KR20100016543A - 영상화를 위한 표지된 ｈｇｆ 결합성 펩티드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생체내 광학 영상화에 적합한 표지된 cMet 결합성 펩티드에 관한 것이다. 이러한 펩티드는 적색 내지 근적외선 영역에서 영상화하는 데에 적합한 광학 리포터 기로 표지화된다. 또한, 본원에는 특히 결장직장암 (CRC)의 탐지, 병기 분류, 진단, 질병 진행 모니터링 또는 치료 모니터링에 사용하기 위한 생체내 영상화 방법 뿐만 아니라 제약 조성물 및 키트가 기재되어 있다.
표지된 cMet 결합성 펩티드, 결장직장암 (CRC)의 진단, 광학 리포터 기, 펩티드 조영제, 생체내 광학 영상화 방법

Description

영상화를 위한 표지된 ＨＧＦ 결합성 펩티드 {Labelled HGF binding peptides for imaging}
본 발명은 생체내 광학 영상화에 적합한 표지된 cMet 결합성 펩티드에 관한 것이다. 이러한 펩티드는 적색 내지 근적외선 영역에서 영상화하는 데에 적합한 광학 리포터 기로 표지시킨다. 또한, 본원에는 특히 결장직장암 (CRC)을 진단하는 데에 사용하기 위한 생체내 영상화 방법이 기재되어 있다.
WO 2005/030266에는 결장직장암 (CRC)을 조기 진단하는 것에 관한 의학적 필요성이 있다고 기재되어 있다. WO 2005/030266에는 CRC에서 비정상적으로 발현된 생물학적 표적에 대한 친화성을 가진 광학 영상화 조영제가 기재되어 있다. 생물학적 표적은 COX-2, 베타-카테닌, E-캐드헤린 (cadherin), P-캐드헤린, 각종 키나제, Her-2, 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP), 사이클린, P53, 티미딜레이트 신타제, VEGF 수용체, EGF 수용체, K-ras, 선종성 결장 폴립증 단백질, 카텝신 B. uPAR, cMet, 뮤린 및 가스트린 수용체 중에서 선택된다. 이러한 표적 중의 바람직한 것은 cMet, MMP-14, COX-2, 베타-카테닌 및 카텝신 B라고 언급되어 있다 (p 7, lines 11-12). WO 2005/030266의 벡터는 펩티드, 펩토이드 (peptoid) 부분, 올리고뉴클레오티드, 올리고당류, 지질 관련 화합물 또는 전통적인 유기 약물-유사 소 분자일 수 있다. 리포터 부분은 바람직하게는 전자기 스펙트럼의 자외선 부분에서부터 적외선 부분까지의 파장 영역 내의 빛과 상호 작용하는 염료이다.
산란 인자 (SF)로서 공지되기도 한 간 세포 성자 인자 (HGF)는 각종 생리학적 과정, 예를 들어 상처 치유 및 혈관형성 (angiogenesis)에 관여하는 성장 인자이다. HGF가 그의 고 친화성 수용체 (cMet)와 상호 작용하는 것은 종양 성장, 침입 및 전이에 밀접한 영향을 미친다.
문헌 [참고: Knudsen et al., Adv. Cancer Res., 91, 31-67 (2004)]에서는 전립선 암에 있어서의 HGF 및 cMet의 역할이 고찰되었는데, 이는 영상화 및 요법에 밀접한 영향을 미칠 수 있다. 진단 및 요법을 위한 표지된 항-met 항체가 WO 03/057155에 기재되어 있다.
WO 2004/078778에는 cMet와 결합하거나 또는 cMet와 HGF를 포함하는 복합체와 결합하는 다량체성 펩티드 구조물 또는 폴리펩티드가 기재되어 있다. 대략 10가지 상이한 구조적 부류의 펩티드가 기재되어 있다. WO 2004/078778에는 시험관내 및 생체내 적용하는 경우에는 펩티드를 탐지 가능한 표지로 표지시킬 수 있거나, 또는 치료적으로 적용하는 경우에는 펩티드를 약물로 표지시킬 수 있다고 기재되어 있다. 이러한 탐지 가능한 표지는 효소, 형광성 화합물, 광학 염료, 상자성 금속 이온, 초음파 조영제 또는 방사성핵종일 수 있다. WO 2004/078778의 바람직한 표지는 방사성 또는 상자성일 수 있고, 가장 바람직하게는 금속 킬레이터에 의해 킬레이트되는 금속을 포함한다고 한다.
발명의 요약
본 발명은 녹색 내지 근적외선 파장 500 내지 1200 nm의 빛을 이용하여 포유류 신체를 생체내 광학 영상화하는데 적합한 광학 리포터 영상화 부분, 및 cMet 결합성 사이클릭 펩티드를 포함하는, 생체내 광학 영상화에 적합한 조영제를 제공한다. cMet 결합성 사이클릭 펩티드는 WO 2004/078778의 구조적 펩티드 부류 중의 하나와 관계가 있고, cMet에 대한 최적의 결합 친화성을 지니고 있다. 이들 펩티드는 WO 2004/078778에 기재된 바와 같이, 파아지 디스플레이 (phage display)로부터 유래되고, cMet에 대한 그들의 친화성과 HGF와의 경쟁 결여로써 선별되었다. 본 발명의 cMet 결합성 펩티드는 바람직하게는 대사 억제성 기 (MIG)에 의해 보호된 그들의 말단 중의 하나 이상을 갖는다. 이는 생체내 적용시 중요하게 고려되는 사항인데, 그렇치 않으면 내인성 효소 및 펩티다제가 펩티드를 신속하게 대사시켜, 결과적으로 cMet 결합 친화성이 상실되어 생체 내에서 선택적 표적화를 할 수 없게 된다.
본 발명은 cMet 결합성 펩티드를 생체 내에서 사용하는 가장 우수한 방법이 기타 영상화 양식 (예: 핵, MRI 또는 초음파)과는 달리 광학 리포터를 사용하는 것을 포함하고, 또한 바람직한 광학 영상화 리포터를 제공하는 것이라고 교시되어 있다. 녹색 내지 근적외선 영역 (파장 500-1200 nm의 빛)이 바람직한데, 이는 이러한 영역이 내인성 조직 및 물질, 예를 들어 해모글로빈, 포르피린, 멜라닌, 및 콜라겐과 중복되는 최소 스펙트럼을 갖고 있기 때문이다 [참고: Licha, Topics Curr. Chem., 222, 1-29 (2002)]. 자가형광에 대한 기타 중요한 기여인자는 NADH, FAD 및 엘라스틴이다.
제1 국면에서, 본 발명은 하기 화학식 I의 접합체를 포함하는 조영제를 제공한다:
Figure 112009069850449-PCT00001
상기 식에서,
Z1은 cMBP의 N-말단에 부착되고, H 또는 MIG이며;
Z2는 cMBP의 C-말단에 부착되고, OH, OBc, 또는 MIG (여기서, Bc는 생체적합성 양이온이다)이며;
cMBP는 아미노산 서열 (서열 1):
Cysa-X1-Cysc-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cysd-Typ-Cysb-Tyr-X4-X5-X6
[여기서, X1은 Asn, His 또는 Tyr이고;
X2는 Gly, Ser, Thr 또는 Asn이며;
X3은 Thr 또는 Arg이고;
X4는 Ala, Asp, Glu, Gly 또는 Ser이며;
X5는 Ser 또는 Thr이고;
X6은 Asp 또는 Glu이며;
Cysa-d는 각각 시스테인 잔기여서 잔기 a 및 b 뿐만 아니라 c 및 d가 고리화되어 2개의 별개의 디설파이드 결합을 형성한다]
을 포함하는 17 내지 30개 아미노산의 cMet 결합성 사이클릭 펩티드이고;
MIG는 cMBP 펩티드의 생체내 대사를 억제하거나 저해하는 생체적합성 기인 대사 억제성 기이며;
L은 화학식 -(A)m-의 합성 링커 기 [여기서, A는 각각 독립적으로 -CR2-, -CR=CR-, -C≡C-, -CR2CO2-, -CO2CR2-, -NRCO-, -CONR-, -NR(C=O)NR-, -NR(C=S)NR-, -SO2NR-, -NRSO2-, -CR2OCR2-, -CR2SCR2-, -CR2NRCR2-, C4-8 시클로헤테로알킬렌 기, C4-8 시클로알킬렌 기, C5-12 아릴렌 기, 또는 C3-12 헤테로아릴렌 기, 아미노산, 당 또는 단분산 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 빌딩 블록이고;
R은 각각 독립적으로 H, C1-4 알킬, C2-4 알케닐, C2-4 알키닐, C1-4 알콕시알킬 또는 C1-4 히드록시알킬 중에서 선택되며;
m은 1 내지 20의 정수이다]이고;
n은 0 또는 1의 정수이며;
IM은 녹색 내지 근적외선 파장 600 내지 1200 nm의 빛을 이용하여 포유류 신체를 생체내 영상화하는데 적합한 광학 리포터 영상화 부분이다.
용어 "조영제"는 포유류 신체를 생체내 영상화하는데 적합한 화합물을 의미한다. 바람직하게는, 포유류가 인간이다. 영상화는 침입성 (예를 들어, 내부-수술 또는 내시경) 또는 비-침입성일 수 있다. 바람직한 영상화 방법은 내시경이다. 화학식 I의 접합체가 생체내 영상화에 적합하긴 하지만, 이를 시험관내 적용 (예를 들어, 생물학적 샘플 중에서 cMet를 정량화하거나 또는 조직 샘플 중에서 cMet를 가시화하는 검정)에서도 사용할 수 있다. 바람직하게는, 조영제를 생체내 영상화에 사용한다.
Z1 기는 마지막 아미노산 잔기의 아민 기를 대체한다. 따라서, Z1이 H인 경우에는, cMBP의 아미노 말단이 마지막 아미노산 잔기의 자유 NH2 기에서 종결된다. Z2 기는 마지막 아미노산 잔기의 카르보닐 기를 대체한다. 따라서, Z2가 OH인 경우에는, cMBP의 카르복시 말단이 마지막 아미노산 잔기의 자유 CO2H 기에서 종결되고, Z2가 OBc인 경우에는 말단 카르복시 기가 CO2Bc 기로서 이온화된다.
용어 "대사 억제성 기" (MIG)는 아미노 말단 (Z1) 또는 카르복시 말단 (Z2)에서 cMBP 펩티드의 생체내 대사를 억제하거나 저해하는 생체적합성 기를 의미한다. 이러한 기는 당업자에게 널리 공지되어 있고, 적합하게는 펩티드아민 말단의 경우에는, N-아실화 기 -NH(C=O)RG [여기서, 아실 기 (C=O)RG는 C1-6 알킬, C3-1O 아릴 기 중에서 선택되거나 또는 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 빌딩 블록을 포함하는 RG를 갖는다] 중에서 선택된다. 적합한 PEG 기는 다음 링커 기 (L)에 대해 기재되어 있다. 바람직한 PEG 기는 화학식 IA 또는 IB의 생체변형제이다. 바람직한 아미노 말단 MIG 기는 아세틸, 벤질옥시카르보닐 또는 트리플루오로아세틸이고, 가장 바람직하게는 아세틸이다.
펩티드 카르복실 말단에 적합한 대사 억제성 기에는 카르복스아미드, 3급-부틸 에스테르, 벤질 에스테르, 시클로헥실 에스테르, 아미노 알코올 또는 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 빌딩 블록이 포함된다. cMBP 펩티드의 카르복시 말단 아미노산 잔기에 적합한 MIG 기는 아미노산 잔기의 말단 아민을 C1-4 알킬 기, 바람직하게는 메틸 기로 N-알킬화시킨 경우이다. 바람직한 MIG 기는 카르복스아미드 또는 PEG이고, 가장 바람직한 기는 카르복스아미드이다.
화학식 I은 -(L)n[IM] 부분이 Z1, Z2 또는 cMBP의 적합한 어떠한 위치에도 부착될 수 있다는 것을 의미한다. Z1 또는 Z2에 관하여, Z1/Z2 중의 어느 하나가 MIG인 경우에는 -(L)n[IM] 부분이 MIG 기에 부착될 수 있다. Z1이 H이거나 Z2가 OH인 경우 에, -(L)n[IM] 부분이 Z1 또는 Z2 위치에 부착되어 화학식 [IM]-(L)n-[cMBP]-Z2 또는 Z1-[cMBP]-(L)n-[IM]의 화합물을 각각 제공한다. 어느 한 펩티드 말단에서 cMBP의 대사를 억제시키는 것은 -(L)n[IM] 부분을 이러한 방식으로 부착시킴으로써 달성할 수도 있지만, -(L)n[IM]은 본 발명의 MIG의 정의를 벗어나고 있다.
화학식 I의 -(L)n- 부분은 IM의 적합한 어떠한 위치에도 부착시킬 수 있다. -(L)n- 부분은 IM의 기존의 치환체를 대신하거나, 또는 IM의 기존의 치환체에 공유적으로 부착된다. -(L)n- 부분은 바람직하게는 IM의 카르복시알킬 치환체를 통하여 부착된다.
용어 "cMet 결합성 사이클릭 펩티드" (cMBP)는 cMet로서 공지되기도 한 간 세포 성장 인자 (HGF) 고 친화성 수용체 (c-Met 또는 간 세포 성장 인자 수용체)와 결합하는 펩티드를 의미한다. 본 발명의 적합한 cMBP 펩티드는 cMet/HGF 복합체의 cMet에 대한 겉보기 KD가 약 20 nM 미만이다. cMBP 펩티드는 프롤린 잔기를 포함하고, 이러한 잔기는 주쇄 아미드 결합의 시스/트랜스 이성체화를 나타낼 수 있는 것으로 공지되어 있다. 본 발명의 cMBP 펩티드에는 이러한 모든 이성체가 포함된다.
용어 "생체적합성 양이온" (Bc)은 음전하를 띤 이온화 기와 염을 형성하는, 양전하를 띤 반대이온을 의미하는데, 이러한 양전하를 띤 반대이온은 또한 무독성 이므로, 포유류 신체, 특히 인체에 투여하기에 적합하다. 적합한 생체적합성 양이온의 예에는 알킬리 금속 나트륨 또는 칼륨; 알칼리 토금속 칼슘 및 마그네슘; 및 암모늄 이온이 포함된다. 바람직한 생체적합성 양이온은 나트륨 및 칼륨, 가장 바람직하게는 나트륨이다.
용어 "아미노산"은 천연 발생적이거나 순전히 합성 기원일 수 있고, 광학적으로 순수할 수 있는데, 즉 단일 에난티오머이므로 키랄 또는 에난티오머의 혼합물일 수 있는, L- 또는 D-아미노산, 아미노산 유사체 (예: 나프틸알라닌) 또는 아미노산 유사작용제를 의미한다. 아미노산에 대한 통상적인 3-문자 또는 단일 문자 약어가 본원에 사용된다. 바람직하게는 본 발명의 아미노산은 광학적으로 순수하다. 용어 "아미노산 유사작용제"는 동배체인, 즉 천연 화합물의 입체적 및 전자 구조를 모방하도록 설계된 천연 발생적 아미노산의 합성 유사체를 의미한다. 이러한 동배체는 당업자에게 널리 공지되어 있고, 이에는 뎁시펩티드 (depsipeptide), 레트로-인베르소 (retro-inverso) 펩티드, 티오아미드, 시클로알칸 또는 1,5-이치환된 테트라졸이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다 [참고: M. Goodman, Biopolymers, 24, 137, (1985)].
용어 "펩티드"는 펩티드 결합에 의해 연결된, 상기 정의된 바와 같은 2개 이상의 아미노산을 포함하는 화합물을 의미한다 (즉, 아미드 결합은 하나의 아미노산의 아민을 또 다른 아미노산의 카르복실에 연결시켜 준다). 용어 "펩티드 유사작용제" 또는 "유사작용제"는 펩티드 또는 단백질의 생물학적 활성을 모방하지만, 화학적 특성상 더 이상 펩티드가 아닌, 즉 더 이상 어떠한 펩티드 결합 (즉, 아미노 산 간의 아미드 결합)도 함유하고 있지 않은 생물학적 활성 화합물을 지칭한다. 따라서, 용어 펩티드 유사작용제는 보다 광범위한 의미에서 천연상 더 이상 완전한 펩티드가 아닌 분자, 예를 들어 가성-펩티드, 반-펩티드 및 펩토이드를 포함하기 위해 사용된다.
용어 "광학 리포터 영상화 부분" (IM)은 녹색 내지 근적외선 파장 (500-1200 nm, 바람직하게는 600-1000 nm)의 빛을 이용하여 광학 영상화 과정에서 직접 또는 간접적으로 탐지할 수 있는 형광성 염료 또는 발색단을 의미한다. 바람직하게는, IM이 형광 특성을 가진다.
화학식 I의 링커 기 -(A)m-의 역할 중의 한 가지는 IM을 cMBP 펩티드의 활성 부위로부터 격리시키는 것이다. 이는 영상화 부위가 비교적 벌키한 경우에 특히 중요한데, 이로써 효소와의 상호 작용이 손상되지 않는다. 이는 가요성 (예를 들어, 간단한 알킬 쇄)을 조합함으로써 달성될 수 있으므로, 벌키 기는 활성 부위 및/또는 강성으로부터 멀리 벗어난 위치로 자유로이 갈 수 있는데, 예를 들어 IM을 활성 부위로부터 벗어나도록 배향시키는 시클로알킬 또는 아릴 스페이서를 갖고 있다. 이러한 링커 기의 특성을 또한 사용하여 조영제의 생체 분포도를 변형시킬 수 있다. 따라서, 링커 내에 에테르 기를 도입하는 것이 혈장 단백질 결합성을 최소화시키는 데에 도움이 될 것이다. -(A)m-이 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 빌딩 블록 또는 1 내지 10개 아미노산 잔기의 펩티드 쇄를 포함하는 경우에는, 링커 기가 생체 내에서 해당 조영제의 약동학과 혈액 청소율을 변형시키도록 기능할 수 있다. 이 러한 "생체변형제" 링커 기는 조영제를 근육 또는 간 등의 배경 조직, 및/또는 혈액으로부터 제거하는 것을 촉진시켜 줄 수 있으므로, 배경 간섭 저하로 인해 보다 우수한 진단 영상을 제공할 수 있다. 생체변형제 링커 기를 또한 사용하여, 예를 들어 간을 통한 배출 경로와는 달리 신장을 통한 특별한 배출 경로를 선호하게 할 수 있다.
용어 "당"은 단당류, 이당류 또는 삼당류를 의미한다. 적합한 당에는 글루코스, 갈락토스, 말토스, 만노스 및 락토스가 포함된다. 임의로, 당을 관능화하여 아미노산과의 커플링을 용이하게 할 수 있다. 따라서, 예를 들어 아미노산의 글루코사민 유도체를 펩티드 결합을 통하여 기타 아미노산에 접합시킬 수 있다. 아스파라긴의 글루코사민 유도체 (시판처: NovaBiochem)가 이의 한 예이다:
Figure 112009069850449-PCT00002
바람직한 특징
조영제의 분자량은 적합하게 8000 달톤 이하이다. 바람직하게는 분자량은 2800 내지 6000 달톤의 범위, 가장 바람직하게는 3000 내지 4500 달톤의 범위인데, 3200 내지 4000 달톤이 특히 바람직하다.
본 발명의 바람직한 조영제는 MIG 기에 의해 보호된 양 펩티드 말단을 갖고 있는데, 즉 바람직하게는 Z1과 Z2는 둘 다 MIG인데, 이는 통상적으로 상이할 것이다.
상기 인지된 바와 같이, Z1/Z2 중의 어느 하나는 임의로 -(L)n[IM]와 동등시할 수 있다. 이러한 방식으로 보호된 양 펩티드 말단이 생체내 영상화 적용에 있어서 중요한데, 이는 cMet에 대한 선택적 결합 친화성 상실을 수반하는 신속한 대사가 예측될 수도 있기 때문이다. Z1과 Z2 둘 다가 MIG인 경우에는, 바람직하게는 Z1이 아세틸이고, Z2가 1급 아미드이다. 가장 바람직하게는, Z1이 아세틸이고, Z2가 1급 아미드이며, -(L)n[IM] 부분이 cMBP의 리신 잔기의 엡실론 아민 측쇄에 부착된다.
본 발명의 바람직한 cMBP 펩티드는 cMet/HGF 복합체에 대한 cMet의 결합에 대한 KD가 약 10 nM 미만 (형광 편광 검정 측정에 의거함), 가장 바람직하게는 1 내지 5 nM의 범위인데, 3 nM 미만이 이상적이다.
화학식 I의 cMBP의 펩티드 서열 (서열 1):
Cysa-X1-Cysc-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cysd-Typ-Cysb-Tyr-X4-X5-X6
은 17량체 펩티드 서열인데, 이는 cMet에 대한 선택적 결합에 대해 주로 책임이 있다. 본 발명의 cMBP 펩티드가 17개 초과의 아미노산 잔기를 포함하는 경우, 나머지 아미노산은 시스테인 이외의 어떠한 아미노산일 수 있다. 부가의 보호되지 않은 시스테인 잔기는 규정된 Cysa-Cysb 및 Cysc-Cysd 디설파이드 브릿지의 불필요한 스크램블링 (scrambling)을 유발시킬 수 있었다. 부가의 펩티드는 바람직 하게는 -(L)n[IM] 부분의 용이한 접합을 위해 적합한 측쇄를 가진 1개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 적합한 측쇄에는 아민-관능화 -(L)n[IM] 기에 접합하는 경우에는 Asp 또는 Glu 잔기가 포함되고, 또는 카르복시- 또는 활성 에스테르-관능화 -(L)n[IM] 기에 접합하는 경우에는 Lys 잔기가 포함된다. -(L)n[IM]의 접합을 위한 아미노산 잔기는 cMBP 펩티드 (서열 1)의 17량체 결합성 영역으로부터 벗어나서 위치하는 것이 적합하고, 바람직하게는 C- 또는 N-말단에 위치한다. 바람직하게는 접합을 위한 아미노산 잔기는 Lys 잔기이다.
서열 1의 트립토판 잔기의 치환은 공지된 아미노산 치환체 페닐알라닌 및 나프틸알라닌을 이용하여 평가하였다. 그러나, cMet 친화성 상실이 밝혀졌는데, 이는 트립토판 잔기가 활성에 중요하다는 사실을 제안하고 있다.
cMBP 펩티드가 N-말단 세린 잔기를 추가로 포함하여, 18량체 (서열 2):
Ser-Cysa-X1-Cysc-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-X4-X5-X6
를 제공하는 것이 바람직하다.
서열 1, 또는 바람직하게는 서열 2 이외에도, cMBP는 가장 바람직하게,
(i) cMBP 펩티드의 C- 또는 N-펩티드 말단의 4개 아미노산 잔기 내에 Asp 또는 Glu 잔기를 추가로 포함하고; -(L)n[IM]은 상기 Asp 또는 Glu 잔기의 카르복실 측쇄에 접합되는 아민 기로 관능화하여 아미드 결합을 제공하거나; 또는
(ii) cMBP 펩티드의 C- 또는 N-펩티드 말단의 4개 아미노산 잔기 내에 Lys 잔기를 추가로 포함하고; -(L)n[IM]은 상기 Lys 잔기의 엡실론 아민 측쇄에 접합되는 카르복실 기로 관능화하여 아미드 결합을 제공한다.
바람직한 cMBP 펩티드는 22량체 아미노산 서열 (서열 3):
Ala-Gly-Ser-Cysa-X1-Cysc-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-X4-X5-X6-Gly-Thr을 포함한다.
본 발명의 cMBP 펩티드는 바람직하게는 X3이 Arg이다.
cMBP 펩티드는 바람직하게는 서열 1, 서열 2 또는 서열 3 이외에도, N- 또는 C-말단에 다음 중에서 선택된 링커 펩티드를 추가로 포함한다:
-Gly-Gly-Gly-Lys- (서열 4), -Gly-Ser-Gly-Lys- (서열 5) 또는 -Gly-Ser-Gly-Ser-Lys- (서열 6).
링커 펩티드의 Lys 잔기가 -(L)n[IM] 부분의 접합에 가장 바람직한 위치이다. 특히 바람직한 cMBP 펩티드는 26량체 아미노산 서열 (서열 7)을 갖는, 서열 4의 링커 펩티드와 함께 서열 3을 포함한다:
Ala-Gly-Ser-Cysa-Tyr-Cysc-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys (서열 7).
서열 1, 서열 2, 서열 3 및 서열 7의 cMBP 펩티드는 바람직하게는 Z1 = Z2 = MIG이고, 가장 바람직하게는 Z1이 아세틸이고 Z2가 1급 아미드이다.
-(L)n[IM] 부분은 적합하게는, Z1 또는 Z2 기, 또는 서열 1의 cMet 결합성 서열과 상이한 cMBP 펩티드의 아미노산 잔기에 부착시킨다. 바람직한 아미노산 잔기 및 접합 부위는 상기 언급된 바와 같다. -(L)n[IM] 부분을 Z1 또는 Z2에 부착시킨 경우, 이는 N- 또는 C-말단에 대한 접합에 의해 Z1 또는 Z2을 대신할 수 있고, 이러한 방식으로 생체내 대사를 차단시킬 수 있다.
바람직한 IM 기는 광범위한 비국재화 전자 시스템, 예를 들어 시아닌, 메로시아닌, 인도시아닌, 프탈로시아닌, 나프탈로시아닌, 트리페닐메틴, 포르피린, 피릴륨 염료, 티아피릴륨 염료, 스쿠아릴륨 염료, 크로코늄 염료, 아줄레늄 염료, 인도아닐린, 벤조페녹사지늄 염료, 벤조티아페노티아지늄 염료, 안트라퀴논, 나프토퀴논, 인다트렌, 프탈로일아크리돈, 트리스페노퀴논, 아조 염료, 분자내 및 분자간 전하-전이 염료 및 염료 복합체, 트로폰, 테트라진, 비스(디티올렌) 복합체, 비스(벤젠-디티올레이트) 복합체, 요오도아닐린 염료, 비스(S,O-디티올렌) 복합체를 갖는다. 형광성 단백질, 예를 들어 그린 형광성 단백질 (GFP) 및 상이한 흡수/방출 특성을 가진 GFP의 변형물이 또한 유용하다. 특정의 희토류 금속 (예: 에우로퓸, 사마륨, 테르븀 또는 디스프로슘) 착물이 형광성 나노결정 (양자 도트)과 같은 특정 맥락에서 사용된다.
사용될 수 있는 발색단의 특별한 예에는 플루오레세인, 설포로다민 101 (Texas Red), 로다민 B, 로다민 6G, 로다민 19, 인도시아닌 그린, Cy2, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, Cy7.5, 마리나 블루 (Marina Blue), 퍼시픽 블루 (Pacific Blue), 오레곤 그린 (Oregon Green) 488, 오레곤 그린 514, 테트라메틸로다민, 및 알렉사 플루오르 (Alexa Fluor) 350, 알렉사 플루오르 430, 알렉사 플루오르 532, 알렉사 플루오르 546, 알렉사 플루오르 555, 알렉사 플루오르 568, 알렉사 플루오르 594, 알렉사 플루오르 633, 알렉사 플루오르 647, 알렉사 플루오르 660, 알렉사 플루오르 680, 알렉사 플루오르 700, 및 알렉사 플루오르 750이 포함된다. 시아닌 염료가 특히 바람직하다. 문헌 [참고: Licha et al., Topics Curr. Chem., 222, 1-29 (2002); Adv. Drug Deliv. Rev., 57, 1087-1108 (2005)]에서는 생체내 광학 영상화를 위한 염료 및 염료 접합체가 고찰되었다.
형광단인 바람직한 시아닌 염료는 하기 화학식 II이다:
Figure 112009069850449-PCT00003
상기 식에서,
X'는 각각 독립적으로 -C(CH3)2, -S-, -O- 또는 -C[(CH2)aCH3][(CH2)bM]- (여기서, a는 0 내지 5의 정수이고, b는 1 내지 5의 정수이며, M은 기 G이거나 또는 SO3M1 또는 H 중에서 선택된다) 중에서 선택되고;
Y'는 각각 독립적으로 H, -CH2NH2, -SO3M1, -CH2COOM1, -NCS 및 F로 이루어진 군 중에서 선택된 1 내지 4개 기를 나타내고, Y' 기는 방향족 환의 모든 위치에 놓여지며;
Q'는 독립적으로 H, -SO3M1, NH2, COOM1, 암모늄, 에스테르 기, 벤질 및 기 G로 이루어진 군 중에서 선택되고;
M1은 H 또는 Bc이며;
l은 정수 1 내지 3이고;
m은 정수 1 내지 5인데,
X', Y' 및 Q' 중의 하나 이상은 기 G를 포함하고;
G는 cMBP 펩티드와 부착하는 데에 적합한 반응성 또는 기능성 기이다.
G 기는 시아닌 염료 형광단과 cMBP 펩티드 간의 공유적 연쇄를 형성하는 cMBP 펩티드의 상보적 기와 반응한다. G는 상기 펩티드의 상보적 기능성 기와 반응할 수 있는 반응성 기일 수 있거나, 또는 cMBP 펩티드의 반응성 기와 반응할 수 있는 기능성 기를 포함할 수 있다. 반응성 및 기능성 기의 예에는 활성 에스테르; 이소티오시아네이트; 말레이미드; 할로아세트아미드; 산 할라이드; 히드라지드; 비닐설폰; 디클로로트리아진; 포스포르아미다이트; 히드록실; 아미노; 설피드릴; 카르보닐; 카르복실산 및 티오포스페이트가 포함된다. 바람직하게는 G가 활성 에스테르이다.
용어 "활성화 에스테르" 또는 "활성 에스테르"는 보다 우수한 이탈 기이므로, 친핵체 (예: 아민)과의 보다 용이한 반응을 허용해 주는 것으로 설계되는 연합된 카르복실산의 에스테르 유도체를 의미한다. 적합한 활성 에스테르의 예는 N-히드록시석신이미드 (NHS), 설포-석신이미딜 에스테르, 펜타플루오로페놀, 펜타플루오로티오페놀, 파라-니트로페놀, 히드록시벤조트리아졸 및 PyBOP (즉, 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트)이다. 바람직한 활성 에스테르는 N-히드록시석신이미드 또는 펜타플루오로페놀 에스테르, 특히 N-히드록시석신이미드 에스테르이다.
화학식 II의 바람직한 양태에서,
X'는 각각, -C(CH3)2- 및 -C(CH3)[(CH2)4M]- (여기서, M은 G 기 또는 SO3M1이다)의 군 중에서 선택되고;
Y'는 각각, -SO3M1, H 또는 1 내지 4개의 F 원자를 나타내고;
Q'는 각각, G 기 및 -SO3M1 중에서 선택되고;
l은 바람직하게는 2이고; m은 바람직하게는 3, 4 또는 5인데,
X' 또는 Q' 중의 하나가 G 기인 경우, 이는 가장 바람직하게는 석신이미딜 에스테르이다.
특별히 바람직한 시아닌 염료는 하기 화학식 III이다:
Figure 112009069850449-PCT00004
상기 식에서,
R1 및 R2는 독립적으로 H 또는 -SO3M1이고, R1 및 R2 중의 적어도 하나는 -SO3M1이며 (여기서, M1은 H 또는 Bc이다);
R3 및 R4는 독립적으로 C1-4 알킬 또는 C1-6 카르복시알킬이고;
R5, R6, R7 및 R8은 독립적으로 Ra 기 [여기서, Ra는 C1-4 알킬, C1-6 카르복시알킬 또는 -(CH2)kSO3M1 (여기서, k는 3 또는 4의 정수이다)이다]이되,
단 시아닌 염료는 R1, R2 및 Ra 기 내에 총 1 내지 4개의 SO3M1 치환체를 갖는다.
화학식 III의 바람직한 염료는 cMBP에 대한 접합을 촉진시키기 위하여 하나 이상의 C1-6 카르복시알킬 기가 존재하도록 선택된다.
화학식 III의 바람직한 개개의 염료가 다음 표 1에 요약되어 있다:
Figure 112009069850449-PCT00005
[상기에서, Rf는 -(CH2)5COOH이다].
화학식 II의 특히 바람직한 염료는 Cy5** 및 Alexa647인데, Cy5**가 이상적이다.
합성 링커 기 (L)가 존재하는 경우, 이는 바람직하게는 [IM] 및 Z1-[cMBP]-Z2에 대한 접합을 촉진시키는 말단 기능성 기를 포함한다. L이 1 내지 10개 아미노산 잔기의 펩티드 쇄를 포함하는 경우, 이러한 아미노산 잔기는 바람직하게는 글리신, 리신, 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산 또는 세린 중에서 선택된다. L이 PEG 부분을 포함하는 경우, 이는 바람직하게는 화학식 IA 또는 IB의 단분산 PEG-유사 구조의 올리고머화로부터 유래된 단위를 포함한다:
Figure 112009069850449-PCT00006
(화학식 IA의 17-아미노-5-옥소-6-아자-3,9,12,15-테트라옥사헵타데카노산)
상기 식에서, p는 정수 1 내지 10이다. 또 다른 한편, 화학식 IB의 프로피온산 유도체에 의거한 PEG-유사 구조를 사용할 수 있다:
Figure 112009069850449-PCT00007
상기 식에서, p는 화학식 IA에 대해 정의된 바와 같고, q는 정수 3 내지 15이다. 화학식 IB에서, p는 바람직하게는 1 또는 2이고, q는 바람직하게는 5 내지 12이다.
링커 기가 PEG 또는 펩티드 쇄를 포함하지 않는 경우, 바람직한 L 기는 2 내지 10개 원자, 가장 바람직하게는 2 내지 5개 원자, 특히 바람직하게는 2 또는 3개 원자의 -(A)m- 부분을 구성하는 연결된 원자의 주쇄를 갖는다. 2개 원자의 최소 링커 기 주쇄는 영상화 부분이 잘 분리되어 바람직하지 못한 어떠한 상호 작용도 최소화시킨다는 이점을 제공해준다.
화학식 I에서, n은 바람직하게는 0 또는 1이고, 가장 바람직하게는 0인데, 즉 링커 기가 존재하지 않는다.
본 발명의 바람직한 조영제는 하기 화학식 IV이다:
Figure 112009069850449-PCT00008
상기 식에서, (L)n[IM] 기는 Lys 잔기의 엡실론 아미노 기에 부착된다. 바람직한 화학식 IV의 조영제는 아세틸과 동등한 MIG (N-말단 Ala) 및 1급 아미드와 동등한 MIG (C-말단 Lys)을 갖는다. 화학식 IV에서, n은 바람직하게는 0이고, IM은 바람직하게는 시아닌 염료, 가장 바람직하게는 화학식 II의 시아닌 염료이다. 특히 바람직한 화학식 IV의 조영제는 IM = Cy5** 또는 Alexa647이고, 이상적으로는 Cy5**이다.
본 발명의 화학식 Z1-[cMBP]-Z2의 펩티드는
(i) 목적하는 cMBP 펩티드와 동일한 펩티드 서열을 갖고 있으며, Cysa 및 Cysb가 보호되지 않으며 Cysc 및 Cysd 잔기가 티올-보호 기를 갖는 선형 펩티드의 고체 상 펩티드 합성 단계;
(ii) 단계 (i)로부터의 펩티드를 용액 중의 수성 염기로 처리하여 Cysa와 Cysb를 연결하는 제1 디설파이드 결합을 수반한 모노사이클릭 펩티드를 수득하는 단계;
(iii) Cysc 및 Cysd 티올-보호 기를 제거하고 고리화 반응시켜, 목적하는 바이사이클릭 펩티드 생성물 Z1-[cMBP]-Z2인, Cysc와 Cysd를 연결하는 제2 디설파이드 결합을 수득하는 단계
를 포함하는 제조 방법에 의해 수득할 수 있다.
용어 "보호 기"는 바람직하지 못한 화학적 반응은 억제 또는 저해하지만, 분자의 나머지 부분은 변형시키지 않기에 충분히 순한 조건 하에 문제의 기능성 기로부터 절단될 수 있기에 충분히 반응성이 되도록 설계되는 기를 의미한다. 탈보호시킨 후에, 목적 생성물을 수득한다. 아민 보호 기가 당업자에게 널리 공지되어 있고, 적합하게는 Boc (여기서, Boc는 3급-부틸옥시카르보닐이다), Fmoc (여기서, Fmoc는 플루오레닐메톡시카르보닐이다), 트리플루오로아세틸, 알릴옥시카르보닐, Dde [즉, l-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥실리덴)에틸] 또는 Npys (즉, 3-니트로-2-피리딘 설페닐) 중에서 선택된다. 적합한 티올 보호 기는 Trt (트리틸), Acm (아세트아미도메틸), t-Bu (3급-부틸), 3급-부틸티오, 메톡시벤질, 메틸벤질 또는 Npys (3-니트로-2-피리딘 설페닐)이다. 추가의 보호 기의 용도는 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: 'Protective Groups in Organic Synthesis', Theorodora W. Greene and Peter G. M. Wuts, (John Wiley & Sons, 1991)]. 바람직한 아민 보호 기는 Boc 및 Fmoc, 가장 바람직하게는 Boc이다. 바람직한 아민 보호 기는 Trt 및 Acm이다.
실시예 1 및 2는 추가의 구체적인 상세 내역을 제공해준다. 고체 상 펩티드 합성 단계의 추가의 상세 내역이 문헌 [참고: P. Lloyd-Williams, F. Albericio and E. Girald; Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, CRC Press, 1997]에 기재되어 있다. cMBP 펩티드는 불활성 대기 하에 가장 잘 저장되고 동결기에서 유지시킨다. 용액 중에서 사용된 경우에는, pH 7 이상을 피하는 것이 가장 좋은데, 이는 디설파이드 브릿지의 스크램블링 위험 때문이다.
본 발명의 조영제는 제3 국면 (다음)에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.
제2 국면에서, 본 발명은 제1 국면의 조영제를 생체적합성 담체와 함께 포함하는, 포유류 투여에 적합한 형태의 제약 조성물을 제공한다.
"생체적합성 담체"는 본 발명의 조영제를 현탁 또는 용해시킬 수 있어 해당 조성물이 생리적으로 관용되도록 하는, 즉 독성이나 과도한 불쾌감을 유발시키지 않으면서 포유류 신체에 투여될 수 있도록 해주는 유체, 특히 액체이다. 생체적합성 담체는 적합하게, 주사용 담체 액체, 예를 들어 멸균성, 발열원-무함유 주사용 수; 수용액, 예를 들어 식염수 (주사되는 최종 생성물이 등장성이 되도록 유리하게 균형을 맞출 수 있다); 하나 이상의 등장성-조정 물질 (예: 혈장 양이온과 생체적합성 반대이온의 염)의 수용액, 당 (예: 글루코스 또는 슈크로스), 당 알코올 (예: 솔비톨 또는 만니톨), 글리콜 (예: 글리세롤), 또는 기타 비이온성 폴리올 물질 (예: 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 등)이다. 바람직하게는 생체적합성 담체는 발열원-무함유 주사용 수 또는 등장성 식염수이다.
본 발명의 조영제와 생체적합성 담체는 주사기 또는 캐눌라에 의해 용액의 첨가와 회수를 허용하면서도, 멸균성 완전성 및/또는 방사성 안전성을 유지시켜 줄 수 있는 밀봉 용기 + 임의로 불활성 상부 공간부분 기체 (예: 질소 또는 아르곤)를 포함하는 적합한 바이알 또는 용기에 각각 공급된다. 바람직한 상기 용기는 기밀 폐쇄부가 오버실 (overseal) (전형적으로 알루미늄이다)로 크림핑된 격막-기밀된 바이알이다. 이러한 폐쇄부는 멸균성 완전성은 유지시키면서도 피하 바늘을 이용하여 단일 또는 여러번 구멍을 뚫는 데에 적합하다 (예: 크림핑된 격막 실 폐쇄). 이러한 용기는 상기 폐쇄부가 경우에 따라 (예를 들어, 상부 공간부분 기체 또는 탈기체 용액을 변화시키기 위해) 진공을 견딜 수 있고, 외부 대기 기체 (예: 산소 또는 수증기)의 진입을 허용하지 않으면서 압력 강하와 같은 압력 변화를 견딜 수 있다는 부가의 이점을 지니고 있다.
적합한 수 회분 용량 용기는 수 회분 환자 용량을 함유함으로써, 임상 상황에 맞도록 하기 위해 해당 제제의 생존 가능한 수명 동안 각종 시간 간격으로 단일 환자 용량을 임상 등급 주사기 내로 회수할 수 있는 단일 벌크 바이알 (예: 10 내지 30 ㎤ 용적)을 포함한다. 예비-충전된 주사기는 단일 인간 용량, 또는 "단위 용량"을 함유하도록 설계되므로, 바람직하게는 임상용으로 적합한 1회용 또는 기타 주사기이다. 본 발명의 제약 조성물은 바람직하게는 단일 환자에 적합한 투여량을 갖고 있고, 상기 언급된 바와 같은 적합한 주사기 또는 용기에 제공된다.
본 발명의 제약 조성물은 부가의 부형제, 예를 들어 항미생물성 방부제, pH 조정제, 충전제, 안정화제 또는 삼투압 조정제를 임의로 함유할 수 있다. 용어 "항미생물성 방부제"는 잠재적으로 해로운 미생물, 예를 들어 세균, 효모 또는 곰팡이의 성장을 억제시키는 작용제를 의미한다. 항미생물성 방부제는 이용된 투여량 에 따라서 몇몇 살균 특성을 나타낼 수도 있다. 본 발명의 항미생물성 방부제(들)의 주요 역할은 제약 조성물 내의 모든 미생물의 성장을 억제시키는 것이다. 그러나, 항미생물성 방부제는 투여에 앞서 상기 조성물을 제조하기 위해 사용된 키트의 한 가지 이상 성분 내의 잠재적으로 해로운 미생물의 성장을 억제시키기 위해 임의로 사용할 수도 있다. 적합한 항미생물성 방부제(들)에는 파라벤, 즉 메틸, 에틸, 프로필 또는 부틸 파라벤 또는 그의 혼합물; 벤질 알코올; 페놀; 크레졸; 세트리미드 및 티오메르살이 포함된다. 바람직한 항미생물성 방부제(들)는 파라벤이다.
용어 "pH 조정제"는 조성물의 pH가 인간 또는 포유류 투여를 위해 허용 가능한 한계치 (대략 pH 4.0 내지 10.5) 내에 존재하도록 하는 데에 유용한 화합물 또는 화합물의 혼합물을 의미한다. 이러한 적합한 pH 조정제에는 제약상 허용 가능한 완충제, 예를 들어 트리신, 인산염 또는 TRIS [즉, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄], 및 제약상 허용 가능한 염기, 예를 들어 탄산나트륨, 중탄산나트륨 또는 그의 혼합물이 포함된다. 조성물을 키트 형태로 사용하는 경우, pH 조정제는 임의로 별개의 바이알 또는 용기에 제공될 수 있기 때문에, 키트 사용자가 다중-단계 과정의 일부로서 pH를 조정할 수 있다.
용어 "충전제"는 생성 및 동결건조 동안 물질 조작을 용이하게 해줄 수 있는 제약상 허용 가능한 벌크제를 의미한다. 적합한 충전제에는 무기 염, 예를 들어 염화나트륨, 및 수용성 당 또는 당 알코올, 예를 들어 슈크로스, 말토스, 만니톨 또는 트레할로스가 포함된다.
제2 국면의 제약 조성물은 무균 제조 공정 (즉, 클린룸) 하에 제조하여 목적 하는 멸균성의 비-발열원성 생성물을 수득할 수 있다. 주요 성분, 특히 조영제와 접촉하게 되는 장치의 일부 (예: 바이알)가 부가된 연합 시약이 멸균성인 것이 바람직하다. 이러한 성분과 시약은 멸균성 여과, 예를 들어 감마선 조사를 이용한 말단 멸균화, 오토클레이빙, 무수 열 또는 화학약품 처리 (예를 들어, 에틸렌 옥사이드를 이용함)를 포함한, 당해 분야에 공지된 방법에 의해 멸균시킬 수 있다. 몇몇 성분들은 미리 멸균시켜 최소 수의 조작 수행이 필요한 것이 바람직하다. 그러나, 사전 조치로서, 제약 조성물을 제조하는 데에 있어서 최종 단계로서 적어도 멸균성 여과를 포함시키는 것이 바람직하다.
제2 국면의 제약 조성물은 임의로, 다음 제4 국면에 대해 기재되는 바와 같이 키트로부터 제조할 수 있다.
제3 국면에서, 본 발명은
(i) Z1이 H이고 Z2가 MIG인 화학식 Z1-[cMBP]-Z2의 cMBP 펩티드를 화학식 Y1-(L)n-[IM]의 화합물과 반응시켜, [IM]이 Z1 위치에서 접합되는 화학식 I의 조영제를 수득하는 단계;
(ii) Z1=Z2=MIG이고 cMBP가 C- 또는 N-cMBP 펩티드 말단의 4개 아미노산 잔기 내에 Asp 또는 Glu 잔기를 포함하고, cMBP 펩티드의 기타 모든 Asp/Glu 잔기가 보호되는 화학식 Z1-[cMBP]-Z2의 cMBP 펩티드를 화학식 Y2-(L)n-[IM]의 화합물과 반응시켜, [IM]이 cMBP 펩티드의 Asp 또는 Glu 잔기에서 접합되는 화학식 I의 조영제를 수득하는 단계;
(iii) Z1이 MIG이고 Z3이 Z2 기 또는 활성화 에스테르이며, cMBP 펩티드의 기타 모든 Asp/Glu 잔기가 보호되는 화학식 Z1-[cMBP]-Z3의 cMBP 펩티드를 화학식 Y2-(L)n-[IM]의 화합물과 반응시켜, [IM]이 Z2 위치에서 접합되는 화학식 I의 조영제를 수득하는 단계;
(iv) Z1=Z2=MIG이고 cMBP가 C- 또는 N-cMBP 펩티드 말단의 4개 아미노산 잔기 내에 Lys 잔기를 포함하는 화학식 Z1-[cMBP]-Z2의 cMBP 펩티드를 화학식 Y2-(L)n-[IM]의 화합물과 반응시켜, [IM]이 cMBP 펩티드의 Lys 잔기에서 접합되는 화학식 I의 조영제를 수득하는 단계
[상기에서, Z1, cMBP, Z2, MIG, L, n 및 IM은 제1 국면 (상기)에서 정의된 바와 같고,
Z3은 Z2 기 또는 활성화 에스테르이며;
Y1은 카르복실산, 활성화 에스테르, 이소티오시아네이트 또는 티오시아네이트 기이고;
Y2는 아민 기이다]
중의 하나를 포함하는, 제1 국면의 조영제를 제조하는 방법을 제공한다.
용어 "활성화 에스테르" 또는 "활성 에스테르" 및 그의 바람직한 양태는 상기 언급된 바와 같다. Y2는 바람직하게는 1급 또는 2급 아민 기, 가장 바람직하게는 1급 아민 기이다.
화합물 Z1-[cMBP]-Z2는 바람직하게는 Z1와 Z2 둘 다가 MIG이다. 바람직한 cMBP 펩티드 및 Z1/Z2 기는 제1 국면에서 기재된 바와 같다. 특히, cMBP 펩티드가 제1 국면의 바람직한 cMBP 펩티드에 대해 기재된 바와 같이 접합을 촉진시키기 위해 Asp, Glu 또는 Lys 잔기를 포함하는 것이 바람직하다. cMBP 펩티드가 단계 (iv)에 기재된 바와 같이 Lys 잔기를 포함하는 것이 특히 바람직하다.
Z1-[cMBP]-Z2의 제조는 제1 양태 (상기)에 기재되어 있다. Z3이 활성 에스테르인 Z1-[cMBP]-Z3은 통상적인 방법에 의해, Z가 OH 또는 생체적합성 양이온 (Bc)인 Z1-[cMBP]-Z3으로부터 제조할 수 있다.
펩티드에 대한 접합에 적합한 관능화된 광학 리포터 염료 (IM)는 공급처 [GE Healthcare Limited, Atto-Tec, Dyomics, Molecular Probes 등]로부터 시판중이다. 이러한 염료 대부분은 NHS 에스테르로서 입수 가능하다.
적합한 광학 리포터 (IM), 특히 염료를 아미노산 및 펩티드에 접합시키는 방법은 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Licha (vide supra), 및 Flanagan et al., Bioconj. Chem., 8, 751-756 (1997); Lin et al, ibid, 13, 605-610 (2002) and Zaheer, Mol. Imaging, 1(4), 354-364 (2002)]. 링커 기 (L)를 cMBP 펩티드에 접합시키는 방법은 염료 단독과 유사한 화학 (상기 참고)을 이용하고, 당해 분야에 공지되어 있다.
제4 국면에서, 본 발명은 멸균성 고체 형태의 제1 국면의 조영제를 포함하며, 제2 국면의 생체적합성 담체의 멸균성 공급물과의 재구성시 분해가 일어나 목적하는 제약 조성물을 제공해 주는, 제2 국면의 제약 조성물을 제조하기 위한 키트를 제공한다.
이러한 경우, 상기 조영제가 상기 언급된 바와 같은 기타 임의의 부형제와 함께, 적합한 바이알 또는 용기 내에 동결건조된 분말로서 제공될 수 있다. 이어서, 상기 조영제는 목적하는 생체적합성 담체와 재구성하여 포유류 투여에 즉시 사용되는 멸균성의 비-발열원성 형태의 제약 조성물이 되도록 설계한다.
조영제의 바람직한 멸균성 고체 형태는 동결건조된 고체이다. 이러한 멸균성 고체 형태는 바람직하게는 제약 조성물에 대해 기재된 바와 같이 (상기) 제약 등급 용기에 공급된다. 키트를 동결건조시키는 경우, 제형은 당류, 바람직하게는 만니톨, 말토스 또는 트리신 중에서 선택된 냉동보호제를 임의로 포함할 수 있다.
제5 국면에서, 본 발명은 제1 국면의 조영제 또는 제2 국면의 제약 조성물을 사용하여 생체내 cMet 과발현 또는 국재화 부위의 영상을 수득하는 것을 포함하는, 포유류 신체의 생체내 광학 영상화 방법을 제공한다.
용어 "광학 영상화"는 적색 내지 근적외선 영역 (파장 600-1200 nm) 내의 빛과의 상호 작용에 근거한, 질병의 탐지, 병기 분류 또는 진단, 후속 질병 발생 또 는 후속 질병 치료에 대한 영상을 형성하는 모든 방법을 의미한다. 광학 영상화에는 어떠한 장치도 사용하지 않고 직접적으로 가시화하는 모든 방법과 각종 스코프, 카테터 및 광학 영상화 장비, 예를 들어 토모그래프적 제시를 위해 컴퓨터를 이용한 하드웨어 등의 장치를 사용하는 것을 포함하는 방법이 추가로 포함된다. 양식 및 측정 기술에는 발광 영상화; 내시경; 형광 내시경, 단층 영상법 (optical coherence tomography); 투과율 영상화; 시간 분해 투과율 영상화; 공촛점 영상화; 비선형 현미경; 광음향 영상화; 음향-광학 영상화; 분광법; 반사도 분광법; 간섭 분광법; 코히런스 (coherence) 간섭 분광법; 확산 광학 토모그래피 및 형광 매개된 확산 광학 토모그래피 (연속 파, 시간 도메인 및 주파수 도메인 시스템), 및 광 산란, 흡수, 편광, 발광, 형광 수명, 양자 수율 및 켄칭 측정법이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 기술의 추가 상세 내역은 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Tuan Vo-Dinh (editor): "Biomedical Photonics Handbook" (2003), CRC Press LCC; Mycek & Pogue (editors): "Handbook of Biomedical Fluorescence" (2003), Marcel Dekker, Inc.; Splinter & Hopper: "An Introduction to Biomedical Optics" (2007), CRC Press LCC].
녹색 내지 근적외선 영역 빛은 바람직하게는 파장이 600-1000 nm이다. 광학 영상화 방법은 바람직하게는 형광 내시경이다. 제5 국면의 포유류 신체는 바람직하게는 인체이다. 조영제의 바람직한 양태는 제1 국면 (상기)에 대해 기재된 바와 같다. 특히 형광성 염료가 이용되는 것이 바람직하다.
제5 국면의 방법에서, 조영제 또는 제약 조성물은 바람직하게는 상기 포유류 신체에 미리 투여하였다. "미리 투여하였다"는 것은 임상의가 조영제를, 예를 들어 정맥내 주사로서 환자에게 제공하는 단계를 영상화 이전에 이미 수행하였다는 것을 의미한다. 이러한 양태에는 cMet가 밀접한 영향을 미치는 포유류 신체의 질병 상태를 생체내에서 진단적 영상화하기 위한 진단제를 제조하기 위한 제1 양태의 조영제의 용도가 포함된다.
제5 국면의 바람직한 광학 영상화 방법은 형광 반사도 영상화 (FRI)이다. FRI에서는, 본 발명의 조영제를 진단하고자 하는 대상체에게 투여한 후, 이러한 대상체의 조직 표면을 여기 광, 통상적으로 연속 파 (CW) 여기 광으로 조사한다. 이러한 광은 리포터 분자 (IM)를 여기시킨다. 여기 광에 의해 생성되는, 조영제로부터의 형광을 형광 탐지기로 탐지한다. 반송되는 빛은 여과시켜 형광 성분을 (전적으로 또는 부분적으로) 분리하는 것이 바람직하다. 형광성 빛으로부터 영상이 형성된다. 통상적으로 최소한도의 프로세싱을 수행하고 (수명, 양자 수율 등의 광학 파라미터를 연산 처리하기 위한 프로세서가 없다), 영상은 형광 세기를 지도로 나타낸다. 조영제는 질병 부위에 집중되도록 설계하여 보다 고도의 형광 세기를 생성시킨다. 이로써, 질병 부위는 형광 세기 영상에서 양성 대비를 나타낸다. 이러한 영상은 바람직하게는 CCD 카메라 또는 칩을 이용하여 수득하기 때문에, 실시간 영상화가 가능하다.
여기 파장은 사용된 염료의 유형에 따라서 다양하다. 여기 광을 생성시키기 위한 장치는 통상적인 여기 광원, 예를 들어 레이저 (예: 이온 레이저, 염료 레이저 또는 반도체 레이저), 할로겐 광원 또는 크세논 광원일 수 있다. 각종 광학 필 터를 임의로 사용하여 최적의 여기 파장을 수득할 수 있다.
바람직한 FRI 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다:
(i) 포유류 신체 내의 관심있는 조직 표면을 여기 광으로 조사하는 단계;
(ii) 영상화 부분 (IM)의 여기에 의해 생성되는, 조영제로부터의 형광을 형광 탐지기로 탐지하는 단계;
(iii) 형광 탐지기에 의해 탐지된 빛을 임의로 여과시켜 형광 성분을 분리하는 단계;
(iv) 상기 관심있는 조직 표면의 영상을 단계 (ii) 또는 (iii)의 형광성 광으로부터 형성하는 단계.
단계 (i)에서, 여기 광은 바람직하게는 사실상 연속 파 (CW)이다. 단계 (iii)에서는, 탐지된 광을 여과시키는 것이 바람직하다. 특히 바람직한 FRI 방법은 형광 내시경이다.
제5 국면의 또 다른 영상화 방법은 FDPM (주파수-도메인 광자 이동)을 이용한다. 이는 조직 내의 IM을 보다 큰 폭으로 탐지하는 것이 중요한 연속 파 (CW) 방법에 비해 이점을 지니고 있다 [참고: Sevick-Muraca et al, Curr. Opin. Chem. Biol., 6, 642-650 (2002)]. 이러한 주파수/시간 도메인 영상화의 경우에는, IM이 영상화시키고자 하는 병변의 조직 폭과 이용된 기기의 유형에 따라서 조정될 수 있는 형광 특성을 가진 경우에 유리하다.
FDPM 방법은 다음과 같다:
(a) 불균질한 조성을 가진 포유류 신체의 광-산란성 생물학적 조직을 광원으 로부터의 광에, 예정된 시간을 이용하여 조영제를 여기시키는 세기를 다양하게 하여 노출시키는데, 상기 조직이 여기 광을 다수 산란시키는 단계;
(b) 상기 노출에 반응하여 조직으로부터 다수 산란된 발광을 탐지하는 단계;
(c) 프로세서를 이용하여 수 많은 값을 확립시킴으로써 발광으로부터 조직 전반에 걸쳐 특징적인 형광을 정량화하는데, 상기 값 각각이 조직 내의 상이한 위치에서 특징적인 형광 수준에 상응하고, 이러한 특징적인 형광 수준이 조직의 불균질한 조성에 따라서 다양한 단계; 및
(d) 단계 (c)의 값에 따라서 조직의 불균질한 조성을 지도화함으로써 조직의 영상을 생성시키는 단계.
단계 (c)의 형광 특징은 바람직하게는 조영제의 흡수에 상응하고, 바람직하게는 조영제를 투여하기 전에 조직의 흡수 및 산란 계수에 상응하는 수 많은 양을 지도화하는 것을 추가로 포함한다. 단계 (c)의 형광 특징은 바람직하게는 형광 수명, 형광 양자 효율, 형광 수율 및 조영제 흡수 중의 한 가지 이상에 상응한다. 이러한 형광 특징은 바람직하게는 발광 세기 및 조영제 농도와 무관하다.
정량화 단계 (c)는 바람직하게는 (i) 해당 값의 추정치를 확립시키고, (ii) 이러한 추정치의 함수로서 계산된 발광을 결정하며, (iii) 상기 계산된 발광을 상기 탐지의 발광과 비교하여 에러를 결정하고, (iv) 에러의 함수로서 형광 특징의 변형된 추정치를 제공하는 것을 포함한다. 정량화는 바람직하게는 조직의 수학적 관계 모델링 다중 광-산란성 거동으로부터 해당 값을 결정하는 것을 포함한다. 제1 선택 방법은 바람직하게는 상기 형광 특징의 변동을 탐지함으로써 생체 내에서 조직의 대사 특성을 모니터링하는 것을 추가로 포함한다.
제5 국면의 광학 영상화를 사용하여 결장직장암 (CRC)의 관리를 용이하게 하는 데에 도움을 주는 것이 바람직하다. 용어 "CRC의 관리"는 질병의 탐지, 병기 분류, 진단, 질병 진행 모니터링 또는 치료 모니터링에 사용된다는 것을 의미한다. 적합한 광학 영상화 방법의 추가의 상세 내역이 다음 문헌에 고찰되었다 [참고: Sevick-Muraca et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 6, 642-650 (2002)].
제6 국면에서, 본 발명은 제5 국면의 생체내 광학 영상화 방법을 포함하는, 포유류 신체의 결장직장암 (CRC)을 탐지, 병기 분류, 진단, 질병 진행 모니터링 또는 치료 모니터링하는 방법을 제공한다.
본 발명은 다음에 상세된 비제한적 실시예에 의해 예시된다. 실시예 1은 본 발명의 cMBP 펩티드 (화합물 1)의 합성을 제공한다. 실시예 2는 음성 대조군으로서의 관련 펩티드의 합성을 제공하는데, 여기서는 화합물 1의 펩티드 서열을 스크램블링한다. 실시예 3은 본 발명의 바람직한 염료인 시아닌 염료 Cy5**의 합성을 제공한다. 실시예 4는 Cy5**의 활성 에스테르의 합성을 제공한다. 실시예 5는 본 발명의 시아닌 염료를 펩티드 (cMBP 펩티드 및 대조군)에 접합시키는 것을 제공한다. 화합물 3 내지 7을 이러한 방식으로 비교하였다. 실시예 6은 시험관 내에서 cMet에 대한 해당 펩티드의 친화도를 결정하는 방법을 제공한다. 이러한 결과는 심지어 광학 리포터 영상화 부분 (시아닌 염료)가 부착된 경우에도 결합이 선택적이라는 것을 보여준다. 실시예 7은 동물 암 모델에서 화합물 5 및 7의 생체내 시험에 대한 데이터를 제공한다. 탁월한 종양:배경 비가 화합물 5를 이용한 경우에 관찰된 반면, 화합물 7 (음성 대조군)은 종양과 배경을 구별하지 못하였다.
약어
통상적인 단일 문자 또는 3-문자 아미노산 약어가 사용된다.
Acm: 아세트아미도메틸
ACN (또는 MeCN): 아세토니트릴
Boc: 3급-부틸옥시카르보닐
DCM: 디클로로메탄
DMF: 디메틸포름아미드
DMSO: 디메틸설폭시드
Fmoc: 9-플루오레닐메톡시카르보닐
HBTU: O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트
HPLC: 고 성능 액체 크로마토그래피
HSPyU: O-(N-석신이미딜)-N,N,N',N'-테트라메틸렌우로늄 헥사플루오로포스페이트
NHS: N-히드록시-석신이미드
NMM: N-메틸모르폴린
NMP : 1-메틸-2-피롤리디논
Pbf: 2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조푸란-5-설포닐
PBS: 인산염 완충 식염수
tBu: t-부틸
TFA: 트리플루오로아세트산
TIS: 트리이소프로필실란
Trt: 트리틸.
Figure 112009069850449-PCT00009
Figure 112009069850449-PCT00010
실시예 1: 화합물 1의 합성
단계 (a): 보호된 전구체 선형 펩티드의 합성
전구체 선형 펩티드는 다음 구조를 갖는다:
Ac-Ala-Gly-Ser-Cys-Tyr-Cys(Acm)-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys(Acm)-Trp-Cys-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2.
펩티딜 수지 H-Ala-Gly-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Ser(tBu)-Gly-Pro-Pro-Arg(Pbf)-Phe-Glu(OtBu)-Cys(Acm)-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(ΨMe,Mepro)-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Gly-Gly-Gly-Lys(Boc)-중합체를, 0.1 mmol 링크 아미드 노바겔 (Rink Amide Novagel) 수지로 출발하는 Fmoc 화학을 이용하여 어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems) 433A 펩티드 합성기 상에서 어셈블리하였다. 과량의 1 mmol 예비-활성화 아미노산 (HBTU을 사용함)을 커플링 단계에 적용하였다. Glu-Thr 가성-프롤린 (Novabiochem 05-20-1122)을 상기 서열에 혼입시켰다. 수지를 질소 버블러 장치에 옮기고, DCM (5 ml)에 용해시킨 아세트산 무수물 (1 mmol) 및 NMM (1 mmol)의 용액으로 60분 동안 처리하였다. 이러한 무수물 용액을 여과시켜 제거하고, 수지를 DCM으로 세척한 다음, 질소 스트림 하에 건조시켰다.
측쇄 보호 기의 동시 제거와 수지로부터의 펩티드 절단은 2.5% TIS, 2.5% 4-티오크레졸 및 2.5% 물을 함유하는 TFA (10 ml)에서 2시간 30분 동안 수행하였다. 수지를 여과시켜 제거하고, TFA를 진공 하에 제거하며, 디에틸 에테르를 잔류물에 가하였다. 이로써 형성된 침전물을 디에틸 에테르로 세척하고, 공기 건조시켜 조 펩티드를 264 mg 수득하였다.
상기 조 펩티드를 정제용 HPLC [구배: 40분에 걸쳐 20-30% B (여기서, A = H2O/O.1% TFA 및 B = ACN/0.1% TFA, 유속: 10 ml/min), 칼럼: 페노메넥스 루나 (Phenomenex Luna) 5 μ C18 (2) 250 x 21.20 mm, 탐지: UV 214 nm, 생성물 체류 시간: 30분]에 의해 정제하여 순수한 화합물 1 선형 전구체를 100 mg 수득하였다. 이러한 순수한 생성물을 분석적 HPLC [구배: 10분에 걸쳐 10-40% B (여기서, A = H2O/O.1% TFA 및 B = ACN/0.1% TFA, 유속: 0.3 ml/min), 칼럼: 페노메넥스 루나 3 μ C18 (2) 50 x 2 mm, 탐지: UV 214 nm, 생성물 체류 시간: 6.54분]에 의해 분석하였다. 전자분무 질량 분광법을 이용하여 추가의 생성물 성상 확인을 수행하였다 (MH2 2+ 계산치: 1464.6, MH2 2+ 실측치: 1465.1).
단계 (b): 모노사이클릭 Cys4-16 디설파이드 브릿지의 형성
Cys4-16; Ac-Ala-Gly-Ser-Cys-Tyr-Cys(Acm)-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu- Cys(Acm)-Trp-Cys-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2.
단계 (a)로부터의 선형 전구체 (100 mg)를 5% DMSO/물 (200 ml)에 용해시키고, 암모니아를 이용하여 용액을 pH 6이 되도록 조정하였다. 반응 혼합물을 5일 동안 교반시켰다. 이어서, TFA를 이용하여 용액을 pH 2가 되도록 조정하고, 나머지 용매는 진공 하에 증발시켜 제거하였다. 잔류물 (40 ml)을 여러 번 나누어 생성물 정제를 위한 정제용 HPLC 칼럼 상으로 주사하였다.
상기 잔류물을 정제용 HPLC [구배: 10분 동안 0% B에 이어, 40분에 걸쳐 0-40% B (여기서, A = H2O/O.1% TFA 및 B = ACN/0.1% TFA, 유속: 10 ml/min), 칼럼: 페노메넥스 루나 5 μ C18 (2) 250 x 21.20 mm, 탐지: UV 214 nm, 생성물 체류 시간: 44분]에 의해 정제하여 순수한 화합물 1 모노사이클릭 전구체를 72 mg 수득하였다.
이러한 순수한 생성물 (이성체 P1 내지 P3의 혼합물로서 존재함)을 분석적 HPLC [구배: 10분에 걸쳐 10-40% B (여기서, A = H2O/O.1% TFA 및 B = ACN/0.1% TFA, 유속: 0.3 ml/min), 칼럼: 페노메넥스 루나 3 μ C18 (2) 50 x 2 mm, 탐지: UV 214 nm, 생성물 체류 시간: 5.37분 (P1); 5.61분 (P2); 6.05분 (P3)]에 의해 분석하였다. 전자분무 질량 분광법을 이용하여 추가의 생성물 성상 확인을 수행하였다 (MH2 2+ 계산치: 1463.6, MH2 2+ 실측치: 1464.1 (P1); 1464.4 (P2); 1464.3 (P3)).
단계 (c): 제2의 Cys6-14 디설파이드 브릿지 (화합물 1)의 형성
단계 (b)로부터의 모노사이클릭 전구체 (72 mg)를 질소 블랭킷 하에 75% AcOH/물 (72 ml)에 용해시켰다. 1 M HCl (7.2 ml) 및 AcOH 중의 0.05 M I2 (4.8 ml)을 언급된 순서로 가하고, 혼합물을 45분 동안 교반시켰다. 1 M 아스코르브산 (1 ml)을 가하여 무색 혼합물을 수득하였다. 대부분의 용매는 진공 하에 증발시키고, 잔류물 (18 ml)은 물/0.1% TFA (4 ml)로 희석시키고, 정제용 HPLC를 이용하여 생성물을 정제하였다.
상기 잔류물을 정제용 HPLC [구배: 10분 동안 0% B에 이어, 40분에 걸쳐 20-30% B (여기서, A = H2O/O.1% TFA 및 B = ACN/0.1% TFA, 유속: 10 ml/min), 칼럼: 페노메넥스 루나 5 μ C18 (2) 250 x 21.20 mm, 탐지: UV 214 nm, 생성물 체류 시간: 43-53분]에 의해 정제하여 순수한 화합물 1을 52 mg 수득하였다. 이러한 순수한 생성물을 분석적 HPLC [구배: 10분에 걸쳐 10-40% B (여기서, A = H2O/O.1% TFA 및 B = ACN/0.1% TFA, 유속: 0.3 ml/min), 칼럼: 페노메넥스 루나 3 μ C18 (2) 50 x 2 mm, 탐지: UV 214 nm, 생성물 체류 시간: 6.54분]에 의해 분석하였다. 전자분 무 질량 분광법을 이용하여 추가의 생성물 성상 확인을 수행하였다 (MH2 2+ 계산치: 1391.5, MH2 2+ 실측치: 1392.5).
실시예 2: 화합물 2의 합성
Ac-Thr-Gly-Glu-Cys-Thr-Cys(Acm)-Pro-Tyr-Trp-Glu-Phe-Arg-Pro-Cys(Acm)-Glu-Cys-Gly-Ser-Tyr-Ser-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2.
화합물 2는 화합물 1의 펩티드 서열을 스크램블링시킨 음성 대조군이다.
단계 (a): 보호된 전구체 선형 펩티드의 합성
펩티딜 수지 H-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Pro-Tyr(tBu)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Arg(Pbf)-Pro-Cys(Acm)-Glu(OtBu)-Cys(Trt)-Gly-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(ΨMe,Mepro)-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Lys(Boc)-중합체를, 0.1 mmol 링크 아미드 노바겔 수지로 출발하는 Fmoc 화학을 이용하여 어플라이드 바이오시스템즈 433A 펩티드 합성기 상에서 어셈블리하였다. 과량의 1 mmol 예비-활성화 아미노산 (HBTU을 사용함)을 커플링 단계에 적용하였다. Tyr-Ser 가성-프롤린 (Novabiochem 05-20-1014)을 상기 서열에 혼입시켰다. 수지를 질소 버블러 장치에 옮기고, DCM (5 ml)에 용해시킨 아세트산 무수물 (1 mmol) 및 NMM (1 mmol)의 용액으로 60분 동안 처리하였다. 이러한 무수물 용액을 여과시켜 제거하고, 수지를 DCM으로 세척한 다음, 질소 스트림 하에 건조시켰다.
측쇄 보호 기의 동시 제거와 수지로부터의 펩티드 절단은 2.5% TIS, 2.5% 4- 티오크레졸 및 2.5% 물을 함유하는 TFA (10 ml)에서 2시간 10분 동안 수행하였다. 수지를 여과시켜 제거하고, TFA를 진공 하에 제거하며, 디에틸 에테르를 잔류물에 가하였다. 이로써 형성된 침전물을 디에틸 에테르로 세척하고, 공기 건조시켜 조 펩티드를 216 mg 수득하였다.
상기 조 펩티드를 정제용 HPLC [구배: 40분에 걸쳐 20-30% B (여기서, A = H2O/O.1% TFA 및 B = ACN/0.1% TFA, 유속: 50 ml/min), 칼럼: 페노메넥스 루나 5 μ C18 (2) 250 x 50 mm, 탐지: UV 214 nm, 생성물 체류 시간: 34.1분]에 의해 정제하여, 200 ml의 ACN/물에 용해된 순수한 DX-1662 음성 대조군 선형 전구체를 수득하였다. 이러한 순수한 생성물을 분석적 HPLC [구배: 5분에 걸쳐 10-40% B (여기서, A = H2O/O.1% TFA 및 B = ACN/0.1% TFA, 유속: 0.6 ml/min), 칼럼: 페노메넥스 루나 3 μ C18 (2) 20 x 2 mm, 탐지: UV 214 nm, 생성물 체류 시간: 3.52분]에 의해 분석하였다. 전자분무 질량 분광법을 이용하여 추가의 생성물 성상 확인을 수행하였다 (MH2 2+ 계산치: 1464.6, MH2 2+ 실측치: 1464.9).
단계 (b): 모노사이클릭 Cys4-16 디설파이드 브릿지의 형성
Cys4-16; Ac-Thr-Gly-Glu-Cys-Thr-Cys(Acm)-Pro-Tyr-Trp-Glu-Phe-Arg-Pro-Cys(Acm)-Glu-Cys-Gly-Ser-Tyr-Ser-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2.
DMSO (10 ml)를 단계 (a)로부터의 음성 대조군 선형 전구체 용액 (200 ml, 참고: 4.3.1)에 가하고, 암모니아를 이용하여 용액을 pH 7이 되도록 조정하였다. 반응 혼합물을 40℃ 하에 18시간 동안 가열한 다음, 60℃ 하에 60분 동안 가열하였다. TFA를 이용하여 용액을 pH 2가 되도록 조정하고, ACN을 진공 하에 증발시켜 제거하였다. 잔류물을 대상으로 하여 정제용 HPLC 정제하였다.
상기 잔류물을 정제용 HPLC [구배: 5분 동안 0% B에 이어, 60분에 걸쳐 20-30% B (여기서, A = H2O/O.1% TFA 및 B = ACN/0.1% TFA, 유속: 50 ml/min), 칼럼: 페노메넥스 루나 5 μ C18 (2) 250 x 50 mm, 탐지: UV 214 nm, 생성물 체류 시간: 29.6분]에 의해 정제하여 100 ml의 ACN/물 중의 순수한 음성 대조군 모노사이클릭 전구체를 수득하였다. 이러한 순수한 생성물을 분석적 HPLC [구배: 5분에 걸쳐 10-40% B (여기서, A = H2O/O.1% TFA 및 B = ACN/0.1% TFA, 유속: 0.6 ml/min), 칼럼: 페노메넥스 루나 3 μ C18 (2) 20 x 2 mm, 탐지: UV 214 nm, 생성물 체류 시간: 3.46분]에 의해 분석하였다. 전자분무 질량 분광법을 이용하여 추가의 생성물 성상 확인을 수행하였다 (MH2 2+ 계산치: 1463.6, MH2 2+ 실측치: 1463.7).
단계 (c): 제2의 Cys6-14 디설파이드 브릿지 (화합물 2)의 형성
Cys4-16, 6-14; Ac-Thr-Gly-Glu-Cys-Thr-Cys-Pro-Tyr-Trp-Glu-Phe-Arg-Pro-Cys-Glu-Cys-Gly-Ser-Tyr-Ser-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2.
단계 (b)로부터의 음성 대조군 모노사이클릭 전구체 용액 (100 ml)를 AcOH (100 ml)로 희석시켰다. 1 M HCl (5 ml) 및 AcOH 중의 0.05 M I2 (7 ml)을 아르곤 블랭킷 하에 언급된 순서로 가하고, 혼합물을 20분 동안 교반시켰다. 1 M 아스코 르브산 (1 ml)을 가하여 무색 혼합물을 수득하였다. 대부분의 용매는 진공 하에 증발시키고, 잔류물 (30 ml)은 물/0.1% TFA (100 ml)로 희석시키고, 정제용 HPLC를 이용하여 생성물을 정제하였다.
상기 잔류물을 정제용 HPLC [구배: 10분 동안 0% B에 이어, 60분에 걸쳐 20-30% B (여기서, A = H2O/O.1% TFA 및 B = ACN/0.1% TFA, 유속: 50 ml/min), 칼럼: 페노메넥스 루나 5 μ C18 (2) 250 x 50 mm, 탐지: UV 214 nm, 생성물 체류 시간: 32.8분]에 의해 정제하여 순수한 화합물 2를 30 mg 수득하였다. 이러한 순수한 생성물을 분석적 HPLC [구배: 10분에 걸쳐 10-40% B (여기서, A = H2O/O.1% TFA 및 B = ACN/0.1% TFA, 유속: 0.3 ml/min), 칼럼: 페노메넥스 루나 3 μ C18 (2) 50 x 2 mm, 탐지: UV 214 nm, 생성물 체류 시간: 6.54분]에 의해 분석하였다. 전자분무 질량 분광법을 이용하여 추가의 생성물 성상 확인을 수행하였다 (MH2 2+ 계산치: 1391.5, MH2 2+ 실측치: 1392.5).
실시예 3: 시아닌 염료 2-{(lE,3E,5E)-5-[1-(5-카르복시펜틸)-3,3-디메틸-5-설포-l,3-디히드로-2H-인돌-2-일리덴]펜타-l,3-디에닐}-3-메틸-1,3-비스(4-설포부틸)-3H-인돌륨-5-설포네이트 (Cy5**)의 합성
Figure 112009069850449-PCT00011
(3a) 5- 메틸 -6- 옥소헵탄 -1- 설폰산
Figure 112009069850449-PCT00012
DMF (25 ml) 중의 에틸 2-메틸아세토아세테이트 (5O g)를 DMF (100 ml) 중의 수화나트륨 현탁액 (12.O g의 광유 중 60% NaH)에 가하고, 1시간 걸쳐 빙욕 냉각시키면서 적가하였다 (내부 온도 0 내지 4℃). 이 혼합물을 재냉각시키기 전에 교반시키면서 45분 동안 주위 온도로 가온시켰다. 이어서, DMF (25 ml) 중의 1,4-부탄설톤 (45 g) 용액을 15분에 걸쳐 적가하였다. 최종 혼합물을 60℃ 하에 18시간 동안 가열하였다. 용매를 회전 증발시켜 제거하고, 잔류물을 물과 디에틸 에테르로 분별시켰다. 수성 층을 수집하고, 신선한 디에틸 에테르로 세척한 다음, 회전 증발시켜 점성 발포체를 수득하였다. 중간체를 물 (100 ml)에 용해시키고, 수산화나트륨 (17.8 g)을 교반시키면서 15분에 걸쳐 가하였다. 혼합물을 90℃ 하에 18시간 동안 가열하였다. 냉각된 반응 혼합물에 진한 염산 (약 40 ml)을 부가함으로써 pH 약 2가 되도록 조정하였다. 용액을 회전 증발시키고, 진공 하에 건조시켰다. 황색 고체를 2% 염산 함유 에탄올로 세척하였다 (3 x 150 ml). 에탄올성 용액을 여과시키고, 회전 증발시킨 다음 진공 하에 건조시켜 황색 고체를 수득하였다. 수득 량 7O g.
(3b) 2,3-디메틸-3-(4-설포부틸)-3H-인돌-5-설폰산, 이칼륨 염
Figure 112009069850449-PCT00013
4-히드라지노벤젠설폰산 (4O g), 5-메틸-6-옥소헵탄-1-설폰산 (3a로부터 유래됨; 6O g) 및 아세트산 (500 ml)을 혼합하고, 환류 하에 6시간 동안 가열하였다. 용매를 여과시키고, 회전 증발시킨 다음, 진공 하에 건조시켰다. 고체를 메탄올 (1 L)에 용해시켰다. 이에 2 M 메탄올성 수산화칼륨 (300 ml)을 가하였다. 혼합물을 3시간 동안 교반시킨 다음, 회전 증발을 이용하여 용매 용적을 50% 정도 감소시켰다. 이로써 생성된 침전물을 여과시키고, 메탄올로 세척한 다음 진공 하에 건조시켰다. 수득량 6O g. MS (LCMS): MH+ 362. Acc. Mass: 실측치, 362.0729. MH+ = C14H20NO6S2는 m/z 362.0732 (-0.8 ppm)을 요구한다.
(3c) 2,3-디메틸-1,3-비스(4-설포부틸)-3H-인돌륨-5-설포네이트, 이칼륨 염
Figure 112009069850449-PCT00014
2,3-디메틸-3-(4-설포부틸)-3H-인돌-5-설폰산 (3b로부터 유래됨; 6O g)을 1,4 부탄 설톤 (180 g) 및 테트라메틸렌 설폰 (146 ml)과 함께 140℃ 하에 16시간 동안 가열하였다. 이로써 생성되는 적색 고체를 디에틸 에테르로 세척하고, 분말 이 되도록 분쇄한 다음 진공 하에 건조시켰다. 수득량 6O g.
(3d) Cy5** (TFA 염으로서 존재함)
1-(5'-카르복시펜틸)-2,3,3-트리메틸-인돌레늄 브로마이드-5-설폰산, K+ 염 (2.7 g), 말론알데히드 비스(페닐이민) 모노히드로클로라이드 (960 mg), 아세트산 무수물 (36 ml) 및 아세트산 (18 ml)을 120℃ 하에 1시간 동안 가열하여 암적갈색 용액을 수득하였다. 반응 혼합물을 주위 온도로 냉각시켰다. 2,3-디메틸-1,3-비비스(4-설포부틸)-3H-인돌륨-5-설포네이트 (3c로부터 유래됨; 8.1 g) 및 칼륨 아세테이트 (4.5 g)를 상기 혼합물에 가하고, 이를 주위 온도 하에 18시간 동안 교반시켰다. 이로써 생성되는 청색 용액을, 에틸 아세테이트를 이용하여 침전시키고 진공 하에 건조시켰다. 조 염료를 액체 크로마토그래피 (RPC18. 물 + 0.1% TFA/MeCN + 0.1% TFA 구배)에 의해 정제하였다. 주요 염료 피크를 함유하는 분획을 수집하고, 풀링한 다음, 진공 하에 증발시켜 표제 염료를 2 g을 수득하였다. UV/Vis (물+0.1% TFA): 650 nm. MS (MALDI-TOF): MH+ 887.1. MH+ = C38H50N2O14S4는 m/z 887.1을 요구한다.
실시예 4: 2-[(1E,3E,5E)-5-(1-{6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}-3,3-디메틸-5-설포-1,3-디히드로-2H-인돌-2-일리덴)펜타-1,3-디에닐]-3-메틸-1,3-비스(4-설포부틸)-3H-인돌륨-5-설포네이트, 디이소프로필에틸아민 염 (Cy5**의 NHS 에스테르)의 합성
Figure 112009069850449-PCT00015
Cy5** (실시예 3; lO mg)를 무수 DMSO (3 ml)에 용해시키고; 이에 HSPyU (20 mg) 및 N,N'-디이소프로필에틸아민 (80 ㎕)을 가하였다. 이로써 생성되는 용액을 3시간 동안 혼합하였는데, 이때 TLC (RPC18. 물/MeCN)는 완전한 반응을 나타내었다. 염료를 에틸 아세테이트/디에틸 에테르에 침전시킴으로써 분리시키고, 여과시키며, 에틸 아세테이트로 세척한 다음 진공 하에 건조시켰다. UV/Vis (물) 650 nm. MS (MALDI-TOF) MH+ 983.5. MH+ = C42H53N3O16S4는 m/z 984.16을 요구한다.
실시예 5: 염료의 접합, 화합물 3 내지 7의 합성
Cys4-16, 6-14; Ac-Ala-Gly-Ser-Cys-Tyr-Cys-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys-Trp-Cys-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys(Cy5)-NH2 (화합물 3).
화합물 1 (10 mg), NMM (4 ㎕) 및 Cy5 NHS 에스테르 (5.7 mg; GE Healthcare PA15104)를 NMP (1 ml)에 용해시키고, 반응 혼합물을 7시간 동안 교반시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 5% ACN/물 (8 ml)로 희석시키고, 정제용 HPLC를 이용하여 생성물을 정제하였다.
상기 조 펩티드를 정제용 HPLC [구배: 40분에 걸쳐 5-50% B (여기서, A = H2O/O.1% HCOOH 및 B = ACN/0.1% HCOOH, 유속: 10 ml/min), 칼럼: 페노메넥스 루나 5 μ C18 (2) 250 x 21.20 mm, 탐지: UV 214 nm, 생성물 체류 시간: 35.5분]에 의해 정제하여 순수한 화합물 3을 8.1 mg 수득하였다. 이러한 순수한 생성물을 분석적 HPLC [구배: 10분에 걸쳐 5-50% B (여기서, A = H2O/O.1% HCOOH 및 B = ACN/0.1% HCOOH, 유속: 0.3 ml/min), 칼럼: 페노메넥스 루나 3 μ C18 (2) 50 x 2 mm, 탐지: UV 214 nm, 생성물 체류 시간: 8.15분]에 의해 분석하였다. 전자분무 질량 분광법을 이용하여 추가의 생성물 성상 확인을 수행하였다 (MH2 2+ 계산치: 1710.6, MH2 2+ 실측치: 1711.0).
유사한 방식 - 전자분무 질량 분광법으로 화합물 4를 제조하였다
(MH2 2+ 계산치: 1710.6, MH2 2+ 실측치: 1710.9).
유사한 방법으로 기타 염료-펩티드 접합체 (화합물 5 내지 7)를 제조하였다. Alexa647은 공급처 [Molecular Probes (A20106)]로부터 구입하였다:
화합물 5 (MH2 2+ 계산치: 1825.7, MH2 2+ 실측치: 1825.9),
화합물 6 (MH2 2+ 계산치: 1811.7, MH2 2+ 실측치: 1812.0),
화합물 7 (MH2 2+ 계산치: 1825.7, MH2 2+ 실측치: 1826.2).
실시예 6: 시험관내 형광 편광 검정
형광 편광 방법의 원리는 다음과 같이 간략하게 기재될 수 있다:
단색 광은 수평 편광 필터를 관통하여 샘플 중의 형광성 분자를 여기시킨다. 수직 편광된 평면으로 적당히 배향된 분자 만이 빛을 흡수하고, 여기되며, 연속해서 빛을 방출시킨다. 이와 같이 방출된 빛을 수평 평면과 수직 평면 둘 다에서 측정하였다. 아니스트로피 (anistropy) 값 (A)은 다음 방정식에 따르는 광 세기 간의 비이다:
A = 수평 편광자를 이용한 경우의 세기 - 수직 편광자를 이용한 경우의 세기
수평 편광자를 이용한 경우의 세기 + 2* 수직 편광자를 이용한 경우의 세기
형광 아니스트로피 측정은 ex646/em678 nm에서 테칸 사파이어 (Tecan Safire) 형광 편광 판 판독기 (공급처; Tecan, US)를 사용하여 결합 완충액 (PBS, 0.01% Tween-20, pH 7.5) 중의 10 ㎕ 용적의 384-웰 미소판에서 수행하였다. 염료-표지된 펩티드의 농도는 일정하게 유지시키고 (2O nM), 인간 또는 마우스 c-Met/Fc 키메라 (공급처: R&D Systems) 또는 세마포린 (Semaphorin) 6A (공급처: R&D Systems)의 농도는 0 내지 150 nM로 다양하게 하였다. 결합성 혼합물을 30℃ 하에 10분 동안 미소역가 판에서 평형시켰다. 아니스트로피 상에서 관찰된 변화를 다음 방정식에 고정시켰다:
Figure 112009069850449-PCT00016
상기에서, robs는 관찰된 아니스트로피이고, rfree는 자유 펩티드의 아니스트로피이며, rbound는 결합된 펩티드의 아니스트로피이고, KD는 해리 상수이며, cMet는 총 c-Met 농도이고, P는 총 염료-표지된 펩티드 농도이다. 상기 방정식은 합성 펩티드와 수용체가 1:1 화학량론으로 용액 중에서 가역적 복합체를 형성한다고 가정하였다. 데이터 고정은 그래프패드 프리즘 (GraphPad Prism) 소프트웨어를 사용하여 비선형 회귀를 통하여 수행하여 KD 값을 수득하였다 (1-부위 결합).
화합물 3 및 4를 대상으로 하여 인간 및 마우스 c-Met (Fc 키메라)에 대한 결합에 관하여 시험하였다. 그 결과, 인간 c-Met과의 화합물 3 결합에 대한 KD가 3±1 nM인 것으로 나타났다. 화합물 4는 인간 c-Met와 결합하지 않았다. 추가로, 화합물 3 및 4는 시험된 범위에서 마우스 c-Met과 결합하지 않은 것으로 나타났다. 동일한 방법을 사용하여, 화합물 5는 인간 cMet에 대한 KD가 1.1 nM인 것으로 밝혀졌다.
실시예 7: 화합물 5 및 7의 생체내 시험
(a) 동물 모델
54마리 암컷 BALB c/A 누드 (Bom) 마우스를 본 연구에 사용하였다. 동물 사용은 지역 윤리 위원회에서 승인하였다. BALB c/A 누드는 기타 누드 마우스 균주와 비교해서 인간 종양에 대한 포획률이 높은 면역 기능 저하된 마우스 근친계이다. 마우스는 도착시 4주생이었고, 연구 시작시 체중이 대략 20 그램이었다. 상기 동물은 HEPA 여과된 공기가 주입되는, 개별적으로 환기된 우리 (공급처; IVC, Scanbur BK)에서 사육하였다. 동물은 "랫트와 마우스 nr. 3 번식" 식이 (Scanbur BK)에 임의로 접근하였고, HCl을 몰 농도 1 mM이 되도록 가함으로써 수돗물을 산성 화시켰다 (pH 3.0).
결장암 세포 HCT-15는 인간 결장 암종으로부터 유래된 것이고, 이는 다음 문헌에 따라서 c-Met를 발현시키는 것으로 보고되었다 [참고: Zeng et al., Clin. Exp. Metastasis, 21, 409-417. (2004)]. 상기 세포주는 누드 마우스 내로 피하 접종되는 경우에 종양원성인 것으로 입증되었다 [참고: Flatmark et al, Eur. J. Cancer 40, 1593-1598 (2004)].
HCT-15 세포를 성장시키고, 10% 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 수반한 RPMI (Sigma Cat # R0883)에서의 피하 접종용으로 제조하였다. 스톡을 계대접종 4회 (P4) 째에 만들었고, 이를 5% DMSO를 함유하는 배양 배지에서 3 x 107개 세포/바이알로 액체 질소에서 저장하기 위해 동결시켰다. 이식 당일에는, 세포를 37℃ 수욕에서 신속하게 해동시키고 (대략 2분), 세척한 다음, PBS/2% 혈청에 재현탁시켰다 (10분 동안 1200 rpm으로 원심분리시킴). 바이알에서 세포를 철저히 혼합하여 매번 세포를 투약 주사기 내로 흡인시켰다. 동물을 약한 기체 마취제 하에 두면서 미세 구멍 바늘 (25 G)을 이용하여 0.1 ml 용적의 세포 현탁액을 어깨와 등에 피하 주사하였다. 이어서, 동물을 우리로 돌려보내고 13일 내지 17일 동안 종양이 성장하도록 두었다. 접종 과정 이전에 동물에게 5일 이상 동안 새환경에 순응하도록 하였다.
(b) 과정
모든 시험 물질은 동결 건조된 분말로부터 PBS와 재구성하였다. 백색 프린 터 종이의 소형 스택을 영상화하여 편평한 시야 영상을 수득하고, 이를 사용하여 조사 불균질성을 교정하였다. 신체를 고정시키는 동안 시험 물질을 미부 측면 정맥에 정맥내 주사하였다. 주사 용적은 0.1 ml인데, 이는 동물 1마리당 1 nmol 시험 물질 용량에 상응한다. 주사 후, 동물을 그들 우리로 돌려 보냈다. 영상화하기 직전에 경추 탈구시킴으로써 동물을 희생시켰다. 각 시험 물질에 대한 최적의 영상화 시점은 제한된 수의 동물에서 (n=1-6) 피부 및 근육 조직에서의 장세척 속도를 비교하여 평가하였다. 화합물 3 및 4에 대한 영상화 시점은 주사 후 120분째였다. 각 동물에 대해, 피하 성장된 종양을 사후에 절제하였다. 두께가 대략 1.6 mm이고 직경이 3 내지 4 mm인 얇은 슬라이드를 종양 중의 하나의 가장자리로부터 절단 제거하였다. 이어서, 종양 슬라이스를 동일한 동물로부터의 정상 결장 부위에 대항하여 영상화하였다.
(c) 영상화
리포터를 여기시키기 위한 광원과 형광 성분을 추출시키기 위한 필터링 시스템을 사용하도록 적응시킨 임상 복강경을 통하여 영상화를 수행하였다. 리포터 분자를 여기시키기 위해 635 nm 레이저를 사용하였다. 하마마쓰 (Hamamatsu) ORCA ERG CCD 카메라를 탐지기로서 사용하였다. 이 카메라는 0 증폭을 수반한 2x2 바이닝 모드 (binning mode)로 작동하였다. 결장 영상화하기 위한 표준 노출 시간은 10초였다. 시스템 구경 측정은 동물 영상화 시스템을 이용한 10초 노출 시간이 임상적으로 관련이 있는 광원, 시계, 및 조직 표면까지의 거리를 이용한 40 ms 노출에 상응한다는 것을 나타낸다. 영상 내의 세기 분포도는 시스템 구경 측정 데이터 를 통하여 조사 불균질성에 대해 교정하였다. 표적 대 배경 비는 종양, 및 정상 결장 배경 위에 놓여진 관심있는 부위로부터 연산처리하였다. 수신자 작동 특징 분석에 이용된 표준 스코어링 시스템을 사용하여 영상을 가시적으로 스코어링하였다.
(d) 결과
화합물 5는 종양 대 정상 비가 1.46:1였고, 동일한 염료를 이용한 상응하는 스크램블링된 대조군 펩티드 (화합물 7)는 종양 대 정상 비가 1.04:1였다. 화합물 5는 용이하게 확인 가능한 종양을 갖고 있는 반면, 화합물 7을 이용한 경우에는 배경에 대항하여 전혀 식별 가능하지 않았다.
SEQUENCE LISTING <110> GE Healthcare AS <120> Peptide Imaging Agents <130> PN0744 WO <160> 7 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic peptide <220> <221> DISULFID <222> (1)..(13) <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> N, H or Y <220> <221> DISULFID <222> (3)..(11) <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> G, S, T or N <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> T or R <220> <221> VARIANT <222> (15)..(15) <223> A, D, E, G or S <220> <221> VARIANT <222> (16)..(16) <223> S or T <220> <221> VARIANT <222> (17)..(17) <223> D or E <400> 1 Cys Xaa Cys Xaa Gly Pro Pro Xaa Phe Glu Cys Trp Cys Tyr Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 2 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic peptide <220> <221> DISULFID <222> (2)..(14) <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> N, H OR Y <220> <221> DISULFID <222> (4)..(12) <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> G, S, T or N <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> T or R <220> <221> VARIANT <222> (16)..(16) <223> A, D, E, G or S <220> <221> VARIANT <222> (17)..(17) <223> S or T <220> <221> VARIANT <222> (18)..(18) <223> D or E <400> 2 Ser Cys Xaa Cys Xaa Gly Pro Pro Xaa Phe Glu Cys Trp Cys Tyr Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa <210> 3 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic peptide <220> <221> DISULFID <222> (4)..(16) <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> N, H or Y <220> <221> DISULFID <222> (6)..(14) <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> G, S, T or N <220> <221> VARIANT <222> (11)..(11) <223> T or R <220> <221> VARIANT <222> (18)..(18) <223> A, D, E, G or S <220> <221> VARIANT <222> (19)..(19) <223> S or T <220> <221> VARIANT <222> (20)..(20) <223> D or E <400> 3 Ala Gly Ser Cys Xaa Cys Xaa Gly Pro Pro Xaa Phe Glu Cys Trp Cys 1 5 10 15 Tyr Xaa Xaa Xaa Gly Thr 20 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic peptide <400> 4 Gly Gly Gly Lys 1 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic peptide <400> 5 Gly Ser Gly Lys 1 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic peptide <400> 6 Gly Ser Gly Ser Lys 1 5 <210> 7 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic peptide <220> <221> DISULFID <222> (4)..(16) <220> <221> DISULFID <222> (6)..(14) <400> 7 Ala Gly Ser Cys Tyr Cys Ser Gly Pro Pro Arg Phe Glu Cys Trp Cys 1 5 10 15 Tyr Glu Thr Glu Gly Thr Gly Gly Gly Lys 20 25

Claims (28)

  1. 하기 화학식 I의 접합체를 포함하는 조영제:
    <화학식 I>
    Figure 112009069850449-PCT00017
    상기 식에서,
    Z1은 cMBP의 N-말단에 부착되고, H 또는 MIG이며;
    Z2는 cMBP의 C-말단에 부착되고, OH, OBc, 또는 MIG (여기서, Bc는 생체적합성 양이온이다)이며;
    cMBP는 아미노산 서열 (서열 1):
    Cysa-X1-Cysc-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cysd-Typ-Cysb-Tyr-X4-X5-X6
    [여기서, X1은 Asn, His 또는 Tyr이고;
    X2는 Gly, Ser, Thr 또는 Asn이며;
    X3은 Thr 또는 Arg이고;
    X4는 Ala, Asp, Glu, Gly 또는 Ser이며;
    X5는 Ser 또는 Thr이고;
    X6은 Asp 또는 Glu이며;
    Cysa-d는 각각 시스테인 잔기여서 잔기 a 및 b 뿐만 아니라 c 및 d가 고리화되어 2개의 별개의 디설파이드 결합을 형성한다]
    을 포함하는 17 내지 30개 아미노산의 cMet 결합성 사이클릭 펩티드이고;
    MIG는 상기 펩티드의 생체내 대사를 억제하거나 저해하는 생체적합성 기인 대사 억제성 기이며;
    L은 화학식 -(A)m-의 합성 링커 기 [여기서, A는 각각 독립적으로 -CR2-, -CR=CR-, -C≡C-, -CR2CO2-, -CO2CR2-, -NRCO-, -CONR-, -NR(C=O)NR-, -NR(C=S)NR-, -SO2NR-, -NRSO2-, -CR2OCR2-, -CR2SCR2-, -CR2NRCR2-, C4-8 시클로헤테로알킬렌 기, C4-8 시클로알킬렌 기, C5-12 아릴렌 기, 또는 C3-12 헤테로아릴렌 기, 아미노산, 당 또는 단분산 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 빌딩 블록이고;
    R은 각각 독립적으로 H, C1-4 알킬, C2-4 알케닐, C2-4 알키닐, C1-4 알콕시알킬 또는 C1-4 히드록시알킬 중에서 선택되며;
    m은 1 내지 20의 정수이다]이고;
    n은 0 또는 1의 정수이며;
    IM은 녹색 내지 근적외선 파장 600 내지 1200 nm의 빛을 이용하여 포유류 신 체를 생체내 영상화하는데 적합한 광학 리포터 영상화 부분이다.
  2. 제1항에 있어서, 서열 1 이외에도, cMBP가 C- 또는 N-cMBP 펩티드 말단의 4개 아미노산 잔기 내에 Asp 또는 Glu 잔기를 추가로 포함하고, -(L)n[IM]이 상기 Asp 또는 Glu 잔기의 카르복실 측쇄에 접합되는 아민 기로 관능화되어 아미드 결합을 제공하는 것인 조영제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 1 이외에도, cMBP가 C- 또는 N-cMBP 펩티드 말단의 4개 아미노산 잔기 내에 Lys 잔기를 포함하고, -(L)n[IM]이 상기 Lys 잔기의 엡실론 아민 측쇄에 접합되는 카르복실 기로 관능화되어 아미드 결합을 제공하는 것인 조영제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, cMBP가 하기 서열 2 또는 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조영제:
    Ser-Cysa-X1-Cysc-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-X4-X5-X6 (서열 2);
    Ala-Gly-Ser-Cysa-X1-Cysc-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-X4-X5-X6-Gly-Thr (서열 3).
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, X3이 Arg인 조영제.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 1, 서열 2 또는 서열 3 이외에도, cMBP가 N- 또는 C-말단에 -Gly-Gly-Gly-Lys- (서열 4), -Gly-Ser-Gly-Lys- (서열 5) 또는 -Gly-Ser-Gly-Ser-Lys- (서열 6) 중에서 선택되는 링커 펩티드를 추가로 포함하는 것인 조영제.
  7. 제6항에 있어서, cMBP가 Ala-Gly-Ser-Cysa-Tyr-Cysc-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys (서열 7)의 아미노산 서열을 갖는 것인 조영제.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, Z1과 Z2 둘 다가 독립적으로 MIG인 조영제.
  9. 제8항에 있어서, Z1이 아세틸이고 Z2가 1급 아미드인 조영제.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, n이 0인 조영제.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, IM이 600 내지 1000 nm 범위에서 최대 흡광도를 갖는 염료인 조영제.
  12. 제11항에 있어서, IM이 시아닌 염료인 조영제.
  13. 제12항에 있어서, 시아닌 염료가 하기 화학식 III을 갖는 것인 조영제:
    <화학식 III>
    Figure 112009069850449-PCT00018
    상기 식에서,
    R1 및 R2는 독립적으로 H 또는 -SO3M1이고, R1 및 R2 중의 적어도 하나는 -SO3M1이며 (여기서, M1은 H 또는 Bc이다);
    R3 및 R4는 독립적으로 C1-4 알킬 또는 C1-6 카르복시알킬이고;
    R5, R6, R7 및 R8은 독립적으로 Ra 기 [여기서, Ra는 C1-4 알킬, C1-6 카르복시 알킬 또는 -(CH2)kSO3M1 (여기서, k는 3 또는 4의 정수이다)이다]이되,
    단 시아닌 염료는 R1, R2 및 Ra 기 내에 총 1 내지 4개의 SO3M1 치환체를 갖는다.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, cMBP가 제7항에서 정의된 바와 같고, Z1 및 Z2가 제9항에서 정의된 바와 같으며, IM이 제3항 및 제13항에서 정의된 바와 같은 것인 조영제.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 조영제를 생체적합성 담체와 함께 포함하는, 포유류 투여에 적합한 형태의 제약 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 단일 환자에 적합한 투여량을 갖고 있으며, 적합한 주사기 또는 용기에 공급되는 제약 조성물.
  17. (i) Z1이 H이고 Z2가 MIG인 화학식 Z1-[cMBP]-Z2의 cMBP 펩티드를 화학식 Y1-(L)n-[IM]의 화합물과 반응시켜, [IM]이 Z1 위치에서 접합되는 화학식 I의 조영제를 수득하는 단계;
    (ii) Z1=Z2=MIG이고 cMBP가 C- 또는 N-cMBP 펩티드 말단의 4개 아미노산 잔기 내에 Asp 또는 Glu 잔기를 포함하고, cMBP 펩티드의 기타 모든 Asp/Glu 잔기가 보호되는 화학식 Z1-[cMBP]-Z2의 cMBP 펩티드를 화학식 Y2-(L)n-[IM]의 화합물과 반응시켜, [IM]이 cMBP 펩티드의 상기 Asp 또는 Glu 잔기에서 접합되는 화학식 I의 조영제를 수득하는 단계;
    (iii) Z1이 MIG이고 Z3이 Z2 기 또는 활성화 에스테르이며, cMBP 펩티드의 기타 모든 Asp/Glu 잔기가 보호되는 화학식 Z1-[cMBP]-Z3의 cMBP 펩티드를 화학식 Y2-(L)n-[IM]의 화합물과 반응시켜, [IM]이 Z2 위치에서 접합되는 화학식 I의 조영제를 수득하는 단계;
    (iv) Z1=Z2=MIG이고 cMBP가 C- 또는 N-cMBP 펩티드 말단의 4개 아미노산 잔기 내에 Lys 잔기를 포함하는 화학식 Z1-[cMBP]-Z2의 cMBP 펩티드를 화학식 Y1-(L)n-[IM]의 화합물과 반응시켜, [IM]이 cMBP 펩티드의 Lys 잔기에서 접합되는 화학식 I의 조영제를 수득하는 단계
    [상기에서, Z1, cMBP, Z2, MIG, L, n 및 IM은 제1항에서 정의된 바와 같고,
    Z3은 Z2 기 또는 활성화 에스테르이며;
    Y1은 카르복실산, 활성화 에스테르, 이소티오시아네이트 또는 티오시아네이트 기이고;
    Y2는 아민 기이다]
    중의 하나를 포함하는, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 조영제의 제조 방법.
  18. 제17항에 있어서, 단계 (iv)의 반응이 사용되는 방법.
  19. 멸균성 고체 형태의 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 조영제를 포함하며, 제15항 또는 제16항의 생체적합성 담체의 멸균성 공급물과의 재구성시 분해가 일어나 목적하는 제약 조성물을 제공해 주는, 제15항 또는 제16항의 제약 조성물을 제조하기 위한 키트.
  20. 제19항에 있어서, 멸균성 고체 형태가 동결건조된 고체인 키트.
  21. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 조영제 또는 제15항 또는 제16항의 제약 조성물을 사용하여 생체내 cMet 과발현 또는 국재화 부위의 영상을 수득하는 것을 포함하는, 포유류 신체의 생체내 광학 영상화 방법.
  22. 제21항에 있어서, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 조영제 또는 제15항 또는 제16항의 제약 조성물을 상기 포유류 신체에 미리 투여하는 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    (i) 포유류 신체 내의 관심있는 조직 표면을 여기 광으로 조사하는 단계;
    (ii) 영상화 부분 (IM)의 여기에 의해 생성되는, 조영제로부터의 형광을 형광 탐지기로 탐지하는 단계;
    (iii) 형광 탐지기에 의해 탐지된 빛을 임의로 여과시켜 형광 성분을 분리하는 단계;
    (iv) 상기 관심있는 조직 표면의 영상을 단계 (ii) 또는 (iii)의 형광성 광으로부터 형성하는 단계
    를 포함하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 단계 (i)의 여기 광이 사실상 연속 파 (CW)인 방법.
  25. 제22항에 있어서,
    (a) 불균질한 조성을 가진 포유류 신체의 광-산란성 생물학적 조직을 광원으로부터의 광에, 예정된 시간을 이용하여 조영제를 여기시키는 세기를 다양하게 하여 노출시키는데, 상기 조직이 여기 광을 다수 산란시키는 단계;
    (b) 상기 노출에 반응하여 조직으로부터 다수 산란된 발광을 탐지하는 단계;
    (c) 프로세서를 이용하여 수 많은 값을 확립시킴으로써 발광으로부터 조직 전반에 걸쳐 특징적인 형광을 정량화하는데, 상기 값 각각이 조직 내의 상이한 위치에서 특징적인 형광 수준에 상응하고, 이러한 특징적인 형광 수준이 조직의 불균질한 조성에 따라서 달라지는 단계; 및
    (d) 단계 (c)의 값에 따라서 조직의 불균질한 조성을 지도화함으로써 조직의 영상을 생성시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 광학 영상화 방법이 형광 내시경을 포함하는 것인 방법.
  27. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 생체내 광학 영상화를 이용하여 결장직장암 (CRC)의 탐지, 병기 분류, 진단, 질병 진행 모니터링 또는 치료 모니터링에 도움을 주는 방법.
  28. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항의 생체내 광학 영상화 방법을 포함하는, 포유류 신체의 결장직장암 (CRC)의 탐지, 병기 분류, 진단, 질병 진행 모니터링 또는 치료 모니터링 방법.
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