KR20100033480A - 혈압 강하 활성을 가지는 펩티드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생리 활성을 가지는 신규한 펩티드를 제공한다. 본 발명의 신규 펩티드는 혈압 강하 활성을 가지며, 고혈압에 기인하는 질환을 치료하는데 유용하다. 또한, 본 발명은 신규 펩티드에 대한 항체에 관한 것이다.

Description

혈압 강하 활성을 가지는 펩티드{PEPTIDE HAVING HYPOTENSIVE ACTIVITY}
본 발명은, 혈압 강하 활성을 가진 신규한 내인성 펩티드 또는 그 유사체에 관한 것이다.
내인성 생리 활성 펩티드의 연구는 1921년의 인슐린의 동정으로부터 시작되어, 현재까지 수많은 내인성 펩티드가 사람을 포함한 고등 생물들에서 동정되고 있다(비특허 문헌 1). 이들 내인성 생리 활성 펩티드는 단일의 생리 작용만을 가지는 것이 아니라, 표적으로 하는 장기에 따라 상이한 작용을 보이는 경우가 많다. 예를 들면, 그렐린은 뇌하수체에 작용하여 다른 내인성 생리 활성 펩티드인 성장 호르몬의 분비 촉진 작용을 보이며, 시상하부에 작용하여 섭식 항진 작용 등의 여러가지 기능을 가지고 있는 것으로 알려져 있다(비특허 문헌 2). 또한, 아드레노메듈린(adrenomedullin)은 혈관에 작용하여 혈관 확장 작용을 보이며, 뇌하수체에 작용하여 다른 내인성 생리 활성 펩티드인 ACTH의 분비를 억제하는 등의 다양한 기능을 가지고 있는 것으로 알려져 있다(비특허 문헌 3).
또한, 상기 그렐린, 아드레노메듈린 이외에도, 내인성 생리 활성 펩티드에 관한 연구가 진행되어, 어떤 생리 활성 펩티드가 다른 펩티드의 작용 발현을 제어한다는 것과, 복수개의 펩티드가 서로간의 작용을 상호 제어하여 복잡한 네트워크 를 형성함으로써 생체 메카니즘을 조절한다는 사실 등이 해명되고 있다. 예를 들면, 섭식 및 생체내 에너지 밸런스에서는, 섭식 항진 작용을 나타내는 내인성 생리 활성 펩티드인 그렐린, 아구티(agouti) 관련 펩티드, 신경 펩티드 Y와, 섭식 억제 작용을 나타내는 펩티드인 펩티드 YY, 콜레시스토키닌, 렙틴, 멜라노코르틴, 인슐린이, 말초와 중추 사이에서 정보 전달을 하면서 서로의 작용을 제어하고 있는 것이 보고되고 있다(비특허 문헌 4).
한편, 내인성 생리 활성 펩티드는 질환의 치료에도 사용되고 있다. 예를 들면, 인슐린은 당뇨병의 치료제로서, 부갑상선 호르몬의 활성 단편은 골다공증의 치료제로서, 심방성 나트륨 이뇨 펩티드(ANP)는 급성 심부전의 치료제로서 사용되고 있다. 이들 내인성 생리 활성 펩티드를 이용한 의약은, 저분자 화합물로 치환되기 어려운 작용 메카니즘을 가지고 있을 뿐만 아니라 원래 생체 내에 존재하는 물질을 이용하여 생체 메카니즘의 정상화를 도모하므로, 안전성이 뛰어나다고 여겨지고 있다.
따라서, 새로운 내인성 생리 활성 펩티드의 동정은 생리 활성을 가진 신규 물질의 발견 뿐만 아니라, 새로운 생체 메카니즘의 해명으로 이어지며, 또한 새로운 작용 메카니즘에 따른 새로운 질환 치료법으로도 이어질 것이다.
일반적인 내인성 생리 활성 펩티드의 동정 방법으로서, 각종 평가 시스템에 대한 작용을 지표로 하여, 생체 조직 추출물로부터 펩티드를 분획·정제하는 방법이 알려져 있다. 지금까지, 평가 시스템으로서 장관 등의 평활근의 이완 수축 등의 적출 장기에 대한 작용(비특허 문헌 5, 6), 배양 세포에서의 cAMP, Ca 이온 등 의 세포내 세컨드 메신저의 변동(비특허 문헌 7) 등이 이용되고 있으며, 신규한 생리 활성 펩티드가 동정되고 있다. 최근, 게놈 해석에 의해 동정·예측된 미확인 리간드에 대한 리셉터를 배양 세포에서 강제 발현시키고, 세포내 세컨드 메신저의 변동(비특허 문헌 8, 9), 세포외 아라키돈산 대사산물의 양적 변화(비특허 문헌 10), 세포외 산성화율의 변화(비특허 문헌 11) 등을 평가 시스템으로서 이용함으로써, 신규한 내인성 생리 활성 펩티드를 동정하고 있다. 그 외에도, 리셉터 또는 리셉터 결합 단백질의 세포내 위치 변화(비특허 문헌 12)나, 세포내 유전 스펙트럼(dielectric spectrum)의 변화(비특허 문헌 13) 등의 최첨단 의과학 기술을 활용한 평가 시스템도 이용되고 있다.
그러나, 현재에도 리간드가 동정되지 않은 G 단백질-커플링형 수용체가 많이 존재하고 있으며, 그 중에서도 27가지의 리셉터는 펩티드를 리간드로 하는 것으로 예측되고 있다(비특허 문헌 14). 내인성 생리 활성 펩티드는 생체내에 미량으로만 존재하고, 불안정하며 분해되기 쉽기 때문에, 최첨단 의과학 기술을 사용하더라도 새로운 내인성 생리 활성 펩티드를 동정하는 것은 쉬운 일이 아니다.
한편, 내인성 생리 활성 펩티드는 유전자에 의해 코딩되어 있으므로, 게놈 서열 등을 이용하여 정보학적으로 예측하고자 하는 시도도 행해지고 있다. 구체적으로는, 공지된 내인성 생리 활성 펩티드 및 이의 전구체에서 나타나는 서열상의 특징을 지표로 하여, 게놈 서열이나 cDNA 서열로부터 신규 내인성 생리 활성 펩티드 서열을 예측하고, 예측한 펩티드를 화학 합성으로 대량 제조한 후, 각종 평가 시스템으로 생물 활성의 유무를 평가할 수 있다. 실제로, 새로운 내인성 생리 활 성 펩티드가, 공지의 내인성 생리 활성 펩티드와의 서열 상동성(비특허 문헌 15)이나 내인성 생리 활성 펩티드에서 많이 나타나는 카르복실 말단 RF 아미드 모티프(비특허 문헌 16-18) 등을 지표로 한, 정보학적 방법에 의해 동정되고 있다. 또한, 공지의 내인성 생리 활성 펩티드 및 그 전구체에 공통적인 복수 개의 서열 특징을 조합한 방법(비특허 문헌 19, 20)에 의해서도, 새로운 내인성 생리 활성 펩티드가 동정되고 있다.
그러나, 전술한 방법에 의해 예측할 수 있는 것은 공지의 내인성 생리 활성 펩티드와 유사한 펩티드로 한정되어, 보다 폭넓은 내인성 생리 활성 펩티드의 예측 방법이 요구되고 있다.
일반적으로, 내인성 생리 활성 펩티드는 전구체 단백질의 부분 서열로서 유전자에 의해 코딩되며, 전구체 단백질이 프로-호르몬 변환 효소에 의해 특정한 위치에서 절단되어 생기는 특정한 분자만 생리 활성을 가진다. 따라서, 공지의 내인성 생리 활성 펩티드와 유사하지 않은, 신규한 내인성 생리 활성 펩티드를 예측할 때에는, 전구체로부터 펩티드가 절단되는 위치를 정확하게 예측하는 것이 매우 중요하다. 일반적으로, 전구체 단백질은 Lys 및 Arg의 조합으로 이루어진 2개의 연속 알칼리성 잔기 위치에서 PC1/3, PC2 등의 프로-호르몬 변환 효소에 의해 절단되는 것으로 생각된다(비특허 문헌 21, 22). 그러나, 이와 같은 2개의 연속 알칼리성 잔기는 내인성 생리 활성 펩티드 전구체 이외의 다른 단백질에도 많이 존재하고 있어, 각종 생물의 전체 게놈을 대상으로 하여 상기 2개의 연속 알칼리성 잔기가 개입되어 있는 모든 서열을 내인성 생리 활성 펩티드로 가정하여 그 활성을 평가하 는 것은 매우 어려운 일이다. 그래서, 프로-호르몬 변환 효소의 기질로서 서열을 예측하는 시도도 보고되고 있지만(비특허 문헌 23), 실용적인 수준에 도달되었다고 할 수는 없다.
이와 같이, 게놈 서열이 해독된 지금도 새로운 생리 활성 펩티드를 예측하는 것은 지극히 어려운 과제이다.
비특허 문헌 1: Kastin, 「Handbook of biologically active peptide」, Academic Press, New York, 2006년
비특허 문헌 2: Hosoda, et al., J. Pharmacol. Sci., 100, 398-410(2006)
비특허 문헌 3: Hinson, et al., Endocrine Reviews, 21, 138-167(2000)
비특허 문헌 4: Morton, et al., Nature, 4433, 289-295(2006)
비특허 문헌 5: Kangawa, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 118, 131-139(1984)
비특허 문헌 6: Minamino, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 130, 1078-1085(1985)
비특허 문헌 7: Miyata, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 164, 567-574(1989)
비특허 문헌 8: Meunier, et al., Nature, 377, 532-535, (1995)
비특허 문헌 9: Kojima, et al., Nature, 402, 656-660, (1999)
비특허 문헌 10: Hinuma, et al., Nature, 393, 272-276, (1998)
비특허 문헌 11: Tatemoto, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 251, 471-476(1998)
비특허 문헌 12: Johnson, et al., J. Biol. Chem., 278, 52172-52178, (2003)
비특허 문헌 13: Verdonk, et al., Assay Drug Dev. Techmol., 4, 609-619, (2006)
비특허 문헌 14: Vassilatis, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 100, 4903-4908(2003)
비특허 문헌 15: Roh, et al., J. Biol. Chem., 279, 7264-7274(2004)
비특허 문헌 16: Hinuma, et al., Nature Cell Biol., 400, 703-708(2000)
비특허 문헌 17: Chartel, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 100, 15247-15252(2003)
비특허 문헌 18: Jiang, et al., J. Biol. Chem., 278, 27652-27657(2003)
비특허 문헌 19: Shichiri, et al., Nat. Med., 9, 1166-1172(2003)
비특허 문헌 20: Mirabeau, et al., Genome Research, 17, 320-327(2007)
비특허 문헌 21: Seidah, et al., Brain Res., 848, 45-62(1999)
비특허 문헌 22: Steiner, Curr. Opin. Chem. Biol., 2, 31-39(1998)
비특허 문헌 23: Duckert, et al., Protein Eng. Des. Sel., 17, 107-112(2004)
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
본 발명의 과제는 신규한 내인성 생리 활성 펩티드를 제공하는 것이다.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명자들은 이와 같은 과제를 해결하기 위해 열심히 노력한 결과, 독자적인 방법에 의해, 종래의 방법에서는 동정이 어려운 생리 활성 펩티드를 발견하고, 혈압 강하 작용을 가지는 신규 펩티드를 성공적으로 수득하였다.
본 발명에 있어서, 기능 미확인의, 아미노산 서열 길이가 잔기 300개 미만이고, 분비 단백질의 구조를 가지는, 단백질을 코딩하는 유전자로서, 상기 모든 조건에 부합되는 서열 중에서, 100개의 아미노산 잔기로 구성된 기능 미확인의 전구체 단백질(HC021: 서열번호 3)을 코딩하는 사람 유전자(서열번호 4)를 공공 서열 데이터 베이스로부터 선택하여, 선택한 유전자를 클로닝하여 전구체 단백질을 대장균 β-갈락토시다제와의 융합 단백질로서 생산한 다음, 상기 융합 단백질을 프로-호르몬 변환 효소에 의해 시험관 내에서 펩티드 특이적으로 절단시키고, 절단으로 생긴 단편 서열을 질량 분석시스템으로 동정함으로써, 전구체 단백질이 프로-호르몬 변환 효소에 의해 절단되는 위치를 특정하였다. 즉, HC021를 프로세싱 효소(Kex2 프로테아제 유도체: Kex2-660)로 처리하였을 때, 내부에서 절단되는 펩티드로서 서열번호 5가 동정되었으며, HC021(서열번호 3)의 아미노 말단에서부터 계수하여 53번째 Arg와 54번째 Gly 사이가 절단됨을 확인하였다. 그 후, 전구체 단백질이 절단되는 위치에 따라 새로운 내인성 생리 활성 펩티드를 추정하고, 추정한 신규 내인성 생리 활성 펩티드 후보를 화학 합성법에 의해 대량으로 제조한 다음, 랫(rat)에 있어서의 혈압 변동 활성을 측정함으로써, 혈압 강하 작용을 나타내는 신규 펩티드를 성공적으로 확인하게 되었다.
이와 같은 방법은, 정보학적 방법을 이용하여 펩티드 전구체 후보 유전자를 미리 특정하기 때문에, 조직 추출물로부터 정제하는 방법에 비해, 다량의 펩티드 샘플을 제공할 수 있다. 또한, 상기 방법은, 펩티드 전구체 단백질을 프로-호르몬 변환 효소에 의해 실험적 방법으로 절단하므로, 정보학적으로는 예측하기 어려운 전구체 단백질의 특이적 절단 부위를 검출할 수 있다.
본 발명에 있어서, 펩티드의 혈압 강하 활성을 측정하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 상기 펩티드를 랫이나 마우스 등의 인간을 제외한 동물에게 투여하고, 혈압의 강하를 측정·평가하는 방법이면 된다. 구체적으로는, 정상 동물 이외에도, Dahl 식염 감수성 랫, 자연적인 고혈압 랫(SHR: spontaneous hypertensive rat), DOCA 식염 부하 랫, DOCA 식염 부하 개, 2-신장 1-클립(2K1C:two-kidney one-clip) Goldblatt 고혈압 랫, 척수 손상 랫 등의 고혈압 모델 동물들을 이용할 수 있으며, 혈압의 측정 방법으로 관혈적(觀血的) 혈압 측정법, 비관혈적 혈압 측정법(tail cuff 법), 무마취무구속하 혈압측정법(원격 측정법 시스템) 등을 이용할 수 있다.
본 발명은 혈압 강하 활성을 가진 신규한 내인성 생리 활성 펩티드 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염에 관한 것이다. 본 발명자들은, 상기 방법으로 수득한 신규 생리 활성 펩티드에 대하여, 아미노 말단 및 카르복실 말단이 결손된 서열을 화학 합성하고, 상기 펩티드의 혈압 강하 활성을 측정함으로써, 혈압 강하 활성에 필요한 코어 서열이 LFFRRLQAY(서열번호 23)의 9개의 잔기로 이루어지는 서열인 것을 특정하였다.
또한, 상기 방법으로 수득한 신규 생리 활성 펩티드에 대하여, 아미노 말단 및 카르복실 말단이 연장된 서열과, 다양한 위치의 아미노산이 치환된 서열들을 화학 합성하고, 상기 펩티드의 혈압 강하 활성을 측정함으로써, 활성 코어 서열(P2)의 아미노 말단에 결합하는 서열의 대부분을 치환하더라도 활성이 유지되며, 활성 코어 서열(P2)의 카르복실 말단에 15개 정도의 잔기를 부가하면 활성이 증강되며, 활성 코어 서열(P2) 내의 소수성 측쇄가 활성에 중요하며, 그리고 활성 코어 서열(P2)내에도 아미노산 보존적인 치환이 행해진 경우에는 활성이 유지된다는 것을 발견하였다.
그리고, 본 발명의 신규한 생리 활성 펩티드의 전구체 폴리펩티드(서열번호 3)에 대해, 그 아미노산 서열 및/또는 그것을 코딩하는 DNA의 염기 서열이, 국제 출원 WO2001/072800; WO2002/002621; WO2002/068579; 미국 출원 US2005/0208602; Nature Biotechnology(2001), 19)(5), 440-445, Genome Research(2003), 13(10), 2265-2270에 기재되어 있으며, GenBank 등의 공공 서열 데이터 베이스에도 등록되어 있다. 그러나, 상기 문헌들에 개시된 사항은 전구체 폴리펩티드 또는 전구체 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 관한 것일 뿐이며, 본 발명의 신규 펩티드나 본 발명의 펩티드가 혈압 강하 활성을 가지는 것에 대해서는 어떠한 기재도 없다.
또한, 본 발명의 신규한 생리 활성 펩티드의 전구체 폴리펩티드(서열번호 3)의 경우, 그 아미노산 서열과 그것을 코딩하는 DNA의 염기 서열이, 국제 출원 WO2003/052377에 40종의 다른 분비 단백질과 함께 개시되어 있다. 단백질의 활성에 대해서는 고혈압 랫을 사용하여 혈압 강하 활성을 평가할 수 있다는 취지로 기재되어 있지만, 활성의 지표가 될 수 있는 복수개의 평가 방법 중 하나로서 기재되어 있을 뿐이며, 어느 활성에 대해서도 그 활성이 있음을 나타내는 실험 데이터는 기재되어 있지 않다. 상기 문헌에는 본 발명의 신규 생리 활성 펩티드에 대한 어떠한 기재도 시사도 없으며, 본 발명에 관한 신규한 생리 활성 펩티드의 전구체 폴리펩티드 유래의 분비 단백질에 대해 혈압 강하 활성이 있다는 것에 대해서는 일체 언급되어 있지 않다.
본 발명은, 식 1의 펩티드 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 의약에 관한 것이다. 본 발명의 펩티드 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염은 혈압 강하 활성을 가지므로, 본 발명은 식 1의 펩티드 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 의약 조성물, 치료 방법 및 의약의 제조 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 인간을 포함한 동물에서 혈압을 강하시킬 수 있으므로, 고혈압 및/또는 고혈압에 기인한 질환들을 치료할 수 있다.
본 발명은 식 1의 펩티드를 항원으로 하여 제조한 항체, 상기 항체를 이용한 내인성 혈압 강하 펩티드의 측정 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명에 개시된 펩티드에 대한 항체, 특히 상기 펩티드의 카르복실 말단에 대한 항체를 제조하고, 상기 펩티드가 전구체 폴리펩티드로부터 절단된 후에 생기는 부위를 특이적으로 인식한다는 점을 이용하여, 상기 펩티드와 전구체 폴리펩티드를 분별 정량할 수 있는 분석 방법도 본 발명에 포함된다.
따라서, 본 발명은 이하의 발명을 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다.
(1)
(i) 하기 식으로 표시되는 펩티드:
P1n-P2-P3m-Y (식 1)
[상기 식에서,
P1n은 서열번호 2의 카르복시 말단에서부터 연속하는 n번째 잔기의 아미노산 서열이고, n은 0 또는 1-21의 정수이며, 여기서, n이 0인 경우 P1n은 존재하지 않으며;
P2는 서열번호 23의 아미노산 서열이며;
P3m은 서열번호 3의 아미노 말단에서부터 50번째 아미노산으로부터 카르복시 말단 측에 연속하는 m번째 잔기의 아미노산 서열을 나타내고, m은 0 또는 1-22의 정수이며, 여기서, m이 0인 경우, P3m은 존재하지 않으며;
P1n의 아미노 말단 아미노산의 α-아미노기의 수소 원자는, 아세틸기 또는 피로글루타밀기로 치환될 수 있으며;
Y는 카르복실 말단 아미노산의 α-카르복실기의 수산기에 해당하는 부분으로, OH 또는 NH2임]; 또는,
(ii) (i)의 펩티드에 있어서, 1개 또는 복수개의 아미노산이 결손, 치환 및/또는 부가되어 있으며, 혈압 강하 활성을 가지는 것인 펩티드;
또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염.
(2) n이 0인, (1)에 기재된 펩티드 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염.
(3) n 및 m이 0인, (1) 또는 (2)에 기재된 펩티드 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염.
(4) (i)의 펩티드가 서열번호 1, 8, 10∼13, 18∼23 및 25∼43으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된, (1)에 기재된 펩티드 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염.
(5) P1n의 아미노 말단 아미노산의 α-아미노기의 수소 원자가 아세틸기 또는 피로글루타밀기로 치환된, (1)∼(4) 중 어느 한 항에 기재된 펩티드 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염.
(6) Y가 NH2인, (1)∼(5) 중 어느 한 항에 기재된 펩티드 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염.
(7) (1)∼(6) 중 어느 한 항에 기재된 펩티드 또는 그것의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는, 고혈압 및/또는 고혈압에 기인하는 질환의 치료용 의약 조성물.
(8) (7)에 기재된 의약 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 고혈압 및/또는 고혈압에 기인하는 질환의 치료 방법.
(9) (1)∼(6) 중 어느 한 항에 기재된 펩티드에 대한 항체.
(10) 피검시료에서 (1)∼(6) 중 어느 한 항에 기재된 펩티드를 상기 펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출하는 것을 포함하는, 상기 펩티드의 정량 방법.
(11) (1)∼(6) 중 어느 한 항에 기재된 펩티드를 유전자 재조합 기술을 사용하여 제조하는 방법으로서,
상기 펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터로 숙주 세포를 형질전환하는 단계;
수득되는 형질전환 세포를 배양하고, 배양물로부터 목적으로 하는 펩티드를 채취하는 단계; 및
선택적으로, 수식 반응(modification reaction)을 행하는 단계;
를 포함하는, 방법.
발명을 실시하기 위한 형태
용어 설명
본 발명에서, 펩티드는 복수개의 아미노산이 펩티드 결합으로 연이어진 화합물을 말한다. 여기서 아미노산(또는 아미노산 잔기로도 표현함)에는 천연 아미노산 외에도 그의 D, L-광학 이성체나 비천연 아미노산도 포함된다. 또한, 본 발명에서 펩티드에는 펩티드의 아미노 말단 및/또는 카르복실 말단이 수식된 화합물도 포함된다.
본 발명에서, Kex2 프로테아제는 효모의 프로-호르몬 변환 효소(EC 3.4.21.61)이다. 또, Kex2-660은 Kex2 프로테아제를 양호한 효율로 분비 및 발현시킬 수 있는 카르복실 말단 결손체이며, Kex2 프로테아제의 아미노 말단 1번째의 Met에서부터 660번째의 Pro까지의 서열을 포함하는 유전자를 효모에서 발현시킨 후 배양 상등액으로부터 정제하여 수득할 수 있다.
본 발명에서, HC021은 서열번호 3에 기재된 서열을 가진 단백질이다. 본 발명에서는, 전구체인 HC021로부터 수득되는 펩티드는 HC021의 뒤에 하이픈과 숫자 3자리수를 부가하여 표기하였다(예를 들면, HC021-004 등).
생리 활성 펩티드
본 발명의 펩티드는, 하기 식으로 표시되는 펩티드:
P1n-P2-P3m-Y (식 1)
[상기 식에서,
P1n은 서열번호 2의 카르복시 말단에서부터 연속하는 n번째 잔기의 아미노산 서열이고, n은 0 또는 1-21의 정수이며, 여기서, n이 0인 경우 P1n은 존재하지 않으며;
P2는 서열번호 23의 아미노산 서열이며;
P3m은 서열번호 3의 아미노 말단에서부터 50번째 아미노산으로부터 카르복시 말단 측에 연속하는 m번째 잔기의 아미노산 서열을 나타내고, m은 0 또는 1-22의 정수이며, 여기서, m이 0인 경우, P3m은 존재하지 않으며;
P1n의 아미노 말단 아미노산의 α-아미노기의 수소 원자는, 아세틸기 또는 피로글루타밀기로 치환될 수 있으며;
Y는 카르복실 말단 아미노산의 α-카르복실기의 수산기에 해당하는 부분으로, OH 또는 NH2임]; 또는,
상기 펩티드에서 1개 또는 복수개의 아미노산이 결손, 치환 및/또는 부가되어 있으며 혈압 강하 활성을 가진 펩티드; 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염이다.
바람직한 태양에 있어서, 본 발명의 펩티드는 n 또는 m이 0이다(P1n 또는 P3m이 존재하지 않음). 또한, 바람직한 태양에 있어서, 본 발명의 펩티드는 n과 m이 0이다(P1n 및 P3m이 존재하지 않음). 또한, 바람직한 태양에 있어서, 본 발명의 펩티드는, 서열번호 1, 8, 10∼13, 18∼23 및 25∼43으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가진다. 또한, 바람직한 태양에 있어서, P1n의 아미노 말단은 아세틸기 또는 피로글루타밀기로 치환된다. 또한, 바람직한 태양에 있어서, Y는 NH2이다.
다른 바람직한 태양에 있어서, P1n에서 1∼21개의 잔기의 아미노산 중, 1개 또는 수개의 아미노산이 결손, 치환 및/또는 부가된 아미노산 서열도, P1n으로서 바람직하다.
바람직한 태양에 있어서, P3m은 서열번호 3의 아미노 말단에서 50번째의 아미노산으로부터 카르복시 말단 측에 연속하는 m번째 잔기의 아미노산 서열을 의미하며, m은 0 또는 1∼22의 정수이다. 다른 바람직한 태양에 있어서, P3m은 페닐 알라닌, 라이신, 글리신 및 아르기닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 아미노산으로 이루어진다. 또, 바람직한 태양에 있어서, P3m은 Phe(m=1), Phe -Lys(m=2), Phe-Lys-Gly(m=3), Phe-Lys-Gly-Arg(m=4)인 것이 특히 바람직하다. 다른 바람직한 태양에 있어서, 상기 1∼22개 잔기의 아미노산에서, 1개 또는 수개의 아미노산이 결손, 치환 및/또는 부가된 아미노산 서열도, P3m으로서 바람직하다.
또한, 다른 바람직한 태양에 있어서, P1n에서의 아미노산들 중 1개 또는 수개의 아미노산이 결손 또는 부가된 아미노산 서열, 또는 1∼n개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열도 P1n으로서 바람직하다. 또, P2의 9개의 아미노산들 중 1개의 아미노산이 보존적으로 치환된 아미노산 서열도 P2로서 바람직하다. 또, P3m의 아미노산들 중 1개 또는 수개의 아미노산이 결손 또는 부가된 아미노산 서열, 또는 1∼m개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열도, P3로서 바람직하다.
일 태양에 있어서, 본 발명의 펩티드는 1개 또는 복수개의 아미노산의 결손, 치환 및/또는 부가를 포함한다. 또, 일 태양에 있어서, 본 발명의 펩티드는 1개 또는 수개의 아미노산의 결손, 치환 및/또는 부가를 포함한다. 또한, 일 태양에 있어서, 본 발명의 펩티드는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산의 결실, 치환 및/또는 부가를 포함한다.
펩티드의 취득 방법
본 발명의 펩티드는 통상적인 방법을 통해 수득할 수 있다. 예를 들면, 천연 유래의 원료로부터의 분리, 화학적 합성 또는 재조합 DNA 기술에 의해 제조할 수 있다.
본 발명의 펩티드를 천연 유래의 원료로부터 취득하는 경우에는, 상기 펩티드를 발현하고 있는 조직 또는 세포로부터, 상기 펩티드의 분자량, 용해도, 등전점, 친화성 등을 고려하여, 겔 여과, 한외 여과, 투석, SDS-PAGE, 각종 크로마토그래피 등의 분리 정제 방법을 적당히 조합시켜 행할 수 있다. 또, 조직·장기로부터 펩티드를 분리·정제할 때에는, 조직·장기에 존재하는 프로테아제의 작용에 의한 목적 펩티드의 분해를 저지하기 위해, 조직·장기를 끓는 물로 열처리함으로써 프로테아제를 실활시키는 것이 바람직하다.
본 발명의 펩티드를 화학 합성에 의해 취득하는 경우에는, 통상적인 방법으로 행할 수 있다. 펩티드의 화학 합성법으로는 이미 각종 방법들이 충분히 확립되어 있고, 본 발명의 펩티드도 공지의 방법에 따라 용이하게 제조할 수 있다. 예를 들면, 고전적인 펩티드 합성법이나 고상법을 따를 수 있다. 구체적으로는, 보호기가 부가된 아미노산을 액상법 및/또는 고상법에 의해 축합하고, 펩티드 사슬을 연장시키고, 산으로 전체 보호기를 제거하고, 얻어진 조생성물을 상기 정제 방법 등으로 정제함으로써, 본 발명의 펩티드를 얻을 수도 있다. 예를 들면, 「생화학 실험 강좌 1 단백질의 화학」 제4권의 제2장, 제3장(도쿄 화학 동인), 또는 「속 의약품의 개발 14 펩티드 합성」(히로가와 서점) 등의 책에 기재되어 있는 방법에 따라 제조할 수 있다.
본 발명의 펩티드를 재조합 DNA 기술을 이용하여 취득하는 경우에는, 예를 들면, 본 발명의 펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하고, 그 배양물로부터 목적으로 하는 펩티드를 채취할 수 있다.
유전자를 포함하는 벡터로서는, 예를 들면, 대장균 벡터(pBR322, pUC18, pUC19 등), 고초균의 벡터(pUB110, pTP5, pC194 등), 효모의 벡터(YEp형, YRp형, YIp형), 또는 동물세포의 벡터(레트로바이러스, 백시니아 바이러스 등) 등을 들 수 있지만, 그 외의 것이라도 숙주 세포내에서 안정적으로 목적 유전자를 유지하게 할 수 있는 것이면, 어떤 것이라도 사용할 수 있다. 상기 벡터는 적당한 숙주 세포에 도입된다. 목적으로 하는 유전자를 플라스미드에 병합하는 방법이나 숙주 세포에 도입하는 방법은, 예를 들면, Molecular Cloning(Sambrook et al., 1989)에 기재된 방법을 이용할 수 있다.
상기 플라스미드에서 목적으로 하는 펩티드 유전자를 발현시키기 위하여, 상기 유전자의 상류에 프로모터를 작동가능하게 연결시킨다. 본 발명에 있어서 사용되는 프로모터로서는, 목적 유전자의 발현에 사용하는 숙주 세포에 따라 적합한 프로모터이면 어떠한 것이라도 가능하다. 예를 들면, 형질전환하는 숙주 세포가 Escherichia 속인 경우에는 lac 프로모터, trp 프로모터, lpp 프로모터, λPL 프로모터, recA 프로모터 등을 사용할 수 있으며, Bacillus 속의 경우에는 SPO1 프로모터, SPO2 프로모터, penP 프로모터 등을 사용할 수 있으며, 효모의 경우에는 GAP 프로모터, PHO5 프로모터, ADH 프로모터 등을 사용할 수 있으며, 동물세포의 경우에는 SV40프로모터, CMV 프로모터, 레트로바이러스 유래 프로모터 등을 사용할 수 있다.
상기와 같이 하여 얻어진 목적 유전자를 함유하는 벡터를 사용하여 숙주 세포를 형질전환하는 경우, 숙주 세포로서는 세균(예를 들면, Escherichia 속, Bacillus 속 등), 효모(Saccharomyces 속, Pichia 속, Candida 속 등), 동물세포(CHO 세포, COS 세포 등) 등을 사용할 수 있다. 배양 배지로서는 액체 배지가 적당하고, 상기 배지내에 배양되는 형질전환 세포의 생육에 필요한 탄소원, 질소원 등이 포함되는 것이 특히 바람직하다. 필요에 따라 비타민류, 성장 촉진 인자, 혈청 등을 첨가할 수도 있다.
본 발명의 펩티드는, 전구체인 폴리펩티드를 적절한 위치에서 절단할 수 있는 프로세싱 프로테아제 활성을 가지고 있는 세포를 숙주로 한다면, 직접 제조할 수 있다. 또한, 프로세싱 프로테아제 활성에 덧붙여 펩티딜글리신α-아미드화 효소 활성을 가지고 있는 세포를 숙주로서 사용하는 경우, 카르복실 말단이 아미드화된 본 발명의 펩티드를 직접 제조할 수 있다. 이와 같은 프로세싱 프로테아제 및 펩티딜글리신α-아미드화 효소 활성을 가지는 숙주 세포는, 상기 전구체 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환하고, 상기 형질전환 세포가 혈압 강하 활성을 가지는 펩티드를 생산하는 것을 확인함으로써 선발할 수 있다.
또한, 본 발명의 펩티드는, 숙주 세포에서 전구체 폴리펩티드를 제조한 다음, 전구체 폴리펩티드로부터 시험관 내에서 목적한 펩티드를 얻는 방법에 의해 제조할 수도 있다. 형질전환에 사용되는 전구체 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열로서는, 목적으로 하는 펩티드를 코딩하는 유전자의 cDNA 서열을 사용할 수도 있으며, 프로세싱 프로테아제의 절단 서열이 샌드위칭되어 있는 펩티드가 직렬 정렬된 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 사용할 수도 있다. 예를 들면, 전구체 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터로 숙주 세포를 형질전환하고 배양한 후, 배양 균체, 세포 또는 배양액으로부터 전구체 폴리펩티드를 추출 및 정제하고, Kex2-660 등의 정제된 프로세싱 프로테아제와 반응시켜 상기 전구체 폴리펩티드를 절단하고, 필요에 따라 정제된 카르복시펩티다제나 펩티딜글리신α-아미드화 효소와 반응시켜 카르복실 말단을 수식하여, 목적으로 하는 펩티드를 얻을 수 있다. 여기서, 본 발명의 펩티드를 포함하는 배양액 또는 반응액으로부터 본 발명의 펩티드를 정제하는 데에는, 천연 유래의 펩티드를 취득하는 경우와 마찬가지의 분리 정제 방법을 이용할 수 있다.
예를 들면, 대장균 β-갈락토시다아제의 N 말단에서부터 139번 잔기까지의 서열(N 말단에서 77번째 및 123번째의 시스테인을 세린으로 치환한 것)의 카르복실 말단에, 프로세싱 효소(예를 들면, Kex2 프로테아제)로 개열할 수 있는 링커 부위를 통하여, HC021의 아미노산 서열(서열번호 3)에서 분비 시그널 서열(서열번호 3에서, 아미노 말단으로부터 21번째까지의 부분)을 제외한 서열이 융합된 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터를, 대장균에 형질전환하고, 얻어진 융합 단백질을 프로세싱 효소(예를 들면, Kex2 프로테아제 유도체인 Kex2-660)로 처리함으로써, 서열번호 23의 카르복실 말단에 Phe-Lys-Gly-Arg가 부가된 서열을 카르복실 말단에 가지는 펩티드를 수득할 수 있다.
또한, 카르복실 말단의 Arg는 알칼리성 아미노산을 분리시킬 수 있는 카르복시펩티다제(예를 들면, 카르복시펩티다제 B)를 시험관 내에서 반응시킴으로써 제거할 수 있다는 것은 공지의 기술로서 알려져 있으므로, 상기 펩티드를 카르복시펩티다제로 처리함으로써, 서열번호 23의 카르복실 말단에 Phe-Lys-Gly가 부가된 서열을 카르복실 말단에 가지는 펩티드를 수득할 수 있다.
또한, 카르복실 말단의 Gly는, 펩티딜글리신α-아미드화 효소를 시험관 내에서 반응시켜 아미드로 변환시키는 것이 공지의 기술로서 알려져 있으므로, 카르복시펩티다제로 처리한 후, 또한 펩티딜글리신α-아미드화 효소를 처리함으로써, 서열번호 23의 카르복실 말단에 Phe-Lys-amide가 부가된 서열을 카르복실 말단에 가지는 펩티드를 수득할 수 있다.
약학적으로 허용가능한 염
본 발명은, 식 1의 펩티드 뿐만 아니라, 그의 약학적으로 허용가능한 염도 포함한다. 약학적으로 허용가능한 염으로서는, 예를 들면, 무기 염기와의 염, 유기 염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 알칼리성 또는 산성 아미노산과의 염 등을 들 수 있다. 본 발명에서, 이들 염 중에서도 나트륨염, 칼륨염이 가장 바람직하다.
무기 염기와의 염의 바람직한 예로서는, 예를 들면, 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리 금속염; 칼슘염, 마그네슘염 등의 알칼리 토류 금속염; 및 알루미늄 염, 암모늄염 등을 들 수 있다. 유기 염기와의 염의 바람직한 예로서는, 예를 들면, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 디시클로헥실아민, N, N'-디벤질에틸렌디아민 등과의 염을 들 수 있다.
무기산과의 염의 바람직한 예로서는, 예를 들면, 염산, 브롬화수소산, 질산, 황산, 인산 등과의 염을 들 수 있다. 유기산과의 염의 바람직한 예로서는, 예를 들면, 포름산, 아세트산, 트리플루오르 아세트산, 푸마르산, 옥살산, 주석산, 말레산, 시트르산, 숙신산, 말산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 등과의 염을 들 수 있다.
알칼리성 아미노산과의 염의 바람직한 예로서는, 예를 들면, 아르기닌, 라이신, 오르니틴 등과의 염을 들 수 있으며, 산성 아미노산과의 염의 바람직한 예로서는, 예를 들면, 아스파라긴산, 글루타민산 등과의 염을 들 수 있다.
의약
본 발명의 펩티드 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염은 혈압 강하 작용을 가진다. 또, 본 발명의 펩티드 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염은, 그 자체로서 또는 공지의 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 증량제 등과 혼합하여 인간을 포함하는 동물에 대해 사용할 수 있다.
투여 형태는 특별히 제한되는 것은 아니지만, 성인에게 정맥 주사하는 경우, 투여량은 1회 0.8 μg 내지 8 mg/kg이며, 바람직하게는 4 μg 내지 2 mg/kg이며, 보다 바람직하게는 8 μg 내지 0.8 mg/kg이다. 이 양을 1일 1회 내지 3회 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 펩티드 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염은 정제, 캡슐제, 과립제, 가루약 등의 고형 제제; 또는 시럽제, 주사제 등의 액상 제재로서 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 또, 필요에 따라, 방부제, 항산화제, 착색제, 감미제 등의 제제 첨가물을 사용할 수도 있다.
본 발명의 펩티드 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염은 약학적으로 허용되는 담체와 조합하여 사용할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로서는, 제제 소재로서 관용의 각종 유기 또는 무기 담체 물질이 사용되며, 고형 제제에는 부형제, 활택제, 결합제, 붕괴제; 액상 제제에는 용매, 용해 보조제, 현탁화제, 등장화제, 완충제, 무통화제 등이 배합된다.
부형제의 바람직한 예로서는, 예를 들면, 락토스, 슈크로스, D-만니톨, 전분, 결정 셀룰로오스, 경질 무수 규산 등을 들 수 있다. 활택제의 바람직한 예로서는, 예를 들면, 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 탈크, 콜로이드 실리카 등을 들 수 있다.
결합제의 바람직한 예로서는, 예를 들면, 결정 셀룰로오스, 슈크로스, D-만니톨, 덱스트린, 하이드록시 프로필 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈 등을 들 수 있다.
붕괴제의 바람직한 예로서는, 예를 들면, 전분, 카르복시메틸 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스 칼슘, 크로스카르멜로스 나트륨, 카르복시메틸스타치나트륨 등을 들 수 있다.
용매의 바람직한 예로서는, 예를 들면, 주사 용수, 알코올, 프로필렌글리콜, 마크로골, 참기름, 옥수수유 등을 들 수 있다.
용해 보조제의 바람직한 예로서는, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌글리콜, D-만니톨, 벤질 벤조에이트, 에탄올, 트리스아미노메탄, 콜레스테롤, 트리에탄올아민, 탄산나트륨, 구연산 나트륨 등을 들 수 있다.
현탁화제의 바람직한 예로서는, 예를 들면, 스테아릴 트리에탄올아민, 라우릴 황산 나트륨, 라우릴 아미노 프로피온산, 레시틴, 염화 벤즈알코늄, 염화 벤즈에토늄, 모노 스테아린산 글리세린 등의 계면활성제; 예를 들면, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨, 메틸 셀룰로오스, 하이드록시 메틸 셀룰로오스, 하이드록시 에틸 셀룰로오스, 하이드록시 프로필 셀룰로오스 등의 친수성 고분자 등을 들 수 있다.
등장화제의 바람직한 예로서는, 예를 들면, 염화 나트륨, 글리세린, D-만니톨 등을 들 수 있다.
완충제의 바람직한 예로서는, 예를 들면, 인산염, 아세트산염, 탄산염, 구연산염 등을 들 수 있다.
무통화제의 바람직한 예로서는, 예를 들면, 벤질 알코올 등을 들 수 있다.
방부제의 바람직한 예로서는, 예를 들면, 파라옥시 안식향산 에스테르류, 클로로 부탄올, 벤질 알코올, 펜에틸 알코올, 데하이드로아세트산, 소르브산 등을 들 수 있다.
항산화제의 바람직한 예로서는, 예를 들면, 아황산염, 아스코르브산 등을 들 수 있다.
항체 및 분석
일 측면에 있어서, 본 발명은 식 1의 펩티드에 대한 항체에 관한 것이다. 혈압 강하 활성을 가진 식 1의 펩티드를 항원으로 하는 항체는, 공지의 방법으로 수득할 수 있다. 본 발명의 항체는 단일 클론 항체 또는 폴리클로날 항체 중 어느 하나일 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 이들 항체를 이용하여 혈압 강하 활성을 가진 펩티드를 측정하는 방법에 관한 것이다.
바람직한 태양에 있어서, 본 발명의 항체는 본 발명에 따른 식 1의 펩티드를 인지하지만, 그 전구체 폴리펩티드는 인지하지 않는다. 이와 같은 항체를 사용하면, 본 발명의 신규 펩티드를 선택적으로 정제 및 정량할 수 있다.
상기 분석 방법의 구체적 태양을 이하에 설명하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
즉, 상기 분석 방법으로서는, 예를 들면,
(i) 본 발명의 펩티드에 대한 항체를, 피검 시료내 피검 물질 및 표지된 본 발명의 펩티드를 경쟁적으로 반응시켜, 상기 항체에 결합된 표지된 본 발명의 펩티드의 비율을 측정하는 것을 포함하는, 본 발명에 따른 펩티드 등의 정량 방법;
(ii) 피검 시료를, 담체 상에 불용화된 본 발명의 항체 및 표지된 본 발명의 다른 항체와 동시 또는 연속적으로 반응시켜, 불용화 담체에서 표지물질의 활성 및/또는 불용화된 담체에서 포착되지 않은 표지물질의 활성을 측정하는 것을 포함하는, 본 발명의 펩티드 등의 정량 방법을 들 수 있다. 상기 정량 방법에 있어서는, 2가지 항체 중 하나는 본 발명에 따른 펩티드는 인지하지만 전구체 폴리펩티드는 인지하지 않는 항체인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 펩티드 등의 분석 방법으로서, 상기 펩티드에 대한 항체를 사용하여 본 발명의 펩티드 등의 정량을 행할 수 있을 뿐만 아니라, 조직 염색 등에 의한 검출도 행할 수도 있다.
이러한 목적으로는, 항체 분자 그 자체를 사용하거나, 또는 항체 분자의 F(ab')2, Fab', 또는 Fab 분획을 사용할 수도 있다.
상기 항체를 이용하는 본 발명의 펩티드 등의 정량 방법은, 특별히 제한되는 것은 아니며, 피검 시료내 항원의 양(예를 들면, 펩티드의 양)에 상응하는, 항체, 항원 또는 항체-항원 복합체의 양을 화학적 또는 물리적 수단에 의해 검출하고, 이를 공지 함량의 항원을 포함하는 표준액을 사용하여 제작한 표준 곡선으로부터 산출하는 측정법이라면, 어떠한 측정법을 이용해도 된다. 예를 들면, 네프로메트리(nephrometry), 경쟁적 방법, 면역법 및 샌드위치법이 바람직하게 사용되지만, 감도, 특이성 측면에서 샌드위치법을 이용하는 것이 특히 바람직하다.
본 발명에 따른 분석 방법들 중, 표지 물질을 사용하는 측정법에 사용되는 표지 물질로는 예를 들면, 방사성 동위원소, 효소, 형광 물질, 발광 물질 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서 방사성 동위원소로서는, 예를 들면, 125I, 131I, 3H, 14C 등을 사용할 수 있다. 또한, 상기 효소로서는, 안정적이며 비활성(specific ctivity)이 높은 것이 바람직하고, 예를 들면, β-갈락토시다제, β-글루코시다제, 알칼리 포스파타제, 퍼옥시다제, 말레이트 탈수소화제 등을 사용할 수 있다. 또한, 형광 물질로는, 예를 들면, 플루오레스카민(fluorescamine), 플루오레세인 이소시아네이트 등을 들 수 있으며, 발광 물질로서는, 예를 들면, 루미놀, 루미놀 유도체, 루시퍼라제, 루시제닌 등을 들 수 있다. 또한, 항체 또는 항원의 표지 물질과의 결합에 비오틴-아비딘계를 사용할 수도 있다.
도 1은 HC021-004 및 HC021-21007의 랫 혈압 강하 작용을 나타낸 도면이다. 도에서, 화살표로 나타낸 시점에 각종 시료를 투여하였다. a는 HC021-004를 10 nmol/rat, b는 HC021-004를 30 nmol/rat, c는 HC021-007을 10 nmol/rat, d는 HC021-007을 30 nmol/rat으로 각각 투여하기 전과 후의 혈압을 나타낸다. e 및 f는 각각, 각 펩티드 10 nmol/rat 및 30 nmol/rat 투여시와 동일한 용매(0.1% 아세트산을 0.1% 소 혈청알부민(Fr.V)을 포함하는 생리 식염수로 10배 희석한 용액)을 투여하기 전과 후의 혈압을 나타낸 도이다.
도 2는 HC021-007의 각성하의 마우스에 대한 혈압 강하 작용을 나타낸 도면이다. 그래프의 가로축은 펩티드 투여 후의 시간(분)이고, 세로축은 투여시를 기준으로 한 수축기 혈압의 변화(mmHg)를 나타낸다. 그래프에서 기호는 HC021-007의 0.1 mg/kg 투여군(n=3)(○), HC021-007의 1 mg/kg 투여군(n=3)(●), 인간 심방성 나트륨 이뇨 펩티드(hANP)의 1 mg/kg 투여군(n=4)(△), 생리 식염수 투여군(n=4)(□)을 나타낸다. 그래프에서 에러 바는 표준오차이다.
도 3은 항[N-Cys]-HC021-004 혈청의 각종 펩티드 서열에 대한 결합을 나타낸 도면이다. a는 HC021-004, HC021-006, HC021-002에 대한 결합능을 나타낸 도면이며, 그래프의 가로축은 항혈청의 희석 배율을 나타내고, 세로축은 ELISA에서의 405nm 흡광도이다. 도면에서 기호는 HC021-004(●), HC021-006(○), HC021-002(□)를 의미한다. b는 HC021-004, HC021-006, HC021-002의 서열을 나타낸 도면이다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 기술적 범위는 이하의 구체적인 실시예로 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 실시예에서 주된 약호의 의미는 다음과 같다.
HBTU: N-[1H-벤조트리아졸-1-일(디메틸아미노)메틸렌]-N-메틸메탄아미늄 헥사플루오로포스페이트 N-옥사이드
HOBt: 1-하이드록시 벤조트리아졸
Trt: 트리틸
Pmc: 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만 6-술포닐
OtBu: t-부틸 에스테르
Mtt: 4-메틸트리틸
TIPS: 트리이소프로필실란
실시예 1: HC021 펩티드의 화학 합성
HC021가 Kex2-660에 의해 53번째의 Arg와 54번째의 Gly 사이에서 절단된다는 정보와, 일반적으로 내인성 생리 활성 펩티드 전구체는 세포내에서 프로세싱되어 펩티드로 생합성되는 메카니즘 기구(2개 이상의 연속된 알칼리성 아미노산 잔기의 카르복실 말단 측이 프로-호르몬 변환 효소에 의해 절단되고, 카르복실 말단의 알 칼리성 아미노산은 카르복실펩티다제에 의해 제거되고, 카르복실 말단의 Gly가 펩티딜글리신α-아미드화 효소에 의해 아미드화됨)를 고려하여, 이하의 펩티드 서열을 고안하여 화학 합성을 행하였다.
HC021-21001 ATVRNEDKWKPLNNPRNRDLFF(서열번호 6)
HC021-21002 LQAYFKGRGLDLGTFPNPFPTNENP(서열번호 7)
HC021-004 NRDLFFRRLQAYFK-amide(서열번호 8)
HC021-21006 LQAYFK-amide(서열번호 9)
HC021-21007 ATVRNEDKWKPLNNPRNRDLFFRRLQAYFK-amide(서열번호 10)
펩티드 사슬의 연장은 주로 펩티드 합성기(433A, Applied Biosystems)를 사용하고, Fmoc법에 의해 보호된 펩티드 유도체-수지를 구축하였다. 제조된, 보호된 펩티드 수지는 트리플루오르 아세트산(TFA), 또는 여러가지 스카벤저(scavenger)를 포함하는 TFA 희석액으로 탈보호하고, 유리된 펩티드를 정제하였다. C18 컬럼을 이용한 역상 HPLC에 의해 정제하면서 동시에 순도를 확인하고, 질량 분석에 의해 구조를 확인하였다.
본 발명의 펩티드는 통상의 펩티드 합성법에 따라 제조할 수 있으며, 대표적인 합성예로서, HC021-004의 합성을 이하에 나타낸다.
HC021 -004의 합성
합성에는, Applied Biosystems 사의 펩티드 합성기(433A)를 사용하였다. Fmoc-Amide 수지(373 mg, 0.25 nmol)를 반응 용기에 넣고, 축합제로서 HBTU/HOBt를 사용하는 FastMoc0.25 프로그램을 사용하였다. 필요에 따라 더블 커플링을 수행하 여, 펩티드 수지를 구축하였다. 마지막으로, N 말단의 Fmoc기를 피페리딘 처리로 제거하였다. 펩티드 수지를 건조하고, 펩티드 수지를 TFA: 페놀: 물: TIPS= 8.8: 0.5: 0.5: 0.2(v/v)의 탈보호 시약 15 ml로 2시간 처리하였다. 반응 후, 여과하여, 수지를 제거하고, 용액을 감압하에서 농축하였다. 잔사에 에테르를 가하여 침전시키고, 침전물을 여과하여 모아, 조 펩티드 352.6 mg을 수득하였다. 그 양의 1/2인 176.3 mg을 YMC ODS 컬럼(5 ㎛, 2 cm X 25 cm)에 첨가하고, 0.1% 트리플루오르 아세트산 중에 아세트 니트릴 농도를 0%에서 60%까지 60분간의 직선 구배(유속: 10 mL/min)로 용출시켰다. 나머지 조 펩티드도 마찬가지로 YMC ODS 컬럼으로 정제하고, 2번의 크로마토그래피를 통해 수득한 순도가 높은 분획을 동결 건조하여, 267.7mg의 분말을 얻었다. 이 분말을 YMC Protein-RP 컬럼(5 ㎛ C4, 2 cm x 25 cm)에 첨가하고, 0.1% 트리플루오르 아세트산 중에 아세트 니트릴 농도를 0%에서 60%까지 60분간의 직선 구배(유속 10 mL/min)로 용출시켰다. 동결건조 후, 목적한 펩티드 245 mg를 수득하였다. ESI-MS 측정값: 1873.0(이론값: 1873.17).
실시예 2: 펩티드의 혈압 효과
8∼10주령의 Sprague-Dawley계 IGS 수컷 랫(일본 Charles River Laboratories)에게 50 mg/kg의 펜토바르비탈 소듐을 복강내 투여하여 마취하고, 기관 캐뉼러(PE 250), 대퇴 정맥 캐뉼러(PE50) 및 대퇴동맥 캐뉼러(PE50)를 삽입하였다. 대퇴 동맥 캐뉼러를 압력 트랜스듀서(PE23XL, 일본 코덴사 제)에 연결시키고, 다용도 프리앰플러 장치(RP-6004, 일본 코덴사 제)에 혈압 측정 유닛(AP-641G, 일본 코덴사 제)과 순간 심박계 유닛(AT-601G, 일본 코덴사 제)을 내장한, 장치를 사 용하여, 혈압 및 심박수를 기록하였다. 혈압은 전기 혈압계 스탠드(MP-25S, 일본 코덴사 제)에 부속된 수은 마노미터를 사용하여 교정하고, 기록지 상에서 10 mm가 100 mmHg 또는 20 mm가 100 mmHg에 해당되도록 조정하였다. 혈압 변동의 양성 컨트롤로서는 아세틸콜린(10 μg/rat)을, 음성 컨트롤로서는 각 펩티드를 용해한 용매를 사용하였다.
각 펩티드를 1 mM 또는 10 mM의 농도로 0.1% 아세트산 용액에 혼합하여 펩티드 용액을 제조한 후, 투여량에 따라, 0.1% 소 혈청 알부민(Fr.V)을 포함하는 생리 식염수로 희석하였다. 10 nmol/rat의 투여량인 경우, 1 mM의 펩티드 용액을 10배 희석하여, 희석액 100 μL를 투여에 사용하였다. 30 nmol/rat의 투여량인 경우, 1 mM의 펩티드 용액을 10배 희석하여, 희석액 300 μL를 투여에 사용하였다. 100 nmol/rat의 투여량인 경우, 10 mM의 펩티드 용액을 10배 희석하여, 희석액 100 μL를 투여에 사용하였다. 각 펩티드는 대퇴 정맥 캐뉼러를 통하여 정맥 내에 투여하고, 수축기 혈압, 확장기 혈압 및 심박수를 측정하였다.
그 결과는 표 1 및 도 1에 나타낸다. HC021-004와 HC021-007에 혈압 강하 활성이 있는 것으로 관찰되었다.
표 1: HC021 유도체 펩티드의 활성
화합물 번호 화합물 구조 서열번호 혈압 강하 활성 (투여량/랫)
10 nmol 30 nmol 100 nmol
1 ATVRNEDKWKPLNNPRNRDLFF (HC021-001) 6 - - -
2 LQAYFKGRGLDLGTFPNPFPTNENP (HC021-002) 7 - - -
3 NRDLFFRRLQAYFK-amide (HC021-004) 8 + ++ +++
4 LQAYFK-amide (HC021-006) 9 NT - -
5 ATVRNEDKWKPLNNPRNRDLFFRRLQAYFK-amide (HC021-007) 10 ++ +++ NT
NT: 미실시
실시예 3: HC021 펩티드의 활성 영역 검색
실시예 1에 준하여, 각종 HC021 유도체 펩티드를 합성하고, 실시예 2에 나타낸 방법에 따라 10 nmol/rat, 30 nmol/rat, 100 nmol/rat의 용량을 랫에게 투여하여 혈압 강하 활성을 측정하였다. 각 유도체 펩티드의 혈압 강하 활성은 2개체 이상에서 활성이 나타난 펩티드에 대해서 활성을 인정하고, 활성의 강도는 반복 실험에 의한 활성의 중앙값으로 판정하였다. 또, 각 유도체 펩티드의 활성을 비교하기 위해, 혈압 강하 활성의 강도를 다음과 같이 정의하였다.
혈압 강하 활성의 강도
·활성이 극히 강함(+++): 수축기 혈압의 강하가 30 mmHg 이상, 또한 회복시까지의 시간이 5분 이상임
·활성이 강함(++): 수축기 혈압의 강하가 20 mmHg 이상, 또한 상기 혈압 강하가 30 mmHg 미만 또는 회복시까지의 시간이 5분 미만임
·활성이 인정됨(+): 수축기 혈압의 강하가 20 mmHg 미만임
·활성이 인정되지 않음(-)
그 결과는 하기 표 2에 나타낸다.
표 2: HCO21 펩티드 연장산물 및 단축 산물의 활성
화합물 번호 화합물 구조 서열 번호 혈압 강하 활성(투여량/랫)
10 nmol 30 nmol 100 nmol
6 NGATVRNEDKWKPLNNPRNRDLFFRRLQAYFK-amide 20 - + NT
7 GATVRNEDKWKPLNNPRNRDLFFRRLQAYFK-amide 19 - ++ NT
8 ATVRNEDKWKPLNNPRNRDLFFRRLQAYFK 10 NT - +++
5 ATVRNEDKWKPLNNPRNRDLFFRRLQAYFK-amide (HC021-007) 10 ++ +++ NT
9 ATVRNEDKWKPLNNPRNRDLFFRRLQAYF 18 NT - +++
10 ATVRNEDKWKPLNNPRNRDLFFRRLQAYF-amide 18 - ++ NT
1 ATVRNEDKWKPLNNPRNRDLFF(HC021-001) 6 - - -
11 NRDLFFRRLQAYFKG 21 - - +
12 NRDLFFRRLQAYFKG-amide 21 - ++ +++
13 NRDLFFRRLQAYFKGR 22 NT - ++
14 NRDLFFRRLQAYFKGR-amide 22 + ++ NT
15 NRDLFFRRLQAYFK 8 - - +
3 (HC021-004) NRDLFFRRLQAYFK-amide 8 + ++ +++
16 RDLFFRRLQAYFK-amide 11 - ++ +++
17 DLFFRRLQAYFK-amide 12 - ++ +++
18 LFFRRLQAYFK 13 NT - ++
19 LFFRRLQAYFK-amide 13 + ++ +++
20 FFRRLQAYFK-amide 14 NT - -
21 FRRLQAYFK-amide 15 NT - -
22 RRLQAYFK-amide 16 NT - -
23 RLQAYFK-amide 17 NT - -
4 (HC021-006) LQAYFK-amide 9 NT - -
24 LFFRRLQAYF-amide 1 NT ++ NT
25 LFFRRLQAY-amide 23 NT - +
26 LFFRRLQA-amide 24 NT - -
27 LFFRRLQAYFKGRGLDLGTFPNPF 25 +++ NT NT
28 LFFRRLQAYFKGRGLDLGTFPNPF-amide 25 +++ NT NT
29 LFFRRLQAYFKGRGLDLGTFPNPFPTNENPR 26 +++ NT NT
30 LFFRRLQAYFKGRGLDLGTFPNPFPTNENPR-amide 26 +++ NT NT
31 acetyl-ATVRNEDKWKPLNNPRNRDLFFRRLQAYFK-amide 10 NT +++ NT
32 acetyl-NRDLFFRRLQAYFK-amide 8 NT ++ NT
33 pyr-EDKWKPLNNPRNRDLFFRRLQAYFK-amide 27 ++ NT NT
NT: 테스트 안함; 밑줄 부분: 코어 서열; pyr-: 피로글루타밀기
화합물 3(HC021-004, 5(HC021-007), 12, 14, 16, 17 및 19는 용량 의존적인 양상으로 혈압 강하 활성을 증강시켰다.
화합물 1∼26의 결과로부터, 활성에는 각 화합물의 카르복실 말단 측에 존재하는 9개의 잔기(LFFRRLQAY: 서열번호 23)가 중요하다는 것을 알게 되었다(이하, 활성 코어 서열이라 함). 화합물 3, 5∼10 및 15∼17의 결과로부터, 활성 코어 서열의 아미노 말단을 연장하더라도 활성은 유지되며, 화합물 3, 11∼15, 18, 19, 24, 25 및 27∼30의 결과로부터, 활성 코어 서열의 카르복실 말단에 수개의 잔기를 연장하더라도 활성은 유지되며, 더 연장하면 활성이 증강된다는 것을 확인하였다. 또한, 화합물 3, 5, 8∼15, 18, 19의 결과로부터, 카르복실 말단의 아미드 구조는 활성의 발현에 필수적인 것은 아니지만, 활성을 증강시킨다는 것을 알게 되었다. 화합물 31∼33의 결과로부터, 아미노 말단의 아미노기의 수식은 활성에 영향을 주지 않는 것으로 확인되었다.
실시예 4: HC021 펩티드의 서열 치환에 의한 활성 영향
실시예 1에 준하여 각종 HC021 펩티드의 서열 치환체를 합성하고, 실시예 3의 방법에 따라 혈압 강하 활성을 측정하였다.
그 결과는 하기 표 3에 나타낸다. 혈압 강하 활성의 강도의 정의는 실시예 3에 따른다.
화합물 34∼40의 결과로부터, 활성 코어 서열에 결합하는 아미노 말단 측의 서열은, 그 대부분이 치환되더라도 활성은 유지되는 것으로 확인되었다. 또한, 화합물 48, 49의 결과로부터, 활성 코어 서열에 결합하는 카르복실 말단 측의 서열은, 그 대부분이 치환되더라도 활성은 유지되는 것으로 확인되었다. 또한, 화합물 36∼38 및 43(친수성 측쇄의 보존적 치환) 및 44∼47(소수성/방향족 측쇄의 보존적 치환)의 결과로부터, 활성 코어 서열의 내부에 1개 정도의 잔기가 보존적 치환되더라도 활성은 유지되며, 화합물 46 및 47의 결과로부터, 활성 코어 서열의 내부에서 는 소수성 측쇄가 활성에 중요하다는 것을 알 수 있었다.
표 3: HC021 펩티드 서열 치환체의 활성
화합물 번호 화합물 구조 서열 번호 혈압 강하 활성 (투여량/랫)
10 nmol 30 nmol 100 nmol
5 ATVRNEDKWKPLNNPRNRDLFFRRLQAYFK-amide (HC021-007) 10 ++ +++ NT
34 ATLRNEDTWKPLSNPRNRDLFFRRLQAYFK-amide 28 - + NT
35 ATLGSEDTWKPLSNPRNRDLFFRRLQAYFK-amide 29 - ++ NT
36 ATLRNEDTWKPLSNPRNRELFFRSLQAYFK-amide 30 - - +++
37 ATLGSEDTWKPLSNPRNRELFFRSLQAYFK-amide 31 - - ++
38 ATLGSEDTWKPLSNPRNRELFFRSLQAYF-amide 32 - - ++
39 FVPIFTYGELQRMQNRDLFFRRLQAYFK-amide 33 - - +++
40 VQQRKESKKPPAKLQPRNRDLFFRRLQAYFK-amide 34 NT ++ NT
3 NRDLFFRRLQAYFK-amide (HC021-004) 8 + ++ +++
41 NRELFFRRLQAYFK-amide 35 - ++ NT
42 NRDLFFRRLQAYAK-amide 36 - - ++
19 LFFRRLQAYFK-amide 13 + ++ +++
43 LFFRSLQAYFK-amide 37 - ++ NT
44 LFFRRLQALFK-amide 38 - ++ NT
45 LFFRRLQA( Cha )FK-amide 39 + +++ NT
46 LFFRRLQAWFK-amide 40 - - +
47 LFFRRLQAHFK-amide 41 - - +++
30 LFFRRLQAYFKGRGLDLGTFPNPFPTNENPR-amide 26 +++ NT NT
48 LFFRRLQAYFKNGAEDESAEAFPLEF-amide 42 +++ NT NT
49 LFFRRLQAYFKASASADYEEQKNSFHNYLK- amide 43 +++ NT NT
NT: 테스트 안함; 밑줄 친 부분: HC021에서 치환된 아미노산 잔기; Cha: 사이클로헥실알라닌
실시예 5: 각성( awake ) 랫에서의 강압 활성
8∼10주령의 Sprague-Dawley계 IGS 수컷 랫(일본 Charles River Laboratories)에 50 mg/kg의 펜토바비탈나트륨을 복강내 투여하여 마취시키고, 펩티드 투여용으로 경정맥 캐뉼러(실라스콘 0. 5-1.0) 및 혈압 측정용으로 경동맥 캐뉼러(PE50)를 삽입하였다. 수술 후 적어도 3시간 이상 경과한 후에, 랫의 자세 및 호흡 등의 일반적인 상태를 기초로 마취에서 풀린(각성) 것을 확인하고, 실험에 사 용하였다.
경동맥 캐뉼러를 압력 트랜스듀서(PE23XL, 일본 코덴사 제)에 연결시키고, 다용도 프리앰플러 장치(RP-6004, 일본 코덴사 제)에 혈압 측정 유닛(AP-641G, 일본 코덴사 제)과 순간 심박계 유닛(AT-601G, 일본 코덴사 제)가 내장된, 장치를 사용하여, 혈압 및 심박수를 기록하였다. 혈압은 전기 혈압계 스탠드(MP-25S, 일본 코덴사 제)에 부속된 수은 마노미터를 사용하여 교정하고, 기록지 상에서 20 mm가 100 mmHg 또는 40 mm가 100 mmHg에 해당되도록 조정하였다. 혈압 변동의 음성 컨트롤로서는 각 펩티드를 용해한 용매를 사용하였다.
각 펩티드는 1 mM의 농도로 5% 만니톨 용액에 혼합하여 펩티드 용액을 조제한 후, 투여량에 따라 5% 만니톨 용액으로 희석하였다. 투여량 10 nmol/rat은, 1 mM의 펩티드 용액을 30배 희석하고, 그 희석액 300 μL를 투여에 사용하였다. 투여량 30 nmol/rat은, 1 mM의 펩티드 용액을 10배 희석하고, 그것의 300 μL를 투여에 사용하였다. 투여량 100 nmol/rat은 1 mM의 펩티드 용액을 3배 희석하고, 그것의 300 μL를 투여에 사용하였다. 각 펩티드는 경정맥 캐뉼러를 통해 정맥내 투여하고, 수축기 혈압, 확장기 혈압 및 심박수를 측정하였다.
그 결과는 표 4에 나타낸다. 혈압 강하 활성의 강도의 정의는 실시예 3에 따른다.
실시예 2, 3 및 4의 마취 랫을 사용한 경우와 마찬가지로, HC021-004, HC021-007 및 화합물 36은 각성 랫에 대해서도 강압 활성을 나타내었다.
표 4: 각성 랫에 대한 HC021 펩티드의 활성
화합물 번호 화합물 구조 서열번호 혈압 강하 활성 (투여량/랫)
10 nmol 30 nmol 100 nmol
3 NRDLFFRRLQAYFK-amide (HC021-004) 8 - - ++
5 ATVRNEDKWKPLNNPRNRDLFFRRLQAYFK-amide(HC021-007) 10 - ++ +++
36 ATLRNEDTWKPLSNPRNRELFFRSLQAYFK-amide 30 - - ++
실시예 6: 각성 마우스에 대한 강압 활성
체중 30g∼40g의 C57BL/6 마우스(일본 Charles River Laboratories)를, 랫·마우스용 무가온형 비관혈식 혈압계(MODEL MK-2000, Muromachi Kikai Co., Ltd.)의 보정기 안에 넣고, 꼬리의 근원에 카프-펄스 센서를 장착하였다. 마우스의 혈압이 안정되는 것을 확인한 후, 실험에 사용하였다.
펩티드는 투여량에 따라 생리 식염수로 희석하여 펩티드 용액을 제조하였다. 투여량 0.1 mg/kg은 0.02 mg/mL의 펩티드 용액으로, 투여량 1 mg/kg은 0.2 mg/mL의 펩티드 용액으로 제조하고, 투여액의 부피는 5 mL/kg으로 하였다. 양성 컨트롤로서는 인간 심방성 나트륨 이뇨 펩티드(hANP)를, 음성 컨트롤로서는 생리 식염수를 사용하였다. 각 펩티드는, 29G 바늘이 부착된 시린지를 사용하여 꼬리 정맥에 투여하고, 투여 후 3분 및 10분에 수축기 혈압 및 심박수를 측정하였다.
그 결과는 도 2에 나타낸다.
실시예 2, 3 및 4의 마취하의 랫의 경우와 동일하게, HC021-007은 마취에서 풀린 마우스에서도 강압 활성을 나타내었다.
실시예 7: 펩티드에 대한 항체 제작
[N-Cys]-HC021-004(HC021-004의 아미노 말단에 시스테인이 결합된 펩티드)를 항원으로 하여 토끼를 면역시킨 후, 항혈청(항[N-Cys]-HC021-004 혈청)을 수득하였 다.
상기 항혈청에 대해 각종 서열의 펩티드에 대한 결합능을 Protein DetectorTM ELISA kit(AP; BluePhos System, KPL사 제조)로 검토하였다. 반응은 모두 실온에서 행하였다. 96웰 면역플레이트(맥시코트됨, Nunc사 제조)에, 각종 서열의 펩티드(1 ng/(100 uL 농도)를 1시간 동안 코팅하고(양: 100 uL/웰), 300 uL/well의 블록킹 용액으로 한시간 블록킹한 후, 연속 희석한 상기 항혈청을 100 uL/well로 첨가하여 한시간 반응시켰다. 세정 후, 500배 희석한 항-토끼 IgG HRP Ab(KPL사 제조)를 100 uL/well로 첨가하여 한시간 반응 후, 세정한 다음, 기질로서 ABTS(KPL사 제조)를 100 uL/well 첨가하고, 30분 후에 405 nm의 흡광도를 측정하였다.
검출 결과는 도 3에 나타낸다. 상기 항혈청은 HC021-004와 HC021-006에 대해 대략 동등한 결합을 보였지만, HC021-002에 대하여는 결합을 전혀 볼 수 없었다. 이러한 결과로부터, 상기 항혈청은 전구체 서열의 HC021를 인지하지 않으며, 카르복실 말단 측에 활성 코어 서열을 가지고 있는 펩티드를 인지하는 것으로 생각된다.
본 발명의 펩티드에 대한 항체를 사용하면, 전구체 폴리펩티드를 구별하여, 본 발명의 펩티드를 정량할 수 있다.
본 발명은 신규한 생리 활성 펩티드에 관한 것이다. 본 발명의 펩티드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염은 인간 또는 동물 투여시 혈압을 저하시키므로, 고혈압에 기인하는 질환을 개선하는 의약으로서 유용하며, 본 발명의 펩티드에 대한 항체는 질병의 진단에 유용하다.
SEQUENCE LISTING <110> Asubio Pharma Co., Ltd. <120> Peptide Having Hypotensive Activity <130> FA0011-08071 <150> 2007-170550 <151> 2007-6-28 <160> 43 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Compound 24 <400> 1 Leu Phe Phe Arg Arg Leu Gln Ala Tyr Phe 1 5 10 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic peptide sequence <400> 2 Asn Gly Ala Thr Val Arg Asn Glu Asp Lys Trp Lys Pro Leu Asn Asn 1 5 10 15 Pro Arg Asn Arg Asp 20 <210> 3 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Thr Arg Ala Pro Leu Leu Leu Leu Cys Val Ala Leu Val Leu Leu 1 5 10 15 Gly His Val Asn Gly Ala Thr Val Arg Asn Glu Asp Lys Trp Lys Pro 20 25 30 Leu Asn Asn Pro Arg Asn Arg Asp Leu Phe Phe Arg Arg Leu Gln Ala 35 40 45 Tyr Phe Lys Gly Arg Gly Leu Asp Leu Gly Thr Phe Pro Asn Pro Phe 50 55 60 Pro Thr Asn Glu Asn Pro Arg Pro Leu Ser Phe Gln Ser Glu Leu Thr 65 70 75 80 Ala Ser Ala Ser Ala Asp Tyr Glu Glu Gln Lys Asn Ser Phe His Asn 85 90 95 Tyr Leu Lys Gly 100 <210> 4 <211> 300 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atgaccagag cacctctcct gctactatgt gttgccctgg tgctgcttgg gcatgtgaat 60 ggagccacag taagaaatga ggacaaatgg aagccactca acaaccccag aaacagagat 120 ctgtttttca gaaggcttca ggcatatttt aagggcagag gtcttgatct tggaacattt 180 ccaaatcctt tccccacgaa tgaaaatcct agacctctct ctttccagtc agaacttact 240 gcttctgcat ctgcagatta tgaagagcag aaaaactcct ttcacaatta tctcaaaggc 300 <210> 5 <211> 47 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gly Leu Asp Leu Gly Thr Phe Pro Asn Pro Phe Pro Thr Asn Glu Asn 1 5 10 15 Pro Arg Pro Leu Ser Phe Gln Ser Glu Leu Thr Ala Ser Ala Ser Ala 20 25 30 Asp Tyr Glu Glu Gln Lys Asn Ser Phe His Asn Tyr Leu Lys Gly 35 40 45 <210> 6 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Compound 1 (HC021-001) <400> 6 Ala Thr Val Arg Asn Glu Asp Lys Trp Lys Pro Leu Asn Asn Pro Arg 1 5 10 15 Asn Arg Asp Leu Phe Phe 20 <210> 7 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Compound 2 (HC021-002) <400> 7 Leu Gln Ala Tyr Phe Lys Gly Arg Gly Leu Asp Leu Gly Thr Phe Pro 1 5 10 15 Asn Pro Phe Pro Thr Asn Glu Asn Pro 20 25 <210> 8 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Compound 3 (HC021-004), Compound 15, Compound 32 <400> 8 Asn Arg Asp Leu Phe Phe Arg Arg Leu Gln Ala Tyr Phe Lys 1 5 10 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Compound 4 (HC021-006) <400> 9 Leu Gln Ala Tyr Phe Lys 1 5 <210> 10 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Compound 5 (HC021-007), Compound 8, Compound 31 <400> 10 Ala Thr Val Arg Asn Glu Asp Lys Trp Lys Pro Leu Asn Asn Pro Arg 1 5 10 15 Asn Arg Asp Leu Phe Phe Arg Arg Leu Gln Ala Tyr Phe Lys 20 25 30 <210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Compound 16 <400> 11 Arg Asp Leu Phe Phe Arg Arg Leu Gln Ala Tyr Phe Lys 1 5 10 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Compound 17 <400> 12 Asp Leu Phe Phe Arg Arg Leu Gln Ala Tyr Phe Lys 1 5 10 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Compound 18/19 <400> 13 Leu Phe Phe Arg Arg Leu Gln Ala Tyr Phe Lys 1 5 10 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Compound 20 <400> 14 Phe Phe Arg Arg Leu Gln Ala Tyr Phe Lys 1 5 10 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Compound 21 <400> 15 Phe Arg Arg Leu Gln Ala Tyr Phe Lys 1 5 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Compound 22 <400> 16 Arg Arg Leu Gln Ala Tyr Phe Lys 1 5 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Compound 23 <400> 17 Arg Leu Gln Ala Tyr Phe Lys 1 5 <210> 18 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Compound 9/10 <400> 18 Ala Thr Val Arg Asn Glu Asp Lys Trp Lys Pro Leu Asn Asn Pro Arg 1 5 10 15 Asn Arg Asp Leu Phe Phe Arg Arg Leu Gln Ala Tyr Phe 20 25 <210> 19 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Compound 7 <400> 19 Gly Ala Thr Val Arg Asn Glu Asp Lys Trp Lys Pro Leu Asn Asn Pro 1 5 10 15 Arg Asn Arg Asp Leu Phe Phe Arg Arg Leu Gln Ala Tyr Phe Lys 20 25 30 <210> 20 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Compound 6 <400> 20 Asn Gly Ala Thr Val Arg Asn Glu Asp Lys Trp Lys Pro Leu Asn Asn 1 5 10 15 Pro Arg Asn Arg Asp Leu Phe Phe Arg Arg Leu Gln Ala Tyr Phe Lys 20 25 30 <210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Compound 11/12 <400> 21 Asn Arg Asp Leu Phe Phe Arg Arg Leu Gln Ala Tyr Phe Lys Gly 1 5 10 15 <210> 22 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Compound 13/14 <400> 22 Asn Arg Asp Leu Phe Phe Arg Arg Leu Gln Ala Tyr Phe Lys Gly Arg 1 5 10 15 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Compound 25, active center <400> 23 Leu Phe Phe Arg Arg Leu Gln Ala Tyr 1 5 <210> 24 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Compound 26 <400> 24 Leu Phe Phe Arg Arg Leu Gln Ala 1 5 <210> 25 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Compound 27/28 <400> 25 Leu Phe Phe Arg Arg Leu Gln Ala Tyr Phe Lys Gly Arg Gly Leu Asp 1 5 10 15 Leu Gly Thr Phe Pro Asn Pro Phe 20 <210> 26 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Compound 29/30 <400> 26 Leu Phe Phe Arg Arg Leu Gln Ala Tyr Phe Lys Gly Arg Gly Leu Asp 1 5 10 15 Leu Gly Thr Phe Pro Asn Pro Phe Pro Thr Asn Glu Asn Pro Arg 20 25 30 <210> 27 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Compound 33 <400> 27 Glu Asp Lys Trp Lys Pro Leu Asn Asn Pro Arg Asn Arg Asp Leu Phe 1 5 10 15 Phe Arg Arg Leu Gln Ala Tyr Phe Lys 20 25 <210> 28 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Compound 34 <400> 28 Ala Thr Leu Arg Asn Glu Asp Thr Trp Lys Pro Leu Ser Asn Pro Arg 1 5 10 15 Asn Arg Asp Leu Phe Phe Arg Arg Leu Gln Ala Tyr Phe Lys 20 25 30 <210> 29 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Compound 35 <400> 29 Ala Thr Leu Gly Ser Glu Asp Thr Trp Lys Pro Leu Ser Asn Pro Arg 1 5 10 15 Asn Arg Asp Leu Phe Phe Arg Arg Leu Gln Ala Tyr Phe Lys 20 25 30 <210> 30 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Compound 36 <400> 30 Ala Thr Leu Arg Asn Glu Asp Thr Trp Lys Pro Leu Ser Asn Pro Arg 1 5 10 15 Asn Arg Glu Leu Phe Phe Arg Ser Leu Gln Ala Tyr Phe Lys 20 25 30 <210> 31 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Compound 37 <400> 31 Ala Thr Leu Gly Ser Glu Asp Thr Trp Lys Pro Leu Ser Asn Pro Arg 1 5 10 15 Asn Arg Glu Leu Phe Phe Arg Ser Leu Gln Ala Tyr Phe Lys 20 25 30 <210> 32 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Compound 38 <400> 32 Ala Thr Leu Gly Ser Glu Asp Thr Trp Lys Pro Leu Ser Asn Pro Arg 1 5 10 15 Asn Arg Glu Leu Phe Phe Arg Ser Leu Gln Ala Tyr Phe 20 25 <210> 33 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Compound 39 <400> 33 Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Met Gln Asn Arg 1 5 10 15 Asp Leu Phe Phe Arg Arg Leu Gln Ala Tyr Phe Lys 20 25 <210> 34 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Compound 40 <400> 34 Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro 1 5 10 15 Arg Asn Arg Asp Leu Phe Phe Arg Arg Leu Gln Ala Tyr Phe Lys 20 25 30 <210> 35 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Compound 41 <400> 35 Asn Arg Glu Leu Phe Phe Arg Arg Leu Gln Ala Tyr Phe Lys 1 5 10 <210> 36 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Compound 42 <400> 36 Asn Arg Asp Leu Phe Phe Arg Arg Leu Gln Ala Tyr Ala Lys 1 5 10 <210> 37 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Compound 43 <400> 37 Leu Phe Phe Arg Ser Leu Gln Ala Tyr Phe Lys 1 5 10 <210> 38 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Compound 44 <400> 38 Leu Phe Phe Arg Arg Leu Gln Ala Leu Phe Lys 1 5 10 <210> 39 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Compound 45 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa: cyclohexylalanine <400> 39 Leu Phe Phe Arg Arg Leu Gln Ala Xaa Phe Lys 1 5 10 <210> 40 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Compound 46 <400> 40 Leu Phe Phe Arg Arg Leu Gln Ala Trp Phe Lys 1 5 10 <210> 41 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Compound 47 <400> 41 Leu Phe Phe Arg Arg Leu Gln Ala His Phe Lys 1 5 10 <210> 42 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Compound 48 <400> 42 Leu Phe Phe Arg Arg Leu Gln Ala Tyr Phe Lys Asn Gly Ala Glu Asp 1 5 10 15 Glu Ser Ala Glu Ala Phe Pro Leu Glu Phe 20 25 <210> 43 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Compound 49 <400> 43 Leu Phe Phe Arg Arg Leu Gln Ala Tyr Phe Lys Ala Ser Ala Ser Ala 1 5 10 15 Asp Tyr Glu Glu Gln Lys Asn Ser Phe His Asn Tyr Leu Lys 20 25 30

Claims (11)

  1. (i) 하기 식으로 표시되는 펩티드:
    P1n-P2-P3m-Y (식 1)
    [상기 식에서,
    P1n은 서열번호 2의 카르복시 말단에서부터 연속하는 n번째 잔기의 아미노산 서열이고, n은 0 또는 1-21의 정수이며, 여기서, n이 0인 경우 P1n은 존재하지 않으며;
    P2는 서열번호 23의 아미노산 서열이며;
    P3m은 서열번호 3의 아미노 말단에서부터 50번째 아미노산으로부터 카르복시 말단 측에 연속하는 m번째 잔기의 아미노산 서열을 나타내고, m은 0 또는 1-22의 정수이며, 여기서, m이 0인 경우, P3m은 존재하지 않으며;
    P1n의 아미노 말단 아미노산의 α-아미노기의 수소 원자는, 아세틸기 또는 피로글루타밀기로 치환될 수 있으며;
    Y는 카르복실 말단 아미노산의 α-카르복실기의 수산기에 해당하는 부분으로, OH 또는 NH2임]; 또는,
    (ii) (i)의 펩티드에서, 1개 또는 복수개의 아미노산이 결손, 치환 및/또는 부가되어 있으며, 혈압 강하 활성을 가진 펩티드;
    또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염.
  2. 제1항에 있어서, n이 0인 것을 특징으로 하는 펩티드 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, n 및 m이 0인 것을 특징으로 하는 펩티드 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염.
  4. 제1항에 있어서, (i)의 펩티드가 서열번호 1, 8, 10∼13, 18∼23 및 25∼43으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 펩티드 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서, P1n의 아미노 말단 아미노산의 α-아미노기의 수소 원자가 아세틸기 또는 피로글루타밀기로 치환된 것을 특징으로 하는 펩티드 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한항에 있어서, Y가 NH2인 것을 특징으로 하는 펩티드 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 기재된 펩티드 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 고혈압 또는 고혈압에 기인하는 질환의 치료용 의약 조성물.
  8. 개체에게 제7항에 따른 의약 조성물을 투여하는 것을 포함하는 고혈압 및/또는 고혈압에 기인하는 질환의 치료 방법.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 기재된 펩티드에 대한 항체.
  10. 피검 시료에서 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드를 상기 펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출하는 것을 포함하는, 상기 펩티드의 정량 방법.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드를 유전자 재조합 기술을 사용하여 제조하는 방법으로서,
    상기 펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터로 숙주 세포를 형질전환하는 단계;
    수득되는 형질전환 세포를 배양하고, 배양물로부터 목적으로 하는 펩티드를 채취하는 단계; 및
    선택적으로, 수식 반응(modification reaction)을 행하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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