성 음성 돌연변이체 에틸렌 수용체이다. 문헌 [Gordon-Kamm et al. (1990), Plant Cell, 2: 603-618]에 기재되어 있는 바와 같이, 배발생 A 188 X B73 (HiII) 캘러스의 입자 충격법에 의해 pACH18 중 옥수수 유비퀴틴 (Ub) 프로모터 제어하에서 아라비돕시스 etr1-1을 함유하는 트랜스제닉 옥수수 (문헌 [Christensen and Quail (1996), Transgenic Res., 5: 213-218])를 생성하였다. bar 유전자로 공-형질전환시켜 형질전환된 캘러스에 대해 비알라포스 선별하였다 (문헌 [De Block et al. (1987) EMBO J. 6: 2513-2518]). PCR을 사용함으로써 Ub-etr1-1 작제물을 함유하는 재생체를 확인하였다.

결과

에틸렌 비감수성 상태를 도입하는 것이 옥수수에서 에틸렌-매개 이벤트를 변경시킬 수 있는지 여부를 측정하기 위해 옥수수 유비퀴틴 (Ub) 프로모터의 제어하에 아라비돕시스 etr1 -1을 발현하는 트랜스제닉 옥수수 세포주를 온실 조건하에서 성장시켰다. PCR에 의해 etr1 -1 트랜스진을 수반하는 것으로 확인된 T₀ 자손의 잎은 성장 표현형이 변경된 것으로 나타났다. etr1 -1 트랜스진으로부터의 발현이 잎 노화 또는 녹색 지속성 표현형을 변경시켰는지 여부를 조사하기 위해 1주일 동안 성체 T₀ 세대 식물로부터의 잎 6 및 잎 7에 빛이 도달하지 않도록 식물에 그대로 잎을 부착시킨 상태로 상기 잎을 쉬딩하였다. 보통 빛이 존재하지 않으면 암기-유도성 노화로서 지칭되는 잎 노화가 유도되는데, 이것이 대개는 녹색 지속성 잠재능의 척도로서 사용된다.

etr1 -1을 발현하는 트랜스제닉 잎이 지연된 잎 노화를 나타내었는데, 이는 옥수수에서 에틸렌 비감수성 상태가 녹색 지속성 표현형을 유도한다는 것을 시사하는 것이다. 이러한 결과는, 예를 들어, 두번째 막투과 부위에서의 Cys→Tyr 돌연변이, 또는 효과가 유사한 기타 다른 돌연변이에 따른 우성 음성 돌연변이체 에틸렌 수용체의 발현을 통해 옥수수에서의 에틸렌 비감수성 상태를 조작하는 것이 에틸렌-매개 과정, 예를 들어, 잎 노화, 및 노화를 변경시킬 수 있다는 것을 입증하는 것이다.

실시예 2: 아라비돕시스에서의 우성 음성 ZmERS1 및 ZmETR2 발현이 에틸렌 비감수성을 유도한다

이어서, 본 발명자들은, 동일한 방식으로 아라비돕시스에서 돌연변이체 지 메이스 에틸렌 수용체의 발현이 에틸렌 비감수성을 유도할 수 있는지 여부를 측정하는 것에 착수하였다.

작제물 디자인 및 식물 형질전환

실시예 1에 기술한 방법에 따라 pBI121 작제물로 아라비돕시스를 형질전환시켰다. 작제물은 하기 코딩 서열들 중 하나에 작동가능하게 연결된 35S 프로모터를 포함하였다: ein2 -5 (문헌 [Alonso et. al. (1999) Science 284:2148-52]에 기재되어 있는 에틸렌 비감수성 아라비돕시스 돌연변이); 돌연변이체 ZmERS1; 또는 돌연변이체 ZmETR2 (ZmETR40). ZmERS1 및 ZmETR2 돌연변이체는 우성 음성 에틸렌 수용체 (비-에틸렌 결합)이며, 이 서열은 본원에 기술되어 있다. 야생형 식물을 에틸렌-감수성 대조군 (WT로 표시)으로 사용하였다. 에틸렌의 전구체인 ACC 상에서의 발아는 묘목 성장을 저해시킨다. 암실에서 20 μM ACC를 함유하는 배지 상에서 형질전환체를 발아시켜 에틸렌 비감수성 형질전환체를 스크리닝하였다. 3개의 독립된 ZmERS1 형질전환체 세포주 (MS1-11, MS2-12, 및 MS1-15로 표시) 및 3개의 독립된 ZmETR2 형질전환체 세포주 (MT2-4, MT2-5, 또는 MT2-9로 표시)를 추가 연구를 위해 선별하였다.

결과

돌연변이체 ZmETR2 및 ZmERS1 에틸렌 수용체가 에틸렌 비감수성 상태를 부여한다는 것을 나타내기 위해, 아라비돕시스에서 에틸렌 비감수성 상태를 화학적으로 부여하는 것인, 20 μM ACC를 함유하는 배지 또는 20 μM Ag를 함유하는 배지 상에서 돌연변이체 세포주를 발아시켰다. 상기 데이타는, 돌연변이체 ZmERS1 또는 ZmETR2를 발현하는 종자가 에틸렌에 대하여 고전적인 "3중 반응"을 보이지는 않지만, 정단 후크는 형성되지 않고, 길고 얇은 배축을 보였다는 점에서 에틸렌 비감수성이라는 것을 나타내는 것이다. 에틸렌 비감수성 돌연변이체, ein2 -5에 대해서 유사한 결과가 관찰되었다. 대조적으로, 야생형 묘목은 에틸렌에 대하여 고전적인 반응을 보였다. Ag의 존재하에서 WT 묘목 또한 에틸렌 비감수성이었다. 5일된 묘목에 대한 정량적 측정값을 표 1에 나타낸다 (달리 언급하지 않는 한, p < 0.001). 상기 데이타는 돌연변이체 ZmERS1 및 ZmETR2 에틸렌 수용체가 아라비돕시스에서 에틸렌 비감수성을 부여할 수 있다는 것을 나타낸다.

여러 범위의 ACC 농도에 걸쳐 부여받은 에틸렌 비감수성 수준을 조사하기 위해 하나의 ZmERS1 세포주 (MS1-11)와 하나의 ZmETR2 세포주 (MT2-9)를, 다양한 수준의 ACC (1.0 내지 20 μM)를 함유하는 배지 중에서 발아시켰다. 돌연변이체 에틸렌 수용체의 발현은 ACC 농도 범위에 걸쳐서 에틸렌 비감수성을 부여하였다. 보다 고농도의 ACC에서 이루어진 에틸렌 비감수성 수준은 일부 감소하기는 하였지만, 실질적으로 WT 묘목에서보다는 그 수준은 컸다. 정량적 측정값을 도 1에 나타낸다.

에틸렌 비감수성은 또한 명실에서 묘목을 20 μM ACC 상에서 발아시켰을 때에도 나타날 수 있다. WT 묘목은 비-확장형 자엽을 나타낸 반면, 돌연변이체 ZmERS1 또는 ZmETR2를 발현하는 세포주는 에틸렌 비감수성 돌연변이체 ein2 -5와 유사하였다. 이후 명실 10 μM ACC 상에서 성장시킨 경우, WT 묘목은 Ag 상에서 성장시킨 것보다 실질적으로 더 작은 반면, 돌연변이체 ZmERS1 또는 ZmETR2를 발현하는 세포주는 Ag 상에서 성장시킨 WT 묘목, 또는 ein2 -5 에틸렌 비감수성 돌연변이체와 유사하였다.

돌연변이체 ZmERS1 또는 ZmETR2를 발현하는 식물의 잎 크기는 더 컸는데, 이는 ein2 -5 및 etr1 -1 에틸렌 비감수성 돌연변이체와 유사하였다. 7주된 돌연변이체 ZmERS1 또는 ZmETR2를 발현하는 식물의 잎 노화와 녹색 지속성 표현형은 지연된 것으로 나타났으며, 이는 ein2 -5에 대해 관찰된 결과와 유사하였다. 4주째 분석하였을 때에는 엽록소 함량에 있어서 차이는 거의 없는 것으로 관찰되었다 (표 2). 그러나, 돌연변이체 ZmERS1 또는 ZmETR2를 발현하는 식물에서 개화가 약간 지연되는 것으로 나타났고, 그 결과, 잎 갯수는 증가한 것으로 나타났다.

이어서, 본 발명자들은, 반접합성 상태 대 동형접합성 상태로 존재할 때 에틸렌 비감수성 상태를 부여함에 있어 돌연변이체 ZmERS1의 발현이 완전히 우성을 띠는지를 측정하고자 하였다. ZmERS1 돌연변이체 (MS1-11) 동형접합체와 야생형 종자 사이의 교배를 실시하여 ZmERS1 돌연변이체에 대해 반접합성인 종자를 수득하였다. 돌연변이체 ZmERS1에 대한 동형접합성에 대하여 종자들을 시험하였다. 암실에서 5일 동안 20 μM ACC 중에서 식물을 성장시켰다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 상기 3중 반응 분석법에서 반접합성 묘목은 동형접합성 묘목만큼 에틸렌에 대하여 비감수성이었다 (p < 0.001). 반접합성 및 동형접합성 돌연변이체는 또한 명실 20 μM ACC 상에서 성장시켰을 때 동등하게 비감수성이었다.

서열 목록

서열 1

지 메이스 ERS1 -유사 코딩 서열 ( Cys → Tyr 65)

서열 2

지 메이스 ERS1 -유사 단백질 서열 ( Cys → Tyr 65)

서열 3

지 메이스 ETR2 -유사 ( ZmETR9 ) 코딩 서열 ( Cys → Tyr 102)

서열 4

지 메이스 ETR2 -유사 ( ZmETR9 ) 단백질 서열 ( Cys → Tyr 102)

서열 5

지 메이스 ETR2 -유사 ( ZmETR40 ) 코딩 서열 ( Cys → Tyr 102)

서열 6

지 메이스 ETR2 -유사 ( ZmETR40 ) 단백질 서열 ( Cys → Tyr 102)

SEQUENCE LISTING <110> Gallie, Daniel R. The Regents of the University of California <120> Increasing Grain Yield Through Targeted Reduction in Ethylene Signaling <130> 02307O-175710PC <140> WO PCT/US08/70507 <141> 2008-07-18 <150> US 60/950,853 <151> 2007-07-19 <160> 6 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1902 <212> DNA <213> Zea mays <220> <223> ERS-1 like dominant negative non-ethylene binding ethylene receptor mutant (Cys65 -> Tyr65) coding sequence <400> 1 atggacggat gcgattgcat agagccacta tggcctaccg atgatcttct cgtcaagtat 60 cagtacatct cagacttctt catagccctt gcgtacttct cgattccatt ggagctcata 120 tattttgtga agaagtcgtc cttcttccca tacagatggg tcctgatcca gtttggtgcg 180 tttatagttc tttatggggc aacccatctg ataaacctgt ggacgttcac cacacataca 240 aagaccgttg cgatggtcat gaccatagcg aagatttcta cagcagtcgt gtcctgtgca 300 actgctttga tgctcgttca tatcattccc gacttgttga gcgtgaaaac tagggagttg 360 ttcttgaaga ataaagctga ggagcttgat agagagatgg gacttataag gacgcaagag 420 gagactggta gacatgttag gatgcttaca catgaaatca gaagtactct tgatagacat 480 acaattttga agactactct cgttgagcta ggaaggacct tgggtctgga agaatgtgca 540 ttgtggatgc catctcgaag tggctcaagc cttcagcttt ctcatacttt gcgccaccag 600 attactgttg gatcatcggt gccaatgaat cttcctgtcg tcaatcaagt gttcagtagc 660 aaccgggcaa tcataatacc ccacacatct tctttggcgc gggttcgacc tcttgcaggg 720 cgatatgttc caccagaagt ggccgcagtc cgtgtacctc ttctacatct ttcaaacttt 780 caaataaatg attggcctga gctctcagca aaaagctttg caatcatggt tttgatgctt 840 ccatctgata gtgctagaaa attgcatgtg catgaattgg agctggttga ggtcgttgct 900 gatcaggtag cagttgcact atctcatgca gctattctcg aagagtccat gcgggcacgt 960 gatttactaa tggagcagaa tgttgccctg gatttagctc gaagagaggc tgagatggct 1020 atccgtgctc gcaatgattt cctagctgtt atgaatcacg aaatgagaac acccatgaat 1080 gcaataatag ccctttcctc cttgcttttg gaaactgagc ttactcctga gcagcgtcta 1140 atggtggaaa cagtactgaa aagcagcaat ttgttagcaa cactcatcaa tgatgttctg 1200 gatctttcca aactcgagga tggaagcctt gaactggaga ttaaagcatt caatcttcat 1260 gctgttttca aagaagtaat gggtttcatt aaaccaattg catctatcaa gaggctatct 1320 gtatcggtta tgttggcacc agatctgccg ttatgtgcaa ttggtgatga aaagagactc 1380 atgcaaacta ttctgaacat ctctggcaat gctgtaaagt ttaccaagga gggacacatc 1440 acgcttgtag cttccattgt gaaggctgac tctttgagag agttcagaac cccagaattt 1500 catccaactg caagtgatga acatttctat ttgaaagttc aggtaaaaga tacaggctgt 1560 ggagttagtc ctcaggatct acctcatgta ttcacaaagt ttgctcatcc tcaaagtgga 1620 ggaaaccgag ggtttaatgg tagtggtctt ggccttgcca tatgcaagag gtttgttagt 1680 cttatgggag ggcacatctg gatcgacagc gaaggaaccg gaagaggttg caccgcaaca 1740 ttcgtcatca agctcggcgt gtgtgacaac acaaacacct accaaaagca gctggttcct 1800 ctaatctggc caagcagtgc agactccaat ttgtctgctc cgaaagtgct gcccgacggg 1860 agaggatctg tttccctgaa atctcggtac caaagaagcg ta 1902 <210> 2 <211> 634 <212> PRT <213> Zea mays <220> <223> ERS-1 like dominant negative non-ethylene binding ethylene receptor mutant (Cys65 -> Tyr65) protein <400> 2 Met Asp Gly Cys Asp Cys Ile Glu Pro Leu Trp Pro Thr Asp Asp Leu 1 5 10 15 Leu Val Lys Tyr Gln Tyr Ile Ser Asp Phe Phe Ile Ala Leu Ala Tyr 20 25 30 Phe Ser Ile Pro Leu 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Ala Val Arg Val Pro Leu Leu His 245 250 255 Leu Ser Asn Phe Gln Ile Asn Asp Trp Pro Glu Leu Ser Ala Lys Ser 260 265 270 Phe Ala Ile Met Val Leu Met Leu Pro Ser Asp Ser Ala Arg Lys Trp 275 280 285 His Val His Glu Leu Glu Leu Val Glu Val Val Ala Asp Gln Val Ala 290 295 300 Val Ala Leu Ser His Ala Ala Ile Leu Glu Glu Ser Met Arg Ala Arg 305 310 315 320 Asp Leu Leu Met Glu Gln Asn Val Ala Leu Asp Leu Ala Arg Arg Glu 325 330 335 Ala Glu Met Ala Ile Arg Ala Arg Asn Asp Phe Leu Ala Val Met Asn 340 345 350 His Glu Met Arg Thr Pro Met Asn Ala Ile Ile Ala Leu Ser Ser Leu 355 360 365 Leu Leu Glu Thr Glu Leu Thr Pro Glu Gln Arg Leu Met Val Glu Thr 370 375 380 Val Leu Lys Ser Ser Asn Leu Leu Ala Thr Leu Ile Asn Asp Val Leu 385 390 395 400 Asp Leu Ser Lys Leu Glu Asp Gly Ser Leu Glu Leu Glu Ile Lys Ala 405 410 415 Phe Asn Leu His Ala Val Phe Lys Glu Val Met Gly Phe Ile Lys Pro 420 425 430 Ile Ala Ser Ile Lys Arg Leu Ser Val Ser Val Met Leu Ala Pro Asp 435 440 445 Leu Pro Leu Cys Ala Ile Gly Asp Glu Lys Arg Leu Met Gln Thr Ile 450 455 460 Leu Asn Ile Ser Gly Asn Ala Val Lys Phe Thr Lys Glu Gly His Ile 465 470 475 480 Thr Leu Val Ala Ser Ile Val Lys Ala Asp Ser Leu Arg Glu Phe Arg 485 490 495 Thr Pro Glu Phe His Pro Thr Ala Ser Asp Asp His Phe Tyr Leu Lys 500 505 510 Val Gln Val Lys Asp Thr Gly Cys Gly Ile Gly Pro Gln Asp Leu Pro 515 520 525 His Val Phe Thr Lys Phe Ala His Pro Gln Ser Gly Gly Asn Arg Gly 530 535 540 Phe Asn Gly Ser Gly Leu Gly Leu Ala Ile Cys Lys Arg Phe Val Ser 545 550 555 560 Leu Met Gly Gly His Ile Trp Ile Asp Ser Glu Gly Thr Gly Arg Gly 565 570 575 Cys Thr Ala Thr Phe Val Val Lys Leu Gly Val Cys Asp Asn Thr Asn 580 585 590 Thr Tyr Gln Gln Gln Leu Ile Pro Leu Val Trp Pro Ser Ser Ala Asp 595 600 605 Ser Asp Leu Arg Ala Pro Lys Pro Leu Pro Asp Gly Arg Gly Ser Thr 610 615 620 Pro Leu Lys Ser Arg Tyr Gln Arg Ser Val 625 630 <210> 3 <211> 2301 <212> DNA <213> Zea mays <220> <223> ETR2-like (ZmETR9) dominant negative non-ethylene binding ethylene receptor mutant 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ggattagaaa atcaaagggc 1680 tatctgttga gttcatcaag cagtcagata agtcagggat ccaaacccaa caattctgag 1740 atggggctta gcttcaatat gtgcaagaag attgtgcaga tgatgaatgg caatatttgg 1800 tcagtatcag attctaaaag catcggagaa actatcatgc tagtcctcca gttccagttg 1860 gaacctgtga ctccggtctc tggagcgtcc tcagatttgt acagatcatc cgcaattccc 1920 aactttaatg ggctcagagt cctccttgcg gacagcgact gcaccaaccg agctgtaact 1980 cacaggctcc tagagaagct tggttgccga gtcctttcgg tcgcttctgg cgtccaatgc 2040 atcagctcct tcgctgcgga gtcgtccttc cagctggtgg ttcttgatct tgacatgcag 2100 acgatggatg gattcgaagt agcccgcgcg atcaggaagt tcagtagcaa tagttggctg 2160 ccgttgatta ttgccctagc agcaagaatc gacgacaaca tccgggatcg ttgccagagg 2220 tcaggagtaa atggcctgat ccagaaaccg gtcacattag ccgcgctggg agatgaactg 2280 tatagagtcc ttcagaacaa t 2301 <210> 4 <211> 767 <212> PRT <213> Zea mays <220> <223> ETR2-like (ZmETR9) dominant negative non-ethylene binding ethylene receptor mutant (Cys102 -> Tyr102) protein <400> 4 Met Val Val Gly Thr Ala Leu Leu Arg Gly Val Ser Ser Ala Trp 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Ser Thr Met Ile Leu Thr His Gln Leu Arg Glu Arg Asp Ile Met 225 230 235 240 Asp Pro Gln Lys His Ser Ile Pro Ile Asp Asp Pro Asp Val Gln Glu 245 250 255 Ile Lys Ala Thr Lys Asp Ala Lys Val Leu Gly Pro Asp Ser Ala Leu 260 265 270 Gly Val Ser Ser Arg Ser Lys His Glu Ala Gly Pro Val Ala Ala Ile 275 280 285 Arg Met Pro Met Leu Arg Val Ser Asn Phe Lys Gly Gly Thr Pro Glu 290 295 300 Val Met Gln Thr Ser Tyr Ala Ile Leu Val Leu Val Leu Pro Asn Asp 305 310 315 320 Gly Ser Leu Gly Trp Gly Arg Arg Glu Leu Glu Ile Val Glu Val Val 325 330 335 Ala Asp Gln Val Ala Val Ala Leu Ser His Ala Ala Leu Leu Glu Glu 340 345 350 Ser Gln Leu Met Arg Glu Lys Leu Ala Glu Gln His Arg Asp Leu Leu 355 360 365 Gln Ala Lys Asp Glu Ala Met Arg Ala Gly Asp Ala Arg Asn Ser Phe 370 375 380 Gln Thr Ala Met Tyr Asp Gly Met Arg Arg Pro Met His Ser Ile Leu 385 390 395 400 Gly Leu Val Ser Met Met Gln Gln Glu Ser Met Asn Pro Glu Gln Arg 405 410 415 Leu Val Met Asp Ala Ile Ala Lys Thr Ser Ser Val Ala Ser Thr Leu 420 425 430 Met Asn Asp Val Met Gln Thr Ser Thr Met Asn Cys Glu His Leu Ser 435 440 445 Leu Val Arg Arg Pro Phe Asn Leu His Ser Phe Ile Lys Glu Val Val 450 455 460 Gly Val Val Arg Cys Leu Thr Gly Cys Lys Gly Val Glu Phe Glu Phe 465 470 475 480 Gln Val Glu Asn Ser Leu Pro Glu Arg Ile Ile Gly Asp Glu Lys Arg 485 490 495 Val Phe His Ile Val Leu His Met Val Gly Thr Leu Thr Asp Arg Cys 500 505 510 Asn Ala Gly Cys Ile Ser Leu Tyr Val Asn Val His Asn Glu Val Glu 515 520 525 Asp Arg His Asn His Asp Trp Met Leu Arg Arg Ala Asn Phe Ser Gly 530 535 540 Gly Tyr Val Cys Val Lys Phe Glu Ile Arg Ile Arg Lys Ser Lys Gly 545 550 555 560 Tyr Leu Leu Ser Ser Ser Ser Ser Gln Ile Ser Gln Gly Ser Lys Pro 565 570 575 Asn Asn Ser Glu Met Gly Leu Ser Phe Asn Met Cys Lys Lys Ile Val 580 585 590 Gln Met Met Asn Gly Asn Ile Trp Ser Val Ser Asp Ser Lys Ser Ile 595 600 605 Gly Glu Thr Ile Met Leu Val Leu Gln Phe Gln Leu Glu Pro Val Thr 610 615 620 Pro Val Ser Gly Ala Ser Ser Asp Leu Tyr Arg Ser Ser Ala Ile Pro 625 630 635 640 Asn Phe Asn Gly Leu Arg Val Leu Leu Ala Asp Ser Asp Cys Thr Asn 645 650 655 Arg Ala Val Thr His Arg Leu Leu Glu Lys Leu Gly Cys Arg Val Leu 660 665 670 Ser Val Ala Ser Gly Val Gln Cys Ile Ser Ser Phe Ala Ala Glu Ser 675 680 685 Ser Phe Gln Leu Val Val Leu Asp Leu Asp Met Gln Thr Met Asp Gly 690 695 700 Phe Glu Val Ala Arg Ala Ile Arg Lys Phe Ser Ser Asn Ser Trp Leu 705 710 715 720 Pro Leu Ile Ile Ala Leu Ala Ala Arg Ile Asp Asp Asn Ile Arg Asp 725 730 735 Arg Cys Gln Arg Ser Gly Val Asn Gly Leu Ile Gln Lys Pro Val Thr 740 745 750 Leu Ala Ala Leu Gly Asp Glu Leu Tyr Arg Val Leu Gln Asn Asn 755 760 765 <210> 5 <211> 2298 <212> DNA <213> Zea mays <220> <223> ETR2-like (ZmETR40) dominant negative non-ethylene binding ethylene receptor mutant (Cys102 -> Tyr102) coding sequence <400> 5 atggtggtgg gaacggcgcc gtgcggggtc tccgtctcct ccgtgtggat cctcctgctc 60 ctttcctccc tgctcctctc gccgtcggcg gcgtccgtcg atttcggcca ctgcggctgc 120 gacgacgccg acgacggcgc cctctcgagc acctacaaca tcctgcaatg ccagaaggtc 180 agcgacttcc tcatcgccgc ggcctacttc tccatcccgc tcgagctgct ctacttcgcc 240 acctgctccg accttttccc cctcaaatgg atcgtgctgc agttcggcgc cttcatcgtg 300 ctctacggcc tcacgcacct catcaccgtg ttcacctacg acccgcactc cttccacctc 360 gtgctcgccc tcaccgtcgc caagttcatg acggcactag tctccttcgc cacagccatc 420 acgctgctga cactgatacc gcagctcctg agggtgaagg tcagggaaaa cttcctggtg 480 aacaaggcac gtgagctgga ccgggaggtg gggatgatga aaatgaaaga agaggcgagc 540 tggcatgtgc gtatgctcac acaggagatc cgcaagtcgc tcgacaggca caccatcttg 600 tacaccacca tggttgagct ctcgaaagcg ctggaactgc agaattgtgc tgtctggatg 660 cccgatgaaa ccaggagcga gatgatctta actcatcagc caagggaaag ggatataatg 720 gaccagcaga actgctcgat tcctattgat gatccagatg ttcaagaaat aaaggctacc 780 aaggacgcaa aagttcttgg gccagattcg gcactagggg ttgctacccg caagcttgac 840 gtggggcctg tggctgcaat aaggatgccg atgttaaggg tgtcaaattt caaaggaggg 900 actccagaag tgatgcagac gagctatgct atcttggttc tggttttgcc taatgatggt 960 tcattggggt ggggtagaag agagttggag attgttgaag tagttgctga ccaagttgcg 1020 gtcgctttgt cacatgctgc actcctagag gagtctcagc tgatgcgaga gaaacttgct 1080 gagcagtata gggacttgct gcaggcaaag catgaagcca tgagggcagg ggaagctcgg 1140 aattccttcc agactgcaat gtacgacgga atgcgaaggc caatgcactc aatccttggt 1200 cttgtctcaa tgatgcaaca ggagagcatg aatccagagc aaagggttgt gatggatgcc 1260 attgccaaga caagcagtgt tgcgtccaca ctgatgaatg atgtgatgca aacatcgaca 1320 atgaactgtg agcacttgtc tttggtgagg aggccgttca atcttcattc ttttattaaa 1380 gaagctgttg gagtggtcag atgtctaact ggttgcaagg gtgtagagtt tgagtttcaa 1440 gtggataatt ctttgccaga aaggatcatt ggtgatgaga agagagtctt ccacattgtc 1500 ctgcacatgg taggcaccct aataaaccga tgtaatgtcg gctgtatctc gttatatgtc 1560 aatggtcata atgaggttga agagaggcat aatcatgact ggatgctgcg gagaacaaac 1620 ttctctgggg gctatgtttg tgtgaaattt gagattagga ttagaaaatc caaggactat 1680 cttttgagtt caaacggtca gataagtcat gggtccaaac caaacaattc tgagatgggg 1740 cttagcttca atatgtgcaa gaagattgtg cagatgatga acggcaacat ttggtcagta 1800 tcagattcta aaagcgttgg agaaaccatc atgctggtcc tccagttcca gctgcagcct 1860 ctgactgcgg tctcctccgc ggcgtcttca gacttgagcc gatcgtccgc aatccccaac 1920 ttcaacgggc tcagagtcct cctggcggac agcgacgaca ccaacagagc agtaacacac 1980 aggctcctgg agaagctcgg ctgccgggtc ctttcggtcg cctccggtgt ccaatgcacg 2040 agctccttcg ccgccgagcc gtccttccag ctggtggtcc tggacctcgc cttgcagagg 2100 acggacgggc tcgaagtggc ccgcgcgatc aggaagttca gtagcaatag ctggctgccg 2160 ctgatcgtcg ccctagctgc gaggatcgat gacaaggtcc gagacggatg ccagaggtcg 2220 gggataagcg gcctgatcca gaaaccggcc acgttagctg cgctgggaga tgagctgtat 2280 agggtccttc agaacagt 2298 <210> 6 <211> 766 <212> PRT <213> Zea mays <220> <223> ETR2-like (ZmETR40) dominant negative non-ethylene binding ethylene receptor mutant (Cys102 -> Tyr102) protein <400> 6 Met Val Val Gly Thr Ala Pro Cys Gly Val Ser Val Ser Ser Val Trp 1 5 10 15 Ile Leu Leu Leu Leu Ser Ser Leu Leu Leu Ser Pro Ser Ala Ala Ser 20 25 30 Val Asp Phe Gly His Cys Gly Cys Asp Asp Ala Asp Asp Gly Ala Leu 35 40 45 Ser Ser Thr Tyr Asn Ile Leu Gln Cys Gln Lys Val Ser Asp Phe Leu 50 55 60 Ile Ala Ala Ala Tyr Phe Ser Ile Pro Leu Glu Leu Leu Tyr Phe Ala 65 70 75 80 Thr Cys Ser Asp Leu Phe Pro Leu Lys Trp Ile Val Leu Gln Phe Gly 85 90 95 Ala Phe Ile Val Leu Tyr Gly Leu Thr His Leu Ile Thr Val Phe Thr 100 105 110 Tyr Asp Pro His Ser Phe His Leu Val Leu Ala Leu Thr Val Ala Lys 115 120 125 Phe Met Thr Ala Leu Val Ser Phe Ala Thr Ala Ile Thr Leu Leu Thr 130 135 140 Leu Ile Pro Gln Leu Leu Arg Val Lys Val Arg Glu Asn Phe Leu Val 145 150 155 160 Asn Lys Ala Arg Glu Leu Asp Arg Glu Val Gly Met Met Lys Met Lys 165 170 175 Glu Glu Ala Ser Trp His Val Arg Met Leu Thr Gln Glu Ile Arg Lys 180 185 190 Ser Leu Asp Arg His Thr Ile Leu Tyr Thr Thr Met Val Glu Leu Ser 195 200 205 Lys Ala Leu Glu Leu Gln Asn Cys Ala Val Trp Met Pro Asp Glu Thr 210 215 220 Arg Ser Glu Met Ile Leu Thr His Gln Pro Arg Glu Arg Asp Ile Met 225 230 235 240 Asp Gln Gln Asn Cys Ser Ile Pro Ile Asp Asp Pro Asp Val Gln Glu 245 250 255 Ile Lys Ala Thr Lys Asp Ala Lys Val Leu Gly Pro Asp Ser Ala Leu 260 265 270 Gly Val Ala Thr Arg Lys Leu Asp Val Gly Pro Val Ala Ala Ile Arg 275 280 285 Met Pro Met Leu Arg Val Ser Asn Phe Lys Gly Gly Thr Pro Glu Val 290 295 300 Met Gln Thr Ser Tyr Ala Ile Leu Val Leu Val Leu Pro Asn Asp Gly 305 310 315 320 Ser Leu Gly Trp Gly Arg Arg Glu Leu Glu Ile Val Glu Val Val Ala 325 330 335 Asp Gln Val Ala Val Ala Leu Ser His Ala Ala Leu Leu Glu Glu Ser 340 345 350 Gln Leu Met Arg Glu Lys Leu Ala Glu Gln Tyr Arg Asp Leu Leu Gln 355 360 365 Ala Lys His Glu Ala Met Arg Ala Gly Glu Ala Arg Asn Ser Phe Gln 370 375 380 Thr Ala Met Tyr Asp Gly Met Arg Arg Pro Met His Ser Ile Leu Gly 385 390 395 400 Leu Val Ser Met Met Gln Gln Glu Ser Met Asn Pro Glu Gln Arg Val 405 410 415 Val Met Asp Ala Ile Ala Lys Thr Ser Ser Val Ala Ser Thr Leu Met 420 425 430 Asn Asp Val Met Gln Thr Ser Thr Met Asn Cys Glu His Leu Ser Leu 435 440 445 Val Arg Arg Pro Phe Asn Leu His Ser Phe Ile Lys Glu Ala Val Gly 450 455 460 Val Val Arg Cys Leu Thr Gly Cys Lys Gly Val Glu Phe Glu Phe Gln 465 470 475 480 Val Asp Asn Ser Leu Pro Glu 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Ala Leu Gln Arg Thr Asp Gly Leu 690 695 700 Glu Val Ala Arg Ala Ile Arg Lys Phe Ser Ser Asn Ser Trp Leu Pro 705 710 715 720 Leu Ile Val Ala Leu Ala Ala Arg Ile Asp Asp Lys Val Arg Asp Gly 725 730 735 Cys Gln Arg Ser Gly Ile Ser Gly Leu Ile Gln Lys Pro Ala Thr Leu 740 745 750 Ala Ala Leu Gly Asp Glu Leu Tyr Arg Val Leu Gln Asn Ser 755 760 765

Claims (19)

1. (a) 서열 2, 서열 4, 및 서열 6으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 95％ 동일한 서열을 포함하며; (b) 그의 발현이 식물에서 녹색 지속성(staygreen) 표현형을 유도하는 비-에틸렌 결합 에틸렌 수용체 폴리펩티드를 코딩하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
2. 제1항에 있어서, 폴리펩티드 서열이 서열 2인 것인 폴리뉴클레오티드.
3. 제1항에 있어서, 폴리펩티드 서열이 서열 4인 것인 폴리뉴클레오티드.
4. 제1항에 있어서, 폴리펩티드 서열이 서열 6인 것인 폴리뉴클레오티드.
5. 제1항에 있어서, 서열 1의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
6. 제1항에 있어서, 서열 3의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
7. 제1항에 있어서, 서열 5의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
8. 제1항의 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함하는 재조합 발현 카세트.
9. 녹색 지속성 표현형을 갖는, 제8항의 발현 카세트를 포함하는 트랜스제닉 식물.
10. 제9항에 있어서, 곡류 식물인 트랜스제닉 식물.
11. 제9항에 있어서, 옥수수인 트랜스제닉 식물.
12. (a) 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1항의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 도입하는 단계; 및
    (b) 에틸렌 감수성이 감소된 식물을 선별하는 단계를 포함하는, 식물에서 에틸렌 감수성을 감소시키는 방법.
13. (a) 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1항의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 도입하는 단계; 및
    (b) 녹색 지속성 특징을 갖는 식물을 선별하는 단계를 포함하는, 식물에서 녹색 지속성 표현형을 유도하는 방법.
14. 제13항에 있어서, 식물이 증가된 광합성능에 기초하여 선별되는 것인 방법.
15. 제13항에 있어서, 식물이 단일 종자 내 존재하는 여러 개의 배에 대한 표현형에 기초하여 선별되는 것인 방법.
16. 제13항에 있어서, 식물이 지연된 노화에 기초하여 선별되는 것인 방법.
17. 제13항에 있어서, 식물이 바이오마커 검출에 기초하여 선별되는 것인 방법.
18. 제13항에 있어서, 식물이 곡류 식물인 방법.
19. 제13항에 있어서, 식물이 옥수수인 방법.

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