KR20090121918A

KR20090121918A - 벼의 잡종퇴화에 관여하는 상보적인 열성 유전자 및스크리닝 마커

Info

Publication number: KR20090121918A
Application number: KR1020080048076A
Authority: KR
Inventors: 고희종; 강문수; 추상호; 박일화; 이주현; 교영이
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2008-05-23
Filing date: 2008-05-23
Publication date: 2009-11-26
Also published as: KR100981042B1

Abstract

본 발명은 벼의 잡종퇴화 (hybrid breakdown)에 관여하는 상보적인 열성 유전자, 상기 유전자에 특이적인 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는 벼의 잡종퇴화를 스크리닝하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 벼의 잡종퇴화를 스크리닝하기 위한 키트, 상기 유전자를 포함하는 벼의 잡종퇴화를 스크리닝하기 위한 마이크로어레이, 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 벼의 잡종퇴화를 스크리닝하기 위한 방법에 관한 것이다.

잡종퇴화, 프라이머 세트, 키트, 마이크로어레이, 스크리닝

Description

벼의 잡종퇴화에 관여하는 상보적인 열성 유전자 및 스크리닝 마커{Complementary recessive genes involved in rice hybrid breakdown and screening marker thereof}

본 발명은 벼의 잡종퇴화에 관여하는 상보적인 열성 유전자 및 스크리닝 마커에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 벼의 잡종퇴화 (hybrid breakdown)에 관여하는 상보적인 열성 유전자, 상기 유전자에 특이적인 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는 벼의 잡종퇴화를 스크리닝하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 벼의 잡종퇴화를 스크리닝하기 위한 키트, 상기 유전자를 포함하는 벼의 잡종퇴화를 스크리닝하기 위한 마이크로어레이, 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 벼의 잡종퇴화를 스크리닝하기 위한 방법에 관한 것이다.

잡종퇴화(Hybrid breakdown, HB)는 F₂또는 종간(interspecific) 또는 아종간(intersubspecific) 교잡의 후세대에서만 관찰되는 번식 장애이다. 벼에서, HB는 분얼수(tiller numbers)의 감소, 줄기(short culms) 또는 이삭 또는 영화(panicles)의 성장 지연, 잎의 백화 또는 괴사, 부실한 종자 맺음 및 뿌리 성장 지연을 야기한다. 이러한 현상은 교잡육종에서 우량 조환형 출현의 저해 요인으로 간주된다. HB는 양쪽 부모로부터 주어진 유전자의 상호작용으로 조절된다고 생각되었다. 처음으로 벼에서 이런 현상에 대한 보고가 있은 후, HB는 대개 인접하지 않은 위치에 존재하는 Hwa1와 Hwa2, hwd1와 hwd2, hwe1와 hwe2, hwg1와 hwg2, 및 hbd2와 hbd3의 상보적 상호작용에 의해 조절된다는 유전적 분석이 제안되어 왔다. 이러한 유전자들 중에서, Sasanishiki(japonica)의 염색체 10번에 위치한 hwd1 및 Col. No. 15 (Thailand upland rice)의 염색체 7번에 위치한 hwd2 , Asominori (자포니카)의 염색체 12번에 위치한 hwe1 및 IR24 (인디카)의 염색체 1번에 위치한 hwe2 , ARC10303 (인디카)의 염색체 6번에 위치한 hwg1 (t) 및 Sasanishiki (자포니카)의 염색체 11번에 위치한 hwg2 (t), Habataki (indica)의 염색체 2번에 위치한 hbd2 및 Sasanishiki (자포니카) 및 Koshihikari (자포니카)의 염색체 11번에 위치한 hbd3는 각각 맵핑되었다. 이러한 상호작용을 설명하기 위해 우위적 상호작용(epistatic interactions)이 모델로서 제안되어 왔다 (Kubo T, Yoshimura A (2005) Theor Appl Genet 110: 346-355). HB는 교배 또는 수정 후에 일어나는 생식 장애 중 하나로 잡종 사멸(hybrid inviability) 또는 불임을 야기한다. 교배 또는 수정을 방해하는 접합 전 생식 장애와 같이, 이러한 수정 후 생식 장애는 종분화에서 중요한 기능이 있다. 수정 후 생식장애의 메카니즘은 잡종 사멸/불임 현상을 통하여 초파리, 쥐 및 식물체와 같은 많은 생물에서 연구되어 왔다. 수정 후 생식 장애에 대한 연구는 다른 종간(interspecies) 또는 아종간(intersubspecies) 유래의 유용한 유전자를 갖는 새로운 변종(varieties)의 개발을 모색하기 위한 육종 프로 그램 뿐만 아니라, 수정 후 생식 장애로 수행된 분기된 집단과 가속화된 유전적 분화를 가로지르는 제한된 유전자 흐름 때문에 발생한 종분화의 진화적인 단서를 제공하는데 있어서 중요하다 (Bomblies K, Weigel D (2007) Nat Rev Genet 8: 382-393).

Bateson-Dobzhansky-Muller (BDM) 모델로 알려진, 잡종 사멸(예를 들면, 잡종 괴사, 잡종 약세, 및 HB)의 발생에 대한 상보성 유전자 모델은 Bateson에 의해 최초로 제안되었고, Dobzhansky와 Muller가 그 뒤를 이었다. 이러한 모델은 핵 게놈의 다른 영역 사이에서의 부정적 상호작용(negative interactions) 뿐만 아니라 핵 게놈의 하나 또는 그 이상의 영역과 엽록체 또는 미토콘드리아 게놈과 같은 세포질의 몇몇의 구성요소 사이의 상호작용으로 인한 잡종 부적합성 현상을 설명할 수 있다. 그러나, 이러한 모델은 잡종 백그라운드로 결합될 때 제시된 혈통 내의 중성 (또는 유리한) 돌연변이가 강력하게 불리한 생존력을 만들어 내는지 설명을 못한다 (Burke J, Arnold ML (2001) Annu Rev Genet 35: 31-52). Lynch와 Force (Lynch M, Force AG (2000) Am Nat 156: 590-605)은 복제된 한쌍의 기능적 유전자가 완전히 소실된 잡종 치사의 메카니즘에 대한 다른 모델을 제안하였는데, 재조합 잡종 자손은 결손 유전자를 갖거나 죽을 수도 있는 반면에 그들의 부모는 정상과 결핍 유전자 카피를 각각 하나씩 갖는 정상 부모인 특성이 있다. 단지 잡종 치사를 야기하는 BDM 유전자의 하나의 세트만이 완전하게 초파리에서 클로닝되었다. 드로소필라 시뮬란스(Drosophila simulans)에서 기능적으로 분기된 Lhr (lethal hybrid rescue)은 F₁잡종 웅성에서 치사를 야기하는 드로소필라 멜라노가스터 Hmr (Drosophila melanogaster hybrid male rescue) 복제를 억제한다. 애기장대에서, 자가 면역 반응은 BDM 모델의 예로서 제안되어왔는데, 계속된 자가면역 반응은 하나의 부모로부터 유전된 NB - LRR 질병 저항 유전자와 다른 부모로부터 유전된 알려지지 않은 유전자 사이의 유전자 상호작용에 의해 잎의 괴사를 야기하기 위해 활성화된다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 인디카 (indica) 변종인 Milyang 23 및 자포니카 (japonica) 변종인 Tong 88-7 사이의 교잡으로부터 유래된 재조합 순계 집단에서 잡종퇴화 (hybrid breakdown; HB) 식물을 동정하고, 유전 분석 및 지도 기재 클로닝을 수행하여 잡종퇴화의 2가지 후보 유전자의 서열을 결정하였으며, 정상 및 HB 식물 사이의 서열 차이를 이용하여 후보 유전자에 대한 유전자 특이적 DNA 마커를 개발하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 벼의 잡종퇴화 (hybrid breakdown)에 관여하는 상보적인 열성 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자에 특이적인 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는 벼의 잡종퇴화를 스크리닝하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 벼의 잡종퇴화를 스크리닝하기 위한 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 벼의 잡종퇴화를 스크리닝하기 위한 마이크로어레이를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 벼의 잡종퇴화를 스크리닝하기 위한 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 상보적인 열성 유전자 및 상기 유전자에 특이적인 마커를 이용하면, 벼의 잡종퇴화를 효과적으로 스크리닝할 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 벼의 잡종퇴화 (hybrid breakdown)에 관여하는 상보적인 열성 유전자를 제공한다. 상기 유전자는 hwh1 (hybrid weakness h1) 및 hwh2 (hybrid weakness h2)이며, 벼의 잡종퇴화는 상기 2가지 열성 유전자의 상보적인(complemetary) 작용에 의해 조절된다. hwh1 유전자는 정밀 맵핑 결과, 2번 염색체의 short arm에 위치하며, hwh2 유전자는 정밀 맵핑 결과, 11번 염색체의 long arm의 동원체(centromere) 영역 근처에 위치한다. 또한, 상기 열성 유전자 hwh1 는 가상적인 글루코오스-메탄올-콜린 산화환원효소를 코딩하며, Hwh1 과 비교하여 하나의 아미노산 변화가 있으며, hwh2 유전자는 가상적인 헥소오스 트랜스포터를 코딩하며, Hwh2 와 비교하여 6개의 아미노산이 삽입되어 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 벼의 잡종퇴화는 인디카 (indica) 변종인 Milyang 23 및 자포니카 (japonica) 변종인 Tong 88-7 사이의 교잡으로부터 유래된 재조합 순계 집단에서 발생된 것일 수 있다.

상기 열성 유전자 hwh1 및 hwh2는 각각 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 변이체는 염기 서열은 변화되지만, 서열번호 1 및 2의 염기 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열이다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1 및 2의 염기 서열 과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.

폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 벼의 잡종퇴화에 관여하는 상보적인 열성 유전자에 특이적인 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는 벼의 잡종퇴화를 스크리닝하기 위한 프라이머 세트를 제공한다. 구체적으로는, 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 세트 (S0299M 마커), 및 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 세트 (S1159H 마커)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는 벼의 잡종퇴화를 스크리닝하기 위한 프라이머 세트를 제공한다. 바람직하게는, 상기 프라이머 세트는 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 세트 (S0299M 마커), 및 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 세트 (S1159H 마커)를 모두 포함하는 프라이머 세트이다.

상기 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 세트는 hwh1 유전자에 특이적이며, 상기 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 세트는 hwh2 유전자에 특이적이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머 세트는 마커와 상호교환하여 사용된다.

본 발명의 마커 S0299M은 서열번호 3 및 서열번호 4의 서열 내의 각각 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드일 수 있다.

또한, 본 발명의 마커 S1159H는 서열번호 5의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드일 수 있으며, 서열번호 6의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있 거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 벼의 잡종퇴화를 스크리닝하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에서, 프라이머 세트는 전술한 바와 같으며, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 중합효소, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 유전자를 포함하는 벼의 잡종퇴화를 스크리닝하기 위한 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, "마이크로어레이"란 기판 상에 폴리뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있는 마이크로어레이를 의미한다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이에 관하여는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있으며, 이들 특허의 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 포함된다. 상기 유전자에 대하여는 상기 기재한 바와 같다.

용어 "기판"은 혼성화 특성을 보유하고, 혼성화의 배경 수준이 낮게 유지되는 조건하에 유전자 프로브가 부착될 수 있는 임의의 기판을 말한다. 통상적으로, 상기 기판은 미세역가(microtiter) 플레이트, 막(예를 들면, 나일론 또는 니트로셀룰로오스) 또는 미세구(비드) 또는 칩일 수 있다. 막에 적용 또는 고정 전에, 핵 산 프로브를 변형시켜 고정화를 촉진시키거나 혼성화 효율을 개선시킬 수 있다. 상기 변형은 단독중합체 테일링(homopolymer tailing), 지방족기, NH₂ 기, SH 기 및 카르복실기와 같은 상이한 반응성 작용기와의 커플링, 또는 바이오틴, 합텐 또는 단백질과의 커플링을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한,

벼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제4항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 벼의 잡종퇴화를 스크리닝하기 위한 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 벼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효 소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

재료 및 방법

식물 재료

두가지 HB 주, RIL-132 및 RIL-166 을 인디카 (indica) 변종인 Milyang 23 (인디카 (indica) x 자포니카 (japonica) 교잡으로 유도된 한국 통일벼로서, 그의 유전자적 성질은 인디카와 유사함) 및 온대 자포니카 변종인 Tong 88-7 (중국 길림성 유래) 사이의 교잡으로부터 단일-종자 적합 (single-seed descent (SSD)) 방법으로 유도한 한 셋트의 166 F₈ 주로 이루어진 재조합 순계 (recombinant inbred lines (RIL))로부터 검출했다. 유전 분석 및 정밀한 맵핑을 위해, Milyang 23 과 Tong 88-7 사이의 교잡에 의한 F₂ 집단, 양쪽 부모에 대한 RIL-166 의 역교잡에 의해 개발된 역교잡 F₂ 집단 (BC₁F₂ 및 BC₃F₂) 및 BC₃F₃ 집단을 이용했다.

표현형 분석

출수일수 (DTH), 간장 (CL), 수장 (PL), 이삭줄기수 (PN), 이삭수 (SN) 및 이삭 임성 (SF) 을 포함하는 작물학적 형질을, 부모의 변종인 RIL-132 및 RIL-166 에서 평가했다. 역교잡 F₂ 식물 (일반적으로는 명확히 구분되는 작물학적 형질을 나타내지 않았음) 을 분류하기 위해, 정상적인 주들과 구별되는 HB 주에 대한 주요 특징으로서 PN 을 이용했다. 모든 역교잡된 F₂ 개체들은, F₃ 주에서의 분리 패턴을 근거로 하여 그들의 표현형을 확인하기 위해, 역교잡된 F₃주를 생산하도록 전진적으로 분화시켰다.

DNA 분석

DNA 는 Causse 등 (Causse et al. (1994) Genetics 138: 1251-1274)의 방법에 따라 맵핑 집단 및 그의 부모 유래의 각 개체의 잎으로부터 추출했다. PCR 은 40 ng 의 주형 DNA, 0.2 μM 의 각 프라이머, 200 μM 의 각 dNTP, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.01% 젤라틴 및 0.5 U 의 Taq DNA 중합효소를 포함하는 20 ㎕ 의 반응 부피에서 수행했다. 증폭은 하기 조건을 이용하는 PTC100 96U Thermocycler (MJ Research, USA) 에서 수행했다: 94℃ 에서 5 분, 이후 94℃ 에서 1 분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 1 분으로 하는 35 회 사이클, 및 72℃ 에 서 5 분의 최종 신장. PCT 산물은 3.0% 아가로스 겔에서 분리했다.

BSA 및 연관 분석 ( linkage analysis )

12 개체의 정상 식물 및 12 개체의 HB 식물을 각각 2 개의 1차 BC₁F₂ 집단에서 선별하고, DNA 를 개별 식물에서 추출하여 BSA(bulked segregant analysis)을 수행했다 (Michelmore et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88: 9828-9832). 12 개 개별 샘플 각각으로부터의 동량의 DNA 를 유전형검사를 위한 단일 집단 샘플로 통합했다. BSA 후, 2 가지 잡종퇴화 유전자(hybrid breakdown gene)를 결정하고, 이웃한 STS (sequence-tagged-site) 및 SSR (simple sequence repeat) 마커를 이용하여 정밀한 맵핑을 수행했다. STS 마커는 인디카 및 자포니카 벼 사이의 DNA 서열에서의 차이를 근거로 한 프라이머를 고안함으로써 개발되었으며, 이는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ (인디카에 대한 것) 및 http://www.rgp.dna.affrc.go.jp/ (자포니카에 대한 것) 에서 이용가능하다. 연관 분석은 MAPMAKER version 3.0 소프트웨어를 이용하여 수행했다. 맵 거리는 Kosambi 함수로 예측했다 (Kosambi DD (1944) Ann Eugenet 12: 172-175).

후보 유전자의 서열분석

후보 유전자의 전장 게놈 DNA 서열은 특정 PCR 프라이머 고안을 위해 여러 개의 절편으로 나누었다. 상기 프라이머들은 Milyang 23, Tong 88-7 및 RIL-166 유래의 게놈 DNA 증폭에 이용했다. PCT 산물들은 TA 클로닝을 위해 PCR 정제 키트 (Bioneer, Korea) 를 이용하여 정제했다. 정제된 PCT 산물은 pGEM-T Easy Vector (Promega, USA) 에 도입하고, 에셰리키아 콜라이 (E. coli) 균주 DH5α로 형질전환했다. 재조합 플라스미드를 ABI Prism 3730 XL DNA Analyzer (PE Applied Biosystems, USA) 로 서열분석했다. 서열 정렬은 BLAST network service (National Center for Biotechnology Information, NCBI) 및 ClustalW (European Bioinformatics Institute, EBI) 를 이용해 수행했다.

dCAPS ( cleaved amplified polymorphic sequence ) 마커 분석

목적하는 SNP 로부터 5' 방향에서 2 개의 염기 미스매치를 시작하는 프라이머는 dCAPS Finder 2.0 program (http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html) 을 이용하여 고안했다. 정방향 프라미어는 길이가 24 내지 30 뉴클레오티드였고, 역방향 프라이머는 3' 말단에서 150 내지 200 bp 떨어져 위치했다. PCT 산물은 적당한 제한효소로 절단하고, 수평 3% 아가로스 겔로 분석했다.

인디카 및 자포니카 변종에서의 hwh 대립형질의 분포

2 개의 HB 유전자좌에서의 hwh 대립형질의 분포를 연구하기 위해, 21 가지의 인디카 및 33 가지의 자포니카 변종을 포함하여 54 가지의 변종에서, 본 연구에서 개발한 각각의 hwh 유전자-특이적 DNA 마커를 이용하여 유전형검사를 수행했다.

실시예 1: 형태학적 특징분석

두가지 HB 주, RIL-132 및 RIL-166 은, 열악한 착근 능력 및 분얼기 때 엽신 말단에서의 적고화(赤枯化)를 포함하는 그의 비정상적인 유약한 외관으로 인해 정상 식물체 및 그의 부모와는 용이하게 구별될 수 있었다 (도 1). HB 주는 5 개 이 하의 원추, 짧은 대 (47.8 cm, RIL-132; 38.6 cm, RIL-166), 짧은 이삭 (19.1 cm, RIL-132; 18.9 cm, RIL-166), 및 더 적은 수의 영화수 (113, RIL-132; 111, RIL-166) 를 갖는 반면, 그의 부모는 9 내지 12 개의 이삭, 70 내지 76 cm 의 대, 21 내지 27 cm 의 이삭길이, 및 139 내지 201 의 영화수를 갖는다 (표 1).

표 1. 부모, 잡종퇴화주, 및 이의 F₁ 교잡에 대한 작물학적 형질

DTH 및 SF 는 HB 주와 그의 부모에서 차이가 없었다. 두가지 HB 주, RIL-132 및 RIL-166 사이의 교잡으로 인한 F₁ 식물은 부모와 동일한 표현형을 나타내, 상기 두가지 HB 주가 동질접합성이며 HB 유전형에 있어서 동일하다는 것을 시사했다 (도 1).

실시예 2: 잡종퇴화 ( HB )의 유전적 분리

Milyang 23 와 Tong 88-7 사이의 교잡으로 인한 200 개체의 F₂ 식물의 유전 분석은 188 개체의 정상 식물 및 12 개체의 HB 식물을 밝혀냈고, 이는 15:1 의 예측된 비율과 맞아떨어져, 한 쌍의 상보적인 열성 유전자가 HB 를 제어한다는 것을 시사했다 (표 2).

표 2. 벼의 잡종퇴화의 유전적 분석

F₁ 식물은 열매를 맺지 않는 원추를 가진 정상 식물이었고, 인디카와 자포니카 사이의 F₁ 잡종의 대부분도 마찬가지였다. 유전 분석 및 퇴화가 이종간 또는 아종간 교잡의 F₂ 또는 그 이후 세대에서만 발생한다는 HB의 독특한 특성을 근거로, 각각의 두 열성 유전자는 부모 각각으로부터 각각 유래된 것으로 추정하는 것은 합당하다. 상기 추정을 확인하기 위해, Tong 88-7 및 Milyang 23 각각에 대한 RIL-166 의 역교잡으로 창출된 BC₁F₂ 및 BC₃F₂ 의 4 가지의 역교잡 F₂ 집단에서 유전 분석을 수행했다. 분리 비율은 정상 식물 대 HB 식물에 대해 예상된 비율 3:1 과 맞아떨어져, HB 가 부모 각각인 Tong 88-7 및 Milyang 23 로부터 각각 기원하는 한 쌍의 상보적인 열성 유전자에 의해 제어된다는 것을 확인했다 (표 2 및 도 2). 2 개의 상보적인 열성 유전자는 각각, 선행기술에서의 'Hwa', 'hwb', 'Hwc', 'hwd', 'hwe', 'hwf' 및 'hwg' 의 명명법에 따라, Milyang 23 유래인 것으로 추정되는 hwh1 ( h ybrid w eakness h1 ), 및 Tong 88-7 유래인 것으로 추정되는 hwh2 ( h ybrid w eakness h2 ) 로 명명했다.

실시예 3: HB 유전자인 hwh1 의 정밀 맵핑

Milyang 23 으로부터 hwh1 유전자를 맵핑하기 위해 먼저, RIL-166 와 Tong 88-7 사이의 교잡으로 유도된 144 가지의 BC₁F₂ 식물 상에서 BSA 를 수행하여 hwh1 유전자에 연관된 마커를 동정했다. 12 개의 염색체 상에 분포된 29 개의 SSR 및 34 개의 STS 마커를 포함하는 63 개의 마커들 중, 2 번 염색체 상의 S0288 및 S0298A 는 BC₁F₂ 집단의 정상 및 HB 식물의 집단내 표현형별 DNA 샘플들 사이에서 현저한 다형성 (polymorphism) 을 나타냈다. 결과적으로, 2 번 염색체 상의 추가적인 SSR 및 STS 마커를 BSA 에 추가로 이용했다. hwh1 및 144 가지의 BC₁F₂ 식물에서 선별된 12 개 마커들 사이의 연관 분석은 HB 유전자 hwh1 가 각각 1.0 cM 및 0.8 cM 의 거리로 마커 S0298A 및 S0299B 사이에 위치한다는 것을 밝혀냈다 (도 3b).

hwh1 유전자의 위치를 더욱 정확하게 정하기 위해, 978 가지의 BC₁F₃ 식물을 포함하는 추가적인 대형 맵핑 집단을 2 개의 BC₁F₂ 식물로부터 유도했다. 인접 마커인 S0298A 및 S0299B 를, 144 가지의 BC₁F₂ _, 133 가지의 BC₃F₂ 및 978 가지의 BC₁F₃ 식물 전부를 조사하기 위해 이용했는데, 그 결과 BC₁F₂ 에서는 4 개의 재조합체를 (9820-21, 9820-23, 9820-30 및 9820-96), BC₁F₃ 에서는 5 개의 재조합체를 (9820-21-3, 9820-21-3-5, 9820-21-3-6, 9820-21-3-83 및 9820-96-37) 검출했다. 추가로, S0298A 및 S0299B 사이에서의 4 개의 STS, 1 개의 SSR, 및 2 개의 dCAPS 를 포함하여 7 개의 신규한 DNA 마커를, 벼 게놈 데이터베이스 (인디카는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, 자포니카는 http://www.rgp.dna.affrc.go.jp/) 를 근거로 하여 고안했다. 모든 8 개 마커 (6 개의 신규한 것, 및 2 개의 인접한 것) 가 9 개의 재조합체의 유전형분석에 이용되었다. 개체들 9820-21, 9820-21-3, 9820-21-5 및 9820-21-6 에서는 S0299N 및 S0299J 사이에서 어딘가에 교차가 일어났고, 9820-21-83 및 9820-96-37 에서는 S0299N 및 S0299J 사이에서 어딘가에 교차가 일어났다 (도 3c). 결과적으로, hwh1 유전자의 위치는 BAC 클론인 BAC OJ1234_B11 기원의 마커 유전자좌 S0299N 및 S0299J 사이에서 동정되었고, 두 마커 사이의 물리적인 거리는 11.8 kb 였다. 유용한 서열 주해 데이터베이스 (http://www.tigr.org, www.gramene.org) 를 근거로 하여, 유일한 1 개의 예측된 유전자로, 글루코오스-메탄올-콜린 (GMC) 산화환원효소 패밀리 단백질 (LOC_Os02g40840) 로 추정되는 것이 있었다 (도 3d). LOC_Os02g40840 유전자는 Milyang 23, Tong 88-7 및 RIL-166 으로부터 서열분석했다. 3 가지의 뉴클레오티드 다형성이 전사체 영역에서 검출되었다; 2 개는 번역된 아미노산에 영향을 주지 않 았으나, Milyang 23 및 RIL-166 에서의 5204 번째 뉴클레오티드 T 는 Tong 88-7 에서 G 로 바뀌어, Milyang 23 및 RIL-166 에서의 타이로신 (Tyr; 763 번째 아미노산) 을 Tong 88-7 에서의 아스파라긴 (Asp) 으로 변경했다 (도 4a). hwh1 유전자의 뉴클레오티드 서열에서의 SNP를 밝혀내기 위해, dCAPS 마커인 S0299M (정방향 프라이머, 5'-cgtattgcctcgcaaatggcatcgtc-3'(서열번호 3); 역방향 프라이머, 5'-tggtcctcgtaacaatcatatacgct-3'(서열번호 4))를 고안하고, 부모로서의 RIL-166/Milyang 23 로부터 유도된 BC₁F₂ 집단을 스크리닝했다. Tong 88-7 가 더 짧은 절편을 갖는 반면, Milyang 23 및 RIL-166 이 더 긴 절편을 갖는다는 것을 관찰했다. BC₁F₂ 집단에서, S0299M 유전형은 표현형과 정확하게 공동분리되었다 (도 4b).

실시예 4: HB 유전자인 hwh2 의 정밀 맵핑

동일한 전략이 Tong 88-7 기원의 hwh2 의 정밀 맵핑에 적용되었다. RIL-166 와 Milyang 23 사이의 교잡으로 유도된 150 개체의 BC₁F₂ 식물에서 BSA 를 수행했다. BSA 에서 사용된 hwh2 에 대한 63 개의 마커들 중에서, 11 번째 염색체 상의 S1159C 가 BC₁F₂ 집단 유래의 정상 및 HB 식물의 집단내 표현형별 DNA 샘플들 사이에서 다형성 마커로서 검출되었다. S1159C 에 인접한 추가적인 STS 마커들은 BC₁F₂ 식물에 대해 조사하여, 그 결과 hwh2 유전자와 연관된 11 가지의 추가적인 STS 마커를 검출했다. BC₁F₂ 집단에서의 12 가지 마커를 이용한 연관 분석을 통해, hwh2 유전자가 마커 S1158A 및 S1159B (S1159C 는 S1159B 와 동일한 유전자좌에서 맵핑됨) 사이에 각각 0.7 cM 및 0 cM 의 거리에서 맵핑되었다 (도 5b). 모든 HB 식물들은 11 번 염색체 상에 S1159B 에 대한 Tong 88-7 동형접합 대립형질을 보유한 반면, 정상 식물은 이형접합 또는 Milyang 23 동형접합 대립형질을 보유했다.

hwh2 유전자의 위치를 더욱 정확하게 하기 위해, 147 가지의 BC₃F₂ 식물 (집단 참가 96288 개체), 222 가지의 BC₃F₂ (참가 96292 개체), BC₃F₂ 의 단일한 개체 유래의 1062 가지의 BC₃F₃ 식물 (참가 96292 개체), 및 BC₃F₂ 의 단일한 개체로부터 개발한 544 가지의 BC₃F₃ 집단 (참가 96292 개체) 을 스크리닝했다. S1158A 및 S1159C 부근의 5 가지의 추가적인 마커를 동정하고, 이후 BC₁F₂ 집단 유래의 3 가지의 재조합체, BC₃F₂ 유래의 6 가지의 재조합체 및 BC₃F₃ 유래의 4 가지의 재조합체를 S1158A 및 S1164A 사이의 마커를 이용한 조사로 검출했다. 8 가지 마커를 이용한 13 가지 재조합체의 유전형검사는, 117.2 kb 의 물리적 거리를 가진, S1159A 및 S1159C 사이의 hwh2 유전자를 맵핑했다 (도 5c). Institute for Genome Research Rice Genome Annotation database (http://www.tigr.org/tdb/e2k1/osa1/) 에 따르면, 상기 영역은 12 가지의 유전자를 포함한다: 가상 단백질 (hypothetical protein) 을 코딩하는 3 가지, 및 레트로트랜스포존 (retrotransposon) 단백질, 헥소오스 트랜스포터, 가상적인 AT 훅 (hook) 모티브-포함 단백질 및 발현된 단백질을 코딩하는 6 가지. 가상 단백질의 아미노산 서열을 이용한 BLAST 분석은 임의의 기타 생물체에서 보고되었던 것과 상동 단백질이 아님을 밝혀냈다. 추가로, 상기 단백질의 기존 보고된 cDNA 서열이 없었으며, 상기 단백질 서열은 상대적으로 더 짧았다. 이에 따라, 상기 단백질들은 hwh2 에 대한 후보 유전 분석에서 제외되었다. 발현된 단백질 (LOC_Os11g28600), 가상적인 헥소오스 트랜스포터 (LOC_Os11g28610) 및 가상적인 AT 훅 모티브-포함 단백질 (LOC_Os11g28650) 의 3 가지 유전자가 선택되어, Milyang 23, Tong 88-7 및 RIL-166 에 대해 서열분석했다. AT 훅 모티프-포함 단백질 및 발현된 단백질에서는 다형성이 검출되지 않았으나, 18 개의 뉴클레오티드 길이를 가진 1 개의 삽입/결실 다형성 (InDel) 영역이 헥소오스 트랜스포터에서 검출되었다 (도 6a). Tong 88-7 및 RIL-166 와 대조적으로, Milyang 23 에는 1402 번째 내지 1419 번째의 18 개 뉴클레오티드를 469 번째 내지 474 번째의 6 개의 아미노산의 리딩 삽입체 (leading insert) 를 이용하여 삽입했다. 서열분석된 유전자인 가상적인 헥소오스 트랜스포터에 대한 STS 마커인 S1159H (정방향 프라이머, 5'-tggaagtggacggagaacgt-3'(서열번호 5); 역방향 프라이머, 5'-atcaggacgtccttggtgtaca-3'(서열번호 6))를 hwh2 유전자의 뉴클레오티드 서열 중의 InDel 을 밝혀내기 위해 고안했다. BC₁F₂ 집단 중에서도 S1159H 에 대한 유전형분석은, S1159H 유전형이 Milyang 23 보다는 더 긴 절편을 갖고 Tong 88-7 및 RIL-166 에 비해서는 더 짧은 절편을 가져, 표현형과 공동분리를 나타냈다는 것을 밝혀냈다 (도 6b).

실시예 5: 벼 변종에서의 hwh 유전자의 분포

인디카 및 자포니카 재배종들에서의 hwh 유전자 분포를 조사하기 위해, 21 가지의 인디카 및 33 가지의 자포니카 벼 변종을 hwh1 에 대한 dCAPS 마커 S0299M 및 hwh2 에 대한 STS 마커 S1159H 를 이용하여 유전형분석을 했다 (표 3).

표 3. 인디카 및 자포니카 벼에서 hwh1 및 hwh2의 유전자 분포

인디카 군에서는, 7 가지의 변종이 hwh1 / Hwh2 유전형을 가졌고, 나머지 변종들에서는 Hwh1 / Hwh2 유전형을 가졌다. 자포니카 군에서는, 33 가지의 변종들 중 27 가지가 Hwh1 / hwh2 유전형을 가졌고, 열대성 자포니카군을 대표하는 5 가지의 변종들은 Hwh1/Hwh2 유전형을 가졌으며, 1 가지의 변종은 hwh1 / Hwh2 유전형을 가졌다. 다산벼 (한국의 인디카 변종)/ TR22183 (중국의 자포니카 변종) 및 상호 TR22183/다산벼 교잡종으로부터 유도된 F₃ 집단에서 검출된 기타 HB 식물에서도 상기 두 마커를 시험했다 (도 7a). F₃ 집단 유래의 HB 식물이 hwh1 / hwh2 유전형을 가졌고, 정상 식물 중 하나가 다산벼/TR22183 교잡종 유래의 Hwh1 / hwh2 유전형을 가졌으며, 나머지 정상 식물은 TR22183/다산벼 교잡종 유래의 hwh1 / Hwh2 유전형을 가졌다 (도 7b).

도 1은 HB 주 및 이의 부모의 표현형을 보여준다. a. 분얼기, b. 성숙 낟알기(grain stage).

도 2는 Milyang 23/Tong 88-7의 F₂ 집단 (a), 및 BC₁F₂ 집단들 RIL-166/ Tong 88-7 (b) 및 RIL-166/Milyang 23 (c)에서 관찰된 분얼수의 분리를 보여준다.

도 3은 hwh1 유전자의 유전자 및 물리적 지도를 보여준다. a, Milyang 23 및 Tong 88-7 사이의 교잡으로부터 유도된 RIL을 이용하여 구축된 2번 염색체의 연관지도. b, BC₁F₂ 집단에서 hwh1 유전자좌의 고해상도 유전 지도. c, 마커 및 hwh1의 유전자좌에서 주요 재조합체의 유전형. d, GenBank accession 유래의 japonica Nipponbare 에서 hwh1 영역의 물리적 지도.

표현형 -- N: 정상 식물, HB: HB 식물, H: 정상 식물이지만, 자손에서 분리됨,

유전형 -- M: Milyang 23 형, T: Tong 88-7 형, H: 이형접합체

도 4는 DNA 서열 정렬 및 DNA 마커 분석을 보여준다. a. 후보 유전자 LOC_Os02g40840의 구조 및 Milyang 23, Tong 88-7, 및 RIL-166의 단일염기다형성. b. dCAPS 마커를 이용한 RIL-166/Tong 88-7 BC₁F₂ 집단에서 공동분리 분석 (S0299M, 단일염기 미스매치 정방향 프라이머는 SalI 특이적 자리를 생성하였다).

M: Milyang 23, T: Tong 88-7, R: RIL-166, 표현형 - N: 정상 식물, H: 분리, HB: HB 식물.

도 5는 hwh2 유전자의 유전자 및 물리적 지도를 보여준다. a, Milyang 23 및 Tong 88-7 사이의 교잡으로부터 유도된 RIL을 이용하여 구축된 11번 염색체의 연관지도. b, BC₁F₂ 집단에서 hwh2 유전자좌의 고해상도 유전자 지도. c, 마커 및 hwh2의 유전자좌에서 주요 재조합체의 유전형. d, GenBank accession 유래의 japonica Nipponbare 에서 hwh2 영역의 물리적 지도.

유전형 -- M: Milyang 23 형, T: Tong 88-7 형, H: 이형접합체

도 6은 DNA 서열 정렬 및 DNA 마커 분석을 보여준다. a. 후보 유전자 LOC_Os11g28610의 구조 및 Milyang 23, Tong 88-7, 및 RIL-166의 InDel. b. STS 마커를 이용한 RIL-166/Tong 88-7 BC₁F₂ 집단에서 공동분리 분석 (S1159H).

도 7은 다산벼 (indica) 및 TR22183 (japonica) 사이의 역교잡 유래의 F₃ 집단에서 hwh 유전자의 표현형 및 유전형 분석을 보여준다. a. 부모 및 각각의 역 유형(reciprocal type)의 표현형, b. 유전형 분석, 상단: dCAPS 마커 S0299M, 하단: STS 마커 S1159H.

레인 1: 다산벼, 레인 2: TR22183, 레인 3: 다산벼/TR22183 유래의 HB 식물, 레인 4: R22183/다산벼 유래의 HB 식물, 레인 5: 다산벼/TR22183 유래의 정상 식 물, 레인 6: TR22183/다산벼 유래의 정상 식물.

<110> Seoul National University Industry Foundation <120> Complementary recessive genes involved in rice hybrid breakdown and screening marker thereof <130> PN08053 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2313 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> gene <222> (1)..(2313) <223> hwh1 gene <400> 1 atgggagagg agaagagcca gcagcggcgg cggcagggcc accctctcct gaggggaggc 60 ggcgcgggga agcaggccgg gcggcgttac acccacggct tctccgcctc ccagatggtc 120 gcgctcgccg ccctgtgcgg cgcgctggcg ccctcgctcc cgccggacac ccgcgacgac 180 gacgacgacg acgccggagg cggacgctat ggcggcgccg gtgcgtccga cgccaaggcc 240 gtcagggact tcctcctcgc ctccgccgcc gacccgcccg tccccgacga ggtggcggag 300 ctgatgacga ggatgtgcct ccgggaggcg ctggcgctgg tgcgggcggt gctgtggctg 360 ctggggacgc ggctggggac gctggcgctg tgcggggggc ggtgcgtgtc gtgggggagg 420 tggccgttcg tgctcacgtt cgcggagatg ccggtggagc ggcgggagga ggcgctcggg 480 cggtggagca gggtgaccgt gctcccgccg ctgcgcgcct tcttcctcgt cgtcaaggtc 540 ttctgcctct acgtcttcta ctcctggatt gacgagagct cagagaaccc gcactggcga 600 gcgatcgggt acagcccgcc gaccgacgaa ccgccggcgg aggagcacac cgaggcgacg 660 aagcggccac tcgacgacgg cgtggtcgag accatcaacc tcacggacgc gtccctcccg 720 tcgtccctcg cggagaaagg cctcgcggtg accgatgacg cggcgcgcaa cgtgtgccgg 780 gtggagtgcg acgtcgccat cgtcggctcc ggctgcggcg ggggcgtggc ggccgcggtg 840 ctcgccgggg ccggccacaa ggtggtggtc atcgagaagg gcaactactt cacgtcgcgg 900 gactacacgt ccttcgaggg cccgtcgatc aaccagctct acgagtccgg tgggttcgtc 960 accacgatga acggcggcgg gctgctcctg gccggctcca cggtcggcgg cggctcggcg 1020 gtgaactggt cggcctgcct caagacgccc gagttcgtgc gcagggagtg ggcggccgcg 1080 cacgggctcc cgctgttcgc cacccccgac tacgccgccg ccatggacaa ggtgttcgag 1140 cggctcggcg tgacgtcggg gtgtacggag gaagggctcc agaacaaggt cctccgcaag 1200 gggtgcgaga agctgggcta caaggtcgac gcggtggcga ggaactcgtc ggagggacac 1260 tactgcggca gctgcggttt cggctgccgc accggggaca agcgcggcac ggacacgacg 1320 tggctggtcg acgcggtggg ccgcggcgcg gtgatcctga cggggtgcaa ggcggagaag 1380 ctggtgctgg aacgcggcgg ggcgaggggc aggcggtgcg tcggcgtggt ggccaggagc 1440 accaacccgg cgatcacgaa gacgctggag gtgcgcgcca aggtgaccgt gtcggcggcc 1500 ggctcgctcc tcacgcccgt gctgctgcag cggagcgggc tcaccaaccc gcacatcggc 1560 aagaacctcc acctccaccc gaccgccctg gcgtggggct acttcccgga cacgatgccg 1620 gacctgaagg ggaaggcgta cgagggcggc atcatcacgt cgatgcacaa ggtggagacc 1680 tccggcgccg gcgcgccgca ccgtgccatc ctcgagacgc cgatgatggc cgtggccgcc 1740 acggggacgc agatgccctg gctgtccggg cgagactcga aggagcggat gctccggttc 1800 gcccggacgg tgcacatctt ctccctggtc agggaccgcg ggtcggggac ggtgcacggc 1860 gagcggcgtg tcgcgtaccg cctcgacgcg gcggacaggg aggacatccg cgacggcttg 1920 cggcgcgcgc tgcgggtcct cgtcgcggcg ggcgcggcgg aggtgggcac gcaccggagc 1980 gacgggcagc ggctgcggtg cgaggggctg accgaggagg cgctggagga gttcctcgac 2040 ggcgtcaccg tggtgcgcgg gccgcagtcg aggagcgaga cgtggggcct cttctgctcg 2100 gcgcaccaca tgggcagctg ccggatgggc gccacggcgg gcgacggcgc cgtcgacgcc 2160 cgcggcgaga gctgggaggc ggagcggctg tacgtgtgcg acggcagcgt gctgcccacc 2220 gcggtgggcg tcaaccccat gatcaccata cagtccgtag cgtattgcct tgcaaatggc 2280 atcgcctact ccctgtccgc taaaacgact taa 2313 <210> 2 <211> 2274 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> gene <222> (1)..(2274) <223> hwh2 gene <400> 2 atgagaggcg ccgtgttggt ggccgtggcg gccgccatcg gcaactacct gcagggatgg 60 gacaacgcca ccatcgccgg cgccgtgctg tacatcaagc gggagttcgc cctcgagacc 120 cagcccgccg tggagggcct cgtcgtcgcc atgtccctca tcggcgccac catcatcacc 180 accttctccg gccccgtctc cgacctcgtc ggccgccgcc ccatgctcat cgcctcctcc 240 ctcctctact tcgccggcgg cctcatcatg ctctggtccc ccaacgtcta cgtcctcctc 300 ctcgcccgcc tcgtcgacgg cttcggcgtc ggcctcgccg tcaccctcgt ccccgtctac 360 atctccgaga cctccccgcc ggagatccgc ggccgcctca acacgctgcc gcagttcacc 420 ggctccggcg gcatgttcat gtcctactgc atgatcttcg ccatgacgct ctcgccctcg 480 cccaactggc gcatcatgct cggcgtcctc ttcgtcccct cgctgctcta cctgttcgtc 540 accgtcttct acctcccgga gtcgccgcgg tggctcgtca gcaaggggcg catgaaggag 600 gccagggttg tgctcgagat gctgcgcggc cgcgaggacg tctccggcga gatggcgctg 660 ctcgtcgagg gcctcggcac cggcggcgac accgagatcg aggactacgt cgtcggcccg 720 tccgagggcg acgccggcga 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cgccacgccc tcttctgcgg cgtcaccatc 1620 cagatcctcc agcaattctc cggcatcaac ggcgtgctct actacacccc gcagatcctc 1680 gaccaggccg gcgtcagcgt cctcctcgcc agcctcggcc tctccggcga ctccacctcc 1740 atcctcatca gcggcctcac cacgctcctc atgctcccgt ccatcggcgt cgccatgcgc 1800 ctcatggacg cctcgggccg ccgcgccctc ctcctctgga cgctgcccgt cctcgtcgcg 1860 tccctcgccg tgctcgtggt ggcgaacgtc gtgcccatgg cggcgaccgc gcacgcggcg 1920 ctgtcgacgg ggagcgtcat cgtctacttc tgctgcttcg tcatggggtt cggccccatc 1980 cccaacatcc tctgcgccga gatcttcccg acgagggtga ggggactctg cattgccatc 2040 tgctcgctga cgttctggct cggcgacatc gccgtcacgt acagcctccc cgtcatgctc 2100 agctccgtgg ggctcgccgg cgtgttctcc ttctacgccg ccgtgtgctg cgtcgcgctc 2160 gtgttcgtgg cgctcaaggt gcccgagacc aagggcctcc cgctcgaggt catcatcgag 2220 ttcttcaacg tcggcgccaa ggccggcacg ttgcctgacg aagagttcca ctga 2274 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for S0299M marker <400> 3 cgtattgcct cgcaaatggc atcgtc 26 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for S0299M marker <400> 4 tggtcctcgt aacaatcata tacgct 26 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for S1159H marker <400> 5 tggaagtgga cggagaacgt 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for S1159H marker <400> 6 atcaggacgt ccttggtgta ca 22

Claims

벼의 잡종퇴화 (hybrid breakdown)에 관여하는 상보적인 열성 유전자 hwh1 (hybrid weakness h1) 및 hwh2 (hybrid weakness h2).
제1항에 있어서, 상기 벼의 잡종퇴화는 인디카 (indica) 변종인 Milyang 23 및 자포니카 (japonica) 변종인 Tong 88-7 사이의 교잡으로부터 유래된 재조합 순계 집단에서 발생된 것을 특징으로 하는 유전자.
제1항에 있어서, 상기 열성 유전자 hwh1 및 hwh2는 각각 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 유전자.
서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 세트, 및 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 세트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는 벼의 잡종퇴화를 스크리닝하기 위한 프라이머 세트.
제4항의 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 벼의 잡종퇴화를 스크리닝하기 위한 키트.
제1항의 유전자를 포함하는 벼의 잡종퇴화를 스크리닝하기 위한 마이크로어레이.
벼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제4항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 벼의 잡종퇴화를 스크리닝하기 위한 방법.
제7항에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질로 표지되어 있는 것인 방법.