KR20100009305A - 키토산 스폰지의 제조방법 및 이를 이용한 창상도포재 - Google Patents

Abstract

본 발명은 키토산에 소수성 지방산기를 결합시켜 세포부착 단백질의 부착능이 증대된 키토산 스폰지와 이를 이용한 창상도포재를 제공한다.

이를 통해, 세포부착단백질이 결합이 매우 증대되며 이를 창상도포재로 사용하는 경우 피부재생능이 현저히 향상된다. 나아가, 특정한 가교제를 사용하여 키토산 스폰지의 제조 시 스폰지가 부서지는 것을 방지할 수 있다.

키토산 스폰지, 창상도포재

Description

키토산 스폰지의 제조방법 및 이를 이용한 창상도포재{MANUFACTURING METHOD OF CHITOSAN SPONGE AND WOUND DRESSING USING THEREOF}

본 발명은 키토산 스폰지의 제조방법 및 이를 이용한 창상도포재에 관한 것으로, 보다 상세하게는 키토산과 소수성 지방산기를 결합시켜 세포부착성을 강화시킨 키토산 스폰지의 제조방법 및 이를 이용한 창상도포재에 관한 것이다.

피부는 우리 몸 중 가장 큰 표면적을 차지하며, 광범위하게 손상시 탈수 등으로 인해 생명을 잃을 수도 있는 중요한 기관으로서, 외부의 미생물이나 자외선, 화학물질 등 여러 가지 유해 환경으로부터 인체를 보호하고, 인체의 수분증발을 억제하여 탈수를 방지하고 체온을 조절하는 역할을 하고 있는 바, 피부는 물리적 자극에 강해야 하고 탄력성이 있어야 하며 인체가 생명체를 유지하는 동안 그 역할을 충분히 수행해야 한다.

그러나, 심한 화상, 외상, 창상, 욕창 및 피부질환 등 다양한 원인에 의한 피부 손상은 흔하게 일어나고 있으며, 특히 일차봉합이 불가능한 심한 창상의 경우 피부이식이 불가피하다. 손상된 피부조직의 복구는 중요한 문제이며, 현재 이를 위한 방법으로는, 환자자신의 피부를 이식하는 자가이식 (autograph), 다른 사람의 피부를 이식하는 동종이식 (homograph 또는 allograph), 동물의 피부를 이식하는 이종이식 (heterograph 또는 xenograph)의 세 가지가 있다. 이들 중, 자가이식이 가장 이상적이지만 넓은 범위의 화상인 경우 확보가능한 조직부위에 제한이 있고 피부를 채취한 건강한 부위에 새로운 외상이 발생되어 환자의 고통이 증가하며 완치기간이 길어지는 문제점이 있다. 나아가, 넓은 면적에 걸쳐 심한 화상을 입은 경

우, 이식에 사용가능한 건강한 피부를 확보할 수 없어 수 차례에 걸친 이식수술이 필요하다.

한편, 영구적 생착보다는 상처주변부의 세포의 이동과 치유를 돕는 동종이식의 경우, 사체로부터의 피부를 글리세롤 등에 냉동 보존하여 일시적인 보호제로서 사용하기도 하며 사체의 피부에서 면역반응을 일으킬 수 있는 세포들을 완전히 제거한 탈표피화/탈세포화된 진피(de-epidermized dermis)의 형태로 만들어서 사용하기도 한다.

이종이식의 경우에는 인체 피부 기증자의 공급 부족에 대한 대안으로서 동결 건조시킨 돼지피부를 사용하기도 하는데, 이 경우 피부원 공급은 안정적이지만, 초급성 거부반응(hyperacute rejection reaction)등의 문제가 있다. 따라서 최소한의

적당한 수분의 투과성을 가지는 동시에 세균 등과 같은 외부 환경을 차단하여 인체를 효과적으로 보호할 수 있는 기능을 가진 인공피부의 개발이 절실히 요구되고 있다.

한편, 인공피부는 일시적 피복형(temporary skin equivalent), 이른바 창상 도포재(WOUND DRESSING)와, 배양 피부 또는 체내 이식용인 영구생착형(permanent skin equivalent)의 두 가지로 대별된다. 창상도포재는 화상이나 외상 등으로 손상을 입은 피부가 회복할 때까지 일시적으로 환부를 보호하는 것으로, 체내로부터의 수분 누출 방지, 삼출액의 흡수 및 외부로부터 잡균 침입과 감염 방지의 역할을 하며, 현재 겔-응용품 이외, 폴리우레탄막 또는 천연 다당류인 키틴을 이용한 다공성 막이나 돼지가죽의 동결건조물 등으로 제조되어 여러 가지 제품이 임상학적으로 사용되고 있다.

피부이식에 사용되고 있는 창상 도포재 또는 조직공학 구조체용 재료로서, 미국특허 제 5143071호는 폴리비닐피롤리돈과 폴리에틸렌옥사이드를 포함한 수용액에 광을 조사하여 가수겔을 제조하는 방법 및 그에 따라 제조된 가수겔에 대해 개시하고 있으며, 미국특허 제 4,773,409호는 one-shot 공정에 의해 폴리에틸렌글리콜, 이소시아네이트, 촉매, 물, 수용성 또는 수팽윤성 고분자를 혼합하는 것을 특징으로 하는 친수성 폴리우레탄폼계 드레싱제의 제조방법을; 미국특허 제4,375,519호는 폴리테르타플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene: PTFE) 피브릴 매트릭스에 친수성 흡수가능한 입자를 첨가하는 것을 특징으로 하는 창상도포재 제조방법이 개시되었고, 미국특허 제4,563,184호는 디메틸설폭시드를 수소결합가소제로서 포함한, 폴리(2-히드록시에틸메타크릴레이트) (poly (2-hydroxyethyl methacrylate: PHEM)의 폴리에틸렌글리콜용액으로부터 제조된 합성 창상도포재 및, 실리콘 가아제, 가교 폴리비닐알콜 스폰지, 폴리아마이드, 폴리에스테르 섬유, 폴리프로필렌 섬유, 레이온 섬유등 합성고분자를 이용하여 제조된 창상도포재를 개시하고 있으나, 상기 기술 모두, 생체와의 거부반응, 기계적 성질 및 밀착성의 결여 등의 문 제점으로 인공피부로서의 충분한 기능을 발휘하지 못하고 있다.

한편, 최근 미국, 유럽, 일본 등에서는 콜라겐을 이용하여 제조된 인공피부가 소개되고 있는 바, 예를 들어, 미국특허 제4,294,214호는 콜라겐 또는 화학적으로 변형된 콜라겐을 겔이나 시트 형태로 제조한 인공피부를 개시하였고, 미국특허 제 4,984,540호는 동결건조로 제조된 다공성의 콜라겐 드레싱 시트 재료의 제조를 개시하였으며, 미국특허 제 6,051,425호는 서로 다른 특성을 가진 두 개의 스폰지로 구성된 조직배양용 콜라겐 적층 스폰지 제조방법을 개시하고 있다. 상기 기술들에 따라, 인체 섬유아세포 및 표피세포를 초기에 배양하고, 이를 수화된 콜라겐에서 3차원적으로 배양하여 수득한 생인공진피의 경우 화상환자 및 성형환자에 대한 임상 응용시 상처 치유 촉진 및 상흔 감소의 면에서 우수한 효과를 얻는 것으로 알려져 있으나, 상기 기술들은 동물 콜라겐을 이용해야 하므로 그 제조비용이 높아 매우 높은 가격으로 시판되고 있으며, 수화된 콜라겐 젤을 이용하므로 경도가 부족한 문제가 있다.

현재, 피부이식에서의 이상적 방법은 이식대상자의 조직으로부터 얻은 건강한 세포를 잘 발달된 미세기공구조의 조직공학용 구조체와 복합화하고 이를 조직손상부에 이식함으로써, 이식된 부위에 증식된 세포로 조직 전체를 재생하고, 조직공학용 구조체로 사용된 재료는 시간경과에 따라 체내에서 서서히 분해·흡수되도록 하는 것인 바, 이러한 이상적 피부이식을 저렴한 비용으로 가능하게 할 조직공학 구조체용 재료에 대해 활발한 연구가 이루어지고 있다.

한편, 키토산은 자연계에 존재하는 다당류의 일종으로 게, 새우의 껍질과 오 징어의 뼈, 곰팡이 및 세균 등의 미생물의 세포벽에 함유되어 있는 키틴을 탈아세틸하여 수득되는 화합물로써, 1980년대 중반부터 그 다양한 산업분야에서 이용되고 있다. 이러한 키토산의 주요 용도는, 과거에는 주로 응집제, 중금속 흡착제, 염료폐수 정화제 등의 폐수처리 분야와 토양개량제, 살충제, 식물항바이러스제, 농약 등 농업분야에 한정되었으나, 키토산의 장점과 다양한 특성이 밝혀지면서 식품과 음료 응용분야, 보건위생 응용분야, 화장품 응용분야, 섬유관련 응용분야, 의약품 응용분야 등으로 그 범위를 더욱 확대해 가고 있다. 특히 1990년대부터 의료용 재료로서 주목받고 있으며, 이에 관해 상처 치유제, 인공 피부, 약전성 재료, 혈액 응고제, 인공 신장막, 생분해성 수술용 봉합사, 항균성 재료에서의 키토산의 이용이 보고되고 있다.

보다 구체적으로, 키틴, 키토산 관련 창상도포재에 관해 거의 최초의 특허라 할 수 있는 독일특허 DE 1,906,155호, DE1,906,159호는 분쇄된 키틴 분말이 상처회복에 우수한 효과를 나타내는 것을 개시하고 있고, 미국특허 제 3,632,754호,일본공개특허 3,914,413호는 키틴이 창상치유를 촉진시키며, 라이조자임에 분해되는 성질이 있어 생리적으로 용해될 수 있음을 개시하고 있다. 또한, 미국등록특허 제 4,651,725호는 키틴 섬유 부직포(nonwoven fabric)로 이루어진 창상도포재 제조방법을 개시하고 있다.

그러나, 이러한 방법들에 의하여 제조된 키토산 스폰지 유래의 창상도포재는 소수성이 부족하여 키토산 스폰지에 세포부착 단백질을 부착하는 경우 접착력이 떨어지는 문제가 있었다. 그러므로 키토산 스폰지에는 세포부착 단백질이 거의 사용 될 수 없었다. 또한 키토산 스폰지가 수용액상에서 제조될 때 부서지는 경우가 많이 발생하였다.

본 발명은 상술한 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 키토산에 소수성 지방산기를 결합시켜 키토산 스폰지와 세포부착 단백질간의 접착능이 증대된 키토산 스폰지와 이를 이용한 창상도포재를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 피부 재생능을 향상시키기 위하여 키토산 스폰지에 세포부착 단백질을 코팅하거나 혼합한 키토산 스폰지와 이를 이용한 창상도포재를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 키토산 스폰지의 제조 시 부서지는 것을 방지하기 위하여 특정한 가교제가 사용된 키토산 스폰지 및 이를 이용한 창상도포재를 제공하는 것이다.

상술한 과제를 해결하기 위한 본 발명의 한 특징에 따른 키토산 스폰지의 제조방법은, 1) 키토산에 소수성 지방산기를 결합시켜 키토산 스폰지 용액을 제조하는 단계, 2) 상기 키토산 스폰지 용액을 동결건조하여 키토산 스폰지를 제조하는 단계 및 3) 상기 키토산 스폰지의 표면을 세포부착 단백질 용액으로 코팅하는 단계를 포함한다.

상기 소수성 지방산기는 바람직하게는 상기 소수성 지방산기는 소수성 지방산기는 프로피온산(propionic acid), 발레산(valeric acid), 헥산산(hexanoic acid) 팔미트산(palmitic acid), 뷰틱산(butyric acid) 및 이들의 무수물로 구성 되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

상기 1)단계에서 바람직하게는 키토산의 글루코사민 잔기 당 소수성 지방산기가 0.1 ~ 1 몰 당량으로 결합될 수 있으며, 상기 1) 단계의 키토산 스폰지 용액의 용매는 초산, 삼불화초산, 염산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드 등의 용액을 단독 또는 혼합하여 사용할 수 있다.

상기 동결건조는 바람직하게는 -80℃ 내지 -70℃에서 12 ~ 24 시간 동안 수행될 수 있다.

상기 2) 단계와 3) 단계 사이에 바람직하게는 키토산 스폰지 용액에 가교제를 더 첨가할 수 있으며, 상기 가교제는 바람직하게는 헥사메틸렌 디이소시아네이트, 글루타알데하이드(Glutaaldehyde), 에피클로로히드린(Epichlorohydrine)로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 사용할 수 있다. 또한 가교제를 대신하여 γ선 조사를 할 수도 있다.

상기 3)단계 이후 키토산 스폰지를 동결건조하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 세포부착 단백질은 바람직하게는 리제닌(regenin)이고, 세포부착 단백질 용액의 용매는 정제수를 사용할 수 있다.

상기 소수성 지방산기와 결합된 키토산은 바람직하게는 디아세틸화도가 80% 이상의 키토산이다.

상술한 과제를 해결하기 위한 본 발명의 다른 특징에 따른 키토산 스폰지의 제조방법은, 1) 키토산에 세포부착성을 높이기 위하여 소수성 지방산기를 결합시켜 키토산 스폰지 용액을 제조하는 단계, 2) 상기 키토산 스폰지 용액에 세포부착 단백질 용액을 혼합하는 단계 및 3) 상기 혼합된 용액을 동결건조하는 단계를 포함한다.

상기 3) 단계 이후에 바람직하게는 키토산 스폰지 용액에 가교제를 더 첨가할 수 있으며 그 뒤 동결건조 과정을 수행할 수 있다.

상기 키토산 스폰지 용액 100중량부에 대하여 바람직하게는 세포부착 단백질 용액 0.1 ~ 1 중량부가 혼합될 수 있다.

상술한 본 발명의 키토산 스폰지의 제조방법을 통해 제조된 키토산 스폰지는 창상도포재로 활용될 수 있다.

본 발명을 통해 제조된 키토산 스폰지는 키토산에 소수성을 부여하여 세포부착단백질이 결합이 매우 증대된다. 따라서, 이를 창상도포재로 사용하는 경우 피부재생능이 현저히 향상된다. 나아가, 특정한 가교제를 사용하여 키토산 스폰지의 제조 시 스폰지가 부서지는 것을 방지하였다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 종래의 키토산 스폰지로 제조된 창상도포재의 경우 소수 성이 부족하여 손상된 피부의 재생에 도움이 되는 세포부착 단백질이 상기 창상도포재에 결합되는데 한계가 있었다. 이런 문제로 키토산 스폰지에 세포부착 단백질을 부착하지 않고 창상도포재로 활용하였으므로 세포재생능력이 떨어지게 되었다. 또한 키토산 스폰지가 수용액상에서 제조될 때 부서지는 경우가 많이 발생하였다.

이에 본 발명에서는 키토산 스폰지의 제조 시 키토산에 세포부착 단백질의 부착성을 높이기 위하여 소수성 지방산기를 결합시키고, 특정한 가교제를 첨가하여 상술한 문제점을 해결하였다.

이에 따른, 본 발명의 일실시예에 따른 키토산 스폰지의 제조방법은, 1) 키토산에 세포부착성을 높이기 위하여 소수성 지방산기를 결합시켜 키토산 스폰지 용액을 제조하는 단계, 2) 상기 키토산 스폰지 용액을 동결건조하여 키토산 스폰지를 제조하는 단계 및 3) 상기 키토산 스폰지의 표면을 세포부착 단백질 용액으로 코팅하는 단계를 포함한다.

먼저, 1)단계로서 키토산에 세포부착성을 높이기 위하여 소수성 지방산기를 결합시켜 키토산 스폰지 용액을 제조한다.

본 발명에 사용되는 키토산은 창상도포재에 사용되는 키토산 스폰지에 사용될 수 있는 것이면, 종류 및 물성에 제한이 없지만, 바람직하게는 키틴을 탈아세틸화한 것으로, 점도가 2 cps 내지 800 cps이며, 탈아세틸화도는 50 % 내지 99 %의 것을 사용할 수 있다.

상기 소수성 지방산기는 친수성인 키토산과 결합하여 키토산에 소수성을 부 여한다. 이를 통해 키토산 스폰지에 대한 세포부착단백질의 결합성이 증진되며, 이러한 소수성 지방산기로는 바람직하게는 상기 소수성 지방산기는 소수성 지방산기는 프로피온산(propionic acid), 발레산(valeric acid), 헥산산(hexanoic acid) 팔미트산(palmitic acid), 뷰틱산(butyric acid) 및 이들의 무수물로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 사용할 수 있다. 한편 소수성 지방산기와 결합된 키토산은 바람직하게는 N-아실레이티드 키토산을 형성하게 된다.

상기 1)단계에서 바람직하게는 키토산의 글루코사민 잔기 당 소수성 지방산기가 0.1 ~ 1 몰 당량으로 결합될 수 있다.

한편, 상기 1) 단계의 키토산 스폰지 용액의 용매는 특별히 제한은 없지만 바람직하게는 아세트산으로서 바람직하게는 1% 아세트산, TFA, HCl, 클로로포름 등을 사용할 수 있으며, 전체적으로 용매 100중량부에 대하여 키토산 1 ~ 10 중량부 및 소수성 지방산기 0.0005 ~ 0.1 중량부를 혼합하여 키토산 스폰지 용액을 제조할 수 있다.

다음, 2)단계로서 상기 1)단계를 통해 제조된 키토산 스폰지 용액을 동결건조하여 키토산 스폰지를 제조한다.

구체적으로 '동결건조'라 함은 재료를 동결시킨 다음 높은 진공장치내에서 액체상태를 거치지 않고, 기체상태의 증기로 승화시켜 건조하는 방법으로, 일반 건조방법보다 훨씬 고품질의 제품을 얻을 수 있고, 동결된 상태에서 수분이 제거되므로 건조된 제품은 가벼운 스폰지 형태를 가지는 특징을 가지며, 현재 식품과 제약, 미생물의 건조에 이용되는 고품질의 상품을 얻는 데에 적합한 건조방법이다.

본 발명에서 동결건조의 조건은 바람직하게는 -80℃ 내지 -70℃에서 12 ~ 24 시간 동안 수행될 수 있다.

상기 2) 단계와 3) 단계 사이에 바람직하게는 동결건조된 키토산 스폰지에 가교제를 더 첨가할 수 있으며, 상기 가교제는 바람직하게는 헥사메틸렌 디이소시아네이트, 글루타알데하이드(Glutaaldehyde), 에피클로로히드린(Epichlorohydrine)로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 사용할 수 있다. 바람직하게는 상기 vapor 법에 의하여 가교될 수 있다. 또한 가교제를 대신하여 γ선 조사를 할 수도 있다.

마지막으로, 상기 2)단계를 거쳐 동결건조된 키토산 스폰지의 표면을 세포부착 단백질 용액으로 코팅하여 키토산 스폰지를 제조한다.

구체적으로 세포부착 단백질은 주요 성장인자가 유도된 기질단백질로서 창상도포재로 이용될 경우 세포부착의 매개체이자 피부재생을 돕는 역할을 수행하는 것으로 바람직하게는 리제닌을 사용할 수 있다.

한편, 세포부착 단백질 용액에 사용되는 용매는 바람직하게는 정제수를 사용할 수 있으며 상기 용매 100중량부에 대하여 세포부착 단백질 0.1 ~ 1중량부가 혼합될 수 있다.

한편, 상기 3)단계를 거쳐 세포부착 단백질이 코팅된 키토산 스폰지를 다시 한번 동결건조시키는 것도 가능하며 이 경우 동결건조 온도는 -80℃ 내지 -70℃이 고 시간은 12 ~ 24시간이다.

한편, 본 발명의 해결하기 위한 본 발명의 제2 실시예에 따른 키토산 스폰지의 제조방법은, 1) 키토산에 세포부착성을 높이기 위하여 소수성 지방산기를 결합시켜 키토산 스폰지 용액을 제조하는 단계, 2) 상기 키토산 스폰지 용액에 세포부착 단백질 용액을 혼합하는 단계 및 3) 상기 혼합된 용액을 동결건조하는 단계를 포함한다. 상기 제1실시예에서는 세포부착 단백질을 동결건조된 키토산 스폰지에 코팅하여 키토산 스폰지를 제조하였다면, 제2 실시예에서는 동결건조 되기 전의 키토산 스폰지 용액에 세포부착 단백질을 혼합한 후 이를 동결건조하여 키토산 스폰지를 제조하는 것에 그 특징이 있으며, 이를 제외하고는 상기 제1 실시예에 따른 키토산 스폰지의 제조방법과 그 내용이 동일하다.

이하에서는 상기 제1 실시예와 상이한 부분을 중심으로 제2 실시예를 설명한다.

먼저, 제1)단계로서 키토산에 세포부착성을 높이기 위하여 소수성 지방산기를 결합시켜 키토산 스폰지 용액을 제조하며 이는 상기 제1 실시예와 동일하다.

다음, 제2)단계로서 상기 키토산 스폰지 용액에 세포부착 단백질 용액을 혼합하여 혼합용액을 제조하는데 이 단계에서 제1실시예와 구별된다. 보다 구제적으로 사용되는 세포부착 단백질 용액은 제1실시예와 동일하나 키토산 스폰지 용액 100중량부에 대하여 바람직하게는 세포부착 단백질 용액 0.1 ~ 1 중량부가 혼합될 수 있다.

마지막으로 키토산 스폰지 용액을 동결건조하여 키토산 스폰지를 제조한다.

한편, 상기 3) 단계 이후 바람직하게는 동결건조된 키토산 스폰지에 가교제를 더 첨가할 수 있으며, 가교제의 종류 및 첨가량은 실시예 1과 동일하다. 그 뒤 키토산 스폰지를 다시 한번 동결건조할 수 있다.

상술한 2 가지의 키토산 스폰지의 제조방법을 통해 제조된 키토산 스폰지는 창상도포재로 활용될 수 있으며, 이 경우 키토산에 소수성이 부여되어 세포부착단백질이 결합이 매우 증대되므로 피부재생능이 현저히 향상된다. 나아가, 특정한 가교제를 사용하여 키토산 스폰지의 제조 시 스폰지가 부서지는 것을 방지할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 세포부착 단백질이 코팅된 키토산 스폰지의 제조

(1) 키토산 스폰지 용액의 제조

키토산에 지방산기를 붙이는 방법은 ①: 키토산 0.5g을 20% 아세트산 10ml에 녹였다. 완전히 녹인 키토산 용액을 50ml 메탄올에 희석시켰다. ②: 그리고 프로피온산 무수물 0.0727ml을 메탄올 50ml에 녹였다. ③: 단계①의 용액에 단계②의 용액을 첨가하여 키토산의 글루코사민 잔기(glucosamine residue) 당 각각의 프로피온산 무수물이 0.4몰 당량으로 결합되도록 하였다. 그 뒤 키토산 스폰지 용액을 실 온에서 12시간 정도 반응시켰다. 반응이 진행되는 동안 키토산 스폰지 용액은 겔화가 진행되며 여기에 100ml 아세톤을 넣어준 후 세게 흔들어 겔이 깨지도록 교반하였다. 그 뒤 3,000rpm으로 10분동안 원심분리를 수행하여 상등액을 제거하였다. (이 과정을 아세톤으로 3번, diethyl ether로 3번 반복하여 wash) 그리고 overnight 동안 진공건조를 하여 dry 시켰다. 이를 통해 최종적으로 0.4몰 당량 N-아실레이티드 키토산을 제조하였다.

수성 지방산기가 결합된 키토산 스폰지 용액은 1% 아세트산을 용매로 사용하였고 여기에 4 wt% 키토산과 소수성 지방산기가 결합된 키토산 0.001 wt%를 녹여 최종적으로 소수성 지방산기가 결합된 키토산 스폰지 용액을 제조하였다.

(2) 세포부착단백질이 코팅된 키토산 스폰지의 제조

상기 (1)단계를 통해 제조된 키토산 스폰지 용액을 디프리져를 사용하여 -70℃로 18시간 동안 동결시킨 뒤, 동결 건조기로 -70℃로 12시간 동안 동결 건조시켜 키토산 스폰지를 제조하였다. 상기 키토산 스폰지를 챔버에 넣은 후 종이타월에 글루타르알데하이드를 10 ml 적신 후 이를 챔버에 투입하여 1시간동안 글루타알데하이드 vapor법을 사용하여 가교시켰다. 그 뒤 이를 중화시키기 위하여 0.1N NaOH에서 10분 동안 3D-rocking을 사용하여 잘 교반시킨 후 키토산 스폰지를 수세하였다.

그 뒤 용매 1㎖ 당 10㎕의 세포부착단백질(리제닌)의 혼합비로 혼합된 세포부착단백질 용액을 준비한 후, 상기 키토산 스폰지를 1시간동안 침지시켜 키토산 스폰지의 표면에 세포부착단백질을 코팅하였다. 그 뒤 키토산 스폰지를 18시간 동안 -70℃로 동결시킨 후 12시간동안 -70℃로 동결건조시켜 세포부착 단백질이 코팅된 키토산 스폰지를 제조하였다.

<실시예 2>

소수성 지방산기로서 뷰틱산 무수물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하여 세포부착 단백질이 코팅된 키토산 스폰지를 제조하였다.

<실시예 3>

소수성 지방산기로서 헥산산 무수물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하여 세포부착 단백질이 코팅된 키토산 스폰지를 제조하였다.

<실시예 4>

소수성 지방산기로서 팔미트산 무수물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하여 세포부착 단백질이 코팅된 키토산 스폰지를 제조하였다.

<실시예 5> 세포부착 단백질이 혼합된 키토산 스폰지의 제조

키토산 스폰지에 세포부착단백질을 코팅하는 것을 대신하여 제조예를 통해 제조된 키토산 스폰지 용액 1g당 1.5ul 세포부착 단백질을 첨가 후 10분간 버티컬 혼합기(vertical rotary)를 사용하여 혼합한 후 이를 동결건조하여 키토산 스폰지를 제조하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하여 세포부착 단백질이 혼합된 키토산 스폰지를 제조하였다.

<실시예 6>

소수성 지방산기로서 뷰틱산 무수물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5와 동일하게 실시하여 세포부착 단백질이 혼합된 키토산 스폰지를 제조하였다.

<실시예 7>

소수성 지방산기로서 헥산산 무수물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5와 동일하게 실시하여 세포부착 단백질이 혼합된 키토산 스폰지를 제조하였다.

<실시예 8>

소수성 지방산기로서 팔미트산 무수물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5와 동일하게 실시하여 세포부착 단백질이 혼합된 키토산 스폰지를 제조하였다.

<비교예 1>

소수성 지방산기를 결합시키되 세포부착 단백질을 사용하지 않는 키토산 스폰지 용액을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하여 키토산 스폰지를 제조하였다.

<비교예 2>

소수성 지방산기를 결합시키지 않고 세포부착 단백질을 사용한 키토산 스폰지 용액을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하여 키토산 스폰지를 제조하였다.

<비교예 3>

소수성 지방산기를 결합시키지 않고 세포부착 단백질을 사용한 키토산 스폰지 용액을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 5와 동일하게 실시하여 키토산 스폰지를 제조하였다.

<실험예>

상기 실시예 1 ~ 8 및 비교예 1 ~ 3에서 제조된 키토산 스폰지의 세포부착성을 확인하기 위하여 590㎚에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 표 1에 나타내었다. 상기 흡광도는 효소면역반응 측정기(Microplate Reader)를 사용하여 측정하였으며 흡광도가 높을수록 세포부착단백질의 부착률이 높다.

[표 1]

	흡광도
실시예 1	0.2130
실시예 2	0.3565
실시예 3	0.2325
실시예 4	0.2765
실시예 5	0.1750
실시예 6	0.1515
실시예 7	0.1765
실시예 8	0.1595
비교예 1	0.1030
비교예 2	0.1355
비교예 3	0.1289

표 1에서 알 수 있듯이, 실시예 1 ~ 8의 키토산 스폰지의 흡광도 값이 비교예에 비하여 매우 높음을 확인할 수 있다. 나아가, 실시예 2, 4의 흡광도의 수치가 매우 높고 동일한 조건의 실시예 6 및 8, 비교예와의 편차가 큼을 고려할 때, 소수성 지방산기로서 뷰틱산 또는 팔미트산을 사용하고 세포부착 단백질을 코팅하는 것이 다른 방법에 비하여 세포부착성을 현저히 향상시킬 수 있는 것을 확인할 수 있다.

한편, 도 1은 면역염색법에 의해 키토산스폰지 표면에 존재하는 리제닌을 확인한 사진으로서(8배 확대) 이 중 A, C 및 E 도면은 각각 소수성 지방산기를 첨가하지 않은 키토산 스폰지에 대하여 리제닌도 첨가하지 않거나(A 도면), 리제닌을 코팅하거나(C 도면), 리제닌을 혼합한 것이다(E 도면). 또한 B, D 및 F 도면은 소수성 지방산기를 첨가한 키토산 스폰지에 대하여 리제닌을 첨가하지 않거나(B 도면), 리제닌을 코팅하거나(D 도면), 리제닌을 혼합한 것이다(F 도면). 도면상에서 리제닌의 활성은 1차 항체 (Rabbit-anti-Regenin antibody) 및 2차 항체 (Goat-anti-rabbit IgG-peroxidase)로 면역흡착시킨 후, Chloro-1-napthol에 의해 진보라색으로 염색한 후, 실체현미경으로 확인한 것으로 진보라색이 강할수록 리제닌의 흡착률이 높은 것을 의미한다.

그 결과 소수성 지방산기를 사용한 키토산 스폰지가 그렇지 않은 키토산 스폰지에 비하여 리제닌의 흡착률이 눈에 띄게 향상되었음을 확인할 수 있었다.

도 2는 통상적으로 판매되는 open wound, occlusive (Duoderm™) 및 키토산스폰지 창상도포재(소수성 지방산기 불사용)와, 본원발명의 리제닌이 코팅된 뷰틱키토산스폰지(소수성 지방산기 사용) 창상도포제의 화상치유능에 대하여 도포 후 96시간 이후 조직평가를 실시한 사진이다. 이를 통해 본원발명의 소수성 지방산기를 사용한 리제닌이 코팅된 뷰틱키토산스폰지의 화상치유능이 가장 우수한 것을 확인할 수 있다.

본 발명을 통해 제조된 키토산 스폰지는 창상도포재로 활용이 가능하여 의료공업상 매우 유용한 발명이다.

이상에서 본 발명은 기재된 구체예에 대해서만 상세히 설명되었지만, 본 발명의 기술적 사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.

도 1은 면역염색법에 의한 키토산 스폰지 표면에 존재하는 리제닌의 정도를 나타내는 사진이다.

도 2는 통상의 창상도포재와 본원발명의 바람직한 실시예에 따른 창상도포재의 화상치유능을 비교한 조직평가 사진이다.

Claims (15)

1) 키토산에 소수성 지방산기를 결합시켜 키토산 스폰지 용액을 제조하는 단계;

2) 상기 키토산 스폰지 용액을 동결건조하여 키토산 스폰지를 제조하는 단계; 및

3) 상기 키토산 스폰지의 표면을 세포부착 단백질 용액으로 코팅하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 키토산 스폰지의 제조방법.

1) 키토산에 소수성 지방산기를 결합시켜 키토산 스폰지 용액을 제조하는 단계;

2) 상기 키토산 스폰지 용액에 세포부착 단백질 용액을 혼합하는 단계; 및

3) 상기 혼합된 용액을 동결건조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 키토산 스폰지의 제조방법.

제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 소수성 지방산기는 프로피온산(propionic acid), 발레산(valeric acid), 헥산산(hexanoic acid) 팔미트산(palmitic acid), 뷰틱산(butyric acid) 및 이들의 무수물로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 상기 키토산 스폰지의 제조방법.

제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 1)단계에서 키토산의 글루코사민 잔기 당 소수성 지방산기가 0.1 ~ 1 몰 당량으로 결합되는 것을 특징으로 상기키토산 스폰지의 제조방법.

제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 1) 단계의 키토산 스폰지 용액의 용매는 초산, 삼불화초산, 염산, 클로로포름 및 메틸렌클로라이드로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 상기 키토산 스폰지의 제조방법.

제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 동결건조는 -80℃ 내지 -20℃에서 12 ~ 24 시간동안 수행되는 것을 특징으로 하는 상기 키토산 스폰지의 제조방법.

제1항에 있어서, 상기 2) 단계와 3) 단계 사이에 키토산 스폰지 용액에 가교제를 더 첨가하는 것을 특징으로 상기 키토산 스폰지의 제조방법.

제2항에 있어서, 상기 3) 단계 이후 사이에 키토산 스폰지에 가교제를 첨가하고 동결건조하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 상기 키토산 스폰지의 제조방법.

제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 가교제는 헥사메틸렌 디이소시아네이트, 글루타알데하이드(Glutaaldehyde) 및 에피클로로히드린(Epichlorohydrine)로 구성 되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 상기 키토산 스폰지의 제조방법.

제1항에 있어서, 상기 세포부착 단백질은 리제닌이고, 세포부착 단백질 용액의 용매는 정제수인 것을 특징으로 하는 상기 키토산 스폰지의 제조방법.

제2항에 있어서, 상기 키토산 스폰지 용액 100중량부에 대하여 세포부착 단백질 용액 0.1 ~ 1 중량부가 혼합되는 것을 특징으로 하는 상기 키토산 스폰지의 제조방법.

제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 소수성 지방산기와 결합된 키토산은 N-아실레이티드 키토산인 것을 특징으로 하는 상기 키토산 스폰지의 제조방법.

제1항에 있어서, 상기 3)단계 이후 동결건조 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 키토산 스폰지의 제조방법.

제1항 또는 제2항의 제조방법을 통해 제조된 키토산 스폰지.

제14항의 키토산 스폰지를 이용한 창상 도포재.

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