KR20090123870A - 섬유모세포 성장 인자 수용체 또는 이의 변이체에 의해 매개되는 신호전달의 조정에 대한 감수성을 나타내는 세포의 확인 방법 - Google Patents

섬유모세포 성장 인자 수용체 또는 이의 변이체에 의해 매개되는 신호전달의 조정에 대한 감수성을 나타내는 세포의 확인 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 FGF-R 기질 2 (FRS-2)의 (특히 타이로신) 인산화를 나타내는 세포가, 이같은 인산화가 없는 세포와 대조적으로, 섬유모세포 성장 인자-수용체 신호전달의 조정인자, 특히 억제제로의 치료가 세포, 예를 들어, 이같은 인산화를 나타내는 환자로부터의 생물학적 샘플로부터의 세포에서 성공적일 것이라는 예측을 허용한다는 발견을 기초로 한다. 따라서, FRS-2의 인산화가 성공적인 치료의 가능성에 대한 바이오마커의 역할을 할 수 있다. 본 발명은 이러한 바이오마커의 적용에서 유용한 다양한 방법, 용도, 키트 및 시약에 관한 것이다.
FGF-R, FRS-2, FRS-2 인산화, 바이오마커

Description

섬유모세포 성장 인자 수용체 또는 이의 변이체에 의해 매개되는 신호전달의 조정에 대한 감수성을 나타내는 세포의 확인 방법{A METHOD OF IDENTIFICATION OF CELLS THAT SHOW SENSITIVITY TO MODULATION OF SIGNALING MEDIATED BY A FIBROBLAST GROWTH FACTOR RECEPTOR OR A VARIANT THEREOF}
본 발명은 FGFR 또는 이의 변이체의 생체내 활성화 또는 억제를 결정하고/하거나 섬유모세포 성장 인자 수용체 (FGF-R) 또는 이의 변이체가 연관되는 신호전달의 조정에 대한 감수성 (예를 들어, 억제 또는 활성화)를 나타내는 세포, 예컨대 종양 세포 (예를 들어, 종양 검사물)를 확인하는 방법, 상기 목적을 위한 생체반응성(bioreactive) 인식제의 용도, 이러한 인식제를 포함하는 키트, 섬유모세포 성장 인자 수용체 (FGF-R) 또는 이의 변이체가 연관되는 신호전달의 조정, 특히 억제에 대한 감수성을 나타내는 세포를 확인하는 것에서 사용하기 위해 이러한 인식제를 검출하기 위한 시약, 및 이같은 키트의 제작을 위한 상기의 용도, 뿐만 아니라 언급된 기타 용도, 방법 및 발명의 실시양태에 관한 것이다.
섬유모세포 성장 인자 (FGF)는 발달적으로 조절되고 광범위한 조직 또는 기관에서 발현되는 20개를 초과하는 구조적으로 관련된 폴리펩티드 부류를 구성한다. FGF는 증식, 세포 이동 및 분화를 자극하고, 골격 및 사지 발달, 상처 치유, 조직 복구, 조혈, 혈관형성 및 종양형성에서 중요한 역할을 한다 ([Ornitz, Novartis Found Svmp 232: 63-76; discussion 76-80, 272-82 (2001)]에 리뷰되어 있음).
FGF의 생물학적 작용은 단백질 키나제의 수용체 타이로신 키나제 (RTK) 부류에 속하는 특이적 세포 표면 수용체에 의해 매개된다. 이러한 단백질들은 세포외 리간드 결합 도메인, 단일 막횡단 도메인, 및 FGF의 결합 시 인산화가 진행되는 세포내 타이로신 키나제 도메인으로 구성된다. 현재까지 4개의 FGF-R가 확인되었다: FGF-R1 (Flg, fms-유사 유전자, fit-2, bFGF-R,N-bFGF-R 또는 Cek1으로 또한 칭해짐), FGF-R2 (Bek-박테리아 발현 키나제, KGFR, Ksam, Ksaml 및 Cek3으로 또한 칭해짐), FGF-R3 (Cek2로 또한 칭해짐) 및 FGF-R4. 모든 성숙형 FGF-R들은 아미노 말단 신호 펩티드, Ig 도메인들 사이에 산성 영역 ("산성 박스" 도메인)이 있는 3개의 세포외 면역글로불린-유사 도메인 (Ig 도메인 I, Ig 도메인 II, Ig 도메인 III), 막횡단 도메인, 및 세포내 키나제 도메인으로 구성되는 공통적인 구조를 공유한다 ([Ullrich and Schlessinger, Cell 61: 203,1990]; [Johnson and Williams (1992) Adv. Cancer Res. 60: 1-41]). 별개의 FGF-R 이소형들은 상이한 FGF 리간드들에 대한 결합 친화력이 상이하고, 따라서 FGF8 (안드로겐-유도 성장 인자) 및 FGF9 (아교세포 활성화 인자)는 FGF-R3에 대한 선택성이 증가된 것으로 여겨진다 ([Chellarah et al. J Biol. Chem 1994 ; 269: 11620]).
최근의 발견은 인간 왜소증의 가장 일반적인 형태인 연골무형성증을 포함하는 증가하는 가짓수의 골격 이상이 FGF-R에서의 돌연변이로부터 초래된다는 것을 나타냈다. FGF-R1, FGF-R2 및 FGF-R3의 여러 도메인에서의 특이적 점 돌연변이가 두개골조기유합증 증후군 및 왜소증 증후군으로 분류된 보통염색체 우성 인간 골격 형성이상과 관련된다 ([Coumoul and Deng, Birth Defects Research 69: 286-304 (2003)]). FGF-R3 돌연변이-관련 골격 형성이상에는 연골저형성증, 발달 지연 및 흑색가시세포종이 있는 중증 연골무형성증 (SADDAN), 및 치사성 형성이상 (TD)이 포함된다 ([Webster et al., Trends Genetics 13 (5): 178-182 (1997)]; [Tavormina et al., Am. J. Hum. Genet., 64: 722-731 (1999)]). 2가지 두개골조기유합증 표현형인 무엔케(Muenke) 관상 두개골조기유합증 ([Bellus et al., Nature Genetics, 14: 174-176 (1996)]; [Muenke et al., Am. J. Hum. Genet., 60: 555-564 (1997)]), 및 흑색가시세포종이 있는 크로존(Crouzon) 증후군 ([Meyers et al., Nature Genetics, 11: 462-464 (1995)])에서 FGF-R3 돌연변이가 또한 기술되었다. 크로존 증후군은 FGF-R2에서의 특이적 점 돌연변이와 관련되고, 가족형 및 산발성 형태 양쪽 모두의 파이퍼(Pfeiffer) 증후군은 FGF-R1 및 FGF-R2에서의 돌연변이와 관련된다 ([Galvin et al., PNAS USA, 93: 7894-7899 (1996)]; [Schell et al., Hum Mol Gen, 4: 323-328 (1995)]). FGF-R에서의 돌연변이는 돌연변이된 수용체의 구성적 활성화 및 증가된 수용체 단백질 타이로신 키나제 활성을 초래하여, 세포 및 조직이 분화할 수 없도록 한다.
구체적으로, 연골무형성증 돌연변이는 돌연변이된 수용체의 강화된 안정성을 초래하여, 수용체 활성화를 하향 조절로부터 분리시키고, 이는 계속 유지되는 연골세포 성숙 및 골 성장 억제에 이른다 ([Vajo et al., Endocrine Reviews, 21(1): 23-39 (2000)]에서 리뷰됨).
다양한 유형의 암에서 FGF-R3를 활성화시키는 돌연변이에 대한 증거가 축적되고 있다.
2가지 일반적인 상피암인 방광암 및 자궁경부암, 뿐만 아니라 다발성 골수종에서의 구성적으로 활성화된 FGF-R3는 암종에서의 FGF-R3에 대한 종양원성 역할에 대한 첫번째 증거이다. 또한, 다수의 최근의 연구들이 대다수의 양성 피부 종양에서 FGF-R3 활성화 돌연변이의 존재를 보고하였다 ([Logie et al., Hum Mol Genet 2005]). 현재 FGF-R3는 방광암에서 가장 빈번하게 돌연변이되는 종양유전자인 것으로 여겨지고, 이는 전체 방광암 사례의 거의 50％에서, 그리고 표재성 방광 종양이 있는 사례의 약 70％에서 돌연변이된다 ([Cappellen, et al., Nature Genetics 1999, 23;19-20]; [van Rhijn, et al., Cancer Research 2001, 61: 1265-1268]; [Billerey, et al, Am. J. Pathol. 2001, 158:1955-1959], WO 2004/085676). 또한, FGF-R3의 과발현이 방광암 (표재성 및 침습성)에서 보고되었다 ([Gomez-Roman et al. Clinical Cancer Research 2005]). t(4,14) 염색체 전위의 결과로서의 비정상적인 FGF-R3 과발현이 다발성 골수종 사례의 10-25％에서 보고된다 ([Chesi et al., Nature Genetics 1997, 16: 260-264]; [Richelda et al., Blood 1997, 90: 4061-4070]; [Sibley et al., BJH 2002, 118: 514-520]; [Santra et al., Blood 2003, 101: 2374-2476]). FGF-R3 활성화 돌연변이가 t(4,14) 염색체 전위가 있는 다발성 골수종의 5-10％에서 나타나고, 종양 진행과 관련된다 ([Chesi et al., Nature Genetics 1997, 16: 260-264]; [Chesi et al., Blood, 97 (3): 729-736 (2001)]; [Intini, et al, BJH 2001, 114: 362-364]). 이러한 정황에서, FGF-R3 신호전달의 결과는 종종 세포-유형 특이적인 것으로 여겨진다. 연골세포에서, FGF-R3 과다활성화는 성장 억제를 초래하는 한편 ([Omitz, 2001]에서 리뷰됨), 골수종 세포에서는 종양 진행에 기여한다 ([Chesi et al.,2001]).
FGF-R3 활성의 억제는, 예를 들어, 류머티스성 관절염 (RA), 콜라겐 II 관절염, 다발성 경화증 (MS), 전신 홍반 루푸스 (SLE), 건선, 유년 발병형 당뇨병, 쇼그렌 질환, 갑상선 질환, 사르코이드증, 자가면역성 포도막염, 염증성 장 질환 (크론병 및 궤양성 대장염), 복부 질환 및 중증 근육무력증을 포함하지만 이에 한정되지 않는 T-세포 매개 염증성 또는 자가면역 질환의 치료에서와 같이, T 세포 매개 염증성 또는 자가면역 질환을 치료하기 위한 수단을 나타내는 것으로 발견되었다. WO 2004/110487 참조. FGF-R3 돌연변이로부터 초래되는 장애는 WO 03/023004 및 WO 02/102972에 또한 기술되어 있다.
FGF-R3에 의해, 그리고 또한 기타 FGF-R에 의해 촉진되는 질환들 중에서 (특히, 예를 들어 비정상적인 FGF23 혈청 수준과 관련됨), 추가적인 보통염색체 우성 저인산혈성 구루병 (ADHR), X-염색체 연관 저인산혈성 구루병 (XLH), 종양-유도 골연화증 (TIO), 뼈의 섬유성 형성이상 (FH)이 언급된다 ([X. Yu et al., Cytokine & Growth Factor Reviews 16, 221-232 (2005)], 및 [X. Yu et al., Therapeutic Apheresis and Dialysis 9(4), 308-312 (2005)]를 또한 참조).
FGF-R1, FGF-R2 및 FGF-R4의 유전자 증폭 및/또는 과발현이 유방암에서 연루되었다 ([Penault-Llorca et al., Int J Cancer 1995]; [Theillet et al., Genes Chrom. Cancer 1993]; [Adnane et al., Oncogene 1991]; [Jaakola et al., Int J Cancer 1993]; [Yamada et al., Neuro Res 2002]). FGF-R1 및 FGF-R4의 과발현은 췌장 선암종 및 별아교세포종과 또한 관련된다 ([Kobrin et al., Cancer Research 1993]; [Yamanaka et al., Cancer Research 1993]; [Shah et al., Oncogene 2002]; [Yamaguchi et al., PNAS 1994]; [Yamada et al., Neuro Res 2002]). 전립선암 또한 FGF-R1 과발현과 관련되었다 ([Giri et al., Clin Cancer Res 1999]).
FGF/FGF-R은 혈관형성에 또한 수반된다. 따라서, FGF-R 시스템의 표적화는 원발성 종양, 뿐만 아니라 전이를 치료하기 위한 항-혈관형성 치료법으로 또한 예견된다 (예를 들어 [Presta et al., Cytokine & Growth Factors Reviews 16, 159-178 (2005)] 참조).
돌연변이, 특히 FGF-R3 (예를 들어 FGF-R3b)에서의 돌연변이가 구강 편평 세포 암종의 경우에 이러한 수용체의 구성적 활성화를 담당하는 것으로 또한 기술되었다 (예를 들어 [Y. Zhang et al, Int. J. Cancer 117, 166-168 (2005)] 참조).
FGF-R, 특히 FGF-R1의 강화된 (특히 기관지) 발현이 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)과 관련되는 것으로 보고되었다 (예를 들어 [A. Kranenburg et al., J. Pathol. 206, 28-38 (2005)] 참조).
FGF-R, 특히 FGF-R1 또는 FGF-R4를 길항하는 방법이 비만, 당뇨병 및/또는 이들과 관련된 질환, 예컨대 대사 증후군, 심혈관 질환, 고혈압, 비정상적인 콜레스테롤 및 트리글리세리드 수준, 피부과 장애 (예를 들어, 감염, 정맥류, 흑색가시세포종, 습진, 운동 불내성, 제2형 당뇨병, 인슐린 저항성, 고콜레스테롤혈증, 담석증, 정형외과 손상, 혈전색전성 질환, 관상 또는 혈관 제한 (예를 들어 죽상동맥 경화증), 주간 졸림증, 수면 무호흡, 말기 신장 질환, 쓸개 질환, 통풍, 열병, 면역 응답 손상, 호흡 기능 손상, 상처후 감염, 불임, 간 질환, 요통, 산과 및 부인과 합병증, 췌장염, 뇌졸중, 수술 합병증, 복압 요실금 및/또는 위장관 장애의 치료에서 유용한 것으로 또한 기술되었다 (예를 들어 WO 2005/037235 A2 참조).
산성 섬유모세포 성장 인자 (특히 FGF-1) 및 FGF-R1이 망막모세포종에서의 비정상적인 신호전달에서 수반되어, FGF-1의 결합 시 증식에 이르는 것으로 또한 기술되었다 (예를 들어 [S. Siffroi-Fernandez et al., Arch. Ophthalmology 123, 368-376 (2005)] 참조).
섬유모세포 성장 인자 신호전달 경로의 파괴에 의해 활막 육종의 성장이 억제되는 것으로 나타났다 (예를 들어 [T. Ishibe et al., Clin. Cancer Res. 11(7), 2702-2712 (2005) 참조).
또한, 갑상선 암종의 사례에서의 FGF-R 수반이 실연될 수 있었다.
상기 언급된 모든 사례에서, FGF-R 신호전달의 비정상적인 활성의 조정 (특히, 키나제의 활성의 억제)은 언급된 질환들의 치료에서 유용할 것으로 합리적으로 예상될 수 있다.
그러나, 언제 FGF-R 신호전달을 조정하는, 예를 들어, 억제하거나 활성화시키는 약물로의 치료가 유용할 것으로 예상될 수 있는지에 대한 지표를 입수하는 것, 그리고 추가로 FGF-R 조정 및 이같은 조정 화합물로의 치료가 효과적인지 아닌지 여부를 모니터링하도록 하는 마커를 입수하는 것이 바람직할 것이다.
언제 약물로의 치료가 FGF-R 신호전달을 억제하는지에 대한 지표를 입수하는 것이 특히 바람직하다.
SNT1으로 또한 칭해지는 FRS-2는 FGF-R 활성화와 세포내 신호전달 경로 간의 1차 연결물의 역할을 하는 지질-고정(anchored) 어댑터 단백질이다 ([Lin et al., Mol. Cell Biol. 18: 3762-3770, 1998]; [Xu et al., J. Biol. Chem. 273: 17987-17990, 1998]; [Dhalluin et al., Mol. Cell 6: 921-929, 2000]; [Ong et al., Mol. Cell Biol. 20: 979-89, 2000]). FRS-2는 FGF-R의 막인접(juxtamembrane) 영역과 구성적으로 회합되는 포스포타이로신 결합 클래스 (PTB)의 수용체 인식 서열, 및 다중 타이로신 및 세린 인산화 부위가 있는 이펙터 도메인으로 구성된다. FGF-R 활성화는 FRS-2 타이로신 잔기의 인산화에 이르고, 이어서 여기에 Grb2 및 타이로신 포스파타제 Shp2가 동원되어 MAPK 및 PI3K 신호전달을 개시시킨다 ([Xu et al. 1998]; [Ong et al, 2000]; [Hadari et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 8578-83, 2001]). FGF 신호전달에서의 FRS-2의 중요성은 FRS-2 유전자의 파괴 후 마우스 발달 동안 관찰된 배아 치사 표현형에서 반영된다. 또한, FRS-2-결핍 마우스 배아 섬유모세포는 FGF-유도 이동, 증식 및 MAK 활성화의 손상을 나타낸다 ([Hadari et al. 2001]).
발명의 개요
놀랍게도, FRS-2의 (특히 타이로신) 인산화 단계가 언급된 (특히 증식성) 질환 및 장애에 대한 조정 화합물의 효율에 대한 바이오마커(biomarker)의 역할을 할 수 있다는 것이 발견되었다: 특히, FRS-2가 FGF-R 신호전달의 억제에 감수성인 세포에서는 고도로 타이로신 인산화되지만, 증식을 위해 FGF-R에 비의존적인 세포주 에서는 그렇지 않은 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명은 FGFR 조정인자에 의한 FGFR 억제가 인산화된 FRS-2의 수준에서의 감소를 초래한다는 발견을 기초로 한다. 증식되고 있는 (예를 들어, 종양) 세포에서, FGF-R 신호전달 억제제의 존재 하에 FGF-R 신호전달의 억제에 응답하는 세포에서의 FRS-2의 타이로신 인산화 정도가 감소되는 한편, 억제에 응답하지 않는 세포에서는 타이로신 인산화 수준이 검출가능하지 않거나 (즉 매우 낮거나 0), 더욱 일반적으로는 조정인자, 특히 억제제의 첨가에 의한 변화에 대해 감수성이지 않고, FRS-2의 타이로신 인산화를 나타내는 세포만이 FGF-R 신호전달의 억제에 대해 감수성을 나타낼 것으로 예상될 수 있다.
별법적으로, FGF-R 신호전달의 활성화를 원하는 경우 (예를 들어, 상처 치유의 경우), 활성화제 (예컨대 FGF 유도체 등)가 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 포스포타이로신 함유 단편의 인산화의 증가에 이르러서, FGF-R 신호전달의 (바람직한) 활성화를 나타내는지 여부를 시험하는 것이 또한 가능하다.
따라서, 증식 중인 세포에서의 FRS-2의 타이로신 인산화 정도 (특히 타이로신 인산화의 존재)를 사용하여, FGF-R 신호전달 조정인자, 특히 억제제로의 치료에 반응할 수 있는 세포를 이같은 치료에 대해 비-응답성일 세포로부터 구별할 수 있다. 따라서, 세포 내의 FRS-2의 타이로신 인산화 상태는 FGF-R 신호전달의 억제제에 의해 (예를 들어, 원치 않는) 세포 증식을 조정, 특히 억제하는 가능성에 대한 바이오마커이다. FRS-2 타이로신 인산화의 수준은 FGFR 및 이의 변이체의 조정인자의 생체외 활성을 결정하는데 또한 사용될 수 있다.
추가로, FRS-2 타이로신 인산화 (또는 동의적으로 인산화 형태의 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편)의 결정은 FGF-R 활성 (특히 활성과 관련됨)을 조정하는 화합물/약물의 확인에서 특히 유용하고, FGF-R 조정인자, 특히 억제제로의 치료가 이로울 수 있는 환자의 확인을 위한, 뿐만 아니라 치료의 효율을 모니터링하기 위한 진단 방법에 또한 적용될 수 있다.
첫번째 실시양태에서, 본 발명은 억제에 대한 감수성에 대한 바이오마커로서 생물학적 샘플 내의 FGF-R 기질 2 (FRS-2), 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편의 타이로신 인산화 상태를 결정하는 것을 포함하는, 섬유모세포 성장 인자 수용체 (FGF-R) 또는 이의 변이체가 연관되는 신호전달의 조정, 특히 억제에 대한 감수성을 나타내는 (바람직하게는 단리된, 예를 들어, 세포 배양물 또는 세포 현탁액 내의) 세포 (일반적으로 생물학적 샘플, 가장 바람직하게는 환자로부터의, 단리된 세포, 또는 단리된 조직 및/또는 기관으로부터의 세포 포함)를 확인하는 방법에 관한 것이다.
추가적인 실시양태에서, 본 발명은 FRS-2 내의 포스포타이로신을 인식할 수 있는 생체특이적(biospecific) 인식 시약으로 생물학적 샘플로부터의 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편 내의 포스포타이로신의 존재를 결정하는 것을 포함하고, 이때 FRS-2 내의 인산화의 양성 발견은 과다활성 FGF-R 신호전달, 특히 구성적으로 활성화된 FGF-R 신호전달을 나타내는, 과다활성 FGF-R 신호전달, 특히 구성적으로 활성화된 FGF-R 신호전달을 나타내는 세포, 조직 또는 기관, 특히 FGF-R 또는 이의 변이체의 억제제로 치료가능하고 이같은 억제제에 대해 응답성인 세포 또는 조직 또는 기관, 특히 환자로부터의 생물학적 샘플로부터의 것에 대한 바이오마커로서 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편에서의 인산화 (특히 포스포타이로신) 확인을 사용하는 방법 또는 바이오마커로서의 이러한 인산화 확인의 용도에 관한 것이고, 바람직하게는, 상기 방법 또는 용도는 섬유모세포 성장 인자 수용체 (FGF-R) 또는 이의 변이체가 연관되는 신호전달의 억제제에 대해 응답성인 세포 또는 조직 또는 기관을 비-응답성인 세포 또는 조직 또는 기관으로부터 구별하기 위해, FGF-R 또는 이의 변이체에 의해 매개되는 신호전달의 억제제의 부재 및 존재 하에서의 인산화 상태를 비교하는 것을 추가로 포함하고, 이때 억제제의 존재 하에서의 인산화에서의 감소는 이같은 응답성의 지표가 된다.
또한 본 발명은
a) 생물학적 샘플을 FRS-2 또는 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편을 인식할 수 있는 생체특이적 인식 시약과 접촉시키는 단계,
b) 상기 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편 내의 타이로신의 인산화 상태를 상기 인산화 상태를 인식할 수 있는 생체특이적 인식 시약으로 결정하는 단계, 및
c) 인산화 상태를 섬유모세포 성장 인자 수용체 (FGF-R) 또는 이의 변이체 (특히 과다활성 형태, 예를 들어 구성적으로 활성인 형태)가 연관되는 신호전달의 억제에 대한 감수성 및/또는 상태의 상태 및/또는 치료 효능과 상관시키는 단계
를 포함하는, 섬유모세포 성장 인자 수용체 (FGF-R) 또는 이의 변이체가 연관되는 신호전달의 조정, 특히 억제에 대한 감수성을 나타내는 (바람직하게는 단리된, 예를 들어, 세포 배양물 또는 세포 현탁액 내의) 세포 (일반적으로 생물학적 샘플, 특히 환자로부터의, 단리된 세포, 또는 단리된 조직 및/또는 기관으로부터의 세포 포함)를 확인하는 방법에 관한 것이다.
추가적인 실시양태에서, 또한 본 발명은 조정, 특히 억제에 대한 감수성에 대한 바이오마커로서, 생물학적 샘플, 바람직하게는 환자로부터의 샘플 내의 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편의 인산화 상태를 결정하기 위한 수단, 특히 인산화된, 더욱 특히 타이로신이 인산화된 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편을 확인하기 위한 수단을 포함하는, FGF-R 또는 이의 변이체가 연관되는 신호전달의 조정, 특히 억제에 대해 감수성인 생물학적 샘플, 특히 환자로부터의 샘플의 확인에서 사용하기 위한, 특히 FGF-R 억제제로의 치료가 유용한 환자의 확인에서 사용하기 위한 키트에 관한 것이다; 바람직하게는, 키트가 조정의 부재 하에서, 더욱 바람직하게는 FGF 자극의 부재 하에서, 즉 더욱 더 바람직하게는 FGF-R 신호전달의 구성적 활성화의 경우에 인산화의 양성 발견을 허용하는 경우, 이는 억제에 대한 감수성의 지표가 되고, 특히 억제제로 처리되지 않은 샘플과 비교하여 억제제로 처리된 샘플에서 인산화가 감소되는 경우에 그러하다.
본 발명의 추가적인 실시양태는 섬유모세포 성장 인자 수용체 (FGF-R) 또는 이의 변이체가 연관되는 신호전달의 조정, 특히 억제에 대한 감수성을 나타내는 세포, 특히 생물학적 샘플로부터의 세포, 특히 환자로부터의 세포를 확인하는 것에서 사용하기 위한 (더욱 특히, FGF-R 억제제로의 치료가 유용한 환자의 확인에서 사용하기 위한), 인산화 형태의 FRS-2 또는 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편을 인식할 수 있는 (특히 이들 내부의 포스포타이로신을 인식할 수 있는) 생체특이적 인식 시약 (특히 항-포스포타이로신 항체)의 용도, 또는 상기 생체특이적 인식 시약 그 자체에 관한 것이고, 이때 바람직하게는 상기 용도는 상기 FRS-2 또는 이의 변이체 또는 이의 단편의 인산화 상태를 결정하는 것을 포함하고; 바람직하게는, 조정의 부재 하에서의 인산화의 발견은 상기 억제에 대한 감수성이 예상될 수 있다는 것을 의미한다; 바람직하게는, 이는 FGF-R 신호전달의 과다활성, 특히 FGF-비의존적 활성화, 더욱 특히 구성적 활성화의 확인에서 사용하기 위한 것이다. 환자로부터의 생물학적 샘플 내의 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 포스포타이로신 포함 단편에서의 인산화, 특히 타이로신 인산화의 확인을 포함하는, FGF-R 신호전달의 억제제로의 치료에 대해 응답성인 환자의 상태의 확인에서 사용하기 위한 용도 또는 생체특이적 인식 시약이 바람직하다.
본 발명의 또다른 실시양태는 조정인자의 존재 및 부재 하에 FRS-2 인산화 상태를 결정하는 단계, 및 상기 (가능한) 조정인자가 첨가된 경우에 인산화의 감소가 발견되면 조정인자를 억제제의 부류에 할당하고, 조정인자가 첨가된 경우에 인산화의 증가가 발견되면 조정인자를 신호전달의 활성화제의 부류로 할당하는 단계를 포함하는, 섬유모세포 성장 인자 수용체 (FGF-R) 또는 이의 변이체가 연관되는 신호전달의 조정인자 (활성을 조정하는 화합물 또는 약물)의 확인에서 사용하기 위한 FRS-2 인산화 (또는 동의적으로 인산화 형태의 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편)의 결정을 위한 방법에 관한 것이다; 특히, 이는 FGF-R 신호전달의 과다활성, 특히 FGF-비의존적 활성화, 더욱 특히 구성적 활성화를 나타내는 세포의 확인에서 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태는 인산화가 억제제 없이 존재하는지 여부 (특히 인산화의 양성 발견은 억제제로의 치료가 환자에게 이로울 수 있다는 것을 가리킴), 바람직하게는 환자로부터의 생물학적 샘플에서 억제제의 존재 하에 인산화가 감소되는지 여부를 결정하는 것을 특히 포함하는, FGF-R 조정인자, 특히 억제제로의 치료가 이로울 수 있는 환자를 확인하는 것에서의, 또는 환자로부터의 생물학적 샘플에서, 치료 없이 양성으로 발견된 경우의 인산화가 조정인자, 특히 억제제의 존재 하에 변화되는지, 특히 감소되는지 여부를 결정하는 것을 포함하는, FGF-R 조정인자, 특히 억제제로의 치료의 효능을 모니터링하는 것에서의, 인산화 형태의 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편을 인식할 수 있는 생체특이적 인식 시약 (특히 항-포스포타이로신 항체)의 진단 방법 또는 용도, 또는 이러한 확인 또는 모니터링에서 사용하기 위한 상기 생체특이적 인식 시약에 관한 것이다; 바람직하게는, 이는 이같은 환자의 생물학적 샘플에서의 FGF-R 신호전달의 과다활성, 특히 FGF-비의존적 활성화, 더욱 특히 구성적 활성화의 확인에서 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태는 환자로부터의 생물학적 샘플 내의 (바람직하게는 타이로신) 인산화 형태의 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편을, 바람직하게는 인산화 형태의 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편을 인식할 수 있는 생체특이적 인식 시약으로, 확인하는 것을 포함하는, FGF-R 신호전달의 억제제로의 치료에 대해 응답성인 (특히 증식성) 질환 (또는 환자)를 진단하는 방법, 또는 상기 진단 방법에서 사용하기 위한 상기 생체특이적 인식 시약에 관한 것이다; 바람직하게는, 이는 FGF-R 신호전달의 과다활성, 특히 FGF-비의존적 활성화, 더욱 특히 구성적 활성화의 확인에서 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태는 생물학적 샘플 내의 인산화 형태의 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편의 부재를, 바람직하게는 인산화 형태의 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편을 인식할 수 있는 생체특이적 인식 시약으로, 확인하는 것을 포함하는, FGF-R 신호전달의 억제제로의 치료에 대해 감수성이지 않은 증식성 질환을 진단하는 방법, 또는 상기 진단 방법에서 사용하기 위한 상기 생체특이적 인식 시약에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태는 치료법 이전에 환자로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계, 인산화 형태의 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편의 존재, 특히 인산화 정도를 각각 결정하는 단계, 및 치료법을 시작한 후 하나 이상의 추가적인 생물학적 샘플을 수득하는 단계 및 상기 FRS-2, 상기 변이체 또는 상기 타이로신 포함 단편의 인산화 정도가 변화되었는지, 특히 감소되었는지 여부를 결정하는 단계를 포함하고, 이때 인산화 정도에서의 감소는 성공적인 치료의 지표가 되는, 환자에서 FGF-R 신호전달에 의존적인 장애를 치료하기 위한 치료법에 대한 응답을 모니터링하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가적인 실시양태는 섬유모세포 성장 인자 수용체 (FGF-R) 또는 이의 변이체가 연관되는 신호전달의 조정에 대해 감수성인 세포를 생물학적 샘플로부터의 세포 또는 조직으로부터 확인하기 위한 진단제의 제작을 위한 것이고, 상기 확인이 FGF-R 기질 2 (FRS-2), 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편의 인산화 상태를 결정하는 것을 포함하는, 인산화된 FRS-2 또는 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편을 인식할 수 있는 생체특이적 인식 시약의 용도에 관한 것이다.
추가적인 실시양태에서, 본 발명은 FGF-R 신호전달을 조정하는 화합물의 확인에 유용한 세포를 확인하기 위한 인산화된 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 단편을 인식할 수 있는 생체특이적 인식 시약의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 추가적인 실시양태는
a) 단리된 세포 또는 조직의 샘플을 FGF-R 억제제의 부재 하에 배지에 적용하고, 병렬 샘플을 FGF의 부재 하에 FGF-R 수용체 억제제의 존재 하에 적용하는 단계,
b) 상기 샘플들로부터 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편을 적어도 부분적으로 정제하는 단계;
c) 상기 샘플들 내의 FRS-2의 인산화 상태를 결정하는 단계; 및
d) 억제제로 처리된 샘플에서의 인산화 상태를 억제제로 처리되지 않은 샘플에서의 인산화 상태와 비교하고, 이때 억제제의 존재 하에서의 인산화의 감소는 FGF-R 신호전달의 과다활성을 포함하는 상태의 치료에서 유용한 억제제를 확인하는데 적합한 세포의 지표가 되는 단계
를 포함하는, 증식을 위해, 특히 구성적인, FGF 수용체 활성화를 필요로 하면서 증식하고, FGF-R 신호전달의 억제에 대해 응답성인 세포를 확인하는 방법에 관한 것이다.
상기 방법은 증식을 위한 FGF 의존적 또는 FGF 비의존적인, 특히 구성적인, FGF 수용체 활성화에 의해 증식하는 세포를 확인하는데 유용하다.
본 발명의 또다른 실시양태는 생물학적 샘플로부터 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편의 인산화 상태를 생체특이적 인식 시약으로 결정하는 단계, 및 인산화가 발견된 경우, 테스트 화합물의 존재 하에서의 인산화 정도를 부재 하에서의 인산화 정도와 비교하는 단계를 포함하고, 이때 인산화에서의 감소는 테스트 화합물이 FGF-R 의존적 신호전달의 억제제로서 유용하다는 것에 대한 지표가 되는 것인, FGF-R 의존적 신호전달의 잠재적 억제제의 확인을 위한, 인산화된 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편을 인식할 수 있는 생체특이적 인식 시약을 사용하는 방법 또는 이러한 시약의 용도에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명의 모든 상기의 방법, 용도, 시약, 키트 및 기타 실시양태는, 특히 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편에서 포스포타이로신이 양성으로 확인되는 경우에, FGF-R 신호전달의 조정인자로의 치료에 대해 응답성일 것으로 예상될 수 있는 상태, 특히 장애 또는 질환이 있는 환자를 확인하도록 한다.
상기 및 하기에서 사용된 일반적인 용어들은 달리 지시되지 않는 한 본 발명의 정황에서 하기의 의미를 갖는다 - 본원에서, 특히 청구항에서 사용된 더욱 일반적인 표현들 중 임의의 하나 이상은, 다른 용어와 독립적으로, 하기에서 제공된 더욱 구체적인 정의로 교체될 수 있어서, 본 발명의 바람직한 실시양태를 정의한다.
바람직하게는, "섬유모세포 성장 인자 수용체 (FGF-R) 또는 이의 변이체가 연관되는 신호전달의 조정에 대한 감수성"을 나타내는 세포는 상기 신호전달의 조정인자, 특히 억제제로의 치료에 대해 응답성이고, 환자로부터의 생물학적 샘플 내에 포함된 세포를 의미한다. 이러한 세포들은 조정인자의 부재 하에서의 인산화와 비교했을 때 FGF-R의 조정인자의 존재 하에 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편의 인산화에서의 변화를 나타낸다 - 특히, 조정인자가 억제제인 경우, 인산화에서의 증가가 발견되거나, 또는 더욱 바람직하게는 조정인자가 억제제인 경우 인산화에서의 감소가 발견된다. 바람직하게는, 조정인자, 바람직하게는 억제제는 FGF-R 또는 이의 변이체에 결합하는, 바람직하게는 FRS-2 또는 이의 변이체와 관련된 이의 (바람직하게는 타이로신) 단백질 키나제 활성을 억제하는 분자이다.
"인산화 상태" (또는 "인산화 정도")는 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편의 1차 아미노산 서열 내에 인산화된 세린, 트레오닌 및/또는 (바람직하게는 유일하게) 타이로신 분자가 부재하거나 또는 부분적이거나 완전하게 존재하는 것을 지칭한다. 본 발명에 따르면, 인산화 상태는 (예를 들어 구성적인) FGF-R 신호전달에 의존적인 상태, 예를 들어 질환 또는 장애를 앓고 있는 환자로부터의 생물학적 샘플 (인산화가 존재하는 것으로 나타날 수 있음)을 이같은 의존성이 제공되지 않은 샘플 (인산화가 존재하는 것으로 나타나지 않거나 약한 인산화만이 존재하는 것으로 나타날 수 있음)로부터 구별하는 수단이다.
특히, FGF-R 신호전달의 조정인자 (특히 억제제)의 존재 및 부재 하에서의 인큐베이션 후 생물학적 샘플의 인산화 상태를 비교함으로써, FGF-R 신호전달이 조정 (특히 억제)될 수 있는 (그리고, 따라서 이같은 조정인자, 특히 억제제로의 치료에 대해 응답성인 (이는 억제제의 경우 억제제 없이 인산화가 발견되고 이러한 인산화가 억제제의 존재 하에 감소 또는 제거된다면 사실임)) 생물학적 샘플을 이같은 조정, 특히 억제가 인산화 상태에 영향을 미치지 않는 생물학적 샘플 (즉, 억제제의 경우, 억제제의 존재 또는 부재 하 모두에서 인산화가 존재하지 않거나 억제제가 있는 샘플 또는 억제제가 없는 샘플을 비교했을 때 소정의 인산화에서의 변화가 나타나지 않음)로부터 구별할 수 있다.
가장 바람직하게는, 본 발명은 특히 FGF-R 신호전달의 과다활성, 가장 특히 이의 구성적 활성화로 인해, 과도하게 증식하고, 따라서 FRS-2 또는 이의 변이체에서 타이로신 인산화를 나타내고, 따라서 (FGF-R 신호전달의 억제제의 존재 및 부재 하 양쪽에서 인산화 상태를 시험함으로써 추가로 구별될 수 있는 바와 같이) FGF-R 신호전달의 억제제로의 치료에 대해 응답성일 것으로 예상되는 세포를 확인하도록하여, 이러한 세포를 이같은 인산화가 없고 따라서 FGF-R 신호전달의 억제제로의 치료가 성공적일 것으로 예상되지 않는 세포로부터 구별하도록 한다.
일반적으로, 따라서, 생물학적 샘플 내의 FGF 자극의 부재하에서 또한 존재하는 FRS-2 또는 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편의 인산화 (특히 타이로신 인산화)를 발견하는 것은 본 발명에 따른 고도로 바람직한 바이오마커이고, 모든 본 발명의 실시양태들은 FGF-R 또는 이의 변이체의 이러한 유형의 과다활성, 특히 구성적 활성을 나타내는 이같은 세포의 발견을 가장 특히 지칭한다.
생물학적 샘플이 환자로부터의 것인 경우, 인산화 상태 (이러한 용어는 본원에서 용어 "인산화 정도"로 또한 교체될 수 있음), 및 조정인자 (특히 억제제)의 존재 및 부재 하에서의 또는 변동의 결여 또는 인산화의 존재는 조정인자, 특히 억제제로의 치료가 환자에게 이로울 수 있는지 없는지 여부를 결정하도록 한다 (억제제의 존재 하에 감소된 인산화가 관찰되거나 인산화가 관찰되지 않는 한편, 억제제의 부재 하에 더 높은 인산화가 관찰되는 이들은 이같은 억제제로의 치료가 이로울 것으로 예측될 수 있다).
"인산화"는, 본원의 어디에서 사용되든지, 바람직하게는 타이로신 인산화를 지칭한다.
환자는 특히 과다활성으로 인한, 특히 구성적 활성화로 인한, 또는 기타 이유 (예를 들어 FGF에 대한 확대된 감수성 및/또는 증가된 FGF 수준, 증가된 FGF-R 생합성 등)로 인한 FGF-R 신호전달의 과다활성에 (적어도 부분적으로) 의존적인 상태 또는 장애를 앓기 쉬운 또는 앓고 있는, 바람직하게는 온혈 동물, 더욱 바람직하게는 포유류, 가장 바람직하게는 인간이다.
상태들 중에서, 특히 하기로부터 선택된 질환 또는 장애가 중요하다:
인간 왜소증의 가장 일반적인 형태인 연골무형성증, 두개골조기유합증 증후군 및 왜소증 증후군으로 분류되는 골격 형성이상, 예를 들어 연골저형성증, 발달 지연 및 흑색가시세포종이 있는 중증 연골무형성증 (SADDAN) 및 치사성 형성이상, 무엔케 관상 두개골조기유합증, 흑색가시세포종이 있는 크로존 증후군, 보통염색체 우성 저인산혈성 구루병, X-염색체 연관 저인산혈성 구루병 (XLH), 종양-유도 골연화증, 뼈의 섬유성 형성이상이 포함되는 골격 이상.
자가면역 질환, 예를 들어 류머티스성 관절염, 콜라겐 II 관절염, 다발성 경화증, 전신 홍반 루푸스, 건선, 유년 발병형 당뇨병, 쇼그렌 질환, 갑상선 질환, 사르코이드증, 자가면역성 포도막염, 염증성 장 질환 (크론병 및 궤양성 대장염), 복부 질환 및 중증 근육무력증, 구강 편평 세포 암종.
만성 폐쇄성 폐 질환, 비만, 당뇨병 및/또는 이들과 관련된 질환, 예컨대 대사 증후군, 심혈관 질환, 고혈압, 비정상적인 콜레스테롤 및 트리글리세리드 수준, 피부과 장애 (예를 들어, 감염, 정맥류, 흑색가시세포종, 습진, 운동 불내성, 제2형 당뇨병, 인슐린 저항성, 고콜레스테롤혈증, 담석증, 정형외과 손상, 혈전색전성 질환, 관상 또는 혈관 제한 (예를 들어 죽상동맥경화증), 주간 졸림증, 수면 무호흡, 말기 신장 질환, 쓸개 질환, 통풍, 열병, 면역 응답 손상, 호흡 기능 손상, 상처후 감염, 불임, 간 질환, 요통, 산과 및 부인과 합병증, 췌장염, 뇌졸중, 수술 합병증, 복압 요실금 및/또는 위장관 장애.
증식성 장애, 특히 조직, 기관 또는 혈액 세포의 암 또는 종양 질환, 예컨대 방광 또는 자궁경부의 상피암, 다발성 골수종, 피부 종양, 유방암, 췌장 선암종, 별아교세포종, 전립선암, 혈관형성이 역할을 하는 고형 종양, 망막모세포종, 활막 육종, 갑상선 암종, 추가적인 흑색종, 악성 림프종, 위장암, 기타 췌장암, 폐암, 식도암, 간암, 난소암, 자궁암, 전립선암, 뇌종양, 카포시 육종, 혈관종, 골육종, 근육 육종, 아교모세포종, 8p11 골수증식 장애 또는 백혈병 등이 특히 중요하다.
FGF-R은 다양한 변이체에서 발견될 수 있는, FGF (이 또한 변이체, 예를 들어 20가지를 초과하는 유전자 및 여러 이소형을 나타냄)에 대한 고친화력 수용체이다.
본원에서 사용된 용어 "FGF-R", 특히 FGF-R1, FGF-R2, FGF-R3 및 FGF-R4는 모든 이러한 변이체들, 특히 구조적으로 활성이거나 또는 공지된 22개의 섬유모세포 성장 인자 중 하나 이상의 결합 (바람직하게는 10-3 또는 이보다 강한 해리 상수, 더욱 바람직하게는 10-5 또는 이보다 강한 해리 상수, 더욱 더 바람직하게는 10-7 또는 이보다 강한 해리 상수로의 결합)으로 인해 활성이어서, 항-포스포타이로신 항체 (예컨대 4G10)로, 특히 실시예에서의 분석법에 의해 증명할 수 있는 바와 같이 여전히 FRS2를 인산화시켜 이의 포스포타이로신 형태를 산출시킬 수 있거나, 또는 FGF-R3 (세포 분석법) 또는 FGF-R3 (효소 분석법)으로 WO 2006/000420 (따라서, 이러한 분석법들과 관련하여 거명에 의해 포함됨)에 언급된 것들에 상응하는 분석법에서 활성 (타이로신 인산화)을 나타내는 것들을 포함한다.
바람직하게는, 변이체는 (아미노산을 기초로) 약 (사용되는 경우 "약"이 붙은 각각의 수치의 ± 10 ％, 또는 바람직하게는 정확하게 그 값을 의미함) 70％ 이상 동일한, 더욱 바람직하게는 적어도 약 85％ 이상 동일한, 더욱 더 바람직하게는 약 90％ 이상 동일한, 더 더욱 바람직하게는 약 95％ 이상 동일한, 매우 바람직하게는 98％ 이상 동일한 서열을 포함한다 (바람직하게는 이러한 서열로 구성된다). FGF-R, 특히 FGF-R1, FGF-R2, FGF-R3 또는 FGF-R4와 이의 변이체 간의 상동성으로 또한 칭해지는 서열 동일성의 백분율은 이러한 목적에 일반적으로 사용되는 컴퓨터 프로그램, 예컨대 Gap 프로그램 (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Cmputer Group, University Reseach Park, Madison Wisconsin, USA; 이는 [Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2: 482-489 (1981)]의 알고리즘을 사용함)에 의해 바람직하게 결정되고, 이때 갭 오픈 페널티 12 및 갭 확장 페널티 1로의 아핀(affine) 갭 검색이 특히 사용된다.
상기에 제공된 모든 서열 변이체의 동일성과 관련된 비교를 위해, FGF-R1, FGF-R2, FGF-R3 및 FGF-R4의 원래의 서열 이외에, 바람직한 기초가 하기와 같이 제공된다:
- FGF-R1은
http://www,ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?val=M34185에서 단백질 서열이 제공된다; (접속 번호 M34185);
- FGF-R2는
http://www.ncbi.nlm.nih.qov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=108773805에서 단백질 서열이 제공된다 (접속 번호 NM_022970 NM_022969);
- FGF-R3은
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer,fcgi?db=nucleotide&val=13112047에서 단백질 서열이 제공된다 (접속 번호 NM_022965);
- FGF-R4는
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore&val=47524176에서 단백질 서열이 제공된다 (접속 번호 NM_022963).
용어 "변이체"는 다양한 형태, 예컨대 특히 이소형, 돌연변이체 (예를 들어, 하나 이상, 예를 들어, 10개 이하의 아미노산의 비-보존적, 또는 특히 보존적 치환, 결실 및/또는 부가 (역위를 또한 포함함)), 대립유전자 변이체, 다형성을 기반으로 하는 변이체, 융합 단백질, 말단절단(truncated) 형태 (예를 들어, 전체 서열과 비교하여 10개 내지 50개의 아미노산이 결여됨) 등을 포함한다. 다음 단락에서 구체적으로 언급되는 돌연변이체, 이소형, 전위 변이체 등이 특히 바람직하다:
FGF-R에 대해 4개의 일반적인 유전자, 즉 FGF-R1, FGF-R2, FGF-R3 및 FGF-R4가 있고, 이들 각각은 여러 이소형 (예를 들어 FGF-R1: a, b, c; FGF-R2: b,c; FGF-R3: b,c; FGF-R4: 말단절단 형태)을 포함한다. 다형성이 존재하고, 돌연변이체가 존재하고, 예를 들어 FGF-R3에 대해, R248C (#), S249C (#), P250R, N328I, G370/372C (#), S371/373C, Y373/375C (#), G375/377C, G380/382R (#), A391/393E (#), I538/540V*, N540/542K,T,S 또는 V, K650/652E (#), K650/652M (#), K650/652Q (#), K650/652N, K650/652T (#), X807/809C,G, L1R1W 등이 있고, 이들 중 다수는 암 형성과 같은 질환에서 수반되며, 예를 들어, #로 표시된 것들이 방광암, 및/또는 골격 형성이상에서 예를 들어 발견될 수 있고, 필적하는 돌연변이가 FGF-R1 및 FGF-R2에 대해 또한 존재한다; 융합 단백질이 전위의 결과로 존재한다 (예를 들어 FGF-R1: Bcr-FGF-R1, ZNF198-FGF-R1, CEP110-FGF-R1, FOP-FGF-R1, Trim-FGF-R-I, MYO18A-FGF-R1, TIF1-FGF-R1; FGF-R2: Tel-FGF-R3) (예를 들어 [Eswarakumat et al., J. Cytokine & Growth Factor Reviews 16 (2005), 139-149] 참조).
따라서, 일반적으로 돌연변이체 (치환, 결실, 삽입 포함), 이소형, 다형성 변이체 및 융합 단백질이, 예를 들어, FGF-R 단백질의 하기의 부분들 중 하나 이상 내에 포함된다: Ig 도메인 I, 산성 박스, Ig 도메인 II, Ig 도메인 III, 막횡단 도메인, 키나제 1, 키나제 삽입물 및/또는 키나제 2.
또한, SNT (Suc-관련 향신경성 인자-유도 타이로신 인산화 표적)으로 또한 명명된 여러 FRS-2 유형들이 발견되었다. FRS-2 부류의 단백질들은 기본적으로 FRS-2α (SNT1) 및 FRS-2β (SNT2)으로 구성되고, 이들은 SH2 도메인-함유 단백질 Grb1 및 SH2-함유 단백질 타이로신 포스파타제 (PTP) SHP-2를 동원하는 지질-고정 다기질 어댑터 분자이다. FRS-2α의 타이로실 인산화는 FGF-R 신호전달의 개시에 결정적이다. FRS-2가 본 명세서에서 언급되는 경우, 이는 FGF-R1, FGF-R2, FGF-R3 및/또는 FGF-R4에 여전히 결합할 수 있는 FRS-2-α (SNT1) 및 FRS-2β (SNT2)의 변이체, 특히 FRS-2α 또는 FRS-2β에 대해 70％ 이상 동일한, 더욱 바람직하게는 적어도 약 85％ 이상 동일한, 더욱 더 바람직하게는 약 90％ 이상 동일한, 더 더욱 바람직하게는 약 95％ 이상 동일한, 매우 바람직하게는 98％ 이상 동일한 이러한 종류의 FRS-2 변이체에 또한 관련된다. FRS-2α 또는 FRS-2β와 이의 변이체 간의 상동성으로 또한 칭해지는 서열 동일성의 백분율은 이러한 목적에 일반적으로 사용되는 컴퓨터 프로그램, 예컨대 Gap 프로그램 (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Cmputer Group, University Reseach Park, Madison Wisconsin, USA; 이는 [Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2: 482-489 (1981)]의 알고리즘을 사용함)에 의해 바람직하게 결정되고, 이때 갭 오픈 페널티 12 및 갭 확장 페널티 1로의 아핀 갭 검색이 특히 사용된다.
따라서, FRS-2 (FRS-2α 또는 FRS-2β)의 변이체는 이소형, 돌연변이체 (예를 들어, 하나 이상, 예를 들어, 10개 이하의 아미노산의 비-보존적, 또는 특히 보존적 치환, 결실 및/또는 부가 (역위를 또한 포함함)), 대립유전자 변이체, 다형성을 기반으로 하는 변이체, 융합 단백질, 말단절단 형태 (예를 들어, 전체 서열과 비교하여 10개 내지 50개의 아미노산이 결여됨) 등을 특히 포함한다. FRS-2α 및 FRS-2β가 특히 바람직하다; 모든 변이체는 인산화에 이용할 수 있는 하나 이상의 부위, 특히 타이로신을 포함하여야 한다.
FRS-2 또는 이의 변이체의 타이로신 포함 단편은 사슬 내에서 인산화될 수 있고, 인산화되지 않은 형태의 이러한 펩티드와 인산화된 형태의 이러한 펩티드를 구별할 수 있고, 특히 예를 들어 다른 단백질로부터의 다른 펩티드들로부터 구별할 수 있는 생체특이적 인식 시약이 여전히 인식할 수 있는, 하나 이상의 타이로신 모이어티(moiety)가 있는 펩티드이다 (예를 들어, 프로테아제, 예컨대 서브막실라루스(Submaxillarus) 프로테아제, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) V8 프로테아제, 펩신, Asp-N-프로테아제, 키모트립신 또는 트립신으로의 단백질용해성 부위 특이적 절단에 의해, 또는 예를 들어 브로모시안으로의 화학절 절단에 의해 생성되고, 바람직하게는 생물학적 샘플, 특히 세포 또는 조직 또는 기관, 매우 특히 종양으로부터 수득된 FRS-2 또는 이의 변이체의 단백질용해성 또는 화학적 절단에 의해 각각 수득됨). 바람직하게는, 단편에는 절단된 FRS-2의 원래의 서열의 5개 이상, 더욱 바람직하게는 10개 이상의 인접한 아미노산, 더욱 더 바람직하게는 20개 이상, 특히 50개 이상이 있다.
바람직하게는, "인산화 형태"의 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편은 상기 FRS-2, 변이체 또는 단편의 1차 아미노산 구조 내의 하나 이상의 세린, 트레오닌 또는 (특히) 타이로신 모이어티에서 인산화된 것이다.
용어 "생물학적 샘플"은, 예를 들어, 체액, 예컨대 타액, 혈액, 혈장, 혈청, 활액, 복강액, 폐내액 또는 소변, 또는 더욱 바람직하게는 세포, 세포 성분 또는 조직 또는 기관 검사물 (기관 또는 특히 종양으로부터의 샘플 포함), 또는 이들 중 2가지 이상, 예컨대 조직 또는 기관 샘플 또는 세포, 또는 시험될 세포, 기관 또는 조직 (예를 들어, 감염되었거나 감염된 것으로 가정되는 세포, 종양 또는 기타 조직 또는 기관)으로부터의 세포 용해물의 혼합물을 지칭한다. 바람직하게는, 단리된 생물학적 샘플이 의도된다. 이는 배양물로부터 유래될 수 있거나, 또는 바람직하게는 환자로부터 수득된다. 본 발명에 따른 방법 및 용도에서, 일반적으로 단리된 생물학적 샘플이 사용되고, 즉, 바람직하게는 방법 및 용도가 환자의 부재 하에, 예를 들어, 별도의 실험실 등에서 일어난다. 따라서, 이러한 경우에, 생물학적 샘플을 수득하는 단계 및 이의 시험 단계가 분리될 수 있고, 바람직하게는 분리되며, 본 발명에 따른 방법 또는 용도는 샘플 추출 또는 샘플의 유형에 독립적이다. 용어 "세포"가 본원에서 사용되는 경우, 이는 방금 정의된 바와 같은 생물학적 샘플로부터의 세포, 세포 단편 또는 세포 용해물을 지칭한다.
한 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법 또는 용도는 환자로부터 샘플을 수득하는 단계를 포함하지 않고, 즉 순수하게 시험관내 방법 또는 용도이며, 즉 환자의 신체 밖에서의, 이의 부재 하에서의 것이다. 다른 한편으로는, 이러한 샘플 수득 단계가 또한 포함되는 실시양태 또한 허용가능한 경우 본 발명의 바람직한 실시양태이다.
"생체특이적 인식 시약"은 항체일 수 있고, 특정한 경우 (특히, 표지된 2차 또는 3차 생체특이적 인식분자로서), 이는 또한 항체 결합 단백질 (예를 들어 박테리아로부터의 단백질 A 또는 단백질 G)일 수 있거나, 또는 앱타머(aptamer) (특이적 분자 표적에 결합하는 이중-가닥 DNA 또는 단일-가닥 RNA 분자를 포함함) 또는 어피바디(affibody) (원하는 단백질에 대해 선택될 수 있고, 예를 들어, 조합형 단백질 라이브러리로부터 단리될 수 있는 단백질 결합 폴리펩티드)일 수 있다.
일반적인 용어 "항체"는, 본 명세서 내에서, 그리고 달리 특정되지 않는 한, 폴리클로날 또는 모노클로날 항체, 이중특이적 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단일쇄 항체, 또는 여전히 FRS-2 및/또는 이의 변이체 및/또는 이의 타이로신 포함 단편 (입체형상 구조 또는 (바람직하게는) 1차 구조가 관련된 (예를 들어, 포스포타이로신을 포함하는) 에피토프들 중 하나 또는 양쪽 모두를 포함함)을 인식할 수 있고, 특히 이에 대해 (실질적으로 또는 완전하게 선택적인) 결합 친화력 (바람직하게는 10-4 이하, 더욱 바람직하게는 10-6 이하, 더욱 더 바람직하게는 10-8 이하의 해리 상수로의 결합 친화력)을 나타내는, 상기 형태의 항체들 중 임의의 하나 이상의 단편을 포함하도록 의도된다. 따라서, "항체"는 기능적으로는 결합 단백질 (항원 상의 특이적 (입체형상 구조 및/또는 1차 구조가 관련된) 에피토프에 결합할 수 있는 분자)로 정의되고, 구조적으로는 면역글로불린 코딩 유전자의 프레임워크 영역으로부터 유래되는 것으로 당업자에게 인식되는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 정의되는 단백질을 특히 지칭한다. 구조적으로, 가장 간단한 천연 발생 항체 (예를 들어 IgG)는 중쇄 (H) 카피 2개 및 경쇄 (L) 카피 2개의 4개의 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 이들 모두는 디술피드 결합에 의해 공유결합으로 연결된다. 에피토프에 대한 결합의 특이성은 H 및 L 사슬의 가변 (V) 영역에서 발견된다. 주로 구조적인 항체의 영역은 불변 (C) 영역이다. 용어 "항체"는 전체 항체, 항체의 여전히 결합성인 단편, 변형물 또는 유도체를 포함한다. 이는 또한 재조합 생성물, 또는 이중특이적 항체 또는 키메라 항체, 예컨대 인간화 항체일 수 있다. 항체는 폴리클로날 혼합물일 수 있거나, 또는 (1가지를 초과하는, 또는 특히 1가지의) 모노클로날 항체일 수 있다. 이는 천연 공급원 또는 천연 공급원(들)로부터 유래된 무손상 면역글로불린일 수 있고, 무손상 면역글로불린의 면역반응성 (결합성) 부분일 수 있다. 항체는 다양한 형태 (유도체)를 나타낼 수 있고, 예를 들어, Fv (VL 및 VH 도메인으로 구성됨), dAB 단편 (VH 도메인으로 구성됨; [Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989] 참조), 단리된 상보성 결정 영역 (CDR), Fab (VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성됨), 및 F(ab)2 (힌지 영역에서 디술피드 다리에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편), 뿐만 아니라 단일쇄를 포함한다. 중쇄 및 경쇄에 대한 유전자들이 단일 코딩 서열 내로 조합된 단일쇄 항체 (SCA)가 또한 사용될 수 있다. 일부 SCA는 경쇄의 가변 영역, 중쇄의 가변 영역 및 이들을 연결하는 적절한 폴리펩티드 링커를 함유하는 재조합 분자이다. 인식하는 또는 인식은 각각의 관심 분자에 대한 높은 친화력, 예를 들어, 해리 상수가 10-4 이하, 더욱 바람직하게는 10-6 이하, 더욱 더 바람직하게는 10-8 이하인 친화력으로의 결합 (바람직하게는 특이적 결합, 예를 들어 샘플 내에 존재하는 임의의 다른 분자에 대한 것보다 100배 이하, 바람직하게는 1000배 이하, 더욱 바람직하게는 10,000배 이하인 해리 상수)이 있다는 것을 특히 의미한다.
FRS-2 (이러한 용어는 어디서 사용되든지 FRS-2, 이의 변이체 (특히 상기 정의된 바와 같은 변이체), 또는 (인산화되지 않은 및/또는 인산화된) 타이로신을 포함하는 이의 단편을 포함함)의 인산화 상태의 결정은, 예를 들어, 생물학적 샘플로부터의 FRS-2 또는 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편의 (적어도 부분적인) 정제를 포함할 수 있고, 예를 들어, 이는 조직, 세포 또는 세포 단편의 용해, 및 1회 이상의 강화 단계, 예를 들어 전통적인 크로마토그래피 또는 고속 단백질 액체 크로마토그래피 (FPLC) 및/또는 전기영동 기술, 예컨대 2차원 전기영동 또는 특히 소듐 도데실술페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 (SDS-PAGE)에 의한, 더욱 바람직하게는 FRS-2 특이적 생체특이적 인식 시약, 예를 들어 항체 또는 항체들, 더욱 바람직하게는 폴리클로날 항체로의 면역침전에 이어지는 SDS-PAGE에 의한, 또는 2가지 이상의 이같은 기술의 임의의 적합한 조합에 이어서, 인산화된 FRS-2, 변이체 또는 단편 (특히 내부에 포함된 포스포타이로신)을 인식하는 생체특이적 인식 시약 (자체가 표지되지 않거나 표지됨)으로 인산화된 (특히 티로신 인산화된) FRS-2, 변이체 또는 단편의 존재 또는 정량적인 양을 결정하거나 FRS-2 또는 변이체 또는 단편 내의 포스포타이로신 함량을 결정하기 위해 인산화된 FRS-2, 이의 변이체 또는 단편에 대해 스크리닝하는 것에 의한 강화 단계를 포함한다.
"부분적 정제"는 샘플 내에 원래 존재하는 다른 단백질과 상대적으로 비교하여 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 단편의 적어도 2개, 더욱 바람직하게는 적어도 5배, 더욱 더 바람직하게는 적어도 10배, 가장 바람직하게는 적어도 25배 강화가 이루어지는 것을 의미한다.
별법적으로, FRS-2를 인식하는 생체특이적 인식 시약을 고체 지지체 (예컨대 막 또는 반응 용기, 예를 들어, 멀티웰 플레이트)에, 예를 들어 공유결합으로 또는 흡착에 의해, 결합시키고, 평가될 FRS-2를 포함하는 배지 (예를 들어, 조직 또는 세포 용해물)에 접촉시킨 후, 결합된 인산화 (특히 타이로신-인산화) FRS-2의 양을 인산화 FRS-2, 특히 내부에 포함된 포스포타이로신을 인식하여 표지시킬 수 있는 생체특이적 인식 시약에 의해 결정하는 것이 또한 가능하다.
또한 별법적으로, 인산화 형태의 FRS-2, 특히 포스포타이로신에 대해 특이적인 생체특이적 인식 시약을 고체 지지체 (전단락 참조)에 결합시키고, 평가될 FRS-2를 포함하는 배지에 접촉시킨 후, 결합된 FRS-2를 인식하여 표지시킬 수 있는 생체특이적 인식 시약을 사용하여 결합된 FRS-2를 결정하는 것이 가능하다.
바람직하게는, 표지 단계는, 각각의 경우에, 자신의 에피토프에 결합된 항체에 결합할 수 있는 하나 이상의 추가적인 표지된 특이적 인식 분자, 예컨대 표지된 단백질 A, 표지된 단백질 G, 표지된 스트렙타비딘, 항체의 불변 영역에 대해 예를 들어 특이적인 추가적인 표지된 항체 등을 포함한다.
원칙적으로, 예를 들어 인산화 형태의 FRS-2 (이의 변이체 또는 단편 포함)에 대해 특이적이고 이의 표지 및/또는 단리를 허용하는 생체특이적 인식 시약을 사용하여, 1단계 결정이 또한 가능하다.
또한, 샘플 내의 인산화된 형태 (예를 들어, 인산화된 형태에만 결합하는 생체특이적 인식 시약에 의한 결정) 및 인산화되지 않은 형태 (예를 들어, 인산화되지 않은 형태에만 결합하는 생체특이적 인식 시약에 의한 결정)의 FRS-2 양쪽 모두를 결정하는 것이 또한 가능하고 (예를 들어, 이들의 비율을 결정하기 위해), 따라서 정량 가능성을 포함하는, 샘플들에서의 미묘한 차이에 대한 더욱 상세한 정보를 수득하는 것이 가능하다.
FRS-2의 인산화 상태를 결정하기 위한 이러한 방법 또는 다양한 기타 방법이 가능하고, 따라서 본 발명의 일부이다.
인식 시약 또는 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편을 위한, 또는 면역침전물을 위한 고체 지지체는, 예를 들어, 세포 및 면역화학에서 관습적인 플라스틱 또는 유리 용기 또는 플레이트 또는 멀티웰 플레이트일 수 있거나, 또는 막, 예를 들어, 니트로셀룰로스 또는 PVDF 막일 수 있다.
결정 단계에서, 표지를 위해, 생체특이적 인식 시약 또는 이에 결합하는 추가적인 표지된 특이적 인식 분자 (상기 및 하기에 정의된 바와 같음)가 통상적인 방식으로, 예를 들어, 과산화효소, 예컨대 양고추냉이 과산화효소 (따라서, 결합된 과산화효소-접합 인식제의 존재를 통상적인 반응, 예컨대 염료 또는 기타 시약으로의 반응, 예를 들어 SuperSignal®West Dura Extended Duration Substrate 검출 시스템 (Pierce, Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL, USA); # 34075; 발광제(luminal) 및 빛 강도 강화제를 포함함)을 사용하는 것 또는 4-클로로-1-나프톨 및 H2O2로 염색하는 것으로 결정하도록 함), 알칼리성 포스파타제 (포스파타제/BCIP-NBT 시스템 사용), β-갈락토시다제; 말레이트 탈수소효소, 스타필로코칼 뉴클레아제, 델타-5-스테로이드 이소머라제, 효모 알콜 탈수소효소, 알파-글리세로포스페이트 탈수소효소, 트리오스 포스페이트 이소머라제 또는 글루코아밀라제를 예를 들어 사용하는 효소 접합에 의해, 비오틴/스트렙타비딘 시스템 (생체특이적 인식 시약에 결합하지 않는 것)의 성분, 발색성, 형광성 (예를 들어, 형광 유로퓸(Europium) 킬레이트 또는 Cy5), 생체발광성 또는 화학발광성 마커, 예컨대 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 파이코에리트린, 파이코시아닌, 알로파이코시아닌, o-프탈알데히드, 플루오레사민 또는 형광-방출 금속 원자 예컨대 유로퓸 또는 기타 란탄족, 또는 방사성 표지 등으로의 표지에 의해 표지되는 것이 바람직하고, 이때 각각의 경우에, 공지된 검출 반응, 특히 당업계에 주지된 표준 검출 반응이 허용되고, 따라서 효소-, 색상-, 화학발광-, 형광-, 생체발광- 또는 방사성-기반 (예를 들어 형광) 또는 기타 검출 및 정량 방법이 예를 들어 허용된다.
별법적으로, 인산화된 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편에 결합하는 생체특이적 인식 분자를 직접적으로 표지하는 것 대신에, 추가로 표지된 생체특이적 인식 분자, 예컨대 표지된 항체 또는 박테리아 단백질 (예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G) (예를 들어, 전단락에서 언급된 바와 같이 표지됨)을 사용할 수 있고, 예를 들어, 이미 결합된 생체특이적 인식 분자, 예를 들어 항체 (예를 들어, 표지된 항-마우스 또는 항-토끼 AB) 상의 불변 영역 또는 올리고당류에 예를 들어 결합하고, 따라서 결합된 항체의 결정을 허용하는 것이, 당업계에 공지된 바와 같이, 사용될 수 있다
인산화된 (특히 타이로신-인산화된) FRS-2가 인산화된 FRS-2 또는 인산화된 기를 포함하는 이의 단편의 입체형상 구조 및/또는 1차 구조를 기초로 하는 에피토프를 특이적으로 인식하도록 하는 생체특이적 인식제 (특히 항체)에 의해, 특히 항-포스포타이로신 항체에 의해 각각의 경우에 특이적으로 인식될 수 있다.
바람직하게는, "인식" 또는 "인식하다"는 특이적으로 결합하는 것, 예를 들어, 생체특이적 인식제에 대해 지시된 해리 상수로 결합하는 것을 의미한다.
다양한 항-포스포타이로신 항체가 다수의 공급원으로부터 예를 들어 시판되고, 본 발명의 방법에 적절하다. 예를 들어, PY-7E1, PY-1B2, 및 PY20은 개별적으로 또는 상표명 PY-PLUS.TM. 하에 판매되는 칵테일로서 Zymed (San Francisco, Calif.)로부터 입수가능한 모노클로날 마우스 항-포스포타이로신 항체이다. Zymed는 친화력으로 정제된 폴리클로날 토끼 항-포스포타이로신 항체인 Z-PY1을 또한 제공한다. 마우스 항-포스포타이로신 항체인 클론 PT-66이 Sigma (St. Louis, Mo.)로부터 입수가능하다. 또한, 폴리클로날 포스포타이로신 항체가 다양한 종에서 당업계에 주지된 면역화 방법에 따라 상승될 수 있다. 모노클로날 항-포스포타이로신 항체의 생산 방법이 미국 특허 번호 4,543,439에 개시되어 있고, 특히 항-포스포타이로신 항체의 수득 및 테스트 방법 (특히, 또다른 항-포스포타이로신 항체를 스크리닝하는데 또한 사용될 수 있는 특이성에 대한 선택 시스템) 및 수득가능한 항-포스포타이로신 항체에 관련된 상기 특허의 내용은 거명에 의해 본원에 포함된다.
면역침전 목적을 위해, 폴리클로날 또는 이중특이적 항체 (항원, 특히 FRS-2 상의 2가지 상이한 에피토프에 결합함)가 사용될 수 있고 (대형 항체/항원 덩어리가 형성되도록 함), 특히 바람직하며, 고체 지지체에의 결합을 위해, (특히 특이적인) 결합 활성을 여전히 나타내는 언급된 항체들 또는 이의 유도체들 중 임의의 것이 가능하다.
한 바람직한 변이체에서, 본 발명에 따른 방법 또는 용도는 먼저, 예를 들어 침전 또는 결합에 의해, FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 (인산화되지 않은 또는 인산화된) 타이로신 포함 단편 (임의의 이러한 변종들은 이후 "FRS-2x"로 지칭됨)을 생물학적 샘플로부터, 예를 들어, FRS-2x를 인식할 수 있는 제1 생체특이적 인식 시약 (예를 들어 항체)으로 (적어도 부분적으로) 정제한 후, FRS-2x를, 예를 들어 SDS-PAGE에 의해, 생체특이적 인식 시약으로부터 분리시키고, FRS-2x를, 예를 들어 막에 FRS-2x를 블롯팅시킴으로써 고정시키고, 이어서 인산화된 FRS-2x, 특히 포스포타이로신을 인식할 수 있는 제2 생체특이적 인식 시약 (추가적인 표지 반응이 필요하지 않도록 자체가 표지될 수 있거나, 또는 표지되지 않을 수 있음)을 결합시키고, (제2 생체특이적 인식 시약이 자체적으로 표지되지 않은 경우) 표지된 생체특이적 인식 시약 (표지 및 표지된 생체특이적 인식 시약은 바람직하게는 상기 정의된 바와 같을 수 있음)을 FRS-2x에 결합된 제2 생체특이적 인식 시약에 추가로 결합시키고, 결합된 생체특이적 인식 시약을 확인하는 것을 포함한다. 따라서, 인산화된, 특히 타이로신이 인산화된 FRS-2x가 샘플 내에 존재하는지 여부 또는 어느 정도로 존재하는지를 알 수 있다.
본 명세서의 전반에 걸쳐 "타이로신 포함 단편"이 사용되는 경우에, 이는 인산화되지 않은 형태 및/또는 (바람직하게는) 인산화된 형태일 수 있다.
본원에서 사용된 면역침전, 표지, 블롯팅 및 기타 방법은 [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]; [Coligan et al., Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991]; [E. Bast: Mikrobiologische Methoden ((Microbiologic Methods)), 2nd edition, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg/Berlin, 2001]; [Hans Guenter Gassen/Gangolf Schrimpf (eds.), Gentechnische Methoden, 2nd edition Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg/Berlin 1999]와 같은 저술로부터 추론될 수 있고, 이들 모두는 거명에 의해 본원에 바람직하게 포함된다.
본 발명에 따른 특수한 실시양태에서, 방법 또는 용도는 인산화 상태가 FGF-R이 연관되는 신호전달의 억제에 대한 감수성을 추론하는데 충분한지 여부를 결정하기 위해 환자의 생물학적 샘플로부터의 FRS-2 또는 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편의 (특히 타이로신) 인산화 상태를 FGF-R이 연관되는 신호전달의 억제에 대한 감수성을 나타내지 않는 환자 및/또는 이같은 감수성을 나타내는 환자로부터 수득된 샘플에서의 이전에 결정된 범위와 비교하는 것을 또한 포함할 수 있다. 인산화 비율이 높을수록, 예상되는 FGF-R 신호전달의 억제에 대한 감수성이 더 높다.
언급되는 경우, 해리 상수는 포스페이트 완충 염수 (pH 7.4)에서 바람직하게 측정되고, 이는 하기와 같이 제조될 수 있다: 800 g NaCl, 20 g KCl, 144 g Na2HPO4 및 24 g KH2PO4 를 8ℓ의 증류수에 용해시키고, 총 10ℓ가 되게 함으로써 10× PBS의 10ℓ 스톡을 제조할 수 있다. pH는 약 6.8이지만, 1× PBS로 희석되는 경우에는 7.4로 변화되어야 한다. 희석시, 생성된 1× PBS의 최종 농도는 하기와 같을 것이다: 137 mM NaCl, 10 mM 포스페이트, 2.7 mM KCl, pH 7.4.
본원에서의 용어 "바이오마커" (또는 "마커")는 이의 존재 및/또는 부재가 검출될 수 있고, 공지된 상태, 특히 FGF-R이 연관되는 신호전달에 좌우되고/되거나 감수성을 나타내는 질환 또는 장애 상태와 상관될 수 있는 생물학적 분자 (본원에서, 특히 인산화되지 않은 또는 인산화된 FRS-2. 또는 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편)를 지칭하는 것으로 이해된다. 이는 FRS-2 또는 이의 변이체의 인산화 상태 (특히, 인산화된 타이로신을 포함함)를 여전히 결정하도록 하는 단편 (예를 들어, FRS-2의 프로테아제 처리 (예를 들어 부위-특이적 프로테아제로의 처리) 등에 의해 수득가능함)을 또한 포함한다. 이같은 바이오마커는 FGF-R 또는 이의 변이체가 연관되는 신호전달의 억제에 대해 응답성인 상태, 예컨대 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상, 및 이같은 억제에 대해 응답성이지 않은 질환이 있는 환자에서 차별적으로 존재한다.
본 발명은 억제에 대한 감수성에 대한 바이오마커로서 생물학적 샘플 내의 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편의 인산화 상태를 결정하기 위한 수단, 특히 인산화된, 더욱 특히 타이로신이 인산화된 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편을 확인하기 위한 수단을 포함하는, FGF-R 또는 이의 변이체가 연관되는 신호전달의 억제에 대한 감수성을 나타내도록 하는 키트에 또한 관련된다.
본 발명에 따른 키트는, 예를 들어, 샌드위치 면역분석법 (ELISA) (샌드위치 ELISA 또는 경쟁적 ELISA 포함), 형광-기반 면역분석법 또는 기타 면역분석법 또는 효소 면역분석법, 예컨대 표면-강화 레이저 탈착/이온화 (SELDI)-기반 면역분석법, 웨스턴 블롯, 면역침전, 면역조직화학, 면역형광, 방사성면역분석법 (RIA) 및/또는 면역방사측정 분석법 (IRMA)을 위한 키트일 수 있다. 이같은 분석법에 필요한 성분 및 구성요소는 당업계에 공지되어 있고, 본 발명에 따른 키트는 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편의 인산화 상태를 확인하도록 하는 2가지 이상의 성분을 포함한다.
키트는 바이오칩, 예를 들어 단백질의 포획용으로 개조된 단백질 바이오칩, 예를 들어 Ciphergen Biosystems, Inc. (Fremont, CA, USA), Packard Bioscience Co. (Meriden, CT, USA), Zyomyx (Hayward, CA, USA), Phylos (Lexington, MA, USA) 또는 Biacore (Uppsala, Sweden)으로부터의 바이오칩을 포함할 수 있고, 이들은 US 6,225,047; WO 99/51773; US 6,329,209; WO 00/56934; 또는 US 5,242,828에 예를 들어 기술되어 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 키트는 - FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편의 인산화 상태를 결정하기 위한 수단으로서 - 인산화 FRS-2, 이의 변이체 또는 (바람직하게는 인산화된) 타이로신을 포함하는 이의 단편을 인식할 수 있는, 특히 이에 결합할 수 있는 생체특이적 인식 시약, 특히 항체, 더욱 특히 항-포스포타이로신 항체를 포함하고; 더욱 더 바람직하게는, 추가적으로 - FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편의 적어도 부분적인 정제를 위한 수단으로서 - FRS-2, 이의 변이체 또는 타이로신을 포함하는 이의 단편을 인식할 수 있고, 바람직하게는 면역침전시킬 수 있는 생체특이적 인식 시약, 및 (바람직하게는 인산화된) 타이로신을 포함하는 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 단편을 인식할 수 있는, 특히 이에 결합할 수 있는 상기 생체특이적 인식 시약을 확인하기 위한 표지를 포함한다. 바람직하게는, 표지는 인산화된 FRS-2, 이의 변이체 또는 (인산화된) 타이로신을 포함하는 이의 단편을 인식할 수 있는, 특히 이에 결합할 수 있는 생체특이적 인식 시약을 이러한 시약이 인산화된 FRS-2, 이의 인산화된 변이체 또는 인산화된 타이로신을 포함하는 이의 단편에 결합되어 있는 상태에서 인식하고, 특히 이에 결합하는 추가적인 생체특이적 인식 분자의 형태 (예를 들어 상기 정의된 바와 같음)일 수 있고, 이는 상기 기술된 바와 같이, 예컨대 표지된 단백질 A, 표지된 단백질 G, 표지된 스트렙타비딘, 항체의 불변 영역에 대해 예를 들어 특이적인 추가적인 표지된 항체 등으로 표지된다.
FGF-R 또는 이의 변이체가 연관되는 신호전달의 조정, 특히 억제를 허용하는 화합물은 특히 조정인자, 바람직하게는 억제제이고, 이는 하기로 구성된 군으로부터 예를 들어 선택될 수 있다: (특히 인간화) 항체, 이의 단편, 단일쇄 항체, 또는 특히 기타 화학 작용제, 특히 억제제, 예를 들어 US 6,774,237 (청구항에 속하는 화합물 (최종 생성물), 더욱 바람직하게는 예로서 구체적으로 언급된 화합물들과 특히 관련하여, 거명에 의해 본원에 포함됨)에 언급된 것들 중 하나 이상, 3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-1-{6-[4-(4-에틸-피페라진-1-일)-페닐아미노]-피리딘-4-일}-1-메틸 우레아 (본원에서 억제제 1로 또한 칭해짐; 실시예 1 참조), WO 2006/000420 A (청구항에 속하는 화합물 (최종 생성물), 더욱 바람직하게는 예로서 구체적으로 언급된 화합물들과 특히 관련하여, 거명에 의해 본원에 포함됨)의 청구항에 속하거나 상기 특허에서 특히 언급된 또다른 화합물들, PD17307 (억제제 2), 또는 특허 US 5,733,913 (청구항에 속하는 최종 화합물, 더욱 바람직하게는 예로서 구체적으로 언급된 화합물들과 특히 관련하여, 거명에 의해 본원에 포함됨)의 청구항에 속하거나 상기 특허에서 특히 언급된 또다른 화합물들 (최종 생성물), PD166866 ([J. Med. Chem. 40: 2296-2303, 1997]).
본 명세서의 상세한 설명 및 청구항 전반에 걸쳐, 용어 "포함하다" 및 이의 변형, 예를 들어 "포함하는"은 "포함하지만 이에 한정되지는 않음"을 의미하고, 용어가 귀착되는 성분 또는 양상이 언급된 것들에 한정되는 것을 의미하는 "함유한다" 및 이의 변형, 예컨대 "함유하는"과 대조적으로, 다른 모이어티, 첨가물, 성분, 정수 또는 단계를 배제하도록 의도되지 않는다 (그리고, 배제하지 않는다). "포함하다" 또는 "포함하는"이 사용되는 경우, 적합하고 합리적인 경우 이는 "구성된다" 또는 "구성되는"으로 교체될 수 있다.
본 명세서에서의 문헌 또는 참고문헌의 어떠한 언급도 참조된 자료가 본 발명의 특허가능성 및 범주에 부정적으로 영향을 미치는 종래 기술이라는 것을 인정하는 것으로 의도되지 않는다.
도 1: 도면에서 제공된 세포주에서의 FRS-2 타이로신 인산화. 기하급수적으로 성장하는 세포들을 용해시키고 (실시예 1 참조), 전체 세포 용해물을 α-FRS-2 항체로의 면역침전에 이은 항-pTyr 항체 또는 항-FRS-2 항체로의 직접적인 면역블롯팅에 적용하거나, 또는 실시예 1의 표 1에 제공된 항-pFRS2 항체로의 면역블롯팅에 직접 적용하였다. WB = 웨스턴 블롯(블롯팅), IP = 면역침전.
도 2: RT4 세포에서 FGF-R 억제제 PD173074 (억제제 1; 실시예 1의 방법 참조)로 처리한 후, RT112의 경우에는 TKI258/CHIR258, 4-아미노-5-플루오로-3-[6-(4-메틸-1-피페라지닐)-1H-벤즈이미다졸-2-일]-2(1H)-퀴놀리논 (억제제 2; 실시예 1의 방법 참조)으로 처리한 후의 FRS-2 인산화의 비교 분석. 지시된 세포주들을 제시된 바와 같이 처리하였다. FRS-2 타이로신 인산화를 특이적 FRS-2 항체로의 면역침전에 이은 항-FRS-2 웨스턴 블롯팅에 의해, 또는 FRS2 상의 인산화된 Tyr196을 검출하는 항체를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 결정하였다. 주: FRS-2 단백질은 MAPK에 의한 세린/트레오닌 잔기 상에서의 인산화에 의해 야기되는 상이한 전기영동 이동성 시프트(shift)를 종종 나타낸다 ([Lax et al., Mol. Cell 10: 709-719, 2004]). Inhib. 1 = 억제제 1, Inhib. 2 = 억제제 2, DMSO = 디메틸 술폭시드.
(A) = 방광암 세포주 RT4
(B) = 방광암 세포주 RT112
도 3: 성장 인자 자극 시의 FRS-2 타이로신 인산화의 비교 분석: 방광암 세포주 RT112 및 RT2를 aFGF/헤파린 (50 ng/㎖ // 5 ㎍/㎖), EGF (10 ng/㎖) (R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN, USA); # 236-EG-200) 또는 인슐린 (5 ㎍/㎖) (Sigma, Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO, USA; # 1882))으로 자극하였다. 세포를 용해시키고, 전체 단백질 용해물을 회수하였다. 실시예 1의 표 1에 언급된 항체들을 사용하여 면역침전에 이은 항-pTyr 항체 웨스턴 블롯팅에 의해 FRS-2 타이로신 인산화를 결정하였다. 전체 세포 용해물을 항-포스포MAPK (실시예 1의 표 1의 pMAPK 항체)로의 웨스턴 블롯팅에 의해 MAPK 활성화에 대해 시험하였다. 동일한 양의 MAPK 단백질을 α-MAPK (실시예 1의 표 1의 MAPK)으로의 웨스턴 블롯팅에 의해 모니터링하였다. WB = 웨스턴 블롯딩, IP = 면역침전, Untr. = 미처리, INS = 인슐린.
도 1 내지 3에서, 실시예 1의 표 1이 언급될 때, 웨스턴 블롯이 PTyr 항체로 수행되는 경우에는 Santa Cruz로부터의 항체 # sc-8318이 면역침전에 사용되었고, 웨스턴 블롯이 항-FRS-2 항체로 수행되는 경우에는 항체 # 05-502가 면역침전에 사용되었다. FRS-2에 대한 웨스턴 블롯을 수행하기 위한 항체는 Santa Cruz로부터의 #Sc-8318이었다. "#"는 카탈로그 번호를 가리킨다.
본 발명의 발명의 바람직한 실시양태
하기에서, 본 발명의 일부 바람직한 실시양태들이 언급된다; 상기 언급된 바 와 같이, 실시양태들을 기술하는 하나 이상의 용어들을 상기 또는 실시예에서 제공된 정의에 의해 교체함으로써 또다른 바람직한 실시양태들이 수득될 수 있다.
(A1) 한 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 억제에 대한 감수성에 대한 바이오마커로서 생물학적 샘플 내의 섬유모세포 성장 인자 수용체 (FGF-R) 기질 2 (FRS-2), 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편의 인산화 상태를 결정하는 것을 포함하는, 섬유모세포 성장 인자 수용체 (FGF-R) 또는 이의 변이체가 연관되는 신호전달의 조정, 특히 억제에 대한 감수성을 나타내는 세포의 확인 방법으로, FRS-2의 타이로신의 인산화 상태가 바이오마커로 사용되는 방법에 관한 것이다.
(A2) 본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는 조정인자, 특히 FGF의 부재 하에서 FRS-2 또는 이의 변이체에서의 인산화, 특히 타이로신의 인산화의 양성 발견이 섬유모세포 성장 인자 수용체 (FGF-R) 또는 이의 변이체가 연관되는 신호전달의 억제가 신호전달에 영향을 미치는데, 특히 신호전달을 억제하는데 효과적일 수 있다는 것에 대한 지표로 사용되는 (A2)에 따른 방법에 관한 것이다.
(A3) 본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는 억제제의 투여에 대해 응답성인 세포를 확인하기 위해 섬유모세포 성장 인자 수용체 (FGF-R) 또는 이의 변이체가 연관되는 신호전달의 억제제의 존재 및 부재 하에서의 인큐베이션 후 생물학적 샘플 내의 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편의 인산화 상태가 비교되고, 이때 인산화 억제의 발견은 이같은 응답성이 예상된다는 지표로서 간주되는 (A2) 또는 (A3)에 따른 방법에 관한 것이다.
(A4) 본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는 용어 FGF-R 또는 변이체가 하나 이상의 섬유모세포 성장 인자의 결합 (바람직하게는 10-3 또는 이보다 강한 해리 상수, 더욱 바람직하게는 10-5 또는 이보다 강한 해리 상수, 더욱 더 바람직하게는 10-7 또는 이보다 강한 해리 상수로의 결합)으로 인해 활성이거나 또는 바람직하게는 구조적으로 활성이어서 항-포스포타이로신 항체로 증명할 수 있는 바와 같이 여전히 FRS-2를 인산화시켜 이의 포스포타이로신 형태를 산출시킬 수 있고, 각각 FGF-R1, FGF-R2, FGF-R3 또는 FGF-R4 중 하나와 비교했을 때 70％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 적어도 85％ 이상 동일하며, 더욱 더 바람직하게는 90％ 이상 동일하고, 더 더욱 바람직하게는 95％ 이상 동일하고, 매우 바람직하게는 98％ 이상 동일한 서열을 포함하는, 바람직하게는 이러한 서열로 구성되는 FGF-R의 모든 형태 또는 변이체를 포함하고, 용어 FGF-R 기질 2 (FRS-2), 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편이 여전히 FGF-R1, FGF-R2, FGF-R3 및/또는 FGF-R4에 결합할 수 있는 FRS-2의 형태, 특히 FRS-2α 또는 FRS-2β, 또는 포스포타이로신을 포함하는 이의 단편에 대해 70％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 적어도 약 85％ 이상 동일하며, 더욱 더 바람직하게는 약 90％ 이상 동일하고, 더 더욱 바람직하게는 약 95％ 이상 동일하고, 매우 바람직하게는 98％ 이상 동일한 FRS-2 변이체를 포함하는 (A1) 내지 (A3) 중 어느 하나에 따른 방법에 관한 것이다.
(A5) 본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는 적어도 부분적으로 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편을 정제한 후, 인산화 형태의 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 단편, 특히 이들 내부에 포함된 포스포타이로신을 인식할 수 있는 생체특이적 인식 시약으로 인산화, 특히 타이로신 인산화의 존재 또는 양을 결정하는 것을 포함하고, 이때 상기 생체특이적 인식 시약 또는 투여되어 상기 생체특이적 인식 시약에 결합할 수 있는 추가적인 생체특이적 인식 분자를 표지하여 투여함으로써 인산화 형태의 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 단편이 검출되도록 하는 (A1) 내지 (A4) 중 어느 하나에 따른 방법에 관한 것이다.
(A6) 본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는 생체특이적 인식 시약이 항체인 (A5)의 방법에 관한 것이다.
(A7) 본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는 포스포타이로신-포함 FRS-2, 이의 포스포타이로신 포함 변이체 또는 이의 포스포타이로신 포함 단편이 섬유모세포 성장 인자 수용체 (FGF-R) 또는 이의 변이체가 연관되는 신호전달의 조정, 특히 억제에 대한 감수성을 나타내는 세포를 지시하는 바이오마커로 사용되고, 바람직하게는 상기 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 단편 내의 타이로신 인산화의 존재 또는 양을 결정하기 위한 항-포스포타이로신 항체 형태의 생체특이적 인식 시약을 사용하는 것을 포함하는 (A1) 내지 (A6) 중 어느 하나에 따른 방법에 관한 것이다.
(A8) 본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는 특히 억제에 대해 감수성인 세포가 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편의 FGF-비의존적 인산화, 더욱 특히 구성적 인산화, 특히 타이로신 인산화가 발견된다는 것을 나타내는 경우에, FGF-R 신호전달의 조정, 특히 억제에 대해 감수성인 세포가 FGF-R에 비의존적으로 증식하는 세포로부터 구별되는 (A1) 내지 (A7) 중 어느 하나에 따른 방법에 관한 것이다.
(A9) 본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는 FRS-2의 인산화의 부재, 특히 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편의 부재 하에서의 인산화의 부재가 FGF-R 신호전달의 억제제에 의한 FGF-R 신호전달의 억제가 예상되지 않는다는 것의 증거로 간주되는 (A1) 내지 (A8) 중 어느 하나에 따른 방법에 관한 것이다.
(B1) 별법적으로, 바람직하게는, 본 발명은 FRS-2 내의 포스포타이로신을 인식할 수 있는 생체특이적 인식 시약으로 생물학적 샘플로부터의 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편 내의 인산화된 타이로신의 존재를 결정하는 것을 포함하고, 이때 인산화의 양성 발견은 과다활성 FGF-R 신호전달, 특히 구성적으로 활성화된 FGF-R 신호전달의 지표가 되는 것인, 과다활성 FGF-R 신호전달, 특히 구성적으로 활성화된 FGF-R 신호전달을 나타내는 세포, 조직 또는 기관, 특히 FGF-R 또는 이의 변이체의 억제제로 치료가능하고 이같은 억제제에 대해 응답성인 세포, 조직 또는 기관에 대한 바이오마커로서 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편에서의 인산화 (특히 포스포타이로신) 확인을 사용하는 방법 또는 이러한 인산화 확인의 용도에 관한 것이다.
(B2) 본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는 FGF-R 또는 이의 변이체가 연관되는 신호전달의 억제제에 대해 응답성인 세포 또는 조직 또는 기관을 비-응답성인 세포 또는 조직 또는 기관으로부터 구별하기 위해, FGF-R 또는 이의 변이체에 의해 매개되는 신호전달의 억제제의 부재 및 존재 하에서의 타이로신 인산화 상태를 비교하는 것을 추가로 포함하고, 이때 억제제의 존재 하에서의 타이로신 인산화에서의 감소는 이같은 응답성에 대한 지표가 되는 (B1)에 따른 방법에 관한 것이다.
(B3) 본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는 억제제의 투여에 대해 응답성인 세포를 확인하기 위해 섬유모세포 성장 인자 수용체 (FGF-R) 또는 이의 변이체가 연관되는 신호전달의 억제제의 존재 및 부재 하에서의 인큐베이션 후 생물학적 샘플 내의 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편의 타이로신 인산화 정도가 비교되고, 이때 인산화의 부분적 또는 완전한 억제, 즉 인산화에서의 감소의 발견은 이같은 응답성이 예상된다는 지표로서 간주되는 (B1) 또는 (B2)에 따른 방법에 관한 것이다.
(B4) 본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는 용어 FGF-R 또는 변이체가 하나 이상의 섬유모세포 성장 인자의 결합 (바람직하게는 10-3 또는 이보다 강한 해리 상수, 더욱 바람직하게는 10-5 또는 이보다 강한 해리 상수, 더욱 더 바람직하게는 10-7 또는 이보다 강한 해리 상수로의 결합)으로 인해 활성이거나 또는 바람직하게는 구조적으로 활성이어서 항-포스포타이로신 항체로 증명할 수 있는 바와 같이 여전히 FRS-2를 인산화시켜 이의 포스포타이로신 형태를 산출시킬 수 있고, 각각 FGF-R1, FGF-R2, FGF-R3 또는 FGF-R4 중 하나와 비교했을 때 70％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 적어도 85％ 이상 동일하며, 더욱 더 바람직하게는 90％ 이상 동일하고, 더 더욱 바람직하게는 95％ 이상 동일하고, 매우 바람직하게는 98％ 이상 동일한 서열을 포함하는, 바람직하게는 이러한 서열로 구성되는 FGF-R의 모든 형태 또는 변이체를 포함하고, 용어 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편이 여전히 FGF-R1, FGF-R2, FGF-R3 및/또는 FGF-R4에 결합할 수 있는 FRS-2의 형태, 특히 FRS-2α 또는 FRS-2β, 또는 포스포타이로신을 포함하는 이의 단편에 대해 70％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 적어도 약 85％ 이상 동일하며, 더욱 더 바람직하게는 약 90％ 이상 동일하고, 더 더욱 바람직하게는 약 95％ 이상 동일하고, 매우 바람직하게는 98％ 이상 동일한 FRS-2 변이체를 포함하는 (B1) 내지 (B3) 중 어느 하나에 따른 방법에 관한 것이다.
(B5) 본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는 적어도 부분적으로 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편을 정제한 후, 상기 FRS-2, 상기 변이체 또는 상기 타이로신 포함 단편 내의 포스포타이로신의 존재 또는 양을 상기 포스포타이로신을 인식할 수 있는 생체특이적 인식 시약으로 결정하는 것을 포함하고, 이때 상기 생체특이적 인식 시약 또는 상기 생체특이적 인식 시약에 결합할 수 있는 추가적인 생체특이적 인식 분자가 표지되어 투여되어서, 인산화 형태의 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 단편이 검출되도록 하는 (B1) 내지 (B4) 중 어느 하나에 따른 방법에 관한 것이다.
(B6) 본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는 생체특이적 인식 시약이 항체인 (B5)의 방법에 관한 것이다.
(B7) 본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는 포스포타이로신-포함 FRS-2, 이의 포스포타이로신 포함 변이체 또는 이의 포스포타이로신 포함 단편이 섬유모세포 성장 인자 수용체 (FGF-R) 또는 이의 변이체가 연관되는 신호전달의 억제에 대한 감수성을 나타내는 세포를 지시하는 바이오마커로 사용되고, 바람직하게는 상기 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 단편 내의 타이로신 인산화의 존재 또는 양을 결정 하기 위한 항-포스포타이로신 항체 형태의 생체특이적 인식 시약을 사용하는 것을 포함하는 (B1) 내지 (B6) 중 어느 하나에 따른 방법에 관한 것이다.
(B8) 본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는 특히 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편의 FGF-비의존적 인산화, 더욱 특히 구성적 인산화, 특히 타이로신 인산화가 발견되는 경우에, FGF-R 신호전달의 조정, 특히 억제에 대해 감수성인 세포가 FGF-R에 비의존적으로 증식하는 세포로부터 구별되는 (B1) 내지 (B7) 중 어느 하나에 따른 방법에 관한 것이다.
(B9) 본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편의 타이로신 인산화의 부재가 FGF-R 신호전달의 억제제에 의한 FGF-R 신호전달의 억제가 예상되지 않는다는 것의 증거로 간주되는 (B1) 내지 (B8) 중 어느 하나에 따른 방법에 관한 것이다.
(B10) 본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는
a) 생물학적 샘플을 FRS-2 또는 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편을 인식할 수 있는 생체특이적 인식 시약과 접촉시키는 단계,
b) 타이로신의 인산화 상태를 포스포타이로신 생체특이적 인식 시약으로 결정하는 단계, 및
c) 인산화 상태를 섬유모세포 성장 인자 수용체 (FGF-R) 또는 이의 변이체 가 연관되는 신호전달의 억제에 대한 감수성 및/또는 상태의 상태 및/또는 치료 효능과 상관시키는 단계
를 포함하는 (B1) 내지 (B10) 중 어느 하나에 따른 방법에 관한 것이다.
(C1) 본 발명의 추가적인 바람직한 실시양태는 섬유모세포 성장 인자 수용체 (FGF-R)가 연관되는 신호전달의 조정, 특히 억제에 대해 감수성인 생물학적 샘플로부터의 세포, 특히 세포 또는 조직 또는 기관을 확인하는 것에서 사용하기 위한 인산화 형태의 FRS-2 또는 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편을 인식할 수 있는 생체특이적 인식 시약 및 FGF-R 또는 이의 변이체에 대한 생체특이적 인식 시약을 포함하는 키트로서, 억제에 대한 감수성에 대한 바이오마커로서 생물학적 샘플 내의 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편의 인산화 상태를 결정하기 위한 수단을 포함하고, 섬유모세포 성장 인자 수용체 (FGF-R)가 연관되는 신호전달의 조정, 특히 억제에 대해 감수성인 세포를 세포 또는 조직 또는 기관으로부터 확인하는 것에서 사용하기 위한 인산화 형태의 FRS-2 또는 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편을 인식할 수 있는 생체특이적 인식 시약 (특히, 항-포스포타이로신 항체)을 인산화 상태를 결정하기 위한 수단으로서 포함하며, FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편의 인산화 상태를, 특히 FGF-R 신호전달의 과다활성, 더욱 특히 FGF-R 신호전달의 구성적 활성화를 결정하도록 하기 위해, 결정하는 것을 포함하는 키트에 관한 것이다.
(C2) 본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는 인산화 형태의 FRS-2 또는 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편을 인식할 수 있는 생체특이적 인식 시약이 항-포스포타이로신 항체이고, FGF-R 또는 이의 변이체를 인식할 수 있는 생체특이적 인식 시약이 모노클로날 또는 폴리클로날 항체인 (C1)에 따른 키트에 관한 것이다.
(C3) 본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는 - FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편의 인산화 상태를 결정하기 위한 수단으로서 - 인산화 FRS-2, 이의 변이체 또는 (바람직하게는 인산화된) 타이로신을 포함하는 이의 단편을 인식할 수 있는, 특히 이에 결합할 수 있는 생체특이적 인식 시약, 특히 항체, 더욱 특히 항-포스포타이로신 항체; 및, 추가적으로 - FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편의 적어도 부분적인 정제를 위한 수단으로서 - FRS-2, 이의 변이체 또는 타이로신을 포함하는 이의 단편을 인식할 수 있고, 바람직하게는 면역침전시킬 수 있는 생체특이적 인식 시약, 및 (바람직하게는 인산화된) 타이로신을 포함하는 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 단편을 인식할 수 있는, 특히 이에 결합할 수 있는 상기 생체특이적 인식 시약을 확인하기 위한 표지를 포함하는 (C1) 또는 (C2)에 따른 키트에 관한 것이다.
(D1) 본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는 섬유모세포 성장 인자 수용체 (FGF-R) 또는 이의 변이체가 연관되는 신호전달의 조정, 특히 억제에 대한 감수성을 나타내는 세포 (특히 생물학적 샘플로부터의 세포, 더욱 특히 환자로부터의 세포), 특히 FGF-R 신호전달의 과다활성, 더욱 특히 구성적 활성화를 나타내는 세포를 확인하는 것에서 사용하기 위한, 인산화 형태의 FRS-2 또는 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편을 인식할 수 있는 생체특이적 인식 시약으로서, 바람직하게는 상기 용도가 상기 FRS-2 또는 이의 변이체 또는 이의 단편의 인산화 상태를 결정하는 것을 포함하고, 바람직하게는, 조정의 부재 하에서의 인산화의 발견은 상기 억제에 대한 감수성이 예상될 수 있다는 것을 의미하는 생체특이적 인식 시약에 관한 것이다. 더욱 바람직하게는, 생체특이적 인식제는 FGF-R 신호전달의 억제제로의 치료에 대해 응답성인 환자의 상태의 확인에서 사용하기 위한 것이다.
(D2) 본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는 FGF-R 신호전달의 과다활성, 특히 FGF-비의존적 활성화, 더욱 특히 구성적 활성화를 나타내는 세포의 확인에서 사용하기 위한 (D1)에 따른 생체특이적 인식 시약에 관한 것이다.
(D3) 본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는 타이로신 인산화 형태의 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편을 확인할 수 있고, 더욱 바람직하게는 항-포스포타이로신 항체인 (D1) 또는 (D2)에 따른 생체특이적 인식 시약에 관한 것이다.
(E1) 본 발명의 추가적인 바람직한 실시양태는 섬유모세포 성장 인자 수용체 (FGF-R) 또는 이의 변이체가 연관되는 신호전달의 조정에 대해 감수성인 세포를 세포 또는 조직으로부터 확인하기 위한 진단제의 제작을 위한 것이고, 상기 확인이 FGF-R 기질 2 (FRS-2), 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편의 인산화 상태를 결정하는 것을 포함하는, 인산화된 FRS-2 또는 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편을 인식할 수 있는 생체특이적 인식 시약의 용도로서, 생체특이적 인식 시약이 타이로신 인산화 형태의 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편을 확인할 수 있고, 더욱 바람직하게는 항-포스포타이로신 항체인 용도에 관한 것이다.
(E2) 본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는 FGF-R 신호전달의 과다활성, 특히 FGF-비의존적 활성화, 더욱 특히 구성적 활성화를 나타내는 세포의 확인을 위한 (E1)에 따른 용도에 관한 것이다.
(F1) 본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는 FGF-R 신호전달을 조정하는 화합물의 확인에 유용한 세포를 확인하기 위한 인산화된 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 단편을 인식할 수 있는 생체특이적 인식 시약의 용도로서, 생체특이적 인식 시약이 타이로신 인산화 형태의 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편을 확인할 수 있고, 더욱 바람직하게는 항-포스포타이로신 항체인 용도에 관한 것이다.
(F2) 본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는 FGF-R 신호전달의 공지된 억제제의 존재 및 부재 하에서의 FRS-2, 이의 또는 이의 타이로신 포함 단편의 인산화 정도를 비교하는 것을 포함하고, 억제제의 존재 하에서의 인산화의 감소는 또다른 억제제를 확인하는데 유용한 세포에 대한 지표가 되는 (F1)에 따른 용도에 관한 것이다.
(G1) 별법적인 바람직한 실시양태에서, 본 발명은
a) 단리된 세포 또는 조직의 샘플을 FGF-R 억제제의 부재 하에 배지에 적용하고, 병렬 샘플을 FGF의 부재 하에 FGF-R 수용체 억제제의 존재 하에 적용하는 단계,
b) 상기 샘플들로부터 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편을 적어도 부분적으로 정제하는 단계;
c) 상기 샘플들 내의 FRS-2의 인산화 상태를 결정하는 단계; 및
d) 억제제로 처리된 샘플에서의 인산화 상태를 억제제로 처리되지 않은 샘플 에서의 인산화 상태와 비교하고, 이때 억제제의 존재 하에서의 인산화의 감소는 FGF-R 신호전달의 과다활성을 포함하는 상태의 치료에서 유용한 억제제를 확인하는데 적합한 세포에 대한 지표가 되는 단계
를 포함하는, 증식을 위해 FGF 비의존적인, 특히 구성적인, FGF 수용체 활성화를 필요로 하면서 증식하고, FGF-R 신호전달의 억제에 대해 응답성인 세포를 확인하는 방법에 관한 것이다
(H1) 본 발명의 추가적인 바람직한 실시양태는 FGF-R 의존적 신호전달의 잠재적 억제제의 확인을 위한, 인산화된 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편을 인식할 수 있는 생체특이적 인식 시약을 사용하는 방법 또는 이러한 시약의 용도로서, 생물학적 샘플로부터 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편의 인산화 상태를 상기 시약으로 결정하는 단계, 및 인산화가 발견된 경우, 테스트 화합물의 존재 하에서의 인산화 정도를 부재 하에서의 인산화 정도와 비교하는 단계를 포함하고, 이때 인산화에서의 감소는 테스트 화합물이 FGF-R 의존적 신호전달의 억제제로서 유용하다는 것에 대한 지표가 되며, 생체특이적 인식 시약이 타이로신 인산화 형태의 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편을 확인할 수 있고, 더욱 바람직하게는 항-포스포타이로신 항체인 방법 또는 용도에 관한 것이다.
(H2) 본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는 생물학적 샘플이 FGF-R 신호전달의 과다활성, 특히 FGF-R 비의존적 활성화, 더욱 특히 구성적 활성을 나타내는 H1에 따른 방법 또는 용도에 관한 것이다.
(I1) 본 발명의 추가적인 바람직한 실시양태는 환자로부터의 생물학적 샘플 내의 인산화 형태의 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편을 확인하는 것을 포함하고, 바람직하게는 확인이 타이로신 인산화 형태의 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편을 인식할 수 있는 생체특이적 인식 시약, 특히 항-포스포타이로신 항체로 일어나는, FGF-R 신호전달의 억제제로의 치료에 대해 응답성인 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다.
(I2) 타이로신이 인산화된 FRS-2, 이의 변이체 또는 타이로신 모이어티를 포함하는 이의 단편을, 특히 EGF 또는 FGF-R 신호전달의 또다른 활성화제의 부재하에서도, 확인하는 것에 의해 바람직하게 제시되는, 환자로부터 취해진 생물학적 샘플 내의 FGF-R 신호전달의 과다활성, 특히 FGF-비의존적 활성화, 더욱 특히 구성적 활성화의 확인에서의 (I1)에 따른 방법이 더욱 바람직하다.
상기 및 하기의 실시양태 모두에서, 바람직하게는, 인산화의 결여가 나타나는 것은 FGF-R 신호전달의 억제에 대해 응답성이지 않을 것으로 예상될 수 있는 생물학적 샘플로부터의 세포를 확인하는 역할을 하고, 따라서, 예를 들어, 이같은 샘플 내에 수득된 세포 또는 조직으로 인한 상태가 있는 환자, 따라서 FGR-R 신호전달의 억제제로의 치료에 대해 응답성이지 않아서 이러한 치료를 받을 수 있지 않은 환자를 확인하도록 하며, 따라서 이같은 억제제를 포함하는 치료 계획에의 불필요한 노출을 피하도록 하는 한편, FRS-2, 이의 변이체 또는 타이로신 모이어티를 포함하는 이의 단편의, 바람직하게는 구성적인 (예를 들어, FGF 또는 기타 FGF-R 신호전달 활성화제의 부재에도 불구하고를 의미함), (특히 타이로신) 인산화를 나타 내고, 특히 FGF-R 신호전달의 억제제에 대해 응답성이어서 (억제제의 존재 하에 감소된 타이로신 인산화를 나타내는 생물학적 샘플), 약물로서의 FGF-R 신호전달의 억제제로의 치료를 받을 수 있는 것으로 간주될 수 있는 환자를 환자로부터 취해진 생물학적 샘플을 기초로 확인하는 것을 특히 허용한다.
FGF-R 신호전달의 조정인자, 특히 FGF의 부재 하에 생물학적 샘플 내의 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편에서 타이로신 인산화가 양성으로 확인되는 것에 관련되는 본 발명에 따른 모든 실시양태들이 가장 바람직한데, 이는 이것이 세포가 FGF-R 신호전달의 억제에 접근가능하여야 하는 FGF-R 신호전달 활성 (예를 들어 과다활성 또는 구성적 활성)을 나타낸다는 것을 의미하기 때문이다.
치료될 상태에 대한 이로운 효과가 억제제에 있는 것으로 예상될 수 있는 경우, 각각의 환자로부터의 생물학적 샘플은 치료 동안 환자에서 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편의 인산화 정도가 감소되었음을 나타낼 것이다. 이것은 바람직한 상황이다. 그러나, 또한 반대로, 치료될 상태에 대한 이로운 효과가 활성화제에 있는 것으로 예상될 수 있는 경우, 각각의 환자로부터의 생물학적 샘플은 치료 동안 환자에서 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편의 인산화 정도가 증가되었음을 나타낼 것이다.
실시예에서 제시된 방법 및 성분, 뿐만 아니라 본 발명의 방법 또는 용도 중 하나에서 사용하기 위한 실시예에서 언급된 항체가 고도로 바람직하다.
본 발명은 요약서의 내용에 또한 관련되고, 따라서 이는 거명에 의해 본원에 포함된다.
하기의 실시예는 본 발명을 이의 범주를 제한하지 않으면서 설명하는 역할을 한다.
실시예 1: 세포주 내의 FRS-2의 인산화를 구별하기 위한 면역침전 및 웨스턴 블롯
1 방법
1.1 세포주 및 세포 배양 조건
ATCC: American Type Culture Collection; LGC Promochem GmbH (Mercatorstr. 51, Wesel, Germany) 또는 http://www.lgcpromochem-atcc.com/를 통해 접근가능함
DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH = German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Germany).
RT112: 원발 방광 암종으로부터 수립된 인간 방광 이행 세포 암종; 조직학적 등급 G2; 병기는 기록되지 않음 ([Masters et al., Cancer Res. 46: 3630-6, 1986]). DSMZ ACC # 418로부터 세포가 수득된다.
RT4: 재발 방광 암종으로부터 수립된 인간 방광 이행 세포 암종; 조직학적 등급 G1; 병기 12 ([Masters et al. 1986]). ATCC # HTB-2로부터 세포가 수득된다.
VMCUB-1: 원발 방광 암종으로부터 수립된 인간 방광 이행 세포 암종. 병기 및 조직학적 등급은 기록되지 않음 ([Masters et al. 1986]). DSMZ ACC # 400로부 터 세포가 수득된다.
J82: 원발 방광 암종으로부터 수립된 인간 방광 이행 세포 암종; 조직학적 등급 G3; 병기 T3 ([Masters et al. 1986]). ATCC # HTB-1로부터 세포가 수득된다.
HT1197: 재발 방광 암종으로부터 수립된 인간 방광 이행 세포 암종; 조직학적 등급 G4, 병기 T2 ([Masters et al. 1986]). ATCC # CRL-1473로부터 세포가 수득된다.
방광 암종 세포주를 1％ L-글루타민 (Amimed # 5-10K00-H), 1％ MEM NEAA (MEM 비-필수 아미노산 용액) (Amimed # 5-13K00-H), 1％ Na-피루베이트 (Amimed # 5-60F00-H) 및 10％ FCS (Gibco, Invitrogen AG (Basel, Schweiz), # 10082-147)가 보충된 MEM EBS (최소 필수 배지+ 얼스(Earls) 기본염) (Amimed (Allschwil, Switzerland), # 1-31F0-I)에서 성장시켰다.
SUM52: 유방암 환자의 늑막 삼출액 표본으로부터 유래된 인간 유방 암종 세포주 ([Ethier et al., Cancer Res. 56: 899-907, 1996]; [Forozan et al., Br. J. Cancer 81: 1328-34, 1999]). 이러한 세포주는 Friedrich Miescher Institute (Basel, Switzerland)의 N Hynes 박사가 제공하였다.
SUM52 세포는 1％ L-글루타민 (Amimed # 5-10K00-H), 2％ FCS (Gibco # 10082-147), 0.1％ BSA (Gibco # 15260-037), 10 mM HEPES (Gibco # 15630-56), 10 μM T3 (Sigma, Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO, USA), # T6397), 1 ㎍/㎖ 하이드로코르티손 (Sigma # H0888), 인슐린-트랜스페린-셀레늄-x 보충물 (Gibco # 51500-056)이 보충된 HAM'S F12 (Amimed # 1-14F01-I)에서 성장시켰다.
OPM2 및 KMS11: 말기 질환 환자로부터 유래된 인간 다발성 골수종 (MM) 세포주. DSMZ ACC # 50으로부터 OPM2 세포를 수득하였다.
Kawasaki Medical School (Okayama, Japan)의 T Otsuki 박사가 KMS11 세포를 제공하였다. 양쪽 세포주 모두 t(4, 14) 전위를 보유하고, 돌연변이된, 구성적으로 활성화된 형태의 FGF-R3을 발현하는 것으로 보고되었다. 특히, OPM2 세포에는 키나제 도메인 내의 ATP 결합 주머니 내에 돌연변이가 있고, 이는 위치 650의 라이신이 글루탐산으로 변화되도록 한다. KMS11 세포에는 수용체의 세포외 도메인 내에 돌연변이가 있어, 위치 373의 타이로신을 시스테인으로 변화시킨다. 양쪽 세포주 모두를 1％ L-글루타민 (Amimed # 5-10K00-H) 및 20％ FCS (Gibco # 10082-147)가 보충된 RPMI 1640 (Gibco # 21875)에서 성장시켰다.
1.2 항체
본 명세서에서 사용된 항체가 표 1에서 열거된다:
Figure 112009052301239-PCT00001
1.3 FGF-R 억제성 화합물
PD173074 (본원에서 억제제 1로 또한 칭해짐); 특이성 및 효능이 확인되어 있는, Parke Davis로부터의 FGF-R 특이적 억제제 ([Mohammadi et al., EMBO J. 17: 5896-5904] 참조). 이의 구조식은 하기와 같다:
Figure 112009052301239-PCT00002
TKI258/CHIR258 (본원에서 억제제 2로 또한 칭해짐); FGFR1, FGFR2 및 FGFR3에 대한 활성이 확인되어 있는, Chiron로부터의 FGF-R 억제제. 이의 구조식은 하기와 같다:
Figure 112009052301239-PCT00003
1.4 면역침전 / WB
세포를 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 함유하는 1％ 트리톤(Triton) 추출 완충제에 용해시켰다 (Hoffmann-LaRoche (Basel, Switzerland)로부터의 "용해 완충제" 50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 5 mM EDTA, 1％ 트리톤, 2 mM 바나드산나트륨, 1 mM PMSF 및 프로테아제 억제 칵테일; # 1187358001). 용해물을 12000×g에서 15분 동안의 원심분리에 의해 정화시키고, DC 단백질 분석법 시약 (Bio Rad, Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA); # 500-0116) (Bradford, M.의 방법을 기초로 하는 분석법 ([Anal. Biochem., 72, 248 (1976)] 참조); 쿠마시 블루(Coomassie Blue)®, ICI를 사용함) 및 소 혈청 알부민 (BSA) 표준물을 사용하여 단백질 농도를 결정하였다.
동일한 양의 단백질을 도면 범례에 지시된 항체 1 ㎍과 함께 2시간 동안 얼음 상에서 인큐베이션함으로써 면역침전을 수행하였다. 면역복합체를 단백질 A- 또는 단백질 G-세파로스 (Sigma, # P-9424; Sigma, # P-3296)로 수집하고, 용해 완충제로 3× 세정하였다. 결합된 단백질을 2× 샘플 완충제 (20％ SDS, 20％ 글리세롤, 160 mM 트리스 pH 6.8, 4％ β-메르캅토에탄올, 0.04％ 브로모-페놀 블루)에서 끓임으로써 방출시켰다.
샘플 (전체 세포 용해물 또는 면역복합체)을 소듐 도데실술페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 (SDS-PAGE)에 적용하고, 단백질을 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 막에 블롯팅시켰다. 1차 항체를 첨가하기 전에, 필터를 20％ 말 혈청 (inVitromex (Geilenkirchen, Germany); # S092I)으로 또는 α-FGF-R3 (항-FGF-R3 항체; "α-X"는 일반적으로 항-X-항체를 가리키고, X는 항체의 표적을 가리킨다), 사이클린 D1 또는 튜불린 웨스턴 블롯의 경우에는 5％ 밀크로 차단하였다. SuperSignal®West Dura Extended Duration Substrate 검출 시스템 (Pierce, Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL, USA); # 34075; 발광제 및 빛 강도 강화제를 포함함)을 사용하여 과산화효소-접합 항-마우스 또는 항-토끼 항체로 단백질을 시각화하였다. 62.5 mM 트리스-HCl pH 6.8; 2％ SDS; 1/125 β-메트캅토에탄올에서 30분 동안 60℃에서 막을 스트리핑(stripping)하였다.
2 결과
2.1 FRS-2이 증식을 위해 FGF-R 신호전달에 의존적인 암 세포주에서 타이로신 인산화된다
FRS-2는 FGF-R의 기질이기 때문에, 본 발명가들은 FGF-R 억제제에 대해 감수성이었고, 저항성인 세포주에 비해 FGF-R 활성이 아마도 높을 세포주에서 FRS-2의 포스포타이로신 수준을 시험하였다.
방광암 세포주 RT4 및 RT112, 다발성 골수종 세포주 OPM2 및 KMS11, 및 유방암 세포주 SUM52는 FGF-R 중 어느 하나에 의존적이었고, 이들의 성장이 억제제 1 및/또는 억제제 2에 의해 억제되었다. 반대로, 방광 암종 세포주 J82, VMCUB1 또는 HT1197은 억제제 1 및 억제제 2에 의한 억제에 대해 저항성이었다. 상세하게, FGF-R1, FGF-R2 및 FGF-R4 발현을 각각 특이적 항체를 사용하여 결정하였다: sc-121 (Santa Cruz), sc-122 (Santa Cruz) 및 sc-124 (Santa Cruz). FGF-R3의 발현을 결정하기 위해, 먼저 FGF-R3을 항체 F-0425 (Sigma)로 면역침전시키고, 면역복합체를 항체 F-0425 (Sigma)를 사용하는 웨스턴 블롯에 적용하였다. 96-웰 플레이트에서 세포 증식을 측정하였다. 세포를 상기에서 제공된 성장 배지에 100 ㎕/웰의 부피로 파종하였다. RT112, RT4 및 SUM52에 대해서는 8500개의 세포/웰을, VMCUB1, J82, HT1197 및 KMS11에 대해서는 5000개의 세포/웰을, OPM2에 대해서는 30000개의 세포/웰을 파종하였다. 파종 24시간 후에 FGF-R 억제제 1, FGFR 억제제 2 또는 (대조군으로서의) DMSO를 함유하는 배지를 각각 첨가하였다. 72시간 후, 25 ㎕/웰의 글루타르알데히드 (20％)를 10분 동안 실온에서 첨가함으로써 세포를 고정시켰다. 그후, 세포를 200 ㎕/웰의 H2O로 2회 세정하고, 100 ㎕의 메틸렌 블루 (0.05％)를 첨가하였다. 10분 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 세포를 200 ㎍/웰의 H2O로 3× 세정하였다. 200 ㎕/웰의 HCl (3％)을 첨가하고, 실온에서 30분 동안 플레이트 진탕기 상에서 인큐베이션하고, 650 nm에서의 광학 밀도를 측정하였다. 50％의 증식 억제를 제공하는 억제제 1의 농도를 엑셀 모듈을 사용하여 계산하였다. 결과가 표 2에 요약된다.
각각의 지시된 세포주에 대한 FGF-R 의존성, 뿐만 아니라 억제제 1 및 억제제 2에 대한 감수성이 상기 지시된 바와 같이 특성화되었다. 증식 분석법에 의해 세포 생육성에 대한 억제제 1 및 억제제 2의 효과를 평가하였다; 제시된 IC50은 여러 독립적인 분석법들 (횟수가 N으로 제공됨)의 평균 IC50이다.
Figure 112009052301239-PCT00004
FGF-R 억제제에 대해 감수성인 모든 세포주에서 FRS-2 포스포타이로신 수준이 상승되었지만, 저항성 세포주 J82, HT1197, VMCUB1에서는 검출가능하지 않거나 매우 낮았다 (도 1).
2.2 FGF-R 억제가 FRS-2 타이로신 인산화를 차단한다
특이적 FGF-R-억제제 억제제 1 및 FGF-R 억제제 억제제 2가 화합물에 의해 성장이 억제된 것으로 나타난 암 세포주에서 FRS-2 타이로신 인산화를 폐지하였다. 이러한 결과는 이러한 세포주에서 FGF-R이 FRS-2를 인산화시키는 것을 담당한다는 것을 나타낸다. (도 2).
지시된 암 세포주를 도 2에 대한 범례 및 도 2에 나타난 바와 같이 처리하였다. 주: FRS-2 단백질은 MAPK에 의한 세린/트레오닌 잔기 상에서의 인산화에 의해 야기되는 상이한 전기영동 이동성 시프트를 종종 나타낸다 ([Lax et al. 2002]).
2.3 FGF-R 리간드는 FRS-2 인산화를 유도하지만, EGF-R 또는 INS-R는 그렇지 않다
FGF-R에 관련되지 않는 또다른 RTK의 활성화가 FRS-2 인산화를 또한 조정할 수 있는지 여부를 시험하였다. EGF 및 인슐린은 RT112 세포에서 MAPK를 활성화시키지만, 포스포-FRS-2를 유도하는데 실패하였다. 유사하게, EGF는 RT4 세포에서 pMAPK를 강력하게 유도하였지만, 포스포-FRS-2는 유도하지 않았다. 예상대로, aFGF는 세포주들에서 FRS-2 포스포타이로신을 효율적으로 증가시켰다 (도 3).
3 토론
FRS-2는 FGF-R 부류 구성원의 하류 기질이고, FGF-R 신호 전달에 수반되는 다중 단백질에 대한 도킹(docking) 분자로서 결정적인 역할을 하는 것으로 나타났다.
본 발명가들은 현저하게 상승된 수준의 포스포-FRS-2를 나타내고 FGF-R에 대해 매우 감수성인 인간 암 세포주들의 패널을 확인하였고, 이는 이러한 세포주에서의 활성 FGF-R-FRS-2 신호전달을 시사한다. 이를 지지하여, 특이적 FGF-R 억제제 억제제 1이 FRS-2 인산화를 완전히 억제하였다. 또한, FGF-R 리간드인 aFGF만이 FRS-2 인산화를 추가로 증가시킬 수 있었고, EGF-R 또는 INS-R 리간드는 그렇지 않았다.
따라서, 이러한 결과들은 포스포-FRS-2가 구성적인 FGF-R 신호전달이 있어서, FGF-R 억제제에 대해 응답할 잠재력이 있는 세포 유형, 특히 환자 세포 유형, 따라서 환자 집단을 선별하기 위한 바이오마커로서 유용하다는 것을 지지한다.
또한, 억제제로의 실험에 대한 유용성에 대해 세포주를 선별할 수 있어서, 잠재적인 약물의 스크리닝을 위한 적합한 테스트 시스템을 수립하도록 한다.

Claims (17)

  1. 억제에 대한 감수성에 대한 바이오마커(biomarker)로서 생물학적 샘플 내의 섬유모세포 성장 인자 수용체 기질 2 (FRS-2), 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편의 인산화 상태를 결정하는 것을 포함하는, 섬유모세포 성장 인자 수용체 (FGF-R) 또는 이의 변이체가 연관되는 신호전달의 조정, 특히 억제에 대한 감수성을 나타내는 세포의 확인 방법.
  2. 제1항에 있어서, FRS-2의 타이로신의 인산화 상태가 바이오마커로 사용되는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 조정인자의 부재 하에서의 FRS-2 또는 이의 변이체에서의 인산화, 특히 타이로신의 인산화의 양성 발견이 섬유모세포 성장 인자 수용체 (FGF-R) 또는 이의 변이체가 연관되는 신호전달의 억제가 신호전달에 영향을 미치는데, 특히 신호전달을 억제하는데 효과적일 수 있다는 것에 대한 지표로 사용되는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 억제제의 투여에 대해 응답성인 세포를 확인하기 위해 섬유모세포 성장 인자 수용체 (FGF-R) 또는 이의 변이체가 연관되는 신호전달의 억제제의 존재 및 부재 하에서의 인큐베이션 후 생물학적 샘플 내의 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편의 인산화 상태가 비교되고, 이때 인산화 억제의 발견은 이같은 응답성이 예상된다는 것에 대한 지표로서 간주되는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 용어 FGF-R 또는 변이체가 하나 이상의 섬유모세포 성장 인자의 결합 (바람직하게는 10-3 또는 이보다 강한 해리 상수, 더욱 바람직하게는 10-5 또는 이보다 강한 해리 상수, 더욱 더 바람직하게는 10-7 또는 이보다 강한 해리 상수로의 결합)으로 인해 활성이거나 또는 바람직하게는 구조적으로 활성이어서 항-포스포타이로신 항체로 증명할 수 있는 바와 같이 여전히 FRS-2를 인산화시켜 이의 포스포타이로신 형태를 산출시킬 수 있고, 각각 FGF-R1, FGF-R2, FGF-R3 또는 FGF-R4 중 하나와 비교했을 때 70％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 적어도 85％ 이상 동일하며, 더욱 더 바람직하게는 90％ 이상 동일하고, 더 더욱 바람직하게는 95％ 이상 동일하고, 매우 바람직하게는 98％ 이상 동일한 서열을 포함하는, 바람직하게는 이러한 서열로 구성되는 FGF-R의 모든 형태 또는 변이체를 포함하고, 용어 FGF-R 기질 2 (FRS-2), 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편이 여전히 FGF-R1, FGF-R2, FGF-R3 및/또는 FGF-R4에 결합할 수 있는 FRS-2의 형태, 특히 FRS-2α 또는 FRS-2β, 또는 포스포타이로신을 포함하는 이의 단편에 대해 70％ 이상 동일하고, 더욱 바람직하게는 적어도 약 85％ 이상 동일하며, 더욱 더 바람직하게는 약 90％ 이상 동일하고, 더 더욱 바람직하게는 약 95％ 이상 동일하고, 매우 바람직하게는 98％ 이상 동일한 FRS-2 변이체를 포함하 는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 부분적으로 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편을 정제한 후, 인산화 형태의 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 단편, 특히 이들 내부에 포함된 포스포타이로신을 인식할 수 있는 생체특이적(biospecific) 인식 시약으로의 인산화, 특히 타이로신 인산화의 존재 또는 양을 결정하는 것을 포함하고, 이때 상기 생체특이적 인식 시약 또는 투여되어 상기 생체특이적 인식 시약에 결합할 수 있는 추가적인 생체특이적 인식 분자를 표지하여 투여함으로써 인산화 형태의 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 단편이 검출되도록 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 포스포타이로신-포함 FRS-2, 이의 포스포타이로신 포함 변이체 또는 이의 포스포타이로신 포함 단편이 섬유모세포 성장 인자 수용체 (FGF-R) 또는 이의 변이체가 연관되는 신호전달의 조정, 특히 억제에 대한 감수성을 나타내는 세포를 지시하는 바이오마커로 사용되고, 바람직하게는 상기 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 단편 내의 타이로신 인산화의 존재 또는 양을 결정하기 위한 항-포스포타이로신 항체 형태의 생체특이적 인식 시약을 사용하는 것을 포함하는 방법.
  8. FRS-2 내의 포스포타이로신을 인식할 수 있는 생체특이적 인식 시약으로 생 물학적 샘플로부터의 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편 내의 인산화된 타이로신의 존재를 결정하는 것을 포함하고, 이때 인산화의 양성 발견은 과다활성 FGF-R 신호전달, 특히 구성적으로 활성화된 FGF-R 신호전달에 대한 지표가 되는 것인, 과다활성 FGF-R 신호전달, 특히 구성적으로 활성화된 FGF-R 신호전달을 나타내는 세포, 조직 또는 기관, 특히 FGF-R 또는 이의 변이체의 억제제로 치료가능하고 이같은 억제제에 대해 응답성인 세포, 조직 또는 기관에 대한 바이오마커로서 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편에서의 인산화 확인을 사용하는 방법 또는 이러한 인산화 확인의 용도.
  9. 제8항에 있어서, FGF-R 또는 이의 변이체가 연관되는 신호전달의 억제제에 대해 응답성인 세포 또는 조직 또는 기관을 비-응답성인 세포 또는 조직 또는 기관으로부터 구별하기 위해, FGF-R 또는 이의 변이체에 의해 매개되는 신호전달의 억제제의 부재 및 존재 하에서의 타이로신 인산화 상태를 비교하는 것을 추가로 포함하고, 이때 억제제의 존재 하에서의 타이로신 인산화에서의 감소는 이같은 응답성에 대한 지표가 되는 것인 방법.
  10. 억제에 대한 감수성에 대한 바이오마커로서 생물학적 샘플 내의 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편의 인산화 상태를 결정하기 위한 수단을 포함하는, 섬유모세포 성장 인자 수용체 (FGF-R)가 연관되는 신호전달의 조정, 특히 억제에 대해 감수성인 생물학적 샘플로부터의 세포를 확인하는 것에서 사용하기 위한 인산화 형태의 FRS-2 또는 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편을 인식할 수 있는 생체특이적 인식 시약 및 FGF-R 또는 이의 변이체에 대한 생체특이적 인식 시약을 포함하는 키트.
  11. 제10항에 있어서, 섬유모세포 성장 인자 수용체 (FGF-R)가 연관되는 신호전달의 조정, 특히 억제에 대해 감수성인 세포를 세포 또는 조직 또는 기관으로부터 확인하는 것에서 사용하기 위한 인산화 형태의 FRS-2 또는 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편을 인식할 수 있는 생체특이적 인식 시약 (특히, 항-포스포타이로신 항체)을 인산화 상태를 결정하기 위한 수단으로서 포함하고, FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편의 인산화 상태를, 특히 FGF-R 신호전달의 과다활성, 더욱 특히 FGF-R 신호전달의 구성적 활성화를 결정하기 위해, 결정하는 것을 포함하는 키트.
  12. 섬유모세포 성장 인자 수용체 (FGF-R) 또는 이의 변이체가 연관되는 신호전달의 조정, 특히 억제에 대한 감수성을 나타내는 세포, 특히 FGF-R 신호전달의 과다활성, 더욱 특히 구성적 활성화를 나타내는 세포의 확인에서 사용하기 위한, 인산화 형태의 FRS-2 또는 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편을 인식할 수 있는 생체특이적 인식 시약.
  13. 섬유모세포 성장 인자 수용체 (FGF-R) 또는 이의 변이체가 연관되는 신호전 달의 조정에 대해 감수성인 세포를 생물학적 샘플로부터의 세포 또는 조직으로부터 확인하기 위한 진단제의 제작을 위한 것이고, 상기 확인이 FGF-R 기질 2 (FRS-2), 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편의 인산화 상태를 결정하는 것을 포함하는 것인, 인산화된 FRS-2 또는 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편을 인식할 수 있는 생체특이적 인식 시약의 용도.
  14. 제13항에 있어서, 생체특이적 인식 시약이 타이로신 인산화 형태의 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편을 확인할 수 있고, 더욱 바람직하게는 항-포스포타이로신 항체인 용도.
  15. a) 단리된 세포 또는 조직의 샘플을 FGF-R 억제제의 부재 하에 배지에 적용하고, 병렬 샘플을 FGF의 부재 하에 FGF-R 수용체 억제제의 존재 하에 적용하는 단계,
    b) 상기 샘플들로부터 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편을 적어도 부분적으로 정제하는 단계;
    c) 상기 샘플들 내의 FRS-2의 인산화 상태를 결정하는 단계; 및
    d) 억제제로 처리된 샘플에서의 인산화 상태를 억제제로 처리되지 않은 샘플에서의 인산화 상태와 비교하고, 이때 억제제의 존재 하에서의 인산화의 감소는 FGF-R 신호전달의 과다활성을 포함하는 상태의 치료에서 유용한 억제제를 확인하는데 적합한 세포에 대한 지표가 되는 것인 단계
    를 포함하는, 증식을 위해, 특히 구성적인, FGF 수용체 활성화를 필요로 하면서 증식하고, FGF-R 신호전달의 억제에 대해 응답성인 세포를 확인하는 방법.
  16. 환자로부터의 생물학적 샘플 내의 인산화 형태의 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편을 확인하는 것을 포함하는, FGF-R 신호전달의 억제제로의 치료에 대해 응답성인 질환을 진단하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 타이로신 인산화 형태의 FRS-2, 이의 변이체 또는 이의 타이로신 포함 단편을 인식할 수 있는 생체특이적 인식 시약, 특히 항-포스포타이로신 항체로 확인이 일어나는 방법.
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