KR20100014495A - 신규한 인간 항-ｒ7ｖ 항체 및 그들의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 HIV의 R7V 에피토프에 특이적으로 결합하는 신규한 인간 항체에 관한 것이다. 이들 항체들은 모두 인간 CDR이고 도피 돌연변이를 포함하여, HIV의 모든 균주를 특이적으로 중화시킬 수 있다. 이들 항체들은 특히 HAART가 실패한 환자에서 HIV 감염의 치료에 유용하다.
인간 모노클로날 항체, HIV 감염 치료, 항체의 제조방법
Description
본 발명은 HIV의 R7V 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 신규한 인간 항체에 관한 것이다. 이들 항체들은 모두 인간 CDR이고 도피 돌연변이를 포함하여, HIV의 모둔 균주를 특이적으로 중화할 수 있다. 이들은 특히 HAART에서 실패한 환자의 HIV 감염의 치료에 유용하다.
HIV 감염은 여전히 대유행 공중보건이다. 약물 치료법이 HIV 복제 및 감염 후 독성을 제한하긴 하지만, 예방 또는 치료적 처리는 아직 이용가능하지 않다. 더우기, AIDS의 감소와 상관없이, 여러 부작용과 약물-내성 바이러스의 출현을 가져오는 고활성 항레트로바이러스 치료는 HIV에 대한 추가의 치료적 접근이 필요함을 강조한다. 그러나, 비-진행자로서 고안된 몇몇의 HIV 감염 환자들은 감염 10년, 15년 이상 후 AIDS 질병이 진행되지 않고, 이것은 HIV 질병이, 약독화 바이러스1, 결손 바이러스2, HIV 수용체 돌연변이3 ,4, 또는 중화 항체의 존재와 같은 여러 방법으로 연기될 수 있다는 것을 나타낸다. 백신을 포함하여 전통적인 엔벨로프-기재 항체는 모두 바이러스의 높은 돌연변이율과 그들의 불량한 면역원성으로 인한 제한을 나타낸다. 기존의 연구에서6, 본 발명자들은 비-진행자 혈청으로부터 정제된 항-R7V 항체를 중화하는 넓은 스펙트럼의 잠재력을 증명하였다. 이들 면역글로불린들은 β2-미세글로불린으로부터 유도되고 발아 중 HIV 코팅에 병합되는 R7V (RTPKIQV 아미노산 서열)로 불리는 세포 에피토프에 대해 지향된다. 본 발명자들의 목적은 바쿨로바이러스 벡터를 통해 비-진행성 환자의 B-림프구로부터 대응 유전자를 단리한 후 재조합 항-R7V 항체를 생산하는 것이다.
바쿨로바이러스 기술은 정확하게 조립되고 글리코실화된 면역글로불린의 생산 및 분비를 허용한다9. 이들 재조합 항체들은 부모 면역글로불린10 ,11의 모든 기능적 특성을 나타내고 항체 지향 세포 세포독성을 유도하는데 요구되는 (i) 보체성분 C1q12 , 13 또는 C314와 (ii) IgG Fc 수용체의 결합과 같은 효과적인 작동체 기능을 나타낸다.
본 발명과 관련하여, 본 발명자들은 바이러스 발아 동안 HIV에 의해 수득되는 세포형 에피토프 R7V에 대해 지향되는 재조합 항체를 구축하였다. 항체-R7V 항체의 가변영역을 암호화하는 c-DNA는 비-진행성 환자의 B 림프구로부터 클론하였다. 이 항체의 중사슬과 경사슬에 대한 완전 암호화 서열들을 함유하는 2개의 전달벡터를 구축하고 재조합 바쿨로바이러스를 바쿨로바이러스 DNA와 2개의 전달벡터 사이의 이중 재조합에 의해 생성하였다. 이 바쿨로바이러스로 감염된 곤충 세포는 완전 인간 항-R7V 면역글로불린을 생성하였다. 본 발명자들은 본인들의 R7V 펩티드에 특이적인 재조합 항체가 내성 바이러스를 포함하는 모든 HIV1 계통을 인식하고 중화한다는 것을 발견하였고, 이것은 항-HIV 치료법에서 새로운 관점을 연다.
따라서, 첫번째 구현예에 따라, 본 발명의 주체는 단리된 항체, 또는 그것의 기능적 단편이고, 상기 항체 또는 그것의 상기 단편은 R7V 에피토프(RTPKIQV - SEQ ID No 11)에 특이적으로 결합하고, HIV 균주를 중화할 수 있고, 여기서 이것은:
i) 아미노산 서열 SEQ ID No 1 (QSVLYSSNNKNY), SEQ ID No 2 (WAS) 및 SEQ ID No 3 (QQYYSTPQT)을 포함하는 상보성 결정 영역 CDR 또는 최적 정렬 후, 서열 SEQ ID No 1, 2 또는 3과 적어도 80%, 바람직하기는 90% 동일한 서열을 갖는 CDR을 포함하는 경사슬, 그리고
ii) 아미노산 서열 SEQ ID No 6(GGSISSYY), SEQ ID No 7 (IYYSGST) 및 SEQ ID No 8 (ARGRSWFSY)을 포함하는 CDR 또는 최적 정렬 후 서열 SEQ ID No 6, 7 및 8과 적어도 80%, 바람직하기는 90% 서열 동일성을 갖는 CDR을 포함하는 중사슬을 포함한다.
본 발명의 설명에서, 항체 화합물 또는 그들의 서열에 첨부된 폴리펩티드, 폴리펩티드 서열, 펩티드 및 단백질이라는 용어들은 서로 교환가능하다.
본 발명은 천연 형태의 항체에 관한 것이 아님을 이해하여야 하고, 즉 그들은 그들의 천연환경에 있지 않고, 천연자원으로부터 정제에 의해 단리되거나 또는 얻을 수 있었고, 또는 유전적 재조합에 의해 또는 화학적 합성에 의해 얻어질 수 있고, 그들은 더욱 설명되는 바와 같이 비천연 아미노산을 함유할 수 있다.
Kabat et al.에 의해 정의된 바와 같이, CDR 영역 또는 CDR에 의해 면역글로불린의 중사슬 및 경사슬의 초가변영역을 나타내는 것이 의도된다 (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991, 및 이후의 판). 3개의 중사슬 CDR과 3개의 경사슬 CDR이 존재한다. 용어 CDR은 본 명세서에서 경우에 따라, 항원 또는 그것을 인식하는 에피토프에 대한 항체의 친화력에 의해 결합하는 능력이 있는 아미노산 잔기의 대부분을 함유하는 이들 영역 중 하나 또는 여러 영역, 또는 심지어 영역 전체를 나타내는데 사용된다.
본 발명의 의미에서 2개의 핵산 또는 아미노산 서열 사이의 "동일성 비율"에 의해, 최고의 정렬(최적 정렬) 후 얻어진, 비교될 2개의 서열간의 뉴클레오티드의 또는 동일 아미노산 잔기의 비율을 표시하는 것이 의도되고, 이 비율은 순수히 통계적이며 두 서열간의 차이는 임의로 및 그들의 전체 길이에 걸쳐 분포된다. 두 핵산 또는 아미노산 서열들 간의 서열의 비교는 통상적으로 이들 서열을 최적 방법으로 정렬 후 그들을 비교함으로써 수행되고, 이들 비교는 구획에 의해 또는 "비교 창문"에 의해 수행될 수 있다. 비교를 위한 서열들의 최적 정렬은 수작업 이외에, Smith and Waterman의 지역 상동성 알고리즘에 의해 (1981) [Ad. App. Math. 2:482], Neddleman and Wunsch의 지역 상동성 알고리즘에 의해 (1970) [J. MoI. Biol. 48: 443], Pearson and Lipman의 유사성 조사법에 의해(1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444), 이들 알고리즘을 사용한 컴퓨터 소프트웨어에 의해(GAP, BESTFIT, FASTA and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, 또는 BLAST N 또는 BLAST P 비교 소프트웨어에 의해) 수행될 수 있다.
2개의 핵산 또는 아미노산 서열 간의 동일성 비율은 최적 방법으로 정렬된 이들 두 서열들을 비교하여 결정되고, 여기서 비교될 핵산 또는 아미노산 서열은 이들 두 서열들 간의 최적 배열을 위한 참조 서열에 대해 추가 또는 결실을 포함할 수 있다. 동일성 비율은 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 두 서열간에 동일한 동일 위치의 수를, 상기 동일 위치의 수를 비교 창문 내의 부분들의 총수로 나누고, 두 서열간의 동일성 백분률을 얻기 위해 얻어진 결과에 100을 곱하여 결정함으로써 산출된다.
예를 들면, 사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html에서 이용가능한 BLAST 프로그램, "BLAST 2 서열" (Tatusova et al, "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250)을 사용할 수 있고, 사용된 계수들은 디폴트로 주어지고(특히, 계수 "오픈 갭 페널티"에 대해: 5, 및 "연장 갭 페널티"에 대해: 2; 선택된 매트릭스는 예를 들면, 프로그램에 의해 제한된 매트릭스 "BLOSUM 62"이다), 비교될 두 서열간의 동일성 비율은 프로그램에 의해 직접 계산된다.
참조 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하기는 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열에 의해, 이들은 참조 서열에 대해, 특정 변형, 특히 적어도 하나의 아미노산의 결실, 첨가 또는 치환을 갖는데, 절단 또는 연장이 바람직하다. 하나 이상의 연속 또는 비연속 아미노산의 치환의 경우, 치환된 아미노산이 "등가의" 아미노산으로 대체된 치환물이 바람직하다. "등가의 아미노산" 이라는 표현은 상응하는 항체의 생물학적 활성의 본질적 변화없이 기본 구조의 아미노산 중 하나가 치환될 수 있는 어느 아미노산을 나타내기 위해 사용되고, 이와 같은 것은 아래에서, 특히 실시예에서 정의될 것이다.
이들 등가의 아미노산은 그들이 대체하는 아미노산과 그들의 구조적 상동성에 의지하거나 또는 다양한 항체들 간에 수행될 수 있는 생물학적 활성의 비교 시도의 결과에 의존하여 결정될 수 있다. 예로서, 상응하는 변형된 항체의 생물학적 활성의 심각한 변형을 가져옴 없이 수행될 수 있는 치환 가능성에 대해 언급된다. 그러므로, 로이신을 발린 또는 이소로이신으로, 아스파르트산을 글루탐산으로, 글루타민을 아스파라긴으로, 아르기닌을 리신으로, 등과 같이 대체하는 것이 가능하고, 역 치환물은 동일한 조건하에서 자연히 상상할 수 있다.
본 발명에 따른 항체들은 바람직하기는 완전 인간 모노클로날 항체 또는 그들의 기능적 단편이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 최적 배열 후, 도 3B - SEQ ID No 4에 도시한 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하기는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 또는 도 3A - SEQ ID No 5에 도시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID No 5와, 최적 배열 후 적어도 80%, 바람직하기는 90% 동일한 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 경사슬에 의해 특징된다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 최적 배열 후 도 3D - SEQ ID No 9에 도시한 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하기는 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중사슬, 또는 도 3C - SEQ ID No 10에 도시된 바와 같은 서열, 또는 최적 배열 후 SEQ ID No. 10과 적어도 80%, 바람직하기는 90% 동일한 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 중사슬에 의해 특징된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 항체는 도 3B - SEQ ID No. 4에 의해 도시되거나 또는 도 3A - SEQ ID No. 5에 의해 도시된 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 및 도 3D -SEQ ID No 9에 도시되거나 또는 도 3C- SEQ ID No 10에 도시된 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 중사슬을 포함한다.
본 발명에 따른 항체의 기능적 단편에 따르면, 이것은 Fv, scFv (sc는 단일사슬을 의미), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc 단편 또는 디아바디(diabodies)와 같은 어느 항체 단편, 또는 폴리(에틸렌)글리콜 ("PEGylation") (Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG or Fab'-PEG로 불리는 페길화된 단편) ("PEG"는 폴리(에틸렌)글리콜을 의미)과 같은 폴리(알킬렌)글리콜의 첨가와 같은 화학적 변형에 의해, 또는 리보솜에서의 병합에 의해 반감기 시간이 증가된 단편을 나타내려는 의도이고, 상기 단편들은 본 발명에 따른 서열 SEQ ID No. 1, 2, 3, 6, 7 및 8의 CDR을 갖고, 그리고 특히 HIV 균주를 중화시킬 수 있다.
바람직하기는, 상기 기능적 단편은 그들이 유도되는 항체의 중 또는 경 가변사슬의 일부 서열을 구축하거나 포함할 수 있고, 상기 일부 서열은 결합의 동일한 특이성을 유지하기에 충분하다. 바람직하기는, 이들 기능적 단편들은 Fv, scFv, Fab, F(ab')2, F(ab'), scFv-Fc 유형 또는 디아바디의 단편이고, 일반적으로 그들이 유래되는 항체로서 결합의 동일한 특이성을 갖는다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 항체 단편들은, 펩신 또는 파파인과 같은 효소에 의한 소화와 같은 방법에 의해 및/또는 화학적 환원에 의한 이황화 결합의 분열에 의해 상기와 같은 항체로부터 출발하여 얻을 수 있다. 또 다른 방법에서, 본 발명에 포함되는 항체 단편들은 본 분야의 당업자에게 잘 알려진 방법과 마찬가지로 유전적 재조합 기술에 의해 또는 예를 들면 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)사 등에 의해 공급되는 것과 같은 자동 펩티드 합성장치에 의한 펩티드 합성에 의해 얻을 수 있다.
더욱 바람직한 방법에서, 본 발명은 유전자 재조합 또는 화학적 합성에 의해 얻어진 본 발명에 따른 항체 또는 그들의 기능적 단편들을 포함한다.
바람직한 방법에서, 본 발명에 따른 상기 기능적 단편들은 단편 Fv, scFv, Fab, (Fab')2, Fab', scFv-Fc 또는 디아바디, 또는 화학적 변형, 특히 페길화에 의해 또는 리포솜에서의 병합에 의해 반감기가 증가되는 어느 기능적 단편으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 최적 배열 후 서열 SEQ ID No 5와 적어도 80%, 바람직하기는 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다.
본 발명은 또한 최적 배열 후 서열 SEQ ID No 10과 적어도 80%, 바람직하기는 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다.
최적 배열 후, 바람직한 서열과 적어도 80%, 바람직하기는 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성 백분률을 갖는 핵산 서열에 의해, 참조 핵산 서열에 대하여, 특정의 변형을 갖는, 특히 결실, 절단, 신장, 키메릭 융합 및/또는 치환, 특히 지점 치환을 갖는 핵산 서열을 나타내는 것이 의도된다. 이것은 서열이 참조 서열과 동일한 아미노산 서열의 유전 암호를 지정하는 서열에 관계되고, 이것은 유전 코드의 퇴화, 또는 바람직하기는 높은 엄격성 조건 하에서 특히 참조 서열과 혼성화될 수 있는 상보적 서열과 관련된다.
높은 엄격성 조건하의 혼성화는 온도 조건과 이온 강도 조건이 상보적 DNA의 두 단편들 사이의 혼성화를 유지하도록 하는 방법으로 선택되는 것을 의미한다. 설명을 위해, 상기 폴리뉴클레오티드 단편들을 정의하는 목적을 위한 혼성화 단계의 높은 엄격성 조건은 다음과 같은 것이 유리하다.
DNA-DNA 또는 DNA-RNA 혼성화는 두 단계로 수행된다: (1) 42℃에서 3시간 동안 5 x SSC (0.15 M NaCl + 0.015 M 시트르산 나트륨 용액에 상응하는 1 x SSC), 포름아미드 50%, 소듐 도데실 설페이트(SDS) 7%, 10 x Denhardt's, 덱스트린 설페이트 5% 및 연어 정자 DNA 1%를 포함하는 인산염 완충액(20 mM, pH 7.5) 중에서 전혼성화하는 단계; (2) 프로브의 크기에 따른 온도에서 20시간 동안 실제 혼성화하고(즉, 프로브 크기 > 100 뉴클레오티드의 경우, 42℃) 이어서 2 x SSC + 2% SDS 중에서 20℃에서 20분 동안 2회 세척, 0.1 x SSC + 0.1% SDS에서 20℃에서 20분 동안 1회 세척하는 단계. 최종 세척은 프로브 크기 > 100 뉴클레오티드의 경우 0.1 x SSC + 0.1% of SDS에서 60℃에서 30분 동안 수행된다. 정의된 크기의 폴리펩티드의 경우 상기의 높은 엄격성의 혼성화 조건은 Sambrook et al.의 기술(1989, Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor)에 따라, 거 크거나 작은 크기의 올리고뉴클레오티드의 경우 당업자에 의해 변형될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 정의된 핵산, 특히 SEQ ID No 5 및 SEQ ID No. 10의 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 특히 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열을 함유하는 클로닝 및/또는 발현 벡터에 관한 것이다. 예를 들면, 본 발명은 상기의 핵산 서열, 특히 SEQ ID No. 5 및 SEQ ID No. 10의 핵산 서열을 포함하는 바쿨로바이러스 전달 벡터에 관한 것이다.
본 발명에 따른 벡터는 한정된 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 발현 및/또는 분비를 허용하는 요소들을 함유하는 것이 바람직하다. 그러므로, 벡터는 프로모터, 번역의 개시 및 종료 신호 뿐 아니라 전사 조절의 적합한 영역을 함유한다. 이것은 숙주 세포에서 안정한 방법으로 유지될 수 있어야 하고 임의로 번역된 단백질의 분비를 명시하는 특정 신호들을 가질 수 있다. 이들 다양한 요소들은 사용된 숙주 세포의 기능에 따라 본 분야의 당업자들로부터 선택되고 최적화된다. 이 효과를 위해, 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열은 선택된 숙주에서 자발적인 복제 벡터에 삽입되거나 또는 선택된 숙주의 통합 벡터일 수 있다.
이와 같은 벡터는 본 분야의 당업자에 의해 현재 사용되는 방법으로 제조될 수 있고, 생성된 클론들은 리포펙션, 전기영동, 열충격 또는 화학적 방법과 같은 표준 방법으로 적절한 숙주로 도입될 수 있다.
본 발명에 따른 벡터는 예를 들면, 플라즈미드 또는 바이러스 기원의 벡터이다. 이들은 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열을 클론하거나 또는 발현하기 위해 숙주세포를 변형하는데 유용하다.
본 발명은 마찬가지로, 본 발명에 따른 벡터에 의해 변형되거나 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함한다.
숙주 세포는 원핵 또는 진핵 시스템으로부터, 예를 들면, 세균 세포 또는 이스트 세포 또는 마찬가지로 동물 세포, 특히 포유동물 세포로부터 선택될 수 있다. 또한 곤충세포 또는 식물 세포를 사용하는 것도 가능하다.
그러므로, 또 다른 면에 따르면, 본 발명은 위에서 정의된 항-R7V 인간 항체를 분비하는 세포주에 관한 것이다. 예를 들면, 상기 항체는 EBV 불멸화된 B 림프구, 바쿨로바이러스 벡터를 이용한 Sf9 세포와 같은 곤충 세포; 또는 CHO(ATCC number CCL-61), 저-푸코실화 항체를 생산하도록 유전적으로 변형된 CHO, 또는 YB2/0(ATCC CRL-1662) 세포주와 같은, 다른 항체 생성 세포주로부터 얻을 수 있다.
또 다른 면에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 그것의 기능적 단편 중 하나의 생산 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:
a) 본 발명에 따른 숙주 세포를 매질 및 적절한 배양 조건에서 배양하는 단계; 및
b) 상기 배양된 세포의 배지로부터 상기 항체를 추출하는 단계를 포함한다.
상기 방법에 의해 얻을 수 있는 항체, 또는 그들의 기능적 단편은 본 발명의 범위에 속한다.
또 다른 면에 따라, 본 발명은 의약으로서의 상기와 같은 항체, 또는 그것의 기능적 단편에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 활성 주성분으로서 본 발명에 따른 항체, 또는 그것의 기능적 단편, 및 부형제 및/또는 약제학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 동시에, 분리하여 또는 연속 사용을 위해 결합 산물로서 AIDS의 치료에 현재 사용되는 적어도 하나의 시약과 상기에 따른 항체를 더욱 포함하는, 상기와 같은 조성물에 관한 것이다. "동시 사용"은 단일 및 동일의 약제학적 형태로 본 발명에 따른 조성물의 두 화합물의 투여를 의미하는 것으로 이해된다. "분리 사용"은 구별된 약제학적 형태로, 본 발명에 따른 조성물의 두 화합물의 동시 투여를 의미하는 것으로 이해된다. "연속 사용"은 각각 구별된 약제학적 형태로, 본 발명에 따른 두 화합물의 투여를 의미하는 것으로 이해된다.
예를 들면, 항-R7V 항체의 투여를 다음과 함께 결합시키는 것이 가능하다:
에파비렌즈(efavirenz) + 지도부딘(zidovudine) + 라미부딘(lamivudine)
에파비렌즈 + 테노포비어(tenofovir) + 엠트라씨다빈(emtricitabine)
스타부딘(stavudine) + 라미부딘 + 네비라핀(nevirapine)
리토나비르(ritonavir)로 부스팅된 로피나비르(lopinavir) + 지도부딘 + 라미부딘
리토나비르로 부스팅된 로피나비르 + 테노포비어 + 엠트라씨다빈.
본 발명은 의약의 제조를 위한, 특히 예를 들면 HAART 치료 하의 환자에서 그리고 특히 HAART 치료가 실패한 환자에서 HIV 감염, AIDS의 치료를 위한 본 명세서에 설명된 항체의 용도를 포함한다.
본 발명은 아래의 도면과 실시예의 관점으로 더욱 설명될 것이다.
도 1: 항-R7V 항체의 발현을 위해 사용된 면역글로불린 특이 전달 벡터를 개략적으로 나타낸다.
도 1A: 경사슬의 발현을 허용하는 pVT-Cκ-전달 벡터를 개략적으로 나타낸다.
도 1B: 중사슬의 발현을 허용하는 pVT-Cγ1-전달 벡터를 개략적으로 나타낸다.
도 2: VH (도 2A) 또는 VL (도 2B) 서열의 PCR 증폭이 R7V 항원에서 선택된 불멸화된 B-림프구로부터 추출된 전체 RNA로부터 합성된 c-RNA에 존재한다. 증폭은 적절한 불변 3' 프라이머 및 주어진 VH 또는 VL 유전자과에 특이적인 5' 프라이머의 세트를 사용하여 Materials and Methods에 보고된 바와 같이 수행되었다. PCR 반응 20㎕를 1.5% 아가로스 겔에서 분류시키고 브롬화에티듐으로 염색하였다. 레인 CVH: 대조 VH 서열. 레인 CVL: 대조 VL 서열. 레인 MW: SmartLadder molecular weight marker (Eurogentec): 200, 400, 600, 800, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 6000, 8000, 10,000 bp.
도 3: 가장 상동성의 생식세포 유전자와 비교한 불별화된 B-림프구에서 발현된 항체의 경사슬(K4) 및 중사슬(M4)의 가변영역의, 도 3A 및 도 3C: 뉴클레오티드 서열, 및 도 3B 및 도 3D: 아미노산 서열. 아미노산 서열은 하나의 문자 코드로 제공된다. 사용된 번호 시스템은 IMGT (http://imgt.cines.fr) 협약에 따른다. VH와 VL 서열의 상보적 결정 영역(CDR)을 강조하였다. 서열 중의 대시(-)는 상부 라인에 제공된 잔기와 동일함을 나타낸다. IGHJ, IGHD 및 IGKJ 유전자는 박스로 처리하였 다.
도 4: 항-R7V 또는 비관련 항체 50 μg/㎖에 의한 HIVi 계통의 중화
실시예
1: 유효한 인간 재조합 항-
R7V
항체의 단리 및 구조화
1.1 재료 및 방법
1.1.1 세포 및 바이러스
인간 말초 혈액 단핵구 (PBMC)를 Ficoll-Paque (Amersham) 구배 원심분리에 의해 건강한 혈청음성 공여자의 신선한 K2E-EDTA 혈액 샘플로부터 추출하였다. 배양된 세포를 하기의 조성을 갖는 완전 RPMI 배지에서 1 × 106 cells/㎖의 밀도로 성장시켰다: 10% 열-불활성 우 태아 혈청 (GIBCO), 1% 페니실린/글루타민 (GIBCO), 10 UI/㎖ IL2 (Euromedex), 처음 3일 동안 10 μg/㎖ PHA-P (Difco), 및 2 μg/㎖ 폴리브렌 (Biowhittaker)이 보충된 RPMI 1640 (Biowhittaker).
CEM 세포주를 0.5 x 106 cells/㎖로 RPMI-10% 배양 배지(10% 열-불활성 우 태아 혈청, 1% 페니실린/글루타민, 2 μg/㎖ 폴리브렌을 함유하는 RPMI 1640)에서 배양하였다.
NDK (계통 D) 및 AZT-내성 RTMC (계통 B) 바이러스들을 감염된 CEM 세포에서 생성하였다. 92UG029 (계통 A), 92BR021 (계통 B), 92BR025 (계통 C), 및 93BR029 (계통 F) 바이러스들을 처음 AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH에 의해 제공받았고, PBMC상에 생성하였다. 바이러스 BCF06 (계통 O), 및 YBF30 (종래의 계통)를 F. Barre-Sinoussi (Pasteur Institute, France)에 의해 기꺼이 제공받았다. 감염된 세포 상청액으로부터의 적정된 바이러스 분취물을 -80℃에서 동결시켰다.
Sf9 세포들을 5% 열-불활성 우 태아 혈청 (GIBCO)이 보충된 TC1OO 배지 (GIBCO)중에서 28℃로 유지시켰다. 야생-형 오토그라파 캘리포니카 다중 핵다각체병 (AcMNPV) 바이러스 클론 1.217 및 재조합 바쿨로바이러스를 Sf9에서 증식시켰다.
1.1.2 비-진행성 환자로부터 말초 혈액 단핵구 (
PBMC
)의 단리
통지받고 동의한 HIV 혈청음성 비-진행성 환자들을 본 발명자들의 연구에 등록하고 Ficoll-Paque 밀도 구배상에서 단리를 통하여 신선한 K2E-EDTA 정맥 혈액으로부터 PBMC를 정제하였다. 이러한 PBMC를 IL2 및 PHA를 제외한 15% 열-불활성 FCS 및 1% 페니실린/글루타민이 보충된 RPMI 1640 배양 배지에서 2일 동안 사전-배양하여 불멸화 전에 B 림프구의 성장을 도왔다.
1.1.3
엡스테인
-
바르
바이러스 (
EBV
)를 사용한 B 림프구의
불멸화
그 다음, B-95.8 배양 상청액 (EBV 생산 세포주) 2 ㎖을 50 ㎖ 원뿔 튜브에 있는 3 ㎖ 10% 열-불활성 FCS, 1% 페니실린/글루타민 RPMI 1640 중의 9 ×106 사전-배양된 PBMC와 혼합하여 B 림프구를 불멸화하였다. 37℃ 수조에서 2시간 배양한 후에, 10% 열-불활성 FCS, 1 μg/㎕ 사이클로스포린 A (Calbiochem) 및 1 % 페니실린/글루타민이 보충된 5 ㎖의 RPMI 1640를 첨가하였다. 10-㎖ 세포 부유물을 습윤 37 ℃, 5% CO2 배양기에 있는 25 cm2 조직-배양 플라스크로 옮기고 4주 동안 가만히 배양하였다. 4-주 배양 말에, EBV-불멸화 세포들은 육안으로 보이는 덩어리들을 형성하였고 그리고 이 세포주를 RPMI-20%에서 106 cells/㎖로 주 2회 재-급식하여 유지시켰다.
1.1.4 항-
R7V
항체를 분비하는 B 림프구의 분리
R7V 펩티드의 아미노핵사논산 형태에 의한 자성 비드의 코팅: 10 μg의 R-8-Ahx 펩티드 (Neosystem)를 저속 경사 회전으로 37℃에서 16-24 시간 동안 107 자성 토실-불활성 비드 (Dynal Dynabeads® M450)로 배양하였다. 비드들을 제조자 과정에 따라 세정하고 PBS pH 7.4에서 4.108 beads/㎖로 재현탁하였다.
항-R7V 항체를 분비하는 B 림프구의 자성 선택: 1 ㎖ 멸균 PBS에 있는 107 EBV-불멸화 B 림프구를 4℃에서 10분 동안 24 106 R-8-Ahx 코팅된 비드로 혼합하고 더 이상 세포가 비드에 고정되지 않을 때까지 3회 반복하였다.
2분 동안 튜브를 자석에 놓고 로제트(rosetted) 세포를 단리하였다. 비드를 교란시키지 않고 상청액을 제거한 후, PBS 세정 버퍼에 세포를 재현탁하였다. 비드-고정 세포들을 5% CO2, 37℃에서 RPMI-20% FCS 중에서 배양하기 전에 세정 단계를 3회 반복하였다. 하루가 지난 다음, 세포들은 비드로부터 스스로 분리되었고 106 cells/㎖으로 성장하였다.
배양 2주 후 이러한 B 림프구를 분비하는 미리-선택된 항-R7V 항체 상에서 동일한 프로토콜을 사용하여 이와 같은 자성 선택을 반복하였다.
1.1.5
ELISA
과정
항-R7V 항체들을 제조업자의 지시에 따라 항-R7V ELISA 분석기(항 R7V™ IVR96000, IVAGEN, France)로 검출하였다. 간략하게, 양성 대조, 음성 대조, 컷-오프 교정기 및 희석된 항체(100 ㎕/well)를 R7V-코팅 시험 플레이트에 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양하였다. 결합된 항-R7V 항체들을 호스래디시 페옥시다제-컨쥬게이트된 항-인간 IgG 항체에 의해 검출하였다.
1.1.6 중화 분석
바이러스 남은 양을 하기의 희석물에 상응하는 분석18 당 100 TCID50를 갖도록 미리 적정하였다: HIV-1NDK (희석 10-5), HIV-1RTMC AZT -내성 (희석 510-5), 92UG029 (희석 10-2), 92BR021 (희석 10-3), 92BR025 (희석 10-2), THA92022 (희석 10-2), 93BR029 (희석 10-2), BCF06 (희석 10-4) 및 HIV-1YBF3O (희석 10-3). 바이러스 (50 ㎕)의 희석물을 습윤 37℃, 5% CO2 배양기에서 1시간 동안 100 μg/㎖의 항체를 함유하는 50 ㎕ RPMI-0% (최종 농도 50 μg/㎖)의 96-웰 미량적정 플레이트에서 사전-배양하였다. PBMC (50 ㎕중 1 × 106)를 37℃에서 1시간 동안 바이러스-항체 혼 합물에 첨가하고 세포들을 배양 배지로 3회 세정한 후 처음 3일 동안 50 μg/㎖ 항체 완전 RPMI-10%의 존재 하에 24-웰 미량적정 플레이트에서 106 cells/㎖로 배양하였다. 배양물을 10일 동안 성장시킨 후 3일 동안 매일 재-현탁하였다. 동일한 분석을 바이러스 대조 (항체 없이 HIV-감염된 세포), 세포 대조 (항체 없이 미감염된 세포) 및 항체 대조 (미 HIV-관련 에피토프에 대한 무관 항체)에 대하여 수행하였다. 각 샘플에 있는 바이러스 복제를 측정하기 위하여, 역전사 효소를 하기에 따라 정량화하였다. 3일 마다 매일 수거한 세포-프리 상청액의 미량적정 샘플들을 95,000 rpm, 4℃, 5분 (TL1OO Beckman) 동안 초원심분리하였다. 바이러스 펠렛을 10 ㎕의 0.1 % Triton X-100 NTE (NaCl 100 mM, 트리스 10 mM, EDTA 1 mM) 버퍼에 재현탁하여 바이러스 효소를 방출하였다. 트리스 50 mM, pH 7.8; MgCl2 20 mM; KCl 20 mM; 디티오트레이톨 (DTT) 2 mM; 올리고 dT 0.25 OD/㎖; 폴리 rA 0.25 OD/㎖ 및 3H dTTP 50 μCi/㎖를 함유하는 50 ㎕의 반응 혼합물에서 효소 반응을 수행하였다. 37℃에서 1시간 후에, 상기 반응을 5% TCA에서 소듐 피로포스페이트로 종료시키고 합성된 DNA 생성물을 20% 트리클로로아세트산으로 침전시킨 후 밀리포어 0.45 μm으로 여과하여 수거하고 β 방사성을 팩커드 섬광 계수기에서 dpm/㎖로 측정하였다. 중화 퍼센트를 다음과 같이 표시하였다:
[100-(샘플의 역전사효소 활성 / 바이러스의 역전사효소 활성) × 100)]
1.1.7 항
R7V
특이성을 발현하는 항체의 가변 영역의 단리 및
클로닝
절차는 뮤린 가변 항체 영역의 증폭에 대해 기재한 기술에서 채택하였다19. 전체 RNA를 RNeasy 키트(Qiagen)를 사용하여 약 5.106 불멸화된 B 림프구로부터 추출하였다. 간략하게, 세포를 600 ㎕의 RLT™/β-머캅토에탄올 버퍼로 용해시키고 20 게이지 바늘을 연속 통과시켜 균질화하였다. 70% 에탄올 600 ㎕를 첨가한 후, 상기 혼합물을 RNeasy 컬럼에 증착시키고 12,000 rpm에서 15초 동안 원심분리하였다(Biofuge, Heraeus). 컬럼을 700 ㎕ RW1™ 버퍼 및 500 ㎕ RPE™ 버퍼로 연속 세정하였다. RNA를 50 ㎕ RNAse-프리 물을 사용하여 용출하고 사용시까지 -80℃에서 보존하였다.
인간 면역글로불린, hCLa, hCLb, hCK, hCG 및 hCM (표 3)의 불변 영역에서 혼성화시킨 전체 RNA 및 5개의 특이적 프리이머를 사용하여 각각 람다, 카파, 감마 1 및 뮤 mRNA에 상응하는 제1가닥 c-DNA를 합성하였다. 역-전사를 다음과 같이 수행하였다: 최종 부피 40 ㎕ 중, 총 RNA 1μg, 1OX RT™ 버퍼 (Qiagen) 4㎕, 5mM의 각각의 dNTP (Qiagen) 4㎕, RNAse 억제제 10 pMoles/㎕ 20 단위에서 특이 프라이머 (Roche) 4㎕ 및 8 단위의 Omniscript 역전사효소 (Qiagen). 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 역 전사 활성은 5분 동안 93℃에서 열-불활성되었다.
매트릭스로서 인간 면역글로불린 (표 3) 및 람다, 카파, 감마 또는 뮤 제1-가닥 cDNA의 중사슬 및 경사슬의 신호 펩티드 염기서열에서 설계된 특이적 프라이머를 사용한 PCR에 의해 전체 길이 VH 및 VL 염기서열을 증폭시켰다. 2 ㎕의 1OX Vent DNA 중합효소 (Biolabs), 2 ㎕의 10 mM 각각의 dNTP (Biolabs), 20 pMoles의 각각의 프라이머, 1.5 ㎕의 25 mM MgSO4, 1 단위의 Vent DNA 중합효소 (Biolabs), 0.5 ㎕의 역전사 혼합물을 함유하는 20 ㎕의 최종 부피에서 PCT 반응을 수행하였다. 30회의 증폭 사이클을 95℃에서 30초, 55℃에서 45초 및 72℃에서 1분 동안 수행하였다. 72℃에서 10분 연장한 후에, PCR 생성물을 1.5% 아가로스 겔 (SeaKem, FMC)에서 분별하고 브롬화에티듐으로 염색하였다.
PCR 생성물을 겔 정제하고, Advantage Taq 중합효소 (Clonetech)로 증폭시킨 후 플라스미드 pGemT easy (Promega)에서 클로닝하였다. 삽입물을 PCR 증폭 (MWG Biotech)에 사용되는 3' 및 5' 프라이머를 사용하여 양 가닥에 나열하였다. BLAST20 및 IMGT Database21을 사용하여 가변 영역의 염기서열 비교 및 생식세포 유전자 분석을 수행하였다.
1.1.8 항-
R7V
항체를 발현하는 재조합
바쿨로바이러스의
구성
VH 및 VL 염기서열을 각각 인간 면역글로불린 신호 펩티드 염기서열, 두 개의 고유한 제한 부위 및 인간 감마 1 및 카파 불변 영역을 코드화하는 염기서열을 함유하는 특이적 전이 벡터 pVTCγ1 및 pVTCκ (도 1)에 삽입하였다. pVTCγ1 벡터는 신호 펩티드 염기서열에 있는 고유한 AfIII 부위 및 감마 1 염기서열의 두개의 제1 코돈을 포함하는 NheI 부위를 함유하는 반면, pVTCκ는 신호 펩티드 염기서열에 있는 고유한 BssHII 부위 및 J 영역의 마지막 보존 아미노산과 불변 카파 영역의 제1 아미노산이 겹치는 BsiWI 부위를 함유한다.
적절한 제한 효소 부위를 하기의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 VH 및 VL 의 5' 및 3' 말단에 도입하였다:
FOR-M4 :
CCATCTTAAGGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGC (SEQ ID No.16),
BAC-M4 : GCATGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGT (SEQ ID No. 17),
FOR-K4 : CGATGCGCGCTGTGACATCGTGATGACCCAGTCT (SEQ ID No. 18) 및
BAC-K4 : CGATCGTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCCCTGGCC (SEQ ID No. 19).
VH에 대한 Aflll-NheI 및 VL에 대한 BssHII-BsiWI 으로 소화된 PCR 생성물을 정제하고 그들 각각의 전이 벡터 pVTCγ1 및 pVTCκ에 삽입하였다.
최종 구조물 pVTCγ1-M4 및 pVTCκ-K4를 나열하여 제어하였다.
이전에 기술한 바와 같이 (22, 10, 11) Sf9 세포의 공동감염 이후에 항체를 발현하는 재조합 바쿨로바이러스를 발생시켰다. 생산 클론을 ELISA으로 검사하였다23. 간략하게, 1μg/㎖의 항-인간 중사슬 Fdγ1 폴리클로날 항체 (결합 부위) 100 ㎕로 코팅된 미량적정 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 세포 배양 상청액의 연속 희석물로 배양하였다. 호스래디시 퍼록시다제-표지된 항-인간 카파 경사슬 항체 (Sigma)를 사용하여 결합된 재조합 IgG를 검출하였다.
재조합 바이러스의 게놈을 서던 블롯으로 제어하였다. 7 ㎖의 세포 배양 상청액에 있는 바이러스 입자들을 40분 동안 35,000 rpm에서 침전시켰다. 펠렛을 물에서 20 mg/㎖로 10 ㎕의 프로테나제 K (Roche) 및 물에서 10% (w/v)로 10 ㎕의 N- 라우릴 살코신 (Sigma)의 존재 하에 1 ㎖의 TEK 버퍼 (0.1 M 트리스, 0.1 M Na2EDTA 2 H2O, 0.2 M KCl, pH 7.5)에 재현탁 시킨 후 50℃에서 하룻밤 배양하였다. 바이러스 DNA를 페놀 및 클로로포름-이소아밀 알코올 (24:1 v/v)로 연속하여 추출하고 에탈올로 침전시켰다. 물에서 재현탁시킨 후, DNA를 HindIII로 소화하였다. 그 다음, 제한된 DNA를 1% 아가로스 겔상에서 전기영동하여 분석하고 Nitran 막 (Schleicher 및 Schull)으로 옮겼다. 인간 불변 γ1 및 불변 ĸ 영역을 코드화하는 c-DNA를 각각 제조업자에 의해 권유되는 바와 같이 다이옥시제닌 (Roche)으로 표지하고 혼성화 프로브로 사용하였다. 세정 후에, 블럿들을 알칼리성 포스파타아제 (Roche, 희석 1:10,000)에 컨쥬게이트된 항다이옥신 항체로 배양하였다. 표지된 DNA의 검출은 화학 발광 기질 CSPD (Roche)로 수행하였다.
1.1.9 재조합 항체의 생성 및 정제
Sf9 세포들을 롤러 용기에 있는 400 ㎖의 무 혈청 배지에서 500,000 cells/㎖의 밀도로 시드하고 세포마다 감염다중도 2로 감염시켰다. 28℃에서 4일 배양 후에, 상청액을 수거하고 분비된 재조합 항체들을 단백질 A 세파로스(Amersham)상에 제조업자의 지시에 따라 정제하였다. 정제된 IgG의 양을 ELISA으로 측정하였다2 3.
재조합 항-R7V 항체들을 또한 유사한 조건 하에 CHO-발현 시스템에서 구축하였다.
1.2 결과
1.2.1 항-
R7V
항체를 분비하는 B 림프구의 선택
항-R7V 항체들을 생성하는 B 림프구를 R7V-코팅된 자성 비드를 사용하여 비-진행성 HIV-감염 환자로부터 선택하였다. 항-R7V 항체를 분비하는 B 림프구의 27%를 제1선택에서 얻었고, 그리고 제2선택에서 14%를 미리-선택된 항-R7V 항체 분비 B 림프구에서 얻었다. 무 항-R7V 항체들이 B 세포 배양 상청액에 있는 항-R7V ELISA에 의해 검출되지 않았다는 것은 항체들이 분비 B 림프구 막에 결합되었거나 ELISA 시험의 검출 한계 이하라는 것을 제시한다.
1.2.2 선택된
불멸화
B-림프구에 의해 발현되는
VH
및
VL
염기서열의 단리 및
클로닝
선택된 B 림프구에 의해 발현되는 항체의 VL 및 VH 영역의 증폭은 본 발명자가 이전에 마우스 면역글로불린에서 기재한 바와 같이 RT-PCR로 수행하였다19. 도 2에 나타낸 바와 같이, 오직 몇 개의 프라이머 조합만이 적절한 크기, VH의 약 450 bp 및 VL의 400 bp를 갖는 단편의 증폭을 야기하였다. hCG/hVH5, hCM/hVH2 및 hCM/hVH3를 사용하여 오직 희미한 밴드만을 관찰하고, 그 이상의 물질은 hCM/hVH4로 관찰되었다. 주요 생성물을 또한 hCK/hVK4로 합성하였다. 그러나, hCLa 및 hCLb 프라이머(나타내지 않음)를 사용하는 어느 조합으로도 어느 증폭이 검출되지 않았다. PCR 생성물의 나열 및 BLAST 분석은 두 개의 M4 단편 (hCG/hVH4) 및 K4 단편 (hCK/hVK4)이 각각 인간 중사슬 및 경사슬의 가변 도메인에 상응한다는 것을 나타내었다. 이러한 결과는 선택된 불멸화 B-림프구의 집단은 아마도 막 IgM 카파 항체를 발현하는 모노클로날이라는 것을 나타낸다. IMGT 데이타베이스로 이러한 염기서 열의 비교는 IGHV-4-59*0124, IGHD2-21*0125 및 IGHJ4*0226 생식세포 유전자 (도 3C)의 재배열에 의한 것이라는 것을 나타낸다. 그것의 Vκ-K4 대응부분은 IGKV4-1*0127 /IGKJ2*0228, 경사슬 가변 영역의 재배열 (도 3A)을 나타낸다. 흥미롭게도, 이 항체는 카파 경사슬 레퍼토리로부터 대부분의 J-근위 IGKV4-1 유전자를 사용하였다. 그러한 경사슬 영역은 주로 IGKV/IGKJ 연결의 영역 3을 결정하는 상보적인 한 돌연변이만을 갖는 경우, 비돌연변이화 되었다 (도 3B). 한편, 영역 3을 결정하는 상보적인 4개의 아미노산 돌연변이를 야기하는 7개의 뉴클레오티드 교체가 VH-M4에서 관찰되었으나, 오직 2개의 사일런트 뉴클레오티드 교체가 구조형성 영역에서 주목되었다 (도 3C, 3D).
1.2.3
바쿨로바이러스
발현 시스템에서 항-
R7V
항체의 발현
항-R7V 항체의 가변 영역을 코드화하는 염기서열을 경사슬 및 중사슬 카세트 바쿨로바이러스 전달벡터 (i) 폴리헤드린 로커스에서 재조합하기 위해 고안된 pVT-CK 및 (ii) P1O 로커스에서 재조합하기 위해 고안된 pVT-Cγ1에 삽입하였다. 이러한 구조물에서, 경사슬 및 중사슬 유전자는 각각 합성 P1O 프로모터, P'1022 및 P1O 프로모터의 제어 하에 존재한다 (도 1). 특이적 프라이머를 도 1에 나타낸 바와 같이 면역글로불린 신호 펩티드 염기서열 및 불변 영역으로 구조에서 그들을 직접 클로닝시키는 K4 및 M4 단편을 증폭시키기 위하여 고안하였다. 두 개의 최종 구조물, pVT-Ck-K4 및 pVT-Cγ1-M4는 배열하는 것에 의해 제어되었고 정제된 바이러스 DNA 의 존재 하에 Sf9 세포를 공동감염시키기 위하여 사용되었다. 이중 재조합 바이러스는 이전에 기술한 바와 같이 2 순환 재조합 이후에 얻어졌다 10,11. 재조합 바이러스는 플라크 정제하고 증폭하였다. 감염된 세포의 세포 배양 상청액에 있는 항체의 존재를 항-인간 항체 ELISA로 분석하였다. 4개의 생산성 클론의 게놈을 프로브로서 인간 γ1 및 κ 불변 영역 DNA을 사용하여 서던 블롯으로 제어하였다. AcR7VI/K4-M4로 명명된 한 바이러스 클론을 추가 실험을 위하여 선택하였다.
1.2.4 재조합 항-
R7V
항체의 특이성
재조합 항-R7V 항체는 IVAGEN 항-R7V ELISA 키트, 심지어 웰에서 항체의 0.625 μg농도에 상응하는 6.25 μg/㎖에서도 양성이었다. 무관한 항체들은 그들의 농도에 관계없이 음성이었다.
비-진행성 환자로부터 정제된 항-R7V 항체의 경우 이전에 보고한 바와 같이, 재조합 모노클로날 항체는 유동세포분석 (데이타는 나타내지 않음)으로 증명한 바와 같이 어느 세포에도 결합하지 않았다.
1.2.5
HIV
-1의 여러 계통의 중화 분석
환자로부터 정제된 항-R7V 항체들을 넓은 중화 스펙트럼을 나타내기 위하여 기술하였고, 항-R7V 모노클로날 항체를 몇몇 계통에 대한 동일 조건 하에 시험하였다. 치료적 항체로서의 그의 사용을 확인하기 위하여, 중화 분석을 또한 약물-내성 바이러스로 수행하였다(RTMC). 항-R7V 재조합 항체에 미치는 중화 효과를 측정하기 위하여, 세포를 감염시키기 전에 항체의 50 μg/㎖ 희석물을 HIV-I의 몇몇 계통와 혼합하였다. 항-R7V 항체는 HIV-I의 8 계통 및 AZT -내성 계통 B RTMC 바이러스 (도 4)를 중화하였다. 바쿨로바이러스 시스템에서 발현하고 동일한 조건 하에 대조로 사용된 비관련 항체에서 어떠한 중화도 관찰되지 않았다. 85% 이상의 중화가 5 계통 (B, C, D, F, 및 O)에서 얻어졌다. 다양한 백분률의 중화가 다양한 바이러스에 따른 50 μg/㎖의 재조합 항-R7V 항체에서 얻어졌다. HIV 비-진행성 환자로부터 정제된 항-R7V 항체의 것과 동일한, 이와 같은 이질적인 결과는 아마도 바이러스에 의해 존재하는 R7V 에피토프의 가변적인 양 때문이다.
CHO-발현 시스템에서의 재조합 항-R7V 항체의 구축
1)
K4M4
로트
번호 13.11.06: 항-
R7V
ELISA
는 40 μg/㎖에서 양성 결과
표 1. 항-
R7V
항체에 의한 중화
백분률
2)
K4M4
로트
번호 28.02.07: 항-
R7V
ELISA
는 50 μg/㎖에서 양성 결과
표 2. 항-
R7V
항체에 의한 중화
백분률
1.3 결론
본 발명자들은 여기서 바쿨로바이러스 발현 시스템에 의한 재조합 인간 항-R7V 항체의 생산에 관한 결과를 보고한다. 이 시스템은 기능적 재조합 항체의 대량 생산에 매우 신속하고 효과적이다10 , 11, 12. 포유동물 세포에서 관찰되는 모든 후 번역 변형이 인시목(lepidopteran) 세포에서 발현된 재조합 단백질에서 발견되었다. 그러나, N-링크된 올리고사카라이드는 더 짧고 본질적으로 고-만노스 또는 포시만노스(paucimannose) 유형이다30 ,31. 항체들의 생물학적 활성은 면역글로볼린의 CH2 불변 도메인의 Asn-292에 링크된 N-글리칸에 크게 의존한다32 , 33. 이와 같은 불완전한 글로코실화 패턴에도 불구하고, Sf9 세포에서 발현된 재조합 항체는 C1q 및 FcγR 결합을 통해 보체 의존 또는 항체-의존 세포-매개 세포독성과 같은 특이한 생물학적 활성을 나타낸다14 ,16,13.
HIV-1 비-진행성 환자에 의해 생성된 항-R7V 항체를 단리하고 특성화하기 위해, EBV-불멸화된 R7V-반응성 B 세포를 한 환자로부터 선택하고 IgG 또는 IgM 면역글로불린의 가변 영역을 암호화하는 c-DNA를 RT-PCR을 사용하여 특이적으로 증폭하 였다. 이 목적을 위해, 공통 프라이머의 3개의 오리지널 세트를 V 유전자 과이면 무엇이든 인간 VH 및 VL 영역의 특이 증폭을 위해 고안하였다.
신호 서열에서 혼성화된 이들 프라이머들을 각각 인간 일정 영역을 지향하는 3' 프라이머의 세트 γ, μ, κ 및 λ와 결합하는데 사용하였다. 체세포 돌연변이를 겪을 수 있는 "FR" 증폭 계획을 목표로 하는 골격 1 영역과 반대로34 , 35, 신호 서열에서 돌연변이의 빈도는 매우 낮고, 따라서 이 영역에서 중요한 돌연변이 없이 전체 서열의 증폭을 허용한다.
이들 c-DNA의 서열 분석은 이들 불멸화된 세포들이 아마도 오직 하나의 막 IgM 카파 항체를 발현하는 모노클로날임을 나타낸다. VL 서열이 VJ 교차점에서 오직 하나의 사일런트 돌연변이를 갖는 대부분 돌연변이되지 않는 것인 반면, 6개의 돌연변이된 아미노산이 FR3에서 오직 2개의 사일런트 돌연변이를 갖는 도메인의 VDJ 교차점에서 CDR 3 중에 발견되었다. 낮은 돌연변이율이 그것의 가변 영역에서 관찰됨에도 불구하고, 이 재조합 항체는 이것이 유동세포 분석되는 어느 세포와 반응하지 않으므로 다가반응성이 아니다.
이 완전 인간 제조합 항체의 HIV-1 서브타입 A, B, C, D, E, F, N, O 및 항레트로바이러스 치료-내성 바이러스에 대한 중화 용량은 비-진행성 환자로부터의 폴리클로날 항체와 명백히 동일하다. 이 결과는 모든 HIV-1 변이체에 의한, 세포-유래 R7V 에피토프의 획득을 확인한다. 항-R7V 항체 50 μg/㎖로 얻어진 중화의 다양한 백분률은 아마도 바이러스에 존재하는 R7V의 다양한 양과 연결될 것이다. 항 체의 증가된 양은 각 계통에서 100% 중화에 도달하는지 시험되어야 한다.
HIV-감염 환자에 대한 치료제로서 작용하기 위한, 모노클로날 항체에 대한 가장 중요한 특징 중 하나는 중화에 대한 넓은 스펙트럼이다. HIV는 감염 시간에 따라 그리고 항레트로바이러스 처리(탈출 돌연변이의 출현)에 따라 한 개체에서 또 다른 것으로 연속적으로 변하고, 이것은 바이러스 복제를 제어하는 면역 시스템의 어려움을 설명한다. 오늘날, 항-R7V 항체와 별개로, 모두 HIV-1 서브타입 B에 대해 발생하는, 4개의 다른 넓게 중화하는 모노클로날 항체는 이와 같은 효능을 나타낸다. 표면 gp120 상의 CD4 결합 부위에 대해 지향된 IgGlbl2는 파아지 디스플레이 기술에 의해 무증상 HIV-양성 개인으로부터 발생되어왔다36 ,37,38. 2F5 및 4E10 항체는 gp41 39, 40의 불변 부분을 인식하는 반면, 2G12는 gp120 상의 에피토프에 대해 발생된다41 , 42. 이들 4개의 항체들은 널리 중화되는 항체로 보고되었고, 가장 유효한 효과는 이들이 함께 혼합되었을 때 얻어졌다43 ,44.
본 발명자들의 결과에서, 본 발명자들은 재조합 항-R7V 항체가 HIV-1 서브타입 C 단리물을 중화시킨다는 것을 나타내었다. 이 서브타입에서, 모노클로날 항체 2F5와 2G12는 효과가 없고, IgG Ib 12는 일부 효과적이고 오직 4E10만이 상당한 활성을 나타내었다45.
따라서, 항-R7V 항체는 지금까지 기재된 HIV-1에 대한 가장 널리 효과적인 Mab 중 하나로 보인다. 그것의 세포 기원에도 불구하고, R7V 에피토프는 자동면역 반응에 책임이 없고 항-R7V를 생성한 환자 중 어느 누구도 자가면역 질환의 임상적 징후를 갖지 않았다5. 이것은 이 항-R7V 항체가 HIV-감염 환자의 치료에 강력한 후보임을 확인한다.
표 3: 경사슬과 중사슬 가변 영역의 동정을 위한 인간 림프구 c-DBA를 스크린하는데 사용되는 유전자 과-특이 PCR 프라이머
혼합부위에 대해 표준약자가 사용됨: R=A 또는 G, Y=T 또는 C, W= A 또는 T.
참조문헌
SEQUENCE LISTING
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<160> 51
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Complementary determining region (CDR)
<400> 1
Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 2
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Complementary determining region (CDR)
<400> 2
Trp Ala Ser
1
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Complementary determining region (CDR)
<400> 3
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Gln Thr
1 5
<210> 4
<211> 135
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Variable region of light (K4) chain (Fig. 3B)
<400> 4
Leu Trp Ile Ser Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro
1 5 10 15
Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys
20 25 30
Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala
35 40 45
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp
50 55 60
Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
65 70 75 80
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp
85 90 95
Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Gln Thr Phe
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser
115 120 125
Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
130 135
<210> 5
<211> 405
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Variable region of light (K4) chain (Fig. 3A)
<400> 5
ctctggatct ctggtgccta cggggacatc gtgatgaccc agtctccaga ctccctggct 60
gtgtctctgg gcgagagggc caccatcaac tgcaagtcca gccagagtgt tttatacagc 120
tccaacaata agaactactt agcttggtac cagcagaaac caggacagcc tcctaagctg 180
ctcatttact gggcatctac ccgggaatcc ggggtccctg accgattcag tggcagcggg 240
tctgggacag atttcactct caccatcagc agcctgcagg ctgaagatgt ggcagtttat 300
tactgtcagc aatattatag tactcctcag acttttggcc aggggaccaa gctggagatc 360
aaacgaactg tggctgcacc atctgtcttc atcttcccgc catcg 405
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> CDR
<400> 6
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr
1 5
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> CDR
<400> 7
Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> CDR
<400> 8
Ala Arg Gly Arg Ser Trp Phe Ser Tyr
1 5
<210> 9
<211> 129
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Variable region of heavy (M4) chain (Fig. 3D)
<400> 9
Pro Arg Trp Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly
1 5 10 15
Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly
20 25 30
Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly
35 40 45
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn
50 55 60
Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser
65 70 75 80
Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr
85 90 95
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Ser Trp Phe Ser Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr
115 120 125
Leu
<210> 10
<211> 388
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Variable region of heavy (M4) chain (Fig. 3C)
<400> 10
cccagatggg tcctgtccca ggtgcagctg caggagtcgg gcccaggact ggtgaagcct 60
tcggagaccc tgtccctcac ctgcactgtc tctggtggct ccatcagtag ttactactgg 120
agctggatcc ggcagccccc agggaaggga ctggagtgga ttgggtatat ctattacagt 180
gggagcacca actacaaccc ctccctcaag agtcgagtca ccatatcagt agacacgtcc 240
aagaaccagt tctccctgaa gctgagctct gtgaccgccg cagacacggc cgtgtattac 300
tgtgcgagag gccgttcgtg gtttagctac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360
tcagggagtg catccgcccc aacccttt 388
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> R7V epitope
<400> 11
Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val
1 5
<210> 12
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> pVT-Ck (Fig. 1A)
<400> 12
atggacatgc gtgtgcccgc tcaactcctg ggcctgctgc tgctctggct cccaggtgcg 60
cgctgtcgta cg 72
<210> 13
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> pVT-Ck (Fig. 1A)
<400> 13
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Arg Cys Arg Thr
20
<210> 14
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> pVT-Cγ1 (Fig. 1B)
<400> 14
atggagttcg gcctgagctg gctgttcctg gtggctattc ttaagggtgt ccagtgtgct 60
agc 63
<210> 15
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> pVT-Cγ1 (Fig. 1B)
<400> 15
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Ala Ser
20
<210> 16
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer FOR-M4
<400> 16
ccatcttaag ggtgtccagt gtcaggtgca gctgcaggag tcgggcccag gactggtgaa 60
gc 62
<210> 17
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer BAC-M4
<400> 17
gcatgctagc tgaggagacg gtgaccaggg t 31
<210> 18
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer FOR-K4
<400> 18
cgatgcgcgc tgtgacatcg tgatgaccca gtct 34
<210> 19
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer BAC-K4
<400> 19
cgatcgtacg tttgatctcc agcttggtcc cctggcc 37
<210> 20
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer hVH1/VH7
<400> 20
atggactgga cctggag 17
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer hVH2
<400> 21
atggacatac tttgttcc 18
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer hVH3
<400> 22
atggagtttg ggctgagc 18
<210> 23
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer hVH4
<400> 23
atgaaacacc tgtggtt 17
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer hVH5
<400> 24
atggggtcaa ccgccatc 18
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer hVH6
<400> 25
atgtctgtct ccttcctc 18
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer hCG
<400> 26
ggaagtagtc cttgaccagg cag 23
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer hCM
<400> 27
ggagacgagg gggaaaaggg t 21
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer hVL1a
<400> 28
tcactgcaca ggstccwggg cc 22
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer hVL1b
<400> 29
tcactgtgca gggtcctggg cc 22
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer hVL2
<400> 30
ctcctcactc aggrcacagg 20
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer hVL3a
<400> 31
ctcctcacty tctgcacag 19
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer hVL3b
<400> 32
ctcctctctc actgcacag 19
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer hVL3c
<400> 33
tccttgctta ctgcacagga 20
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer hVL3d
<400> 34
tcactctttg cataggttct gtg 23
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer hVL4
<400> 35
ctcctcctcc actgsacagg g 21
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer hVL5
<400> 36
ttcctctctc actgcacagg 20
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer hVL6
<400> 37
ctcctcgctc actgcacag 19
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer hVL7
<400> 38
ctcctcacty gctgcccagg g 21
<210> 39
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tcagctcctg gggctyctg 19
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<223> Primer hCK
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gatggcggga agatgaagac agatgg 26
1
Claims (16)
- 단리된 항체, 또는 그것의 기능적 단편으로, 상기 항체 또는 그것의 상기 단편은 R7V 에피토프(RTPKIQV - SEQ ID No 11)에 특이적으로 결합하고 HIV 균주를 중화할 수 있고, 여기서 항체는:i) 아미노산 서열 SEQ ID No 1 (QSVLYSSNNKNY), SEQ ID No 2 (WAS) 및 SEQ ID No 3 (QQYYSTPQT)을 포함하는 상보성 결정 영역 CDR 또는 최적 정렬 후, 서열 SEQ ID No 1, 2 또는 3과 최소한 80%, 바람직하기는 90% 동일한 서열을 갖는 CDR을 포함하는 경사슬, 그리고ii) 아미노산 서열 SEQ ID No 6(GGSISSYY), SEQ ID No 7 (IYYSGST) 및 SEQ ID No 8 (ARGRSWFSY)을 포함하는 CDR, 또는 최적 정렬 후, 서열 SEQ ID No 6, 7 및 8과 최소한 80%, 바람직하기는 90% 서열 동일성을 갖는 CDR을 포함하는 중사슬을 포함하는 것인 항체.
- 제1항에 있어서, 완전 인간 모노클로날 항체 또는 그것의 기능적 단편인 항체.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 최적 배열 후, 도 3B - SEQ ID No 4에 도시한 아미노산 서열과 최소한 80%, 바람직하기는 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬, 또는 도 3A-SEQ ID No 5에 도시된 서열 또는 최적 배열 후 SEQ ID No 5와 최소한 80%, 바람직하기는 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 경사슬을 포함하는 것인 항체.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 최적 배열 후, 도 3D - SEQ ID No 9에 도시한 아미노산 서열과 최소한 80%, 바람직하기는 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬, 또는 도 3C - SEQ ID No 10에 도시된 서열 또는 최적 배열 후, SEQ ID No 10과 최소한 80%, 바람직하기는 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 중사슬을 포함하는 것인 항체.
- 제1항에 있어서, 도 3B - SEQ ID No 4에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 경사슬과 도3D - SEQ ID No 9에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 중사슬을 포함하거나, 또는 Fv, scFv, Fab, F(ab')2, F(ab'), scFv-Fc 유형 또는 디아바디(diabodies)로부터 선택되는 그들의 기능적 단편인 것인 항체.
- 최적 배열 후, SEQ ID NO. 5와 최소한 80%, 바람직하기는 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 단리된 핵산.
- 최적 배열 후, SEQ ID NO. 10과 최소한 80%, 바람직하기는 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 단리된 핵산.
- 제6항 또는 제7항에 정의된 바에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
- 제6항에 정의된 바에 따른 핵산 서열과 제7항에 정의된 바에 따른 핵산 서열을 포함하는 바쿨로바이러스 전달 벡터.
- 제8항 또는 제9항에 따른, 벡터에 의해 변형되거나 벡터를 포함하는 숙주세포.
- 제10항에 있어서, 상기 숙주 세포는 Sf9 세포와 같은 곤충세포, 세균 세포, 이스트 세포, 동물 세포, 특히 EBV 불멸화된 B 림프구, CHO, 저 푸코실화된 항체를 생성하기 위해 유전적으로 변형된 CHO, 또는 YB2/0와 같은 포유동물 세포인 숙주세포.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항체, 또는 그들의 기능적 단편의 제조방법으로, 상기 방법은:a) 제10항 또는 제11항에 따른 숙주 세포를 매질 및 적절한 배양 조건에서 배양하는 단계; 그리고b) 상기 배양된 세포의 배양 매질로부터 상기 항체를 추출하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 의약으로서의, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항체, 또는 그것의 기능적 단편.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 항체 또는 그것의 기능적 단편, 및 부형제 및/또는 약제학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는 약제학적 조성물.
- AIDS의 치료에 현재 사용되는 하나 이상의 시약과 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는, 동시, 분리 또는 연속 사용을 위한 조합물.
- 예를 들면, HAART 치료 하의 환자 및 특히 HAART 치료에 실패한 환자 중에서 HIV 감염, AIDS의 치료를 위한, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
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