KR20090102374A - 연골 재생용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 알긴산(특히, 알긴산 올리고당)을 유효성분으로 포함하는 관절 내의 연골 재생용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 프로티오글리칸 및 타입 Ⅱ 콜라겐의 생성을 촉진하고, 친염증성 사이토카인인인 IL-1β의 작용을 억제함으로써, 우수한 연골 재생 효능을 발휘한다. 또한, 본 발명의 조성물에서 유효성분으로 이용되는 알긴산은 해초에서 대량으로 얻을 수 있으며, 또한 알긴산 올리고당은 알긴산을 원료로 하여 효소 반응으로 간편하게 얻을 수 있기 때문에, 본 발명의 조성물은 산업적 규모로 대량 생산하는 데 매우 유리하며, 유효성분으로 이용되는 알긴산은 인체에 무해하기 때문에, 의약 및 식품으로서 개발하기가 용이하다.

Description

연골 재생용 조성물 {Compositions for Regenerating Cartilage}

본 발명은 연골재생용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 프로티오글리칸 및 타입 Ⅱ 콜라겐의 생성을 촉진하여 연골재생을 하는 조성물에 관한 것이다.

골관절염(Osteoarthrits)은 가장 일반적인 관절염 증상 중의 하나이며, 많은 사람들이 골관절염 증상을 가지고 생활하고 있다. 골관절염은 여러 가지 다른 명칭, 예를 들면 퇴행성 관절 질환, 골관절증, 비후성 관절염, 퇴행성 관절염 등으로 알려져 있다. 골관절염은 손가락, 팔꿈치, 무릎과 발목과 같은 주요 관절에서의 연골 조직의 만성 진행성 파괴로 특징지울 수 있다.

연골은 탄력성 있는 조직으로서 두 개의 뼈를 서로 연결하며, 관절부위에 운동성을 부여하며 그리고 충격완화의 역할을 한다. 특히, 관절 연골은 결합조직으로서 프로티오글리칸(proteoglycan)과 타입 Ⅱ 콜라겐의 매트릭스에 임베딩되어 있는 연골세포를 포함한다. 상기한 타입의 연골조직이 손상됨으로써, 뼈끼리의 직접적인 마찰, 관절의 뻣뻣함, 관절 연골운동의 점진적 저하 및 연골부위의 빈발성 통증이 유발된다. 골관절염의 초기 병인이 아직 불분명하지만, 일반적으로 관절연골 매트릭스 내의 동화 및 이화 대사기전의 변화나 불균형에 의하여 연골 파괴가 초래되는 것으로 알려져 있다.

골관절염과 같은 관절질환에서는, 과잉의 이화작용 및 동화작용의 부족현상이 분명하게 나타나며, 이는 대사 평형의 불균형을 초래한다. 이화활성이 동화활성을 능가하게 되면, 전체 매트릭스의 감소가 초래될 수 있다. 프로티오글리칸 및 타입 Ⅱ 콜라겐의 구조적 파괴는 연골세포에 의한 이화작용의 증가 때문으로 알려져 있다.

동화와 이화 대사작용이 불균형적으로 일어나는 데는, 인터루킨-1, 일산화질소(NO) 및 매트릭스 메탈로프로티나아제(MMPs)와 같은 많은 생화학적 중개자가 관여한다. 이러한 중개자 중에서 MMPs는 대부분의 타입 Ⅱ 콜라겐과 프로티오글리칸 생성을 파괴함으로써 연골 매트릭스에 부정적으로 영향을 미쳐 결과적으로 골관절의 퇴화를 촉진한다. 특히, 인터루킨-1은 MMPs의 생산을 유도하며 타입 Ⅱ 콜라겐과 프로테오글리칸의 생성을 억제한다.

골관절염을 치료하고 예방하기 위한 치료법이 꾸준히 연구되고 있으나, 아직까지는 제한적인 성공만을 이루었다. 예를 들어, 관절 연골의 분리된 스플리트(splits)를 치료하는 외과적인 방법이 있다. 주로 이 시술과정은, 환자 자신의 연골을 실험실에서 배양하고 새로이 얻어진 연골을 손상부위에 삽입하는 방식으로 손상된 무릎 조직이 회복되도록 한다. 상기의 방법에 의해 반드시 골관절염이 완치되지는 않지만, 손상된 연골을 재생하는 방법을 제공한다.

추가적으로 다른 연구팀에서는, 충분한 양의 글루코사민 화합물을 투여하면 골관절염의 소견을 보이는 관절 내 연골의 보호 또는 실제적인 질적 향상이 초래될 수 있는 지에 대한 연구가 진행 중이다. 특히, 글리코사미노글리칸(GAG)의 이당류 유닛의 기본 구성분의 하나인 글루코사민 설페이트(glucosamine sulfate)는 연골세포에서 프로티오글리칸 생성을 통계적으로 유의하게 촉진시키는 것으로 나타났다. 그러나 글루코사민은 타입 Ⅱ 콜라겐의 생성에 대해서는 비교적 영향이 없다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 관절의 연골을 재생하는 데 유효한 물질을 개발하고자 노력한 결과, 생체적합성 생고분자(다당류)로 알려진 알긴산이 연골세포에서 프로티오글리칸 및 타입 Ⅱ 콜라겐의 생성을 크게 촉진하여 연골재생에 대한 유효한 효능을 발휘할 수 있고, 최종적으로 골관절염을 치료할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다. 따라서, 본 발명의 목적은 연골 재생용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

분자량대별 알긴산 올리고당을 제조하여 알긴산의 타입 Ⅱ 콜라겐의 합성 증진에 대한 영향, 알긴산의 프로티오글리간의 합성 증진에 대한 영향동물모델을 이용한 골관절염 치료 효능 분석

위에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명의 조성물은 프로티오글리칸 및 타입 Ⅱ 콜라겐의 생성을 촉진하고, 친염증성 사이토카인인인 IL-1β의 작용을 억제함으로써, 우수한 연골 재생 효능을 발휘한다. 또한, 본 발명의 조성물에서 유효성분으로 이용되는 알긴산은 해초에서 대량으로 얻을 수 있으며, 또한 알긴산 올리고당은 알긴산을 원료로 하여 효소 반응으로 간편하게 얻을 수 있기 때문에, 본 발명의 조성물은 산업적 규모로 대량 생산하는 데 매우 유리하며, 유효성분으로 이용되는 알긴산은 인체에 무해하기 때문에, 의약 및 식품으로서 개발하기가 용이하다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 연골의 매트릭스를 형성하는 타입 Ⅱ 콜라겐의 생성에 미치는 알긴산 올리고당의 영향을 보여주는 그래프이다. 도 2는 알긴산처리의 관절내 타입 II 콜라겐 생성에 미치는 영향을 보기 위한 조직검사 면역조직화학염색 결과를 보여주는 사진이다. 도 3은 알긴산처리의 관절내 프로티오글리칸 생성에 미치는 영향을 보기 위한 조직검사 면역조직화학염색 결과를 보여주는 사진이다.

본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 알긴산을 유효성분으로 포함하는 관절 내의 연골 재생용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 관절의 연골을 재생하는 데 유효한 물질을 개발하고자 노력한 결과, 생체적합성 생고분자(다당류)로 알려진 알긴산이 연골세포에서 프로티오글리칸 및 타입 Ⅱ 콜라겐의 생성을 크게 촉진하여 연골재생 효능(chondroregenerative effect)을 발휘할 수 있고, 최종적으로 골관절염을 치료할 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서 유효성분으로 이용되는 알긴산은 생체적합성 생고분자(다당류)로서, 세포 배양 또는 증식의 담체 또는 스캐폴드로 많이 이용되며, 이렇게 증식된 세포를 포함하는 알긴산은 생체 내에 이식(implantation)되어 세포 치료(cell therapy)가 이루어지도록 한다.

전형적으로, 알긴산은 해초에서 추출된 천연 산성 선형 다당류로서, L-굴루로네이트(guluronate: G) 및 D-만누로네이트(mannuronate: M)을 포함한다. 이 잔기들은 호모중합체, 즉 폴리굴루로네이트(PG) 또는 폴리만누로네이트(PM), 또는 헤테로중합체, 즉 상기 잔기들의 혼합 서열의 블록 구조로 정렬된다. 일반적으로, 상기 블록 구조물을 각각 G-블록, M-블록 및 MG 블록으로 통칭한다. 산업적인 규모로 대량 추출된 알긴산은 식품산업, 생명공학 분야 및 의학 분야에서 널리 이용되고 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 포함되는 알긴산은 연골의 타입 Ⅱ 콜라겐 및 프로티오글리칸의 생성을 촉진한다. 타입 Ⅱ 콜라겐 및 프로티오글리칸은 연골에 있어서 매트릭스 역할을 하기 때문에, 타입 Ⅱ 콜라겐 및 프로티오글리칸의 생성을 증가시키는 것은 연골의 재생을 촉진하는 것이 된다. 보다 상세하게는, 알긴산은 친염증성 사이토카인인(proinflammatory cytokines)인 인터루킨-1β의 작용(actions)을 감소시킴으로써, MMPs의 생성을 감소시키고, 이는 결국 타입 Ⅱ 콜라겐 및 프로티오글리칸의 생성을 증가시킨다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 알긴산은 알긴산올리고당이다. 고분자량의 알긴산(예컨대, 평균분자량 100,000 이상의 알긴산)은 타입 Ⅱ 콜라겐 및 프로티오글리칸의 생성을 촉진하는 능력이 미약하다.

보다 바람직하게는, 본 발명의 조성물에서 유효성분으로 이용되는 알긴산은 200-25,000의 평균 분자량, 보다 더 바람직하게는 200-10,000의 평균 분자량, 보다 더욱 더 바람직하게는 200-5,000의 평균 분자량, 가장 바람직하게는 200-3,000의 평균 분자량을 가지는 알긴산 올리고당(alginate oligosaccharide)이다.

상기 저분자량의 알긴산 올리고당은 해초에서 추출한 알기산 또는 다른 고분자량의 알긴산을 가수분해하여 얻을 수 있다. 알긴산의 가순분해는, 예컨대, 산가수분해 또는 효소적 가수분해를 통해 실시할 수 있다. 산 가수분해는 무기산(예를 들어, 염산 및 황산 등) 또는 유기산을 이용하여 실시할 수 있고, 효소적 가수분해는 알긴산 분해효소(alginate lyase)를 이용하여 실시할 수 있다.

적합한 평균 분자량의 알긴산 올리고당은 상기 알긴산 가수분해물으로부터 당업계에 공지된 방법에 따라 다양하게 얻을 수 있다. 예를 들어, 알긴산 가수분해 산물을 젤 여과크로마토그래피하여 소망하는 분자량의 알긴산 올리고당을 얻을 수 있다. 또한, 알긴산 가수분해 산물을 적합한 분자량 컷-오프 값을 가지는 멤브레인 필터로 한외여과하여 소망하는 분자량의 알긴산 올리고당을 얻을 수 있다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 조성물은 (a) 유효량(effective amount)의 알긴산; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 명세서에서 용어 “유효량”은 프로티오글리칸 및 타입 Ⅱ 콜라겐의 생성을 촉진하여 연골재생을 할 수 있는 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 및 관절내 주입 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 연골재생용 조성물은 식품, 특히 기능성 식품 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분으로서의 알긴산 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)을 이용할 수 있다. 식품에 대한 용이한 접근성을 고려한다면, 본 발명의 식품은 연골재생에 매우 유용하다.

본 발명의 조성물은 유효성분으로서 알긴산 이외에, 연골재생에 효능이 있는 것으로 알려진 다른 유효성분, 예컨대, 키토산, 글루코사민, 글루코사민 설페이트, 콘드로이틴 및/또는 콘드로이틴 설페이트를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 연골의 매트릭스를 형성하는 프로티오글리칸 및 타입 Ⅱ 콜라겐의 생성을 크게 촉진함으로써 연골을 재생하는 데에 매우 유효하다. 본 발명의 조성물이 유효한 치료 또는 예방 효과를 발휘할 수 있는 질병, 질환 또는 상태는, 예컨대, 골관절염, 류마티스 관절염 및 다른 관절 질환들을 포함한다.

본 발명의 특징 및 이점(advantages)을 정리하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명의 조성물에서 유효성분으로 이용되는 알긴산, 특히 알긴산 올리고당은 프로티오글리칸 및 타입 Ⅱ 콜라겐의 생성을 촉진함으로써 연골 재생 효능을 발휘한다.

(ⅱ) 본 발명의 조성물에서 유효성분으로 이용되는 알긴산, 특히 알긴산 올리고당은 친염증성 사이토카인인(proinflammatory cytokines)인 IL-1β의 작용(action)을 억제하는 작용을 한다.

(ⅲ) 본 발명의 조성물에서 유효성분으로 이용되는 알긴산은 해초에서 대량으로 얻을 수 있으며, 또한 알긴산 올리고당은 알긴산을 원료로 하여 효소 반응으로 간편하게 얻을 수 있기 때문에, 본 발명의 조성물은 산업적 규모로 대량 생산하는 데 매우 유리하다.

(ⅳ) 본 발명의 조성물에서 유효성분으로 이용되는 알긴산은 인체에 무해하기 때문에, 의약 및 식품으로서 개발하기가 용이하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 알긴산 올리고당의 제조

5 L 발효관에 평균 분자량 100,000에서 500,000을 갖는 알긴산나트륨(Qingdao Bright Moon, China) 150 g와 증류수 3,000 ml를 넣어 알긴산 나트륨을 완전히 용해하였다. 발효관 온도는 35℃로 고정한 후 알긴산 분해효소(Sigma, USA)를 150 mg (3,500 unit/g) 첨가하였다. 효소분해 반응은 20시간 지속하였다. 효소분해 반응은 발효관 온도를 90℃로 승온하여 정지시켰으며 냉각수를 순환시켜 알긴산나트륨 용액을 상온으로 냉각시켰다. 효소분해된 알긴산 용액으로부터 적절한 분자량을 얻기 위해 한외여과막을 이용하여 저분자 알긴산을 수득하였다.

실시예 2: 연골세포 배양

2주령 토끼의 무릎관절에서 연골을 채취하여, 혈청-부재 DMEM(GIBCO., USA) 1.6 ml에 연골편을 담근 후 1% 콜라게나아제(Sigma Aldrich., USA) 0.4 ml를 처리하였다. 37℃ CO2 배양기에 넣은 후 30분마다 세포를 흔들어 주면서 6시간 정도 기다려 연골세포가 단일 세포로 분리되도록 하였다. 단일 세포로 분리된 것을 원심분리하여 상층액을 버리고 완전배지(혈청-함유 DMEM)를 1 ml 넣어 토끼 한 마리 2 ml의 정상 배지에 희석하여 세포 현탁액을 만들었다. 세포수를 계수한 후 희석하여 0.5 x 105 cells/cm2 세포밀도가 되도록 각 dish당 필요한 양을 계산하여 세포현탁액을 넣고 잘 흔들어 준 후 현미경으로 분산정도, 세포밀도 등을 확인한 다음 배양기에 넣었다. 배양된 연골세포를 이후 실험에 이용하였다.

실시예 3: 알긴산의 타입 Ⅱ 콜라겐의 합성 증진에 대한 영향

배양 연골세포가 담긴 각각의 디쉬를 대조군, 저분자 알긴산(평균분자량 2,000) 처리군 및 고분자 알긴산(평균분자량 98,000) 처리군으로 나누고 대조군은 아무 처리를 하지 않고, 저분자 알긴산 처리군과 고분자 알긴산처리군은 각각 100 ㎎/L씩 알긴산 처리를 하고, 37℃ CO2 배양기에서 48시간 배양 후 웨스턴 블롯팅(Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 108-121, CRC press)을 실시하여 알긴산에 의한 타입 Ⅱ 콜라겐의 발현정도를 분석하였다.

도 1에서 볼 수 있듯이, 저분자 알긴산 처리군에서 연골세포에 의한 타입 Ⅱ 콜라겐의 발현이 대조군에 비해 발현도가 현저히 상승한 것을 알 수 있다. 그리고 고분자 알긴산 처리군에서는 타입 Ⅱ 콜라겐의 발현도에 변화가 없음을 알 수 있다.

따라서, 저분자 알긴산이 연골세포를 활성화하여 타입 Ⅱ 콜라겐 합성을 향상시키는 반면, 고분자 알긴산은 타입 Ⅱ 콜라겐 합성에 영향을 주지 않음을 알 수 있다.

실시예 4: 알긴산의 프로티오글리간의 합성 증진에 대한 영향

본 발명의 저분자 알기산이 연골조직 매트릭스를 형성하는 프로티오글리칸의 합성에 미치는 영향을 분석하였다. 프로티오글리칸의 양을 측정하기 위하여 알시안 블루 염색분석법(Alcian Blue staining assay,)을 실시하였다. 실시예 2에서 제1차 배양된 연골세포에 저분자 알긴산(평균분자량 2,000)과 고분자 알긴산(평균분자량 98,000)을 각각 100 ㎎/L씩 48시간 처리한 후 OD 값(600nm에서 측정)을 측정하였다. 실험 결과는 표 1에 정리되어 있다.

구분	대조군	고분자 알긴산	저분자 알긴산
프로티오글리칸 농도(OD)	0.255	0.267	0.351
	0.227	0.225	0.396
	0.270	0.262	0.436

연골조직 매트릭스 분자인 프로티오글리칸을 측정하기 위하여 알시안 블루 염색법을 실시한 결과, 대조군에 비해 저분자 알긴산 처리 시 연골세포에 의한 프로티오글리칸의 양이 유의적으로 증가하였으나, 고분자 알긴산은 프로티오글리칸의 합성에는 영향을 주지 못함을 확인하였다.

실시예 5: 동물모델을 이용한 골관절염 치료 효능 분석

실시예 5-1: 실험 동물

각 군 당 10마리씩 총 30마리의 뉴질랜드 흰색 토끼(New Zealand white rabbit; 3-3.5 kg, 자성)을 사용하였다. 실험동물은 각각 분리된 철제 케이지에서 사육하였고, 고형사료와 음수는 자유급여 하였다.

실시예 5-2: 골관절증 유발

골관절증 유발은 우측 후지의 전십자인대 절제 방법으로 실시하였다. 자일라진 하이드로클로라이드(xylazine hydrochloride) 3 mg/kg 및 케타민 하이드로클로라이드(ketamine hydrochloride) 50 mg/kg을 근육주사하여 전신마취 한 후 우측 후지부를 제모하고 70% 알코올과 10% 포비돈-요오드액으로 소독을 하였다. 우측 후지 무릎관절 내측부를 2 cm 절개하고 근막과 관절낭을 절개 후 슬개골을 외측으로 젖혀서 전십자인대를 노출시켰다. 11호 블레이드를 이용하여 전십자인대를 절제한 후 생리식염수로 세척을 하였다. 슬개골을 제위치 시키고 관절낭과 근막을 4-0 흡수성 봉합사로 단속 봉합하고 피부는 3-0 비흡수성 봉합사로 연속 및 단속 봉합하였다. 10% 포비돈-요오드액으로 봉합부를 소독한 후 항생제(enrofloxacin, 5 mg/kg)를 피하주사하였다.

실시예 5-3: 투여 방법

모든 물질은 경구투여 하였다. 대조군은 생리식염수를 0.5 ml/㎏ 투여하였고, 저분자 알긴산(평균분자량 2,000)군과 고분자 알긴산(평균분자량 98,000)군을 각각 30 ㎎/㎏ B.W 투여하였다. 모든 군은 수술 후 다음날부터 5주째 되는 날까지 매일 경구투여 하였다.

실시예 5-4: 검사 방법

수술 후 6주째 모든 토끼를 자일라진과 케타민으로 마취시킨 후 티오펜탈 소듐(thiopental sodium)을 심장내 주입하여 안락사 시킨 후 무릎 관절을 노출시켜 관절면을 육안적으로 관찰하였다.

대퇴부 관절 내, 외측에서 연골 결손부의 깊이를 인디안 잉크를 도포하여 골관절염 심각도(severity)를 1에서 4의 다섯 단계로 나누어 점수를 부여 하였다: 1은 관절면이 정상으로 보이며 잉크가 묻지 않는 상태를 나타내며, 2는 겉보기엔 정상으로 보이나 잉크 도포시 연회색의 반점형태로 묻는 것을 나타낸다. 3은 관절면이 우둘투둘하며 잉크 도포시 진한 검은 반점이 형성되는 것이며, 4는 연골하골이 드러난 것을 나타낸다.

위와 같이 점수를 매겨서 4개의 점수의 평균을 계산하였다. 객관적인 비교를 위해 2명의 관찰자가 이중맹검법으로 검사를 실시하였다.

육안적 검사 후, 관절염으로 인해 변색되거나 결손된 관절면의 연골을 채취하여 면역조직화학염색법으로 타입 Ⅱ 콜라겐의 발현도를 관찰하고, 프로티오글리칸의 양을 조사하기 위하여 알시안 블루 염색을 하였다. 연골이 완전히 결손되어 연골하골이 드러난 부분은 바로 옆 부분의 연골을 채취하였다.

실시예 5-5: 육안적 검사 결과

대조군, 저분자 알긴산군 및 고분자 알긴산군의 육안적인 검사를 통해 골관절증 심각도 점수를 매긴 결과, 각각 2.95± 0.75, 2.18± 0.75 및 2.82± 0.75의 점수를 나타내어 대조군에 비하여 저분자 알긴산군이 유의적인 감소를 보였으나, 고분자 알긴산군은 대조군과 유사한 결과를 나타내었다(참조: 표 2).

동물모델 실험의 육안적 검사 결과

구분	대조군	저분자 알긴산	고분자 알긴산
중간 대퇴골	3.50± 1.0	2.85± 1.0	3.35± 0.5
측부 대퇴골	2.40± 0.5	1.50± 0.5	2.30± 1.0
총 평균	2.95± 0.75	2.18± 0.75	2.82± 0.75

실시예 5-6: 조직검사 면역조직화학염색(타입 Ⅱ 콜라겐)

면역조직화학염색 검사 결과, 정상 관절쪽 연골에 비하여 대조군과 고분자 알긴산처리군에서 타입 Ⅱ 콜라겐에 대한 염색도가 떨어지는 것을 알 수 있었다. 저분자 알긴산군도 역시 정상 관절쪽 연골과 비교하여 염색도가 떨어졌지만, 다른 두 군에 비하여 상당히 개선된 경향을 나타내었다(참조: 도 2)

실시예 5-7: 조직검사 알시안 블루 염색( 프로티오글리칸 )

알시안 블루 염색 결과도 마찬가지로, 대조군과 고분자 알긴산군의 염색도는 정상 관절쪽 연골에 비하여 많이 떨어져 있었지만, 저분자 알긴산군의 경우 염색도가 정상에 비하여 떨어지긴 하였지만 그 정도가 다른 군에 비하여 덜하였다.(참조: 도 3)

실시예 5의 결과를 종합하면, 본 발명의 저분자 알긴산은 연골조직에서 타입 Ⅱ 콜라겐 및 프로티오글리탄의 생성을 촉진하여 골관절증 동물모델에서 통계적으로 유의성 있는 치료 효능을 나타낸다는 것을 알 수 있다.

Claims (6)

1. 알긴산을 유효성분으로 포함하는 관절 내의 연골 재생용 조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 연골의 타입 Ⅱ 콜라겐 및 프로티오글리칸의 생성을 촉진하는 것을 특징으로 하는 조성물.제 1 항에 있어서, 상기 알긴산은 200-25,000의 분자량을 가지는 알긴산올리고당인 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제 3 항에 있어서, 상기 알긴산은 200-5,000의 분자량을 가지는 알긴산올리고당인 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제 4 항에 있어서, 상기 알긴산은 200-3,000의 분자량을 가지는 알긴산올리고당인 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 조성물 또는 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 경구 투여용 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.