KR20100002912A - 조혈모세포로부터 거핵구 및 혈소판으로의 분화를 조절하는유전자 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 KLF2(Kruppel-like factor2), LOC138225(OTTHUMP00000021439), GDF15(growth differentiation factor 15), 및 INHBE(inhibin, betaE)로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 조혈모세포로부터 거핵구 및 혈소판으로의 분화 여부를 탐지하기 위한 마커 검출용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트, 상기 마커 유전자를 이용하여 거핵구 및 혈소판으로의 분화를 탐지하는 방법, 거핵구 및 혈소판으로의 분화를 조절하는 방법, 및 거핵구 및 혈소판으로의 분화 조절 후보 화합물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
조혈모세포, 인간골수백혈병세포주, 거핵구, 혈소판, 분화 마커

Description

조혈모세포로부터 거핵구 및 혈소판으로의 분화를 조절하는 유전자 및 이의 용도{Genes controlling differentiation of hematopoietic stem cells into megakaryocytes and platelets, and use thereof}
본 발명은 조혈모세포로부터 거핵구 및 혈소판으로의 분화 여부를 탐지하기 위한 마커 검출용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트, 상기 마커 유전자를 이용하여 거핵구 및 혈소판으로의 분화를 탐지하는 방법, 거핵구 및 혈소판으로의 분화를 조절하는 방법, 및 거핵구 및 혈소판으로의 분화 조절 후보 화합물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
인간 유전체 프로젝트 연구 결과, 인체의 질환을 분자 수준에서 이해하고 새로운 질환 관련 표적을 발굴하고 이를 이용한 신약을 개발하고자 하는 신개념의 바이오 생명공학 기술의 시대가 열리고 있다. 이에 따라, 유전적 환경이 다른 환자 개개인에 맞추어 각종 다양한 질병을 진단, 치료, 예측하는 맞춤의학 시대가 현실로 다가오고 있다. 맞춤의학에는 유전체 진단용 바이오마커의 발굴, 표적화 치료기 술, 질병 특이적 약물작용점의 발굴, 표적치료용 신약, 정확한 임상 정보, 환자의 유전체 정보, 유전체적 역학결과, 그리고 이들을 분석 통합할 수 있는 바이오인포매틱스 등이 상호보완적으로 구성된 약물 유전체기술 개발이 수반되어야 한다. 특히, 맞춤의학에서 경쟁력을 갖추기 위해서는 질환과 개인에 대한 약물 예측 시스템, 진단 바이오마커 발굴, 새로운 표적유전자 및 단백질을 발굴하는 기초연구 및 이를 이용한 치료제의 개발이 중요하다.
전 세계적으로 다양항 질병 치료와 관련된 유전자의 기능 연구를 통해 치료용 표적을 발굴하고 이들을 진단 및 치료제 개발에 이용하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 게놈 연구의 활성화와 함께 인간 유전자 DNA 칩 또는 프로테옴 분석 연구가 활발하게 이루어지고 다양한 질병과 관련된 유전자가 대량 발굴됨에 따라 많은 유전자들의 목록과 관련 데이터베이스는 구축되어 있으나 대부분 이들 유전자들에 대한 세포 내에서의 구체적 생물학적 기능 및 질병 관련성은 아직 연구되지 않았거나 불확실한 실정이다.
한편, 혈소판 감소증(thrombocytopenia)은 골수세포 내에 존재하는 혈소판 전구세포인 거핵구 콜로니 형성 전구세포들이 파괴되어 혈소판의 수가 부족하게 됨으로써 유발되는 질병이다. 현재, 유전성 혈소판 감소증, 특발성 혈소판감소성 자반병, 재생불량성 빈혈 등이 알려져 있으나, 임상적으로 중요한 혈소판 감소증은 방사선 전신조사 또는 조혈 억제 작용을 하는 약제에 의한 2차성 혈소판 감소증이다. 이러한 2차성 혈소판 감소증은 암 환자에게 실시되는 화학요법, 방사선요법, 골수이식 치료법 등에 의해 유발되며, 많은 경우에 있어서 골수 거핵구의 형성이 저조해지는 일이 발생하며, 환자의 예후의 회복을 지연시키며, 경우에 따라 출혈에 의한 사망을 일으키는 위험한 질병이다.
이러한 혈소판 감소증 치료에 빈번히 사용되고 있는 혈소판 수혈은 혈액 제공자가 부족하다는 문제점 이외에도 외래 혈액에서 유래한 감염원에 의한 감염이나 면역반응 유발 등의 부작용이 있어, 줄기세포를 혈소판으로 분화, 성장시켜 이들을 세포치료제로서 이용하기 위한 연구가 진행되고 있다.
또한, 혈소판 증가증은 혈액 혈소판의 증가 또는 비정상적인 생성과 관련된 장애에 의해 유발되는 질병이다. 혈소판은 혈액 응고(clotting)에 관련되기 때문에, 그들의 비정상적인 생성은 혈액 응고의 부적절한 생성 또는 출혈을 초래할 수 있고, 위장관 출혈(gastrointestinalbleeding), 심장 마비(heart attack) 및 뇌졸증(stroke)의 환자 위험이 증가한다. 혈소판 증가증과 관련된 질환의 예로는 본태성 혈소판 증가증(essential thrombocythemia; ET), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous; CML), 진성다혈증(polycythemia vera; PV), 특발성 골수 섬유화증(agnogenic mteloid metaplasia; AMM) 및 겸형적혈구 빈혈증(sickle cell anemia; SCA) 등이 알려져 있다. 이러한 혈소판 증가증을 치료하기 위해 혈소판의 생성을 억제시키는 화합물 등이 연구되어 왔다.
줄기세포(stem cell)은 여러 기관으로의 분화능(multipotent)과 재생능(self renewal)을 가진 세포로서 간세포(幹細胞)라 불리기도 하며, 배아에서뿐만 아니라 성체에서도 발견된다. 줄기세포는 하나의 세포로부터 특정세포 도는 기관으로의 분화가 가능하며, 이를 이용한 기관이식(organ transplantation) 또는 세포 대체요법(cell therapy) 치료에 많은 관심이 모이고 있다.
상기와 같은 혈소판 관련 질환은 혈액 세포 내에서 특정한 기작에 의해 혈소판이 증대되거나 감소되어 나타나는 질병이므로, 줄기세포로부터 거핵구 및 혈소판으로의 분화과정에 관여하는 유전자들을 연구하여 이들을 혈소판 감소증 또는 혈소판 증가증 치료를 위한 표적 유전자로 이용함으로써 세포의 혈소판 분화 정도를 효과적으로 조절할 수 있을 것으로 기대된다.
이에 본 발명자들은 혈소판 관련 질환 치료를 위한 표적 유전자를 개발하기 위해, 조혈모세포로부터 거핵구 및 혈소판으로의 분화조절에 관여하는 신규한 유전자들을 발굴하였으며, 이들 유전자들이 실질적으로 조혈모세포로부터 거핵구 및 혈소판으로의 분화를 조절할 수 있음을 밝힘으로써 이들 유전자를 혈소판 증가증 및 혈소판 감소증 치료를 위한 표적 유전자로 이용할 수 있으며, 거핵구 및 혈소판으로의 분화 마커로 이용할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
구체적으로, 본 발명자들은 대한민국 등록특허 제10-0688261호에서 줄기세포의 일종인 인간골수백혈병세포에 (R)-MALPCE 화합물을 처리하여 거핵구 및 혈소판으로 분화시킴으로써 여기서 얻어진 혈소판을 혈소판 감소증 치료에 이용할 수 있음을 제시한바 있다. 이러한 줄기세포로부터 거핵구 및 혈소판으로의 분화과정에 관여하는 유전자들을 탐색하고, 이들 유전자들의 발현량을 조절함으로써 거핵구 및 혈소판으로의 분화를 조절할 수 있음을 밝혔다.
본 발명의 목적은 KLF2(Kruppel-like factor2), LOC138255(OTTHUMP00000021439), GDF15(growth differentiation factor 15) 및 INHBE(inhibin, betaE)로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 조혈모세포로부터 거핵구 및 혈소판으로의 분화 여부를 탐지하기 위한 마커 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는, 조혈모세포로부터 거핵구 및 혈소판으로의 분화 마커 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자들의 발현 수준을 확인하여 조혈모세포로부터 거핵구 및 혈소판으로의 분화 여부를 탐지하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자들을 유효성분으로 포함하는 조혈모세포로부터 거핵구 및 혈소판으로의 분화 조절제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 유전자들의 발현을 증가 또는 감소시킴으로써 조혈모세포로부터 거핵구 및 혈소판으로의 분화를 조절하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 유전자 발현을 증가시키거나 단백질의 활성을 증진시키는 물질을 유효성분으로 포함하는 혈소판 감소증 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 유전자 발현을 감소시키거나 단백질의 활성을 억 제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 혈소판 증가증 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 마커 유전자들의 증가 또는 감소를 측정하는 단계를 포함하는, 조혈모세포로부터 거핵구 및 혈소판으로의 분화 조절 후보 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 스크리닝 방법으로 선별된 조혈모세포로부터 거핵구 및 혈소판으로의 분화 조절 화합물을 유효성분으로 포함하는 혈소판 감소증 또는 증가증 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 KLF2(Kruppel-like factor2), LOC138255(OTTHUMP00000021439), GDF15(growth differentiation factor 15) 및 INHBE(inhibin, betaE)로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 조혈모세포로부터 거핵구 및 혈소판으로의 분화 여부를 탐지하기 위한 마커 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "조혈모세포 (hematopoietic stem cell)"는 혈액을 구성하는 적혈구, 백혈구 및 혈소판 등의 혈액세포로 분화할수 있는 능력을 지닌 세포를 말한다. 조혈모세포는 미분화 상태에서 무한 증식능력(self-renewal capacity)과 더불어 특정한 분화유도자극에 의해 다양한 혈액 세포로 분화될 수 있는 능력을 가진다. 본 발명의 조혈모세포는 인간(human), 원숭이(monkeys), 돼지(pigs), 말(horses), 소(cows), 양(sheeps), 개(dogs), 고양이(cats), 생쥐(mice), 토끼(rabbits) 등의 모든 동물로부터 유래할 수 있으며, 바람직하게는 인간 유래의 조혈모세이다.
또한, 본 발명에서 용어 "인간골수백혈병세포주"는 골수성 혈액 줄기세포(조혈모세포)가 암세포로 변화된 세포주를 의미한다. 이 세포주는 단핵백혈구(monocyte), 호중구(neutrophil), 호산성구(eosinophil), 적혈구(erythrocyte), 대식세포(macrophage), 거핵구(거대핵)세포(megakaryocyte), 혈소판(thrombocyte)으로 분화가 가능한 세포이다. 구체적 실시예에서 인간만성골수백혈병세포주의 하나인 K562 세포이다. "K562 세포"는 인간 만성 골수성 백혈병(CML) 세포주로, 최종 급성기(terminal blast crisis)의 골수로부터 유래된 세포이며, 조혈 줄기세포처럼 다양한 혈액세포로 분화할 수 있는 잠재성(potential)을 갖고 있어 적혈구, 거핵구 및 호중구로 분화될 수 있는 만능 세포이다.
본 발명에서 용어, "조혈모세포로부터 거핵구 및 혈소판으로의 분화 여부를 탐지하기 위한 마커"란 거핵구로 분화를 유도시키지 않은 대조군과 비교했을 때 분화를 유도시킨 실험군에서 그 발현 여부에 유의한 차이를 보이는 유기 생체 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 마커는 거핵구로 분화된 세포에서 유의적으로 증가됨으로써 분화 여부 탐지에 사용할 수 있는 유전자 마커를 의미한다.
본 발명의 마커로서 이용될 수 있는 유전자로는 조혈모세포로부터 거핵구로 분화된 세포에서 분화되지 않은 세포에 비해 유의적으로 증가되는 유전자들을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 KLF2(Kruppel-like factor2), LOC138255(OTTHUMP00000021439), GDF15(growth differentiation factor 15) 및 INHBE(inhibin, betaE)을 사용할 수 있다.
본 발명에서는 조혈모세포로부터 거핵구 및 혈소판으로의 분화 과정에 관여하는 유전자들의 발현 양상을 올리고뉴클레오타이드 어레이를 통해 분석하고, 미분화 상태의 조혈모세포에 비해 분화된 거핵구 세포에서 유전자 발현율이 10배 이상 증가된 유전자들 5개를 선별하고, 이들 유전자들이 분화 과정에서 어떠한 발현 패턴을 나타내는지 분석하고, 이들 유전자들의 shRNA에 의해 분화가 억제된다는 것을 밝힘으로써, 상기 KLF, LOC, GDF15, 및 INHBE 유전자들이 조혈모세포로부터 거핵구 및 혈소판으로의 분화 여부를 탐지할 수 있는 마커로서 유용하게 사용될 수 있다는 것을 확인했다.
본 발명에서 사용되는 마커 유전자들은 미국국립보건원 유전자은행 (NIH GenBank)으로부터 유전정보를 확보할 수 있으며, 구체적으로 KLF2(Kruppel-like factor, NM_016270.2), LOC138255(OTTHUMP00000021439, NM_001010940.1), GDF15(growth differentiation factor 15, NM_004864.1), 및 INHBE(inhibin, betaE, NM_031479.3)으로 구성될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 마커 유전자는 이러한 유전자를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물을 포함하는 개념이다. 구체적으로 본 발명의 마커 유전자는 상기한 마커 유전자와 동일한 기능적으로 동일한 작용을 하는 작용성 등가물, 즉, 인위적인 변형에 의해 뉴클레오타이드의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution), 삽입(insertion) 또는 이들의 조합(combination)에 의해 변형된 변이체(variants) 또는 동일한 작용을 수행하는 상기 폴리뉴클레오티드의 작용성 단편(fragments)을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적 실시예에 따르면, 인간골수백혈병세포에 (R)-MALPCE 화합물을 처리하여 거핵구 및 혈소판으로 분화시켰을 때(대한민국 등록특허 제10-0688261호 참고), 이들 거핵구로의 분화에 관여하는 유전자들의 발현양상을 분석하기 위해, 마크로젠의 올리고뉴클레오타이드 어레이를 통해 유전자칩 분석을 수행함으로써 미분화 조혈모세포에 비해 분화된 거핵구 세포들에서 유의적으로 증가되는 유전자들 67개를 선정하였다. 이들 67개 유전자를 전사인자 수용체, 불분명한 기능, 선택적 칼슘결합 단백질, 포스파타아제, 신호 분자, 선택적 조절인자, 프로테아제, 핵산결합, 세포골격 단백질, 키나아제, 세포 부작 분자, 트랜스퍼라제, 신타아제, 가수분해 효소 방어/면역 및 분류되지 않은 분자 기능으로 분류하고, 이들 유전자들 중 10배 이상 증가한 유전자들, KLF2, LOC138255, GDF15 및 INHBE을 선별하였다.
본 발명에서 용어 "유전자의 발현수준을 측정하는 제제"란 상기와 같이 거핵구 및 혈소판으로의 분화에 있어서 상기 마커 유전자들의 발현 수준을 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미한다. 본 발명에서 유전자 발현수준 측정 제제는 상기 마커 유전자들의 발현 정도를 유전자 수준 또는 이들 유전자가 발현하는 단백질 수준에서 측정할 수 있는 것이면 특별히 한정하지 않으나, 바람직하게는 마커 유전자에 특이적인 프라이머 또는 마커 유전자가 발현하는 단백질에 특이적인 항체를 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 마커 유전자들의 mRNA 양을 측정하기 위한 프라이머 또는 마커 단백질 양을 측정하기 위한 항체일 수 있다.
본 발명에서 유전자 수준에서의 조사는 유전자 발현 정도를 측정하는데 이용되는 공지의 방법을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 상기 마커 유전자들의 핵산 서열에 기초하여 제작된 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하거나, 프로브를 이용한 혼성화 반응을 통하여 실시할 수 있으며, 노던 블럿 기술(Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine)을 이용하여 실시할 수도 있다.
본 발명에서 용어, "프라이머"는 당해 분야에서 공지된 용어로서 "프라이머(primer)"란 적절한 버퍼 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트(ATP, GTP, CTP, TTP) 및 DNA 폴리머라제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 10 ∼ 100, 바람직하게는 10 ∼ 50, 더욱 바람직하게는 10 ∼ 30 뉴클레오티드 길이를 가진다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적 일 필요는 없으나, 주형과 혼성화될 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 구체적 양태로서 본 발명에 사용될 수 있는 프라이머는 각각의 마커 유전자들에 특이적인 프라이머쌍들, 즉, KLF2(서열번호 1 및 서열번호 2), LOC138255(서열번호 3 및 서열번호 4), GDF15(서열번호 5 및 서열번호 6) 및 INHBE(서열번호 7 및 서열번호 8)가 가능하다. 본 발명의 구체적 실시예에서 상기 각각의 마커 유전자들에 특이적인 프라이머쌍을 사용하여, 조혈모세포로부터 거핵구 및 혈소판으로의 분화 과정에서 각 마커 유전자들의 발현 양상을 RNeasy 미니키트를 사용하여 측정한 결과, 분화 유도 후 12시간 이후부터 이들 유전자들이 실질적으로 발현되고 있음을 확인하였다.
또한, 단백질 수준에서의 조사는 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 대한 항체를 이용하여 면역분석(immunoassay, 예컨대, 방사능 면역분석 방법, 방사능 면역-침전 방법, 효소-결합 면역흡착 방법 (ELISA), 도트 블롯 분석, 웨스턴 블롯, 억제 또는 경쟁 분석 및 샌드위치 분석)를 통하여 정량적으로 또는 정성적으로 실시될 수 있다(Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980).
본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커 유전자인 KLF2(Kruppel-like factor2), LOC138255(OTTHUMP00000021439), GDF15(growth differentiation factor 15) 및 INHBE (inhibin, betaE)가 코딩하는 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체 및 단클론 항체를 모두 포함한다. 상기한 바와 같이 본 발명의 마커 단백질이 규명되었으므로 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.
다클론 항체는 상기한 거핵구 분화 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 및 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.
단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 융합 방법(fusion method)에 의해 만들어질 수 있다(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조). 단클론 항체를 분비하는 "하이브리도마"를 만들기 위해 융합되는 두 세포 집단 중 하나의 집단은 거핵구 분화 마커 단백질 항원을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터의 세포를 이용하고, 나머지 하나의 집단으로는 암 또는 골수종 세포주를 이용한다. 이러한 두 집단의 세포들을 폴리에틸렌글리콜과 같은 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 융합시키고 나서 항체-생산 세포를 표준적인 조직 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 수득한 후, 마커 단백질에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 표준 기술에 따라 시험관 내에서 또는 생체 내에서 대량으로 배양한다. 상기한 하이브리도마가 생산하는 단 클론 항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 고순도로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 사용하기 위한 항체의 정제 기술로는, 예를 들어 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피 등을 이용할 수 있다.
본 발명의 거핵구 분화 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 거핵구 분화 마커 검출용 조성물을 포함하는, 조혈모세포로부터 거핵구 및 혈소판으로의 분화 마커 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 마커 검출용 키트에는 거핵구 분화에 있어서 발현이 증가 또는 감소하는 마커 단백질을 선택적으로 인지할 수 있는 프라이머 또는 항체뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함된다. 이러한 도구나 시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함하나 이로 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 거핵구 분화 마커 검출용 키트는 ELISA 플레이트, 딥-스틱 디바이스, 면역크로마토그래피 시험 스트립 및 방사 분할 면역검정 디바이스, 및 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스 등의 형태를 가질 수 있으며, 바람직하게는 마이크로어레이지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 거핵구 분화 마커 단백질에 대한 항체가 다수의 단백질이 고정될 수 있는 단백질 칩에 제공되는 경우에는, 2개 이상의 항체에 대한 항원-항체 복합체 형성을 관측할 수 있어 거핵구 및 혈소판으로의 분화 탐지에 보다 유리하다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 마커 유전자들의 발현 수준을 확인하여 조혈모세포로부터 거핵구 및 혈소판으로의 분화 여부를 탐지하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 마커 유전자들의 발현 수준 확인은 특정 유전자의 발현 정도를 측정하는 공지의 방법들을 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 이용하여 유전자 수준의 발현 정도를 측정하거나 웨스턴 블럿팅 방법을 이용하여 단백질 수준의 발현 정도를 측정할 수 있다.
구체적 양태로서, 본 발명의 조혈모세포로부터 거핵구 및 혈소판으로의 분화 여부를 유전자 수준에서 탐지하는 방법은, (a) 조혈모세포로부터 핵산 시료를 얻는 단계; (b) 상기 핵산 시료 중, KLF2(Kruppel-like factor2), LOC138255(OTTHUMP00000021439), GDF15(growth differentiation factor 15) 및 INHBE (inhibin, betaE)로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 발현량을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 유전자가 과발현되었을 때, 조혈모세포가 거핵구세포로 분화된 것으로 판정하는 단계를 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 단계 (b)에서 유전자 발현량 측정은 상기 마커 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하여 거핵구로 분화시킨 조혈모세포로부터 얻은 핵산 시료와 반응시켜 RT-PCR 및 전기영동법을 수행함으로써 마커 유전자들의 mRNA 발현량을 측정함으로써 유전자 발현 정도에 따라 분화 여부를 탐지할 수 있게 된다.
또한, 본 발명의 조혈모세포로부터 거핵구 및 혈소판으로의 분화 여부를 단백질 수준에서 탐지하는 방법은, 상기 마커 유전자가 코딩하는 단백질에 대한 항체를 조혈모세포와 접촉시켜 항원-항체 복합체를 형성하는 단계 및 상기 항원-항체 복합체의 형성량의 증가를 대조군의 형성량과 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "항원-항체 복합체"란 거핵구 및 혈소판으로의 분화 여부를 탐지하기 위한 거핵구 분화 마커 단백질과 이를 인지하는 항체의 결합물을 의미한다. 상기 검출 방법은 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 분화 유도군에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교하여 거핵구 분화 마커의 발현량 증감 정도를 측정함으로써 분화 여부를 탐지할 수 있다.
상기 검출 방법에서 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제, GDPase, RNase, 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제 및 β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드 및 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W(CN) 8 , [Os(bpy) 3 ] 2+ , [RU(bpy) 3 ] 2+ 또는 [MO(CN) 8 ] 4- 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I 또는 186Re 등이 있으며 이로 제한되지 않는다.
항원-항체 복합체 형성을 검출하기 위해 비색법(colorimetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법을 이용할 수 있으며, 반드시 이들로만 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 항원-항체 복합체를 웨스턴 블랏팅(western bloting) 또는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 이용하여 검출할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 KLF2(Kruppel-like factor2), LOC138255(OTTHUMP00000021439), GDF15(growth differentiation factor 15) 및 INHBE (inhibin, betaE)로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 발현을 증가 또는 감소시킴으로써 조혈모세포로부터 거핵구 및 혈소판으로의 분화를 조절하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 효과적인 거핵구 및 혈소판으로의 분화 유도를 위해 유전자 발현율을 높이는 방법은 세포 내에서 유전자 발현율을 높일 수 있는 당업계에 공지된 다양한 방법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 상기 유전자들을 포함하는 벡터를 제작하고, 이들을 세포에 형질도입시켜 이들 유전자의 발현율을 높일 수 있다.
또한, 본 발명에서 거핵구 및 혈소판으로의 분화를 저지하기 위해 유전자 발현율을 낮추는 방법은 세포 내에서 유전자를 결실시키거나 유전자 변이를 통해 유전자 기능을 상실시킬 수 있는 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있으며, 바람직 하게는 상기 유전자들에 대한 shRNA(small hairpin RNA)를 제작하고, 이들을 세포에 형질도입시켜 이들 유전자의 발현을 낮출 수 있다.
본 발명의 구체적 실시예에서, 상기 마커 유전자들에 대한 shRNA를 제작하여 이들을 조혈모세포에 형질도입시켜 유전자들의 발현을 억제했을 때, 거핵구로 분화유도시킨 조혈모세포는 거핵구 특이적 형질인 배수체화가 억제되었으며, 거핵구 특이적인 형태로 변화되지 못하는 것을 확인하였다. 또한, 상기 마커 유전자들에 대한 shRNA에 감염된 K562 세포를 거핵구로 분화 유도 한 후, 공지의 거핵구 특이적 마커인 CD41 및 CD61 단백질의 발현율을 항-CD41/PECY5 항체 및 항-CD61/Percp을 사용하여 측정한 결과, CD41 및 CD61 단백질의 발현이 억제되는 것을 확인하였다. 마지막으로, 이들 유전자들 중 KLF2 및 LOC138255에 대한 shRNA로 감염된 K562 세포의 유전자 발현율을 RT-PCR법으로 측정한 결과, shRNA를 처리하지 않은 대조군에 비해 KLF2 및 LOC138255의 mRNA 발현 정도가 억제된 것으로 나타났다.
이러한 결과들은 본 발명의 KLF2, LOC138255, GDF15, 및 INHBE 유전자들이 조혈모세포로부터 거핵구 및 혈소판으로의 분화를 실질적으로 조절하는 유전자임을 확인해주는 결과이며, 이러한 유전자들을 표적으로 하여 유전자들의 발현량을 조절함으로써 거핵구 및 혈소판으로의 분화를 조절함으로써 혈소판 관련 질환 치료에 이용에 적용될 수 있음을 시사해 주는 결과이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 유전자들 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 조혈모세포로부터 거핵구 및 혈소판으로의 분화 조절제에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "분화 조절제"는 조혈모세포로부터 거핵구 및 혈소판으로의 분화 정도를 조절할 수 있는 물질을 의미하는데, 본 발명에서는 조혈모세포 내에서 상기 유전자들의 발현율을 높임으로써 분화를 효과적으로 유도하거나, 상기 유전자들의 발현율을 낮춤으로서 분화를 저지하기 위한 조절제를 말한다. 본 발명에서 분화 유도를 위한 조절제로는 상기 유전자의 발현율을 높일 수 있는 분자, 바람직하게는 상기 유전자를 과발현시킬 수 있는 벡터를 포함할 수 있으며, 분화 저지를 위한 조절제로는 상기 유전자의 발현율을 낮출 수 있는 분자, 바람직하게는 상기 유전자에 대한 shRNA를 포함할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 유전자들의 발현을 증가시키거나 단백질의 활성을 증진시키는 물질을 유효성분으로 포함하는 혈소판 감소증 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 상기 유전자들의 발현을 증가시키거나 단백질 활성을 증진시키는 물질로는 상기 유전자를 포함하여 세포 내에서 상기 유전자들의 발현을 증폭시킬 수 있는 물질이나, 유전자 발현을 증가시키거나 또는 단백질 활성을 증진시킬 수 있는 화합물, 천연물, 신규 단백질 모두가 가능하다.
상기 유전자는 DNA 및 DEAE-덱스트란의 복합체, DNA 및 핵 단백질의 복합체, DNA 및 지질의 복합체 등의 다양한 트랜스팩션 기술을 이용하여 세포 내로 도입될 수 있으며, 상기 유전자는 세포 내로의 효율적인 도입을 가능하게 하는 전달체 내 에 포함된 형태일 수 있다. 상기 전달체는 바람직하게는 벡터이며, 바이러스 벡터 및 비바이러스 벡터 모두 이용 가능하다. 바이러스 벡터(viral vector)의 예로는 레트로바이러스 벡터(retroviral vector), 아데노바이러스 벡터(adenoviral vector) 및 아데노 부속 바이러스 벡터(adeno-associated viral vector) 등이 있다.
본 발명의 유전자를 표적으로 하여 치료할 수 있는 혈소판 감소증 관련 질환으로는 예를 들어, 유전성 혈소판 감소증, 특발성 혈소판감소성 자반병, 재생불량성 빈혈, 골수 세포곤란(Myelodysplastic) 증후군, 급성 골수구 백혈병 및 2차성 혈소판 감소증 등을 포함한다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 유전자들의 발현을 감소시키거나 단백질의 활성을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 혈소판 증가증 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
상기 유전자의 발현을 감소시키는 물질로는 바람직하게는 상기 유전자들에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드, RNAi, siRNA, 또는 shRNA가 가능하며, 이들 외에도 상기 유전자의 발현을 저해하는 저분자화합물, 천연물, 생체유용단백질, 생체 내 단백질 또는 신규단백질, 합성 및 천연화합물질 등 어떤 것이든 가능하다. 따라서 종래 당해 기술 분야에서 상기 유전자의 저해제로 알려진 화합물 및 상기 유전자를 이용한 스크리닝을 통해 발굴한 물질도 이용가능하다.
본 발명의 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 생체 내뿐만 아 니라 생체 외에서도 유전자-특이적 억제를 달성할 수 있으며, 특정 DNA 또는 RNA 타겟에 대해 안티센스(또는 상보)인 짧은 길이의 DNA 합성 가닥(또는 DNA 아날로그)이다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 타겟에 결합하고 전사, 번역 또는 스플라이싱의 단계에서 발현을 멈추게 함으로써 DNA 또는 RNA 타겟에 의해 코딩된 단백질의 발현을 막을 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이중나선 또는 단일나선 DNA, 이중나선 또는 단일나선 RNA, DNA/RNA 하이브리드, DNA 및 RNA 아날로그 및 염기, 당 또는 백본 변형을 지닌 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드는 안정성을 증가시키고, 뉴클레아제 분해에 대한 저항성을 증가시키기 위해 당분야에 알려진 방법에 의해 변형될 수 있다. 이들 변형은 당분야에 알려져 있고 올리고뉴클레오타이드 백본의 변형, 당 모이어티의 변형 또는 염기의 변형을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
본 발명의 유전자에 대한 siRNA는 세포 내에서 상기 유전자들을 분해시킴으로써 유전자들의 발현을 억제할 수 있는데, 이러한 siRNA는 생체내 핵산 분해효소에 의한 빠른 분해를 막기 위해 화학적으로 변형된 형태일 수 있다. siRNA는 이중나선 구조를 가지므로, 단일나선 구조의 리보핵산이나 안티센스 올리고핵산(antisense oligonucleotide)보다는 상대적으로 안정한 구조이지만 생체내 핵산 분해효소에 의해 빠르게 분해되기 때문에 화학적 변형을 통해 분해 속도를 감소시킬 수 있다. siRNA의 화학적 변형에 가장 많이 사용되는 방식은 보라노포스페이트(boranophosphate) 또는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 수식 방법(modification)이다. 이들 물질은 siRNA의 뉴클레오사이드(nucleoside) 간의 연 결을 안정하게 형성하여, 결과적으로 핵산 분해에 대한 저항성을 부여한다.
또한, 본 발명의 유전자에 대한 shRNA도 siRNA와 비슷한 작용으로 세포 내에서 상기 유전자들을 분해시킴으로써 유전자들의 발현을 억제할 수 있다. shRNA는 siRNA를 기본 염기서열로 하여 합성할 수 있으며, 이들은 짧은 헤어핀 구조를 가지는데, 이들을 렌티바이러스 (lentivirus) 및 아데노바이러스 (adenovirus)에 삽입하여 발현시키면 loop가 있는 헤어핀 구조의 shRNA (short hairpin RNA)가 만들어지고 세포 내의 Dicer에 의해 siRNA로 전환되어 RNAi 효과를 나타낸다. 상기 shRNA는 siRNA에 비해 비교적 장기간 RNAi 효과를 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명의 혈소판 증가증 치료용 약제학적 조성물은 상기 siRNA 또는 shRNA는 siRNA의 세포 내 전달 효율을 높이기 위한 안전하고 효율적인 핵산 전달체를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 siRNA 또는 shRNA 핵산 물질을 세포 내로 전달하기 위한 핵산 전달체로는 바람직하게는 벡터이다. 바이러스 벡터 (viral vector)의 예로는 레트로바이러스 벡터(retroviral vector), 아데노바이러스 벡터(adenoviral vector) 및 아데노 부속 바이러스 벡터(adeno-associated viral vector) 등이 있다. 이러한 바이러스 벡터는 리보핵산의 세포내 전달 면에서는 효율적이지만, 생체 내에서의 활성을 가진 바이러스로의 재조합, 면역 반응 유발, 숙주 염색체로의 무작위 삽입 등 안전성(safety) 측면에서 여러 문제점이 있을 수 있다. 비바이러스 벡터(nonviral vector)는 바이러스 벡터에 비해 장점을 가지고 있는데, 독성과 면 역 반응이 작고, 반복적으로 투여가 가능하며, 리보핵산과의 복합체 형성이 간편하고, 대량 생산이 용이하다. 또한, 질환 세포나 조직부위에 특이적 리간드를 비바이러스성 벡터에 접합하여, 장기·세포 선택적 핵산 전달을 가능하게 한다. 비바이러스성 벡터로서는 리포좀, 양이온성 고분자를 비롯하여, 미셀, 에멀젼, 나노입자 등의 다양한 제형이 사용될 수 있다. 핵산 전달체는 동물 세포 내에 목적하는 핵산의 수송 효율을 현저히 증강시킬 수 있으며 전달하고자 하는 핵산의 사용 목적에 따라 어떤 동물 세포로도 핵산 전달이 가능하다.
또한, 본 발명의 유전자가 코딩하는 단백질의 발현을 감소시키는 억제제로는 상기 단백질에 대한 항체일 수 있으며, 단클론 항체, 다클론 항체, 키메릭 항체 및 인간화 항체 등을 포함한다. 상기 단백질에 대한 단클론 항체는 당업계에 통상적인 단클론 항체 제작 방법을 통해 제작되어 사용될 수도 있고, 시판되는 것을 사용할 수 있다. 또한, 단클론 항체 대신에 상기 단백질을 인식하는 다클론 항체를 사용할 수도 있고 이는 당업계에 통상적인 항혈청 제작 방법을 통해 제작되어 사용될 수도 있다.
본 발명의 유전자를 표적으로 하여 치료할 수 있는 혈소판 증가증 관련 질환으로는 예를 들어, 본태성 혈소판 증가증(essential thrombocythemia; ET), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous; CML), 진성다혈증(polycythemia vera; PV), 특발성 골수 섬유화증(agnogenic mteloidmetaplasia; AMM) 및 겸형적혈구 빈혈증(sickle cell anemia; SCA) 등을 포함한다.
본 발명의 혈소판 감소증 또는 혈소판 증가증 치료용 약제학적 조성물은 상기 유효 성분들 이외에 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체로는 예를 들면, 하나 이상의 물, 식염수, 인산 완충 식염수, 덱스트린, 글리세롤, 에탄올뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다. 이러한 조성물은 개체 투여 후 활성 성분의 빠른 방출, 또는 지속적이거나 지연된 방출을 제공하도록 제제화될수 있다. 또한, 유효성분이 항체일 경우 약제학적으로 허용되는 담체는 결합 단백질의 저장 수명 또는 유효성을 증가시키는 습윤제 또는 유화제, 방부제 또는 완충액과 같은 최소량의 보조 물질을 포함할 수 있다.
또한, 상기 약제학적 조성물은 상기 성분 외에도 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 포함할 수 있으며, 이러한 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 가용화제 등이 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용되는 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 제제화할 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다.
본 발명의 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 치료학적 유효량으로 필요한 대상자에게 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 혈소판 감소증(thrombocytopenia) 또는 혈소판 증가증 치료방법에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "치료학적 유효량"은 상태, 장애 또는 병을 치료하기 위해 대상자에게 투여될 때, 상기 치료에 영향을 미치기에 충분한 양을 의미한다. 치료학적 유효량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 조혈모세포 거핵구 및 혈소판으로의 분화 조절 후보 화합물을 처리하는 단계; 및 조혈모세포에서 KLF2(Kruppel-like factor2), LOC138255(OTTHUMP00000021439), GDF15(growth differentiation factor 15) 및 INHBE (inhibin, betaE)로 이루어진 군으로부터 선택되는 마커 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계를 포함하는, 조혈모세포로부터 거핵구 및 혈소판으로의 분화 조절 후보 화합물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "거핵구 및 혈소판으로의 분화 조절 후보 화합물"은 거핵구 및 혈소판으로의 분화시 세포 내에서 유의하게 일어나는 마커 유전자 발현량의 변화를 간접적 또는 직접적으로 억제 또는 유도하는 화합물을 의미한다. 본 발명의 스크리닝 방법은 후보 화합물의 존재 및 부재 하에서의 거핵구 분화 마커 유전자의 발현량 증감을 측정함으로써 거핵구 및 혈소판으로의 분화를 조절할 수 있는 물질들을 선별해낼 수 있으며, 특별히 마커 유전자의 발현량을 증대시키는 화합물을 선별함으로써, 조혈모세포로부터 거핵구로의 분화를 효율적으로 유도하는 화합물을 간편하게 스크리닝할 수 있다.
또한, 상기 스크리닝 방법으로 선별된 조혈모세포로부터 거핵구 및 혈소판으로의 분화 조절 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 혈소판 감소증 또는 증가증 치료에 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 마커 유전자들은 혈소판 감소증 치료에 실질적으로 사용될 수 있는 거핵구 및 혈소판의 분화 여부를 간편하게 탐지할 수 있는 마커로 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 조혈모세포로부터 거핵구 및 혈소판으로의 분화조절을 위한 표적 유전자로 이용되거나 거핵구 및 혈소판으로의 분화를 조절할 수 있는 후보화합물의 스크리닝에 효율적으로 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. K562 세포( 인간골수백혈병 세포주)의 배양 및 거핵구로의 분화 유도
본 발명자들은 조혈모세포로서 인간골수백혈병 세포주인 K562 세포를 사용하였으며, K562 및 OP9 골수 기질 세포는 ATCC(American Type Culture Collection, Rockville, MD)로부터 구입하였다.
OP9 골수 지질 세포주를 웰당 1×105 개가 되도록 조절하여 6웰 배양접시에 분주하여 20% 열-불활성화된 FBS, 0.5% 페니실린/스트렙토마이신 및 1.5 g/L 탄산수소 나트륨이 공급된 a-MEM 배지에서 세포들이 단일막 상태로 되도록 24시간 동안 배양하였다. OP 세포가 바닥에 고루 분주 되었는지를 확인하고, K562 세포를 웰당 1×105 개가 되도록 조절하여 각각의 웰 내 OP 세포 위에 분주하여 OP 세포와 함께 공배양하고, 이들 K562 세포에 (R)-NALPLE(한국 등록특허 제10-0688261호 참고)을 40㎍/ml 농도로 처리하여 거핵구로 분화 유도시켰다.
실시예 2. mRNA 분리 및 올리고뉴클레오타이드 어레이
미분화 상태의 K562 세포와 실시예 1의 방법에 의해 화합물 처리되어 거핵구로의 분화가 유도된 세포들의 mRNA를 추출하였다. 분화 과정에서의 유전자 발현 양상을 구체적으로 살피기 위해, 화합물 처리한 후 6, 12, 24, 48, 72, 96 및 120 시간 째의 세포들을 각각 Qiagen사(미국)의 RNeasy mini kit를 이용하여 분리하고, 1㎍의 RNA를 사용하여 마크로젠의 올리고뉴클레오타이드 어레이를 분석하였다.
분석 결과, 미분화 상태의 K562에 비해 분화유도된 K562세포에서 발현 정도가 5배 이상 증가된 유전자들 67개를 선정하고, 이들 유전자를 전사인자 수용체, 불분명한 기능, 선택적 칼슘결합 단백질, 포스파타아제, 신호 분자, 선택적 조절인자, 프로테아제, 핵산결합, 세포골격 단백질, 키나아제, 세포 부작 분자, 트랜스퍼라제, 신타아제, 가수분해 효소 방어/면역 및 분류되지 않은 분자 기능으로 분류 한 후, 이들 유전자들 중 발현량이 10배 이상 증가되어 거핵구로 분화된 세포에 특이적인 마커로서 이용할 수 있는 4개 유전자 KLF2(Kruppel-like factor2), LOC138255(OTTHUMP00000021439), GDF15(growth differentiation factor 15) 및 INHBE (inhibin, betaE)을 선정했다.
실시예3 . 세포 내의 KLF2 , LOC138255 , GDF15 및 INHBE 유전자 발현 측정
상기에서 선정된 4개 유전자 KLF2, LOC138255, GDF15, 및 INHBE가 거핵구로의 분화 과정에서 어떠한 발현 양상을 나타내는지 분석하기 위해 RT-PCR을 수행하 여 세포 내의 mRNA 양을 측정하였다.
분화 과정에서의 유전자 발현 양상을 구체적으로 살피기 위해, K562 세포 및 화합물((R)-NALPLE 40㎍/ml) 처리 후 6, 12, 24, 48, 72, 96 및 120 시간째의 세포들로부터 M-MLV Reverse Transcriptase (Promega, Madison,WI)를 이용하는 제조자의 지침서에 따라 RNeasy mini kit를 이용하여 RNA를 추출, 분리하고 RT-PCR을 수행하였다.
증폭 조건은 95℃에서 30초, 60℃에서 60초, 및 72℃에서 90초 동안으로 20회(GAPDH) 또는 25회(KLF2, LOC138255, GDF15, 및 INHBE)로 하였다. 이때 사용한 프라이머를 하기에 기재하였다.
- KLF2 forward primer(서열번호 1) ; 5’-GCAAGACCTACACCAAGAGTTCG-3’
reverse primer(서열번호 2) ; 5’-CATGTGCCGTTTCATGTGC-3’
- LOC138255 forward primer(서열번호 3) ; 5’-ATGAGGAAACAGTGAGCTCC-3’
reverse primer(서열번호 4) ; 5’-AATCCCACTCTCATCATGCC-3’
- GDF15 forward primer(서열번호 5) ; 5’-ATGGCTCTCAGATGCTCCTG-3’
reverse primer(서열번호 6) ; 5’-AGAGATACGCAGGTGCAGGT-3’
- INHBE forward primer(서열번호 7) ; 5’-ATGGGTTGCACCTGACCAGT-3’
reverse primer(서열번호 8) ; 5’-TTGGTGATGTGGTGCTCAGC-3’
- GAPDH forward primer(서열번호 9) ; 5’-CTGCACCACCAACTGCTTAG-3’
reverse primer(서열번호 10) ; 5’-AGATCCACGACGGACACATT-3’
PCR 반응 후에, 각 반응 혼합액은 1% 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석되었고, 밴드는 에티디움 브로마이드 염색에 의해 가시화되었다(도 1).
실험 결과, KLF2, LOC138255, GDF15, 및 INHBE 유전자들이 분화가 유도되는 과정동안 실질적으로 발현된다는 것을 확인할 수 있었고, 특히 12시간 내지 96시간 내에 집중적으로 발현되는 경향을 나타냈다.
실시예 4. shRNA 에 의한 배수체화의 억제 및 형태변화
상기에서 선정된 유전자들이 거핵구 및 혈소판으로의 분화과정을 조절할 수 있는지를 살펴보기 위해, 상기 유전자들의 발현을 억제할 수 있는 KLF2, LOC138255, GDF15, 및 INHBE 유전자 각각에 대한 shRNA를 제작하고, 이를 K562 세포에 형질도입시켰다.
각 유전자의 shRNA에 의해 감염된 K562세포를 FACS Aria로 분리해낸 후, 감염된 K562 세포에 화합물((R)-NALPLE 40㎍/ml)을 처리한 후, OP 세포와 함께 4일간 공동배양하였다. 그 후 세포는 셀퀘스트(cell quest)를 이용한 형광-활성화된 세포 분리기로 분석하였다. 그리고 200배율로 사진 촬영하였다. 결과는 평균 ± SD (n = 3)로 나타내었다. 유사한 결과가 3회의 독립적인 실험으로부터 얻어졌다(도 2).
실험 결과, 감염되지 않은 K562 세포는 혈소판 생성능을 갖는 거핵구에 특이적으로 나타나는 특징인 유사분열을 통한 배수체화 정도가 증대되어 핵 수가 증가되는 결과를 나타냈지만, 상기 유전자들에 대한 shRNA로 감염된 K562세포는 대조군 에 비해 핵 수가 줄어들어 배수체화가 되는 정도가 억제되는 경향을 보였다. 특히, KLF2 및 LOC138255 유전자에 대한 shRNA를 형질도입시킨 세포는 배수체화 정도가 억제되었을 뿐만 아니라, 화합물을 처리하지 않아 분화가 전혀 유도되지 않은 미분화 K562 세포의 형태와 비슷한 정도를 나타냈다.
실시예 5. shRNA 에 의한 거핵구 및 혈소판으로의 분화 억제
상기에서 선정된 유전자들의 발현을 억제시켰을 때, K562 세포의 거핵구로의 분화도 억제되는지 알아보기 위해, KLF2, LOC138255, GDF15, 및 INHBE 유전자 각각에 대한 shRNA를 K562 세포에 형질도입시킨 후, 거핵구 특이적 마커로 알려진 CD41 및 CD61 단백질의 발현 정도를 확인하였다.
각 유전자의 shRNA에 의해 감염된 K562세포에 화합물((R)-NALPLE 40㎍/ml)을 처리한 후, OP 세포와 함께 4일간 공동배양하였다. 그 후 세포를 모아서 20 ㎍/ml 항-CD41/PECY5, 항-CD61/Percp를 포함하는 PBS(200 ㎕)에서 30분 동안 37℃에서 배양하였다. 세포는 Cell quest를 이용한 형광-활성화된 세포 분리기로 분석하였다. 결과는 평균 ± SD (n = 3)로 나타내었다. 유사한 결과가 3회의 독립적인 실험으로부터 얻어졌다(도 3).
실험 결과, shRNA로 감염되지 않은 세포(대조군)에 비해 각 유전자들에 대한 shRNA로 감염된 세포군에서 CD41 및 CD61 단백질의 발현이 억제되는 것으로 나타났다. 특히, KLF2 및 LOC138255 유전자에 대한 shRNA를 형질도입시킨 세포는 대조군에 비해 거핵구 특이 마커인 CD41 및 CD61 단백질의 발현 정도가 50% 정도로 억제 되는 결과를 보였다. 이러한 결과는 상기 KLF2, LOC138255, GDF15, 및 INHBE 유전자들이 세포 내에서 거핵구 및 혈소판으로의 분화과정을 직접적으로 조절할 수 있다는 것을 보여주는 결과이며, 나아가 이들 유전자들을 거핵구로 분화된 세포를 탐지하기 위한 마커로서 사용할 수 있다는 점을 확인시켜주는 결과이다.
실시예 6. shRNA 에 의한 유전자 발현 억제
상기에서 선정된 유전자들 중 KLF2 및 LOC138255 유전자에 대한 shRNA에 의해 세포 내에서 KLF2 및 LOC138255 유전자의 mRNA 발현이 실제로 억제되는지를 확인하기 위해, 세포를 shRNA로 감염시킨 후, RNA를 분리하여 RT-PCR을 수행하였다.
K562 세포는 마이크로포레이션 방법을 이용하여 KLF2 및 LOC138255 유전자에 대한 shRNA인 shKLF2 및 shLOC138255으로 각각 감염시켰다. 마이크로포레이션 후 감염된 K562 세포를 4일 동안 배양하였다. 감염된 세포와 미분화 K562 세포로부터 총 RNA를 추출하였고 RT-PCR을 수행하여 상기 유전자 발현 정도를 확인하였다. 증폭 조건은 95℃에서 30초, 60℃에서 60초, 및 72℃에서 90초 동안으로 20회(GAPDH) 또는 25회(KLF2, LOC138255)로 하였다. PCR 반응 후에, 각 반응 혼합액은 1% 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석되었고, 밴드는 에티디움 브로마이드 염색에 의해 가시화되었다(도 1).
실험 결과, KLF 및 LOC 유전자에 대한 shRNA로 감염된 세포들의 KLF2 및 LOC138255 유전자의 mRNA 발현 정도가 억제되는 결과를 보였다(도 4). 이러한 결과는 KLF2 및 LOC138255 유전자가 조혈모세포로부터 거핵구 및 혈소판으로의 분화 및 성숙과정에 관여한다는 것을 보여주는 결과이다.
본 발명에 따른 거핵구 및 혈소판으로의 분화 마커 검출용 조성물은 혈소판 감소증 치료에 사용될 수 있는 거핵구 및 혈소판으로 분화되었는지 여부를 간편하게 판단할 수 있어, 거핵구 및 혈소판으로의 분화 여부 탐지를 위한 키트에 효율적으로 이용될 수 있으며, 거핵구 및 혈소판으로의 분화를 조절할 수 있는 후보화합물의 스크리닝에 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 마커 유전자들은 거핵구 및 혈소판으로의 분화조절 및 혈소판 관련 질환 치료제 개발을 위한 새로운 표적 유전자로 이용될 수 있다.
도 1은 화합물((R)-NALPLE)을 처리하여 거핵구로 분화를 유도한 후, K562 세포내의 KLF2, LOC138255, GDF15, 및 INHBE 유전자 발현 양상을 RT-PCR 방법을 통해 분석한 결과이다.
도 2는 KLF2, LOC138255, GDF15, 및 INHBE 유전자에 대한 shRNA로 감염된 K562 세포를 거핵구로 분화유도했을 때, shRNA에 의해 세포의 배수체화 억제 및 형태 변화를 보여주는 결과이다.
도 3은 KLF2, LOC138255, GDF15, 및 INHBE 유전자에 대한 shRNA로 감염된 K562 세포를 거핵구로 분화유도했을 때, shRNA에 의해 실질적으로 분화가 억제되는지를 확인하기 위해 거핵구 특이적 마커인 CD41 및 CD61 단백질 발현 정도를 분석한 결과이다.
도 4는 KLF2 및 LOC138255 유전자에 대한 shRNA로 감염된 K562 세포를 거핵구로 분화유도했을 때, 세포 내의 KLF2 및 LOC138255 유전자의 mRNA 발현량을 측정한 결과이다.
<110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation <120> Genes controlling differentiation of hematopoietic stem cells into megakaryocytes and platelets, and use thereof <130> PA080100 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for identifying KLF2 gene <400> 1 gcaagaccta caccaagagt tcg 23 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for identifying KLF2 gene <400> 2 catgtgccgt ttcatgtgc 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for identifying LOC138255 gene <400> 3 atgaggaaac agtgagctcc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for identifying LOC138255 gene <400> 4 aatcccactc tcatcatgcc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for identifying GDF15 gene <400> 5 atggctctca gatgctcctg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for identifying GDF15 gene <400> 6 agagatacgc aggtgcaggt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for identifying INHBE gene <400> 7 atgggttgca cctgaccagt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for identifying INHBE gene <400> 8 ttggtgatgt ggtgctcagc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for identifying GAPDH gene <400> 9 ctgcaccacc aactgcttag 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for identifying GAPDH gene <400> 10 agatccacga cggacacatt 20

Claims (14)

  1. KLF2(Kruppel-like factor2), LOC138255(OTTHUMP00000021439), GDF15(growth differentiation factor 15) 및 INHBE(inhibin, betaE)로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 조혈모세포로부터 거핵구 및 혈소판으로의 분화 여부를 탐지하기 위한 마커 검출용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조혈모세포는 인간골수백혈병세포주인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 유전자의 발현수준을 측정하는 제제는 상기 유전자들의 mRNA 또는 단백질의 양을 측정하는 제제인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제제가 프라이머 또는 항체인 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 조혈모세포로부터 거 핵구 및 혈소판으로의 분화 마커 검출용 키트.
  6. KLF2(Kruppel-like factor2), LOC138255(OTTHUMP00000021439), GDF15(growth differentiation factor 15) 및 INHBE(inhibin, betaE)로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 발현 수준을 확인하여 조혈모세포로부터 거핵구 및 혈소판으로의 분화 여부를 탐지하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 유전자가 코딩하는 단백질에 대한 항체를 조혈모세포와 접촉시켜 항원-항체 복합체를 형성하는 단계 및 상기 항원-항체 복합체의 형성량의 증가를 대조군의 형성량과 비교하는 단계를 포함하는, 조혈모세포로부터 거핵구 및 혈소판으로의 분화 여부를 탐지하는 방법.
  8. KLF2(Kruppel-like factor2), LOC138255(OTTHUMP00000021439), GDF15(growth differentiation factor 15) 및 INHBE(inhibin, betaE)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 유효성분으로 포함하는, 조혈모세포로부터 거핵구 및 혈소판으로의 분화 조절제.
  9. KLF2(Kruppel-like factor2), LOC138255(OTTHUMP00000021439), GDF15(growth differentiation factor 15) 및 INHBE(inhibin, betaE)로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 발현을 증가 또는 감소시킴으로써 조혈모세포로부터 거핵구 및 혈소판으로의 분화를 조절하는 방법.
  10. KLF2(Kruppel-like factor2), LOC138255(OTTHUMP00000021439), GDF15(growth differentiation factor 15) 및 INHBE(inhibin, betaE)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 발현을 증가시키거나 단백질의 활성을 증진시키는 물질을 유효성분으로 포함하는 혈소판 감소증 치료용 약제학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 유전자 발현을 증가시키거나 단백질 활성을 증진시키는 물질은 상기 유전자를 포함하는 벡터인 조성물.
  12. KLF2(Kruppel-like factor2), LOC138255(OTTHUMP00000021439), GDF15(growth differentiation factor 15) 및 INHBE(inhibin, betaE)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 발현을 감소시키거나 단백질의 활성을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 혈소판 증가증 치료용 약제학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 유전자 발현을 감소시키거나 단백질의 활성을 억제하는 물질은 상기 유전자에 대한 RNAi, siRNA, shRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 상기 단백질에 대한 항체인 조성물.
  14. 조혈모세포로부터 거핵구 및 혈소판으로의 분화 조절 후보 화합물을 처리하는 단계; 및 조혈모세포에서 KLF2(Kruppel-like factor2), LOC138255(OTTHUMP00000021439), GDF15(growth differentiation factor 15) 및 INHBE(inhibin, betaE)로 이루어진 군으로부터 선택되는 마커 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계를 포함하는, 조혈모세포로부터 거핵구 및 혈소판으로의 분화 조절 후보 화합물을 스크리닝하는 방법.
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KR20160084709A (ko) * 2015-01-06 2016-07-14 주식회사 두산 인간골수백혈병세포주로부터 분화유도된 거핵구 및 혈소판을 생산하는 방법

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KR20160084709A (ko) * 2015-01-06 2016-07-14 주식회사 두산 인간골수백혈병세포주로부터 분화유도된 거핵구 및 혈소판을 생산하는 방법

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