KR20100028608A

KR20100028608A - 조직수복재료로서의 콜라겐 기반 매트릭스 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20100028608A
Application number: KR1020100007230A
Authority: KR
Inventors: 이성기; 박시내; 배상희
Original assignee: (주)다림티센
Priority date: 2010-01-27
Filing date: 2010-01-27
Publication date: 2010-03-12
Also published as: KR101068967B1

Abstract

본 발명은 조직수복재료로서의 콜라겐 기반 매트릭스 제조방법 및 이 방법에 의해 제조된 콜라겐 기반 매트릭스에 관한 것으로서, 콜라겐 분산액으로 평판 위에 일정두께로 확산시킨 상태에서 동결건조시켜 콜라겐 다공성막을 얻고 별도의 콜라겐 분산액을 평판 위에 일정두께로 확산시켜 가압하여 콜라겐 경질막을 얻은 다음 경질막 위에 상기 콜라겐 다공성막을 가볍게 적층시켜 풍건하여 2중막을 얻고 이를 에탄올용액에 EDC를 용해시킨 혼합용액에 침지하여 다공성막과 경질막을 가교시켜 일체화시키고 가교화된 2중막을 세척하여 잔류 EDC를 제거시킨 다음 다시 동결건조하여 일정크기로 재단한 방법에 의해 제조된 콜라겐 기반 매트릭스에 관한 것이다.

Description

조직수복재료로서의 콜라겐 기반 매트릭스 및 이의 제조방법{A matrix used for materials to restore tissues comprising two collagen based layers which are different from each other in their porosity and manufacturing method thereof}

본 발명은 조직수복 재료로서의 콜라겐 기반 매트릭스 및 이의 제조방법에 관한 것으로 구체적으로는 가교화를 통한 경질층 및 다공성층의 2중 구조로 구성된 콜라겐막의 개발에 관련된 것으로 동물에서 추출한 1형 콜라겐에서 텔로펩타이드를 제거하여 아텔로 콜라겐을 얻고 이 콜라겐을 증류수에 분산시킨 후 다공성층과 경질층을 만들어 EDC[1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl)carbodiimide]로 가교화시킴으로써 수용액 환경속에서도 쉽게 분리되지 않고 격자형태로 매트릭스를 제작하여 상처표면에 최대한의 접착 및 여분의 매트릭스 손실을 방지할 수 있는 조직수복재로서의 콜라겐 기반 매트릭스 및 그 제조방법에 관한 것이다.

사회의 구조가 변해가고 인구가 증가하면서 화상, 욕창, 외상, 성형, 난치성 궤양, 당뇨성 피부괴사 등의 환자의 수도 점점 증가함에 따라 이에 맞는 손상된 피부의 치료 방법도 발전하고 있다. 30년 전까지만 해도 화상으로 체표면적의 60% 이상이 손상되면 패혈증으로 사망하는 것이 보통이였으나, 최근에는 인공피부의 발전으로 수분손실과 감염을 막을 수 있어 사망률을 상당히 감소시킬 수 있게 되었다.

인공피부는 크게 창상피복재(wound dressing)와 배양피부(cultured skin)로 나뉜다.

창상피복재는 국소적인 창상이나 상처 깊이가 심하지 않은 창상에 적용가능하며, 식피가 가능할 때까지의 기간동안 창상을 보호하거나, 자가배양피부가 완성되는데까지 소요되는 3~4주 동안 상처를 보호하여 배양피부의 적용을 쉽게 하는 역할을 한다. 배양피부는 심한 피부결손이나 광범위한 창상의 경우 반흔 조직을 최소화시키기 위한 치료방법에 사용되는 것으로서 세포배양 기술을 이용하여 피부세포를 충분히 증식시킨 후 영구 생착을 목적으로 이식된다.

하지만 배양피부의 경우는 박테리아, 진균류, 내독성 및 마이코플라즈마(mycoplasma) 시험을 통한 안전성의 많은 검토가 필요하며, 여러 가지 바이러스 [HIV 1&2, HTLVⅠ&Ⅱ, CMV lgM, B형 및 C형 간염바이러스(Hepatitis B & C), 아데노바이러스] 시험을 거쳐 안정성을 확인하여 제조해야 하는 번거로움이 있다. 또한, 사체의 피부를 이식하는 경우 그것의 원사지 파악이 되지 않는 문제점과, 가공처리에 있어서 인체성분은 열가공이 불가능하기 때문에 위에서 언급한 치명적인 바이러스를 100% 멸균시킬 수 없는 단점을 지니고 있다. 그리고 세포를 배양하여 이식하는 데까지 걸리는 시간이 적어도 일주일 이상이 소요되므로 응급처치를 요구하는 환자의 경우에는 사용하기가 곤란하다.

한편, 창상피복재의 경우에는 배양피부에 비해 광범위하게 적용이 가능하고 취급이 용이하며 응급처치를 요구하는 환자에게 적용할 수 있다는 장점이 있다.

그러나, 창상피복재는 일시적인 피복의 용도로 사용되었으므로 영구 생착에 어려움이 있다. 또한, 키틴, 키토산, 콜라겐과 같은 천연고분자의 창상피복재의 경우 기계적인 강도가 낮고 가격이 고가이며 대량 생산이 어렵고, 실리콘, 폴리우레탄 같은 합성고분자의 창상피복재의 경우 세포와의 친화성이 떨어지고 상처부위와의 밀착성 결여라는 단점을 가지고 있다.

이러한 문제점을 해결하기 위하여 본 발명자들은 예의 연구를 거급한 결과, 동물에서 추출한 1형 콜라겐에서 텔로펩타이드를 제거하여 아텔로 콜라겐을 얻고, 이러한 아텔로 콜라겐을 증류수에 분산시킨 후 다공성층과 경질층을 각각 별도로 준비한 후 공극률이 서로 다른 2개의 콜라겐 층을 가교화시킴으로써 수용액 환경속에서도 쉽게 분리되지 않고, 격자형태로 매트릭스를 제작하여 상처표면에 최대한의 접착이 가능하고 여분의 매트릭스 손실을 방지할 수 있는 조직수복재료로서의 콜라겐 기반 매트릭스 및 이의 제조방법을 개발하게 되었다.

본 발명은 종래 조직수복재료의 문제점을 개량 보완한 것으로서, 공극률이 서로 다른 2개의 콜라겐 층을 포함하는 조직수복재료로서의 콜라겐 기반 매트릭스 및 이의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

구체적으로, 본 발명은 합성고분자와 천연고분자를 혼합하여 사용하였던 기존의 제품과는 달리 천연고분자인 콜라겐 만을 사용하였으며, 콜라겐 다공성층과 콜라겐 경질층을 각각 별도로 준비한 후 이중막의 가교화를 행함으로써 기계적인 강도를 높이는 동시에 제조과정에서 수용액 중에서 다공성의 막이 부분적으로 파괴되어 손실되고 경질층과 쉽게 분리되는 문제점을 해결한 조직수복재료로서의 콜라겐 기반 매트릭스 및 이의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 상기와 같이 콜라겐 2중막 형성의 어려움을 해결하여 그 형태를 유지할 수 있도록 함으로써 공극구조를 유지할 수 있는 일정크기의 격자형 매트릭스를 용이하게 제작할 수 있도록 하고, 더욱이 바이러스 감염에서의 안정성을 확보할 수 있으며 다공성 막의 효능을 더욱 개선시킨 조직수복재료로서의 콜라겐 기반 매트릭스 및 이의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 목적 달성을 위해 합성고분자와 천연고분자를 혼합하여 사용하였던 기존의 제품과는 달리 천연고분자인 콜라겐 또는 이들의 접착성을 향상시킨 콜라겐 만을 이용하여 생체와의 친화성을 높이고 다공성층과 경질층 막의 EDC[1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl)carbodiimide]를 이용한 가교화를 행함으로써 기존의 창상피복재에서의 가장 큰 단점인 기계적인 강도를 해결하고, 또한 지금까지는 수용액 분위기에서 다공성 막의 부분적인 파괴와 손실로 경질층과 쉽게 분리되어 콜라겐 이중막 제조의 어려움이 있었지만 가교화 반응시 90~99%의 알코올(에틸알코올, 메틸알코올 등)을 사용함으로써 그 형태를 확실하게 유지할 수 있도록 함으로써 200㎛×200㎛×200㎛에서 최대 10mm×15mm×15mm 크기의 격자형태로도 매트릭스 제작이 가능하여 상처의 불규칙한 가장자리나 손등, 얼굴, 발 등 상처부위가 좁고 곡면인 부위에도 빈공간이 생기지 않도록 잘 밀착되고 여분의 매트릭스의 손실도 방지할 수 있어 조직수복재로서의 활용도도 높일 수 있으며, 또한 환자에게 바로 사용할 수 있어 교통사고와 같은 응급시 신속한 치료를 가능케 할 수 있다.

그리고, 돼지 피부에서 콜라겐을 추출함으로써 소에서 추출한 콜라겐을 이용하는 것보다 TSE's(Transmissible Spongiform Encephalopathies) 감염에 대한 안전성을 높이고, 항생제를 혼합하여 제조함으로써 2차적인 감염의 위험성을 줄일 수 있으며, 더욱 효능개선을 위해 조직공학과 DDS(drug delivery system) 분야에서 많이 이용되고 콜라겐 섬유와 결합시 세포이동을 증가시키는 기능이 있는 히알루론산을 첨가함으로써 우수한 다공성 막을 얻을 수 있는 조직수복재로서의 콜라겐 기반 매트릭스 및 그의 제조방법을 제공할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 일실시예의 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법은,

(a) 콜라겐 분산액을 일정한 두께로 확산시켜 일정 두께의 균일한 막을 형성한 후 이를 동결건조시켜 콜라겐 다공성층을 형성하는 단계와,

(b) 상기 (a) 단계와는 별개로 콜라겐 분산액을 일정한 두께로 확산시키고 다공성의 흡착판으로 압력을 가해서 수분은 침출시키고 콜라겐 입자들은 밀착시켜 조직이 치밀한 콜라겐 경질층을 형성하는 단계와,

(c) 상기 (b) 단계에서 형성된 콜라겐 경질층 상에 상기 (a) 단계에서 형성된 콜라겐 다공성층을 적층시키고 풍건하여 상기 콜라겐 경질층과 상기 콜라겐 다공성층을 1차적으로 결합시키는 단계와,

(d) 상기 (c) 단계를 통해 1차적으로 결합된 상기 콜라겐 경질층과 상기 콜라겐 다공성층을 가교화 수단을 이용하여 가교화시킴으로써 상기 콜라겐 경질층과 상기 콜라겐 다공성층을 2차적으로 결합시키는 단계를 포함한다.

본 발명의 일실시예의 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법은, (e) 상기 가교화 수단이 가교화제인 경우 가교화제를 세정하는 단계를 더 포함한다.

또한, 더욱 바람직하기로는 상기 (e) 단계에서 가교화제를 세정한 후 상기 콜라겐 경질층과 상기 콜라겐 다공성층의 이중층을 추가로 동결건조할 수 있다.

본 발명의 일실시예의 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법에 있어서, 상기 콜라겐 분산액은 아텔로 콜라겐 분산액일 수 있고, 바람직하기로는 감염억제 아텔로 콜라겐 분산액일 수 있다.

본 발명의 일실시예의 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법에 있어서, 상기 동결건조는 -60℃~-80℃에서 1~2일간 수행되는 것이 바람직하다.

본 발명의 일실시예의 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법에 있어서, 상기 (b) 단계에서 다공성의 흡착판으로 가해지는 압력은 1~20psi인 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 일실시예의 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법에 있어서, 상기 가교화 수단은 EDC[1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl)carbodiimide]인 것을 특징으로 한다. 추가로, 상기 가교화 수단은 90~99wt%의 에탄올 용액에 EDC를 첨가한 후 교반하여 얻은 혼합용액일 수 있다.

본 발명의 일실시예의 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법에 있어서, 상기 (a) 단계에서 사용된 콜라겐 분산액은 증류수에 1~3wt%의 아텔로 콜라겐을 넣고 4℃에서 1~2일간 교반시킨 후 0.05~1N NaOH를 이용하여 pH7.4로 조절하여 준비한 것임을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 일실시예의 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법에 있어서, 상기 (a) 단계에서 사용되는 콜라겐 분산액에는 히알루론산이 첨가될 수 있다.

본 발명의 일실시예의 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법에 있어서, 상기 (b) 단계에서 사용된 콜라겐 분산액은 증류수에 2~5wt%의 아텔로 콜라겐을 넣고 4℃에서 1~2일간 교반시킨 후 0.05~1N NaOH를 이용하여 pH7.4로 조절하여 준비한 것임을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 일실시예의 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법에 있어서, 상기 감염억제 아텔로 콜라겐 분산액은 0.001mg~10mg/㎖의 항생제가 첨가되어 분산된 감염억제 아텔로 콜라겐 분산액임을 특징으로 한다.

예를 들어, 상기 항생제는 테트라사이클린계 항생물질인 테트라사이클린, 독시사이클린, 오레오마이신 등일 수 있고, 페니실린계 항생물질인 페니실린V, 앰피실린, 아목시실린, 바캄피실린, 카베니실린, 클록사실린, 디클록사실린, 나프실린, 옥사실린 등일 수 있으며, 세팔로스포린계 항생물질인 세팔렉신, 세프라딘, 세파드록실, 세파클로, 세프록심, 악세틸, 세프포독심, 로라카베프, 세픽심 등일 수 있고, 아미노글리코사이드계 항생물질인 겐타마이신 설페이트, 토브라마이신, 아미카신, 네틸리신, 네오마이신 등일 수 있으며, 폴리믹신계 항생물질인 폴리믹신 B일 수 있고, 설폰아마이드계 항생물질인 마페니드, 실버 설파다이아진, 설파살라진 등 일 수 있으며, 세포막 형성 억제제인 테이코플라닌, 바시트라신, 노보비오신 등일 수 있고, 단백질 합성 억제제인 클린다마이신일 수 있으며, DNA 합성 저해제인 노플록사신, 에녹사신, 페플록사신, 사이프로프록사신, 오플록사신 등일 수 있다.

한편, 본 발명의 일실시예의 콜라겐 기반 매트릭스는 전술한 바와 같은 제조방법으로 제조된 것이다.

본 발명에 의해 제조되는 조직수복재료로서의 콜라겐 기반 매트릭스는 기존의 창상피복재에 비해 천연고분자인 콜라겐 만을 이용하여 생체와의 친화성을 높였으며, 콜라겐 다공성층과 콜라겐 경질층을 각각 별도로 준비한 후 이중막의 가교화를 행함으로써 기계적인 강도를 높이는 동시에 제조과정에서 수용액 중에서 다공성의 막이 부분적으로 파괴되어 손실되고 경질층과 쉽게 분리되는 문제점을 해결하였다.

또한, 본 발명에 따르면 상기와 같이 콜라겐 2중막 형성의 어려움을 해결하여 그 형태를 유지할 수 있도록 함으로써 공극구조를 유지할 수 있는 일정크기의 격자형태 매트릭스를 용이하게 제작할 수 있고, 이에 따라 상처의 불규칙한 가장자리나 손등, 얼굴, 발 등 상처부위가 좁고 곡면인 부위에도 빈공간이 생기지 않도록 잘 밀착되어 환자에게 바로 사용할 수 있으며, 교통사고와 같은 응급시 신속한 치료가 가능하고 여분의 매트릭스의 손실도 방지할 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면 돼지 피부에서 콜라겐을 추출하여 기존의 소에서 추출한 콜라겐을 이용하였을 때보다 TSE 등 감염에서의 안전성을 높였으며 항생제를 혼합하여 제조함으로써 2차적인 감염의 위험성을 줄였다.

도 1은 본 발명의 일실시예의 제조방법에 따라 제조된 콜라겐 기반 매트릭스2중막의 사진이다.
도 2는 본 발명의 콜라겐 기반 매트릭스에 있어서 각종 항생제(A: 토브라마이신, B: 사이프로프록사신, C: 폴리믹신 B)를 함유한 콜라겐 기반 매트릭스의 전자현미경 사진이다.
도 3은 본 발명의 일실시예의 콜라겐 기반 매트릭스 2중막의 단면사진이다.

이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 보다 상세히 기술한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.

본 발명은 종래 인체피부조직 수복재료의 문제점을 개량보완한 피부조직 수복재료로서의 콜라겐 기반 매트릭스 및 이의 제조방법에 관한 것으로 먼저 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법을 구체적으로 단계별로 설명하기로 한다.

본 발명에 포함되는 콜라겐 기반 매트릭스는 다공성막과 경질막의 2중막으로 구성되며 기본적으로 다공성막과 경질막은 콜라겐 분산액으로부터 얻어진다.

상세하게는, 다공성막 제조용 콜라겐 분산액은 증류수에 콜라겐을 분산시킨 콜라겐 분산액(A)과, 감염억제를 위해 항생제를 콜라겐에 첨가시킨 "감염억제 콜라겐 분산액(B)"이 있다. 또한, 다공성막 제조용 콜라겐 분산액으로는 콜라겐에 첨가시 콜라겐 기반 매트릭스의 구조적인 차원이나 콜라겐 섬유와 결합시 세포이동을 증가시켜 효능을 개선시킬 수 있는 히알루론산이 첨가된 "콜라겐 및 히알루론산 혼합액(C)"과, 이 혼합액(C)에 항생제를 첨가시킨 "감염억제 콜라겐 및 히알루론산 혼합액(D)"이 있다. 그리고, 이러한 다공성막 제조용 콜라겐 분산액들과, 이들에 비해 콜라겐 분산함량이 높은 경질막 제조용 콜라겐 분산액(E)으로부터 콜라겐 기반 매트릭스가 얻어진다.

이상의 다공성막 제조용 콜라겐 분산액 및 경질막 제조용 콜라겐 분산액의 제조방법을 설명하면 다음과 같다.

실시예 1: 아텔로 콜라겐 분산액의 제조방법

실시예 1-1: 다공성막 제조용 콜라겐 분산액

(1) 다공성막 제조용 콜라겐 분산액(A)

증류수에 1~3wt%에 해당하는 아텔로 콜라겐을 넣고 4℃에서 1~2일간 교반 분산시킨 후 0.05~1N NaOH를 이용하여 pH7.4로 조절한 콜라겐 분산액이다.

(2) 감염억제 콜라겐 분산액(B)

다공성막 제조용 콜라겐 분산액(A)에 항생제를 미량 첨가하여 균질화시킨 콜라겐 분산액이다.

(3) 아텔로 콜라겐 및 히알루론산의 혼합분산액(C)

증류수에 0.5~3wt%의 아텔로콜라겐을 넣고 4℃에서 1~2일 교반하여 분산시킨 분산액과, 별도로 증류수에 1~3wt%에 해당하는 히알루론산을 첨가하여 4℃에서 13~24시간 교반한 히알루론산 수용액을 혼합하되, 아텔로 콜라겐 분산액을 무게의 비율이 5~10:0.5~2이 될 때까지 히알루론산 수용액을 첨가하여 4℃를 유지한 상태에서 8,000~10,000RPM으로 3~6분 동안 균질화시킨 다음, 0.05~1N NaOH를 이용하여 pH7.4로 조절한 혼합 분산액이다.

(4) 감염억제 콜라겐-히알루론산의 혼합분산액(D)

상기 혼합분산액(C)에 산 비용해성 항생제를 미량으로 첨가하여 균일하게 분산시킨 혼합 분산액이다.

실시예 1-2: 경질막 제조용 콜라겐 분산액(E)의 제조방법

증류수에 2~5wt%의 아텔로 콜라겐을 넣고 4℃를 유지한 상태에서 1~2일간 교반하여 분산시킨 후 0.05~1N NaOH를 첨가하여 pH7.4로 조절한 콜라겐 분산액이다.

실시예 2: 조직수복재료로서의 콜라겐 기반 매트릭스 제조방법

여기에서는 다공성막 제조용의 아텔로 콜라겐 분산액(A) 또는 감염억제 아텔로 콜라겐 분산액(B)과, 경질막 제조용 아텔로콜라겐 분산액(E)으로 콜라겐 기반 매트릭스를 제조하는 실시예들을 설명한다.

우선, 본 발명의 제1실시예의 콜라겐 기반 매트릭스 제조방법은, 아텔로 콜라겐 분산액(A) 또는 감염억제 아텔로 콜라겐 분산액(B)을 페트리디쉬(Petri dish) 또는 이형성의 평판 위에 확산시켜 0.05~1mm 범위의 균일한 막을 형성시킨 다음 -60~-80℃에서 1~2일간 동결건조시켜 다공성막을 제조하는 1단계 공정과, 경질막 형성용 아텔로 콜라겐 분산액(E)을 이형성의 평판바닥에 확산시켜 1~20psi의 압력을 가해 0.05~1mm의 경질막을 제조하는 2단계 공정과, 상기 2단계 공정에서 얻은 경질막을 10~20분정도 상온에서 건조시킨 후 그 위에 상기 1단계 공정에서 얻은 다공성막을 가볍게 적층시켜 상온에서 1~2일간 풍건하여 경질막과 다공성막을 결합시켜 2중막을 얻는 3단계 공정과, 90~99wt%의 에탄올 용액에 EDC를 10~100mM농도로 첨가하여 4℃에서 10~15분간 교반하여 혼합용액을 얻는 4단계 공정과, 상기 4단계 공정에서 얻은 혼합용액에 상기 2중막이 잠길 정도로 침지한 후 4℃에서 1~2일간 다공성막과 경질막을 가교화시키는 5단계 공정과, 상기 5단계 공정의 가교화된 2중막에서 EDC를 제거하기 위해 증류수로 4~6회 세정하는 6단계 공정과, 세정된 2중막을 다시 -60℃~-80℃에서 1~2일간 동결건조하여 정형의 2중막을 제조하는 7단계 공정과, 상기 7단계 공정에서 얻은 2중막을 200㎛×200㎛×200㎛에서 최대 10mm×15mm×15mm크기로 재단하여 조직수복재로서의 활용도를 높인 8단계 공정을 포함한다.

또한, 본 발명의 제2실시예의 콜라겐 기반 매트릭스 제조방법에서는 상기 제1실시예에서 제조된 콜라겐 기반 매트릭스의 효능개선을 위해 조직공학과 DDS(drug delivery system) 분야에서 많이 이용되고 있고, 콜라겐 섬유와 결합시 세포의 이동을 증가시킬 수 있는 무코다당(mucopolysaccharide)인 히알루론산을 첨가한 아텔로 콜라겐 혼합 분산액(C) 또는 이 혼합 분산액에 항생제를 더 첨가한 혼합분산액(D)과, 경질막 제조용 콜라겐 분산액(E)으로 콜라겐 기반 매트릭스를 제조할 수 있다. 콜라겐 기반 매트릭스 제조방법의 제2실시예는 다음과 같다.

본 발명의 제2실시예의 콜라겐 기반 매트릭스 제조방법은, 이형성 평판 위에 "콜라겐 및 히알루론산 혼합분산액(C)" 또는 이 혼합분산액(C)에 미량의 항생제가 첨가된 "감역억제 콜라겐 및 히알루론산의 혼합분산액(D)"으로 0.05~1mm의 막을 형성시키고 이를 -60~-80℃로 유지되는 동결건조기에서 1~2일간 동결건조하여 다공성막을 제조하는 1단계 공정과, 경질막 형성용 아텔로 콜라겐분산액(E)을 이형성의 평판 위에 일정두께로 확산시켜 1~20psi의 압력을 가해서 0.05~1mm의 경질막을 제조하는 2단계 공정과, 상기 경질막을 10~20분 정도 상온에서 건조시킨 후 그 위에 상기 1단계 공정에서 얻은 다공성막을 가볍게 적층시켜 상온에서 1~2일간 풍건하여 경질막과 다공성막을 결합시켜 2중막을 형성시키는 3단계 공정과, 90~99wt%의 에탄올 용액에 EDC를 10~100mM농도로 첨가하여 4℃에서 10~15분간 교반하여 혼합용액을 얻는 4단계 공정과, 상기 4단계 공정에서 얻은 혼합용액에 상기 2중막이 잠길 정도로 침지한 후 4℃에서 1~2일간 다공성막과 경질막을 가교화시키는 5단계 공정과, 상기 5단계 공정의 가교화된 2중막에서 EDC를 제거하기 위해 증류수로 4~6회 세정하는 6단계 공정과, 세정된 2중막을 다시 -60℃~-80℃에서 24~48시간 동결건조하여 정형의 2중막을 제조하는 7단계 공정과, 상기 7단계 공정에서 얻은 2중막을 200㎛×200㎛×200㎛에서 최대 10mm×15mm×15mm 크기로 재단하여 활용도를 높인 8단계 공정을 포함한다.

실시예 3: 제1실시예의 구체적인 제조방법

이하에서는 본 발명의 제1실시예로 제시된 콜라겐 기반 매트릭스 제조방법을 좀더 구체적으로 설명한다.

실시예 3-1:

우선, 증류수에 2wt%에 해당하는 아텔로 콜라겐을 넣고 4℃를 유지하여 40시간 교반하여 분산시켜 콜라겐 분산액을 얻었고, 이 분산액에 0.5N NaOH를 넣어 pH를 7.4로 조절한 다공성막 형성용 아텔로 콜라겐 분산액(A)을 얻었다. 또한, 상기 수득된 아텔로 콜라겐 분산액(A)에 페니실린V을 미량첨가하여 균질화시킨 다공성막 형성용 감염억제 콜라겐 분산액(B)을 얻었다.

그리고, 증류수에 4wt%에 해당하는 아텔로 콜라겐을 넣고 4℃를 유지하여 30시간 교반하여 분산시켜 콜라겐 분산액을 얻고 이 분산액에 0.5N의 NaOH를 넣어 pH를 7.4로 조절한 경질막 형성용 아텔로 콜라겐 분산액(E)을 얻었다.

이와 같이 준비된 다공성막 형성용 아텔로 콜라겐 분산액(A) 또는 감염억제 아텔로 콜라겐 분산액(B)과, 경질막 형성용 아텔로 콜라겐분산액(E)으로 콜라겐 기반 매트릭스를 다음과 같이 제조하였다:

① 아텔로 콜라겐 분산액(A)을 이형성의 평판 위에 확산시켜 0.5mm의 균일한 막을 형성시킨 다음 -70℃로 유지된 동결건조기에서 30시간 동결건조시켜 다공성막을 제조하였다;

② 경질막 형성용 아텔로 콜라겐분산액(E)을 이형성의 평판바닥에 확산시켜 10psi의 압력을 가해 0.5mm의 경질막을 제조하였다;

③ 상기 ② 과정에서 얻은 경질막을 15분간 상온에서 건조시킨 후 그 위에 상기 ① 과정에서 얻은 다공성막을 가볍게 적층시키고 상온에서 30시간 풍건하여 경질막과 다공성막을 결합시켜 2중막을 얻었다;

④ 95wt%의 에탄올 용액에 EDC를 50mM농도로 첨가하여 4℃에서 15분간 교반하여 혼합용액을 얻었다;

⑤ 상기 ④ 과정에서 얻은 혼합용액에 상기 ③ 과정에서 얻은 2중막이 잠길정도로 침지한 후 4℃에서 40시간 다공성막과 경질막을 가교화시켰다;

⑥ 상기 ⑤ 과정에서 가교화된 2중막에서 EDC를 제거하기 위해 증류수로 15분간 5회 세정하였다;

⑦ 세정된 2중막을 다시 -70℃에서 30시간 동결건조하여 정형의 2중막을 얻었다;

⑧ 상기 ⑦ 과정에서 얻은 2중막을 200㎛×200㎛×200㎛에서 최대 10mm×15mm×15mm 크기로 재단하여 조직 수복재료로서의 활용도를 높인 콜라겐 기반 매트릭스를 제조하였다.

실시예 3-2:

상기 실시예 3-1의 제조방법에서 아텔로 콜라겐 분산액(A) 대신 감염억제 아텔로 콜라겐 분산액(B)을 사용하여 실시예 3-1과 동일한 방법으로 처리하여 감염억제기능이 있는 콜라겐 기반 매트릭스를 제조하였다.

실시예 4: 제2실시예의 구체적인 제조방법

이하에서는 본 발명의 제2실시예로 제시된 콜라겐 기반 매트릭스 제조방법을 좀더 구체적으로 설명한다.

실시예 4-1:

우선, 증류수에 2wt%에 해당하는 아텔로 콜라겐을 넣고 4℃에서 30시간 교반분산시켜 콜라겐 분산액을 얻었고, 별도로 증류수에 2wt%에 해당하는 히알루론산을 넣고 4℃에서 20시간 교반하여 히알루론산 수용액을 얻었다. 그런 다음, 콜라겐 분산액을 무게비율이 7:1이 될 때까지 히알루론산 수용액을 첨가하여 4℃에서 9,000rpm으로 4분간 균질화시킨 혼합 분산액에 0.5N의 NaOH를 넣어 pH를 7.4로 조절한 "아텔로 콜라겐 및 히알루론산 혼합분산액(C)"을 제조하였다. 또한, 상기 아텔로 콜라겐 및 히알루론산 혼합분산액(C)에 미량의 페니실린V를 첨가한 "감염억제 아텔로 콜라겐 및 히알루론산 혼합분산액(D)"을 제조하였다.

이와 같이 준비된 아텔로 콜라겐 및 히알루론산 혼합분산액(C) 또는 감염억제 아텔로 콜라겐 및 히알루론산 혼합분산액(D)과, 경질막 형성용 콜라겐 분산액(E)으로 콜라겐 기반 매트릭스를 다음과 같이 제조하였다:

① 살균처리된 이형성 평판 위에 "콜라겐 및 히알루론산 혼합분산액(C)"을 확산시켜 0.5mm의 막을 형성시키고 이를 -70℃로 유지되는 냉동건조기에서 40시간 동결건조하여 다공성막을 제조하였다;

② 경질막 형성용 아텔로 콜라겐 분산액(E)을 이형성의 평판 위에 일정두께로 확산시켜 14psi의 압력을 가해서 0.4mm의 경질막을 제조하였다;

③ 상기 ② 과정에서 얻은 경질막을 15분간 상온에서 건조시킨 후 그 위에 상기 ① 과정에서 얻은 다공성막을 가볍게 적층시키고 상온에서 1∼2일간 풍건하여 경질막과 다공성막을 결합시켜 2중막을 형성시켰다;

⑦ 세정된 2중막을 다시 -70℃에서 40시간 동결건조하여 정형의 2중막을 얻었다;

⑧ 상기 ⑦ 과정에서 얻은 2중막을 200㎛×200㎛×200㎛에서 최대 10mm×15mm×15mm 크기로 재단하여 활용도를 높인 콜라겐 기반 매트릭스를 제조하였다.

실시예 4-2:

상기 실시예 4-1의 제조방법에서 아텔로 콜라겐 및 히알루론산 혼합분산액(C) 대신 감염억제 아텔로 콜라겐 및 히알루론산 혼합분산액(D)을 사용하여 실시예 4-1과 동일하게 처리하여 감염억제 기능을 갖는 콜라겐 기반 매트릭스를 제조하였다.

이상의 콜라겐 기반 매트릭스 제조방법이나 제조방법의 구체적인 실시예에서 사용되는 항생물질로는 테트라사이클린계 항생물질, 예를 들면, 테트라사이클린, 독시사이클린, 오레오마이신 등이고, 페니실린계 항생물질로서 페니실린V, 앰피실린, 아목시실린, 바캄피실린, 카베니실린, 클록사실린, 디클록사실린, 나프실린, 옥사실린 등이며, 세팔로스포린계 항생물질로서 세팔렉신, 세프라딘, 세파드록실, 세파클로, 세프록심, 악세틸, 세프포독심, 로라카베프, 세픽심이고, 아미노글리코사이드계 항생물질로서 겐타마이신 설페이트, 토브라마이신, 아미카신, 네틸리신, 네오마이신이며, 폴리믹신계 항생물질로서 폴리믹신 B, 설폰아마이드계로서 마페니드, 실버 설파다이아진, 설파살라진이며, 세포막 형성 억제제로서 테이코플라닌, 바시트라신, 노보비오신이고, 단백질 합성 억제제로서 클린다마이신, DNA 합성 저해제로서 노플록사신, 에녹사신, 페플록사신, 사이프로프록사신 및 오플록사신 등이 있으며 0.001mg~10mg/㎖ 농도로 사용할 수 있다. 그리고 다공성막의 형성원리는 이형성의 평판 위에 아텔로 콜라겐 분산액이 일정두께로 막을 형성하고 있는 상태에서 동결건조기에 넣으면 순간적으로 결빙되고 결빙상태에서 장시간 건조되면 수분만 제거되고 섬유상의 분산입자끼리 성글게 결합됨으로써 해면상의 다공성막이 형성되고, 콜라겐 경질막은 이형성의 평판 위에 아텔로 콜라겐 분산액이 일정두께로 막을 형성하고 있는 상태에서 치밀한 다공성의 흡착판으로 가압하면 수분이 침출되고 가압되어 섬유상의 콜라겐 입자끼리 밀착되어 조직이 치밀한 콜라겐 경질막이 형성된다.

또한, 콜라겐을 가교화시키기 위하여 사용되는 고농도의 알코올용액은 EDC를 용해시키는 용매로도 기능을 하지만 콜라겐의 카르복실기(COOH)와 에스터화 반응을 일으켜 콜라겐 표면에 양이온적 성질을 띠게 함으로써 음전하를 가진 혈소판이 빠르고 쉽게 결합할 수 있는 정착기능이 향상된다.

그밖에, 아텔로 콜라겐에 히알루론산을 첨가함으로써 조직이 약한 다공성막을 보강할 수 있고 콜라겐 섬유와 결합시 세포의 이동을 증가시키는 기능을 갖게 됨으로써 효능개선을 할 수 있다.

이상 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.

Claims

(a) 콜라겐 분산액을 일정한 두께로 확산시켜 일정 두께의 균일한 막을 형성한 후 이를 동결건조시켜 콜라겐 다공성층을 형성하는 단계와,
(b) 상기 (a) 단계와는 별개로 콜라겐 분산액을 일정한 두께로 확산시키고 다공성의 흡착판으로 압력을 가해서 수분은 침출시키고 콜라겐 입자들은 밀착시켜 조직이 치밀한 콜라겐 경질층을 형성하는 단계와,
(c) 상기 (b) 단계에서 형성된 콜라겐 경질층 상에 상기 (a) 단계에서 형성된 콜라겐 다공성층을 적층시키고 풍건하여 상기 콜라겐 경질층과 상기 콜라겐 다공성층을 1차적으로 결합시키는 단계와,
(d) 상기 (c) 단계를 통해 1차적으로 결합된 상기 콜라겐 경질층과 상기 콜라겐 다공성층을 가교화 수단을 이용하여 가교화시킴으로써 상기 콜라겐 경질층과 상기 콜라겐 다공성층을 2차적으로 결합시키는 단계를 포함하는 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법.
제1항에 있어서,
(e) 상기 가교화 수단이 가교화제인 경우 가교화제를 세정하는 단계를 더 포함하는 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법.
제2항에 있어서,
상기 (e) 단계에서 가교화제를 세정한 후 상기 콜라겐 경질층과 상기 콜라겐 다공성층의 이중층을 추가로 동결건조하는 것을 특징으로 하는 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 콜라겐 분산액은 아텔로 콜라겐 분산액이거나, 감염억제 아텔로 콜라겐분산액인 것을 특징으로 하는 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 동결건조는 -60℃~-80℃에서 1~2일간 수행되는 것을 특징으로 하는 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 (b) 단계에서 다공성의 흡착판으로 가해지는 압력은 1~20psi인 것을 특징으로 하는 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법.
제1항 내지 제3항에 있어서,
상기 가교화 수단은 가교화제인 EDC인 것을 특징으로 하는 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법.
제7항에 있어서,
상기 가교화 수단은 90~99wt%의 에탄올 용액에 EDC를 첨가한 후 교반하여 얻은 혼합용액인 것을 특징으로 하는 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 (a) 단계에서 사용되는 콜라겐 분산액에 히알루론산이 첨가되는 것을 특징으로 하는 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법.
제4항에 있어서,
상기 감염억제 아텔로 콜라겐 분산액은 테트라사이클린계 항생물질인 테트라사이클린, 독시사이클린, 오레오마이신, 페니실린계 항생물질인 페니실린V, 앰피실린, 아목시실린, 바캄피실린, 카베니실린, 클록사실린, 디클록사실린, 나프실린, 옥사실린, 세팔로스포린계 항생물질인 세팔렉신, 세프라딘, 세파드록실, 세파클로, 세프록심, 악세틸, 세프포독심, 로라카베프, 세픽심, 아미노글리코사이드계 항생물질인 겐타마이신 설페이트, 토브라마이신, 아미카신, 네틸리신, 네오마이신, 폴리믹신계 항생물질인 폴리믹신 B, 설폰아마이드계 항생물질인 마페니드, 실버 설파다이아진, 설파살라진, 세포막 형성 억제제인 테이코플라닌, 바시트라신, 노보비오신, 단백질 합성 억제제인 클린다마이신, DNA 합성 저해제인 노플록사신, 에녹사신, 페플록사신, 사이프로프록사신 및 오플록사신으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 항생제를 포함하는 것을 특징으로 하는 콜라겐 기반 매트릭스의 제조방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 정의된 제조방법으로 제조된 콜라겐 기반 매트릭스.