KR20100037638A - Ｅｇｆｒ 억제제를 이용한 치료에 대한 예측 마커 - Google Patents

Abstract

본 발명은 암 환자에서 EGFR 억제제를 이용한 치료의 임상적 이익을 예측하는 바이오마커 SFRS7 을 제공한다.

Description

ＥＧＦＲ 억제제를 이용한 치료에 대한 예측 마커 {PREDICTIVE MARKER FOR EGFR INHIBITOR TREATMENT}

본 발명은 암 환자에서 EGFR 억제제를 이용한 치료의 임상적 이익을 예측하는 바이오마커를 제공한다.

많은 인간 악성종양이 상피 성장 인자 수용체 (EGFR) 의 일탈 또는 과발현과 연관되어 있다. EGF, 형질전환 성장 인자-α (TGF-α) 및 다수의 기타 리간드가 EGFR 에 결합하여, 수용체의 세포내 타이로신 키나아제 도메인의 자가인산화를 자극한다. 다양한 세포내 경로들이 후속하여 활성화되며, 이들 하류방향 사건들은 시험관 내 종양 세포 증식을 초래한다. EGFR 을 통한 종양 세포의 자극이 생체 내 종양 성장과 종양 생존 모두에 중요할 수 있다는 것은 기정사실이다.

EGFR 타이로신 키나아제의 억제제인 Tarceva™ 를 이용한 초기의 임상 데이터는, 그 화합물이 안전하며, 표적으로 하는 유효 농도를 제공하는 투여량 (전임상 데이터로 결정됨) 에서 일반적으로 널리 용인된다고 했다. 진행성 질환 환자에서의 제 I 상 및 II 상 임상 시험은, Tarceva™ 가 폭넓은 상피 종양에서 유망한 임상 활성을 갖는다는 것을 증명했다. 실제로, Tarceva™ 가 두경부암 환자 및 NSCLC (비-소세포 폐암) 환자에서, 기존 확립된 2 차 항암치료의 화학요법과 비슷한 정도로 지속적인 부분적인 차도를 유도할 수 있으면서도, 화학요법보다 더 나은 안전성 프로파일 및 개선된 편의성 (정맥내 [i.v.] 투여 대신 정제) 이라는 이점을 추가하는 것으로 나타났다. 최근 완결된, 무작위적인 이중맹검 위약 통제 시험 (BR.21) 은, 단일 약제 Tarceva™ 가 진행성 질환에 대한 표준 요법이 실패한 NSCLC 환자의 생존을 현저하게 연장시키고 개선시킨다는 것을 보여줬다.

Tarceva™ (erlotinib) 는 소형 화학 분자이다; 이는 EGFR 타이로신 키나아제의, 경구활성인 강력하고 선별적인 억제제 (EGFR-TKI) 이다.

폐암은 북미 및 유럽에서 암 관련 사망의 주된 요인이다. 미국에서, 폐암에 부차적인 사망자 숫자는 암 관련 사망 원인을 주도하여, 두번째 (대장암), 세번째 (유방암) 및 네번째 (전립선암) 를 총합한 사망자 수를 능가한다. 전체 폐암의 약 75% 내지 80% 이 NSCLC 이며, 약 40% 의 환자들은 국소적으로 진행되고/되거나 수술로 치유불가능한 질환을 나타내고 있다. 이러한 그룹에는 일반적으로 악성 흉수를 제외한, 종양의 부피가 큰 병기인 IIIA 기 및 IIIB 기 질환을 가진 이들이 포함된다.

유럽 연합에서, 매 년 폐암의 대략적인 발생율은 100,000 명당 52.5 명이며, 사망율은 48.7　명이다. 남성들 중에서는 상기 비율이 각각 79.3 및 78.3 이며, 여성들 중에서는 상기 비율이 각각 21.6 및 20.5 이다. NSCLC 은 폐암 전체의 80% 를 차지한다. 남성 폐암 사망의 약 90% 및 여성 폐암 사망의 80% 는 흡연이 원인이다.

미국에서, 미국 암 학회에 따르면, 2004 년 동안 약 173,800 건의 신규한 폐암 발병 (남성 93,100 건, 여성 80,700 건) 이 있었으며, 이는 모든 신규한 암 발병의 약 13% 를 차지했다. 대부분의 환자들은 진단 후 2 년 내에 그 질환으로 인해 사망한다. 다수의 NSCLC 환자에 있어서, 성공적인 치료는 찾기 힘든 것으로 남아있다. 한참 진행된 종양은 종종 수술로도 치료불가능하며, 용인가능한 투여량의 방사선요법 및 화학요법에도 내성을 가지게 될 수 있다. 무작위 시험에서, 현재 가장 활발한 병용 화학요법은 약 30% 내지 40% 의 반응율을 달성하며, 1 년간 생존율은 35% 내지 40% 이다. 이는 단독적인 보존적 치료가 보여주는 10% 의 1 년 생존율을 훨씬 앞선다.

최근까지, 재발한 환자에 대한 치료 선택폭은 최선의 보존적 치료 또는 일시적 완화로 제한되어 있었다. 도세탁셀 (Taxotere) 과 최선의 보존적 치료를 비교한 최근의 시험에서는, NSCLC 환자가 시스플라틴 기반의 1 차 항암치료의 섭생에 실패한 후, 2 차 항암치료의 화학요법으로 효과를 볼 수 있다는 것을 보여줬다. 모든 연령대의, ECOG 활동 상태 (performance status) 가 0, 1, 또는 2 인 환자에서, 앞서 했던 백금-기반의 치료로는 치료가 어려웠던 이들에서처럼, 도세탁셀의 이용으로 생존이 개선되었음을 증명했다. 상기 요법으로 이익을 얻지 못한 환자들에는, 10% 의 체중 손실이 있거나, 락테이트 디히드로게나아제 수준이 높거나, 여러 장기에 연루되어 있거나 또는 간에 연루되어 있는 이들이 포함되었다. 부가적으로, 도세탁셀 단일요법의 이익은 2 차 항암치료 설정을 넘어서진 못했다. 3 차 이상의 항암치료로서 도세탁셀을 수여받은 환자들에게서 생존 연장이 나타나지 않았다. 단일 약제 도세탁셀은 NSCLC 에 대한 표준 2 차 항암치료 요법이 되었다. 최근, NSCLC 의 2 차 항암치료 요법에서 또다른 무작위적인 III 상 시험에서는 페메트렉세드 (Alimta®) 와 도세탁셀을 비교했다. 페메트렉세드를 이용한 치료는 임상적으로 동등한 효능을 도출했으나, 도세탁셀보다 훨씬 더 적은 부작용이 있었다.

개별화된 암 치료 방법 개발에 대한 필요가 있음은 오래전부터 인정되어 왔다. 목표로 삼은 암 치료법을 개발하면서, 종양 표적의 분자적인 프로파일을 제공할 수 있는 방법론 (즉, 임상적 이익에 대한 예측을 하는 것) 이 특별한 관심대상이 되었다. 암에서의 유전자 발현 프로파일링에 대한 법칙의 증거는, 현재의 형태학적 및 면역세포화학적 시험을 근거로 하기에는 명확하지 않은, 종양 유형의 분자적 분류를 이용하여 이미 확립되어 있다. 유전자 발현 프로파일링을 사용하는 미만성 거대 B 세포 림프종의 단일 현행 분류에서 예후를 달리하는 2 가지 별개의 질환 실재가 구별되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 암 환자에서 EGFR 억제제를 이용한 치료의 임상적 이익을 예측하는 발현 바이오마커를 제공하는 것이다.

첫번째 목적으로는, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, EGFR 억제제를 이용한 치료에 대한 암 환자의 임상적 이익을 예측하기 위한 시험관 내 방법을 제공한다:

환자의 종양 시료 중의 SFRS7 유전자의 발현 수준을 측정하고, SFRS7 유전자의 발현 수준을 치료로부터 임상적 이익을 얻지 못한 환자 집단의 종양 중의 SFRS7 유전자의 발현 수준의 대표값과 비교하는 것을 포함하는 방법으로서, 환자의 종양 시료 중의 SFRS7 유전자의 높은 발현 수준이 치료로부터 임상적 이익을 얻게 될 환자에 대한 지표인 방법.

약어 SFRS7 은 스플라이싱 인자, 아르기닌/세린-풍부 7 을 의미한다. Seq. Id. No. 1 에는 인간 SFRS7 의 뉴클레오티드 서열이 제시되어 있다.

용어 "치료로부터 임상적 이익을 얻지 못한 환자 집단의 종양 중의 SFRS7 유전자의 발현 수준의 대표값" 은 치료로부터 임상적 이익을 얻지 못한 환자 집단의 종양 중의 마커 유전자의 평균 발현 수준의 계산치를 의미한다. 임상적 이익은 12 주 이상 동안 목적하는 반응 또는 질환 안정화를 보이는 것으로 정의되었다.

더욱 바람직한 구현예에서, SFRS7 유전자는 치료로부터 임상적 이익을 얻지 못한 환자 집단의 종양 중의 SFRS7 유전자의 발현 수준의 대표값과 비교하여 환자의 종양 시료에서 1.2 내지 1.7 배 이상 높은 발현 수준을 보인다.

바람직한 구현예에서, 마커 유전자의 발현 수준은 마이크로어레이 기법 또는, 정량 RT-PCR 과 같이 RNA 발현 수준을 평가하는 기타 기법으로, 또는 각각의 단백질의 발현 수준을 관찰하는 임의의 방법, 예를 들어 면역조직화학법 (IHC; immunohistochemistry) 으로 측정한다. 유전자 칩의 구축 및 이용은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어 미국 특허 제 5,202,231 호; 제 5,445,934 호; 제 5,525,464 호; 제 5,695,940 호; 제 5,744,305 호; 제 5,795,716 호 및 제 5,800,992 호를 참조한다. 또한, [Johnston, M. Curr. Biol. 8:R171-174 (1998); Iyer VR 등, Science 283:83-87 (1999)] 을 참조한다. 물론, 유전자 발현 수준은 당업자에게 공지된 기타 방법, 예를 들어 노던 블롯, RT-PCR, 실시간 정량 PCR, 프라이머 신장, RNase 프로텍션, RNA 발현 프로파일링으로 측정될 수 있다.

본 발명의 마커 유전자는 기타 바이오마커와 바이오마커 세트로 조합될 수 있다. 바이오마커 세트는 암 환자에서의 EGFR 억제제를 이용한 치료 효과에 대한 예측을 위해 예측 바이오마커의 임의의 조합으로부터 성립될 수 있다. 본원에 기재되는 바이오마커 및 바이오마커 세트는, 예를 들어, 어떻게 암 환자가 EGFR 억제제를 이용한 치료 개입에 반응할 것인지를 예측하는데 사용될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "유전자" 라는 용어는 유전자의 변이체를 포함한다. "변이체" 라는 용어는 GenBank 접근 번호로 주어진 핵산 서열과 실질적으로 유사한 핵산 서열에 관한 것이다. "실질적으로 유사한" 이라는 용어는 당업자에게는 잘 이해된다. 특히, 유전자 변이체는 인간 집단 내에서 가장 우세한 대립형질의 핵산 서열과 비교하여 뉴클레오티드 교환을 보이는 대립형질일 수 있다. 바람직하게는, 이러한 실질적으로 유사한 핵산 서열은 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 가장 우세한 대립형질과의 서열 유사성을 갖는다. "변이체" 라는 용어는 또한 스플라이싱 (splice) 변이체에 관한 것을 의미한다.

EGFR 억제제는 게피티니브, 에를로티니브, PKI-166, EKB-569, GW2016, CI-1033 및 항-erbB 항체, 예컨대 트라스투주마브 및 세툭시마브로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 또다른 구현예에서, EGFR 억제제는 에를로티니브이다.

또다른 구현예에서, 암은 NSCLC 이다.

본 발명에 의해 기재되는 유전자의 유전자 발현 검출 및 정량 기법에는 노던 블롯, RT-PCR, 실시간 정량 PCR, 프라이머 신장, RNase 프로텍션, RNA 발현 프로파일링 및 관련 기법이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 기법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 [Sambrook J 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 2000)] 를 참조한다.

본 발명에 의해 기재되는 각 유전자의 단백질 발현 검출 기법에는 면역조직화학법 (IHC) 이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따르면, 종양 또는 암 생검과 같은 환자 조직 시료로부터의 세포를 어세이하여, 하나 이상의 바이오마커의 발현 패턴을 측정할 수 있다. 암 치료의 성공 또는 실패는, 종양 또는 암 생검과 같은 시험 조직으로부터의 세포 (시험 세포) 의 바이오마커 발현 패턴이, 하나 이상의 바이오마커의 대조군 세트의 발현 패턴과 비교적 유사 또는 상이한 가에 근거해 결정될 수 있다. 본 발명의 문맥에서, EGFR 억제제를 이용한 치료로부터 임상적 이익을 얻지 못한 환자의 종양과 비교하여 EGFR 억제제를 이용한 치료로부터 임상적 이익을 얻은 환자의 종양에서, 표 3 의 유전자가 상향조절되었다는, 즉 보다 높은 발현 수준을 보인다는 것을 발견하였다. 그러므로, 시험 세포가 암 치료에 반응하였던 환자의 바이오마커 발현 프로파일에 상응하는 바이오마커 발현 프로파일을 보이는 경우, 개체의 암 또는 종양이 EGFR 억제제를 이용한 치료에 바람직하게 반응할 것 같거나 그러할 것으로 예상된다. 반대로, 시험 세포가 암 치료에 반응하지 않았던 환자의 바이오마커 발현 프로파일에 상응하는 바이오마커 발현 프로파일을 보이는 경우, 개체의 암 또는 종양이 EGFR 억제제를 이용한 치료에 바람직하게 반응하지 않을 것 같거나 그러할 것으로 예상된다.

본 발명의 바이오마커, 즉 표 3 에 열거된 유전자는 암환자, 특히 난치성 NSCLC 환자에 대한 개별화된 요법에 대한 첫번째 단계이다. 이러한 개별화된 요법은 진료 의사가 암 요법, 특히 NSCLC 에 대한 기존의 약물 중 가장 적합한 제제를 선택할 수 있도록 할 것이다. 장래의 각 환자에 대한 개별화된 요법의 이익은, 반응율/이익을 얻은 환자 수가 증가할 것이고 효과가 없는 치료로 인한 유해한 부작용의 위험이 감소할 것이라는 것이다.

본 발명의 추가 목적에서는 본 발명의 시험관 내 방법에 의해 확인된 암 환자를 치료하는 치료 방법을 제공한다. 상기 치료 방법은 표 3 의 유전자의 예측 발현 패턴에 근거해 치료하기로 선택된 환자에게 EGFR 억제제를 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 EGFR 억제제는 에를로티니브이고, 치료하고자 하는 바람직한 암은 NSCLC 이다.

도 1 은 연구 설계를 보여준다.
도 2 는 시료 처리 과정 도식을 보여준다.

연구에 대한 근거 및 연구 설계

최근 NSCLC 환자의 일부 세트의 종양 조직 중의 EGFR 유전자에서의 돌연변이 및, 에를로티니브 및 게피티니브에 대한 감수성을 가진 이러한 돌연변이의 연관성이 기재되어 있다 (Pao W, 등. 2004; Lynch 등. 2004; Paez 등. 2004). 2 가지 연구를 조합한 경우 환자에서, 돌연변이된 EGFR 은 게피티니브에 반응을 보였던 환자 14 명 중 13 명에서 관찰되었고, 반응을 보이지 않았던 11　명의 게피티니브-처리된 환자에서는 관찰되지 않았다. 이들 돌연변이의 보고된 유병율은 미선별된 NSCLC 환자 중 8% (25 명중 2 명) 에 달했다. 이들 돌연변이는 샘암종 (21%), 여성으로부터의 종양 (20%), 및 일본인 환자로부터의 종양 (26%) 에서 더욱 자주 발견되었다. 이들 돌연변이는 EGFR 의 시험관 내 활성 증가 및 게피티니브에 대한 감수성 증가를 야기하였다. 돌연변이와 장기적으로 안정된 질환 또는 생존 기간과의 관계는 유망하게 평가되지는 않았다.

BR.21 연구로부터의 예비 분석에 근거하여, 심지어 목적하는 반응을 보이는 환자를 분석에서 제외시킨 경우에도 유의한 생존 이익이 유지되기 때문에 (자료에 근거함), 관찰되는 생존 이익은 오직 EGFR 돌연변이로 인한 것만은 아닌 것으로 보인다. 기타 분자 메커니즘도 또한 효과에 기여하는 것이 분명하다.

Tarceva™ 처리에 대한 반응/이익을 예측하는 유전자 발현 수준의 변화가 있다는 가정하에, 마이크로어레이 분석을 사용하여 이들 변화를 검출하였다.

이를 위해서는 1 차 항암치료 요법의 실패 후 Tarceva™ 단일요법으로 치료된 명확하게 정의된 연구 집단이 필요하였다. BR.21 연구로부터의 실험에 근거하여, 이익을 얻은 집단을 목적하는 반응, 또는 12 주 동안의 질환 안정화를 보이는 것으로서 정의하였다. 임상 및 마이크로어레이 데이터 세트를 미리 정의된 통계 계획에 따라 분석하였다.

이 기법을 적용하기 위해서는 신선한 동결 조직 (FFT; fresh frozen tissue) 이 필요하다. 그러므로, 처리 시작 전에 의무적인 생검을 실시해야만 한다. 수집된 물질을 액체 질소 (N₂) 에서 동결시켰다.

동시에 두번째 종양 시료를 수집하고, 파라핀에 저장하였다 (포르말린 고정 파라핀 포매: FFPE; formalin fixed paraffin embedded). 상기 시료를 EGFR 신호전달 경로에서의 변경에 대해 분석하였다.

기관지경술을 통한 종양 생검을 실시하는 역량이 본 연구를 위한 전제 조건이었다. 기관지경술은 폐암 진단을 확인하기 위한 표준 절차이다. 일반적으로 안전하지만, 출혈과 같은 합병증의 위험이 남아있다.

본 연구는 난치성 NSCLC 환자에 대한 개별화된 요법에 대한 첫번째 단계이다. 이러한 개별화된 요법은 진료 의사가 상기 징후에 대해 기존의 약물 중 가장 적합한 제제를 선택할 수 있도록 할 것이다.

일단 개별화된 요법이 가능해지면, 장래의 각 환자에 대한 이익은 현재의 연구에서 환자들이 감수해야 하는 위험을 능가할 것이다:

반응율/이익을 얻은 환자 수가 증가할 것이고,

효과가 없는 치료로 인한 유해한 부작용의 위험이 감소할 것이다.

투여량 선택에 대한 근거

Tarceva™ 을 질병 진행, 용인불가한 독성 또는 사망시까지 150 mg 의 투여량으로 1 일 1 회 경구 투여하였다. 상기 투여량에 대한 선택은 약동학적 변수, 및 사전-치료를 과도히 받은 진행암 환자들에서 제 I, II 및 III 상 시험에서 관찰된 상기 투여량의 안전성 및 내약성 프로파일을 기초로 하였다. 150　mg/일 투여량을 받은 암 환자들의 혈장에서 나타난 약물 수준은 임상적 효능을 목적으로 하는 500　ng/ml 의 평균 혈장 농도보다 높은 수준으로 일정했다. BR.21 은, 상기 투여량에 의한 생존 이익을 보여주었다.

상기 연구의 목적

이의 일차적 목적은 Tarceva™ 치료의 이익 (CR, PR 또는 SD ≥ 12 주) 을 예측하는 차등 발현 유전자들을 규명하는 것이었다. Tarceva™ 치료에 대한 "반응" (CR, PR) 을 예측하는 차등 발현 유전자들의 확인은 중요한 부가적인 목적이었다.

부차적인 목적은, 치료를 통한 이익에 관해 EGFR 신호전달 경로에서의 변경을 평가하는 것이었다.

연구 설계

연구 설계 및 투여 섭생에 대한 개관

이는 공개 (open-label) 예측 마커 규명 제 II 상 연구였다. 본 연구는 약 12 개국의 대략 26 개 지역에서 수행되었다. 1 가지 이상의 사전 화학요법 섭생에 실패한 264 명의 진행성 NSCLC 환자가 12 개월의 기간에 걸쳐 등록하였다. 지속적으로 경구 Tarceva™ 를 150　mg/일의 투여량으로 투여하였다. 약물 요법에 대한 내약성에 기초하여 투여량 감소가 허용되었다. 질병 제어 및 독성을 평가하기 위해 임상 및 실험 변수들을 평가하였다. 치료는 질병 진행, 허용불가능한 독성 또는 사망시까지 계속되었다. 당해 연구 설계는 도 1 에 나타나 있다.

분자적 분석을 위해 종양 조직 및 혈액 시료를 수득하여, Tarceva™ 의 효과를 평가하고 치료를 통해 이익을 얻는 환자들의 일부 그룹을 규명하였다.

예측 마커 평가

치료 시작 전 2 주 내에 종양 생검을 채취하였다. 하기 2 가지의 상이한 시료를 채취하였다:

첫번째 시료는 항상 액체 N₂ 로 즉시 동결시켰다.

두번째 시료는 포르말린으로 고정시킨 후 파라핀에 포매시켰다.

순간 동결 조직을 본 연구에서 가장 높은 우선순위에 두었다.

도 2 는 시료 처리 과정 도식을 보여준다.

마이크로어레이 분석

종양 RNA 및 종양 주변 조직으로부터의 RNA 를 추출하기 위한 종양 세포의 레이저 포획 미세절제술 (LCM; laser capture microdissection) 에, 상기 순간 동결 시료를 사용하였다. 상기 RNA 를 Affymetrix 마이크로어레이 칩 (HG-U133A) 상에서 분석하여 상기 환자들의 종양 유전자 발현 프로파일을 확립하였다. Affymetrix 칩에 대한 품질 관리 (Quality Control) 를 이용하여 통계학적 비교를 위한 적절한 품질의 시료들을 선택하였다.

포르말린 고정된 파라핀 포매 조직에 대한 단일 바이오마커 분석

상기 두번째 종양 생검인 FFPE 시료를 이용하여, DNA 변이유발, IHC 및 ISH 분석을 하기에 기재되는 바와 같이 수행하였다. 초기 진단시 수집된 조직에 대해서도 유사한 분석을 수행하였다.

EGFR 및 EGFR 신호전달 경로에 관여하는 기타 분자들을 인코딩하는 유전자의 DNA 변이유발 상태를 DNA 서열분석을 이용하여 분석하였다. EGFR 및 관련 유전자들에 대한 유전자 증폭을 FISH 로 연구하였다.

단백질 발현 분석에는 EGFR 및 EGFR 신호전달 경로 중의 기타 단백질에 대한 면역조직화학 [IHC] 분석이 포함되었다.

반응 평가

RECIST (Uni-dimensional Tumour Measurement) 기준을 이용하여 반응을 평가하였다. 상기 기준은 하기 링크에서 찾아볼 수 있다:

http://www.eortc.be/recist/

다음을 주의해야 한다: CR 또는 PR 의 상태로 규정하기 위해서는, 상기 치료 기간 중의 임의의 시점과는 적어도 4 주 떨어진 시점에서의 반복 평가에 의해 종양 측정치의 변화가 확인되어야 한다.

SD 의 경우, 후속적인 측정치가 연구 시작 후 최소 6 주의 간격으로 적어도 1 회 SD 기준을 충족해야 한다.

SD 유지의 경우, 후속적인 측정치가 연구 시작 후 적어도 1 회 최소 12 주의 지속 기간에 걸쳐 SD 기준을 충족해야 한다.

생존 평가

환자가 진료소로 방문하거나 또는 전화를 이용하여 3 개월마다 정기적인 상태 점검을 수행하였다. 모든 사망을 기록하였다. 연구의 말미에 각 환자에 대해 최종적 생존 확인을 요청하였다.

방법

RNA 시료 조제 및 RNA 시료에 대한 품질 관리

모든 생검 시료 처리는 병리학 표준 실험실에서 취급되었다; 신선한 동결 조직 시료는 조사기관 지역에서 로셰 바젤 (Roche Basel) 의 임상 시료 작업실 [Clinical Sample Operations] 시설로 수송되었고, 추가적인 처리를 위해 거기에서 상기 병리학 실험실로 수송되었다. 레이저 포획 미세절제술을 이용하여 주변 조직으로부터 종양 세포를 선별하였다. LCM 후, 상기 종양 풍부 물질로부터 RNA 를 정제하였다. 그 다음 상기 병리학 실험실에서 상기 RNA 의 농도 및 품질에 대한 추정을 위한 일련의 단계를 수행하였다.

RNase 는 RNA 분해 효소이며 도처에서 발견되고, 따라서 RNA 가 사용될 모든 절차는 RNA 분해를 최소화하도록 엄격히 조절되어야만 한다. 대부분의 mRNA 종은 자체적으로 다소 짧은 반감기를 가지며, 따라서 상당히 불안정한 것으로 간주된다. 그러므로, 임의 어세이 전에 RNA 완전성 체크 및 정량화를 수행하는 것이 중요하다.

RNA 농도 및 품질 프로파일은 2100 Bioanalyzer® 로 불리는 Agilent 기기 (Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA) 를 사용하여 평가될 수 있다. 기기 소프트웨어는 RNA 완전성 번호 (RIN; RNA Integrity Number), 정량화 추정 (Schroeder, A., 등, The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol, 2006. 7: p.3) 을 생성하고, 총 RNA 시료의 리보솜 비율을 계산한다. RIN 은 RNA 시료의 전체 전기영동적 추적으로부터 측정되며, 이에는 분해 생성물의 존재 또는 부재가 포함된다.

RNA 품질을 2100 Bioanalyzer® 로 분석하였다. Affymetrix 플랫폼 상에서의 추가적 분석을 위해, 충분한 RNA 및 첨가된 폴리-I 노이즈 초과의 하나 이상의 rRNA 피크를 갖는 시료만을 선택하였다. 마이크로어레이 분석을 위해, 정제된 RNA 를 로셰 의학 게놈학 센터 [Roche Centre for Medical Genomics (RCMG; Basel, Switzerland)] 로 보냈다. 추가적인 처리를 위해 병리학 실험실로부터 122 개의 RNA 시료를 받았다.

조직 RNA 시료의 표적 표지

생산자의 지침에 따른 것으로서, Affymetrix 로부터의 2-사이클 표적 표지 증폭 프로토콜 (Affymetrix, Santa Clara, California) 에 따라 표적 표지를 실행하였다.

상기 방법은 표준 에버와인 선형 증폭 방법을 기준으로 하지만, 마이크로어레이에 대한 혼성화를 위해 충분히 표지된 cRNA 가 생성되도록 상기 절차를 두 사이클로 사용한다.

표지 반응에서 사용된 총 RNA 투입량은, 10 ng 초과의 RNA 가 활용가능한 경우 이들 시료에 대해 10 ng 이었고; 10 ng 미만이 활용가능하거나 또는 활용가능한 양 데이터가 없는 경우 (매우 낮은 RNA 농도로 인해), 총 시료의 절반을 반응에 사용하였다. 표지 반응으로부터의 수율은 20 ~ 180 ㎍ cRNA 이었다. 모든 시료에 대해 15 ㎍ cRNA 가 사용된 혼성화 수준에서 표준화 단계를 도입하였다.

각 시료 배치 (batch) 의 작업물 중의 대조군 시료로서 인간 참조 RNA (Stratagene, Carlsbad, CA, USA) 를 사용하였다. 10 ng 의 상기 RNA를 시험 시료과 함께 투입물로서 사용하여, 표지 및 혼성화 시약이 예측한 바와 같이 작용하는지 확인하였다.

마이크로어레이 혼성화

Affymetrix HG-U133A 마이크로어레이는 약 14,500 개의 잘 분석된 유전자를 나타내는 약 18,400 개의 전사체 및 변이체를 표적하는 22,000 개 초과의 프로브 세트를 포함한다.

Affymetrix 지침 (Affymetrix Inc., Expression Analysis Technical Manual, 2004) 에 따라 모든 시료에 대한 혼성화를 수행하였다. 간략하게는, 각각의 시료에 대해, 15 ㎍ 의 바이오틴-표지된 cRNA 를 2 가 양이온의 존재 하 및 가열 하에 절편화하고, Affymetrix HG-U133A 전체 게놈 올리고뉴클레오티드 어레이에 대해 하룻밤 동안 혼성화하였다. 다음날 어레이를 제조자의 지침에 따라 스트렙타비딘-피코에리트린 (Molecular Probes; Eugene, OR) 으로 염색하였다. 이후 GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix) 을 사용하여 어레이를 스캐닝하고, GeneChip Operating Software (GCOS) 버전 1.4 (Affymetrix) 로 신호 세기를 자동으로 계산하였다.

통계학적 분석

Affymetrix™ 데이터 분석은 5 개 주요 단계로 이루어져 있다.

단계 1 은 품질 관리였다. 목표는 표준 이하의 품질 프로파일을 갖는 어레이 데이터를 확인하고 이를 분석에서 제외시키는 것이었다.

단계 2 는 예비-처리 및 표준화였다. 목표는 칩 간 비교를 가능하게 할 표준화 및 스케일화된 "분석 데이터 세트" 를 생성하는 것이었다. 이는 배경 노이즈 추정 및 감산, 프로브 요약 및 스케일링을 포함하였다.

단계 3 은 탐색 및 설명이었다. 목표는 변동성의 원천 및 잠재적 편향 (bias) 을 확인하는 것이었다. 이는 다변수 및 단변수 설명 분석 기법을 적용하여 유력한 공변량을 확인하는 것으로 이루어졌다.

단계 4 는 모델링 및 검정이었다. 목표는 "임상적 이익" 과 "임상적 무이익" 환자 사이의 평균 발현 수준 차이의 통계학적 평가를 근거로 후보자 마커의 목록을 확인하는 것이었다. 이는 각각의 프로브-세트에 대해 적당한 통계학적 모델을 맞추고 통계학적 유의성의 측정을 추론하는 것으로 이루어졌다.

단계 5 는 강건성 분석이었다. 목표는 예비-처리 방법 및 통계학적 추정에 크게 좌우되지 않는 후보자 마커의 자격있는 목록을 생성하는 것이었다. 이는 상이한 방법론적 접근법 분석을 반복하고 후보자 목록을 교차시키는 것으로 이루어졌다. 모든 분석을 R 소프트웨어 패키지를 사용하여 수행하였다.

단계 1: 품질 관리

데이터 품질의 관리는 여러 파라미터를 체크하는 것을 기준으로 하였다. 이들에는 표준 Affymetrix GeneChip™ 품질 파라미터, 특히 스케일링 인자, 현존 호출 % (Percentage of Present Call) 및 평균 백그라운드가 포함된다. 이러한 단계는 또한 국지적인 혼성화 문제점을 검출하기 위한 가상 칩 영상의 시각적 검사, 중앙값 거동으로부터의 임의적인 비정상적 이탈을 검출하기 위한 가상 중앙값 칩에 대한 각각의 칩의 비교가 포함된다. 또한 칩 간 상관관계 분석을 수행하여 특이점 시료를 검출하였다. 또한, Agilent Bioanalyzer™ 2100 으로 RNA 시료를 분석하여 수득한 RNA 품질의 부수적 측정치를 고려하였다.

이들 파라미터를 기준으로, 20 개의 어레이 데이터를 분석에서 제외시켰다. 따라서 102 명의 환자를 나타내는 총 102 개의 어레이 데이터를 분석에 포함시켰다. 이들 102 개의 시료의 임상적 설명을 하기 표 1 에 보고하였다.

분석에 포함된 환자의 임상적 특징 설명
변수	값	n = 102
		n (%)
최고 반응	N/A	16 (15.7%)
	PD	49 (48.0%)
	SD	31 (30.4%)
	PR	6 (5.9%)
임상적 이익	없음	81 (79.4%)
	있음	21 (20.6%)
성별	여성	25 (24.5%)
	남성	77 (74.5%)
인종	백인	65 (63.7%)
	동양인	37 (36.3%)
조직학	샘암종	35 (34.3%)
	편평	53 (52.0%)
	기타	14 (13.7%)
흡연 경험	없음	20 (19.6%)
	있음	82 (80.4%)

단계 2: 데이터 예비-처리 및 표준화

rma 알고리즘 (Irizarry, R.A., 등, Summaries of Affymetrix GeneChip probe level data. Nucl. Acids Res., 2003. 31(4): p. e15) 을 예비-처리 및 표준화에 사용하였다. mas5 알고리즘 (AFFYMETRIX, GeneChip® Expression: Data Analysis Fundamentals. 2004, AFFYMETRIX) 을, 개별적 프로브-세트에 대한 검출 호출을 만드는데 사용하였다. 모든 시료에서의 "부재" 또는 "한계" 라 불리는 프로브-세트를 추가적 분석에서 제거하고; 5930 개의 프로브-세트를 상기 기준을 근거로 분석에서 제거하였다. 그러므로 분석 데이터 세트는 102 명의 환자에서 측정된 16353 개 (22283 개 중) 프로브-세트를 갖는 매트릭스로 이루어졌다.

단계 3: 데이터 설명 및 탐색

잠재적 편향 및 변동성의 주요 원천을 규명하기 위해 설명 탐색 분석을 수행하였다. 유전자 발현 프로파일에 대해 잠재적 영향을 가진 공변량 세트를 스크리닝하였다. 이는 기술적 (technical) 및 임상적 변수를 모두 포함하였다. 기술적 공변량에는 하기가 포함되었다: RNA 처리 (이후, 배치로 언급) 날짜, RIN (RNA 품질/완전성의 척도로서의 것), 조작자 및 시료 채취 센터. 임상적 공변량에는 하기가 포함되었다: 조직학적 유형, 흡연 상태, 종양 등급, 활동 점수 (performance score) (Oken, M.M., 등, Toxicity and response criteria of the Eastern Cooperative Oncology Group. Am J Clin Oncol, 1982. 5(6): p. 649-55), 인구통계 데이터, 반응자 상태 및 임상적 이익 상태.

분석 도구에는 단변량 ANOVA 및 주성분 분석이 포함되었다. 이들 각 공변량에 있어서, 각 프로브-세트에 단변량 ANOVA 를 독립적으로 적용하였다.

상기 배치 변수의 유의한 효과가 확인되었다. 실제로, 상기 배치 변수는 시료 처리일과 Affymetrix 칩 로트 (lot) 간의 차이점을 포착하였다. 상기 배치 변수가 관심 변수들로부터 거의 독립적인 것을 체크한 후에, 배치 효과를 문헌 [Johnson, W.E., C. Li, 및 A. Rabinovic, Adjusting batch effects in microarray expression data using empirical Bayes methods. Biostat, 2007. 8(1): p. 118-127] 에 기재된 방법을 이용하여 보정하였다.

배치 효과 보정 후의 표준화된 데이터 세트를 이후의 분석에서 분석 데이터 세트로 이용하였다.

설명 분석으로 강조된 2 가지 추가적으로 중요한 변수들은 조직학 및 RIN 이었다.

단계 4: 데이터 모델링 및 검정

각각의 프로브-세트를 독립적으로 선형 모델에 적용하였다. 모델에 포함되는 변수를 표 2 에 나타내었다. 최우 추정법 기술 (maximum likelihood technique) 로 모델 파라미터를 추정하였다. "임상적 이익" 변수 (X1) 에 상응하는 파라미터를 사용하여 임상적 이익을 얻은 환자군과 임상적 이익을 얻지 못한 환자군 사이의 발현 수준 차이를 평가하였다.

선형 모델에 포함된 변수의 설명
변수	유형	값
유전자 발현	종속변수 (Yip)	환자 p에서의 프로브-세트 i의 log2 세기
절편	전체 평균 (μ)
임상적 이익	관심 예측자 (X1)	있음/없음
조직학	조정 공변량 (X2)	샘암종/편평/기타
인종	조정 공변량 (X3)	동양인/백인
성별	조정 공변량 (X4)	여성/남성
RIN	조정 공변량 (X5)	[2,...,7.9]
흡연자	조정 공변량 (X6)	현재/과거/무경험
병기	조정 공변량 (X7)	비절제.III/IV

각각의 프로브-세트 i 에 대해, 통계학적 검정의 목표는 표 2 에 열거한 기타 조정 공변량을 고려하여, 임상적 이익을 얻은 환자와 임상적 이익을 얻지 못한 환자에서의 평균 발현 수준이 동등하다는 가설을 거부하는 것이었다. 공식적으로, 동등성의 무효적 가설을 두 면의 대안에 대해 시험하였다. 상응하는 p-값을 표 3 에 나타내었다.

두 가지 이유로 인해 선형 모델을 선택하게 된 동기가 되었다. 첫째로, 선형 모델은 다목적적이며, 잘 특징화되어 있고 간건성 접근법이어서, 관심 변수의 영향을 추정하는 경우 혼동 변수가 조정되도록 한다. 둘째로, 시료 크기 102 가 주어지고, 데이터 세트의 표준화 및 스케일링, 표준 분포 가정이 합리적이고 정당하였다.

각각의 프로브-세트에 대해, 잔류 모델을 기준으로 플리그너-킬린 (Fligner-Killeen) 검정을 사용하여 변동의 동질성 가정을 평가하였다. 분석은 하기 3개 단계로 이루어졌다:

1. 잔류 변동의 동질성에 대해 각각의 카테고리별 변수를 시험하는 단계,

2. 최소 p-값을 갖는 변수 V 에 주목하는 단계, 및

3. 최소 p-값이 0.001 미만인 경우, 상이한 수준의 변수 V 가 상이한 변동을 갖도록 모델을 다시 맞추는 단계.

단계 5: 강건성

강건성 분석의 목표는, 통계학적 분석에 근본이 되는 예비-처리 단계 또는 가정의 결과로서 분석 결과가 인위적인 수 있는 위험을 감소시키는 것이었다. 하기의 세 가지 측면이 고려되었다: a) 품질 관리 단계에서의 몇몇 여분의 칩을 포함시키거나 제외시킴; b) 예비-처리 및 표준화 알고리즘; c) 통계학적 가정 및 시험 접근.

후보자 마커의 목록을, 상이한 분석 설정으로 유의하다고 일관적으로 표명된 유전자의 일부 세트로서 정의하였다. 상이하게 적용된 분석 옵션은 하기와 같다:

a) 보다 엄격한 품질 관리 기준을 근거로 8 개 칩의 부가적인 일부 세트를 확인하였다. 이들 8 개 칩을 제외시킴으로써 "감소 (reduced) 데이터 세트" 를 정의하였다.

b) 예비-처리 및 표준화용 rma 에 대한 대안물로서 MAS5 를 확인하였다. MAS5 는 백그라운드 추정, 프로브 요약 및 표준화를 위해 상이한 방법을 사용한다.

c) 하기 2 가지의 부가적인 통계학적 검정을 사용하였다.

a. 임상적 이익·임상적 무이익 사이의 차이에 대한 윌콕슨 (wilcoxon) 검정 및

b. 응답 변수로서 임상적 이익을 취하고 공변량으로서 유전자 발현을 취하는 로지스틱 회귀 모델을 검정하는 우도비 검정 (LRT; likelihood ratio test). 이들 2 가지 부가적인 검정은 상이한 세트의 근본적인 통계학적 가정에 따라 다르다. 각 프로브-세트에 있어서, LRT 는 1 자유도의 카이-제곱을 따랐다.

요약하면, 2 가지 세트의 시료 ("풀 (full)" 데이터-세트 및 "감소" 데이터-세트), 및 2 가지의 미리 처리된 알고리즘 (mas5 및 rma) 이 고려되었다; 이는 4 가지의 상이한 분석 데이터 세트를 산출하였다. 상기 4 가지의 데이터 세트 각각에, 3 가지의 상이한 통계학적 검정을 적용하였다. 그러므로, 각 프로프-세트에 대해, 3 가지 p-값을 계산하였다. 각각의 분석 데이터 세트에서, 복합 기준을 적용하여, 차등 조절되는 유전자 목록을 확인하였다. 상기 복합 기준을 다음과 같이 정의하였다: 최대 p-값은 0.05 미만이고, 최소 p-값은 0.001 미만이다. 마커 유전자를 확인하기 위해 기준 1 을 사용하는 강건성 분석으로 EGFR 억제제를 이용한 치료에 대한 예측 마커로서 SFRS7 을 확인하였다.

표 3: 복합 기준 적용 후 강건성 분석에 근거한 임상적 이익에 대한 유전자 마커.

제 1 열은 프로브-세트의 Affymetrix 확인자이다. 제 2 열은 상응하는 유전자 서열의 GenBank 접근 번호이다. 제 3 열은 상응하는 공식적인 유전자 명칭이다. 제 4 열은 선형 모델로부터 추정된 바와 같은 임상적 이익·임상적 무이익 환자 사이의 발현 수준에 있어서의 상응하는 보정 평균 배수 변화이다. 제 5 열은 선형 모델로부터 유도된 바와 같은 임상적 이익·임상적 무이익 환자 사이의 발현 수준에 있어서의 차이 검정에 대한 p-값이다. 제 6 열은 발현 수준에 있어서의 보정 평균 배수 변화에 대한 95% 신뢰 구간이다.

Affymetrix 프로브 세트 ID	GenBank	유전자	보정 평균 배수 변화	P-값	CI 95%
213649_at	NM_001031684	SFRS7	1.41	8.9E-4	1.2 , 1.7

추가의 통계학적 분석

선별된 후보자 마커 SFRS7 의 경우, 독립적인 통계학자에 의해 인증된 환경에서 하기 부가적인 분석을 수행하였다:

· 일차 Affymetrix 분석으로부터의 PFS (Progression free survival: 무진행 생존율) 에 대한 단변량 콕스 회귀,

· 일차 Affymetrix 분석으로부터의 임상적 이익에 대한 단변량 로지스틱 회귀, 및

· 일차 Affymetrix 분석으로부터의 생존에 대한 단변량 콕스 회귀.

상기 분석 결과를 하기에 제시한다. 이들은 일차 분석 결과와 일치하며, 선별된 마커 선택을 확인시켜준다.

결과: 일차 Affymetrix 분석으로부터의 PFS (Progression free survival: 무진행 생존율) 에 대한 단변량 콕스 회귀:

결과: 일차 Affymetrix 분석으로부터의 임상적 이익에 대한 단변량 콕스 회귀:

결과: 일차 Affymetrix 분석으로부터의 생존에 대한 단변량 콕스 회귀:

토의

조직 시료를 고밀도 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이 기법을 이용하여 분석하고, 그 데이터에 통계학적 모델링을 적용함으로써, 본 발명자들은 에를로티니브를 이용한 치료로부터 임상적 이익을 얻는 환자를 해당 유전자의 발현 수준을 통해 예측할 수 있는 유전자를 규명할 수 있었다.

복합 기준 (상기 정의됨) 을 적용하였다. 그 결과, SFRS7 이 EGFR 억제제를 이용한 치료에 대한 예측 마커인 것으로 나타났다.

SFRS7 (splicing factor, arginine/serine-rich 7: 스플라이싱 인자, 아르기닌/세린-풍부 7) 인 35kDa 의 단백질이다. 후생동물에서, 왕복 세린/아르기닌-풍부 (SR)-스플라이싱 인자를 비롯한 다중 RNA-결합 단백질은, 유출 수용체 TAP/핵 유출 인자 1 (NXF1) 과 상호작용하여 mRNA 핵 유출에 대한 어댑터로서 기능한다. 그러나, 어댑터와 TAP 사이의 상호작용이 어떻게 조절되는지는 불분명하다. SR 단백질 SFRS7 및 ASF/SF2 는 저인산화되는 경우 TAP/NXF1 에 더 높은 친화성을 나타낸다. SFRS7 은 과인산화 형태로 예비-mRNA 에 모집되나, 스플라이싱 동안 생체 내 및 시험관 내 모두에서 저인산화가 된다. TAP 는 예비-mRNA-단백질 복합체보다는 스플라이싱된 mRNA-단백질 복합체에 우선적으로 결합한다. 그러므로, SR 단백질 어댑터의 인산화 상태는 스플라이싱된 mRNA 의 TAP-매개 유출 선별성의 기본이 될 수 있다.

본 연구에서, SFRS7 은 에를로티니브를 이용한 치료로부터 임상적 이익을 얻는 환자에서 비교적 상향 조절된다는 것이 발견되었다

<110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Predictive marker for EGFR inhibitor treatment <130> 24416WO <150> EP07114326.7 <151> 2007-08-14 <160> 1 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 2381 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 agtgccgccg ggactcttgg cgggtgaagg tgtgtgtcag cttttgcgtc actcgagccc 60 tgggcgctgc ttgctaaaga gccgagcacg cgggtctgtc atcatgtcgc gttacgggcg 120 gtacggagga gaaaccaagg tgtatgttgg taacctggga actggcgctg gcaaaggaga 180 gttagaaagg gctttcagtt attatggtcc tttaagaact gtatggattg cgagaaatcc 240 tccaggattt gcctttgtgg aattcgaaga tcctagagat gcagaagatg cagtacgagg 300 actggatgga aaggtgattt gtggctcccg agtgagggtt gaactatcga caggcatgcc 360 tcggagatca cgttttgata gaccacctgc ccgacgtccc tttgatccaa atgatagatg 420 ctatgagtgt ggcgaaaagg gacattatgc ttatgattgt catcgttaca gccggcgaag 480 aagaagcagg tcacggtcta gatcacattc tcgatccaga ggaaggcgat actctcgctc 540 acgcagcagg agcaggggac gaaggtcaag gtcagcatct cctcgacgat caagatctat 600 ctctcttcgt agatcaagat cagcttcact cagaagatct aggtctggtt ctataaaagg 660 atcgaggtat ttccaatccc cgtcgaggtc aagatcaaga tccaggtcta tttcacgacc 720 aagaagcagc cgatcaaagt ccagatctcc atctccaaaa agaagtcgtt ccccatcagg 780 aagtcctcgc agaagtgcaa gtcctgaaag aatggactga agctctcaag ttcacccttt 840 agggaaaagt tattttgttt acattattat aagggatttg tgatgtctgt aaagtgtaac 900 ctaggaaaga taattcaacc atctaatcaa aatggatctg gattactatg taaattcaca 960 gcagtaagat aatataaatt ttgttgaatg tattaacatc atatggtctg aaaatgtggg 1020 tttttatttg gcacatttaa ataaaatgtt tctaactaga tttttgattt gtgttcaata 1080 ttaacacttc ttaatttgat atatttgaga gtcagacatt ataattgtta accttattca 1140 tacataccta cattcagaat tgaaaggtgt tggttaagtc ttgaacatca ctattctatg 1200 cataaaactt ggccaggatc ttaagggact ttgaaaattc catcttaccc ttgtagctct 1260 gggtaagatg acctgagtcc cttatgatac agcctgaatg catcatgaca gatccttaag 1320 ttagctaatc cgtttgaagt tggtgttagt aggtattgta tgatcagtgg tgaagcaagt 1380 aggaccactg atgtgtctaa atgagcatga caggaactaa acgaaactga ttaaatgtat 1440 gagaaataga aactgatttc tggatgatct ttatactaat tgcagctttc aggctactag 1500 gtggcatagt gttaattagg actccccaag atatggggag ttctactctc aatggtcttg 1560 tttctttgct ttctacatta gttaaccagt tttataccaa aaaatgcatg tttgaggaat 1620 tgtctgaaat tgggacaaaa caccttcatg taaaccagct ttgcaaaatt ttccagccca 1680 gatactcttc atctattcaa atggattgtc ttattctgag caaagacctg ttgttaatct 1740 tcaagctagg ttttgcagtt cccaaccaca acattcttct attttgccag gctggtgcaa 1800 agtaattaaa gatgtcaatc agaaatgtca atgagactaa agtggttttg taaatctcag 1860 ctatatttag caacactcca tgtagctaat attttttggt agcatctggt agaccttaga 1920 atgttacata gccagtaggt tctttattca aattttaagt atcttaagaa tagtagggca 1980 gtaacagtta cttttgagag ttttctggtc aagcttttac caggcattct ctagccttgg 2040 tacaaaaaaa aaaaaaacct gctggttgcg cagataccta ggcttgtcca ttttatgcat 2100 ttcagcaaag tcattggata ctattgcaac ttgggaatac tggtctgcat caagtttatt 2160 cggtagtttg accgctagta tgttggaagt tatttggatt gtttttggaa ttttgactgg 2220 ctgaattatg gttggtataa agttatgtgt ataactggca ggcttattta tctgttgcac 2280 ttggttagct ttaattgttc tgtattattt aaagataagt ttactcaaca ataaatctgc 2340 agagattgaa caagtaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 2381

Claims (11)

1. 하기 단계를 포함하는, EGFR 억제제를 이용한 치료에 대한 암 환자의 반응을 예측하기 위한 시험관 내 방법:
   환자의 종양 시료 중의 SFRS7 유전자의 발현 수준을 측정하고, SFRS7 유전자의 발현 수준을 치료로부터 임상적 이익을 얻지 못한 환자 집단의 종양 중의 SFRS7 유전자의 발현 수준의 대표값과 비교하는 것을 포함하는 방법으로서, 환자의 종양 시료 중의 SFRS7 유전자의 높은 발현 수준이 치료로부터 임상적 이익을 얻게 될 환자에 대한 지표인 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 발현 수준이 마이크로어레이 기법으로 측정되는 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 SFRS7 유전자가, 상기 치료로부터 임상적 이익을 얻지 못한 환자 집단의 종양 중의 SFRS7 유전자의 발현 수준의 대표값과 비교하여, 상기 환자의 종양 시료에서 1.2 내지 1.7 배 이상 높은 발현 수준을 나타내는 방법.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EGFR 억제제가 에를로티니브인 방법.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 NSCLC 인 방법.
6. EGFR 억제제를 이용한 치료에 대한 암 환자의 반응을 예측하기 위한 SFRS7 유전자의 용도.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 암이 NSCLC 인 용도.
8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 상기 EGFR 억제제가 에를로티니브인 용도.
9. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 방법으로 확인된 암 환자에게 EGFR 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 암 환자의 치료 방법.
10. 제 9 항에 있어서, 상기 EGFR 억제제가 에를로티니브인 방법.
11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 상기 암이 NSCLC 인 방법.

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