JP2010518869A - 線維芽細胞増殖因子受容体またはその変異体により媒介されるシグナリングの調整に対して感受性を示す細胞の同定方法 - Google Patents
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Abstract
Description
種々の型の癌において変異活性化FGF−R3に関する累積証拠がある。
さらに、甲状腺癌の症例では、FGF−Rの関与を実証できた。
驚くべきことに、FRS−2の(特にチロシン)リン酸化状態が、記載した(特に増殖性)疾患および障害に対するかかる調整性化合物の有効性に関するバイオマーカーとして働き得ることが本発明により見出された:特にFGF−Rシグナリングの阻止に対して感受性がある細胞においてはFRS−2が高度にチロシンリン酸化されているが、増殖に関してFGF−Rに非依存的である細胞系ではされていないことが示された。
第1の態様では本発明は、生物学的試料中のFGF−R基質2(FRS−2)、その変異体またはチロシン含有フラグメントのチロシンリン酸化状態を、阻止に対するかかる感受性に関するバイオマーカーとして決定することを含む、線維芽細胞増殖因子受容体(FGF−R)またはその変異体が関与するシグナリングの調整、特に阻止に対して感受性を示す(好ましくは、例えば細胞培養物または細胞懸濁液中で単離された)細胞(単離された細胞、または単離された組織および/もしくは器官からの、一般的には生物学的試料からの、最も好ましくは患者からの細胞を含む)の同定の方法に関する。
a)FRS−2または変異体またはチロシン含有フラグメントを認識することができる生体分子特異的認識試薬と生物学的試料を接触させ;そして
b)該FRS−2、その変異体またはそのチロシン含有フラグメントにおけるチロシンのリン酸化状態を、該リン酸化状態を認識することができる生体分子特異的認識試薬を用いて測定し;そして
c)リン酸化状態を、線維芽細胞増殖因子受容体(FGF−R)またはその変異体(特に活性亢進性、例えば構成的活性形態)が関与するシグナリングの阻止に対する感受性および/または症状状態および/または処置有効性と相関させること;
を含む、線維芽細胞増殖因子受容体(FGF−R)またはその変異体が関与するシグナリングの調整、特に阻止に対して感受性を示す(好ましくは、例えば細胞培養物または細胞懸濁液中で単離された)細胞(単離された細胞、または単離された組織および/もしくは器官からの、一般的には生物学的試料からの、特に患者からの細胞を含む)の同定のための方法に関する。
a)単離された細胞または組織の試料をFGF−R阻害剤の不在下で培地に、そして並行試料をFGF−R受容体阻害剤の存在下、FGFの不在下に付し;
b)該試料からFRS−2、その変異体またはチロシン含有フラグメントを少なくとも部分的に精製し;
c)該試料中のFRS−2のリン酸化状態を決定し;そして
d)処理された試料中のリン酸化状態を、阻害剤で処理されていない試料中のものと比較することを含み、阻害剤の存在下でのリン酸化の低下は、阻害剤を同定するのに適切である細胞が、FGF−Rシグナリングの活性亢進を含む症状の処置に有用であることを示している;
増殖のために特に構成的なFGF受容体活性化を必要として増殖し、そしてFGF−Rシグナリングの阻止に応答する細胞を同定するための方法に関する。
軟骨無形性症、最も一般的な形態であるヒト低身長症、頭蓋骨癒合症症候群および低身長症症候群として分類される骨格異形成、例えば軟骨低形成症、発育遅延および黒色表皮腫を伴う重篤な軟骨無形性症(SADDAN)、ならびに致死性骨異形成症、Muenke冠状頭蓋骨癒合症、黒色表皮腫を伴うクルーゾン症候群、常染色体優性低リン血症性くる病、X染色体連鎖低リン血症性くる病(XLH)、腫瘍誘発性骨軟化症、骨の線維性骨異形成症を含む骨格異常。
FGF−R1に関しては;
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?val=M34185;にて与えられるタンパク質配列(受託番号M34185);
FGF−R2に関しては;
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=108773805にて与えられるタンパク質配列(受託番号NM 022970_NM_022969);
FGF−R3に関しては;
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=13112047にて与えられるタンパク質配列(受託番号NM_022965);および
FGF−R4に関しては;
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore&val=47524176に示されるタンパク質配列(受託番号NM_022963)である。
以下では、本発明のいくつかの好ましい態様に言及し、前記の通りの他の好ましい態様は、態様を記載する1個以上の用語を、前記または実施例において与えられた定義により置き換えることにより得ることができる。
a)FRS−2または変異体またはそのチロシン含有フラグメントを認識することができる生体分子特異的認識試薬と生物学的試料とを接触させ;そして
b)ホスホチロシン生体分子特異的認識試薬を用いてチロシンのリン酸化状態を決定し;そして
c)リン酸化状態を、線維芽細胞増殖因子受容体(FGF−R)が関与するシグナリングの阻止に対する感受性および/または症状状態および/または処置の有効性と相関させること;
を含む。
a)単離された細胞または組織の試料をFGF−R阻害剤の不在下で培地に、そして並行試料をFGF−R受容体阻害剤の存在下、FGFの不在下で付し;
b)該試料からFRS−2、その変異体またはそのチロシン含有フラグメントを少なくとも部分的に精製し;
c)該試料中のFRS−2のリン酸化状態を決定し;そして
d)処理された試料中のリン酸化状態を、阻害剤で処理されていない試料中のものと比較することを含み、阻害剤の存在下でのリン酸化の低下は、阻害剤を同定するのに適切である細胞が、FGF−Rシグナリングの活性亢進を含む症状の処置に有用であることを示しており;
ここで工程c)におけるリン酸化状態の決定を、FRS−2、その変異体またはそのチロシン含有フラグメントのチロシンリン酸化形態を同定することができる生体分子特異的認識試薬により、さらに好ましくは抗ホスホチロシン抗体により行う。
本発明はまた要旨の内容にも関し、それ故にそれを出典明示により本明細書の一部とする。
1 方法
1.1 細胞系および細胞培養条件
(ATCC:American Type Culture Collection, LGC Promochem GmbH, Mercatorstr. 51, Wesel, Germany またはhttp://www.lgcpromochem-atcc.com/を介して利用可能;
DSMZ:Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH=German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Germany)。
RT4:再発性膀胱癌から樹立されたヒト膀胱移行上皮癌、組織学的等級G1、段階T2(Masters et al., loc. cit. (1986))。細胞をATCC #HTB-2から入手する。
VMCUB−1:原発性膀胱癌から樹立されたヒト膀胱移行上皮癌。段階および組織学的等級は記録されていない(Masters et al., loc. cit. (1986))。細胞をDSMZ ACC#400から入手する。
J82:原発性膀胱癌から樹立されたヒト膀胱移行上皮癌、組織学的等級G3、段階T3(Masters et al., loc. cit. (1986))。細胞をATCC #HTB-1から入手する。
HT1197:再発性膀胱癌から樹立されたヒト膀胱移行上皮癌、組織学的等級G4、段階T2(Masters et al., loc. cit. (1986))。細胞をATCC #CRL-1473から入手する。
1%L−グルタミン(Amimed #5-10K00-H)、1%MEM NEAA(MEM非必須アミノ酸溶液)(Amimed #5-13K00-H)、1%ピルビン酸Na(Amimed #5-60F00-H)および10%FCS(Gibco, Invitrogen AG, Basel, Schweiz, #10082-147)を補充したMEM EBS(Earls Basal Saltsを含む最小必須培地)(Amimed, Allschwil, Switzerland, #1-31F0-I)中で膀胱癌細胞系を成長させる。
1%L−グルタミン(Amimed #5-10K00-H)、2%FCS(Gibco #10082-147)、0.1%BSA(Gibco #15260-037)、10mM HEPES(Gibco #15630-56)、10μM T3(Sigma, Sigma−Aldrich, Inc., St. Louis, MO, USA, #T6397)、1μg/mlヒドロコルチゾン(Sigma #H0888)、インスリン−トランスフェリン−セレン−xサプリメント(Gibco #51500-056)を補充したHAM'S F12(Amimed #1-14F01-I)中でSUM52細胞を成長させる。
KMS11細胞はDr. T Otsuki(Kawasaki Medical School, Okayama, Japan)から提供される。双方の細胞系はt(4,14)転座を担持し、そしてFGF−R3の変異した、構成的に活性化された形態を発現することが報告されている。とりわけ、OPM2細胞はキナーゼドメインのATP結合ポケットに変異を宿し、その結果650位置のリジンのグルタミン酸への変化を招く。KMS11細胞は受容体の細胞外ドメインに変異を宿し、373位置のチロシンをシステインに変化させる。1%L−グルタミン(Amimed #5-10K00-H)および20%FCS(Gibco #10082-147)を補充したRPMI1640(Gibco #21875)中で双方の細胞系を成長させる。
この報告で使用された抗体を表1に列挙する:
IP:免疫沈降;
P−tyr:ホスホチロシン
Santa Cruz:Sant Cruz Biotechnology, Inc.
Upstate Biotechnology:Upstate Biotechnology, Inc.、現在 Millipore Corp., Billerica, MA, USAの一部。
Cell Signaling: Cell Signaling Technology, Inc., Boston, MA, USA.
Amersham:Amersham plc, Buckinhamshire, United Kingdom、現在GE Healthcareの一部。
Parke DavisからのFGF−R特異的阻害剤、PD173074(本明細書では阻害剤1とも称される)(Mohammadi et al., EMBO J. 17:5896-5904参照)、その特異性および効力を確認する。それは式:
プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含有する1%Triton 抽出バッファー(「溶解バッファー」50mM Tris pH7.5、150mM NaCl、1mM EGTA、5mM EDTA、1%Triton、2mM バナジウム酸Na、1mM PMSFおよびプロテアーゼ阻止カクテル(Hoffmann−LaRoche, Basel, Switzerland, #1187358001))中で細胞を可溶化する。ライゼートを12000×gで15分間の遠心により清澄化し、そしてDCタンパク質アッセイ試薬(Bio Rad, Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA, #500-0116)(Coomassie Blue(登録商標)(ICI)を用いるBradford, M.の方法に基づくアッセイ、Anal. Biochem., 72:248(1976)参照)および標準ウシ血清アルブミン(BSA)を用いてタンパク質濃度を決定する。
2.1 増殖に関してFGF−Rシグナリングに依存的な癌細胞系においてFRS−2はチロシンリン酸化される
FRS−2はFGF−Rの基質であるので、耐性細胞系と対比して、FGF−R阻害剤に対して感受性があり、そして恐らく高いFGF−R活性を有する細胞系においてFRS−2のホスホチロシンレベルを試験した。
ND:決定されなかった
FRS−2ホスホチロシンレベルは、FGF−R阻害剤に対して感受性のある全ての細胞系で上昇するが、抵抗性細胞系J82、HT1197、VMCUB1では検出されないか、または非常に低い(図1)。
特異的FGF−R−阻害剤、阻害剤1およびFGF−R阻害剤、阻害剤2は、その化合物により成長阻止されることが示されている癌細胞系においてFRS−2チロシンリン酸化を無効にする。この結果により、これらの細胞系では、FGF−RがFRS−2のリン酸化の原因となることが示される(図2)。
示された癌細胞系を図2の説明文および図2において示されるように処理する。注:FRS−2タンパク質はしばしば、MAPKによるセリン/スレオニン残基のリン酸化により引き起こされる異なる電気泳動移動度シフトを示す(Lax et al. (2002))。
FGF−Rに関係しない他のRTKの活性化もまたFRS−2リン酸化を調整し得るかどうかを試験する。EGFおよびインスリンはRT112細胞におけるMAPKを活性化するが、しかしながらホスホFRS−2を誘起することはできない。同様にEGFはRT4細胞においてpMAPKを強く誘起するが、ホスホFRS−2を誘起しない。予期されるように、aFGFはその細胞系においてFRS−2ホスホチロシンを効率的に増大させる(図3)。
FRS−2はFGF−Rファミリーメンバーの下流基質であり、そしてFGF−Rシグナル伝達に関与する複数のタンパク質に関するドッキング分子として非常に重大な役割を果たすことが示されている。
ホスホFRS−2の著明なレベル上昇を提示し、そしてFGF−R阻止に対して非常に感受性が高いヒト癌細胞系のパネルを同定し、それはこれらの系における活性なFGF−R−FRS−2シグナリングを示唆している。これを支持して、特異的FGF−R阻害剤、阻害剤1はFRS−2リン酸化を完全に阻止する。加えてFGF−Rリガンド、aFGFのみがFRS−2リン酸化をさらに増大させることができるが、EGF−RまたはINS−Rリガンドはできない。
さらに阻害剤を用いる実験のためのその有用性に関して細胞系を選択することが可能であり、故に潜在的薬物のスクリーニングのための適切な試験系を確立することが可能になる。
Claims (17)
- 線維芽細胞増殖因子受容体(FGF−R)またはその変異体が関与するシグナリングの調整、特に阻止に対する感受性を示す細胞の同定であって、生物学的試料中のFGF−R基質2(FRS−2)、その変異体またはチロシン含有フラグメントのリン酸化状態をかかる阻止に対する感受性に関するバイオマーカーとして決定することを含む、方法。
- FRS−2のチロシンのリン酸化状態をバイオマーカーとして使用する、請求項1に記載の方法。
- モジュレーターの不在下でのFRS−2またはその変異体における特にチロシンのリン酸化の陽性の所見を線維芽細胞増殖因子受容体(FGF−R)またはその変異体が関与するシグナリングの阻止がシグナリングに影響を及ぼす、特にシグナリングを阻止するために有効であり得ることの指標として使用する、請求項1または2に記載の方法。
- 阻害剤の投与に対して応答する細胞を同定するために線維芽細胞増殖因子受容体(FGF−R)またはその変異体が関与するシグナリングの阻害剤の存在下および不在下でインキュベートした後の生物学的試料中のFRS−2、その変異体またはそのチロシン含有フラグメントのリン酸化状態を比較し、ここでリン酸化の阻止の所見はかかる応答が予期されるはずである指標と見なす、請求項3に記載の方法。
- FGF−Rまたは変異体なる用語が、依然、1種以上の線維芽細胞増殖因子への好ましくは解離定数が10−3もしくはそれより強い、さらに好ましくは10−5もしくはそれより強い、なおさらに好ましくは10−7もしくはそれより強い結合のために活性であるか、または好ましくは構成的に活性であり、FRS−2をリン酸化して抗ホスホチロシン抗体で証明できる、そのホスホチロシン形態を生じることができ、そしてFGF−R1、FGF−R2、FGF−R3またはFGF−R4の各々のうちの1つと比較した場合、70%以上同一、さらに好ましくは少なくとも85%以上同一、なおさらに好ましくは90%以上同一、その上さらに好ましいのは95%以上同一、非常に好ましいのは98%以上同一である配列を含む、好ましくはそれからなるFGF−Rの全てのこれらの形態または変異体を含み、そしてここでFGF−R基質2(FRS−2)、その変異体またはそのチロシン含有フラグメントなる用語はFRS−2αまたはFRS−2βまたはそのホスホチロシン含有フラグメントに70%以上同一、さらに好ましくは少なくとも約85%以上同一、なおさらに好ましくは約90%以上同一、その上さらに好ましいのは約95%以上同一、非常に好ましいのは98%以上同一であるFGF−R1、FGF−R2、FGF−R3および/またはFGF−R4、特にFRS−2変異体に依然結合することができるFRS−2のこれらの形態を含む、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- FRS−2、その変異体またはそのチロシン含有フラグメントを少なくとも部分的に精製し、そして次にFRS−2の、変異体の、またはそのフラグメントのリン酸化形態、特にそこに包含されるホスホチロシンを認識することができる生体分子特異的認識試薬でリン酸化、特にチロシンリン酸化の存在または量を決定することを含み、ここで該生体分子特異的認識試薬または、該生体分子特異的認識試薬に結合することができる投与されるさらなる生体分子特異的認識分子のいずれかを標識し、そして投与し、故にFRS−2の、変異体の、またはそのフラグメントのリン酸化形態の検出を可能にする、請求項1から5のいずれかに記載の方法。
- ホスホチロシンを含むFRS−2、ホスホチロシンを含むその変異体またはそのホスホチロシン含有フラグメントを、線維芽細胞増殖因子受容体(FGF−R)またはその変異体が関与するシグナリングの調整、特に阻止に対して感受性を示す細胞の指標となるバイオマーカーとして使用し、そして該FRS−2、変異体またはそのフラグメントにおけるチロシンリン酸化の存在または量を決定するために好ましくは抗ホスホチロシン抗体の形態の生体分子特異的認識試薬を使用することを含む、請求項1から6のいずれかに記載の方法。
- FRS−2中のホスホチロシンを認識することができる生体分子特異的認識試薬を用いて生物学的試料からのFRS−2におけるその変異体における、またはそのチロシン含有フラグメントにおけるリン酸化チロシンの存在を決定することを含み、リン酸化の陽性の所見は活性亢進性の、特に構成的に活性化されたFGF−Rシグナリングを示す活性亢進性の、特に構成的に活性化されたFGF−Rシグナリングを示し、特にFGF−Rまたはその変異体の阻害剤で処置でき、そしてかかる阻害剤に応答する細胞、組織または器官に関するバイオマーカーとしてFRS−2、その変異体またはそのチロシン含有フラグメントにおけるリン酸化同定を使用する、方法またはその使用。
- さらにFGF−Rまたはその変異体が関与するシグナリングの阻害剤に対して応答性である細胞または組織または器官を、非応答性であるかかる細胞または組織または器官から区別するためにFGF−Rまたはその変異体により媒介されるシグナリングの阻害剤の不在下および存在下のチロシンリン酸化状態を比較することを含み、阻害剤の存在下でのチロシンリン酸化の低下はかかる応答性を示す、請求項8に記載の方法。
- 生物学的試料中のFRS−2、その変異体またはそのチロシン含有フラグメントのリン酸化状態を阻止に対するかかる感受性に関するバイオマーカーとして決定するための手段を含む、線維芽細胞増殖因子受容体(FGF−R)が関与するシグナリングの調整、特に阻止に対して感受性がある生物学的試料からの細胞の同定において使用するための、FGF−Rまたはその変異体に関する生体分子特異的認識試薬およびFRS−2の、または変異体の、またはそのチロシン含有フラグメントのリン酸化形態を認識することができる生体分子特異的認識試薬を含む、キット。
- 線維芽細胞増殖因子受容体(FGF−R)が関与するシグナリングの調整、特に阻止に対して感受性がある細胞または組織または器官からの細胞の同定において使用するために、リン酸化状態を決定するための手段としてFRS−2の、または変異体の、またはそのチロシン含有フラグメントのリン酸化形態(特に抗ホスホチロシン抗体)を認識することができる生体分子特異的認識試薬を含み、特にFGF−Rシグナリングの活性亢進、さらに特にFGF−Rシグナリングの構成的活性化を決定することを可能にするために、FRS−2の、その変異体の、またはそのチロシン含有フラグメントのリン酸化状態を決定することを含む、請求項10に記載のキット。
- 線維芽細胞増殖因子受容体(FGF−R)またはその変異体が関与するシグナリングの調整、特に阻止に対して感受性を示す細胞、特にFGF−Rシグナリングの活性亢進、さらに特に構成的活性化を示す細胞の同定において使用するためのFRS−2の、または変異体の、またはそのチロシン含有フラグメントのリン酸化形態を認識することができる生体分子特異的認識試薬。
- 同定がFGF−R基質2(FRS−2)、その変異体またはそのチロシン含有フラグメントのリン酸化状態を決定することを含む、線維芽細胞増殖因子受容体(FGF−R)またはその変異体が関与するシグナリングの調整に感受性がある生物学的試料からの細胞または組織からの細胞の同定のための診断薬の製造のためのリン酸化FRS−2または変異体またはそのチロシン含有フラグメントを認識することができる生体分子特異的認識試薬の使用。
- 生体分子特異的認識試薬はFRS−2、その変異体またはそのチロシン含有フラグメントのチロシンリン酸化形態を同定することができ、さらに好ましくは抗ホスホチロシン抗体である、請求項13に記載の使用。
- a)単離された細胞または組織の試料をFGF−R阻害剤の不在下で培地に、そして並行試料をFGF−R受容体阻害剤の存在下、FGFの不在下で付し;
b)該試料からFRS−2、その変異体またはそのチロシン含有フラグメントを少なくとも部分的に精製し;
c)該試料中のFRS−2のリン酸化状態を決定し;そして
d)処理された試料中のリン酸化状態を、阻害剤で処理されていない試料中のものと比較することを含み、阻害剤の存在下でのリン酸化の低下は、阻害剤を同定するのに適切である細胞が、FGF−Rシグナリングの活性亢進を含む症状の処置に有用であることを示す;
増殖のために特に構成的なFGF受容体活性化を必要として増殖し、そしてFGF−Rシグナリングの阻止に応答する細胞を同定するための方法。 - 患者からの生物学的試料中のFRS−2の、その変異体の、またはそのチロシン含有フラグメントのリン酸化形態を同定することを含む、FGF−Rシグナリングの阻害剤での処置に応答する疾患を診断する方法。
- FRS−2の、その変異体の、またはそのチロシン含有フラグメントのチロシンリン酸化形態を認識することができる生体分子特異的認識試薬、特に抗ホスホチロシン抗体を用いて同定を行う、請求項16に記載の方法。
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