KR20100025825A - 에르고티오네인의 함량 증가를 위한 자흑색불로초 균사체 배양 배지 및 자흑색불로초 균사체 배양 방법 - Google Patents

에르고티오네인의 함량 증가를 위한 자흑색불로초 균사체 배양 배지 및 자흑색불로초 균사체 배양 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 에르고티오네인(ergothioneine)의 함량 증가를 위한 자흑색불로초 균사체 배양 배지 및 자흑색불로초 균사체 배양 방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 탄소원으로 글루코오스(glucose), 말토오스(maltose) 및 전분(starch)의 군으로 선택된 어느 하나 이상, 질소원으로 글루탐산(glutamic acid), 복합질소원으로 효모 추출물(yeast extract)을 포함하는 자흑색불로초 균사체 배양 배지 및 자흑색불로초 균사체를 상기의 자흑색불로초 균사체 배양 배지에 접종하고 배양하여 자흑색불로초 균사체에 함유된 에그로티오네인의 함량을 증가시킬 수 있는 자흑색불로초 균사체의 배양 방법에 관한 것이다.
자흑색불로초 균사체, 에르고티오네인(ergothioneine), 배지

Description

에르고티오네인의 함량 증가를 위한 자흑색불로초 균사체 배양 배지 및 자흑색불로초 균사체 배양 방법{Culture medium of Ganoderma neo-japonicum for increasing ergothioneine and culture method of Ganoderma neo-japonicum}
본 발명은 에르고티오네인(ergothioneine)의 함량 증가를 위한 자흑색불로초 균사체 배양 배지 및 자흑색불로초 균사체 배양 방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 탄소원으로 글루코오스(glucose), 말토오스(maltose) 및 전분(starch)의 군으로 선택된 어느 하나 이상, 질소원으로 글루탐산(glutamic acid), 복합질소원으로 효모 추출물(yeast extract)을 포함하는 자흑색불로초 균사체 배양 배지 및 자흑색불로초 균사체를 상기의 자흑색불로초 균사체 배양 배지에 접종하고 배양하여 자흑색불로초 균사체에 함유된 에르고티오네인의 함량을 증가시킬 수 있는 자흑색불로초 균사체의 배양 방법에 관한 것이다.
자흑색불로초는 불로초과(Polyporaceae)에 속하는 버섯으로 낙엽송 등 침엽수에서 발생하는 부후균의 일종이다.
이러한 자흑색불로초를 포함하는 불로초과 버섯은 우리나라를 비롯하여 세계적으로 분포되어 있으며, 우리나라, 중국 등에서 항암치료 등의 목적으로 전통적 민간요법 및 한약제로 사용되어왔다.
한편, 에르고티오네인(ergothioneine)은 항산화 기능물질로서 우리 인체에서 발견되는 물질이나 인간, 동물 및 고등식물 내에서는 생합성되지 못하여 외부로부터 흡수, 공급되어야만 하는 물질이다.
에르고티오네인은 인체에서 항산화 기능으로서 생체 내에서 항염증의 작용과 세포의 정상적인 대사기능에 중요한 역할을 하고 있으며, 더불어 알츠하이머병 예방 및 억제에 효과가 있다고 학계에 알려져 있다.
버섯 균사체로부터 에르고티오네인 생산은 버섯 자실체로부터 생산되는 량에 비해 매우 낮아 경제성이 매우 낮은 상태에 있었다.
특히, 자흑색불로초 균사체를 활용한 에르고티오네인의 생산에 관한 보고는 거의 전무한 상태에 있다.
이에 본 발명은 자흑색불로초에 함유된 에르코티오네인의 함량을 증가시킬 수 있는 배양 배지 및 배양 방법을 제공함으로써 인공적으로 자흑색불로초 균사체를 연중 안정적으로 대량생산하여 항산화 물질인 에르고티오네인을 경제적으로 다량생산할 수 있고 또한 에르고티오네인의 함량 증가에 따른 항산화 기능이 증진된 자흑색불로초 균사체를 제공하고자 한다.
본 발명은 에르고티오네인(ergothioneine)의 함량 증가를 위한 자흑색불로초 균사체 배양 배지 및 자흑색불로초 균사체 배양 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 탄소원으로 글루코오스(glucose), 말토오스(maltose) 및 전분(starch)의 군으로 선택된 어느 하나 이상, 질소원으로 글루탐산(glutamic acid), 복합질소원으로 효모 추출물(yeast extract)을 포함하는 자흑색불로초 균사체 배양 배지 및 자흑색불로초 균사체를 상기의 자흑색불로초 균사체 배양 배지에 접종하고 배양하여 자흑색불로초 균사체에 함유된 에르고티오네인(ergothioneine)의 함량을 증가시킬 수 있는 자흑색불로초 균사체의 배양 방법을 제공하고자 한다.
자흑색불로초의 자실체 및 균사체에는 에르고티오네인의 함량이 적었으나, 본 발명에 의해 에르고티오네인의 함량이 많은 자흑색불로초의 균사체를 얻을 수 있어, 이러한 자흑색불로초 균사체로부터 에르고티오네인(ergothioneine)의 생산량을 증가시킬 수 있음으로 자흑색불로초 재배농가의 수입증가에 기여할 수 있다.
한편, 자흑색불로초의 균사체 액체배양을 통하여 항산화제의 역할을 지니는 에르고티오네인을 보다 많이 얻을 수 있어, 에르고티오네인의 관련 산업의 발전에 도 기여할 수 있다.
본 발명은 자흑색불로초 균사체에 함유된 에르고티오네인(ergothioneine)의 함량을 증가시키기 위한 자흑색불로초 균사체 배양 배지를 나타낸다.
본 발명은 자흑색불로초 균사체에 함유된 에르고티오네인의 함량을 증가시키기 위해 탄소원으로 글루코오스(glucose), 말토오스(maltose) 및 전분(starch)의 군으로 선택된 어느 하나 이상, 질소원으로 글루탐산(glutamic acid), 복합질소원으로 효모 추출물(yeast extract)을 포함하는 자흑색불로초 균사체 배양 배지를 나타낸다.
상기에서 자흑색불로초 균사체 배양 배지는 pH가 4.0∼6.5인 자흑색불로초 균사체 배양 배지를 나타낸다.
상기에서 자흑색불로초 균사체 배양 배지는 배지 배양액 1리터(L) 당 글루코오스(glucose) 20∼25g, 효모 추출물(yeast extract) 0.5∼2g, 글루탐산(glutamic acid) 0.5∼1g, KH2PO4 1∼2g, MgSO4 0.1∼0.5g, Fe-EDTA 5ml-0.05∼0.1M, MnSO4 5ml-0.05∼0.1M를 포함하는 자흑색불로초 균사체 배양 배지를 나타낸다.
상기에서 자흑색불로초 균사체 배양 배지는 배지 배양액 1리터(L) 당 글루코오스(glucose) 25g, 효모 추출물(yeast extract) 2g, 글루탐산(glutamic acid) 1g, KH2PO4 2g, MgSO4 0.5g, Fe-EDTA 5ml-0.1M, MnSO4 5ml-0.1M를 포함하는 자흑색불로초 균사체 배양 배지를 나타낸다.
상기에서 자흑색불로초 균사체 배양 배지에 메티오닌(methionine), 시스테인(cysteine) 및 암모니움 타르트레이트(ammonium tartrate)의 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 추가로 더 포함하는 자흑색불로초 균사체 배양 배지를 나타낸다.
상기에서 자흑색불로초 균사체 배양 배지 배양액 1리터(L) 당 메티오닌(methionine) 2∼8mM, 시스테인(cysteine) 2∼8mM 및 암모니움 타르트레이트(ammonium tartrate) 0.5∼1.5g/L의 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 추가로 더 포함하는 자흑색불로초 균사체 배양 배지를 나타낸다.
상기에서 자흑색불로초 균사체 배양 배지 배양액 1리터(L) 당 메티오닌(methionine) 2mM, 시스테인(cysteine) 2mM 및 암모니움 타르트레이트(ammonium tartrate) 1g/L의 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 추가로 더 포함하는 자흑색불로초 균사체 배양 배지를 나타낸다.
본 발명은 자흑색불로초 균사체에 함유된 에르고티오네인(ergothioneine)의 함량을 증가시키는 자흑색불로초 균사체의 배양 방법을 나타낸다.
본 발명은 자흑색불로초 균사체를 상기에서 언급한 자흑색불로초 균사체 배양 배지에 접종하고 배양하여 자흑색불로초 균사체에 함유된 에르고티오네인(ergothioneine)의 함량을 증가시키는 자흑색불로초 균사체의 배양 방법을 나타낸다.
상기에서 자흑색불로초 균사체를 자흑색불로초 균사체 배양 배지 부피 대비 5∼10％로 접종하는 자흑색불로초 균사체의 배양 방법을 나타낸다.
상기에서 자흑색불로초 균사체를 자흑색불로초 균사체 배양 배지 부피 대비 5∼10％으로 자흑색불로초 균사체 배양 배지에 접종하고 10∼25℃에서 6∼12일 동안 배양하는 자흑색불로초 균사체의 배양 방법을 나타낸다.
상기에서 자흑색불로초 균사체 배양 배지에 메티오닌(methionine), 시스테인(cysteine) 및 암모니움 타르트레이트(ammonium tartrate)의 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 첨가한 후 자흑색불로초 균사체를 자흑색불로초 균사체 배양 배지 부피 대비 5∼10％으로 상기의 자흑색불로초 균사체 배양 배지에 접종하고 10∼25℃에서 6∼12일 동안 배양하는 자흑색불로초 균사체의 배양 방법을 나타낸다.
상기에서 자흑색불로초 균사체 배양 배지는 pH가 4.0∼6.5인 자흑색불로초 균사체 배양 배지를 나타낸다.
상기에서 자흑색불로초 균사체 배양 배지는 배지 배양액 1리터(L) 당 글루코오스(glucose) 20∼25g, 효모 추출물(yeast extract) 0.5∼2g, 글루탐산(glutamic acid) 0.5∼1g, KH2PO4 1∼2g, MgSO4 0.1∼0.5g, Fe-EDTA 5ml-0.05∼0.1M, MnSO4 5ml-0.05∼0.1M를 포함하는 자흑색불로초 균사체 배양 배지를 나타낸다.
상기에서 자흑색불로초 균사체 배양 배지는 배지 배양액 1리터(L) 당 글루코오스(glucose) 25g, 효모 추출물(yeast extract) 2g, 글루탐산(glutamic acid) 1g, KH2PO4 2g, MgSO4 0.5g, Fe-EDTA 5ml-0.1M, MnSO4 5ml-0.1M를 포함하는 자흑색불로초 균사체 배양 배지를 나타낸다.
상기에서 자흑색불로초 균사체 배양 배지에 메티오닌(methionine), 시스테인(cysteine) 및 암모니움 타르트레이트(ammonium tartrate)의 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 추가로 더 포함하는 자흑색불로초 균사체 배양 배지를 나타낸다.
상기에서 자흑색불로초 균사체 배양 배지 배양액 1리터(L) 당 메티오닌(methionine) 2∼8mM, 시스테인(cysteine) 2∼8mM 및 암모니움 타르트레이트(ammonium tartrate) 0.5∼1.5g/L의 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 추가로 더 포함하는 자흑색불로초 균사체 배양 배지를 나타낸다.
상기에서 자흑색불로초 균사체 배양 배지 배양액 1리터(L) 당 메티오닌(methionine) 2mM, 시스테인(cysteine) 2mM 및 암모니움 타르트레이트(ammonium tartrate) 1g/L의 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 추가로 더 포함하는 자흑색불로초 균사체 배양 배지를 나타낸다.
본 발명은 버섯 균사체로부터 에르고티오네인을 생산하는 방법을 포함한다.
본 발명은 버섯 균사체로부터 에르고티오네인을 생산하는 방법에 있어서, 메티오닌(methionine), 시스테인(cysteine) 및 암모니움 타르트레이트(ammonium tartrate)의 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 하기의 (1) 내지 (4) 중에서 선택된 어느 하나 의 자흑색불로초 균사체 배양 배지에 첨가한 후 상기 배양배지에 버섯 균사체를 접종하고 배양하는 단계를 포함한다.
상기에서 버섯 균사체는 자흑색불로초 균사체, 잔나비불로초 균사체, 눈꽃동충하초 균사체, 잣버섯 균차령, 저령 균사체, 송이버섯 균사체, 꽃송이버섯 균사 체, 뽕나무버섯 균사체, 표고버섯 균사체 중에서 선택된 어느 하나를 사용할 수 있다.
상기에서 버섯 균사체는 자흑색불로초 균사체, 잔나비불로초 균사체, 눈꽃동충하초 균사체, 잣버섯 균차령, 저령 균사체, 송이버섯 균사체, 꽃송이버섯 균사체, 뽕나무버섯 균사체, 표고버섯 균사체 중에서 선택된 어느 하나를 상기 배양배지 부피 대비 5∼10％으로 배양 배지에 접종하고 10∼25℃에서 6∼12일 동안 배양할 수 있다.
(1)탄소원으로 글루코오스(glucose), 말토오스(maltose) 및 전분(starch)의 군으로 선택된 어느 하나 이상, 질소원으로 글루탐산(glutamic acid), 복합질소원으로 효모 추출물(yeast extract)을 포함하는 자흑색불로초 균사체 배양 배지.
(2)pH가 4.0∼6.5인 자흑색불로초 균사체 배양 배지.
(3)배지 배양액 1리터(L) 당 글루코오스(glucose) 20∼25g, 효모 추출물(yeast extract) 0.5∼2g, 글루탐산(glutamic acid) 0.5∼1g, KH2PO4 1∼2g, MgSO4 0.1∼0.5g, Fe-EDTA 5ml-0.05∼0.1M, MnSO4 5ml-0.05∼0.1M를 포함하는 자흑색불로초 균사체 배양 배지.
(4)배지 배양액 1리터(L) 당 글루코오스(glucose) 25g, 효모 추출물(yeast extract) 2g, 글루탐산(glutamic acid) 1g, KH2PO4 2g, MgSO4 0.5g, Fe-EDTA 5ml-0.1M, MnSO4 5ml-0.1M를 포함하는 자흑색불로초 균사체 배양 배지.
본 발명의 자흑색불로초 균사체에 함유된 에그로티오네인의 함량을 증가시키는 자흑색불로초 균사체 배양 배지, 자흑색불로초 균사체에 함유된 에그로티오네인의 함량을 증가시키는 자흑색불로초 균사체의 배양 방법 및 버섯 균사체로부터 에르고티오네인을 생산하는 방법에 대해 조사한바, 본 발명의 목적을 달성하기 위해서는 상기에서 언급한 조건의 자흑색불로초 균사체 배양 배지, 자흑색불로초 균사체의 배양 방법 및 버섯 균사체로부터 에르고티오네인을 생산하는 방법을 제공하는 것이 바람직하다.
이하 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 자흑색불로초 균사체 조제
자흑색불로초 균사체는 서울 홍릉 국립산림과학원내에서 채취한 자흑색불로초(도 1 참조)로부터 무균적으로 조직을 떼어내어 PDA배지에 순수분리 배양한 것을 이용하였다. 최초 액체 배양용 재료로 사용하기위해 PDA 고체배지에 배양중인 자흑색불로초 균사체를 무균적으로 잘게 짤라 250ml의 삼각플라스크에 넣고, PDB 배지를 첨가하여, 100rpm으로 15일간 진탕배양하여 액체배양용 자흑색불로초 균사체를 얻었다.
<실시예 2> 액체배양용 배지조성 및 배양조건
자흑색불로초 균사체의 액체배양에 적합한 배지를 파악하기 위해 삼각플라스크에 Czapeck 배지(배양액 1L당 sucrose 30g, NaNO3 3g, MGSO4·7H2O 0.5g, KCl 0.5g, KH2PO4 1g, FeSO4·7H2O 0.5g 함유), PDB 배지(배양액 1L당 potato extract 4g, glucose 20g 함유), CDY 배지(배양액 1L당 glucose 30g, yeast extract 5g, NaNO3 3g, MGSO4·7H2O 0.5g, KCl 0.5g, KH2PO4 1g, FeSO4·7H2O 0.01g, NaCl 0.5g 함유), YMM 배지(배양액 1L당 glucose 20g, yeast extract 1.5g, soytone 1.5g, KH2PO4 1g, MgSO4 0.5g, FeSO4·7H2O 0.5g 함유), GYS 배지(배양액 1L당 glucose 10g, yeast extract 5g, peptone 3g, malt extract 3g 함유), MMN 배지(배양액 1L당 glucose 10g, malt extract 3g, (NH4)2HPO4 0.25g, KH2PO4 1g, MgSO47H2O 0.5g, CaCl2 0.05g, FeCl3 0.2mg, NaCl 0.025g, thiamine-HCl 100ug 함유) 및 FGM 배지(배양액 1L당 glucose 25g, yeast extract 2g, glutamic acid 1g, KH2PO4 2g, MgSO4 0.5g, 5ml-0.1M Fe-EDTA, 5ml-0.1M MnSO4 함유)를 각각 넣은 후 상기 실시예 1에서 얻은 액체배양용 자흑색불로초 균사체를 각각의 배지 배양액의 부피 대비 3％로 각각의 배지에 접종하고 25℃에서 10일 동안 배양하였다.
상기에서 각각의 배지 pH는 4.5가 되도록 하였다.
각각의 배지에서 배양한 자흑색불로초 균사체의 건중(g/L)을 측정하고 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서처럼 자흑색불로초 균사체의 액체배양에 적합한 배지는 GYS 배지, YMM 배지 및 FGM배지로서 이중에서 자흑색불로초 균사체의 건중(g/L)은 GYS 배지가 가장 우수하였으나, 삼각플라스크 수준에서의 접종원으로 사용하기위한 액체배양용 적정 배지조성은 FGM 배지였다.
<실시예 3> 자흑색불로초 균사체 액체배양에 의한 에르고티오네인 함량 증진
(1) 버섯 균사체의 에르고티오네인 함량 분석방법
자흑색불로초 균사체의 에르고티오네인(ergothioneine) 함량을 증진시키기 위한 다양한 처리에 따른 균사체내의 에르고티오네인 함량은 두보스트(Dubost) 등의 방법으로 정량하였다. 즉, 시료 0.2g에 20ml의 cold 70％-ethanolic extraction 용액(10mM diethiothreitol, 100μM 베타인(betaine), 100μM 2-mercapto-1-methyl imidazole 함유)을 첨가, 교반 후 3분간 초음파 처리(sonicate) 후 여기에 1.0％-sodium dodecylsulfate 함유 에탄올 용액 4ml를 첨가하여 혼합 후, 원심분리 하였다. 그런 다음 상등액 10ml을 취해 농축 건조하고 여기에 10ml의 증류수를 첨가하여 녹인 후 원심분리하여 상등액을 에르고티오네인 함량 분석용으로 사용하였다.
에르고티오네인 정량은 Econosphere C18 column (4.6ㅧ250mm, 5um; Alltech Associates, IL. USA)을 장착한 HPLC(Thermo Electron C, Finnigan Surveyor System, Massachusetts USA)를 사용하였다. 이동상은 50mM-sodium phosphate with 3％ acetonitrile(0.1％ 트리에틸아민(triethylamine)으로 pH 7.3으로 조절)를 유속(flow rate)은 0.7ml/min로 하여 UV(ultraviolet - visible) 검출기 254nm에서 측정하였다.
(2)버섯 균사체 종류별에 따른 에르고티오네인 함량
하기 표 1에 기재된 액체배양된 다양한 버섯의 균사체를 실시예 2에 기재된 FGM 배지에 배지 배양액의 부피 대비 5％로 접종한 후 25℃에서 10일 동안 배양하였다.
각각의 버섯 균사체로부터 상기 (1)에서 언급한 방법에 의해 에르고티오네인(ergothioneine) 함량을 분석하고 그 결과를 아래의 표 1에 나타내었다.
표 1에서와 같이 자흑색불로초 및 잔나비불로초 같은 영지버섯류에서 에르고티오네인의 함량이 높았으나, 표고, 송이 등과 같은 일반 식용버섯류에서는 에르고티오네인의 함량이 다소 낮음을 알 수 있었다.
표 1. 버섯 균사체 종류별 에르고티오네인 함량
버섯종류 ergothioneine 함량(ug/g DW)
자흑색불로초 715±106*
잔나비불로초 692±21
눈꽃동충하초 334±45
표고 494±11
송이 366±96
꽃송이 418±40
뽕나무버섯 411±50
잣버섯 340±14
* 표 1에 기재된 액체배양된 다양한 버섯의 균사체는 각각의 버섯 균사체를 실시예 1에 기재된 방법을 이용하여 얻은 것을 사용하였다.
(3)자흑색불로초 균사체의 액체배양배지 처리조건에 의한 에르고티오네인 생 산 증진
자흑색불로초 균사체를 대상으로 에르고티오네인(ergothioneine) 생산성을 높이고자 실시예 2의 FGM 배지를 기본으로 하여 9종의 각 아미노산을 8mM로 배양배지에 처리하였다. 표 2에서와 같이 아미노산 종류별에 따라 자흑색불로초의 에르고티오네인 생산량은 다른 것으로 나타났다.
표 2. 배양배지내 아미노산 종류별에 따른 에르고티오네인 생산량
아미노산 종류 ergothioneine 함량 (ug/g 건중) 균사체 생산량 (g 건중/ℓ) 전체 ergothioneine 함량 (ug/ℓ)
무처리 746.8 ± 105.0* 8.8 ± 0.2 6573 ± 657
Asp 528.6 ± 49.4 8.3 ± 1.1 5326 ± 686
Ser 478.6 ± 46.8 8.7 ± 0.2 4186 ± 491
Cys 1199.4 ± 158.5 8.4 ± 0.1 10169 ± 1192
Lys 908.4 ± 12.2 9.8 ± 0.4 8956 ± 511
Met 2231.1 ± 54.8 5.9 ± 0.3 13054 ± 386
His 792.6 ± 114.3 4.5 ± 0.0 3589 ± 501
Leu 536.1 ± 20.7 9.5 ± 0.5 5096 ± 96
Pro 456.4 ± 81.6 8.6 ± 0.4 3941 ± 544
Arg 187.2 ± 26.1 8.2 ± 0.0 1532 ± 206
Gly 464.7 ± 130.3 8.8 ± 0.6 4066± 858
* : 평균 ± 표준오차
상기 표 2에서처럼 단위 균사체당 에르고티오네인 함량은 메티오닌(methionine)(2,231ug/g)>시스테인(cysteine)(1,199ug/g)>히스티딘(histidine)(793ug/g)순으로 아미노산 무처리(747ug/g)보다 높은 것으로 나타나 메티오닌, 시스테인 및 히스티딘의 3종류 아미노산이 에르고티오네인 생산 증진에 영향을 주고 있는 것으로 나타났다. 또한 배양배지 1리터당 생산량도 메티오닌(13,054ug/ℓ) 및 시스테인 (10,169ug/ℓ)처리에서 아미노산 무처리(6,573ug/ℓ) 보다 높게 생산되었다. 이러한 결과로부터 FGM 배지를 기본 배지로한 조건에서 메티오닌 및 시스테인 이 에르고티오네인 생산 증진에 주요한 인자인 것으로 조사되었다.
자흑색불로초 균사체의 에르고티오네인의 생산 증진을 위해 배양배지내의 적정 메티오닌(methionine) 첨가량을 구명하였다. 하기 표 3에서와 같이 배양배지내에서 메티오닌의 처리농도가 증가 할수록 균사체내의 에르고티오네인량도 증가하였으나 4∼8 mM 사이부터는 그 증가폭이 급격히 감소하였다. 또한 균사체 생산량도 4mM 처리부터는 감소하기 시작하였다. 배양액 리터당 생산량도 메티오닌 처리농도가 증가할수록 증가하였으나 4mM 이후부터는 증가량이 감소하였다. 자흑색불로초균사체로부터 에르고티오네인의 생산을 위한 적정한 methionine 처리 농도는 2∼8mM인 것으로 나타났다.
표 3. 배양배지내 메치오닌 처리 농도별에 따른 ergothioneine 생산량
메치오닌 처리농도(mM) ergothioneine 함량 (ug/g 건중) 균사체 생산량 (g 건중/ℓ) 전체 ergothioneine 함량(ug/ℓ)
0 715.1 ± 51.9* 8.8 ± 0.2 6313 ± 577
0.5 927.8 ± 147.7 8.5 ± 0.8 7981 ± 1996
1.0 1030.2 ± 237.4 9.0 ± 0.4 9265 ± 1827
4.0 1991.6 ± 324.5 7.5 ± 0.1 14907 ± 2467
8.0 2343.3 ± 315.4 6.9 ± 0.1 15949 ± 341
12.0 2306.4 ± 343.9 7.1 ± 0.5 16234 ± 856
16.0 2553.0 ± 106.0 6.5 ± 0.5 16651 ± 618
표 4는 메티오닌 첨가배지에서 자흑색불로초의 배양기간에 따른 에르고티오네인 생산량 변화를 나타낸 것이다. 배양기간이 길수록 자흑색불로초 균사체의 에르고티오네인 생산량은 증가하였으나 10일을 정점으로 감소였다. 균사체의 생산량도 배양 10일까지 증가하였고 10일 이후부터는 생육 정체기에 이르는 것으로 나타 났다. 자흑색불로초의 에르고티오네인 생산은 생장이 활발한 시기에 증가하여 생육 정체기 이후에 감소하기 시작함으로 생육 정체기 바로 전후에 수확하는 것이 적정한 시기인 것으로 추정되었다.
표 4. 배양일자별에 따른 에르고티오네인 생산량
배양일자(일) ergothioneine 함량 (ug/g 건중) 균사체 생산량 (g 건중/ℓ) 전체 ergothioneine 함량 (ug/ℓ)
2 518.4 ± 144.5* 2.3 ± 0.1 1168 ± 250
4 1294.5 ± 118.4 4.6 ± 0.3 5976 ± 869
6 1337.5 ± 16.0 6.3 ± 0.1 8408 ± 117
8 1812.6 ± 277.2 6.5 ± 0.3 11712 ± 1432
10 1940.4 ± 200.0 8.3 ± 0.6 16280 ± 983
12 1454.0 ± 569.0 8.1 ± 1.1 11727 ± 4501
자흑색불로초 균사체의 배양 배지내에서 복합질소원인 이스트 추출물(yeast extract) 농도별에 따른 에르고티오네인 생산량을 도 3에 나타내었다.
이스트 추출물 무처리(0g/L)에서는 에르고티오네인 생산량이 2,802ug/ℓ이었으나 1g/L 처리에서는 17,141ug/ℓ로 5배 이상 증가하였다. 그러나 복합질소원의 농도가 3g/L 이상으로 증가할수록 균사체 g당 에르고티오네인 함량이 감소하여 7g/L의 이스트 추출물 처리에서는 6,310 ug/ℓ로 1g/L 처리군 보다 매우 낮게 생산되었다. 따라서 자흑색불로초 균사체의 배양 배지내에서 자흑색불로초 균사체의 에르고티오네인을 생산하기 위한 적정한 이스트 추출물(yeast extract) 처리농도는 0.5∼2g/L임을 알 수 있었다.
한편 이스트 추출물(Yeast extract)과 암모니움 타르트레이트(ammonium tartrate)를 배지에 병행 첨가하고 메티오닌(methionine)을 더불어 처리했을 경우 에르고티오네인 생산량은 더욱 증가하였다(표 5 참조).
표 5. 메티오닌을 포함하는 배양 배지내 질소원 종류에 따른 에르고티오네인 생산량
질소원 ergothioneine 함량 (ug/g 건중) 균사체 생산량 (g 건중/ℓ) 전체 ergothioneine 함량 (ug/ℓ)
Yeast extract 1940 ± 200 8.3 ± 0.6 16280 ± 983
Peptone 1378 ± 261 3.4 ± 0.6 4401 ± 442
Soytone 3540 ± 154 4.6 ± 0.2 16196 ± 1378
Maltose 1371 ± 250 3.4 ± 0.1 4543 ± 812
Amonium tartrate 2665 ± 303 2.7 ± 1.0 16280 ± 983
Yeast extract+ Amonium tartrate 2231 ± 167 10.0 ± 1.0 22409 ± 676
(4)버섯 균사체 종류별 메티오닌 첨가 배양에 의한 에르고티오네인 생산 효과
여러 버섯 균사체 액체배양시 메티오닌 첨가에 따른 에르고티오네인(ergothioneine) 생산 증진효과가 있는지 구명하기 위해 메티오닌 무첨가의 경우와 비교하였다. FGM 배지를 기본 배지에 메티오닌 8 mM을 첨가하여 여러종류의 균사체를 배양한 결과 송이버섯(Tricholoma matsutake)균사체를 제외한 모든 균사체에서 무처리에 비해 methionine 처리에 따라 균사체 건중 당 높은 에르고티오네인 생산량을 보였다. 자흑색불로초, 저령(Grifola umbellata), 잣버섯(Lentinus lepideus) 및 꽃송이버섯(Sparassis crispa)에서는 무처리에 비해 2배 이상 높은 에르고티오네인 생산량을 나타냈다(도 4 참조). 이러한 결과로 일부 버섯 균사체의 액체 배양시 메티오닌 처리에 의해서 균사체내 에르고티오네인 함량이 증가함을 확인하였다.
<실시예 4> 생물반응기를 이용한 에르고티오네인 생산 방법 및 생산 균사체의 항산화능 증진 효과
도 5의 공기부양식 생물반응기를 사용하여 FGM 배지조성을 기본으로 하고 조성중 이스트 추출물 농도는 0.5g/L∼1g/L로, 암모니움 타르트레이트(ammonium tartrate) 1g/L 및 메티오닌은 0∼4mM로 처리하여 자흑색불로초 균사체를 배양하였다. 공기 공급량은 0.075±0.025vvm으로, 초기 균사체 접종량을 5％(v/v)로 10일간 균사체를 배양하였다. 이러한 배양조건에서 생물반응기를 이용한 에르고티오네인(ergothioneine) 생산량은 배양액 1리터당 50mg이상을 생산할 수 있었다(표 6 참조).
표 6. 생물반응기를 이용한 ergothioneine 생산량
처리 농도 균사체 량 (g 건중/L) Ergthionine 함량
Methionine (mM) Yeast extract (g/L) mg/g mg/L
4 0.5 6.73 3.43±0.22 57.51±4.03
4 1 8.48 2.43±0.03 52.07±0.81
0 1 9.02 1.33±0.18 30.31±1.19
또한 상기의 조건으로 공기부양식 생물반응기에서 생산된 균사체의 폴리페놀 함량과 항산화능을 분석한 결과 메티오닌 무처리 배양균사체 보다 메티오닌 처리에 의해 폴리페놀함량도 증가가 되었고, 또한 항산화능도 증가하였다(표 7 참조).
표 7. 배양된 자흑색불로초 균사체의 폴리페놀 및 DPPH (2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl-hydrate) 라디칼 소거능
처리농도 폴리페놀함량 (ug/g) EC50 a (ug/ml)
Methionine (mM) Yeast extract (g/L)
4 0.5 5160±103 6690±37
4 1 5070±156 8160±473
0 1 3670±168 11970±407
a : EC50 (mg/ml): 50％의 DPPH 라디칼을 소거할 수 있는 유효 농도
상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시 예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
본 발명에 의해 자흑색불로초 균사체로부터 높은 수율의 에르고티오네인(ergothioneine)을 얻을 수 있어 제약원료로서 에르고티오네인 생산과 에르고티오네인 함량증진과 더불어 항산화 기능이 향상된 균사체가 생산됨으로 기능성 음료, 식품 및 화장품 등의 첨가제로 이용할 원료의 공급이 가능하다.
도 1은 본 발명의 시료인 균사체로 사용한 자흑색불로초를 나타낸 사진이다.
도 2는 배지 종류별 자흑색불로초 균사체의 생장량을 나타낸 그래프이다.
도 3는 배양배지내 이스트 추출물(yeast extract) 농도별 에르고티오네인(ergothioneine) 생산량이다.
도 4는 버섯 균사체 종류별 메티오닌 첨가 액체배양에 의한 에르고티오네인(ergothioneine) 생산 효과를 나타낸 그래프로서, 그래프 중에서 Con.은 메티오닌을 첨가하지 않은 배양액, Methionine은 메티오닌을 첨가한 배양액에 의한 에르고티오네인 생산 효과를 나타낸 그래프이고, 이때 도 4에서 G. J:자흑색불로초(Ganoderma neo-japonicum); G. P:잔나비불로초(Ganoderma applanatum); I. J:눈꽃동충하초(Isaria japonica); L. L:잣버섯(Lentinus lepideus); G. U:저령(Grifola umbellata); T. M:송이버섯(Tricholoma matsutake); S. C::꽃송이버섯(Sparassis crispa); A. T:뽕나무버섯(Armillariella tabescens); L. E:표고버섯(Lentinus edodes) 이다.
도 5는 공기부양식 생물반응기에서 자흑색불로초 균사체 배양 광경을 나타낸 사진이다.

Claims (11)

  1. 자흑색불로초 균사체에 함유된 에르고티오네인(ergothioneine)의 함량을 증가시키기 위해 탄소원으로 글루코오스(glucose), 말토오스(maltose) 및 전분(starch)의 군으로 선택된 어느 하나 이상, 질소원으로 글루탐산(glutamic acid), 복합질소원으로 효모 추출물(yeast extract)을 포함하는 자흑색불로초 균사체 배양 배지.
  2. 제1항에 있어서, 자흑색불로초 균사체 배양 배지는 pH가 4.0∼6.5인 자흑색불로초 균사체 배양 배지.
  3. 제1항에 있어서, 자흑색불로초 균사체 배양 배지는 배지 배양액 1리터(L) 당 글루코오스(glucose) 20∼25g, 효모 추출물(yeast extract) 0.5∼2g, 글루탐산(glutamic acid) 0.5∼1g, KH2PO4 1∼2g, MgSO4 0.1∼0.5g, Fe-EDTA 5ml-0.05∼0.1M, MnSO4 5ml-0.05∼0.1M를 포함하는 자흑색불로초 균사체 배양 배지.
  4. 제1항에 있어서, 자흑색불로초 균사체 배양 배지는 배지 배양액 1리터(L) 당 글루코오스(glucose) 25g, 효모 추출물(yeast extract) 2g, 글루탐산(glutamic acid) 1g, KH2PO4 2g, MgSO4 0.5g, Fe-EDTA 5ml-0.1M, MnSO4 5ml-0.1M를 포함하는 자 흑색불로초 균사체 배양 배지.
  5. 제1항에 있어서, 자흑색불로초 균사체 배양배지에 메티오닌(methionine), 시스테인(cysteine) 및 암모니움 타르트레이트(ammonium tartrate)의 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 추가로 더 포함하는 자흑색불로초 균사체 배양 배지.
  6. 자흑색불로초 균사체를 청구항 제1항 내지 제5항 중 선택된 어느 한 항의 자흑색불로초 균사체 배양 배지에 접종하고 배양하여 자흑색불로초 균사체에 함유된 에르고티오네인(ergothioneine)의 함량을 증가시키는 자흑색불로초 균사체의 배양 방법.
  7. 제6항에 있어서, 자흑색불로초 균사체를 자흑색불로초 균사체 배양 배지 부피 대비 5∼10％로 접종하는 자흑색불로초 균사체의 배양 방법.
  8. 제6항에 있어서, 자흑색불로초 균사체를 자흑색불로초 균사체 배양 배지 부피 대비 5∼10％으로 자흑색불로초 균사체 배양 배지에 접종하고 10∼25℃에서 6∼12일 동안 배양하는 자흑색불로초 균사체의 배양 방법.
  9. 제6항에 있어서, 자흑색불로초 균사체 배양 배지에 메티오닌(methionine), 시스테인(cysteine) 및 암모니움 타르트레이트(ammonium tartrate)의 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 첨가한 후 자흑색불로초 균사체를 자흑색불로초 균사체 배양 배지 부피 대비 5∼10％으로 상기의 자흑색불로초 균사체 배양 배지에 접종하고 10∼25℃에서 6∼12일 동안 배양하는 자흑색불로초 균사체의 배양 방법.
  10. 버섯 균사체로부터 에르고티오네인을 생산하는 방법에 있어서,
    메티오닌(methionine), 시스테인(cysteine) 및 암모니움 타르트레이트(ammonium tartrate)의 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 청구항 제1항 내지 제4항 중 선택된 어느 한 항의 자흑색불로초 균사체 배양 배지에 첨가한 후 상기 배양배지에 버섯 균사체를 접종하고 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 버섯 균사체로부터의 에르고티오네인을 생산하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 버섯 균사체는 자흑색불로초 균사체, 잔나비불로초 균사체, 눈꽃동충하초 균사체, 잣버섯 균차령, 저령 균사체, 송이버섯 균사체, 꽃송이버섯 균사체, 뽕나무버섯 균사체, 표고버섯 균사체 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 버섯 균사체로부터의 에르고티오네인을 생산하는 방법.
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