KR20090127980A - 척수 손상 동물에서 줄기세포를 경피적으로 경막 내공간으로 이식하는 비침습적 투여 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 제대혈 유래 줄기세포를 포함하는 척수마비 치료 및 개선을 위한 세포 치료제 조성물, 그리고 척수 손상 동물에서 척수(spinal cord)로 줄기세포를 직접 투여하는 비침습적인 이식 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법에 의하면 침습적인 수술 방법이 필요하지 않으므로 감염의 위험이 적으며 정확하고 간편하게 15분 이내에 시술할 수 있으며, 사람에 적용할 경우 국소 마취만으로도 시술이 가능하고, 척수 손상 후에 줄기세포 치료제 및 신약 등을 임상적으로 투여하는 방법으로 사용할 수 있으며, 연구 분야에 있어서는 척수 손상 모델에서 줄기세포 투여 후 척수의 재생과 관련한 연구 및 척수 손상 치료를 위한 병리생리학적인 연구에 사용될 수 있다.
척수 손상, 투시기, 척추 바늘, 줄기세포 치료.

Description

척수 손상 동물에서 줄기세포를 경피적으로 경막 내 공간으로 이식하는 비침습적 투여 방법{PERCUTANEOUS INTRATHECAL TRANSPLANTATION OF STEM　CELLS ON SPINAL CORD INJURED ANIMALS}
본 발명은 제대혈 유래 줄기세포를 포함하는 척수마비 치료 및 개선을 위한 세포 치료제 조성물, 그리고 척수 손상 동물에서 척수(spinal cord)로 줄기세포를 직접 투여하는 비침습적인 이식 방법에 관한 것이다.
척수 손상(spinal cord injury)은 척수에 손상이 발생하여 손상된 영역 이하에서 감각신호와 운동신호의 전달이 영향을 받게 되어, 운동 장애 및 감각 장애를 초래하는 질환을 일컫는다. 근래 의학의 발전에 따라, 척수마비를 개선 또는 치료할 수 있는 방법들이 다양하게 모색되고 있으며, 줄기세포(stem cell) 치료요법은 그 방법 중 하나로 관심이 점차 높아지고 있다.
척수 손상에서 줄기세포를 치료 목적으로 이식하는 방법은, 투여하는 방식에 따라 국소 투여(local administration)와 전신 투여(systemic administration)로 구분할 수 있다(Jesus Vaquero et al., Cell therapy using bone marrow stromal cells in chronic paraplegic rats: systemic or local administration? 2006, Neuroscience Letter 398: 129~134쪽). 전신 투여는 정맥 내로 세포를 투여하는 것이고(Takeuchi et al., Intravenously transplanted human neural stem cells migrate to the injured spinal cord in adult mice in an SDF-1- and HGF-dependent manner.2007, Neuroscience Letter 426:69~74쪽), 국소 투여는 병변 부위 척수에 직접 투여 하거나(KS Kang et al., 2005,A 37-year-old spinal cord injured female patient transplanted of multipotent stem cells from human UC blood, with improved sensory perception and mobility, both functionally and morphologically: a case study Cytotherapy 7(4): 368-373쪽), 뇌척수액이 있는 거미막 밑공간(subarachnoid space) 또는 경막내 공간(intrathecal space)으로 투여(Sufan Wu et al., 2002, New method for transplantation of neurosphere cell into injured spinal cord through cerebrospinal fluid in rat. Neuroscience Letters 318: 81~84쪽; Ajay Bakshi et al., Lumbar puncture delivery of bone marrow stromal cells in spinal cord contusion: a novel method for minimally invasive cell transplantation, 2006, J Neurotrauma 23: 55~65쪽)하는 것이다. 척수 손상을 유발한 쥐에서 동일한 양의 줄기세포를 전신 투여(정맥투여, intravenous)와 국소 투여(척수강내 투여, intralesional)하여 효과를 비교한 결과, 국소 투여한 동물이 전신 투여한 동물에 비해서 월등히 높은 후지 마비의 회복을 보였다(Vaquero et al., 2006). 즉, 동일한 양의 줄기세포를 투여할 경우 국소적인 투여가 더 높은 효과를 준다는 것을 보여주고 있다.
정맥투여 방법은 그 시술이 간편하지만, 척수 손상의 직접적인 치료와 관련 이 적은 폐, 간, 비장 등의 장기에도 세포들이 정착하여 실제 병변 부위로 도달하는 세포가 줄어들게 되고(Takeuchi et al., 2007), 이에 따라서 많은 양의 세포를 주입하여야 한다.
국소적으로 세포를 투여 이식하는 방법은, 손상된 척수강(spinal canal)을 다시 수술적인 방법으로 재노출 시켜서 손상된 척수 내로 투여하거나(Kang et al., 2005), 손상된 척수 주위에 직접 투여하는 방법(Vaquero et al., 2006)과, 뇌척수액에 세포를 투여하는 방법(Wu et al., 2002)이 대표적으로 사용되었다.
수술적인 방법으로 척수강을 재노출 시켜 직접 세포를 투여하는 경우, 척추 추궁 절제술(척추의 일부분을 제거하는 수술)을 실시하여 손상된 척수를 노출시킬 수 있다. 또한 일정한 간격을 두고 세포 치료를 할 경우, 척추 추궁 절제술을 실시한 부위를 재수술하여 다시 척수를 노출시켜 투여한다. 이는 감염의 위험성과 함께, 척수 주변 조직이 수술로 인해 염증 반응을 유발하게 되므로, 연구나 임상적인 치료에 원하지 않은 부작용을 유발할 수 있다.
한편, 척수 거미막 공간(subarachnoid space)의 뇌척수액을 매개로 하여 뇌척수액으로 투여한 세포가 손상된 척수로 이동하여 치료효과가 있음이 보고된 바 있다(Wu et al., 2002). 그러나, 이 보고에서는 뇌척수액이 있는 척수 거미막 공간(subarachnoid space)에 투여하기 위해서 두개골에 지름 1 ㎜ 크기의 구멍을 뚫는 수술적인 방법을 사용하였다.
위와 같이, 세포를 투여하기 위하여 손상 부위를 수술하여 척수를 직접 보면서 투여하거나, 두개골의 구멍을 뚫는 수술은 전신 마취나 오랜 시술 시간이 필요 하다. 또한, 척수 손상이 외상으로 인하여 발생하는 경우가 많은 것을 고려하면 다른 장기의 손상을 배제할 수 없으므로, 줄기세포의 이식을 위한 수술 횟수의 증가나 심도가 깊고 오랜 시간의 마취는 바람직하지 못하며, 수술에 대한 환자의 경제적인 부담도 증가시킨다.
근래, Bakshi 등(Bakshi et al., 2006)이 비침습적인 방법으로 줄기세포를 국소 투여한 것이 보고되었다. 이 연구에서는 요추 천자(lumbar puncture)의 방법을 도입함으로써 수술적인 방법을 배제하였다. Bakshi 등의 연구에서 요추 천자 방법은 척수 바늘이 경막 내 공간(intrathecal space)으로 투여되므로 수술적인 노출이 없어 감염의 위험성이 적고, 일정한 기간을 두고 치료의 효과를 높일 수 있도록 여러 차례 반복 투여가 가능하다.
한편, 요추 천자 방법에서는 척수 바늘이 정확한 위치에 있다는 것을 확인하기 위해서, 다음과 같은 3가지 증상을 사용한다: (1) 척수 바늘이 들어갈 때의 느낌, (2) 꼬리가 튀는 현상(a tail flick), (3) 뇌척수액(CSF)이 척수 바늘의 hub에 보이는 것. 그러나, 이러한 방법은 전임상 및/또는 임상적으로 사용하기에는 부족한 점이 있다. 첫 번째 증상인 척수 바늘이 척수강 내로 들어가는 느낌은 주관적인 성격이 강하여 개인적인 차이가 크며 정확히 바늘이 경막 내 공간이 있는지 객관적인 확인이 어렵다. 두 번째 꼬리가 튀는 현상은 사람에게 적용할 수 없으며, 세 번째 증상은, 흉추의 여러 부위에서 척수의 손상으로 흉추 내의 척수가 심하게 종창되어 있을 경우나 여러 부위의 척수 손상이 있을 경우에는 뇌척수액이 천자한 척수 바늘 끝에 맺히지 않을 수 있다.
또한, 이 요추 천자 방법은 맹목방법(blind method)으로 실시하기 때문에, 척수강 내에 척수 바늘이 들어가서 척수강 바닥의 혈관이 손상되거나 바늘이 척추를 지나 복강 내로 들어갈 수 있으며, 시술 동안 발생할 수 있는 바늘의 위치 변화를 알 수 없다는 문제점이 있다.
본 발명의 목적은 척수 손상에서 줄기세포를 척수 경막 내로 국소 투여함으로써 그 효과를 최대화 시키고, 수술적인 방법 없이 투시기를 통하여 시술의 정확성과 용이성을 증가시킨 비침습적인 줄기세포 이식 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 척수마비 치료 및 개선을 위한 세포 치료제 조성물을 제공하고자 하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는, CD34 음성, CD90 음성, CD45 양성, CD44 양성, CD31 양성, CD13 양성 및 CD166 양성의 제대혈 유래 줄기세포를 포함하는 척수마비 치료 및 개선을 위한 세포 치료제 조성물을 제공한다.
본 발명의 세포 치료제 조성물은 면역 억제제 없이 단독으로 투여될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 척수마비 치료 및 개선을 위한 세포 치료제 조성물의 제조방법은,
출산 24 시간 이내의 순수 제대혈로, 1 유닛(unit) 당 부피가 45 ㎖ 이상인 제대혈에 항응고제를 가하고;
항응고제가 혼합된 제대혈을 저-포도당 DMEM(low-glucose Dulbecco's Modified Eagle Media) 배지로 희석하고 원심분리하여 단핵구를 수확하고; 그리고,
얻어진 단핵구를 Stem Cell Factor, GM-CSF(granulocyte-macrophage colony- stimulating factor), G-CSF(granulocyte colony-stimulating factor), IL-3(interleukin-3) 및 IL-6(interleukin-6)이 포함된 저-포도당 DMEM 배지에 부유 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 척수마비 치료 및 개선을 위한 세포 치료제 조성물의 다른 제조방법은,
냉동 보관된 제대혈을 해동하여 저-포도당 DMEM(low-glucose Dulbecco's Modified Eagle Media) 배지로 희석하고 원심분리하여 단핵구를 수확하고; 그리고,
얻어진 단핵구를 Stem Cell Factor, GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), G-CSF(granulocyte colony-stimulating factor), IL-3(interleukin-3) 및 IL-6(interleukin-6)이 포함된 저-포도당 DMEM 배지에 부유 배양하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 척수마비 치료 및 개선을 위한 세포 치료제의 이식방법은, 투시기(fluoroscopy) 하에서 등쪽 척추 사이 공간으로 척수 바늘(spinal needle)을 삽입하여 척수강(spinal canal) 내로 삽입하고 세포 치료제를 투여하는 단계를 포함한다.
상기 척수마비 치료 및 개선을 위한 세포 치료제의 이식방법은 구체적으로,
투시기(fluoroscopy) 하에서 등쪽 척추 사이 공간으로 척수 바늘(spinal needle)을 삽입하여 척수강(spinal canal) 내로 삽입하고;
삽입된 척수 바늘에 양성 혈관 조영제가 들어 있는 주사기를 장착하고, 투시기 하에서 양성 조영제를 투여하여 삽입한 바늘의 위치를 확인하고;
세포 치료제가 들어 있는 주사기로 교체하여 세포 치료제를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 이식방법은, 척수의 여러 부위에 실시할 수 있으며, 세포와 약물을 병용 투여하는 것도 가능하고, 세포와 약물을 일정 시간 간격으로 반복 투여하는 것 역시 가능하다.
본 발명에 따른 이식방법에서는, 주사기를 교체하거나, 동물의 조작 등에 의해서 생길 수 있는 바늘 끝의 위치 변화는 각 단계마다 투시기를 통하여 확인하고, 변위가 있을 경우 재위치 시킨 후 투여를 실시한다.
본 발명의 이식방법은 경막외 마취법을 응용한 것으로, 모든 척추동물에서 사용이 가능하나. 생쥐나 흰쥐 같은 작은 동물보다는 개나 돼지 이상의 크기를 가진 동물과 사람에서 더욱 유효하게 사용될 수 있다. 이는 척수가 해부학적으로 너무 작은 생쥐나 흰쥐의 경우에서는 투시기를 통하여, 조영제가 투여된 부분을 정확하게 구분하기 어려울 수 있기 때문이다.
본 발명은 경추, 흉추, 요추의 모든 부위에서의 적용이 가능하며, 실제 수술적인 방법을 실시하여 세포를 투여하는 것에 의하여 생길 수 있는 감염이나 수술 후 근육에 대한 염증 등 연구에 미칠 수 있는 잠재적인 요인을 최소화시킬 수 있다.
즉, 본 발명의 방법에 따르면, 척수 손상 동물에 복잡한 수술 적용 없이 쉽게 세포이식을 실시할 수 있으며, 시술 시간은 약 15분 정도로 짧다. 본 발명의 실시예에서는 적용예로서 개를 사용하고 있지만, 사람의 경우는 전신 마취 없이 투여 하고자 하는 부위의 국소 마취만으로도 시술이 가능하기 때문에 경제적인 부담과 전신 마취로 발생할 수 있는 부작용의 위험이 감소된다. 또한, 손상 부위에 따라서 여러 부위로 나누어 투여 가능하며, 일정 기간을 두고 중복 시술 및 반복 투여가 가능하다.
종래에 개발된 요추 천자 이식 방법과 비교하여, 본 발명의 방법에 의하면 척수강으로 세포를 정확하게 이식할 수 있으며, 시술 동안 척수강 내의 혈관 손상 위험과 복강으로 척수 바늘이 천자되는 것을 최소화할 수 있다. 또한, 동물의 조작이나, 척수 바늘의 조작(예를 들어, 세포 이식할 주사기나 기구의 장착 등) 중에 생기는 척수 바늘 이동을 투시기로 확인하는 것에 의하여, 맹목으로 투여하는 요추 천자 투여법의 단점을 보완하고 있다.
본 발명의 이식방법에 의하면, 척수 손상 동물에 수술적인 처치가 필요하지 않으므로 시술 시간이 짧고(약 15분), 비침습적 방법으로 시술 후 감염의 위험이 적으며, 치료를 위한 세포의 반복 투여가 가능하다. 사람에게 적용할 경우, 전신 마취를 하지 않고 국소 마취만으로도 시술 가능하므로 경제적 부담과 전신마취에 대한 잠재적인 부작용의 위험을 최소화할 수 있다. 또한, 투시기를 통하여 척수 바늘의 이동을 확인하고 조정할 수 있으므로 정확한 부위에 투여할 수 있다.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 제한되는 것은 아니다.
실시예 1-1: 제대혈로부터 줄기세포의 분리 및 배양
제대혈로부터 세포를 분리하기 위해, 저-포도당 DMEM(low-glucose Dulbecco's Modified Eagle Media) 배지를 사용하여 제대혈을 2 배 용량으로 희석한 후, 50 ㎖ 팔콘 튜브(falcon tube)에 옮겨 실온에서 10 분간 300xg로 원심분리하였다. 분리된 buffy coat 층을 수확하여 다시 2 배 용량의 저-포도당 DMEM 배지로 희석한 후, Ficoll-Hypaque에 중첩하고 실온에서 30 분간 300xg로 원심분리를 시행하였다.
혈액으로부터 단핵구를 분리하는 데는 Ficoll(슈크로스의 중합체)과 Hypaque (디트리조에이트 나트륨; sodium ditrizoate)의 중합체인 Ficoll-Hypaque가 주로 이용된다. Ficoll-Hypaque의 비중은 1.077 g/㎖로, 단핵구는 이보다 가벼우나 적혈구는 이보다 무겁기 때문에 비중차에 의한 분리가 가능하다. 즉, 혈액을 Ficoll-Hypaque 위에 올려서 원심분리하면 단핵구는 Ficoll-Hypaque 위에 모이게 된다.
이와 같은 밀도구배 원심분리 방법으로 얻어진 단핵구를 다시 첨가물이 섞이지 않은 세척용 저-포도당 DMEM 배지에 넣어 10 분간 200xg로 원심분리한 후, 팔콘 튜브 바닥에 가라앉은 세포를 제외하고 저-포도당 DMEM 배지를 버려 세척하였다. 한번 더 저-포도당 DMEM을 넣어 10 분간 200xg로 원심분리한 후 팔콘 튜브 바닥에 가라앉은 세포를 제외하고 저-포도당 DMEM을 버려 1 회 더 세척하였다.
다음에, 항생제(1000 U/㎖ 페니실린 G, 1000 ㎍/㎖ 황산 스트렙토마이신, Gibco-BRL)와 항진균제(0.25 ㎍/㎖ 암포테리신 B), 그리고 2 mM의 글루타민 (Glutamine, Sigma)이 포함된 αMEM 배지에 20% 우태혈청(FBS; fetal bovine serum, JRH, USA)과 함께 세포성장인자로서 Stem Cell Factor(50 ng/㎖), GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor; 10 ng/㎖), G-CSF(granulocyte colony-stimulating factor; 10 ng/㎖), IL-3(interleukin-3; 10 ng/㎖) 및 IL-6(interleukin-6; 10 ng/㎖)을 첨가하고, 세포수 1×106/㎠의 농도로 부유시켜 배양하였다.
5 일간 배양한 세포 군집에서 부유세포를 제거하고 부착세포가 확보된 후, 20% 우태혈청 및 항생제가 포함된 저-포도당 DMEM을 배양액으로 하여 2 일 간격으로 세척과정 없이 완전 교환하여 7 일간 배양함으로써, CD34 음성, CD90 음성, CD45 양성, CD44 양성, CD31 양성, CD13 양성 및 CD166 양성의 제대혈 유래 줄기세포를 포함하는 조성물을 제조하였다.
실시예 1-2: 냉동보관된 제대혈로부터 줄기세포의 분리 및 배양
냉동보관된 제대혈을 해동하여 저-포도당 DMEM 배지로 제대혈을 2 배 용량으로 희석한 후 50 ㎖ 팔콘 튜브(falcon tube)에 옮겨 실온에서 10 분간 300xg로 원심분리하였다. 분리된 buffy coat 층을 수확하여 다시 2 배 용량의 저-포도당 DMEM 배지로 희석한 후 Ficoll-Hypaque에 중첩하고 실온에서 30 분간 300xg로 원심분리를 시행하였다.
혈액으로부터 단핵구를 분리하는 데는 Ficoll(슈크로스의 중합체)과 Hypaque (디트리조에이트 나트륨; sodium ditrizoate)의 중합체인 Ficoll-Hypaque가 주로 이용된다. Ficoll-Hypaque의 비중은 1.077 g/㎖로, 단핵구는 이보다 가벼우나 적혈 구는 이보다 무겁기 때문에 비중차에 의한 분리가 가능하다. 즉, 혈액을 Ficoll-Hypaque 위에 올려서 원심분리하면 단핵구는 Ficoll-Hypaque 위에 모이게 된다.
이와 같은 밀도구배 원심분리 방법으로 얻어진 단핵구를 다시 첨가물이 섞이지 않은 세척용 저-포도당 DMEM 배지에 넣어 10 분간 200xg로 원심분리한 후, 팔콘 튜브 바닥에 가라앉은 세포를 제외하고 저-포도당 DMEM 배지를 버려 세척하였다. 한번 더 저-포도당 DMEM을 넣어 10 분간 200xg로 원심분리한 후 팔콘 튜브 바닥에 가라앉은 세포를 제외하고 저-포도당 DMEM을 버려 1 회 더 세척하였다.
다음에, 항생제(1000 U/㎖ 페니실린 G, 1000 ㎍/㎖ 황산 스트렙토마이신, Gibco-BRL)와 항진균제(0.25 ㎍/㎖ 암포테리신 B), 그리고 2 mM의 글루타민 (Glutamine, Sigma)이 포함된 αMEM 배지에 20% 우태혈청(FBS; fetal bovine serum, JRH, USA)과 함께 세포성장인자로서 Stem Cell Factor(50 ng/㎖), GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor; 10 ng/㎖), G-CSF(granulocyte colony-stimulating factor; 10 ng/㎖), IL-3(interleukin-3; 10 ng/㎖) 및 IL-6(interleukin-6; 10 ng/㎖)을 첨가하고, 세포수 1×106/㎠의 농도로 부유시켜 배양하였다.
5 일간 배양한 세포 군집에서 부유세포를 제거하고 부착세포가 확보된 후, 20% 우태혈청 및 항생제가 포함된 저-포도당 DMEM을 배양액으로 하여 2 일 간격으로 세척과정 없이 완전 교환하여 7 일간 배양함으로써, CD34 음성, CD90 음성, CD45 양성, CD44 양성, CD31 양성, CD13 양성 및 CD166 양성의 제대혈 유래 줄기세 포를 포함하는 조성물을 제조하였다.
도 1은 본 발명의 세포 치료제 조성물인 CD34 음성, CD90 음성, CD45 양성, CD44 양성, CD31 양성, CD13 양성, CD166 양성인 제대혈 줄기세포의 특성을 나타낸 그래프이고, 도 2a 및 2b는 본 발명의 세포 치료제 조성물의 현미경 사진이다.
실시예 2: 척추 손상 동물에서 비침습적으로 줄기세포를 경피적으로 경막 내 공간으로 이식하는 투여 방법
15 마리의 개(비글견, 몸무게 7.2∼11.2 ㎏)에서, 요추 2번과 3번 사이의 척수를 손상시켜 후지의 완전 마비를 일으키고, 척수 손상 7일 후에 9 마리의 개에서 제대혈 줄기세포 이식을 실시하였다. 제대혈 줄기세포의 이식은 1×106의 세포수로 5마리에 투여하고 나머지 4마리에서는 2×106 세포수로 이식하였다. 이식하는 세부 절차는 다음과 같다.
전신 호흡 마취 후, 횡와 자세(lateral recumbency)로 눕힌 다음 척추의 등쪽 사이 공간을 크게 하기 위하여, 구부린 자세를 취하게 하였다.
투시기(Mobile C-ARM system, MCA-6100, MedisonXray Co., Ltd., Korea)의 유도 하에 요추의 등쪽 사이 공간을 통해서 척수강 내로 척수 바늘(spinal needle)(26G×3½" SPINAL NEEDLE, Hakko Co., Ltd, Japan)을 삽입하였다. 바늘의 끝이 척수 내에 있는 것을 투시기로 확인하고 척수 바늘의 탐침(stylet)을 제거하였다.
척수 바늘에 양성 조영제(positive contrast medium, iohexol, Omnipaque, Amersham Health, Cork, Ireland)를 채운 1 cc 주사기를 장착하였다. 도 3은 척수 바늘에 주사기를 장착시킨 것을 보여주는 사진이다.
장착 후 바늘의 이동 여부를 투시기를 통해서 확인하여, 이동이 있을 경우 재위치 시키고, 바늘의 끝이 경막 아래의 척수강 내에 있는 것을 정확하게 하기 위해 양성 조영제 0.1∼0.2 ㎖를 천천히 투여하여 척수 조영을 실시하여 확인하였다. 도 4는 투시기 유도 하에 척수 바늘의 끝이 척수 경막 내 공간에 위치하고 있음을 확인한 영상이다.
다음에, 치료 목적으로 사용할 세포 치료제가 들어 있는 주사기로 교체하여, 세포를 투여하였다. 세포는 소량 천천히 투여하여, 투여 조작 등에 의해서 생길 수 있는 바늘 끝의 위치 변화는 투시기를 통해 확인하고, 변위가 있을 경우 재위치 시킨 후에 투여를 실시하였다. 도 5은 투시기 유도 하에 척수 바늘의 변위를 확인하면서 세포 이식을 실시하는 것을 보여주는 사진이다.
상기 단계에 따라, 제대혈 줄기세포를 척수가 손상된 부위(요추 2번과 3번), 손상된 부위 앞과 뒤(요추 1번과 2번 사이와, 요추 3번과 4번 사이) 3곳으로 나누어 이식하였다.
실시 결과는 다음과 같다.
제대혈 줄기세포를 이식한 개 2마리와 제대혈 줄기세포를 이식하지 않고 척수 손상만 유발한 개 2마리가 세포 이식과 관련이 없는 증상(방광염, 욕창, 욕창으로 인한 패혈증)으로 줄기세포 이식 1주 내지 4주 사이에 폐사하였다.
제대혈 줄기세포를 이식하지 않은 대조군으로 척수 손상만을 유발한 개에서 는, 후지의 임상 증상이 개선되지 않고 완전한 하반신 마비 증상이 유지되었다. 반면, 제대혈 줄기세포를 이식한 개에서 생존한 7마리 중 5마리는 이식 후 20주까지 개별적인 차이를 보이면서 후지 보행이 개선되어, 기립하여 자발적인 보행이 가능한 상태까지 회복되었다.
도 6은 줄기세포 이식 후에 보행의 변화를 BBB score(완전 보행 불능 “0” 점에서 정상 보행 “21” 까지로 나누어진 운동평가 점수)로 나타낸 것이다. 개의 개체 번호 1∼9번까지가 줄기세포를 이식한 예이다.
세포 이식 후 20주에 근전도를 실시하여, 척수 손상만을 유발한 개와, 정상적인 개, 제대혈 줄기세포 이식 후 보행이 회복된 개를 검사하였다. 도 7은 정상적인 개의 근전도로서, 전지 및 후지 모두에서 신경 전도가 일어나는 것을 보여준다. 도 8은 척수 손상 개에서의 근전도로서, 전지의 반응만이 있으며 후지의 반응은 소실된 상태를 보여준다. 도 9는 본 발명에 따라 줄기세포를 이식한 개의 근전도로서, 후지의 반응이 정상적인 개보다 시간적으로 늦게 나타나고 있으나 명확한 형태를 보이는 것을 알 수 있다.
도 1은 본 발명의 세포 치료제 조성물인 CD34 음성, CD90 음성, CD45 양성, CD44 양성, CD31 양성, CD13 양성, CD166 양성인 제대혈 줄기세포의 특성을 나타낸 그래프.
도 2a 및 2b는 본 발명의 세포 치료제 조성물의 현미경 사진.
도 3은 척수 바늘에 주사기를 장착시킨 것을 보여주는 사진.
도 4는 투시기 유도 하에 척수 바늘의 끝이 척수 경막 내 공간에 위치하고 있음을 확인한 영상.
도 5은 투시기 유도 하에 척수 바늘의 변위를 확인하면서 세포 이식을 실시하는 것을 보여주는 사진.
도 6은 줄기세포 이식 후에 보행의 변화를 BBB score(완전 보행 불능 “0” 점에서 정상 보행 “21” 까지로 나누어진 운동평가 점수)로 나타낸 그래프.
도 7은 정상적인 개의 근전도.
도 8은 척수 손상 개에서의 근전도.
도 9는 본 발명에 따라 줄기세포를 이식한 개의 근전도.

Claims (9)

  1. CD34 음성, CD90 음성, CD45 양성, CD44 양성, CD31 양성, CD13 양성 및 CD166 양성의 제대혈 유래 줄기세포를 포함하는, 척수마비 치료 및 개선을 위한 세포 치료제 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 면역 억제제 없이 단독으로 투여하는 것을 특징으로 하는 세포 치료제 조성물.
  3. 출산 24 시간 이내의 순수 제대혈로, 1 유닛(unit) 당 부피가 45 ㎖ 이상인 제대혈에 항응고제를 가하고;
    항응고제가 혼합된 제대혈을 저-포도당 DMEM(low-glucose Dulbecco's Modified Eagle Media) 배지로 희석하고 원심분리하여 단핵구를 수확하고; 그리고,
    얻어진 단핵구를 Stem Cell Factor, GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), G-CSF(granulocyte colony-stimulating factor), IL-3(interleukin-3) 및 IL-6(interleukin-6)이 포함된 저-포도당 DMEM 배지에 부유 배양하는 단계를 포함하는,
    척수마비 치료 및 개선을 위한 세포 치료제 조성물의 제조방법.
  4. 냉동 보관된 제대혈을 해동하여 저-포도당 DMEM(low-glucose Dulbecco's Modified Eagle Media) 배지로 희석하고 원심분리하여 단핵구를 수확하고; 그리고,
    얻어진 단핵구를 Stem Cell Factor, GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), G-CSF(granulocyte colony-stimulating factor), IL-3(interleukin-3) 및 IL-6(interleukin-6)이 포함된 저-포도당 DMEM 배지에 부유 배양하는 단계를 포함하는,
    척수마비 치료 및 개선을 위한 세포 치료제 조성물의 제조방법.
  5. 투시기(fluoroscopy) 하에서 등쪽 척추 사이 공간으로 척수 바늘(spinal needle)을 삽입하여 척수강(spinal canal) 내로 삽입하고 세포 치료제를 투여하는 단계를 포함하는, 척수마비 치료 및 개선을 위한 세포 치료제의 이식방법.
  6. 투시기(fluoroscopy) 하에서 등쪽 척추 사이 공간으로 척수 바늘(spinal needle)을 삽입하여 척수강(spinal canal) 내로 삽입하고;
    삽입된 척수 바늘에 양성 혈관 조영제가 들어 있는 주사기를 장착하고, 투시기 하에서 양성 조영제를 투여하여 삽입한 바늘의 위치를 확인하고;
    세포 치료제가 들어 있는 주사기로 교체하여 세포 치료제를 투여하는 단계를 포함하는,
    척수마비 치료 및 개선을 위한 세포 치료제의 이식방법.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 척수의 여러 부위에 투여하는 것을 특징으 로 하는 방법.
  8. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 세포와 약물을 병용 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 세포와 약물을 일정 시간 간격으로 반복 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
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