KR20100040212A

KR20100040212A - 만성 폐쇄성 폐질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물

Info

Publication number: KR20100040212A
Application number: KR1020080099336A
Authority: KR
Inventors: 양선미; 임권조; 박현진; 김일환; 이상호; 이종욱
Original assignee: 주식회사 대웅
Priority date: 2008-10-09
Filing date: 2008-10-09
Publication date: 2010-04-19
Also published as: US20110192396A1; JP2012505207A; WO2010041889A3; EP2340032A2; WO2010041889A2; TW201016229A

Abstract

본 발명은 상피세포성장인자(EGF) 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 기도 점액 과분비 또는 만성폐쇄성폐질환(COPD)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 조성물 및 화학요법제를 각각 개별적으로 투여할 수 있도록 포함하는 복합제제를 제공한다.

Description

만성 폐쇄성 폐질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물{A pharmaceutical composition for preventing or treating chronic obstructive pulmonary disease}

본 발명은 만성 폐쇄성 폐질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 상피세포성장인자를 활성성분으로 포함하는 기도점액 과분비 또는 만성폐쇄성폐질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

만성 폐쇄성 폐질환(이하 COPD, Chronic Obstructive Pulmonary Disease)은 직/간접 흡연이나 카드뮴(Cd), 실리카(Si) 같은 환경 오염원을 직접 다루는 직업군에서 발생할 수 있고 드물게 a1-안티트립신 유전자의 이상에 의하여 발생할 수 있다.

COPD는 폐에 발생한 염증으로부터 조직을 보호하기 위해 생성된 점액질(mucus)이 과도하게 생성된 후 소실(clearance)에 문제가 발생되어 기도가 폐쇄되며, 폐포 세포(alveolar cell)의 파괴로 인하여 유발된 저산소증으로 사망에 까지 이를 수 있는 치명적인 질환이다.

COPD는 발생 조직과 메커니즘에 따라 만성 기관지염(chronic bronchitis) 및 폐기종(emphysema)으로 구분된다. 만성 기관지염의 가장 큰 특징은 기도 상피세포에서 과발현된 점액질이 제거되지 않고 계속적으로 과발현되어 결과적으로 축적된 점액질로 인하여 기도가 폐쇄되는 것이 특징이며, 폐기종은 폐포 세포(alveolar cell)가 파괴되어 저산소증 또는 심장질환, 및 비가역적인 세기관지(bronchiole) 폐쇄성을 보이는 것이 특징이다. 특히, 폐기종은 염증세포에 의하여 활성화된 엘라스타아제(elastase)에 의한 가수분해로 인하여 폐포 세포가 비가역적으로 파괴되며, 조직병리학적으로 CD⁸⁺, T 림프구, 대식세포(macrophage), 및 호중성 백혈구(neutrophil)가 증가하게 된다.

기도의 점액은 일반적으로 인체의 기도를 통해 흡입된 입자 또는 감염인자의 제거를 촉진하지만, 점액의 과분비는 진행성 기도폐색증을 일으킨다. 말초 기도에서, 기침은 점액의 제거에 효과가 없다. 더 나아가, 많은 배상세포(globlet cell)를 포함하는 좁은 기도는 특히 점액에 의한 기도 폐색이 일어나기 쉽다. 따라서, COPD의 만성기관지염에서의 점액 과발현을 포함하여, 기관지 확장, 낭성 섬유증, 급성 천식 등과 같이 다수의 다른 폐질환에서 발생되는 점액 과분비를 예방 및 치료할 필요가 있다.

EGF는 상피세포성장을 촉진시키는 단백질로, 현재까지 상피세포의 재생, 세포분열의 촉진 등 상처치료와 관련된 효능들이 널리 알려져 있으나(US 6,589,540 등), EGF가 COPD의 혹은 기도의 점액 과발현을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다고 보고된 바는 없다.

이에 본 발명자들은 COPD의 혹은 기도의 점액 과발현을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있는 약물을 개발하기 위해 연구한 결과, EGF가 만성 기관지염 및 폐기종을 포함한 COPD의 예방 및 치료에 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 기도의 점액 과발현을 억제하는 효과가 있어 광범위한 폐질환에서 고질적인 문제가 되고 있는 기도 점액 과분비를 예방 및 치료하는데 효과가 있다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 기도 점액 과분비의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 만성 폐쇄성 폐질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 흡입투여용기 및 그 안에 유동성 제조물을 포함하는 기도 점액 과분비의 예방 또는 치료를 위한 패키지를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상피세포성장인자(EGF) 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 기도 점액 과분비의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상피세포성장인자(EGF) 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 만성폐쇄성폐질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 흡입투여용기 및 그 안에 존재하는 상피세포성장인자를 포함하는 유동성 제조물을 포함하는, 기도 점액 과분비의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 패키지를 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에서 "상피세포성장인자" 또는 EGF라 함은 정상인의 십이지장 또는 침샘에서 합성되어 사람의 모유에서 발현되는 것으로 알려진 53 아미노산 단백질이다. 사람의 EGF 아미노산 서열은 다음과 같다:

Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His ASp Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg (SEQ ID NO: 1).

본 명세서의 실시예의 실험에서 사용된 단백질은 전술한 서열을 갖는다. 사람에 있어서 EGF로서 작용하는 비인간 EGF 서열 역시 상기 상피세포성장인자에 포함된다. EGF의 종변이체 역시 포함되며, 예컨대 마우스, 랫드, 및 돼지의 EGF(49-52) 또는 미국특허출원 2003-0059802에 인용된 바와 같은 소의 EGF, 또는 상이한 EGF 수용체 리간드의 소위 상-작용제 키메라(53) 등이 포함된다. 상기 상피세포성장인자는 또한 정제된 천연 상피세포성장인자의 것과 실질적으로 동일한 서열과 활성을 갖는 폴리펩티드를 가리키는 것이기도 하다. 여기에는 재조합적으로 그리고 화학적으로 합성된 펩티드나 단백질이 포함된다. 이 용어는 또한 본 발명에서 필요한 EGF의 생물학적 활성이 실질적으로 보존되는 한, 천연 서열로부터 하나 이상 의 아미노산이 삽입 또는 결실에 의해 치환 변경된 단백질을 가리키는 것이기도 하다. 이 정의는 또한 본 발명에서 필요한 EGF의 생물학적 활성이 실질적으로 보존되는 한, EGF의 단편, 펩티드 유사체, 및 펩티드 모사체도 포함된다. 2001년 2월 20일자로 등록된 미국특허 6,191,106호의 실시예에 설명된 바와 같은 EGF의 뮤테인 역시 본 발명에서 필요한 EGF 활성을 갖는 한 본 발명에서의 EGF에 속한다.

본 발명자들은 이러한 EGF가 기도 점액 과분비 및 만성폐쇄성폐질환의 예방 또는 치료에 효과가 있음을 밝혀내어 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 일 측면에 있어서, 본 발명은 EGF 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 기도 점액 과분비의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

또한, 다른 일 측면에 있어서, 본 발명은 EGF 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 만성폐쇄성폐질환(COPD)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 상기 COPD는 만성기관지염 또는 폐기종일 수 있다.

상기 EGF는 앞서 정의한 바와 같은 화학합성 또는 재조합 합성된 것이거나, 천연원 유래의 임의의 EGF일 수 있으며, 바람직하게는 재조합 대장균(E. coli JM101)으로부터 분리 정제된 것을 사용할 수 있다. 이 경우, 상피세포성장인자는 재조합 대장균을 반회분식(Fed-batch) 방법으로 48-72 시간동안 발효시킨 후, 발효 상등액을 암바크롬 CG71 크로마토그래피(Amberchrome CG71 chromatography)와 Q-세파로즈 크로마토그래피(Q-sepharose chromatography) 방법으로 순수 분리함으로써 정제된다(US 5,652,120, JP 2609515, EP O 652 954, KR102993, KR 107023, KR 110123, KR 114856). 재조합 대장균으로부터 분리 정제된 상피세포성장인자가 동일하다는 것은 US 5,652,120, JP 2609515, EP 0 652 954, KR 102993, KR 107023, KR 110123, KR 114856 등에서 이미 확인된 바 있다.

본 발명자들은 상기 EGF가 점액질 과발현의 감소, 염증의 감소, 및 세포사멸의 감소 효과가 있음을 in vitro 모델에서 확인하였으며, COPD에 대한 in vivo 모델에서 대한 병리학적 소견을 관찰함으로써, EGF가 기도의 점액 과분비 및 COPD의 예방 또는 치료에 효과가 있음을 밝혀냈다. 이러한 in vitro 실험 및 in vivo 실험은 하기 실시예에서 구체적으로 설명하였다.

상기 약제학적 조성물에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 상기 조성물의 투여방법에 따른 제제의 형태에 따라 달라질 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 정맥내 투여, 피하 투여, 기관내 투여, 또는 흡입에 의한 투여 방법에 따라 투여될 수 있다. 따라서, 상기 약제학적 조성물은 주사제, 또는 흡입을 위한 액제, 스프레이제, 현탁제, 또는 콜로이드제 등의 형태로서 제제화될 수 있으며, 식염수 또는 완충용액 등이 주된 약제학적 담체로 이용될 수 있다. 상기 제제는 필요에 따라, 점도 조절제, 삼투압 조절제, 완충제, pH 조절제, 안정화제, 방향제, 착색제, 방부제 등과 같은 첨가제를 함유할 수 있다. 이러한 제제화에 필요한 기술 및 약제학적으로 적절한 담체, 첨가제 등에 관해서는 당해 제제학 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 널리 알려져 있으며, 이와 관련하여 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)를 참조할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물에 있어서, 상기 EGF는 기도 점액 과분비나 COPD 의 예방 또는 치료에 유효한 양으로 투여될 수 있으며, 상기 치료학적으로 유효한 양은 기도 점액 과분비나 COPD의 정도, 환자의 나이, 성별, 감수성 등에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 조성물은 기도의 점액 과분비의 예방 또는 치료, 그리고 COPD의 예방 또는 치료를 위해, EGF 0.1 ㎍/kg ~ 100 mg/kg을 주 1~5 회 투여하는 것을 1 ~ 8 주기 수행할 수 있으며, 제제의 종류에 따라 가감될 수 있다.

본 발명에 따른 EGF를 포함하는 약제학적 조성물은, 흡입투여에 적절한 용기 내에 배치하여 점액 과분비의 예방 또는 치료를 위해 편리한 제제로서 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 흡입투여용기 및 그 안에 존재하는 EGF를 포함하는 유동성 조제물을 포함하는, 기도 점액 과분비 치료에 사용하기 위한 패키지를 제공한다.

상기 흡입투여용기는 당해 기술분야에서 통상적으로 기도에 흡입투여하기에 적절한 것으로 알려져 있는 임의의 용기가 사용될 수 있으나, 바람직하게는 미터용량흡입기 또는 분무기 등이 이용될 수 있다. 미터용량흡입기가 이용될 경우는 상기 EGF는 추진제와 함께 제제화되어 상기 조제물을 형성할 수 있다. 상기 추진체로는 당해 기술분야 공지되어 있는 적절한 임의의 추진체가 이용될 수 있으며, 예를 들어 탄화수소류의 추진체가 이용될 수 있다. 상기 분무기가 이용될 경우에는 상기 EGF는 식염수 또는 완충용액과 함께 제제화되어 상기 조제물을 형성할 수 있다. 분무기를 이용하여 투여하게 되면, 기체 내에서 실질적으로 균일한 크기의, 매우 미세한 액체 입자의 형태로 기도 내로 투여할 수 있다. 이러한 흡입투여용기 를 이용한 제제화 또한, 당해 제제학 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 널리 알려져 있으며, 이와 관련하여 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)를 참조할 수 있다.

앞서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 활성성분으로 EGF를 포함하여 COPD 또는 기도 점액 과분비의 예방 또는 치료에 사용할 수 있는 약제학적 조성물을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면 흡입투여용기 중에 EGF를 포함하는 조제물을 포함시켜 기도 점액 과분비의 예방 또는 치료에 편리하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: EGF의 COPD 및 기도 점액 과분비에 대한 효능 시험

1. 재료 및 방법

1-1. 점액질 발현 억제 효과 확인

6-웰 플레이트의 한 웰당 10⁶의 NCI-H292 세포(ATCC, CRL-1848)를 적정한 뒤 하루 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 무혈청 배지α를 하루 동안 처리 한 후 100 mg/mL의 Pseudomonas aeruginosa 리포폴리사카라이드(이하, PA-LPS, Sigma L8643)와 10 ng/mL Transforming growth factor-alpha(이하 TGF-α, R&D systems 239-a-100)를 6 시간 동안 동시에 처리하여 MUC5AC 점액질의 과발현을 유도하였다. PA-LPS와 TGF-α를 모두 제거한 상태에서 EGF을 농도 별로 처리한 후 real time PCR 기법을 사용하여 유발된 점액질(MUC5AC) 유전자의 발현을 확인하였다.

본 실험에서 사용한 모든 EGF는 이미 알려진 천연 hEGF(human Epidermal Growth Factor)와 아미노산 서열은 같으나, 한국특허등록 0107023 및 WO 94/025592에 개시된 유전자 서열과 발현벡터를 이용해 제조되는 재조합 단백질이다.

1-2. 항염증 효과 확인

12-웰 플레이트의 한 웰 당 5 x 10⁴의 MLE-12 세포(ATCC, CRL-2110 murine alveolar epithelial cell)를 적정한 뒤 3 ~ 4일간 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 무혈청 배지를 12 시간 처리한 후 EGF과 KGF를 각각 1시간 동안 처리한 후 0.1 U/mL 엘라스타제(Sigma, E1250)로 18 시간 동안 염증을 유발하였다. 유발된 염증은 real time PCR 기법을 사용하여 ICAM-1(IntraCellular Adhesion Molecule-1) 유전자의 발현으로 확인하였다.

1-3. 세포 보호 효과 확인

96-웰 플레이트의 한 웰 당 5 x 10⁵의 MLE-12 세포를 적정한 뒤 하루 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 2 U/mL 엘라스타제가 함유된 배양 배지와 EGF를 혼합하여 하루 동안 세포에 처리하였고, 세포 사멸 정도는 살아있는 세포만을 염색하는 뉴트럴 레드(neutral red)를 사용하여 NRU(Neutral Red Uptake) 어세이를 실시하였다. 엘라스타제와 EGF를 처리한 각 웰에 100 mg/mL의 뉴트럴 레드 염색 시약을 3 시간 동안 처리하여 살아있는 세포를 염색하였다. 고정 용액(1% 포름알데히드, 1% CaCl₂)으로 1 분간 고정한 뒤 발색 용액(50% 에탄올, 1% 빙초산)으로 염색 시약을 추출한 후 540 nm 파장에서 흡광을 측정하였다.

1-4. 폐기종 동물모델에서 EGF의 효과 확인

1-4-1. 실험동물

평균체중이 200~250 g인 6 주령 수컷 Sprague-Dawley 랫드(Japan SLC, Inc)를 1 주간 순화하여 7 주령 랫드로 실험을 수행하였다. 실험동물은 항온, 항습(온도 22 ± 3℃, 상대습도 55 ± 15%, 형광등조명 12 시간, 08:00 점등 ~ 20:00 소등)이 되는 사육장의 IVC (Individually Ventilated Cages ) rack (GR900 plus rat cage, Polysulfone, 355 W x 405 I x 230 H mm)에서 사육되었으며, 식이와 물은 자유롭게 섭식하도록 하였다(고형사료 5L79, ㈜ 오리엔트).

1-4-2. PPE(Porcine pancreatic elastase)를 이용한 폐기종 모델

랫드를 이소플루란 마취 하에 돼지 췌장 엘라스타제(이하 PPE, Merck 324682) 120 U/kg을 1 mL/kg으로 기관 내 단회 점적투여하였으며, 폐기종 미유발군은 0.9% 식염수를 1 mL/kg으로 기관내 단회 점적투여하였다. 시험물질의 폐강 내 균일한 투여를 위하여 모든 점적 투여 시 투여물질의 양과 동일하게 공기를 함께 주입하였다.

PPE 투여 후 4 주째 EGF 0, 0.1, 또는 1 mg/kg을 각각 기관 내로 점적 투여하였으며, PPE 투여 후 4 주부터 6 주까지 주 1회, 총 3회 EGF를 기관 내로 점적 투여하였다. PPE 투여 후 7 주째 이소플루란으로 마취하여 폐와 기관를 적출한 후 10% 중성 포르말린에 고정하였다. 그런 다음, 기관 조직을 현미경으로 관찰하여 촬영하고, 기관 및 폐의 조직병리학적 검사를 수행하였다.

1-4-3. 통계방법

실험 결과는 평균치± 표준편차로 표시하고, 음성 대조군과 통계적으로 유의성이 있는 시험군을 알아내기 위해 one way ANOVA를 이용하여 통계처리를 실시하고 다중비교법을 이용하여 유의성을 분석하였다.

1-5. 유전자 발현 시험 방법

상기 시험에서 수행한 유전자 발현 확인시험은 다음과 같은 방법으로 수행하였다.

1-5-1. 총 RNA 분리

총 RNA를 분리하기 위해 QIAGEN사 키트(RNeasy Plus Mini 키트, 74134)를 이용하여 제조사가 제공한 실험방법에 따라 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA는 스펙트 로포토미터(spectrophotometer)를 이용하여 260 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 RNA를 정량하였다.

추출한 RNA로부터 SuperScript Ⅲ(Invitrogen, 18080-044)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 역전사 반응은 RNA 시료 1 ㎍, Oligo(dT) 프라이머 1.25 μM, random hexamers 25 ng, dNTP 5 mM, MgCl₂ 5 mM, 200 U SuperScript Ⅲ의 조건으로 수행하였다. 50℃에서 30분 동안 반응시켜 cDNA를 합성한 후, 85℃에서 5분 동안 열을 가하여 반응을 중지시켰다. 합성된 cDNA는 소량으로 분주하여 -70℃에 보관하였다.

1-5-2. 프라이머 준비

인간의 MUC5AC 유전자(AJ001402)와 내부 대조군(Endogenous control)로 사용할 베타-액틴(β-ACT, NM001101) 그리고 murine ICAM-1 유전자(NM010493)와 내부 대조군으로 사용할 리보솜 단백질 L13(RPL13, NM016738)의 프라이머는 NCBI의 GeneBank에서 검색한 mRNA 염기서열을 바탕으로 디자인하였다. 프라이머 세트는 Applied Biosystems사가 제공하는 Primer Express 프로그램을 이용하여, 일반적으로 PCR 프라이머 요건을 따르되 증폭산물의 길이가 100 bp 내외이고 Tm값이 80℃ 내외가 되도록 디자인하였다. 유전자별로 사용한 프라이머는 하기 표 1과 같다.

[표 1]

인간

MUC5AC-for: 5'CCTCTTCTACCCTGGCGAGAC 3' (SEQ ID NO: 2) MUC5AC-rev: 5'AGCCCATCCTGGTGCTTCT 3' (SEQ ID NO: 3) β-ACT-for: 5'GGCATTGCCGACAGGATG 3' (SEQ ID NO: 4) β-ACT-rev: 5'CTCAGGAGGAGCAATGATCTTGAT 3' (SEQ ID NO: 5)

마우스

ICAM-1-for: 5'GCCACTTCCTCTGGCTGTCA 3' (SEQ ID NO: 6) ICAM-1-rev: 5'CACCGAGTCCTCTTAGCTCTGAG 3' (SEQ ID NO: 7) RPL13-for: 5'AAGGGAGACAGTTCTGCTGAAGAA 3' (SEQ ID NO: 8) RPL13-rev: 5'TTTGTACACATTCCGGATGGG 3' (SEQ ID NO: 9)

1-5-3. 반응 조건 확립

SYBR 그린 어세이는 SYBR 그린 PCR master mix (Applied Biosystems, 4309155) 12.5 mL에 cDNA, 정방향 프라이머, 역방향 프라이머를 각각 첨가하여 총 25 mL 로 진행하였다.

cDNA는 RT때 사용한 총 RNA 기준으로 50 ng의 양이 되도록 첨가하였다. 프라이머는 정방향 프라이머, 역방향 프라이머에 대한 100 nM, 300 nM, 900 nM의 3 x 3 농도 조합 중 비특이적 합성 없이 유전자 증폭이 가장 잘 이루어지는 농도를 결정하여 사용하였다. MUC5AC, ICAM-1, RPL1에 대해 결정된 프라이머의 농도는 모두 900 nM 이었고 β-ACT 는 300 nM 이었다.모든 프라이머 세트 종류에 대하여 cDNA를 넣지 않은 음성 대조군 시료를 같이 준비하여 비특이적 생성물의 유무를 확인하였다. 또한, 동일 실험을 2-3번 반복하여 피펫팅 오차(pipetting error), 웰간 변이(variation) 등에 의한 실험적 오차를 줄였다. PCR 반응은 50℃ 1 분, 95℃ 10 분의 초기 반응 후, 95℃ 15 초 60℃ 1분 주기를 40 - 50 회 반복하였다. 반응 후에는 기기에서 제공하는 프로토콜에 따라 분리(dissociation) 실험을 수행하여 비특이적 증폭 유무를 확인하였다.

1-5-4. 상대적 유전자 발현량 측정

테스트하는 임상 시료의 Ct(cycle of threshold) 값이 스탠다드 커브(Standard curve)를 벗어나지 않도록 적절한 cDNA 농도 범위를 결정하여 사용하였다. 스탠다드 커브용 시료는 시료에서 추출한 RNA들을 혼합한 후 cDNA를 합성한 것을 사용하였다. 매 반응마다 스탠다드용 실험을 동일 플레이트 내에서 3 회 반복하여 진행하고, 세 반응 중 현저한 차이를 나타내는 것을 제외한 나머지 2-3 반응의 평균 Ct 값을 이용하여 스탠다드 커브를 그렸다. 이때 스탠다드 커브의 상관계수(R2) 값이 1 과 가깝게 되고 기울기 값이 3.3과 가깝게 되도록 역치(threshold) 값을 조정하였다.

스탠다드로 사용한 cDNA내의 특정 유전자의 정확한 양을 모르기 때문에 본 어세이로 결정하는 유전자량은 스탠다드 시료에 대한 상대적인 발현량이라 할 수 있다. 먼저 스탠다드 커브를 그릴 때 결정한 역치 값을 사용하여 각 시료 별로 Ct 값을 결정하고 Ct 값을 스탠다드 커브와 비교하여 유전자량을 구하였다. 시료별 cDNA 농도 차이를 보정하여 각 시료의 상대적 유전자 발현량을 결정하였다.

각 시료간 cDNA 농도 차이는 주로 역전사 반응 효율의 차이에 기인한다. 즉, 동일한 조건으로 역전사 반응을 수행하더라도 PCR 기기의 웰 간 분산(variation)으로 합성되는 cDNA 양이 약간씩 달라지게 된다. 역전사 후 cDNA만을 분리하거나 농도를 측정하는 단계가 없기 때문에 RT 효율에 의한 시료간 cDNA 농도 차이는 내부 대조군을 사용하여 보정하였다. 내부 대조군은 house keeping 유전자 RPL13을 사용하였다. 내부 대조군은 각 시료 별로 발현량이 같다고 가정하였으므로 각 cDNA의 상대적인 양은 내부 대조군의 발현량에 비례하게 된다. 따라서 cDNA 차이를 보 정하기 위한 정상화 배수(normalization fold)는 내부 대조군의 상대적 발현량의 역수가 된다.

cDNA의 농도 차이를 보정할 때에는 구해진 스탠다드 커버를 이용하여 구한 유전자량에 정상화 배수를 곱하여 상대적 유전자 발현량을 구하였다.

2. 결과

2-1. 만성 기관지염(Chronic Bronchitis) in vitro 모델에서 EGF의 효과

100 mg/mL의 PA-LPS와 10 ng/mL TGF-α를 동시에 처리하여 점액질 유전자인 MUC5AC를 과발현 시킨 후, EGF를 50, 100 ng/mL의 농도로 처리한 후 MUC5AC의 mRNA 발현을 조사한 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 보여지는 바와 같이, 50 ng/mL의 EGF로 인하여 MUC5AC 발현이 65%로 감소하였고, 100 ng/mL의 EGF로 인하여 60%까지 MUC5AC 발현이 감소하여 EGF로 인한 점액질 발현 억제 효과를 확인할 수 있었다.

2-2. 폐기종 in vitro 모델에서 EGF의 효과

2-2-1. EGF의 항염증 효과

MLE-12 세포에 0.1 U/mL의 엘라스타제를 단독 처리한 군과 100 ng/mL의 EGF을 혼합하여 처리한 그룹간의 ICAM-1 유전자 발현을 비교한 결과를 도 2에 나타내었다. ICAM-1은 폐의 상처 부위에 대식세포(macrophage)와 호중성 백혈구(neutrophil)을 끌어들여 염증반응을 악화시키는 것으로 알려져 있다. EGF를 1 시간 동안 전처리한 후 엘라스타제를 18 시간 동안 처리하여 EGF에 의한 항염증 효과를 보고자 하였다.

도 2에서 보여지는 바와 같이, 엘라스타제를 처리하면 음성 대조군에 비해 ICAM-1의 발현이 2배 증가하였고, EGF을 전처리 한 군에서는 60% 이상 ICAM-1 발현이 감소하여, EGF에 의한 항염증 효과를 확인할 수 있었다.

2-2-2. 폐포 세포 보호 효과

MLE-12 세포에 2 U/mL의 엘라스타제를 단독 처리한 군과 여러 농도의 EGF을 혼합하여 처리한 그룹간의 세포 독성을 비교한 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 보여지는 바와 같이, 엘라스타제 단독 처리 그룹을 100%, 배양 배지만을 처리한 군을 0% 세포 독성이라고 설정한 후, EGF의 세포 보호 효과를 살펴본 결과, 160 ng/mL의 EGF을 첨가한 경우 세포 독성이 약 10% 정도 감소하였고 100 ㎍/mL에서는 15% 정도 독성이 감소하여 엘라스타제에 의한 세포 사멸로부터 세포를 보호하는 효과를 확인할 수 있었다.

2-2-3. PPE를 이용한 폐기종 모델

PPE로 유발한 랫드의 폐기종(emphysema) 모델에서 EGF의 투여에 따른 병변의 완화 효과를 확인하고자 기관 및 폐장의 조직병리학적 검사를 실시하였다. 폐기종 미유발군(G1), 폐기종 유발 대조군(G2), 폐기종유발+EGF 0.1 mg/kg 처리군(G3) 각각의 기관 조직을 광학 현미경(X 40)으로 관찰하여 촬영한 사진을 각각, 도 4, 도 5, 및 도 6에 나타내었다(도 4: 개체 수= 5. 도 5: 개체 수= 20, 도 6: 개체 수 = 11). 또한, 기관 및 폐장의 조직병리학적 검사결과를 도 7 및 도 8에 표로서 나타 내었다.

조직병리학적 검사 결과, 폐기종 미유발군(G1)에서는 폐포 확장, 조직구증 및 술잔세포 과다형성이 각각 2 례, 3 례 및 1 례인 것을 제외하고는 주목할 만한 병변을 확인하지 못하였다.

폐기종 유발군(G2 및 G3)의 주요 소견으로는 기종성 병변으로써 폐포의 확장(enlargement of alveoli) 및 붕괴(breakdown of alveoli)가 관찰되었으며, 일부 폐장에서는 폐포강 내 공포를 함유한 세포질이 풍부한 조직구가 관찰되는 폐포 조직구증(alveolar histiocytosis) 및 국소적인 출혈(hemorrhage)이 관찰되기도 하였다.

폐기종 유발 대조군(PPE 유도 폐기종 + 부형제 대조군)(G2)의 동물은 폐포 확장 및 폐포붕괴 소견이 경도부터 현저한 정도까지 다양하였으며, 모두 다른 군에 비하여 병변의 정도가 가장 심하였다. 폐포 확장은 현저한 정도, 중등도 및 경도가 각각 1 례, 4 례 및 1 례였으며, 폐포 붕괴는 중등도 및 경도가 각각 3 례 였다. 조직구증은 2 례가 관찰되었으나 그 정도가 미약한 수준이었다.

폐기종이 유발된 EGF 0.1 mg/kg 투여군(G3)에서는 폐포 확장은 중등도, 경도 및 극미한 정도가 각각 1 례, 3 례 및 2 례였으며, 폐포 붕괴는 중등도, 경도 및 극미한 정도가 1 례, 3 례 및 1 례 확인되었다. 조직구증은 극미한 정도로 1 례 관찰되었다.

3. 결론 및 고찰

만성 기관지염과 폐기종에 대한 치료 효과를 in vitro 평가법으로 확인한 결과, PA-LPS와 TGF-α로 인하여 과발현된 점액 단백질(Mucin) 중 대표적인 MUC5AC 유전자가 EGF으로 인하여 발현이 상대적으로 감소되는 것을 확인하였으며, 염증을 유발시킨 폐포 세포에서 EGF 처리 후 ICAM-1 발현이 감소되어 염증 반응이 감소되는 것을 확인하였다. 이로부터, EGF가 기도점액의 과다분비를 억제하는 효과가 있다는 것을 알 수 있었다.

엘라스타제를 사용하여 폐기종의 특징인 페포 세포 파괴를 유발하고, 세포 사멸을 뉴트럴 레드로 살아있는 세포를 염색하여 사멸한 세포와 구별하여 관찰한 결과, 엘라스타제에 의해서 유발된 세포 사멸은 EGF의 첨가로 인하여 감소하는 경향이 나타났으며, 이로부터 EGF의 폐포 세포인 MLE-12 세포에 대한 세포 보호 효과가 확인되었다.

엘라스타제를 기관내 투여(intratracheal injection)하여 폐기종이 유발된 랫드에서 시험물질인 EGF의 완화효과를 알아보고자 각 동물을 조직병리학적으로 비교하였다. 유발된 폐기종에서는 검체의 폐장 병변으로 폐포강 확장 및 폐포벽 붕괴를 특징으로 하는 기종성 병변이 주로 관찰되었으며, 폐장의 출혈 및 염증 또는 기도상피(airway epithelium)의 비정상적인 변화는 모두 주목할 만한 수준으로 확인되지 않았다. 이러한 소견은 인간 호중구 엘라스타제로 유발한 폐장 병변에서 급성단계(acute phase)가 주로 폐출혈 및 호중구침윤 소견을 나타내는 반면, 만성단계(chronic phase)는 폐장의 과다팽창(hyperinflation), 탄성되감기의 기능감퇴(degradation of elastic recoil) 및 공기공간확장(airspace enlargement)이 주 로 확인되는 기존의 보고와도 유사하였다.

본 시험 결과, 폐기종 미유발군(G1)은 총 4마리의 동물에서 극미한 폐포 확장 소견이 관찰되기도 하였으나, 유발군에 비하여 병변의 분포 및 정도가 극히 미약하여 폐기종 유발군의 병변과는 차이가 있었다. 폐기종 미유발군의 극미한 확장소견은 물질 자체의 영향보다는 물질의 기관내 투여에 따른 물리적 자극으로 형성될 수 있는 것으로 사료된다. 폐기종 유발군에서 기종성 병변이 가장 현저한 군은 부형제 대조군(G2)으로 엘라스타제에 의해 본 병변이 유발되었음을 확인할 수 있었다. EGF 투여군(G3)에서 폐포확장과 붕괴가 폐기종을 유발한 부형제 대조군에 비해 병변 정도 및 횟수가 감소하였다. 따라서, 본 조직병리학적인 검사결과, PPE을 이용한 폐기종모델에서 병변이 EGF의 기관내 투여로 인하여 완화되는 것으로 판단되었다.

요약하면, EGF는 점액질 과다 발현 억제, 항염증효과, 폐포세포 보호효과, 폐기종 모델에서의 조직병리학적 소견의 개선 등의 효과를 갖는다는 것이 확인되었으므로, EGF는 만성기관지염, 폐기종과 같은 COPD에 있어서 효과가 있을 뿐만 아니라, 광범위한 만성 폐질환에서의 기도 점액 과분비에 대한 예방 및 치료효과가 있다는 것을 알 수 있다.

도 1은 NCI-H292 세포에 PA-LPS 와 TGF-a를 6시간 동안 처리하여 MUC5AC 유전자를 과발현시킨 다음, 50, 100 ng/mL의 EGF를 각각 처리한 후 MUC5AC 유전자의 발현을 real time PCR로 측정한 결과를 대조군(PA-LPS + TGF-a only)과 비교하여 그래프로서 나타낸 것이다.

도 2는 MLE-12 세포에 0.1 U/mL의 엘라스타제와 100 ng/mL의 EGF를 처리한 후 ICAM-1 유전자의 발현을 real time PCR로 측정한 결과를 대조군(elastase only, media only)과 비교하여 그래프 및 표로서 나타낸 것이다.

도 3은 MLE-12 세포에 2 U/mL의 엘라스타제와 EGF를 농도별로 각각 혼합한 후 24 시간 동안 처리한 다음, 살아있는 세포를 뉴트럴 레드(Neutral red)로 염색한 뒤 대조군(elastase only, media only)과 비교하여 세포 독성이 감소한 정도를 그래프 및 표로 정리한 것이다.

도 4, 5, 및 6은 PPE로 유발한 랫드의 폐기종(emphysema) 모델에서 EGF의 투여에 따른 병변의 완화 효과를 확인한 실험에서, 폐기종 미유발군(도 4), 폐기종 유발 + 부형제 대조군(도 5), 폐기종유발 + EGF 0.1 mg/kg 처리군(도 6)의 각각의 기관 조직을 광학 현미경(X 40)으로 관찰하여 촬영한 사진이다. B : 세기관지, '*' : 폐포확장 및 붕괴

도 7은 PPE로 유발한 랫드의 폐기종(emphysema) 모델에서 EGF의 투여에 따른 병변의 완화 효과를 확인한 실험에서, 기관 및 폐장의 조직병리학적 검사결과를 표로서 나타낸 것이다.

도 8은 도 7의 실험 결과를 각각의 동물 모델에 대해 구체적으로 나타낸 표이다.

<110> DAEWOONG CO. LTD. <120> A pharmaceutical composition for preventing or treating chronic obstructive pulmonary disease <130> PN081139 <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 53 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His 1 5 10 15 Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn 20 25 30 Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys 35 40 45 Trp Trp Glu Leu Arg 50 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 cctcttctac cctggcgaga c 21 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 agcccatcct ggtgcttct 19 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 4 ggcattgccg acaggatg 18 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 5 ctcaggagga gcaatgatct tgat 24 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 6 gccacttcct ctggctgtca 20 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 7 caccgagtcc tcttagctct gag 23 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 8 aagggagaca gttctgctga agaa 24 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 9 tttgtacaca ttccggatgg g 21

Claims

상피세포성장인자(EGF) 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 기도 점액 과분비의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
상피세포성장인자(EGF) 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 만성폐쇄성폐질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 만성폐쇄성폐질환은 만성기관지염 또는 폐기기종인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 EGF는 화학합성 또는 재조합 합성된 것이거나 천연원으로 유래된 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수 또는 완충용액인 것을 특징으로 하는 조성물.
흡입투여용기 및 그 안에 존재하는 약제학적으로 활성인 상피세포성장인자를 포함하는 유동성 제조물을 포함하는, 기도 점액 과분비의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 패키지.
제 6 항에 있어서, 상기 EGF는 화학합성 또는 재조합 합성된 것이거나 천연원으로 유래된 것을 특징으로 하는 패키지.
제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 상기 흡입투여용기는 미터 용량 흡입기이고, 상기 EGF는 추진제와 함께 조제되는 것을 특징으로 하는 패키지.
제 6 항 또는 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 흡입투여용기는 분무기이고, 상기 EGF는 식염수 또는 완충요액과 함께 조제되는 것을 특징으로 하는 패키지.