KR20090128119A

KR20090128119A - 골풀 추출물을 함유하는 염증질환 또는 면역질환의 치료또는 예방용 조성물

Info

Publication number: KR20090128119A
Application number: KR1020080054142A
Authority: KR
Inventors: 최송암; 최재승; 이영재; 양희경; 안은미
Original assignee: (주)유라팜
Priority date: 2008-06-10
Filing date: 2008-06-10
Publication date: 2009-12-15
Also published as: KR101113184B1

Abstract

본 발명은 염증질환 또는 면역질환의 치료 또는 예방에 유용한 약학 조성물에 관한 것으로서, 골풀(Juncus effusus) 추출물, 바람직하게는, 칸토사이드, 보다 바람직하게는, 칸토사이드 B를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

칸토사이드 B, 골풀, 염증, NO, TNF-알파, NF-κB, COX-2

Description

골풀 추출물을 함유하는 염증질환 또는 면역질환의 치료 또는 예방용 조성물{Juncus effusus extract-containing composition for treating or preventing inflammatory disease or immunological disease}

본 발명은 염증질환 또는 면역질환의 치료 또는 예방에 유용한 약학 조성물에 관한 것이다.

NO(Nitric oxide; 산화질소)는 인체의 대식세포(macrophage)에서 산화질소 합성효소 (Nitric oxide synthetase, 이하 NOS)에 의해 L-아르기닌으로부터 생성된다. 인체의 NOS에는 내피세포 구성형 NOS (endothelial constitutive NOS, eNOS), 신경세포 구성형 NOS (neuronal constitutive NOS, nNOS) 및 유도성 NOS (inducible NOS, iNOS)의 3가지 이성체가 존재한다. 이중 eNOS와 nNOS는 각각 내피세포(endothelial cell)와 신경외피세포(neuroectodermal cell)에서 발현되며, 칼슘 및 칼모듈린에 의존적인 반면, iNOS는 병원균의 세포막 성분인 리포폴리사카라이드(이하 LPS), IL-1, TNF-알파와 같은 사이토카인, 방사선 등의 면역자극제에 의해 세포가 활성화될 때에만 여러 세포에서 큰 양이 발현되며, 칼슘 및 칼모듈린에 비의존적이다.

NO는 높은 농도에서는 종양세포와 병원균에 대하여 방어기능을 하며, 혈관내피세포에서 생성된 낮은 농도의 NO는 혈압조절작용을, 신경세포에서 생성되는 NO는 신경전달물질, 학습, 기억 등에 관련된 다양한 생리 반응을 수행한다. 유도형이 아닌 구성형 NOS는 인체의 항상성 유지에 중요한 역할을 하는데, eNOS에 의해 생성된 NO는 혈관계에 작용하여 혈관확장, 혈소판 부착이나 응집을 억제시키며, nNOS에 의해 성성된 NO는 신경계에 작용하여 기억능력에 중요한 장기기억능력을 상승시키거나 신경전달물질로서 우울증을 일으킬 뿐만 아니라, 소화기관의 운동성이나 음경의 발기에도 관여한다. 반면에, 특정 사이토카인이나 LPS에 의해 유도된 iNOS 발현에 의해서 생성되는 NO는 염증발현이나 숙주방어기전 등에 작용하며, 또한 균체내독소 (endotoxin)의 자극에 의해 대식세포에서의 iNOS 발현이 유도되고, 이로부터 NO의 생성이 증가하기도 한다 [Butler A.R., Chemistry & Industry, 1995, 16, 828-830].

LPS, 염증유발인자, 방사선조사 등의 외부자극에 의해 iNOS의 발현이 유도되면 많은 양의 NO가 4-6시간 동안 계속적으로 생성되고, 이는 인체에 염증반응을 유발하는 것으로 알려져 있다. 또한, 쥐의 경우 LPS의 외부자극에 의해 대식세포에서 많은 양의 iNOS mRNA와 단백질이 발현되고 여기서 합성된 NO는 미생물 살균작용과 항종양작용을 수행한다. 그러나, 필요 이상의 과다한 NO 생성은 관절염, 패혈증 등의 염증질환과 조직이식거부반응, 자가면역질환, 당뇨병 등의 면역질환 및 신경세포의 사멸을 야기하는 것으로 알려져 있다. 따라서 iNOS 활성 억제제는 이러한 질병치료제로서의 개발 가능성이 크며, 이러한 관점에서 iNOS에 의한 NO 생성을 억제 하는 화합물은 인체의 다양한 염증질환의 치료제로 이용될 수 있다.

이러한 염증 반응에 의해 발생하는 염증질환에는 동맥경화 외에 위염, 대장염, 관절염, 신장염, 간염, 암 또는 퇴행성 질환(Gobert A. P. et al., J. Immunol. 168(12), pp6002-6006, 2002; Dijkstra G. et al., Scand. J. Gastroenterol. 37(5), pp546-554, 2002; Sakac V. and Sakac M. Med. Pregl. 53, pp463-474, 2000; Albrecht E. W. et al., Am. J. Transplant, 29(5), 448-453, 2002; Ramachandran A. et al., Free Radical Biol. Med. 33(11), pp1465-1474, 2002; Sartor L. et al., Biochemical Pharmacol. 64, pp229-237, 2002; Sadowska-Krowicka H. et al., Proc. Soc. Exp. biol. Med. 217(3), pp351-357, 1998, Lo A-H. et al., Carcinogenesis, 23(6) , pp983-991, 2002) 등이 포함된다.

염증유발인자 중 종양 괴사 인자(TNF)-알파는 오랫동안 염증질환 및 면역질환 치료제 개발의 중요 목표가 되어 왔으며, 생체 내에서 LPS 등의 다양한 자극에 반응하여 NO와 같이 대식세포로부터 생성된다. TNF-알파는 자가면역질환 (류마티스 관절염, 장기이식거부반응 등), 알러지성 염증질환 (천식, 아토피성 피부염 등), 급성면역질환 (패혈증, 급성간질환 등) 등에 관련성이 보고되면서 TNF-알파의 합성을 억제하는 화합물 개발 연구가 활발하게 진행되고 있고, 암세포의 혈관신생과의 관련성도 제기되었다. 따라서 과도하게 상승한 TNF-알파의 활성을 조절하게 되면 각종 염증반응 및 면역반응을 조절하여 이들 관련 질환들을 치료할 수 있게 된다.

한편 전사인자 NF-κB(Nuclear factor kappa B)는 염증유발 사이토카인, 독성화합물, 박테리아감염, 바이러스감염, 방사선, UV, 활성산소 등의 다양한 외부자 극에 의해 활성화되어 세포사멸, 면역반응, 염증반응 등의 다양한 세포 반응에 관련된 단백질 발현을 조절하는 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서 비정상적인 NF-κB의 활성은 각종 암, 관절염 등의 염증질환, 천식이나 아토피 피부염과 같은 알러지성 질환, 동맥경화, 알츠하이머, 호치킨씨병 등의 암, 염증, 면역질환 등과 관련되어 있으므로 이러한 NF-κB의 활성을 저해하는 화합물은 상기 질환들을 치료하기 위한 치료제로서의 표적이 되고 있다[A. S. Baldwin Jr, J. Clin . Invest ., 2001, 107, 241-246].

보다 구체적으로, 염증이 퇴행성 뇌질환의 병태생리에 중요한 역할을 한다는 결과들이 연이어 보고되고 있다. 뇌에 존재하는 마이크로글리아(microglia)는 알츠하이머성 치매, 파키슨병, 루게릭병에서 신경손상이 일어나는 부위에서 활성화 된다(Liu B 및 Hong JS. J Pharmacol Exp Ther. 2003;304(1):1-7; Orr CF et al., Prog Neurobiol. 2002;68(5):325-40; 및 Henkel JS et al., Ann Neurol. 2004;55(2):221-35). 활성화된 마이크로글리아는 프로스타글랜딘, 사이토카인, 키모카인, 활성산소, NO 등을 생성하여 뇌에서의 염증반응을 개시한다(Minghetti L. Curr Opin Neurol. 2005;18(3):315-21; Gao HM, Trends Pharmacol Sci. 2003;24(8):395-401; Weydt P and Moller T. Neuroreport. 2005;16(6):527-31; 및 J.J.M. Hoozemans Int. J. Devl Neuroscience. 2006; 24:157-165). 따라서 염증을 억제하는 약물의 투여는 알츠하이머성 치매의 동물모델에서 베타 아밀로이드와 플라크의 생성을 억제하며(Townsend KP and Pratico D. FASEB J. 2005;18:315-21), 파킨슨병 동물모델에서 도파민 신경세포를 보호하고(Ferger B et al., Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 1999;360(3):256-61; 및 Teismann P, Ferger B. Synapse. 2001;39(2):167-74), 루게릭병 모델에서 척수 운동신경세포의 사멸을 방지 및 글리아(glia) 활성을 줄이는 것으로 보고되었다(Kiaei M et al., J Neurochem. 2005;93(2):403-11). 실제로 타박상 등 뇌에 염증반응을 동반하는 병력을 가진 환자에게서 AD의 발병율이 높고(Breitner et al., 1994), 비스테로이드성 소염제(nonsteroidal anti-inflammatory drug, NSAID)를 장기 복용하는 류머티즘성 관절염 환자의 AD 발병률이 낮다고 보고되었다(McGeer and Rogers, 1990). NSAID의 복용이 AD의 예방은 물론 인지기능 손상의 진행을 늦춘다는 연구결과도 발표되었다(Rich et al., 1995 Neurology; Andersen et al., 1995 Neurology; 및 Breitner et al., 1994 Neurology). 이러한 결과는 염증반응을 억제하는 약물이 퇴행성 뇌질환의 예방과 치료에 사용될 가능성이 있음을 제시한다.

또한, 아포리포프로테인(Apolipoprotein) E-결핍 (apoE(-/-)) 생쥐의 초기 죽상경화 병변(atherosclerotic lesion) 형성에 있어 선택적인 COX-2 억제제(예를 들어, 로페콕시브(rofecoxib) 및 NS-398)와 비선택적인 COX 억제제(예를 들어, 인도메타신)는 죽상경화증을 각각 약 35-38% 및 약 38-51% 감소시켰다(Burleigh ME J Mol Cell Cardiol. 2005 Sep;39(3):443-52).

NF-κB를 활성화하는 대표적인 자극인자인 LPS, TNF-알파, 인터루킨(Interleukin)-1, 방사선조사 등의 유해한 자극은 인체 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 TNF-알파, 인터루킨-1, 인터루킨-6, 프로스타글란딘(prostaglandin)-E2, 루코트리엔(leucotriene) 및 산화질소(nitric oxide) 와 같은 염증 유발 물질의 생산을 과도하게 유도하여 관절염, 패혈증 등의 염증질환과 조직이식 거부반응, 천식이나 아토피 등을 포함하는 자가면역질환 및 치매 등에서 신경세포의 사멸, 암, 당뇨병, 지질동맥경화 등을 유발하는 것으로 알려져 있다. 실제로 TNF-알파나 아드리아마이신(adriamycin)으로 암세포를 처리하면 NF-κB가 활성화되어 상기 약물에 의해 유도되는 세포사멸을 억제하게 되고, NF-κB의 활성을 억제하면 세포사멸 경로가 활성화되어 약물의 감수성이 증가하게 된다[A. A. Berg & D. Baltimore, Science , 1996, 274:782-784; C. Y. Wang & M. W. Mayo & A. S. Baldwin Jr., Science , 1996, 274:784-789]. 즉, NF-κB는 세포 내에 존재하지만 자유라디컬, 염증을 유발하는 자극, 발암물질, 톡신, 자외선 등의 자극에 의해 활성화되면 핵 내로 옮겨가게 되며 세포사멸 억제, 세포 변형, 증식, 침윤, 전이 또는 화학적 저항, 염증 등을 일으키는 200여 개의 유전자의 발현을 유도한다. 따라서 암, 동맥경화, 당뇨, 알러지, 천식, 관절염, 알츠하이머병, 비만 등과 직접적인 관련이 있다[Chen., Biochem Biophy Res Comm, 2005, 332:1; Jove et al., Endocrinology , 2005, 146:3087; Dandrona et al., Circulation , 2005, 111:1448; Aggarwal et al., Ann N Y Acad Sci , 2004, 1030:434].

NF-κB의 활성화를 억제하는 화합물로는 커큐민(curcumin), 캡사이신(capsaicin), 카페인산(caffeic acid), 데트란드린(tetrandrine), 생귀나린(sanguinarine) 등이 보고되었으며, 대표적인 글루코코르티코이드계 소염제인 덱사메타손(dexamethasone)은 iNOS 유전자의 발현을 억제하여 NO의 생성을 저해하는데 덱사메타손의 이러한 활성 기전은 NF-κB의 활성을 억제함으로써 iNOS의 유전자 전사를 억제하는 것으로 보고되었다[De Vera, M. E. et al., Am J Physiol, 1997, 273:1290-1296].

예를 들어, 대한민국특허(출원번호 10-2001-0078375)에서는 노박덩굴(Celastrus orbiculatus)에서 분리한 세래스트롤, 세래판올, 세스퀴테르펜 에스터계 화합물이 NF-κB의 활성을 억제함에 따라, 염증 유도 효소인 iNOS 및 COX-2의 발현을 억제하고, TNF-알파의 염증유도 사이토카인의 생성을 강력히 저해하므로 염증질환 치료제, 면역질환 치료제 또는 암 치료제로 유용하게 이용될 수 있음이 개시되어 있다.

따라서 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 iNOS의 발현 억제 효과, 전사인자 NF-κB의 활성화 조절 효과, TNF-알파의 생성 억제 효과 등을 나타내어 염증질환, 면역질환, 암, 동맥경화 등의 치료, 개선 또는 예방에 유용하며, 안전한 조성물을 제공하는 것이다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 골풀(Juncus effusus) 추출물을 유효 성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 염증질환 또는 면역질환의 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.

바람직하게, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 칸토사이드(canthoside) 유도체를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 염증질환 또는 면역질환의 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.

<화학식 1>

상기 화학식 1에서, R1 내지 R5는 서로 독립적으로 H, OMe, COOMe 및 OH 중 어느 하나이다.

이하, 본 발명에 따른 염증질환 또는 면역질환의 치료 또는 예방용 조성물에 대해 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명자들은 염증유발인자인 NO의 생성을 억제하는 화합물을 개발하기 위해 연구하던 중 등심초(Juncus effusus L.)로서 골풀과에 속하는 나년생 식물인 골풀로부터 분리한 페놀릭 글리코사이드(phenolic glycoside) 계열의 화합물인 칸토사이드 유도체들이 LPS로 자극한 대식세포에서 NF-kappaB의 활성화를 억제하여 NO와 TNF-α의 생성을 강력하게 억제하는 활성이 있음을 발견하고, 이로부터 칸토사이드 유도체의 염증질환 또는 면역질환 개선제로서의 용도를 제시함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명은 골풀 추출물, 바람직하게는 상기 화학식 1로 표시되는 칸토사이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 더욱 바람직하게는 칸토사이드 B 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 염증질환 또는 면역질환의 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.

여러 칸토사이드 유도체들 중에서 상기 화학식 1의 R1, R2, R3, R4 및 R5가 COOMe, H, H, H 및 H인 칸토사이드 A; R1, R2, R3, R4 및 R5가 H, OMe, OH, OMe 및 H인 칸토사이드 B; R1, R2, R3, R4 및 R5가 H, OMe, OH, H 및 H인 칸토사이드 C; 및 R1, R2, R3, R4 및 R5가 OMe, H, OH, H 및 H인 칸토사이드 D의 약리 효과가 우월하며, 특히 이들 중 칸토사이드 B의 염증질환 또는 면역질환 관련 약리 효과가 탁월하다.

본 발명에 따른 칸토사이드 유도체는 골풀로부터 본 발명이 속한 분야에서 잘 알려진 추출, 분리 및 정제방법을 통해서도 얻을 수 있으며, 또한 본 발명이 속한 분야에서 잘 알려진 화학적 합성법을 통해서도 제조될 수 있다.

통상적인 용매추출방법으로서 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 클로로포름, 헥산, 에틸아세테이트, 디클로로메탄, 이들의 혼합물 등의 적당한 용매를 이용하여 추출하거나 초임계 추출법을 통해서도 얻을 수 있으며, 또한 추출물을 다시 정제함으로써 더욱 고순도의 골풀 추출물 또는 칸토사이드를 얻을 수 있다. 그러나 본 발명을 완성하기 위하여 칸토사이드 유도체를 얻는 방법이 여기에 한정된 것은 아니다.

본 발명의 "약학적으로 허용 가능한 염"은 독성이 없거나 적은 염기로 제조된 염들을 말한다. 본 발명 화합물의 염기(base) 부가 염들은 충분한 양의 원하는 염기와 적당한 비활성(inert) 용매로 그러한 화합물의 중성 형태를 접촉하여 얻을 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염기 부가 염은 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 암모늄, 마그네슘 또는 디에틸아민 등의 유기 아미노로 이루어진 염을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또한 상기 칸토사이드의 수화물 형태를 포함하며, 용매화된 형태뿐만 아니라 비-용매화된(unsolvated) 형태도 포함한다. 또한 본 발명의 상기 화합물은 결정형 또는 무정형 형태로 존재할 수 있으며, 이러한 모든 물리적 형태는 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명의 염증질환 또는 면역질환의 치료 또는 예방용 조성물은 의약품 및 기능성 식품의 형태로 제조될 수 있다. 이러한 의약품 및 기능성 식품은 약제학적 으로 허용되는 부형제 또는 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 단독으로 혹은 어떤 편리한 운반체, 부형제 등과 함께 혼합하여 투여될 수 있고, 그러한 투여 제형은 단회투여 또는 반복투여 제형일 수 있다.

본 발명의 조성물을 포함하는 의약품 또는 기능성 식품은 고형 제제 또는 액상 제제일 수 있다. 고형 제제는 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 좌제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 고형 제제에는 부형제, 착향제, 결합제, 방부제, 붕해제, 활택제, 충진제 등이 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 액상 제제로는 물, 프로필렌 글리콜 용액 같은 용액제, 현탁액제, 유제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 적당한 착색제, 착향제, 안정화제, 점성화제 등을 첨가하여 제조할 수 있다.

예를 들어, 산제는 본 발명의 골풀 추출물 또는 칸토사이드 B와 유당, 전분, 미결정셀룰로오스 등 약제학적으로 허용되는 적당한 부형제를 단순 혼합함으로써 제조될 수 있다. 과립제는 본 발명의 골풀 추출물 또는 칸토사이드 B; 약제학적으로 허용되는 적당한 부형제; 및 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필셀룰로오스 등의 약제학적으로 허용되는 적당한 결합제를 혼합한 후, 물, 에탄올, 이소프로판올 등의 용매를 이용한 습식과립법 또는 압축력을 이용한 건식과립법을 이용하여 제조될 수 있다. 또한 정제는 상기 과립제를 마그네슘스테아레이트 등의 약제학적으로 허용되는 적당한 활택제화 혼합한 후, 타정기를 이용하여 타정함으로써 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물은 치료해야할 질환 및 개체의 상태에 따라 경구제, 주사 제(예를 들어, 근육주사, 복강주사, 정맥주사, 주입(infusion), 피하주사, 임플란트), 흡입제, 비강투여제, 질제, 직장투여제, 설하제, 트랜스더말제, 토피칼제 등으로 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 투여경로에 따라 통상적으로 사용되고 비독성인, 약제학적으로 허용되는 운반체, 첨가제, 비히클을 포함하는 적당한 투여 유닛 제형으로 제제화될 수 있다. 일정 시간 동안 약물을 지속적으로 방출할 수 있는 데포(depot) 제형 또한 본 발명의 범위에 포함된다.

염증질환 또는 면역질환의 개선이라는 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 골풀 추출물 또는 칸토사이드 유도체는 매일 약 0.001 mg/kg 내지 약 10 g/kg이 투여될 수 있으며, 약 0.01 mg/kg 내지 약 1 g/kg의 1일 투여 용량이 바람직하다. 그러나 상기 투여량은 골풀 추출물의 정제 정도, 환자의 상태(연령, 성별, 체중 등), 치료하고 있는 상태의 심각성 등에 따라 다양할 수 있다. 필요에 따라 편리성을 위하여 1일 총 투여량이 나누어지고 하루 동안 여러 번 나누어 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물로 치료, 개선 또는 예방될 수 있는 염증질환은 염증 및 염증반응에 의해 발생하는 위염, 대장염, 관절염, 패혈증, 신장염, 간염, 암, 동맥경화 또는 퇴행성 질환을 예시할 수 있으며, 본 발명에 따른 조성물로 치료, 개선 또는 예방될 수 있는 면역질환은 자가면역질환, 조직이식거부반응, 당뇨병, 천식, 아토피, 급성 간질환 등을 예시할 수 있다. 퇴행성 질환으로는 신경세포의 사멸이 일어나는 신경질환을 예시할 수 있으며, 이러한 신경질환으로는 파킨슨병, 알츠하이머병, 루게릭병 등을 예시할 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 골풀 추출물은 염증질환 및 면역질환에 중요한 역할을 담당하는 전사인자인 NF-kappaB의 활성을 억제할 뿐만 아니라, 대식세포를 염증 유도 물질인 LPS로 자극하는 단핵 식세포 모델에서 염증 전구 사이토카인인 TNF-알파 및 NO, COX-2의 발현을 강력하게 억제함이 확인되었으며, 급성독성실험에서 특이할만한 독성 변화가 관찰되지 않는 안전한 물질로 판단됨으로써, 골풀 추출물은 NF-kappaB 또는 TNF-알파에 의하여 매개 되는 각종 염증질환, 천식이나 아토피와 같은 면역질환, 또는 당뇨병, 비만, 치매, 에이즈나 암 등의 치료 또는 예방제로 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석돼서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예 1> 시료의 추출 및 동정

시중 한약재상에서 구입한 국내산 골풀 1kg을 음지에서 건조하여 분쇄한 다음 Soxhlet 추출장치를 써서 3L의 95% 에탄올로 3회 반복 추출하였다. 여과한 여액을 모두 합하여 감압 농축시켜서 약 200g의 조추출물을 얻었다. 이 조추출물 약 100g을 가지고 다시 정제수 1000ml에 고르게 분산시킨 다음 약 3배량의 디에틸에테 르를 가하여 지방을 제거하였다. 얻어진 추출물 약 25g을 취하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 행하여 클로로포름-메탄올-에틸아세테이트로 점차적으로 용출시킨 다음 얻어진 분획물을 농축시킨 다음 Sephadex LH-20 컬럼에 적용하여 메탄올-물을 전개액으로 용출시켜서 칸토사이드(canthoside) B를 분리하였으며, 이를 NMR 및 질량 분석을 통해서 확인하였다.

¹H NMR (CD₃OD, d, J/Hz): 6.51 (1H, s, H-2), 6.51 (1H, s, H-6), 3.84 (3-OMe), 3.84 (5-OMe), Apiose [5.1 (1H, d, J = 2.5, H-1), 4.02 (1H, d, J = 2.5, H-4), 3.88 (1H, d, J = 1.5, H-2), 3.70 (1H, d, J = 9.5, H-4), 3.50 (2H, s, H-5)], Glucose [4.90 (1H, d, J = 7.8, H-1), 3.69 (1H, dd, J = 9.0, 7.8, H-2), 3.54 (1H, dd, J = 9.3, 8.0, H-3), 3.45 (1H, dd, J = 8.8, 8.6, H-4), 3.56 (1H, m, H-5), 3.71 (1H, dd, J = 10.3, 2.0, H-6)].

¹³C NMR (DMSO, d): 152.5 (C-1), 97.3 (C-2), 149.8 (C-3), 132.6 (C-4), 149.8 (C-5), 79.1 (C-6), 56.9 (3-OMe), 56.9 (5-OMe), Apiose [110.8 (C-1￠), 77.9 (C-2￠), 80.9 (C-3￠), 74.9 (C-4￠), 65.8 (C-5￠)], Glucose [103.8 (C-1￠), 75.1 (C-2￠), 70.9 (C-3￠), 71.9 (C-4￠), 77.1 (C-5￠), 68.9 (C-6￠)].

FAB-MS, m/z: 464 (M) (100), 318 (60), 138 (50).

<실험예 1> NF-κB 활성 억제 효과 평가

상기 실시예 1에서 얻은 칸토사이드 B가 LPS로 자극된 세포에서 NF-κB의 활 성을 억제하는 정도를 조사하기 위하여 다음과 같이 실험하였다.

마우스 대식세포주 264.7을 10% FCS와 항생제를 함유한 DMEM(Dubelco's modified Eagle's medium) 배지를 이용하여 96-웰 플레이트에서 37℃에서 24시간 배양하였다. 세포를 5×10⁵농도로 96-웰 플래이트에 분주하고 24시간 후 세포가 플레이트 바닥에 잘 부착되었는지 확인하였다. 이후 본 발명의 칸토사이드 1ug/ml 혹은 10ug/ml의 농도로 처리하고 LPS (5ug/ml)와 IFN-감마 (3ng/ml)을 처리하여 자극을 유발시켰다. 12시간을 추가로 배양한 후 라이시스 버퍼 (lysis buffer)를 이용하여 배양액을 처리한 후 배양액 내의 NF-κB의 활성을 효소면역에세이법(Enzyme immunoassay)을 이용하여 492nm에서 흡광도를 측정함으로써 구하였다(Mukhopadhyay et al. J Immunol , 2002;168:2914). 억제율은 시험물질이 첨가되었을 때의 상대적인 농도 (A), 시료가 첨가되지 않았을 때의 상대적인 농도 (A0)로부터 식 [억제율 %= 100 - (A/A0 × 100)]에 의하여 구하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

시료	상대적인 NF-κB의 활성	NF-κB 억제율(%)
대조군	1.0	-
LPS 처리군	5.2	0
Canthoside B(1ug/ml)	2.4	54
Canthoside B(10ug/ml)	1.9	64

상기 표 1에 나타난 바와 같이 본 발명의 칸토사이드 B의 저해 활성은 1, 10ug/ml 에서 각각 54%, 64%로서 비교적 높은 활성을 보여주었다.

<실험예 2> 염증 전구 사이토카인(pro-inflammatory cytokines) TNF-알파의 생성 저해 효과

칸토사이드 B가 염증 전구 사이토카인인 TNF-알파의 생성에 어느 정도 영향을 주는지를 조사하기 위하여 시험관 내에서 쥐과의 대식세포 세포주(Murine macrophage cell line)인 RAW264.7 세포를 이용하였다. 또한, 내독소로 알려진 LPS가 대식세포에서 TNF-알파를 증가시키는 것으로 알려져 있으므로 1 ug/ml의 LPS를 사용하여 RAW264.7 세포로부터 이러한 사이토카인의 생성을 유도하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, RAW264.7 세포를 DMEM 배지를 이용하여 1×10⁶ 세포/ml로 조절한 후 24-웰 플레이트에 접종하고, 5% CO₂ 항온기에서 18시간 전-배양하였다. 이후 배지를 제거하고 10배 농도(1 mg/ml)로 조제된 시험물질로써 상기 칸토사이드 B(1, 5, 10ug/ml)와 450ul의 LPS 최종농도(1 ug/ml)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하여 전-배양과 동일 조건에서 배양하였다. 6시간 후 배양 배지를 원심분리(12,000 rpm, 3분)하여 얻어진 상층액의 TNF-알파 생성량을 측정하였다[An, S. J. et al., Int . Immunopharmacol ., 2002, 2:1173-1181]. TNF-알파 정량은 ELISA 키트(R&D system Inc, USA)를 이용하여 정량하였으며, 그 결과, 칸토사이드 B 단독 처리 시에는 사이토킨의 생성에는 영향을 주지 않았으며, 세포독성도 나타내지 않았다. 그러나, LPS 자극과 함께 각각 다른 농도의 칸토사이드를 처리한 결과 TNF-알파 생성에 있어서 LPS 1ug/ml 단독처리에 비해 농도 의존적인 생성 억제 효과를 보였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

시료	TNF-알파 생성량 (pg/ml)
대조군	6.8
LPS 처리군	360
Canthoside B(1ug/ml)	280
Canthoside B(5ug/ml)	210
Canthoside B(10ug/ml)	138

<실험예 3> COX-2 단백질 발현의 억제 정도

칸토사이드 B에 의한 염증매개인자 COX-2 단백질 발현에 대한 억제정도를 하기와 같이 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 통하여 알아보았다. 먼저, RAW264.7 세포(1×10⁶ cells/ml)를 DMEM 배지를 이용하여 5% CO₂ 항온기에서 18시간 전-배양하였다. 이후 배지를 제거하고 1ug/ml의 칸토사이드와 LPS (1ug/ml)와 INF-알파 (50 U/ml)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하여 전-배양과 동일 조건에서 배양하였다. 세포를 2-3회 PBS(phosphate buffered saline)로 세척 후 1 ml의 용혈 완충용액(lysis buffer)을 첨가, 30분-1시간 동안 용혈(lysis)시킨 후 12,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 세포막 성분 등을 제거하였다. 단백질 농도는 BSA(bovine serum albumin)를 표준화하여 바이오-레드 단백질 분석 킷트(Bio-Rad Protein Assay Kit)를 사용하여 브래드포드(Bradford) 방법으로 정량하였다. 20-30 ug의 라이세이트(lysate)를 8% 미니겔(mini gel) SDS-PAGE(Poly Acrylamide Gel Electrophoresis)로 변성 분리하여, 이를 PVDF 막(membrane)(BIO-RAD)에 200 mA로 2시간 동안 이식(transfer)하였다. 그리고 막의 차단(blocking)은 5 % 스킴 밀크(skim milk)가 함유된 TTBS(TBS + 0.1 % Tween 20) 용액에서 하룻밤 동안 두어 실시하였다. COX-2의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 항-래빗(anti-rabbit) COX-2(1:1000)(Santa-Cruz)를 TTBS 용액에서 희석하여 상온에서 2시간 반응시킨 후 TTBS로 3회 세정하여 사용하였다. 2차 항체로는 HRP(Horse Radish Peroxidase)가 결합된 항-래빗(anti-rabbit) IgG(Amersham Co.)를 1 : 5000으로 희석하여 상온에서 40분간 반응시킨 후, TTBS로 3회 세정하여 ECL 기질(Amersham Co.)과 1분간 반응 후 X-레이 필름에 감광하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타나는 바와 같이, COX-2 단백질 수준에서도 칸토사이드 B 처리군이 LPS 처리군에 비해 강한 억제 효과를 나타내었다.

<실험예 4> 산화질소의 생성에 미치는 영향

최근 염증 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 산화질소(NO) 생성에 대한 효과를 알아보기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, RAW264.7 세포를 DMEM 배지를 이용하여 1.5×10⁵ 세포/ml로 조절한 후 24-웰 플레이트에 접종하고, 시험물질 즉, 본 발명의 칸토사이드 B 1 ug/ml와 LPS(1 ug/ml)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 생성된 NO의 양은 그리즈(Griess) 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO2-의 형태로 측정하였다. 세포배양 상등액 100 ul와 그리즈 시약 [2.5 % (v/v) 인산 중 1 % (w/v) 설파닐아마이드(sulfanilamide), 0.1 % (w/v) 나프일에틸렌디아민(naphylethylenediamine)] 100 ul를 혼합하여 96-웰 플레이트에서 10분 동안 반응시킨 후 ELISA 리더(reader)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다 (Green L.C. et al., Anal. Biochem., 1982, 126:131-138). 표준농도 곡선은 아초산 나트리움(sodium nitrite; NaNO2)을 연속희석(serial dilution)하여 얻었다.

그 결과, 무처리 대조군의 결과는 4.1 uM인 반면, LPS 단독 처리군의 결과는 61.8 μM로 NO가 과량 생성되었으며, 칸토사이드 B 1 ug/ml 처리군에서 무처리 대조군과 비슷한 생성농도인 8.7 μM로 생성량이 감소함을 확인할 수 있었다.

<실험예 5> 마우스 급성독성시험

본 발명의 칸토사이드 B를 임상적으로 사용하기 위하여 아래와 같이 독성을 평가하였다.

ICR계 마우스를 20마리 구입하여 5마리씩 4개의 군으로 나누어 본 발명의 칸토사이드 B를 각각 10, 25, 50, 100, 200, 500mg/kg의 용량으로 경구 투여한 다음 2주간 독성 여부를 관찰한 결과 모든 군에서 사망례가 관찰되지 않았다. 또한 임상증상, 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 하였으며, 부검하여 육안으로 내부 장기의 이상 여부를 관찰하였을 때에도 본 발명의 칸토사이드 B는 모든 검사에서 특이할만한 독성 변화는 관찰되지 않았다.

<실험예 6> 칸토사이드들의 TNF-알파 생성 저해 효과 비교

실시예 1과 유사한 방법으로 칸토사이드 A, C 및 D를 얻었으며, 이를 이용하여 실험예 2와 동일한 방법으로 TNF-알파 생성 저해 정도를 평가하였다. 시험 물질의 농도는 모두 10ug/ml이었다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

시료	TNF-α 생성량 (pg/ml)
대조군	10.7
LPS 처리군	420
Canthoside A	330
Canthoside B	158
Canthoside C	287
Canthoside D	305

상기 표 3에 나타나는 바와 같이, 칸토사이드 A, C 및 D는 칸토사이드 B와 마찬가지로 TNF-알파 생성 저해 효과를 나타내었다. 다만, 칸토사이드 B가 다른 칸토사이드들보다 그 효과가 뛰어났다.

도 1은 본 발명에 따른 칸토사이드 B가 COX-2 단백질 발현을 억제하는 정도를 평가한 결과이다.

Claims

골풀(Juncus effusus) 추출물을 유효 성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 염증질환 또는 면역질환의 치료 또는 예방용 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 칸토사이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 염증질환 또는 면역질환의 치료 또는 예방용 조성물:

<화학식 1>

상기 화학식 1에서, R1 내지 R5는 서로 독립적으로 H, OMe, COOMe 및 OH 중 어느 하나임.
제2항에 있어서, 상기 R1, R2, R3, R4 및 R5는 COOMe, H, H, H 및 H이거나, H, OMe, OH, OMe 및 H이거나, H, OMe, OH, H 및 H이거나, OMe, H, OH, H 및 H인 것을 특징으로 하는 조성물.
제3항에 있어서, 상기 R1, R2, R3, R4 및 R5는 H, OMe, OH, OMe 및 H인 것을 특징으로 하는 조성물.