BRPI0618176B1 - Métodos para determinar os hábitos alimentares de um inseto através de análise de perfil de ácido graxo, e para determinar a área de refúgio natural para pragas em relação a um cultivo transgênico - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS PARA DETERMINAR OS HÁBITOS AUMENTARES DE UM INSETO A- TRAVÉS DE ANÁLISE DE PERFIL DE ÁCIDO GRAXO, E PARA DETER- MINAR A ÁREA DE REFÚGIO NATURAL PARA PRAGAS EM RELAÇÃO A UM CULTIVO TRANSGÊNICO”.

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se geralmente a métodos para de- terminar os hábitos alimentares e históricos de alimentação de um animal, e mais particularmente, a métodos para determinar as plantas hospedeiras de pragas.

ANTECEDENTE DA INVENÇÃO

Cultivos transgênicos resistentes a pragas estão sendo continu- amente desenvolvidos para permitir rendimentos de cultivo aumentados en- quanto se reduz a quantidade de pesticidas necessários. Entretanto, o po- tencial para resistência da praga aos cultivos transgênicos é amplamente reconhecido, e a comunidade agrícola está ansiosa para estabelecer proto- colos pelos quais a emergência de populações de pragas completa mente não suscetíveis pode ser significativamente atrasada ou impedida.

Uma maneira de reduzir a taxa na qual as pragas desenvolvem resistência aos cultivos transgênicos é assegurar a presença de um refúgio onde pragas suscetíveis não estão expostas ao pesticida. Em teoria, as pra- gas adultas que emergem do ambiente de refúgio se dispersarão e cruzarão com quaisquer pragas que emergem dos campos recombinantes e se qual- quer um dos insetos que emergem dos campos recombinantes tiver desen- volvido um nível de resistência às proteínas pesticidas recombinantes, a dis- ponibilidade daquela característica nas gerações subsequentes será diluída, dessa maneira reduzindo ou retardando o inicio da emergência de uma raça que será total mente resistente à planta recombinante. Áreas de refúgio podem consistir em porções do cultivo de inte- resse que não são tratadas (isto é, refúgio estruturado) ou outro cultivo ade- quado e ervas daninhas hospedeiras das pragas {isto é refugio hospedeiro alternativo ou refúgio natural). A avaliação do refúgio disponível para uma Segue-se folha 1 a praga que é capaz de se desenvolver em múltiplas espécies de plantas hos- pedeiras requer alguns meios de avaliação da porção da população de inse- tos que existe nos diferentes hospedeiros potenciais.

No ambiente regulador atual, obter a aprovação de uma agência reguladora apropriada para a comercialização de uma planta recombinante requer que um percentual de todo o cultivo que é plantado contendo uma característica recombinante seja plantado como um refúgio de cultivos não- recombinantes ou não-transgênicas em base fazenda a fazenda. As neces- sidades do refúgio aumentam o trabalho dos fazendeiros e despesas finan- ceiras e são difíceis de vigiar. O trabalho adicional de plantar e isolar o refú- gio e os rendimentos provavelmente menores dentro do refúgio como um resultado de maior infestação de insetos são um desincentivo para o fazen- deiro cumprir com os requisitos regulatórios.

Assim, permanece uma necessidade por métodos de determinar os hábitos alimentares e história alimentar de animais, e particularmente de pragas, tal que áreas de refúgio mais eficazes podem ser determinadas e designadas. Conseqüentemente, seria desejável ser capaz de rastrear ou identificar um animal ou população de animais de uma maneira que se pu- desse rapidamente identificar os padrões de movimento e história ou hábitos alimentares.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Agora é fornecido um método para determinar se um animal in- geriu uma planta de interesse. O método compreende rastrear o animal quanto a presença de pelo menos um indicador de uma planta de interesse.

Também é fornecido um método de alta produtividade para de- terminar a história alimentar de um animal. O método compreende coletar uma amostra de tecido de uma pluralidade de animais, colocar as amostras de tecido em cavidades individuais de uma placa multicavidades e rastrear cada amostra de tecido quanto a presença de um ou mais indicadores de uma planta de interesse.

Ainda é fornecido um método para determinar se um animal in- geriu uma das várias plantas de interesse. O método compreende coletar pelo menos um tecido do animal; determinar o perfil de ácido graxo do teci- do; e comparar o perfil de ácido graxo do tecido com um perfil de ácido gra- xo de um animal que se tem conhecimento de ter consumido a planta de interesse durante seu ciclo de vida.

Ainda é fornecido um método para determinar o estágio de ali- mentação em que um inseto ingeriu uma planta de interesse. O método compreende rastrear o inseto quanto a presença de pelo menos um indica- dor selecionado do grupo que consiste em gossipol, nicotina, nornicotina, cotinina, norcotinina, resveratrol, genesteína, daidzeína, gliciteína, derivados dos mesmos e combinações dos mesmos.

Ainda é fornecido um método para determinar um estágio de alimentação em que um inseto ingeriu uma planta de algodão. O método compreende determinar as quantidades de C16:1 e C18:1 no perfil de ácido graxo do inseto adulto.

Também é fornecido um método para determinar o estágio de alimentação em que um inseto ingeriu uma planta de amendoim. O método compreende determinar as quantidades relativas de C16:0, C18:1 e C18:2 no perfil de ácido graxo do inseto adulto.

Também é fornecido um método para determinar o estágio de alimentação em que um inseto ingeriu uma planta de tabaco. O método compreende determinar as quantidades relativas de C16:0 e C18:3 no perfil de ácido graxo do inseto adulto.

Também é fornecido um método para determinar o estágio de alimentação em que um inseto ingeriu uma planta de soja. O método com- preende determinar as quantidades relativas de C16:0 e C18:3 no perfil de ácido graxo do inseto adulto.

Ainda é fornecido um método para determinar a área de refúgio natural para uma praga em relação a um cultivo transgênico. O método compreende aprisionar pragas da vizinhança de um cultivo transgênico, ras- trear as pragas aprisionadas quanto a presença de um ou mais indicadores de pelo menos uma planta de interesse e determinar o percentual da popu- lação de praga que consumiu uma planta diferente das plantas do cultivo transgênico.

Aspectos e benefícios adicionais da invenção ficarão claros ao versado na técnica a partir da leitura desse pedido.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1 é um gráfico de barras ilustrando os perfis de ácido gra- xo de mariposas surgidas em plantas de algodão como determinado no E- xemplo 1.

Figura 2 é um gráfico de barras ilustrando o perfil de ácido graxo de mariposas surgidas em plantas de amendoim como determinado no E- xemplo 1.

Figura 3 é um gráfico de barras que ilustra os perfis de ácido graxo de mariposas surgidas em plantas de tabaco como determinado no Exemplo 1.

Figura 4 é um gráfico de barras que ilustra os perfis de ácido graxo de mariposas surgidas em plantas de soja como determinado no E- xemplo 1.

Figura 5 é uma representação gráfica da relação de sinal para ruído determinada no estudo de validação de gossipol do Exemplo 1.

DESCRIÇÃO DETALHADA É fornecido agora um método para determinar se um animal in- geriu uma planta de interesse. O método compreende rastrear o animal quanto a presença de pelo menos um indicador de uma planta de interesse.

Antes de descrever adicionalmente a invenção, é útil entender o problema aqui identificado e abordado.

Padrões de comportamento do animal têm uma variedade de implicações comerciais na agricultura, práticas de uso da terra, conservação, estado real etc. Padrões de movimentação são extrinsecamente rastreados por transmissores de rádio, tecnologia por satélite, marcação etc., mas há dificuldades. Por exemplo, a radiotelemetria não é prática para usar com a- nimais menores ou animais que migram por longas distâncias. A tecnologia por satélite é de custo proibitivo. A marcação requer a captura e recaptura de alguns animais em um grupo e esses animais podem não ser representa- tivos do grupo. Métodos com isótopos estáveis também têm sido usados para acompanhar padrões de movimentação animal. Isótopos estáveis são for- mas estáveis que ocorrem naturalmente de elementos com diferentes mas- sas nucleares. Isótopos estáveis são incorporados diretamente nos tecidos do animal através da dieta do animal. Embora métodos com isótopos está- veis não dependam da recaptura de animais previamente capturados, supo- sições adicionais devem ser feitas. Por exemplo, diferenças na dieta, locali- zação da pastagem e metabolismo, diferenças de clima e altitude, e diferen- ças na composição do leito rochoso e heterogenicidade do solo invariavel- mente afetam os padrões do isótopo no tecido do animal.

Gould et ai (2002) Proc. Natl. Acad. Sei. 99(26), 16581-16586 propuseram a avaliação de isótopo estável como um caminho para identifi- car plantas hospedeiras utilizadas por larvas de Helicoverpa zea (lagarta da cápsula do algodão), uma praga de cultivo. A composição de isótopo estável de carbono (proporção de 13C para 12C, comumente relatada como Õ13C) de plantas C3 tais como algodão e soja está dentro de uma faixa de -20 a -32 0/00 e dentro de uma faixa de -9 a -17 0/00 para plantas C4 tal como 0 milho.

Similarmente, Bontemps et al. (2004) Proc. R. Soe. Lond. 271, 2179-2185 propõem 0 uso de õ13C para distinguir entre plantas hospedeiras de Ostrinia nubilalis (broca européia do milho). Entretanto, 0 uso de õ13C é restrito à comparação entre plantas C3 e C4 e pode não ser útil, por exemplo, para dis- tinguir mariposas criadas como larvas em algodão e mariposas criadas como larvas em soja.

De acordo com a presente invenção, as Requerentes descobri- ram um método para determinar se um animal ingeriu uma planta de interes- se que pode ser aplicado a uma variedade de plantas. O método compreen- de geralmente rastrear 0 animal quanto a presença de pelo menos um indi- cador de uma planta de interesse.

Como usado aqui, "um indicador" de uma planta de interesse é qualquer composto químico que pode ser detectado dentro ou sobre um a- nimal e que signifique que 0 animal ou um estágio de alimentação do animal ingeriu a planta de interesse. Para ser um indicador bem-sucedido, 0 com- posto deve ser tanto específico para a planta como não metabolizado ou preditivamente metabolizado pelo animal após a ingestão. Preferivelmente, 0 indicador é único para a planta e causa uma alteração de padrão única na constituição bioquímica do animal. Por exemplo, em uma modalidade o indi- cador é um biomarcador. Em outra modalidade, o indicador é um composto químico que é encontrado naturalmente na planta de interesse, por exemplo, nicotina ou gossipol. Em outra modalidade, o indicador é resultado de mani- pulação humana de uma planta de interesse, por exemplo, um marcador genético específico para uma planta transgênica. Ainda em outras modalida- des, o indicador é um composto químico que é preditivamente metabolizado pelo animal após ingerir a planta de interesse.

Como usado aqui, o termo "ingerir11 abrange outros termos simi- lares incluindo, por exemplo, consumir, comer, beber, metabolizar, digerir e absorver.

Rastrear um animal quanto a presença de um indicador pode ou não pode requerer obter uma amostra do animal. Em modalidades que re- querem uma amostra, a amostra pode compreender tecido, pêlo, pena, sali- va, suor, lágrimas, conteúdo intestinal ou excreções. Em uma modalidade, o método da presente invenção compreende analisar pelo menos um tecido do animal quanto a presença de um indicador da planta. Em uma modalidade particular, pelo menos um tecido do animal inclui o animal inteiro, por exem- plo, um inseto. Em outras modalidades, tecidos ilustrativos podem incluir pele, pêlo, penas, asas, órgãos internos, sangue, plasma, linfa ou semelhan- tes. Um tecido pode ser um órgão inteiro, por exemplo, um fígado. Alternati- vamente, a amostra de tecido pode ser obtida por biópsia.

Geralmente, uma amostra de tecido pode ser analisada por qualquer método de laboratório ou teste de campo para determinar a pre- sença de indicadores de interesse. Métodos de análise ilustrativos incluem extração de proteína, extração de ácido graxo, imunoprecipitação, extração de DNA, extração de RNA, PCR, análise por Northern blot, análise por Sou- thern blot, análise por Western blot, composição elementar, cromatografia, espectroscopia de massa, imunomarcação, microscopia confocal e micros- copia de fluorescência.

Os métodos da presente invenção são geralmente úteis na de- terminação de hábitos alimentares ou história alimentar de uma ampla varie- dade de animais incluindo seres humanos e não humanos, vertebrados ou invertebrados. Em várias modalidades o animal é um inseto, um peixe, um pássaro, um réptil ou um mamífero. Além disso, o animal pode ser domesti- cado ou selvagem.

Em uma modalidade particular, os métodos da presente inven- ção são usados para determinar a história alimentar de um inseto, por e- xemplo, um inseto nocivo. Insetos contemplados geralmente incluem qual- quer inseto identificado como uma praga para um cultivo de planta economi- camente importante. Exemplos de insetos nocivos incluem, sem limitação, lagarta da raiz do milho do norte, lagarta da raiz do milho do oeste, lagarta da raiz do milho do sul, lagarta da cápsula de algodão, lagarta da cápsula do algodão do tabaco, broca do milho européia, larva da espiga do milho, lagar- ta do cartucho, besouro de plantas, percevejo.

Similarmente, a planta de interesse pode incluir qualquer planta consumida por um animal diretamente ou consumida indiretamente através da cadeia alimentar. Em uma modalidade, a planta de interesse é uma plan- ta de cultivo agrícola, por exemplo, algodão, milho (corn), canola, milho (ma- ize), tabaco, soja, amendoim, girassol, arroz, alfafa ou trigo. Em outra moda- lidade, a planta de interesse é uma planta ou árvore frutífera. Em outra mo- dalidade, a planta de interesse é um vegetal. Em outra modalidade ainda, a planta de interesse é selecionada do grupo que consiste em cana de açúcar, plantas de cacau e plantas de café.

Como descrito acima, indicadores adequados incluem qualquer composto químico que pode ser detectado dentro ou sobre um animal e que significa que o animal ou um estágio de alimentação do animal ingeriu a planta de interesse. Em modalidades nas quais a planta de interesse é uma planta de cultivo, indicadores adequados podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em um ácido graxo, um tocoferol, um açúcar, um flavo- nóide, nicotina, nornicotina, cotinina, norcotinina, gossipol, uma proteína de planta, um mineral, um metabólito secundário de planta, um derivado dos mesmos e uma combinação dos mesmos.

Flavonóides ilustrativos incluem antocianinas, flavanóis, flavono- nas, flavonóis, flavonas e isoflavonas. Isoflavonas ilustrativas incluem genes- teína, daidzeína e gliciteína.

Tocoferóis ilustrativos incluem RRR-tocoferol, beta-tocoferol, gama-tocoferol, delta-tocoferol, tocotrienóis, alfa-tocotrienol, e delta-trienol. Açúcares ilustrativos incluem glicose, frutose ou maltose. Ácidos graxos ilustrativos incluem C16:0, C16:1, C18:0, C18:1, C18:2, e C18:3.

Minerais ilustrativos incluem cálcio, ferro, magnésio, fósforo, po- tássio, sódio, zinco, cobre e manganês.

Proteínas de planta ilustrativas incluem resveratrol.

Metabólitos secundários de planta incluem gossipol e um alca- lóide. Alcalóides ilustrativos incluem solanina.

Em uma modalidade particular quando se rastreia um animal quanto a ingestão de algodão, gossipol pode ser um indicador adequado.

Gossipol é um pigmento de aldeído polifenólico presente em sementes, cas- ca de raiz e glândulas subepidérmicas de plantas do gênero Gossypium e em particular no algodão. Rojas et aí. (1992) Environmental Entomoloav 21(3), 518-526 discutem a distribuição de gossipol e metabólitos em Helio- this virescens (lagarta da cápsula do algodão do tabaco), uma praga de cul- tivos. A larva de Heliothis se alimenta de plantas de cultivo incluindo o algo- dão. Os autores relatam que a mariposa adulta de Heliothis contém 2,4% do total de gossipol ingerido pela larva de Heliothis.

Gossipol está relacionado unicamente às glândulas lisógenas do algodão (Gossypium spp.) e plantas relacionadas. A pesquisa de Rojas et ai. demonstrou que a mariposa adulta de Heliothis virescens continha 2,4% do gossipol ingerido pelo estágio larval. O estudo indicou que todo o gossipol era como uma forma ligada e não encontrou gossipol livre. Assim, métodos analíticos que podem determinar a presença de gossipol ligado na mariposa adulta poderíam permitir que mariposas que se desenvolveram sobre o al- godão sejam discriminadas daquelas que se desenvolveram sobre outros hospedeiros.

Em outra modalidade para determinar se um animal ingeriu uma planta de tabaco, o animal pode ser rastreado quanto à presença de nicotina ou um derivado de nicotina. Geralmente a nicotina é um indicador adequado para a ingestão de plantas de tabaco. Entretanto, como a nicotina é relati- vamente abundante no ambiente a partir de outras fontes que não o tabaco, derivados de nicotina incluindo metabólitos de nicotina podem ser mais pre- feridos como um indicador do consumo de tabaco. Exemplos de metabólitos de nicotina incluem cotinina, nornicotina e norcotinina.

Em outra modalidade ainda para determinar se um animal inge- riu uma planta de soja, o animal pode ser rastreado quanto à presença de uma ou mais isoflavonas. Isoflavonas adequadas incluem, por exemplo, ge- nisteína, daidzeína ou gliciteína.

Em outra modalidade para determinar se um animal ingeriu pelo menos uma planta de interesse, o método compreende coletar pelo menos um tecido do animal; determinar o perfil de ácido graxo do tecido; e compa- rar o perfil de ácido graxo do tecido com o perfil de ácido graxo de um animal que se tem conhecimento de ter consumido a planta de interesse durante seu ciclo de vida. Geralmente, o perfil de ácido graxo é determinado pelo contato da amostra de tecido com um solvente para extrair os ácidos graxos da amostra de tecido. Os ácidos graxos extraídos são então transesterifica- dos para produzir ésteres metílicos de ácido graxo que podem ser ainda se- parados e detectados para determinar o perfil de ácido graxo para a amostra de tecido.

Em algumas modalidades, a presença de um ácido graxo deter- minará se o animal ingeriu uma planta de interesse. Em outras modalidades, dois ou mais ácidos graxos em combinação determinarão se o animal ingeriu uma planta de interesse. Em outras modalidades ainda, o perfil de ácido graxo determinará se o animal ingeriu uma planta de interesse. O perfil de ácido graxo pode ser qualquer proporção de um ou mais ácidos graxos em relação ao total de ácidos graxos medido.

Por exemplo, foi descoberto que as quantidades relativas de C16:1 e C18:1 no perfil de ácido graxo do animal podem determinar se o animal consumiu plantas de algodão. Além disso, as quantidades relativas de C16:0, C18:1 e C18:2 no perfil de ácido graxo do animal são indicativas de plantas de amendoim; as quantidades relativas de C16:0, C18:1, C18:2 e C18:3 no perfil de ácido graxo do animal são indicativas de plantas de soja; e as quantidades relativas de C16:0 e C18:3 no perfil de ácido graxo do ani- mal são indicativas de plantas de tabaco.

Em algumas modalidades, o método compreende analisar pri- meiro um tecido do animal quanto à presença de um indicador de uma plan- ta de interesse, e em depois determinar o perfil de ácido graxo do tecido e comparar o perfil de ácido graxo do tecido com um perfil de ácido graxo indi- cativo de alimentação com a planta. Em outras modalidades, o método com- preende determinar primeiro o perfil de ácido graxo do tecido e comparar o perfil de ácido graxo do tecido com um perfil de ácido graxo de um animal que se tem conhecimento de ter consumido a planta e depois analisar o te- cido quanto à presença de um indicador da planta.

Em uma modalidade particular, os métodos da presente inven- ção são configurados para fornecer um método de alta produtividade para determinar as características alimentares de um animal. O método geral- mente compreende coletar amostras de tecidos de uma pluralidade de ani- mais e colocar as amostras em cavidades individuais de uma placa de múlti- plas cavidades. Cada amostra na placa de múltiplas cavidades é então ras- treada quanto à presença de pelo menos um indicador de uma planta de interesse ou para determinar o perfil de ácido graxo das amostras de tecido como descrito acima.

Os métodos e conceitos aqui descritos para rastrear os hábitos alimentares ou o histórico alimentar de um animal têm múltiplas aplicações.

Em uma modalidade particular, os métodos de rastreamento descritos aqui podem ser usados pra determinar as áreas de refúgio natural de pragas em relação a um cultivo transgênico. Tal método compreende aprisionar pragas da vizinhança de um cultivo transgênico; rastrear as pragas aprisionadas quanto à presença de um ou mais indicadores de pelo menos uma planta de interesse; e determinar o percentual da população de pragas que consome uma planta diferente da cultura transgênica. Alternativamente ou adicional- mente, o método pode compreender coletar pelo menos um tecido das pra- gas aprisionadas; determinar o perfil de ácido graxo do tecido; e comparar o perfil de ácido graxo do tecido com um perfil de ácido graxo de uma praga que se tem conhecimento de ter consumido a planta de interesse durante seu ciclo de vida antes de determinar o percentual da população de praga que consumiu uma planta diferente do cultivo transgênico. Conseqüente- mente, desenvolvedores de produtos, cientistas e autoridades reguladoras envolvidas na determinação de áreas de refúgio para pragas podem usar a informação relacionada aos hábitos alimentares e história alimentar das pra- gas para determinar se a área de refúgio natural para aquelas pragas é sufi- ciente para substituir parcialmente ou completamente a necessidade dos fazendeiros de plantar refúgios estruturados para um cultivo transgênico de interesse em suas fazendas, dessa maneira retardando ou impedindo signi- ficativamente o desenvolvimento de populações de pragas resistentes en- quanto maximizam o rendimento do cultivo.

EXEMPLO O seguinte exemplo é de natureza meramente ilustrativa e não deve ser interpretado em um sentido limitante.

Esse exemplo demonstra um método da invenção para determi- nar se um animal ingeriu uma planta de interesse. O experimento compre- endeu alimentar mariposas da lagarta do tabaco no estágio de larva com uma das plantas de tabaco, algodão, soja, ou amendoim. Após a metamor- fose, as mariposas adultas foram analisadas quanto ao seu perfil de ácido graxo. Os perfis foram usados para determinar diferenças nos perfis de áci- do graxo para cada uma das espécies de planta hospedeiras. As mariposas foram então analisadas quanto à presença de cotinina (um metabólito de nicotina) para determinar se as mariposas se desenvolveram em tabaco.

Finalmente, as mariposas foram analisadas quanto à presença de gossipol para determinar se as mariposas se desenvolveram em algodão.

Embora as análises nesse experimento fossem completadas em seqüência, é importante observar que as análises podem ser realizadas em qualquer ordem ou independentemente um ou outro.

Extração de ácidos araxos Mariposas adultas foram coletadas, liofilizadas, pesadas, e colo- cadas individualmente em cavidades de 2 ml_ de uma placa de 96 cavida- des. As mariposas foram então trituradas por adicionar uma esfera de vidro a cada cavidade, tampar a placa e colocar a placa em um triturador como descrito, por exemplo, na Patente U.S. N°. 6.880.771, que está incorporada aqui por referência. Durante a trituração, o triturador agitou a placa a 800 rpm por 60 segundos. Após a trituração, éter dietílico (1 mL) foi adicionado a cada cavidade. A placa foi tampada novamente, e vortexada por 15 minutos para extrair os ácidos graxos da matriz da mariposa para dentro do éter die- tílico. Os ácidos graxos no éter dietílico foram então colocados em uma ca- vidade de 2 mL em uma nova placa de 96 cavidades para transesterificação. A placa de 96 cavidades original contendo as mariposas foi colocada sob um vapor seco de nitrogênio para remover o éter residual, e então tampada e armazenada a -20°C para determinações posteriores de cotinina e gossipol.

Transmetilacão de ácidos araxos extraídos Acetato de metila (20 pL) e metóxido de sódio (40 pL) foram adi- cionados a cada cavidade contendo os ácidos graxos em éter dietílico. A placa foi vortexada novamente por 30 segundos e a solução foi deixada re- pousar em temperatura ambiente por 10 a 40 minutos. A seguir, éter dietílico saturado com ácido oxálico (30 pL) foi adicionado e a placa foi vortexada por pelo menos 20 segundos. A solução de éter foi então removida usando um vapor seco de nitrogênio. Após a secagem, hexano (1,5 mL) foi adicionado a cada cavidade e a placa foi vortexada. Uma amostra (1 mL) de cada cavida- de foi transferida para um frasco de amostrador automático para análise por cromatografia a gás.

Condições de cromatoqrafia a gás e esoectrometria de massa A cromatografia a gás compreendeu uma coluna DB-FFAP, de 15 metros de comprimento, 0,25 mm de diâmetro, e uma espessura de filme de 0,25 mícrons. A temperatura da entrada era de 250°C e a injeção foi ajus- tada para uma injeção dividida (razão de 6:1). Cada amostra (1 pL) foi inje- tada com hélio como gás veículo em uma taxa de fluxo de 0,8 mL/minuto. A coluna foi operada em uma temperatura de 85°C por 30 segundos, e então aumentada para 150°C em uma taxa de 25°C/minuto, e então aumentada para 250°C em uma taxa de 17°C/minuto. A coluna foi então mantida a 250°C por 3 minutos. O detector era um detector sensível a massa de impacto de elé- tron, com a detecção de massa ajustada entre 60 e 350 m/z. As áreas inte- gradas de ácido graxo foram obtidas para C16:0, C16:1, 018:0,-018:1, C18:2 e C18:3.

ANÁLISE DE COTININA

As mariposas trituradas restantes nas cavidades da placa de 96 cavidades foram analisadas quanto à presença de cotinina de acordo com o seguinte: Extração de cotinina Uma solução de extração foi preparada por adicionar ácido acé- tico (50 mL) a um frasco volumétrico de 1000 mL seguido pela adição de metanol (200 mL). Água deionizada foi adicionada ao frasco para trazer o volume total para 1000 mL. NaOH 40% foi adicionado à solução de extração para aumentar o pH acima de 11.

Solução de extração (1 mL) foi adicionada a cada cavidade con- tendo uma mariposa triturada. A seguir, cotinina deuterada (20 pl) foi adicio- nada como um padrão interno. A placa foi então tampada por colocar para- filme sobre o topo da placa e então fazer pressão sobre a tampa sobre o parafilme. A placa tampada foi primeiro vortexada por 15 minutos, e então centrifugada. A camada de líquido de cada cavidade foi removida e adicio- nada a frascos de 8 mL. Um segundo volume de solução de extração (1 mL) foi adicionado a cada cavidade, a placa vortexada por 5 minutos, e então centrifugada. A camada de líquido de cada cavidade foi adicionada ao extra- to anterior no respectivo frasco de 8 mL. Para cada frasco de 8 mL, NaOH 40% (150 pL) foi adicionado, seguido por água deionizada (4 mL). A placa de 96 cavidades contendo o resíduo da mariposa foi seca sob um vapor se- co de nitrogênio e armazenada a -20°C até análise posterior.

Extração em fase sólida de 100 mg de divinil benzeno (DVB

SPE) foi usada para remover a cotinina da solução de extração. A SBV DVB foi preparada por lavar a coluna com etanol (2 mL), seguido por água deioni- zada (2 mL). Então, a cotinina na solução de extração foi passada pela colu- na, seguido por água deionizada adicional (1 mL). A coluna foi seca por 5 a 30 minutos por passar ar através da coluna. Subseqüentemente, a coluna foi lavada com metanol 20% em éter (3 mL) para eluir a cotinina da coluna. O

metanol/éter foi removido da cotinina usando um vapor seco de nitrogênio. A cotinina foi ressuspensa em metanol/éter (150 pL), e as laterais da coluna foram lavadas para evitar perda de amostra. As amostras foram colocadas em frascos de amostradores automáticos para análise por GC/MS.

Cromatoarafia a gás e espectrometria de massa O cromatógrafo a gás compreendeu uma coluna DB-5, de 15 metros de comprimento, 0,25 mm de diâmetro interno, e uma espessura de filme de 0,25 pm. A temperatura da entrada foi de 285°C e a injeção foi ajus- tada para uma injeção dividida/não dividida (razão de 6:1). Um microlitro de cada amostra foi injetado com hélio como o gás veículo e uma taxa de fluxo de 2,1 mL/minuto. A temperatura da coluna começou em 100°C, mantida nesta temperatura por 0,1 minutos, e então aumentada para 175°C em uma taxa de 40°C/minuto, seguido por um aumento de 30°C/minuto para 300°C. O espectrômetro de massa usado foi um tempo de vôo Leco Pe- gasus III, com energia de ionização de impacto de elétron de 70 eV e um retardo de solvente de 50 segundos. A variação de escaneamento foi de 50 - 210 m/z com 15 escaneamentos por segundo. A temperatura da fonte de íon foi de 200°C.

Quantificação de cotinina nas amostras foi determinada por me- dir a proporção da área de m/z 176 à área de m/z 180, onde m/z 180 era o padrão de cotinina deuterada. O padrão de cotinina em cada amostra foi u- sado para determinar o tempo de retenção. Os dados de cotinina foram me- didos em partes por bilhão, com um limite de detecção de cerca de 1 parte por bilhão.

ANÁLISE DE GOSSIPOL

Os restantes das mariposas trituradas na placa de 96 cavidades foram analisadas quanto à presença de gossipol de acordo com o seguinte: Extração de aossipol A maior parte do gossipol encontrado nas mariposas foi metaboli- zado e ligado à proteína. Ao gossipol do extrato na forma ligada, o complexo pode ser derivatizado por criar uma base de Shiff com anilina formando dianili- no-gossipol. O dianilino-gossipol pode então ser isolado da matriz da mariposa usando DVB SPE. Ambas as etapas estão descritas em detalhe abaixo.

Agente de derivatização foi preparado por misturar anilina (1 ml_), ácido acético glacial (5 ml_) e dimetilformamida (44 ml_). O agente de derivatização pode ser armazenado a 4°C por uma semana. Agente de deri- vatização deuterado foi preparado por misturar anilina (0,1 mL de d5-anilina), ácido acético (0,5 mL), e dimetilformamida (4,4 mL). O agente de derivatiza- ção deuterado pode ser armazenado a 4°C por uma semana.

Agente de derivatização (1 mL) foi adicionado a cada cavidade contendo uma mariposa triturada. A placa foi coberta com parafilme e uma tampa pressionada sobre o parafilme para lacrar cada cavidade. A placa foi vortexada por 1 minuto, e então a tampa e o lacre foram removidos e a placa coberta com papel alumínio. A placa foi aquecida a 80 - 90°C por 1 hora em um forno ou suporte de placa de cavidades aquecida. Após remover do sis- tema de aquecimento e resfriar, a placa foi coberta novamente com parafil- me e tampada para lacrar cada cavidade. A placa foi centrifugada por 5 mi- nutos a 2500 - 3000 rpm.

Uma DVB SPE foi usada para remover o gossipol do agente de derivatização. Uma placa de 96 cavidades de DVB SPE foi preparada por lavar as colunas com acetona (0,5 mL), seguido por metanol (0,5 mL). As colunas foram então deixadas úmidas com uma solução que compreende uma mistura igual de água e DMF (0,5 mL).

Para evitar contaminação cruzada, a tampa e o parafilme foram cuidadosamente removidos da placa de 96 cavidades contendo as mariposas e o agente de derivatização. A seguir, água (0,5 mL) foi adicionada a cada cavi- dade. Cada amostra foi transferida para as respectivas cavidades na placa de 96 cavidades de DVB SPE e deixado passar através da coluna. DMF adicional (0,5 mL) foi adicionado à placa de 96 cavidades original contendo o resíduo de mariposa, a placa foi coberta com parafilme e então tampada, vortexada por 1 minuto, e centrifugada por 5 minutos a 3000 rpm. Após centrifugar, água (0,5 mL) foi adicionada a cada cavidade e as amostras foram transferidas para as respectivas cavidades na placa de 96 cavidades de DVB SPE.

Após as amostras terem passado pelas colunas, as colunas fo- ram enxaguadas com 20:80 água para metanol (0,5 mL) e seguido por 5:95 acetona para metanol (0,5 mL). Subseqüentemente, o gossipol foi eluído da coluna com acetona (500 pL) em uma placa de 96 cavidades de 2 mL ou 1,5 mL. A acetona foi removida das amostras e as amostras foram secas com um vapor suave de nitrogênio. As amostras foram armazenadas a -20°C até análise por ionização de eletronspray/ espectrometria de massa/ espectro- metria de massa (ESI/MS/MS).

Determinação de HPLC/ESI/MS/MS de gossipol A cada amostra, acetona (200 pL) foi adicionada e as amostras foram misturadas. A seguir, uma solução que compreende 5 pg/mL de diani- lino-gossipol derivatizado deuterado (20 pL) foi adicionado a cada amostra como um padrão interno. As amostras foram tampadas e vortexadas, e en- tão transferidas para uma placa de 96 cavidades de 0,5 mL para análise. O HPLC usou uma coluna curta (Zorbax Eclipse XBD-C18 dis- ponível comercialmente por Agilent Technologies, Inc.) com fase móvel de solvente duplo. O solvente A foi 10% água em metanol e solvente B foi 2:1 acetonitrila para acetona. A taxa de fluxo foi 0,25 mL/minuto com um gradi- ente como mostrado na Tabela 1.

Tabela 1: Gradiente de solvente HPLC O espectrômetro de massa era um detector Micromass Quattro Ultima LC/MS/MS por Waters, e continha um espectrômetro de massa qua- dripolar com ionização de eletronspray negativa. Pelo fato do HPLC não for- necer a matriz de ionização correta para ionização por eletronspray negativa do dianilino-gossipol, NH4OH 0,6% em metanol foi introduzido pela coluna de HPLC em uma taxa de fluxo de 0,05 mL/minuto. Mistura pós-coluna do NH4OH em MeOH com 0 eluente de HPLC foi obtido usando uma conexão- T. No modo MS/MS, 0 primeiro quadrupolo foi usado para selecionar 667,3 como a relação de massa para carga que representou o íon negativo de dia- nilino-gossipol. No segundo quadrupolo, a relação de massa para carga de 667,3 foi fragmentada em uma célula de colisão. O terceiro quadrupolo foi usado para selecionar 0 íon fragmento, monoanilino-gossipol, que tinha uma relação de massa para carga de 574,2 como um resultado da perda de anili- na. A detecção do segundo íon fragmento fornece especificidade melhorada e relações sinal ruído aumentadas.

Semi-quantificação de gossipol foi determinada pela razão da área de pico do 547,2 m/z com a área de pico do padrão interno, dianilino- gossipol deuterado. Essas razões foram então comparadas aos padrões, brancos, e resultados de mariposas de controle criadas em laboratório para determinar se 0 gossipol estava presente.

RESULTADOS

Como descrito acima, mariposas da lagarta do tabaco surgidas como larvas sobre plantas de tabaco, algodão, soja e amendoim foram ana- lisadas quanto aos seus perfis de ácido graxo, presença de cotinina e pre- sença de gossipol.

Para construir 0 perfil de ácido graxo de cada planta hospedeira, um cromatograma de íon total foi integrado e a área para cada ácido graxo (C16:0, C16:1, C18:0, C18:2, e C18:3) foi obtida e adicionadas juntas para um total. A fração de um ácido graxo do total é mostrada abaixo nas Tabelas de 2 a 5. As comparações de todas as quatro plantas hospedeiras mostram que cada uma tem um perfil de ácido graxo único que pode ser usado para distinguir umas das outras.

Modelação independente por analogia de classes (Soft Indepen- dent Modeling for Class Analogy (SIMCA)) foi usada para desenvolver um modelo de classificação supervisionado baseado nos perfis de ácidos graxos de mariposas surgidas em cada uma das quatro plantas de cultivo. O desen- volvimento do modelo SIMCA gerou um modelo de análise de componente principal (Principal Component Analysis (PCA)) separado para cada uma das quatro plantas de cultivo ou modelo de classe. Uma amostra nova, desco- nhecida foi classificada com cada modelo de PCA e sua filiação de classe determinada pela distância mínima da amostra desconhecida do modelo de classe de PCA. Veja figuras 1 a 4. O gráfico S/S0 versus H0 mostra a distân- cia amostra-modelo em relação a distância média do modelo (S/S0) na abs- cissa e a elevação para cada amostra no eixo das ordenadas. Os limites da classe são mostrados como linhas horizontais e verticais no nível de signifi- cância de 5%. Amostras desconhecidas próximas da origem dentro de am- bas as linhas podem ser classificadas como membros do modelo de classe.

Amostras fora dessas linhas podem ser classificadas como não pertencentes ao modelo de classe. As figuras 1 a 4 mostram que os dados do perfil de ácido graxo podem ser usados para classificar amostras de mariposas de acordo com a planta hospedeira da qual a larva se alimentou antes da me- tamorfose. A Tabela 6 mostra a distância entre os modelos. Quanto maior a distância intermodelo, maior a diferença existente entre as classes. Tipica- mente, uma diferença de modelo maior do que 3 indica modelos de classe que são significativamente diferentes. Com valores na faixa de 200-45.000, os modelos de classe são significativamente diferentes e podem ser usados para classificar novas amostras de acordo com suas classes.

Tabela 6: Distância de modelo entre plantas de algodão, tabaco, soia e a- mendoim Ensaios de validação para gossipol foram realizados em dois grupos separados em dois dias diferentes. A maioria dos insetos surgiu no algodão. No primeiro grupo no dia um, os insetos alimentados com folhas de nerbascam, soja e ervilha foram incluídos para comparação. Seria esperado que esse grupo tivesse prova negativa para gossipol. No segundo dia, inse- tos alimentados com dieta artificial foram incluídos como controles negativos.

Em ambos os dias, brancos e padrões também foram realizados como con- troles adicionais do ensaio.

Os resultados na figura 5 são expressos como relação de sinal para ruído registrado pelo espectrômetro de eletrospray/massa que forneceu os resultados mais consistentes. Outros parâmetros de resposta do espec- trômetro de massa, tais como área de pico, também podem ser usados. A relação de sinal para ruído mínima, média e máxima é mostrada para cada um dos grupos de tratamento: insetos criados com dieta artificial, folhas de nerbascam, soja, ervilha ou algodão (com os insetos alimentados com algo- dão dos dois dias apresentados separadamente). Um valor de ponto de cor- te de 12 para a relação de sinal para ruído foi escolhido como o valor para determinar se gossipol estava presente ou não (se maior, então a amostra era positiva; se menor ou igual a, ela era negativa). Usando esses critérios, os insetos alimentados com algodão foram sempre identificáveis como posi- tivos para gossipol no ensaio. Para mariposas surgidas no algodão a relação de sinal para ruído era tipicamente maior do que 100, quase sempre maior do que 30 e nunca menor do que 14. Os valores mínimos dos dois dias fo- ram 14 e 18 respectivamente, com um total de mais do que 50 insetos ali- mentados com algodão testados em cada um dos dias. Os critérios de sinal para ruído dependem do método global e assim podem variar de laboratório para laboratório. Portanto é importante que um estudo de validação seja rea- lizado para ajustar os critérios de maneira a minimizar falsos negativos.

Usando os critérios de sinal para ruído, os resultados do estudo de validação para o ensaio de HPLC-MS de gossipol são mostrados na Ta- bela 7. Todas as mariposas alimentadas com algodão foram descobertas ser positivas para gossipol. As mariposas surgidas sobre outras plantas que não contêm gossipol tiveram uma taxa de falso positivo. A tabela 7 também mos- tra que para as mariposas surgidas em plantas sem gossipol houve uma ta- xa de falso positivo. Ou seja, as mariposas teriam sido identificadas como tendo surgido em algodão quando não surgiram. Por exemplo, 4 das 28 ma- riposas alimentadas com folhas de nerbascam testadas foram identificadas como tendo sido alimentadas com algodão.

Com um sinal para ruído ajustado para detecção de gossipol em 12:1, o ensaio permite a identificação bem-sucedida de todos os insetos do algodão (positivo para gossipol), mas haverá uma taxa de falso positivo de cerca de 15%. Ou seja, alguns insetos que não se alimentaram de algodão conservativamente serão identificados como do algodão.

Claims (14)

1. Método de alto rendimento para determinar se um inseto ingeriu pelo menos uma planta de interesse, caracterizado pelo fato de que compreende: coletar pelo menos um tecido do inseto; determinar o perfil do ácido graxo do tecido; comparar o perfil do ácido graxo do tecido a um perfil de ácido graxo de um inseto conhecido que tenha consumido a planta de interesse durante o seu ciclo de vida; e determinar as quantidades relativas de C16:1 e C18:1 no perfil de ácido graxo de um inseto adulto para determinar se o estágio de alimentação do inseto ingeriu uma planta de algodão, e analisar um tecido teste do inseto adulto para a presença de gossipol; ou determinaras quantidades relativas de C16:0, C18:1, e C18:2 no perfil de ácido graxo de um inseto adulto para determinar se o estágio de alimentação do inseto ingeriu uma planta de amendoim, e analisar um tecido teste do inseto adulto para a presença de resveratrol; ou determinar as quantidades relativas de C16:0 e C18:3 no perfil de ácido graxo de um inseto adulto para determinar se o estágio de alimentação do inseto ingeriu uma planta de tabaco, e analisar um tecido teste do inseto adulto para a presença de nicotina e/ou um derivado de nicotina; ou determinar as quantidades relativas de C16:0, C18:1, C18:2, e C18:3 no perfil de ácido graxo de um inseto adulto para determinar se o estágio de alimentação do inseto ingeriu uma planta de soja, e analisar um tecido teste do inseto adulto para a presença de pelo menos uma isoflavona.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método ainda compreende: contatar o tecido com um solvente para extrair os ácidos graxos a partir do tecido; transesterificar os ácidos graxos para preparar uma mistura de ésteres metílicos de ácido graxo; e analisar a mistura de ésteres metílicos de ácido graxo para determinar o perfil do ácido graxo do tecido.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método ainda compreende analisar o tecido para a presença de pelo menos um indicador de uma planta de interesse.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que compreende determinar o perfil do ácido graxo do tecido antes de analisar o tecido para a presença de pelo menos um indicador de uma planta de interesse.

5. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o indicador é selecionado do grupo que consiste em um ácido graxo, um tocoferol, um açúcar, um flavonóide, um alcalóide, uma proteína de planta, um marcador genético, um mineral, um metabólito secundário, um derivado dos mesmos, e uma combinação dos mesmos.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o indicador é um flavonóide selecionado a partir do grupo que consiste em antocianinas, flavanóis, flavononas, flavonóis, flavonas, e isoflavonas.

7. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o indicador é um tocoferol selecionado a partir do grupo que consiste em RRR-tocoferol, beta-tocoferol, gama-tocoferol, delta-tocoferol, tocotrienóis, alfa-tocotrienol, gama-tocotrienol, e delta-trienol.

8. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o indicador é selecionado a partir do grupo que consiste em nicotina, nornicotina, cotinina, norcotinina, outros metabólitos de nicotina, e gossipol.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma isoflavona é selecionada do grupo que consiste em genesteína, daidzeína, e gliciteína.

10. Método para determinar a área de refúgio natural para pragas em relação a um cultivo transgênico, caracterizado pelo fato de que compreende: aprisionar pragas da vizinhança de um cultivo transgênico C3 e/ou aprisionar pragas da vizinhança de um cultivo transgênico C4; classificar as pragas aprisionadas quanto à presença de um ou mais indicador(es), utilizando o método descrito na reivindicação 1, em que pelo menos uma planta de interesse inclui uma planta C3 diferente do cultivo transgênico C3 e/ou uma planta C4 diferente do cultivo transgênico C4; e determinar uma porcentagem das pragas que consomem a planta C3 diferente do cultivo transgênico C3 e/ou determinar uma porcentagem das pragas que consomem a planta C4 diferente do cultivo transgênico C4; em que a porcentagem das pragas que consomem a planta C3 diferente do cultivo transgênico C3 e/ou a porcentagem das pragas que consomem a planta C4 diferente do cultivo transgênico C4 indica a área de refúgio natural.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o indicador é selecionado do grupo que consiste em um ácido graxo, um tocoferol, um açúcar, um flavonóide, um alcalóide, uma proteína de planta, um marcador genético, um mineral, um derivado dos mesmos, e uma combinação dos mesmos.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o indicador é selecionado a partir do grupo que consiste em nicotina, nornicotina, cotinina, norcotinina, e gossipol.

13. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o(s) um ou mais indicador(es) inclui(em) um ácido graxo, e em que classificar as pragas aprisionadas inclui a coleta de pelo menos um tecido a partir das pragas aprisionadas e determinar um perfil de ácido graxo do pelo menos um tecido, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende ainda comparar o perfil de ácido graxo do pelo menos um tecido a um perfil de ácido graxo de uma praga conhecida por ter consumido a planta de interesse durante o seu ciclo de vida para determinar se as pragas aprisionadas ingeriram a planta de interesse.

14. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a praga é um inseto.