KR20100005820A - 효소 전환반응을 이용한 광학순수형 락티드 제조방법 및광학순수형 유산 또는 알킬 락테이트의 분리방법 - Google Patents

효소 전환반응을 이용한 광학순수형 락티드 제조방법 및광학순수형 유산 또는 알킬 락테이트의 분리방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 광학순수형 락티드 제조방법 및 광학순수형 유산 또는 알킬 락테이트의 분리방법에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 광학비순수형 유산 또는 알킬 락테이트 중 한가지 형의 광학이성질체만을 기질로 사용하는 효소를 통해 유기용매 중에서 효소 전환반응에 의해 광학순수형 락티드를 제조하고, 기질로 사용되지 않은 나머지 형의 광학이성질체를 미반응물로서 분리하는 방법에 관한 것이다. 이러한 반응을 최적화하기 위하여 최적으로 선정된 효소 촉매에 대하여 유기용매, 반응온도, 효소량, 물분자를 흡수할 수 있는 분자체 (molecular sieve)의 양을 조절하였다. 이러한 공정을 거쳐 생성된 광학순수형 락티드는 이 후 고분자를 합성할 경우 기존의 광학비순수형 폴리유산 고분자에 비하여 매우 향상된 물성을 나타나게 된다. 또한, 이와 동시에 기질로서 반응하지 않고 남은 광학적으로 순수한 유산 또는 알킬 락테이트를 분리할 수 있는 효과도 지니고 있으며, 이 역시 광학순수형 락티드 등 제품 제조시 보다 우수한 물성의 제품을 수득할 수 있는 장점이 있다.
락티드, 광학순수형, 폴리유산

Description

효소 전환반응을 이용한 광학순수형 락티드 제조방법 및 광학순수형 유산 또는 알킬 락테이트의 분리방법 {Method for Synthesis of Chirally Pure Lactide and Separation of Chirally Pure Lactic Acid or Alkyl Lactate through Enzymatic Transformation}
본 발명은 광학순수형 락티드 제조방법 및 광학순수형 유산 또는 알킬 락테이트의 분리방법에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 광학비순수형 유산 또는 알킬 락테이트 중 한가지 형의 광학이성질체만을 기질로 사용하는 효소를 통해 유기용매 중에서 효소 전환반응에 의해 광학순수형 락티드를 제조하고, 기질로 사용되지 않은 나머지 형의 광학이성질체를 미반응물로서 분리하는 방법에 관한 것이다.
생분해성 고분자로 사용되는 폴리유산은 단량체인 유산 (젖산, lactic acid)으로부터 생성된 락티드(lactide)의 개환중합반응에 의하여 합성된다. 현재까지 유산으로부터 락티드 합성에 관하여 많은 연구가 진행되어 왔다. 그리고 미국 Cargill Dow에서는 고분자량 폴리유산 중합에 사용되는 락티드를 연속 공정에 의해서 생산하고 있다 (미국특허 5,357,035). 그러나, 이 방법에 의해 생산된 락티드 는 수율이 낮고 생산단가가 높아서 원래 목적인 범용 고분자의 대체용으로 사용하기에 많은 문제점이 있다. 현재는 공업적으로 유산에서 락티드를 직접 합성하고 생산된 락티드를 고온고압 조건하에서 분리하는 공정을 주로 사용하고 있는 실정인데, 이러한 공정은 제조 시 고가의 복잡한 증류 설비가 필요할 뿐만 아니라, 고온의 증류탑 내에서 락티드의 중합이 발생하여 결과적으로 획득되는 락티드의 수율이 감소하게 되는 단점이 존재한다.
또한, 기존의 화학적인 전환공정은 광학순수형 락티드를 생성할 수 없는 문제점이 있다. 광학순수형 락티드에서 개환중합공정을 통하여 얻어지는 광학순수형 폴리유산은 광학비순수형 폴리유산에 비하여 월등히 뛰어난 내열성 및 내충격성을 가지는 것으로 알려져 있다. 예컨대, 광학비순수형 락티드에서 형성된 광학비순수형 폴리유산의 녹는점이 170 ~ 180 ℃인 반면 광학순수형 폴리유산의 경우 207 ℃의 녹는점을 나타낸다 (Biopolymers from Renewable Resources, D. L. Kaplan Ed., 397, Springer, 1999). 따라서, 광학순수형 락티드가 필수적으로 필요하나, 현재까지 알려진 어느 합성공정도 이러한 광학순수형 락티드를 합성하는 공정은 알려진 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명자들은 광학적으로 비순수한 유산 또는 알킬 락테이트 (L-형과 D-형의 혼합물)에서 광학적으로 순수한 락티드를 합성하는 효소를 발견하고, 상기 효소를 이용하였을 때 여러 가지 조건의 변화에 따른 락티드 수율의 변화 및 그에 따른 광학순수도에 미치는 영향을 조사하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 효소를 이용하여 광학적으로 비순수한 유산 또는 알킬 락테이트로부터 한가지 형만을 기질로 사용하여 광학적으로 순수한 락티드를 합성하는 제조방법를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법을 거친 후 반응하지 않은 나머지 형만을 분리 회수하는 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명의 광학순수형 락티드 제조방법은 상술한 바와 같은 목적을 달성하기 위하여,
(A) 유산 (젖산, lactic acid) 또는 알킬 락테이트를 유기용매에 용해시키는 단계;
(B) 상기 유산 또는 알킬 락테이트의 유기용매 용액에 효소를 첨가하고 4 내지 24 시간 동안 교반하는 단계; 및
(C) 생성된 광학순수형 락티드(lactide)를 분리하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 효소는 리파제(lipase), 리포자임
Figure 112008049079416-PAT00001
(LIPOZYME
Figure 112008049079416-PAT00002
, Novozymes, 덴마크), 큐티나제(cutinase), 프로테아제(protease), 및 프로티나제(proteinase)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또한, 상기 리파제는 Candida antarctica로부터 유래된 것이 바람직하다.
또한, 상기 리파제는 Candida antarctica로부터 유래된 리파제 B (PDB# 1TCA)인 것이 바람직하다.
또한, 상기 유기용매는 n-헥산(n-hexane), 시클로헥산(cyclohexane), 헵탄(heptane), 옥탄(octane), 이소옥탄(isooctane), 톨루엔(toluene) 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또한, 상기 단계 (B) 이전에 흡수제를 상기 유기용매에 첨가할 수 있다.
또한, 상기 알킬 락테이트는 C1 내지 C12인 것이 바람직하다.
또한, 상기 흡수제는 분자체 (molecular sieve)인 것이 바람직하다.
또한, 상기 분자체는 제올라이트인 것이 바람직하다.
한편, 본 발명의 광학순수형 유산 또는 알킬 락테이트의 분리방법은 상기 광학순수형 락티드 제조방법을 거친 후 반응되지 않은 유산 또는 알킬 락테이트를 분리 회수하는 것을 특징으로 한다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 순수 광학활성의 락티드를 제조할 수 있는 새로운 합성방법을 제시하고 있다. 이는 광학적으로 비순수한 유산 또는 알킬 락테이트 혼합물에서 광학적으로 동일한 활성을 갖는 한 가지 형의 락티드만으로 선택적 반응을 촉매할 수 있는 효소 촉매를 선발함으로써 구현되었다. 이러한 반응의 결과물로는 광학순수형 락티드 뿐만 아니라 상기 효소에는 기질로 반응하지 않는 다른 광학순수형 유산 또는 알킬 락테이트만 남게 되어 이를 역시 분리 획득할 수 있는 효과도 거둘 수 있다. 이러한 반응을 최적화하기 위하여 최적으로 선정된 효소 촉매에 대하여 유기용매, 반응온도, 효소량, 물분자를 흡수할 수 있는 분자체 (molecular sieve)의 양을 조절하였다. 이러한 공정을 거쳐 생성된 광학순수형 락티드는 이 후 고분자를 합성할 경우 기존의 광학비순수형 폴리유산 고분자에 비하여 매우 향상된 물성을 나타나게 된다. 또한, 이와 동시에 기질로서 반응하지 않고 남은 광학적으로 순수한 유산 또는 알킬 락테이트를 분리할 수 있는 효과도 지니고 있으며, 이 역시 광학순수형 락티드 등 제품 제조시 보다 우수한 물성의 제품을 수득할 수 있는 장점이 있다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 또한, 하기의 설명에서는 구체적인 구성요소 등과 같은 많은 특정사항들이 개시되어 있는데, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐 이러한 특정 사항들 없이도 본 발명이 실시될 수 있음은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다. 그리고, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명에서 사용되는 용어 중 D-락티드 및 L-락티드는 당 업계에서 사용되는 관용명으로, 이 중 D-락티드는 하기 화학식 1과 같으며, L-락티드의 IUPAC명은 (3S)-cis-3,6-디메틸-1,4-디옥산-2,5-디온 ((3S)-cis-3,6-dimethyl-1,4-dioxane-2,5-dione)이다.
Figure 112008049079416-PAT00003
본 발명의 광학순수형 락티드 제조방법은 (A) 광학적으로 비순수한 유산 (젖산, lactic acid) 또는 알킬 락테이트를 유기용매에 용해시키는 단계; (B) 상기 유산 또는 알킬 락테이트의 유기용매 용액에 효소를 첨가하고 4 내지 24 시간 동안 교반하여 광학적으로 순수한 락티드(lactide)를 합성하는 단계; 및 (C) 생성된 락티드를 분리하는 단계로 구성된다.
이렇게 광학순수형 락티드를 만드는 것은 이로부터 중합합성된 고분자의 물성이 광학비순수형 락티드로부터 형성된 고분자에 비하여 월등한 물성을 나타내기 때문이다. 따라서, 광학적으로 순수한 락티드를 합성하는 것은 결과적으로 형성될 고분자의 물성을 결정하는 중요인자라 할 수 있다.
먼저 광학적으로 순수한 락티드를 제조하는 데 사용되는 원료는 유산 또는 알킬 락테이트에 있어서 광학적으로 순수하지 않은 D-형과 L-형의 혼합물, 또는 R-형과 S-형의 혼합물을 유기용매에 용해시키는 단계로부터 시작된다.
상기 알킬 락테이트는 본 발명의 효소 반응에 의해 락티드로 전환되는 것이라면 제한이 없으나, C1 내지 C12의 알킬 락테이트인 것이 보다 바람직하다.
그리고, 상기 유산이나 알킬 락테이트가 용해되는 유기용매로는 소수성 용매라면 제한이 없으며, 특히 n-헥산(n-hexane), 시클로헥산(cyclohexane), 헵탄(heptane), 옥탄(octane), 이소옥탄(isooctane), 톨루엔(toluene) 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 것이 보다 바람직하다.
이렇게 용해된 광학적으로 비순수한 원료물질, 즉 광학적으로 비순수한 유산 또는 알킬 락테이트의 유기용매 용액에 효소를 첨가하여 락티드로의 전환반응을 수행한다.
이처럼 광학적으로 비순수한 유산 또는 알킬 락테이트로부터 광학적으로 순수한 락티드를 생성시키는 효소의 발견이 본 발명의 가장 중요한 핵심기술이며, 이로부터 본 발명이 완성되었다.
효소에 의하여 유산 또는 알킬 락테이트가 락티드로 전환되는 반응은 하기 반응식 1과 같은 2 단계에 의하여 이루어진다.
Figure 112008049079416-PAT00004
식 중 R은 동일하거나 동일하지 않으며, Na, NH3, H, CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, 이소프로필(isopropyl), 부틸(butyl), 이소부틸(isobutyl), 펜틸(pentyl), 헥실(hexyl), 옥틸(octyl), 노닐(nonyl)로 이루어진 군에서 선택됨.
다양한 효소를 대상으로 상기 전환반응을 실험한 결과 Candida antarctica에서 유래한 리파제 B (PDB# 1TCA), Novozymes(덴마크)의 리포자임®(LIPOZYME®) RMIM과 리포자임® TLIM은 D-유산을 선택적으로 전환시켜 D-락티드를 우세하게 생성시키는 것으로 나타났다. 특히 Candida antarctica에서 유래한 리파제 B의 경우 L-락티드를 전혀 생성하지 않는 것으로 나타나, 뛰어난 선택성을 지니고 있음을 발견하였다. 이러한 특성을 이용할 경우 L-유산과 D-유산의 혼합물로부터 우수한 선택도를 가지고 D-락티드를 획득할 수 있는 장점이 있다.
반대로, 큐티나제(cutinase), 프로테아제(protease), 및 프로티나제(proteinase)의 경우 L-유산을 기질로 사용하여 L-락티드를 우세하게 생성한다. L-락티드 역시 광학적으로 순수한 락티드이므로 이로부터 제조된 중합체 등도 종전의 광학적으로 비순수한 락티드로 제조된 중합체보다 우수한 물성을 나타냄은 당연하다.
따라서, 본 발명은 리파제(lipase), 리포자임® (LIPOZYME®, Novozymes, 덴마크), 큐티나제(cutinase), 프로테아제(protease), 및 프로티나제(proteinase)로 이루어진 군에서 선택된 효소를 사용하며, 리파제 및 리포자임®의 혼합물, 또는 큐티나제, 프로테아제 및 프로티나제의 혼합물을 사용하는 것도 가능하다.
본 발명에서는 특히 D-락티드에 대해 높은 선택도를 보이는 Candida antarctica로부터 유래된 리파제를 사용하는 것이 바람직하고, 특히 Candida antarctica로부터 유래된 리파제 B (PDB# 1TCA)를 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
한편, 본 발명에서 사용되는 효소는 효소 자체 (free-type)를 사용할 수도 있으며, 조작의 편의를 위해 관련분야에서 공지된 각종 담체 및 매트릭스에 고정화된 형태를 사용하는 것 또한 가능하다.
본 발명은 또한 상기 단계 (B) 이전에 흡수제를 상기 유기용매에 첨가할 수 있다. 상기 흡수제는 분자체 (molecular sieve)인 것이 바람직하며, 그 중에서도 특히 제올라이트인 것이 바람직하다.
한편, 본 발명의 광학순수형 유산 또는 알킬 락테이트의 분리방법은 상기 광학순수형 락티드 제조방법을 거친 후 반응되지 않은 유산 또는 알킬 락테이트를 분리 회수함으로써 이루어진다.
상기 전환 효소반응의 효소가 촉매하는 기질은 광학적으로 순수한 유산 또는 알킬 락테이트만이므로, 원료물질인 광학적으로 비순수한 원료 유산 또는 알킬 락테이트가 한 가지 형의 락티드로 전환반응되고 나면, 남은 미반응 원료물질은 광학적으로 반대 형의 유산 또는 알킬 락테이트 뿐이다. 이는 이후 광학적으로 순수한 반대 형의 락티드를 만들거나 다른 의약, 식품, 정밀화학제품을 합성하는데 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예에 대하여 설명한다.
실시예
실시예 1: 광학비순수 유산(L-유산과 D-유산의 혼합물)로부터 광학적으로 순수한 D-락티드를 합성하는 효소 촉매
기계식 교반기 및 응축기(condenser)가 있는 1000 ㎖ 3구 환저플라스크(3-neck round bottom flask) 효소 반응장치를 준비했다. 상기 3구 플라스크에 n-헥산 500 ㎖를 넣고 여기에 D-유산 1.5 g, L-유산 1.5 g을 투입하여 용해시켰다. 분자체(50 ㎛. 시그마, 미국) 1.5 g을 투입한 후, 하기 표 1의 각기 다른 효소 1 g을 투입한 후 100 rpm으로 교반했다. 상기 효소들 중 리포자임® RMIM 및 리포자임® TLIM은 Novozyme사에서 구입하였으며, 나머지 효소들은 Sigma-Aldrich사에서 구입하였다.
이때 반응온도는 50 ℃를 유지하며 반응시간은 12 시간으로 고정하고, 12 시간 후에 시료를 채취했으며 유산의 소모율 및 락티드의 생성률을 GC-Mass (Agilent 6890, Agilent, USA)로 측정했다. 이때 사용한 GC용 컬럼은 J & W Scientific Cyclosil-B, 길이: 30 m, 내경: 0.32 mm, 필름: 0.25 ㎛ 이다. 구체적인 GC-Mass분석조건은 다음과 같다: 50 - 100 ℃, 5 ℃/분 승온, 100 - 200 ℃, 10 ℃/분 승온, 유입부 온도 230 ℃. 그리고 흐름가스(carrier gas)는 헬륨이며, 이때 유량은 1 ㎖/분이었다.
효소 종류에 따른 광학비순수 유산(L-유산과 D-유산의 혼합물)로부터 광학순수 D-락티드 및 L-락티드의 합성효율
효소명 L-유산 소모율 (%) D-유산 소모율 (%) L-락티드 생성률 (%) D-락티드 생성률 (%)
리파제 B - Candida antarctica 0 99 0 85
리포자임® RMIM (Novozyme) 2 85 0.5 43
리포자임® TLIM (Novozyme) 3 25 1 10
Carboxylesterase - Bacillus stearothermophilus 0 0 0 0
Cutinase - Fusarium solani 15 2 8 0.5
Cutinase - Nectria haematococca 25 1 9 0.5
Proteinase K - Tritirachium album 20 2 11 0.5
Protease - Bacillus licheniformis 17 2 8 0.5
상기 표 1은 다양한 효소를 이용하여 실시예 1의 조건하에서 효소반응을 실시하였을 때 기질의 소모율 및 락티드의 생성률을 나타낸 것이다.
표 1에서 볼 수 있듯이 카르복시에스테라제는 어느 형의 유산도 기질로 이용하지 못하여 락티드를 생성할 수 없으나, 리파제나 리포자임®은 L-유산보다 D-유산을 훨씬 잘 이용하며 그 결과 D-락티드를 압도적으로 많이 생성함을 확인할 수 있다.
그리고, 큐티나제, 프로티나제 K, 또는 프로테아제의 경우 기질로서 D-유산에 비해 L-유산을 더 많이 사용하여 D-락티드에 비해 L-락티드를 훨씬 많이 생성할 수 있는 것으로 확인되었다.
이로부터 본 발명의 제조방법에 의하면 종래 광학적으로 비순수한 단량체로부터 제조된 폴리유산에 비해, 물성이 훨씬 뛰어난 폴리유산의 제조를 가능케 하는 광학적으로 순수한 락티드 또는 한가지 형의 광학이성질체의 비율이 나머지형의 광학이성질체에 비해 월등히 높은 락티드의 제조가 가능하다. 무엇보다, 광학적으로 순수하지 않아 가격이 저렴한 유산 또는 알킬 락테이트로부터 1 회의 효소반응만으로 간편하게 제조가 가능하다는 점에서 종래 당업계에서 도달하지 못한 효과를 구현할 수 있다.
특히, Candida antarctica에서 유래한 리파제 B의 경우 D-유산만 선택적으로 전환시킴으로써 D-락티드만 형성시키는 것으로 나타났다. 다시 말해, Candida antarctica 유래의 리파제 B는 L-유산을 전혀 기질로 사용하지 못하며, 때문에 L-락티드는 전혀 형성시키지 못하는 것이다.
이러한 특성을 이용하면 원료물질이 광학적으로 순수하지 않은 L-유산과 D-유산의 혼합물이더라도 그로부터 선택적으로 D-락티드를 획득하는 것이 가능하다.
또한, 이러한 효소반응 결과 기질 중에서 L-유산은 전혀 소모되지 않으므로 효과적으로 이를 순수분리할 수도 있다. 이렇게 분리된 L-유산 또는 L-알킬 락테이트 역시 광학적으로 순수한 형태이므로 활용도가 높으며 종래 광학적으로 비순수한 혼합물에 비해 보다 뛰어난 물성의 제품을 만드는 데 원료로 사용될 수도 있는 장점이 있다.
실시예 2: D-락티드 합성에 미치는 유기용매의 효과
실시예 2에서는 실시예 1과 다른 모든 조건은 동일하며, 다만 실시예 1에서 가장 우수한 D-락티드 합성능력을 보인 Candida antarctica 유래의 리파제 B를 이용하여 D-락티드를 합성하고자 할 때, 사용되는 유기용매의 종류를 변화시키면서 기질의 소모율 및 반응물의 생성률을 측정하였다.
하기 표 2에서 볼 수 있듯이 n-헥산과 같은 소수성 용매인 시클로헥산(cyclohexane), 헵탄(heptane), 옥탄(octane), 이소옥탄(isooctane), 또는 톨루엔(toluene)에서 반응이 잘 진행되어, D-락티드가 높은 수율로 생성되는 것을 관찰할 수 있다. 이에 반하여 친수성 유기용매의 경우에는 상대적으로 낮은 전환율을 보이는 것으로 나타났다.
이는 친수성 유기용매에서 효소를 둘러싸고 있는 물분자들이 유기용매층으로 탈리되어, 결과적으로 효소의 안정성을 저해하는 것으로 보인다. 이외에 기질 및 생성되는 D-락티드의 용해성 역시 반응의 정도에 영향을 미치는 것으로 보인다.
D-락티드 합성에 미치는 유기용매의 효과
유기용매 L-유산 소모율 (%) D-유산 소모율 (%) L-락티드 생성률 (%) D-락티드 생성률 (%)
n-헥산 0 99 0 85
아세토니트릴 0 0 0 0
톨루엔 0 99 0 88
디클로로메탄 0 82 0 52
테트라하이드로푸란 0 53 0 0
t-부탄올 0 0 0 0
디메틸포름아미드 0 0 0 0
아세톤 0 0 0 0
벤젠 0 83 0 55
시클로헥산 0 99 0 88
헵탄 0 99 0 90
옥탄 0 99 0 95
이소옥탄 0 99 0 82
실시예 3: D- 락티드 합성에 미치는 반응온도의 효과
실시예 3에서는 실시예 1과 다른 모든 조건은 동일하며, 다만 실시예 1에서 가장 우수한 D-락티드 합성능력을 보인 Candida antarctica 유래 리파제 B를 이용하여 D-락티드를 합성할 때, 반응온도를 변화시키면서 기질의 소모율 및 반응물의 생성률을 측정하였다.
하기 표 3에서 볼 수 있듯이 반응온도가 실시예 1보다 낮은 30 ℃에서 가장 높은 D-락티드 생성률을 보였다. 특히 이 온도에서 D-유산의 소모율은 40 ℃와 50 ℃에서와 유사하였으나, 상대적으로 생성률이 높았는데 이는 락티드 생성에 관계하는 환 형성 반응이 낮은 온도에서 더 잘 진행되기 때문으로 추정된다.
반면 너무 낮은 온도에서는 상대적으로 D-유산 자체의 소모율이 작아서 이로 인하여 D-락티드의 생성률이 낮은 것으로 판단된다. 그리고, 너무 높은 온도에서는 기질의 소모율 역시 감소하는데 이는 효소의 안정성이 높은 온도에서 감소하기 때문으로 보이며, 역시 D-락티드의 생성률이 감소하는 것은 이에 더하여 환 형성 반응효율이 떨어지기 때문으로 보인다.
D-락티드 합성에 미치는 반응온도의 효과
반응온도 (℃) L-유산 소모율 (%) D-유산 소모율 (%) L-락티드 생성률 (%) D-락티드 생성률 (%)
10 0 83 0 75
20 0 90 0 85
30 0 99 0 92
40 0 99 0 88
50 0 99 0 85
60 0 85 0 70
70 0 70 0 55
실시예 4: D- 락티드 합성에 미치는 효소량의 효과
실시예 4에서는 실시예 1과 다른 모든 조건은 동일하며, 다만 실시예 1에서 가장 우수한 D-락티드 합성능력을 보인 Candida antarctica 유래 리파제 B를 이용하여 D-락티드를 합성하고자 할 때, 효소의 투입량을 변화시키면서 기질의 소모율 및 반응물의 생성률을 측정하였다.
하기 표 4에 의하면 효소의 투입량이 증가함에 따라 기질인 D-유산의 소모율 및 D-락티드 생성율이 점차적으로 증가함을 알 수 있다. 특히 효소가 1.0 g 이상 투입되면 D-유산은 완전히 소모되나, D-락티드는 점진적으로 증가하는 현상이 나타난다.
이는 상기 반응식 1에서 볼 수 있듯이 유산으로부터 락티드를 형성하기 위해서는 두단계 반응을 거쳐야 하기 때문인 것으로 판단된다. 즉, D-유산이 완전히 소모되었다 할지라도 D-락티드 외에 여전히 중간 화합물 상태로 일부가 존재하고 있기 때문으로 판단된다.
D-락티드 합성에 미치는 효소량의 효과
효소량 (g) L-유산 소모율 (%) D-유산 소모율 (%) L-락티드 생성률 (%) D-락티드 생성률 (%)
0.25 0 83 0 75
0.5 0 90 0 78
1.0 0 99 0 85
1.5 0 99 0 88
2.0 0 99 0 93
실시예 5: D- 락티드 합성에 미치는 분자체량의 효과
실시예 5에서는 실시예 1과 다른 모든 조건은 동일하며, 다만 실시예 1에서 가장 우수한 D-락티드 합성능력을 보인 Candida antarctica 유래의 리파제 B를 이용하여 D-락티드를 합성하고자 할 때, 분자체 투입량을 변화시키면서 기질의 소모율 및 반응물의 생성률을 측정하였다.
하기 표 5에서 분자체의 투입량이 증가함에 따라 기질인 D-유산의 소모율 및 D-락티드 생성률이 점차적으로 증가함을 알 수 있다. 특히 분자체가 1.0 g 이상 투입되면 D-유산은 완전히 소모되나, D-락티드는 점진적으로 증가하는 현상이 나타난다. 이는 앞서 설명한 바와 같이 유산으로부터 락티드를 형성하기 위해서는 두 단계 반응을 거쳐야 하기 때문인 것으로 판단된다.
그리고, 분자체의 양이 감소할 때 D-락티드의 생성률이 감소하는 이유는 물분자의 존재로 인한 역반응의 증가 때문이다. 구체적으로 반응식 1의 반응에 의해 2 개의 물분자가 부산물로 생성되는데, 만약 생성된 물분자가 제거되지 않으면 물분자에 의한 역반응, 즉 가수분해 반응으로 인하여 생성물인 락티드의 수율 감소가 일어날 것이다. 따라서, 분자체는 충분한 양만큼 첨가되는 것이 D-락티드의 효율적인 생산에 필요하다.
다만, 일부 생성된 D-락티드가 반응매인 유기용매에 잘 녹지 않아 반응시스템에서 분리되는 현상이 관찰되었다. 이러한 경우에는 역반응에 크게 영향을 받지 않으므로, 적은 양의 분자체로 실험한 경우에도 D-락티드가 상당량 생성되는 것을 설명할 수 있다.
그러나, 이러한 효과도 원료물질이 유산이 아닌 긴 탄소 사슬을 가진 알킬 락테이트의 경우 그 효과가 반감된다. 왜냐하면 긴 탄소 사슬을 가진 알킬 락테이트는 헥산과 같은 소수성 용매에 잘 용해되고, 분자체를 통과하기 여려워 역반응을 잘 일으킬 것이기 때문이다. 따라서, 원료물질에 따라 적절한 양의 분자체를 첨가하는 것이 바람직하며, 이는 당업계의 전문가라면 용이하게 실시할 수 있을 것이다.
D-락티드 합성에 미치는 분자체량의 효과
분자체량 (g) L-유산 소모율 (%) D-유산 소모율 (%) L-락티드 생성률 (%) D-락티드 생성률 (%)
0.25 0 82 0 75
0.5 0 85 0 78
1.0 0 99 0 84
1.5 0 99 0 85
실시예 6: D- 락티드 합성에 미치는 원료물질의 효과
실시예 6에서는 실시예 1과 다른 모든 조건은 동일하며, 다만 실시예 1에서 가장 우수한 D-락티드 합성능력을 보인 Candida antarctica 유래의 리파제 B를 이용하고, 원료물질로 L-유산과 D-유산의 혼합물이 아닌 광학 비순수형 알킬 락테이트를 기질로 사용할 때, 기질의 소모율 및 반응물의 생성률을 측정하였다. 하기 표 6에서 볼 수 있듯이 유산보다는 메틸 락테이트 또는 에틸 락테이트를 원료물질로 사용한 경우에 모두 기질 소모율이 높았으며, 동시에 D-락티드의 생성율도 소폭 증가하였다. 이러한 이유는 에틸 락테이트의 경우 유산 또는 메틸 락테이트에 비해 소수성 알킬기의 길이가 길어지면서 반응용매인 n-헥산에 더 잘 용해되기 때문으로 보인다. 따라서, 이러한 에틸 락테이트 외에 더 긴 탄화수소 사슬을 가지는 알킬 락테이트의 경우 더 효율적으로 D-락티드를 생성할 수 있을 것으로 생각된다.
D-락티드 합성에 미치는 원료물질의 효과
기질 L-형 소모율 (%) D-형 소모율 (%) L-락티드 생성률 (%) D-락티드 생성률 (%)
유산 0 99 0 85
메틸 락테이트 0 99 0 90
에틸 락테이트 0 99 0 92
이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대해서 설명하였으나, 본 발명은 상술한 특정의 실시예에 한정되지 아니하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본원 발명의 요지를 벗어남이 없이 다양한 변형 실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 범위는 위의 실시예에 국한해서 해석되어서는 안되며, 후술하는 특허청구범위 뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 할 것이다.

Claims (7)

  1. (A) 유산 (젖산, lactic acid) 또는 알킬 락테이트를 유기용매에 용해시키는 단계;
    (B) 상기 유산 또는 알킬 락테이트의 유기용매 용액에 효소를 첨가하고 4 내지 24 시간 동안 교반하는 단계; 및
    (C) 생성된 광학순수형 락티드(lactide)를 분리하는 단계
    를 포함하는 광학순수형 락티드 제조방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 효소는 리파제(lipase), 리포자임® (LIPOZYME®, Novozymes, 덴마크), 큐티나제(cutinase), 프로테아제(protease), 및 프로티나제(proteinase)로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 광학순수형 락티드 제조방법.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 리파제는 Candida antarctica로부터 유래된 것을 특징으로 하는 광학순수형 락티드 제조방법.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 리파제는 Candida antarctica로부터 유래된 리파제 B인 것을 특징으로 하는 광학순수형 락티드 제조방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 유기용매는 n-헥산(n-hexane), 시클로헥산(cyclohexane), 헵탄(heptane), 옥탄(octane), 이소옥탄(isooctane), 톨루엔(toluene) 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 광학순수형 락티드 제조방법.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 단계 (B) 이전에 흡수제를 상기 유기용매에 첨가하는 것을 특징으로 하는 광학순수형 락티드 제조방법.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 청구항의 광학순수형 락티드 제조방법을 거친 후 반응되지 않은 유산 또는 알킬 락테이트를 분리 회수하는 것을 특징으로 하는 광학순수형 유산 또는 알킬 락테이트의 분리방법.
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