KR20090101442A - 전립선 병태를 진단, 치료 및 예방하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

전립선 병태를 진단, 치료 및 예방하기 위한 조성물 및 방법

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KR20090101442A
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Abstract

전립선암 및 전립선 상피내 종양 (PIN)을 진단, 예방 및 치료하기 위한 조성물 및 방법을 개시한다. hBD-1의 수준

Description

전립선 병태를 진단, 치료 및 예방하기 위한 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS FOR DIAGNOSING, TREATING, AND PREVENTING PROSTATE CONDITIONS}
알킬화제, 항-대사체 및 천연 생성물에 기반한 현재의 항암 화학요법은 그들의 작용 메카니즘에 있어서 이종성이다. 그 결과, 이들 중 대부분은 정상 세포에도 작용하여 환자에게 심각한 부작용 및 독성을 일으킨다.
돌연변이의 축적 및 세포성 제어 기능의 손실은 정상 조직으로부터 초기 전암, 예를 들어 상피내 종양 (IEN)에서 점점 중증 IEN으로, 표재 암으로, 마지막으로 침습성 질병으로 진행하는 표현형 변화를 일으킨다. 상기 과정은 일부 경우에 비교적 침습성일 수 있지만, 일반적으로 수 년 및 심지어 수십 년에 걸쳐 비교적 느리게 일어난다. 종양유전자 중독 (oncogene addiction)은 악성 표현형을 유지하기 위해 단일 종양유전자의 지속적인 활성화 또는 과다발현에 대한 암 세포의 생리학적 의존성이다. 상기 의존성은 신생물성 진행을 표시하는 다른 변화의 환경에서 일어난다.
암 화학예방은 암의 예방 또는 전-암 상태 또는 훨씬 더 초기의 치료로서 정의된다. 침습성 암으로의 장기간의 진행은 후보 화학예방 약물의 임상 이익을 보여주는 주요한 과학적인 기회이지만 또한 경제적인 장애이다. 따라서, 최근에 화학예방제 개발 연구의 중요한 구성요소는 물질의 임상 이익 또는 암 발생-감소 효과를 정확하게 예측하는 보다 초기의 (전암) 종점 (end point) 또는 바이오마커를 확인하는 것이다. 많은 암에서, IEN은 전립선에서와 같이 초기 종점이다.
<발명의 개요>
본 발명의 목적에 따라, 본원에서 구현되고 광범하게 설명되는 바와 같이, 본 발명은 전립선암 및 전립선 상피내 종양 (PIN)을 진단, 치료 및 예방하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
개시된 방법 및 조성물의 추가의 잇점은 부분적으로 다음의 명세서에 설명될 것이고, 부분적으로는 상세한 설명으로부터 이해될 것이거나, 개시된 방법 및 조성물의 실시에 의해 달성될 수 있다. 개시된 방법 및 조성물의 잇점은 특히 첨부된 청구의 범위에서 지적된 요소 및 조합에 의해 실현되고 얻어질 것이다. 상기 일반적인 설명 및 다음의 상세한 설명은 모두 단지 예시적이고 설명하기 위한 것이고, 특허 청구되는 본 발명을 제한하지 않음을 이해해야 한다.
본 명세서에 포함되고 그의 일부를 구성하는 동봉하는 도면은 개시된 방법 및 조성물의 몇몇 실시태양을 예시하고, 상세한 설명과 함께 개시된 방법 및 조성물의 원리를 설명하는 역할을 한다.
도 1은 베타-데펜신-1 (DEFB1) 발현의 정량적 RT-PCR (QRT-PCR) 분석을 보여준다. DEFB1 발현의 유도를 입증하기 위해, QRT-PCR을 수행하였다. 도 1A는 근치적 (radical) 전립선절제술을 받은 6명의 환자로부터의 임상 샘플에서 비교된 DEFB1의 상대적인 발현 수준을 보여준다. 도 1B는 양성 및 악성 전립선 임상 샘플, hPrEC 세포 및 DEFB1 유도 전후의 전립선암 세포주에서 비교된 DEFB1의 상대적인 발현 수준을 보여준다. 도 1C는 단일 조직 절편으로 양성 조직, 악성 조직 및 전립선 상피내 종양 (PIN)에서 분석된 DEFB1의 상대적인 발현 수준을 보여준다. 도 1D는 양성 조직에서 발견된 평균 DEFB1 발현 수준에 비교한 1명의 환자에서 양성 조직, 악성 조직 및 PIN에서 DEFB1 발현을 보여준다.
도 2는 막 통합성 (integrity) 및 세포 형태에서 DEFB1 유도된 변화의 현미경 분석을 보여준다. DU145, PC3 및 LNCaP의 세포 형태를 DEFB1 유도 48시간 후에 위상 대조 현미경으로 분석하였다. 막 러플링 (ruffling)은 흑색 화살표로 표시하고, 세포자멸체 (apoptotic body)는 백색 화살표로 표시한다.
도 3은 전립선암 세포에서 DEFB1 세포독성의 분석을 보여준다. 전립선 세포주 DU145, PC3 및 LNCaP를 DEFB1 발현을 유도하기 위해 PonA로 1-3일 동안 처리하고, 그 후 MTT 분석을 수행하여 세포 생존율 (viability)을 결정하였다. 결과는 평균±s.d. (n=9)를 나타낸다.
도 4는 DEFB1에 의한 DU145 및 PC3 세포에서 세포 사멸의 유도를 보여준다. DEFB1 발현을 전립선암 세포주 DU145 (A) 및 PC3 (B)에서 유도한 후, 아넥신 V/FITC/프로피듐 요오다이드 염색 및 유동 세포측정 분석을 수행하였다. 프로피듐 요오다이드 및 아넥신 V에 대해 양성인 세포는 세포자멸성인 것으로 간주되었다. 유도 시간은 각각의 패널 아래에 나타낸다. 각각의 시점에 대한 상자 다음의 숫자는 프로피듐 요오다이드 (PI)- 아넥신 V+ 세포 (하부 우측 4분면), 및 PI+ 아넥신 V+ 세포 (상부 우측 4분면)의 백분율을 나타낸다. 데이타는 3개의 독립 실험을 대표하는 단일 실험으로부터의 것이다.
도 5는 DEFB1 유도 후에 팬 (pan)-카스파제 분석을 보여준다. DU145 및 PC3 세포를 카스파제 활성을 검출하기 위해 FAM-VAD-FMK-표지된 플루오로메틸 케톤으로 염색하였다. 세포는 각각의 조건에 대해 DIC 하에 가시적이었다. 공초점 현미경 분석으로 대조군 DU145 (B), PC3 세포 (F) 및 LNCaP (J)에서 카스파제 염색이 없는 것으로 밝혀졌다. DEFB1을 유도하기 위해 PonA로 24시간 동안 처리한 세포는 DU145 (D) 및 PC3 (H)에서 카스파제 활성이 있는 것으로 밝혀졌다. LNCaP (L)에서 카스파제 활성이 검출되지 않았다.
도 6은 PAX2 siRNA 처리 후 페어드 박스 호메오 (paired box homeotic) 유전자 2 (PAX2) 단백질 발현의 침묵 (silencing)을 보여준다. 도 6A는 제0일 (레인 1), 제2일 (레인 2) 및 제4일 (레인 3)에서 PAX2 siRNA 이중체로 형질감염된 PC3 및 DU145 세포의 웨스턴 블롯 (Western blot) 분석을 보여준다. 도 6B는 제0일 (레인 1), 제2일 (레인 2), 제4일 (레인 3) 및 제6일 (레인 4)에서 PAX2 siRNA 이중체로 형질감염된 PC3 및 DU145 세포의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다. PAX2 단백질은 DU145 세포에서 처리 4일 후 (레인 3) 및 PC3에서 처리 6일 후와 같이 초기에 검출가능하지 않았다. 블롯을 스트리핑 (stripping)하고, 내부 대조군으로서 β-액틴에 대해 재-프로빙(re-probing)하였다.
도 7은 PAX2 siRNA로 처리한 후 전립선암 세포 성장의 분석을 보여준다. 정상 성장 배지의 존재 하에 6일에서 DU145, PC3 및 LNCaP의 위상 대조 현미경 분석. 음성 대조군 siRNA로 처리하면 세포에 대해 효과가 없었다. 그러나, PAX2 siRNA로 사용한 처리 후 3개의 모든 세포주에서 세포수가 유의하게 감소하였다.
도 8은 PAX2의 siRNA 침묵 후 세포 사멸의 분석을 보여준다. 전립선암 세포주 PC3, DU145 및 LNCaP를 0.5 ㎍의 4개의 PAX2 siRNA의 풀 (pool) 또는 4개의 비-특이적 대조 siRNA의 풀로 2, 4 또는 6일 동안 처리하고, 그 후 MTT 분석을 수행하여 세포 생존율을 결정하였다. 결과는 평균±s.d. (n=9)를 나타낸다.
도 9는 카스파제 활성의 분석을 보여준다. PAX2 siRNA로 처리한 후 카스파제 활성을 검출하기 위해 DU145, PC3 및 LNCaP 세포를 카르복시플루오레세인-표지된 플루오로메틸 케톤으로 염색하였다. 비처리된 및 처리된 세포의 공초점 현미경 분석은 세포가 DIC로 가시적이었음을 보여준다. 형광 하의 분석으로 대조군 DU145 (B), PC3 세포 (F) 및 LNCaP 세포 (J)에서 카스파제 염색이 없는 것으로 밝혀졌다. 그러나, PAX2 siRNA로 처리된 세포는 DU145 (D), PC3 (H) 및 LNCaP (L)에서 카스파제 활성을 유도하였다.
도 10은 PAX2 siRNA 처리 후 세포자멸 인자의 분석을 보여준다. 세포자멸 촉진 (pro-apoptotic) 인자의 발현 변화를 비처리된 대조군 세포에서 및 6일 동안 PAX2 siRNA로 처리한 세포에서 비교하였다. 도 10A는 Bcl-2-연관 X 단백질 (BAX) 발현 수준이 DU145, PC3 및 LNCaP에서 증가하였음을 보여준다. 도 10B는 BH3 상호작용 도메인 사멸 아고니스트 (BID) 발현이 DU145 및 LNCaP에서 증가하지만, PC3에서 변화하였음을 보여준다. 도 10C는 Bcl-2-연관 사멸 프로모터 (BAD) 발현 수준이 3개의 모든 세포주에서 증가하였음을 보여준다.
도 11은 DNA 인식 서열에 대한 PAX2 결합의 모델을 보여준다. PAX2 전사 억제자 (repressor)는 전사 및 DEFB1 단백질 발현을 방지하는 DEFB1 TATA 박스에 바로 인접한 CCTTG (서열 1) 인식 부위에 결합한다. PAX2 단백질 발현의 억제는 정상 DEFB1 발현을 허용한다.
도 12는 DEFB1 리포터 (reporter) 구성체를 도시한 것이다. mRNA 개시 부위의 상류의 처음 160개 염기로 이루어지는 DEFB1 프로모터를 DU145 세포로부터 PCR 증폭시키고, pGL3 루시퍼라제 리포터 플라스미드 내로 라이게이팅하였다.
도 13은 PAX2의 억제가 DEFB1 발현을 일으킴을 보여준다. DU145, PC3, LNCaP 및 HPrEC를 48시간 동안 PAX2 siRNA로 처리하였다. 처리 전의 QRT-PCR 분석은 DU145, PC3 및 LNCaP에서 DEFB1 발현이 없음을 보여주었다. 그러나, DEFB1 발현은 모든 세포주에서 처리 후 회복되었다. PAX2-없는 (null) HprEC의 siRNA 처리 후 DEFB1 발현에서 변화가 없었다.
도 14는 PAX2의 억제가 DEFB1 프로모터 활성을 증가시켰음을 보여준다. PC3 프로모터/pGL3 및 DU145 프로모터/pGL3 구성체를 생성하고, 각각 PC3 및 DU145 세포 내로 형질감염시켰다. 프로모터 활성을 siRNA 처리에 의한 PAX2 억제 전후에 비교하였다. DEFB1 프로모터 활성은 처리 후 DU145에서 2.65배 및 PC3에서 3.78배 증가하였다.
도 15는 DEFB1 프로모터에 대한 PAX2 결합의 ChIP 분석을 보여준다. ChIP 분석을 DU145 및 PC3 세포에 대해 수행하였다. 항-PAX2 항체를 사용한 면역침전 후, PCR을 수행하여 GTTCC PAX2 인식 부위를 함유하는 DEFB1 프로모터 구역을 검출하였다. 이는 PAX2 전사 억제자가 전립선암 세포주에서 DEFB1 프로모터에 결합함을 입증한다.
도 16은 DNA를 갖는 PrdPD 및 PrdHD의 예측된 구조를 보여준다. DNA에 결합된 PrdPD (Xu et al., 1995) 및 DNA에 결합된 PrdHD (Wilson et al., 1995)의 구조의 배위를 사용하여, 이들이 PH0 부위에 결합될 때 2개의 도메인의 모델을 구성하였다. 개별 결합 부위들은 표시된 바와 같은 특이적 배향으로 서로에 이어 인접한다. RED 도메인은 PrdPD 결정 구조에 기초하여 배향된다.
도 17은 상이한 페어드 (paired) 도메인의 컨센서스 서열의 비교를 보여준다. 도면의 상부에 Prd-페어드-도메인±DNA 복합체의 결정학 분석에서 설명된 단백질±DNA 접촉부의 개략도를 보여준다. 빈 상자는 a-나선을 나타내고, 어두운 상자는 b-시트를 나타내고, 두꺼운 선은 b-턴 (turn)을 나타낸다. 접촉하는 아미노산은 단일-문자 코드로 표시된다. 직접적인 아미노산±염기 접촉만을 보여준다. 빈 원은 메이저 그루브 (major groove) 접촉을 나타내는 반면, 적색 화살표는 마이너 (minor) 그루브 접촉을 나타낸다. 상기 도면은 페어드-도메인 단백질에 대한 모든 공지의 컨센서스 서열에 대해 정렬된다 (상부 가닥만을 도시한다). 컨센서스 서열들 사이의 수직선은 보존된 염기쌍을 나타낸다. 위치의 넘버링은 도면의 하부에 도시된다.
도 18은 화학예방 전략으로서 PAX2를 표적화하는 것을 보여준다. 이상 PAX2 발현은 암의 개시 및 진행에서 초기 사건이다. 형성이상 또는 다른 전암성 단계 동안 PAX2의 억제는 암 예방을 위해 사용될 수 있다.
도 19는 DU145 세포에서 PAX2 발현에 대한 안지오텐신 II (AngII)의 효과를 보여준다. PAX2 발현에 대한 AngII의 효과를 결정하기 위해, 처리 후 DEFB1 단백질 수준을 모니터링하였다. 여기서, PAX2 발현 수준은 4시간 정도의 초기에 증가하고, 48시간까지 지속하였다.
도 20A는 DU145에서 PAX2 발현에 대한 로사르탄 (Los)의 효과를 보여준다. DU145 세포를 안지오텐신 II 타입 1 수용체 (ATR1) 차단제 로사르탄으로 처리하였다. QRT-PCR에서는 PAX2 메세지 (message) 수준이 처리 후 적어도 절반으로 감소하였음이 밝혀졌다. 도 20B는 DU145에서 PAX2 발현에 대한 안지오텐신 II 타입 2 수용체 (ATR2) 차단제의 효과를 보여준다. PAX2 발현에 대한 ATR2 수용체의 효과를 결정하기 위해, DU145 세포를 ATR2 수용체 차단제 PD123319로 처리하였다. 여기서, PAX2 발현은 7 내지 8배 증가하였다.
도 21은 Los가 DU145에서 PAX2 발현에 대한 AngII 효과를 차단함을 보여준다. DU145 세포를 5 μM의 AngII로 72시간 동안 처리하면 PAX2 발현을 2배 증가시켰다. 또한, 10 μM로 72시간 동안 처리하면 발현을 3배 초과로 증가시켰다. 세포를 5 μM의 로사르탄으로 처리하면 증식을 50% 억제하였다. 또한, 로사르탄으로 30 min 처리한 후 AngII로 처리하면 증식에 대한 AngII의 효과를 차단하였다.
도 22는 AngII가 DU145 세포 증식을 증가시킴을 보여준다. DU145 세포를 5 μM의 AngII로 72시간 동안 처리하면 증식이 2배 증가하였다. 또한, 10 μM로 72시간 동안 처리하면 증식이 3배 초과로 증가하였다.
도 23은 DU145 세포에서 PAX2 발현에 대한 Los 및 MAP 키나제 억제제의 효과를 보여준다. 도 23A는 DU145 세포를 로사르탄으로 처리하면 포스포르 (phosphor)-ERK 1/2 및 PAX2 발현이 억제됨을 보여주고; 도 23B는 MEK 키나제 억제제 및 AICAR이 PAX2 단백질 발현을 억제함을 보여주고; 도 23C는 MEK 키나제 억제제 및 로사르탄이 포스포-STAT3 단백질 발현을 억제함을 보여준다.
도 24는 DU145 세포에서 PAX2 활성화에 대한 Los 및 MEK 키나제 억제제의 효과를 보여준다. 도 24A는 AT1R 신호전달의 억제제로 DU145 세포를 처리하면 PAX2의 활성형인 포스포르-PAX2 단백질 수준이 감소됨을 보여준다. 또한, AMP 키나제 유도제 AICAR로 처리하면 PAX2 발현이 억제되었다. 도 24B는 AT1R 신호전달을 Los로 억제시키면 포스포-JNK 수준이 감소됨을 보여준다. 그러나, AngII는 포스포르-JNK 단백질 수준을 증가시켰다.
도 25는 AngII가 hPrEC 세포에서 PAX2를 증가시키고 DEFB1 발현을 감소시킴을 보여준다. hPrEC에서 PAX2 수준에 대한 AngII의 효과를 결정하기 위해, 세포를 72 및 96시간 동안 처리하고, PAX2 및 DEFB1 발현을 QRT-PCR에 의해 검사하였다. 여기서, AngII 처리는 PAX2를 PC3 전립선암 세포에 유사한 수준으로 극적으로 증가시켰다. 이와 반대로, DEFB1 발현은 AngII 처리 후 유의하게 감소되었다.
도 26은 AngII 신호전달 및 PAX2 전립선암의 개략도를 보여준다. 전립선암 세포에서 PAX2 발현은 AT1R 신호전달 경로에 의해 조절된다. 구체적으로, MEK 키나제 신호전달 케스케이드는 PAX2 발현을 증가시켰다. 또한, AT1R 및 AngII는 JNK를 통해 PAX2 활성화를 상향조절하였다.
도 27은 전립선암에 대한 요법으로서 PAX2 발현을 차단하는 개략도를 보여준다. 도 27A는 PAX2 발현이 AT1R 신호전달 경로에 의해 조절됨을 보여준다. PAX2 발현의 억제는 DEFB1의 재-발현 및 암세포 사멸을 일으킨다. 도 27B는 AT1R, 하류 키나제를 차단하거나 PAX2를 직접 억제하는 화합물이 전립선암을 치료하는 신규한 방법을 제공함을 보여준다.
도 28은 글리슨 스코어 (Gleason Score)를 사용한 DEFB1 및 PAX2 발현의 비교를 보여준다. DEFB1의 상대적인 발현 수준을 근치적 전립선절제술을 받은 6명의 환자로부터의 양성 임상 샘플에서 비교하였다. 여기서, 글리슨 스코어는 인접한 양성 전립선 조직에서 DEFB1 발현 수준과 역관계이다. 0.005보다 더 높은 상대적인 DEFB1 발현 수준을 갖는 환자는 6의 글리슨 스코어를 가졌다. 그러나, 0.005 미만의 발현 수준을 갖는 환자는 7의 글리슨 스코어를 가졌다.
도 29는 전립선암 발달에 대한 예측 인자로서 PAX2-DEFB1 비를 보여준다. 레이저 포획 미세절제 (microdissection) (LCM) 전립선 조직 절편에 대해 QRT-PCR을 수행하여 상대적인 DEFB1 및 PAX2 발현 수준을 결정하였다. DEFB1 발현 수준은 정상에서부터 PIN으로, 암으로 가면서 감소하였다. 그러나, PAX2 발현은 정상에서부터 PIN으로, 암으로 가면서 증가하였다. 또한, 글리슨 스코어 6의 암을 갖는 환자 #1457은 글리슨 스코어 7의 암을 갖는 환자 #1569에 비해 정상 조직 및 PIN에서 더 많은 DEFB1을 가졌다. 이와 반대로, 환자 #1569는 환자 #1457에 비해 암성 구역에서 더 높은 PAX2 수준을 가졌다.
도 30은 도날드 (Donald) 예측 인자 (DPF)가 상대적인 PAX2-DEFB1 발현비에 기반함을 보여준다. 전립선 조직의 DPF의 증가는 발달하는 전립선암의 가능성을 증가시킨다. DPF에 기초한 PAX2-DEFB1 비가 0 내지 39인 조직은 정상이었다 (양성). PAX2-DEFB1 비가 40 내지 99인 조직은 DPF 스케일에 기초하여 PIN (전-암성)을 나타냈다. 마지막으로, PAX2-DEFB1 비가 100 내지 500인 조직은 악성이었다 (저등급 내지 고등급 암).
도 31은 인간 전립선 조직에서 hBD-1 발현의 분석을 보여준다. hBD-1 상대적인 발현 수준을 근치적 전립선절제술을 받은 환자로부터의 정상 임상 샘플에서 비교하였다. 점선은 육안 (gross) 및 LCM-유래된 시료 사이에 얻은 값을 비교하기 위한 참조 지점으로서 역할을 하고, 상응하는 글리슨 스코어를 각각의 막대 위에 나타낸다. 도 31A는 육안 절제에 의해 얻은 조직에서 비교된 hBD-1 발현 수준을 보여준다. 도 31B는 레이저 포획 미세절제에 의해 얻은 조직에서 비교된 hBD-1 발현 수준을 보여준다.
도 32는 전립선 세포주에서 hBD-1 발현의 분석을 보여준다. 도 32A는 hBD-1 유도 전후에 전립선암 세포주에서 hPrEC 세포에 대해 비교한 hBD-1 발현 수준을 보여준다. 별표는 hPrEC에 비해 통계학상 더 높은 발현 수준을 나타낸다. 이중 별표는 hBD-1 유도 전의 세포주에 비해 통계학상 유의한 발현 수준을 나타낸다 (스튜던트 t-시험 (Student's t-test), p <0.05). 도 32B는 면역세포화학에 의해 이소성 (ectopic) hBD-1 발현이 전립선암 세포주 DU145에서 입증되었음을 보여준다. KPrEC 세포를 양성 대조군으로서 hBD-1에 대해 염색하였다 (a: DIC 및 b: 형광). DU145 세포를 hBD-1로 형질감염시키고, 18 h 동안 유도하였다 (c: DIC 및 d: 형광). 크기막대 (sizebar) = 20 ㎛.
도 33은 전립선암 세포에서 hBD-1 세포독성의 분석을 보여준다. 전립선 세포주 DU145, PC3, PC3/AR+ 및 LNCaP를 hBD-1 발현을 유도하기 위해 PonA로 1-3일 동안 처리하고, 그 후 MTT 분석을 수행하여 세포 생존율을 결정하였다. 각각의 막대는 삼중으로 수행된 3회의 독립 실험의 평균±S.E.M.을 나타낸다.
도 34는 정상, PIN 및 종양의 LCM 인간 전립선 조직 절편에서 hBD-1 및 cMYC 발현의 QRT-PCR 분석을 보여준다. 각각의 유전자에 대한 발현은 β-액틴과 비교한 발현비로서 제시한다. 도 35A는 정상, PIN 및 종양 절편에서 hBD-1 발현 수준의 비교를 보여준다. 도 35B는 정상, PIN 및 종양 절편에서 cMYC 발현 수준의 비교를 보여준다.
도 35는 siRNA를 사용한 PAX2 녹다운 (knockdown) 후 hBD-1 발현의 QRT-PCR 분석을 보여준다. hBD-1 발현 수준은 β-액틴과 비교한 발현비로서 제시한다. 별표는 PAX2 siRNA 처리 전의 세포주에 비교한 통계학상 더 높은 발현 수준을 나타낸다 (스튜던트 t-시험, p <0.05).
도 36은 PAX2 siRNA 처리 후 PAX2 단백질 발현의 침묵을 보여준다. 도 36A는 HPrEC 전립선 1차 세포 (레인 1)에서 및 DU145 (레인 2), PC3 (레인 3) 및 LNCaP (레인 4) 전립선암 세포에서 웨스턴 블롯 분석에 의해 검사한 PAX2 발현을 보여준다. 블롯을 스트리핑하고, 동일한 로딩을 보장하기 위해 내부 대조군으로서 β-액틴에 대해 재-프로빙하였다. 도 36B는 모두 PAX2 siRNA 이중체로 형질감염한 후 PAX2 발현의 녹다운을 확인한 DU145, PC3 및 LNCaP의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다. 다시, 블롯을 스트리핑하고, 내부 대조군으로서 β-액틴에 대해 재-프로빙하였다.
도 37은 PAX2 siRNA로 처리한 후 전립선암 세포 성장의 분석을 보여준다. 음성 대조군 비-특이적 siRNA의 존재 하에 6일에서 HPrEC (A), LNCaP (C), DU145 (E) 및 PC3 (G)의 위상 대조 현미경 분석. PAX2 siRNA로 처리한 후, DU145 (D), PC3 (F) 및 LNCaP (H)에서 세포수가 유의하게 감소하였다. 그러나, HPrEC (B)에 대해 효과가 없는 것으로 보였다. 막대 = 20 ㎛.
도 38은 PAX2의 siRNA 침묵 후 세포 사멸의 분석을 보여준다. 전립선암 세포주 PC3, DU145 및 LNCaP를 PAX2 siRNA 또는 비-특이적 음성 대조군 siRNA로 2, 4 또는 6일 동안 처리하고, 그 후 MTT 분석을 수행하였다. PAX2의 녹다운은 3개의 모든 세포주에서 상대적인 세포 생존율의 감소를 일으켰다. 결과는 평균±SD (n=9)를 나타낸다.
도 39는 카스파제 활성의 분석을 보여준다. PAX2 siRNA로 처리한 후 카스파제 활성을 검출하기 위해, DU145, PC3 및 LNCaP 세포를 카르복시플루오레세인-표지된 플루오로메틸 케톤으로 염색하였다. 형광 하의 분석으로 대조군 DU145 (A), PC3 세포 (C) 및 LNCaP 세포 (E)에서 카스파제 염색이 없는 것으로 밝혀졌다. 그러나, PAX2 siRNA로 처리된 세포는 DU145 (B), PC3 (D) 및 LNCaP (F)에서 카스파제 활성을 유도하였다. 막대 = 20 ㎛.
도 40은 PAX2 siRNA 처리 후 세포자멸 인자의 분석을 보여준다. 세포자멸 촉진 인자의 발현에서의 변화를 비처리된 대조군 세포에서 및 6일 동안 PAX2 siRNA로 처리한 세포에서 비교하였다. 도 41A는 BAD 발현이 PAX2 녹다운 후 DU145, PC3 및 LNCaP에서 증가하였음을 보여준다. 도 41B는 BID 발현 수준이 LNCaP 및 DU145에서 증가하지만, PC3 세포에서 증가하지 않았음을 보여준다. 도 41C는 AKT 발현이 LNCaP 및 DU145에서 감소하였음을 보여준다. 그러나, PAX2 녹다운 후 PC3 세포에서 AKT 발현에서는 변화가 없었다. 결과는 평균±SD (n=9)를 나타낸다. 별표는 통계학적 차이 (p < 0.05)를 나타낸다.
개시된 방법 및 조성물은 특정 실시태양의 다음 상세한 설명 및 본원에 포함된 실시예와 도면과 그의 상기 및 다음 설명을 참조하여 보다 쉽게 이해할 수 있다.
개시된 방법 및 조성물을 위해 사용될 수 있거나, 그와 함께 사용될 수 있거나, 그의 제조에 사용될 수 있거나, 그의 제품인 물질, 조성물 및 성분을 개시한다. 상기 물질 및 다른 물질은 본원에서 개시되고, 이들 물질의 조합, 하위세트, 상호작용, 군 등이 개시될 때, 이들 화합물의 각각의 다양한 개별적인 및 종합적인 조합 및 치환의 구체적인 언급이 명백하게 개시될 수 없지만, 각각은 본원에서 구체적으로 고려되고 설명되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 펩티드가 개시되고 논의되고, 펩티드를 포함한 많은 분자에 대해 이루어질 수 있는 많은 변형이 논의되면, 펩티드의 각각의 및 모든 조합 및 치환과 가능한 변형이 특별히 반대로 지시하지 않는 한 구체적으로 고려된다. 따라서, 분자 A, B 및 C의 클래스가 개시되고 또한 분자 D, E 및 F의 클래스 및 조합 분자 A-D의 예가 개시되면, 각각이 개별적으로 인용되지 않더라도, 각각은 개별적으로 및 종합적으로 고려된다. 따라서, 상기 예에서, 조합 A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E 및 C-F 각각이 구체적으로 고려되고, A, B 및 C; D, E 및 F; 및 예 조합 A-D의 개시내용으로부터 개시되는 것으로 간주되어야 한다. 마찬가지로, 임의의 하위세트 또는 그의 조합이 또한 구체적으로 고려되고 개시된다. 따라서, 예를 들어, A-E, B-F 및 C-E의 하위-군이 구체적으로 고려되고, A, B 및 C; D, E 및 F; 및 예시적인 조합 A-D의 개시내용으로부터 개시되는 것으로 간주되어야 한다. 상기 개념은 개시된 조성물을 제조하고 사용하는 방법에서의 단계를 포함하고 이로 제한되지 않는 본원의 모든 측면에 적용된다. 따라서, 수행될 수 있는 다양한 추가의 단계가 존재하면, 각각의 이들 추가 단계는 개시된 방법의 임의의 특정한 실시태양 또는 실시태양의 조합으로 수행될 수 있고, 각각의 상기 조합은 구체적으로 고려되고, 개시된 것으로 간주되어야 함이 이해된다.
당업자는 단지 통상적인 실험을 이용하여, 본원에 설명된 방법 및 조성물의 구체적인 실시태양에 대한 많은 동등물을 알거나 확인할 수 있을 것이다. 상기한 동등물은 하기 청구의 범위에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
본원에 설명된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약은 변경될 수 있기 때문에 본원에 개시된 방법 및 조성물이 이들로 한정되지 않음을 이해해야 한다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 실시태양을 설명하기 위한 것으로서, 첨부된 청구의 범위에 의해서만 제한될 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않음을 이해해야 한다.
A. 전립선암의 진단, 치료 및 예방
전립선암 및 전립선 상피내 종양 (PIN)을 진단, 치료 및 예방하기 위한 조성물 및 방법을 본원에서 개시한다.
1. 전립선암
전립선의 암종은 많은 국가에서 중요한 질병이 되었고, 서구 사회에서 남성에게서 가장 일반적으로 진단되는 악성종양이고, 그의 발생은 연령에 따라 유의하게 증가한다. 이러한 증가 및 최근에 전립선암으로 인한 많은 유명 인사의 사망으로 인해 상기 암에 관하여 어떤 일을 해야할 필요가 강조되었다. 보다 넓은 스크리닝 (screening)의 이용가능성이 전립선암으로 인한 사망률을 제한할 수 있는 것으로 제안되었다.
전립선암 스크리닝은 현재 직장 검사 및 전립선 특이적 항원 (PSA) 수준의 측정으로 이루어진다. 직장 수지 검사 (digital rectal examination)는 상당한 검사자간 변동성이 있고 PSA 수준은 양성 전립선 비대 (BPH), 전립선 염증 및 다른 병태에서 상승될 수 있으므로, 상기 방법은 특이성이 결여된다. 진단 시험으로서 PSA의 상대적인 실패는 22,000명 초과의 남성의 전향 연구인 Physicians Health Study에 포함되는 동안 전립선암이 발병한 366명의 남성에게서 나타났다. PSA 수준은 연구의 개시 시에 저장된 혈청에서 측정되었고, 상승된 수준은 후속적인 4년 이내에 전립선암이 발병한 남성의 47%에서만 발견되었다 (Gann et al, 1995).
전립선암은 당업자에게 잘 알려진 바와 같이 글리슨 시스템을 사용하여 스코어링할 수 있다 (Gleason, et al. 1966). 이는 세포학적 특징보다는 조직 구조를 이용한다. 1 내지 5의 등급 (잘 분화된 내지 불량하게 분화된)이 사용되고, 및 병변의 가장 빈번하고 가장 중증 영역의 스코어를 합한다. 글리슨 스코어는 종양의 시기의 평가 (시기결정 (staging))에 추가로 유용할 수 있는 예후 정보를 제공한다. 2 내지 4 및 8 내지 10의 글리슨 스코어는 우수한 예측 값을 갖지만, 약 3/4의 종양이 중간값을 갖는다.
전립선암의 시기를 결정하기 위해 2가지 주요 시스템이 사용된다: TNM 및 쥬에트 (Jewett) 시스템 (Benson & Olsson, et al. 1989). 시기결정은 종양의 임의의 전이적 확산을 고려해야 하고, 국소 림프절 연루 또는 국소 침습을 평가하기 어렵기 때문에 어렵다. 종양 조직은 정상 전립선 조직으로부터 거시적으로 구분될 수 없고, 전립선은 구분되는 캡슐이 결여되고 섬유성 지방 조직 층으로 에워싸여져 있어서, 종양 크기를 또한 측정하기가 어렵다.
4개의 카테고리로 전립선 종양의 (T) 시기를 T1 내지 T4로서 설명한다. T1에 있어서, 암은 미시적이고 편측성이고 촉진가능하지 않다. 의사는 종양을 느끼거나, 경직장 초음파와 같은 영상화로 볼 수 없다. BPH에 대한 치료가 질병을 개시한 것일 수 있거나, 상승된 PSA로 인해 수행된 바늘 생검의 이용을 통해 확인되었다. T2에 있어서, 의사는 DRE로 암을 느낄 수 있다. 질병은 전립선의 하나 또는 두 측면 모두에서 전립선에 한정되는 것으로 보인다. T3에 있어서, 암은 전립선 바로 외부의 조직으로 진행한다. T4에 있어서, 암은 신체의 다른 부분으로 확산한다.
따라서, 현재의 스크리닝 방법은 불만족스럽고; 암을 진단하거나, 대부분의 환자에 대한 주요 사인인 그의 가능한 전이 확산을 예측 또는 예방하기 위한 신뢰할만한 방법이 없다.
2. PAX2
Pax 유전자는 핵 전사 인자를 코딩하는 9개의 발달 조절 유전자의 패밀리이다. 이들은 배발생에서 중요한 역할을 하고, 매우 질서정연한 시간 및 공간 패턴으로 발현된다. 이들은 모두 진화 전체에서 고도하게 보존된 DNA 결합 도메인을 코딩하는 384개 염기쌍의 "페어드 박스" 구역을 함유한다 (Stuart, ET, et al. 1994). 발달 과정에 대한 Pax 유전자의 영향은 심지어 Pax 유전자 내의 이종접합 부족에 직접적으로 기여할 수 있는 많은 천연 마우스 및 인간 증후군에 의해 입증되었다. PAX2 서열은 문헌 [Dressier, et al. 1990]에 제공된다. PAX2 발현이 검출된 암의 예를 표 1에 나열한다.
PAX2-발현 암
PAX2 발현 암 미국에서 추정된새로운 환자 미국에서 추정된사망 전세계의 추정된새로운 환자 전세계의 추정된사망
전립선암 234,460 27,350 679,023 221,002
유방암 214,600 41,430 1,151,298 410,712
난소암 20,180 15,310 204,500 124,860
신암 38,890 12,840 208,479 101,895
뇌암 12,820 18,820 189,485 141,650
자궁경부암 9,710 3,700 493,243 273,505
방광암 61,420 13,060 356,556 145,009
백혈병 35,020 22,280 300,522 222,506
카포시 육종 데이타가 이용가능하지 않음 데이타가 이용가능하지 않음 데이타가 이용가능하지 않음 데이타가 이용가능하지 않음
총 (근사치) 627,100 154,790 3,583,106 1,641,139
3. DEFB1
베타-데펜신은 상피 및 백혈구의 생성물인 광범위 항미생물 활성을 갖는 양이온성 펩티드이다 (Ganz and Weiss, 1997). 이들 2개의 엑손, 단일 유전자 생성물은 상피 표면에서 발현되고, 피부 (Harder et al., 1997), 각막 (McNamara et al., 1999), 혀 (Mathews et al., 1999, Jia et al., 2000), 잇몸 ([Mathews et al., 1999]; [Krisanaprakornkit et al., 1998]), 침샘 (Mathews et al., 1999), 식도 (Jia et al., 2000), 장 (O'Neil et al., 1999), 신장 ([Valore et al., 1998]; [Zucht et al., 1998]), 비뇨생식기관 (Valore et al., 1998) 및 호흡 상피 ([Bals et al., 1998]; [Goldman et al., 1997]; [McCray and Bentley. 1997])를 포함한 부위에서 분비된다. 지금까지, 상피 기원의 5개의 베타-데펜신 유전자가 인간에서 확인되고 특성화되었다: DEFB1 (Bensch et al., 1995), DEFB2 (Harder et al., 1997), DEFB3 ([Harder et al., 2001]; [Jia et al., 2001]), DEFB4 및 HE2/EP2.
각각의 베타-데펜신 유전자 생성물의 1차 구조는 작은 크기, 6개의 시스테인 모티프, 높은 양이온성 전하 및 이들 특징을 뛰어넘는 정교한 다양성을 특징으로 한다. 데펜신 단백질의 가장 특징적인 특색은 3개의 디술피드 결합의 네트워크를 형성하는 그들의 6-시스테인 모티프이다. 베타-데펜신 단백질 내의 3개의 디술피드 결합은 C1-C5, C2-C4 및 C3-C6에 존재한다. 인접한 시스테인 잔기 사이의 가장 일반적인 간격은 6, 4, 9, 6, 0이다. 베타-데펜신 단백질 내의 시스테인 사이의 간격은 카르복시 말단에 가장 근접하게 위치한 C5 및 C6에 대한 것을 제외하고는 1 또는 2개의 아미노산에 의해 변화할 수 있다. 모든 공지의 척추동물 베타-데펜신 유전자에서, 이들 2개의 시스테인 잔기는 서로 인접한다.
베타-데펜신 단백질의 두번째 특징은 그들의 작은 크기이다. 각각의 베타-데펜신 유전자는 크기가 59 내지 80개 아미노산이고, 평균 크기가 65개 아미노산인 프리-프로 (pre-pro)-단백질을 코딩한다. 이어서, 상기 유전자 생성물은 미지의 메카니즘에 의해 절단되어, 크기가 36 내지 47개 아미노산이고, 평균 크기가 45개 아미노산인 성숙 펩티드를 생성한다. 상기 범위에 대한 예외는 베타-데펜신 모티프를 함유하고 부고환에서 발현되는 EP2/HE2 유전자 생성물이다.
베타-데펜신 단백질의 세번째 특징은 높은 농도의 양이온성 잔기이다. 성숙 펩티드 내의 양전하를 띈 잔기 (아르기닌, 라이신, 히스티딘)의 수는 6 내지 14이고, 평균 9이다.
베타-데펜신 유전자 생성물의 마지막 특징은 그들의 다양한 1차 구조, 그러나 3차 구조의 명백한 보존이다. 6개의 시스테인을 넘어서, 주어진 위치에서 단일 아미노산은 상기 단백질 패밀리의 모든 공지의 멤버에서 보존되지 않는다. 그러나, 보존된 위치는 2차 및 3차 구조 및 기능에 중요한 것으로 보인다.
베타-데펜신 단백질의 1차 아미노산 서열의 큰 다양성에도 불구하고, 제한된 데이타는 상기 단백질 패밀리의 3차 구조가 보존되는 것을 제안한다. 구조적 코어는 BNBD-12 및 DEFB2에 의해 코딩된 단백질로 예시된 바와 같이 3중-가닥의 역평행 베타-시트이다. 3개의 베타-가닥은 베타-턴 및 알파-헤어핀 (hairpin) 루프에 의해 연결되고, 제2 베타-가닥은 또한 베타-벌지 (bulge)를 함유한다. 이들 구조가 그들의 적합한 3차 구조로 접힐 때, 양이온성 및 소수성 잔기의 겉보기에 랜덤한 서열은 구상 단백질의 2개의 면 내로 집중된다. 하나의 면은 친수성이고 많은 양전하를 띈 측쇄를 함유하고, 다른 면은 소수성이다. 용액 내에서, DEFB2 유전자에 의해 코딩된 HBD-2 단백질은 이전에는 알파-데펜신의 용액 구조에 또는 베타-데펜신 BNBD-12에 속하는 것으로 생각되지 않은 N-말단 부근에서 알파-나선 절편을 보였다. 측쇄가 단백질의 표면에 대해 지향되는 아미노산은 베타-데펜신 단백질 사이에서 덜 보존되는 반면, 코어 베타-시트의 3개의 베타-가닥 내의 아미노산 잔기는 보다 고도로 보존된다.
베타-데펜신 펩티드는 프리-프로-펩티드로서 생산된 후, 절단되어 C-말단 활성 펩티드 단편을 방출하지만, 기도 상피 내의 인간 베타-데펜신 펩티드의 세포내 처리, 보관 및 방출을 위한 경로는 알려지지 않았다.
4. 진단
본 발명의 교시내용의 핵심 잇점은 본원에 개시된 방법이 조직 또는 체액으로부터 전립선암에 걸리거나 전립선암의 위험이 있는 대상을 확인하는 보다 신속하고 단순화된 과정을 제공한다는 점이다.
따라서, 본원에서 개시된 방법은 대상의 조직, 예를 들어 전립선의 생검 샘플에서 PAX2 및/또는 DEFB1의 검출 (측정 포함)을 포함할 수 있다. 전립선 생검은 암의 존재에 대해 시험할 남성의 전립선으로부터 작은 샘플을 제거하는 절차이다. 이는 일반적으로 PSA 혈액 시험으로부터의 스코어가 전립선암의 가능한 존재와 연관된 수준으로 상승할 때 수행된다.
본원에서 개시된 방법은 대상의 세포, 예를 들어 대상의 전립선으로부터의 세포에서 PAX2 및/또는 DEFB1의 검출 (측정 포함)을 포함할 수 있다.
또한, 본원에 개시된 방법은 대상의 체액, 예를 들어 혈액, 소변, 혈장, 혈청, 눈물, 림프, 담즙, 뇌척수액, 간질액, 수성 또는 유리체액, 초유, 가래, 양수, 타액, 항문 및 질 분비액, 땀, 정액, 누출액, 삼출액 및 윤활액 내에서 PAX2 및/또는 DEFB1의 검출 (측정 포함)을 포함할 수 있다. 혈장은 혈액의 액체 성분이고, 여기에 혈액 세포가 현탁되어 있다. 혈장은 혈액의 최대 단일 성분으로, 총 혈액 부피의 약 55%를 구성한다. 혈청은 응고 인자 (예를 들어 피브린)가 제거된 혈장을 나타낸다. 혈장은 피브리노겐, 글로불린 및 인간 혈청 알부민을 포함한 많은 필수 (vital) 단백질을 함유한다. 때때로, 혈장은 바이러스 처리를 통해 추출되어야 하는 바이러스 불순물을 함유할 수 있다.
암의 보다 정확하거나 보다 초기의 진단을 제공하는 혈액 단백질 마커의 확인은 암 치료 및 관리에 긍정적인 영향을 미칠 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 이상 PAX2 발현은 암의 진행에서 초기에 일어나고, 종양발생에서 개시 사건일 수 있다. 따라서, PAX2 단백질 또는 항원의 존재에 대해 스크리닝하기 위해 모은 환자로부터의 샘플은 암의 조기 검출을 위해 사용될 수 있다.
또한, PAX2 스크리닝의 포함은 임상의에게 개시된 또는 전-암성 조직에 대한 예후인자 (prognosticator)를 제공할 수 있다. 상기 시험에 대한 후보는 암에 대한 고위험 (연령, 인종을 기준으로 하여)의 환자를 포함한다. 이어서, 진단 수단으로서, 양성 PAX2 시험 이후에 암 부위를 결정하기 위해 바이오마커를 사용한 추가의 스크리닝을 수행할 수 있다. 또한, 이들 환자는 그들의 암에 대한 화학예방을 위한 PAX2 억제제에 대한 후보일 수 있다. 별법으로, 상기 시험은 그들의 암 요법의 유효성의 측정치로서 또는 암 재발을 모니터링하기 위해 환자에 대해 사용될 수 있다.
다른 예로서, 임상의의 직장 수지 검사 동안 전립선에서 결절의 검출과 같은 암의 잠재적인 표시자를 제시하는 환자 또는 PSA의 갑작스러운 상승을 경험하는 환자는 종종 "주의 대기 (Watchful Waiting)" 상태에 놓인다. 이들 환자가 암에 걸렸는지 또는 암이 발병할 것인지를 확정하는 것은 종종 어렵다. 이들 환자로부터의 샘플, 예를 들어 혈장/혈청 내의 PAX2의 검출은 전립선암이 의심되는 남성에서 생검을 얻기 위한 결정을 돕도록 사용될 수 있고, 이는 불필요한 전립선 생검의 횟수를 감소시키고 그들의 질병에 대한 보다 초기의 개입을 가능하게 할 수 있다.
또한, 대상의 전립선으로부터의 세포 내에서 PAX2 및 베타-데펜신-1 (DEFB1)의 수준을 검출하는 것을 포함하고, 여기서 PAX2 대 DEFB1의 비가 적어도 약 100:1인, 대상에서 전립선암을 진단하는 방법을 본원에서 제공한다.
또한, 대상의 전립선으로부터의 세포 내에서 PAX2 및 베타-데펜신-1 (DEFB1)의 수준을 검출하는 것을 포함하고, 여기서 PAX2 대 DEFB1의 비가 적어도 약 40:1 내지 약 100:1 미만인, 대상에서 전립선 상피내 종양 (PIN)을 진단하는 방법을 본원에서 제공한다.
대상의 전립선으로부터의 세포 내에서 PAX2 및 베타 데펜신-1 (DEFB1)의 수준을 검출하는 것을 포함하고, 여기서 PAX2 대 DEFB1의 비가 약 40:1 미만인, 대상을 정상 전립선을 갖는 것으로서 확인하는 방법을 또한 본원에서 제공한다.
대상의 전립선으로부터의 세포 내에서 PAX2 및 베타 데펜신-1 (DEFB1)의 수준을 검출하는 것을 포함하는, 대상에서 정상, 전-암성 및 암성 전립선 상태를 구분하는 방법을 또한 본원에서 제공한다. 일부 측면에서, PAX2 대 DEFB1의 비가 약 40:1 미만인 경우에, 정상 전립선 상태가 검출된다. 일부 측면에서, PAX2 대 DEFB1의 비가 적어도 약 40:1 내지 약 100:1 미만인 경우에, 전암성 상태가 검출된다. 일부 측면에서, PAX2 대 DEFB1의 비가 적어도 약 100:1인 경우에, 암성 전립선이 검출된다.
5. 진단 및 치료
대상의 전립선으로부터의 세포 내에서 PAX2 및 베타 데펜신-1 (DEFB1)의 수준을 검출하는 것을 포함하고, 여기서 PAX2 대 DEFB1의 비가 적어도 약 100:1이고, 상기 대상을 치료하는 것을 추가로 포함하는, 대상에서 전립선암을 진단 및 치료하는 방법을 또한 본원에서 제공한다.
대상의 전립선으로부터의 세포 내에서 PAX2 및 베타 데펜신-1 (DEFB1)의 수준을 검출하는 것을 포함하고, 여기서 PAX2 대 DEFB1의 비는 적어도 약 40:1 내지 약 100:1 미만이고, 상기 대상을 치료하는 것을 추가로 포함하는, 대상에서 전립선 상피내 종양 (PIN)을 진단 및 치료하는 방법을 또한 본원에서 제공한다.
개시된 방법에 사용된 바와 같이, 전립선암에 대한 치료는 주의 대기, 수술, 방사선 요법, 고강도 집속형 초음파 (HIFU), 화학요법, 한랭수술, 호르몬 요법 또는 일부 조합을 포함할 수 있다. 어떠한 선택이 최선인지는 질병의 시기, 글리슨 스코어, 및 PSA 수준에 의존한다. 다른 중요한 인자는 남성의 연령, 그의 전반적 건강, 및 잠재적인 치료에 대한 그의 느낌 및 그들의 가능한 부작용이다.
암이 전립선을 넘어 확산되면, 치료 선택은 유의하게 변화하고, 따라서 전립선암을 치료하는 많은 의사는 확산의 가능성을 예측하기 위해 다양한 노모그램 (nomogram)을 이용한다. 주의 대기, HIFU, 방사선 요법, 한랭수술 및 수술에 의한 치료는 일반적으로 암이 전립선 내에 남아있는 남성에게 제공된다. 호르몬 요법 및 화학요법은 종종 전립선을 넘어 확산되는 질병을 위해 남겨둔다. 그러나, 예외는 있다: 방사선 요법은 일부 진행된 종양에 대해 사용될 수 있고, 호르몬 요법은 일부 초기 종양에 대해 사용된다. 한랭요법, 호르몬 요법 및 화학요법은 또한 초기 치료가 실패하고 암이 진행하면 제공될 수 있다.
주의 대기 (또한 "능동 감시 (active surveillance)"로도 불림)는 침습적 치료를 하지 않는 관찰 및 규칙적인 모니터링 (monitoring)을 나타낸다. 주의 대기는 종종 초기의 느리게 성장하는 전립선암이 보다 고령의 남성에서 발견될 때 사용된다. 주의 대기는 또한 수술, 방사선 요법 또는 호르몬 요법의 위험이 가능한 이익을 능가할 때 제안될 수 있다. 증상이 발병하면, 또는 암 성장이 가속화하는 징후가 있으면 (예를 들어, 반복 생검에 대한 신속하게 상승하는 PSA, 글리슨 스코어의 증가 등), 다른 치료를 시작할 수 있다. 초기 종양에 대해 주의 대기를 선택하는 대부분의 남성은 궁극적으로 종양 진행의 징후를 갖고, 3년 이내에 치료를 시작하는 것을 필요로 할 수 있다.
전립선의 수술적 제거, 또는 전립선절제술은 초기 전립선암에 대한, 또는 방사선 요법에 반응하지 않는 암에 대한 일반적인 치료법이다. 가장 일반적인 종류는 근치적 치골후 전립선절제술이고, 외과의는 복부 절개를 통해 전립선을 제거한다. 다른 종류는 근치적 회음부 전립선절제술이고, 외과의는 회음부와 항문 사이의 피부에서 회음부 내의 절개를 통해 전립선을 제거한다. 근치적 전립선절제술은 또한 복강경으로 복부 내의 일련의 작은 (1 cm) 절개를 통해 수술 로봇의 도움 하에 또는 도움 없이 수행할 수 있다.
근치적 전립선절제술은 전립선을 넘어 확산하지 않은 종양에 대해 고도로 효과적이고; 치유 속도는 PSA 수준 및 글리슨 등급과 같은 위험 인자에 의존한다. 그러나, 전립선암 생존자의 삶의 질을 유의하게 변경시키는 신경 손상을 일으킬 수 있다. 실데나필 (비아그라 (Viagra)), 타달라필 (시알리스 (Cialis)), 또는 바르데나필 (레비트라 (Levitra))와 같은 의약품을 일부 정도의 성교능을 회복시키기 위해 사용할 수 있다. 장기에 한정된 질병을 갖는 대부분의 남성에 대해서는, 보다 한정된 "신경-보존 (nerve-sparing)" 기술이 요실금 및 발기부전을 피하는 것을 도울 수 있다.
근치적 전립선절제술은 전통적으로 암이 작을 때 단독으로 사용되었다. 병리학에서 발견된 양성 변연 (margin) 또는 국소 진행된 질병의 경우에, 보조 방사선 요법이 생존을 개선시킬 수 있다. 암이 방사선 요법에 반응하지 않을 때 수술을 또한 제공할 수 있다. 그러나, 방사선 요법은 조직 변화를 일으키므로, 방사선 후 전립선절제술은 합병증의 위험이 더 크다.
전립선의 요도경유 절제술 (일반적으로 "TURP"로 불림)은 방광으로부터 음경까지의 관 (요도)이 전립선 비대에 의해 차단될 때 수행되는 수술 절차이다. TURP는 일반적으로 양성 질병에 대한 것이고, 전립선암에 대한 최종 치료를 의미하지 않는다. TURP 동안, 작은 관 (방광경)을 음경 내로 넣고, 차단하는 전립선을 절제한다.
전이성 질병에서, 암이 전립선을 넘어 확산하는 경우에, 테스토스테론 수준을 감소시키고 암 성장을 제어하기 위해 고환의 제거 (고환절제술로 불림)를 수행할 수 있다.
전립선암에 대한 근접치료 (brachytherapy)는 종양 내로 직접 이식된 작은 방사성 막대인 "선원 (seed)"을 사용하여 투여된다. 방사선 요법 (방사선요법으로도 공지됨)에서는 전립선암 세포를 사멸시키기 위해 감마선을 사용한다. 2가지 상이한 종류의 방사선 요법이 전립선암 치료에서 사용된다: 외부빔 (external beam) 방사선 요법 및 근접치료.
외부빔 방사선 요법에서는 전립선을 향한 빔 내에 안내되는 고에너지 감마선을 생산하기 위해 선형 가속기 (accelerator)를 사용한다. 방사선 빔을 종양의 형상과 합치하도록 조정하기 위해 강도 조절 방사선 요법 (IMRT)로 불리는 기술을 사용할 수 있고, 이는 방광 및 직장에 손상을 덜 끼치면서 전립선 및 정낭에 보다 고선량을 제공할 수 있다. 외부빔 방사선 요법은 일반적으로 방사선 요법 센터를 매일 방문하면서 수주에 걸쳐 제공된다.
전립선암에 대한 외부빔 방사선 요법은 이와 같은 선형 가속기에 의해 전달된다. 근접치료는 회음부의 피부를 통해 종양 내로 직접 바늘을 사용하여 방사성 물질 (예를 들어 요오드-125 또는 팔라듐-103)을 함유하는 약 100개의 작은 "선원"의 배치를 포함한다. 이들 선원은 짧은 거리만을 이동할 수 있는 보다 저-에너지 X-선을 방출한다. 근접치료 선원은 전립선 내에 영구히 머물 것이지만, 이식된 선원을 가진 남성은 다른 이를 방사선에 노출시킬 위험이 없다.
방사선 요법은 전립선암 치료에서 일반적으로 사용된다. 이는 초기 암에 대해 수술 대신 사용될 수 있고, 또한 고통스러운 뼈 전이를 치료하기 위해 진행기의 전립선암에서 사용될 수 있다. 방사선 치료는 또한 방사선 요법 단독으로는 암을 치유할 가능성이 적을 때 중간 위험의 질병에 대해 호르몬 요법과 조합될 수 있다. 외부빔 방사선은 중간 내지 고위험 상황에 대해 근접치료와 조합될 수 있다. 외부빔 방사선 요법, 근접치료 및 호르몬 요법의 "삼중 모드 (triple modality)" 조합이 또한 고려된다.
방사선 요법은 의학적 문제로 인해 수술이 보다 위험한 남성에 대해 종종 제공된다. 방사선 요법은 전립선에 한정된 작은 종양을 거의 수술만큼 치유하는 것으로 보인다. 그러나, 2006년 현재에는 방사선이 골반의 나머지 부분에 제공되어야 하는지, 흡수된 선량이 얼마 정도여야 하는지, 및 호르몬 요법이 동시에 제공되어야 하는지 여부와 같이 해결해야할 몇가지 문제가 남아있다.
한랭수술은 전립선암을 치료하는 다른 방법이다. 이는 근치적 전립선절제술보다 덜 침습성이고, 전신 마취는 덜 일반적으로 사용된다. 초음파 안내 하에, 금속 막대를 회음부의 피부를 통해 전립선 내로 삽입한다. 액체 질소를 사용하여 막대를 냉각시켜, 둘러싸는 조직을 -196℃ (-320℉)로 동결시킨다. 전립선 세포 내의 물이 동결하므로, 세포가 사멸한다. 요도는 따뜻한 액체로 채운 카테터 (catheter)에 의해 동결로부터 보호한다. 한랭수술은 일반적으로 소변 제어에서 다른 치료보다 더 적은 문제를 일으키지만, 이 시기에 90%까지 발기부전이 발생한다.
호르몬 요법에서는 전립선암 세포가 디히드로테스토스테론 (DHT) (전립선에서 생산되고 대부분의 전립선암 세포의 성장 및 확산을 위해 필요한 호르몬)를 얻는 것을 차단하는 의약품 또는 수술을 사용한다. DHT를 차단시키면 종종 전립선암의 성장을 중지시키고 심지어 축소시킨다. 그러나, 초기에 호르몬 요법에 반응하는 암은 일반적으로 1 내지 2년 후에 내성으로 되기 때문에 호르몬 요법은 전립선암을 거의 치유하지 않는다. 따라서, 호르몬 요법은 대체로 암이 전립선으로부터 확산될 때 사용된다. 이는 또한 방사선 요법 또는 수술을 받는 남성에게 그들의 암의 재발을 방지하는 것을 돕도록 제공될 수 있다.
전립선암에 대한 호르몬 요법은 DHT를 생산하기 위해 인체가 사용하는 경로를 표적으로 한다. 고환, 시상하부, 및 뇌하수체선, 부신선 및 전립선을 포함하는 피드백 (feedback) 루프가 DHT의 혈액 수준을 제어한다. 먼저, DHT의 낮은 혈액 수준은 시상하부를 자극하여 성선자극호르몬 (gonadotropin) 방출 호르몬 (GnRH)을 생산시킨다. 이어서, GnRH는 뇌하수체선을 자극하여 황체형성 호르몬 (LH)을 생산시키고, LH는 고환을 자극하여 테스토스테론을 생산시킨다. 마지막으로, 고환으로부터의 테스토스테론 및 부고환으로부터의 데히드로에피안드로스테론은 전립선을 자극하여 보다 많은 DHT를 생산시킨다. 호르몬 요법은 상기 경로를 임의의 지점에서 중단시킴으로써 DHT의 수준을 감소시킬 수 있다.
고환절제술은 고환을 제거하기 위한 수술이다. 고환은 대부분의 체내 테스토스테론을 생산하기 때문에, 고환절제술 후 테스토스테론 수준은 급감한다. 이제 전립선은 DHT를 생산하기 위한 테스토스테론 자극이 결핍될 뿐만 아니라, DHT로 전환하기 위한 테스토스테론이 충분하지 않다.
항안드로겐은 전립선암 세포 내에서 테스토스테론 및 DHT의 작용을 직접 차단시키는 플루타미드, 비칼루타미드, 닐루타미드 및 시프로테론 아세테이트와 같은 의약품이다.
DHEA와 같은 부신 안드로겐의 생산을 차단하는 의약품은 케토코나졸 및 아미노글루테티미드를 포함한다. 부신은 체내 안드로겐의 약 5%만을 구성하므로, 이들 의약품은 일반적으로 고환에서 제조된 안드로겐의 95%를 차단할 수 있는 다른 방법과 조합으로만 사용된다. 이들 조합 방법을 총 안드로겐 차단 (TAB)로 부른다. TAB는 또한 항안드로겐를 사용하여 달성할 수 있다.
GnRH 작용은 2가지 방식 중 하나로 중단될 수 있다. GnRH 길항제는 GnRH의 생산을 직접 억제하는 반면, GnRH 아고니스트는 초기의 자극 효과 후 하향조절의 과정을 통해 GnRH를 억제한다. 아바렐릭스는 GnRH 길항제의 예인 반면, GnRH 아고니스트는 류프롤리드, 고세렐린, 트립토렐린 및 부세렐린을 포함한다. 초기에, 이들 의약품은 LH의 생산을 증가시킨다. 그러나, 의약품의 일정한 공급이 신체의 자연 생산 리듬에 일치하지 않기 때문에, LH 및 GnRH 모두의 생산은 수주 후에 감소한다.
6. 치료/예방
전립선 상피내 종양 (PIN)으로 진단된 대상에게 PAX2 발현 또는 활성의 억제제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 전립선암을 예방하는 방법을 또한 본원에서 제공한다. 단백질의 "활성"은 예를 들어, 전사, 번역, 세포내 전위 (translocation), 분비, 키나제에 의한 인산화, 프로테아제에 의한 절단, 다른 단백질에 대한 동종친화성 및 이종친화성 결합, 유비퀴틴화를 포함한다. 일부 측면에서, "PAX2 활성"은 구체적으로 DEFB-1 프로모터에 대한 PAX2의 결합을 나타낸다. 대상을 전립선 상피내 종양 (PIN)으로 진단하고, 대상에게 PAX2 발현 또는 활성의 억제제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 전립선암을 예방하는 방법을 또한 본원에서 제공한다. 대상은 대상의 전립선으로부터의 세포 내에서 PAX2 및 베타 데펜신-1 (DEFB1)의 수준을 검출함으로써 (여기서, PAX2 대 DEFB1의 비는 적어도 약 40:1 내지 약 100:1 미만임), PIN으로 진단받을 수 있다.
일부 측면에서, PAX2는 PIN 전에 위축 시기에 상향조절된다. 따라서, 대상의 전립선으로부터의 세포 내에서 PAX2 및 베타 데펜신-1 (DEFB1)의 수준을 검출하고, 여기서 PAX2 대 DEFB1의 비는 적어도 약 40:1 내지 약 100:1이고, 대상에게 PAX2 발현 또는 활성의 억제제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 전립선암을 예방하는 방법을 또한 제공한다.
대상을 PIN으로 진단하고 대상에게 PAX2 발현 또는 활성의 억제제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 전립선 상피내 종양 (PIN)을 치료하는 방법을 또한 본원에서 제공한다. 대상은 대상의 전립선으로부터의 세포 내에서 PAX2 및 베타 데펜신-1 (DEFB1)의 수준을 검출함으로써 (여기서, PAX2 대 DEFB1의 비는 적어도 약 40:1 내지 약 100:1 미만임), PIN으로 진단받을 수 있다.
대상의 전립선으로부터의 세포 내에서 PAX2 및 베타 데펜신-1 (DEFB1)의 수준을 검출하고, 여기서 PAX2 대 DEFB1의 비는 적어도 약 40:1 내지 약 100:1 미만이고, 대상에게 PAX2 발현 또는 활성의 억제제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 전립선 상피내 종양 (PIN)을 치료 또는 예방하는 방법을 또한 제공한다.
대상을 전립선암으로 진단하고 대상에게 PAX2 발현 또는 활성의 억제제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 전립선암을 치료하는 방법을 또한 본원에서 제공한다. 대상은 대상의 전립선으로부터의 세포 내에서 PAX2 및 베타 데펜신-1 (DEFB1)의 수준을 검출함으로써 (여기서, PAX2 대 DEFB1의 비는 적어도 약 100:1임), 전립선암으로 진단받을 수 있다.
개시된 방법의 억제제는 안지오텐신 II의 선택적 길항제일 수 있다. 개시된 방법의 억제제는 안지오텐신-전환 효소 (ACE)의 선택적 길항제일 수 있다. 예를 들어, 억제제는 에날라프릴일 수 있다. 억제제는 안지오텐신 II 타입 1 수용체 (AT1R)의 선택적 길항제일 수 있다. 예를 들어, 억제제는 발사르탄, 올메사르탄 또는 텔미사르탄일 수 있다. 억제제는 MEK의 선택적 길항제일 수 있다. 억제제는 ERK1,2의 선택적 길항제일 수 있다. 억제제는 STAT3의 선택적 길항제일 수 있다. 억제제는 PAX2의 선택적 길항제일 수 있다. 억제제는 베타 데펜신-1 (DEFB1) 프로모터에 대한 PAX2의 결합을 차단할 수 있다. 일부 측면에서, PAX2 발현 또는 활성의 개시된 억제제는 AT1R 수용체 길항제가 아니다.
"선택적 길항제"는 표적에 직접 결합하고 그의 활성을 억제하는 것을 의미한다. 단백질의 "활성"은 예를 들어, 전사, 번역, 세포내 전위, 분비, 키나제에 의한 인산화, 프로테아제에 의한 절단, 다른 단백질에 대한 동종친화성 및 이종친화성 결합, 유비퀴틴화를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 키나제의 선택적 길항제는 키나제에 결합하고 키나제에 의한 표적의 인산화를 억제할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 키나제의 선택적 길항제는 키나제에 결합하고 그의 기질에 대한 키나제의 결합을 방지할 수 있다.
대상에게 MEK 및/또는 ERK1,2의 선택적 길항제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 전립선암을 치료 또는 예방하는 방법을 또한 본원에서 제공한다. 이는 또한 PAX2의 발현을 억제하는 방법일 수 있다. 상기 방법에서 대상은 전-암성 상태 (예를 들어, PIN)로 또는 암으로 처음 진단받을 수 있다.
MEK 및/또는 ERK1,2의 선택적 길항제는 U0126일 수 있다. U0126은 초기에 세포성 AP-1 길항제로서 인정되었고, 그의 바로 상류 활성인자인 미토겐 활성화된 단백질 키나제 1 및 2 (MEK1 및 MEK2로도 공지됨, IC50: 각각 70 및 60 nM)를 억제함으로써 미토겐-활성화된 단백질 키나제 (MAPK) 캐스케이드의 매우 선택적이고 고도로 강력한 억제제인 것으로 밝혀진 화학 합성된 유기 화합물이다. U0126은 불활성 MEK의 활성화만을 억제하는 PD098059와는 달리, 활성 및 불활성 MEK1,2를 모두 억제한다. MEK 활성화의 차단은 p62TCF (Elk-1) (AP-1 복합체의 성분인 c-Fos 및 c-Jun의 상류 유도인자)를 포함한 많은 인자의 하류 인산화를 방지할 것이다. U0126에 의한 MEK/ERK 경로의 억제는 또한 발암성 H-Ras 및 K-Ras의 모든 효과를 방지하고, 성장 인자에 의해 촉발된 효과의 일부를 억제하고, 염증성 사이토킨 및 매트릭스 메탈로프로테이나제의 생산을 차단한다.
MEK 및/또는 ERK1,2의 선택적 길항제는 PD98059일 수 있다. PD98059 (MEK1 억제제)는 MEK1 활성화 및 MAP 키나제 캐스케이드의 고도의 선택적 억제제로서 생체 내에서 작용하는 것으로 나타났다. PD98059는 불활성 형태의 MEK1에 결합하고, c-Raf와 같은 상류 활성인자에 의한 활성화를 방지한다. PD98059는 MEK1 및 MEK2의 활성화를 각각 4 μM 및 50 μM의 IC50 값으로 억제한다.
대상에게 STAT3의 선택적 길항제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 전립선암을 치료 또는 예방하는 방법을 또한 제공한다. 이는 또한 PAX2의 발현을 억제하는 방법이다. 상기 방법에서 대상은 전-암성 상태 (예를 들어, PIN)로 또는 암으로 처음 진단받을 수 있다.
본원에 제시된 바와 같이, PAX2는 DEFB1의 발현을 억제하고, DEFB1은 종양 세포 치사 활성을 갖는 것으로 나타났다. 따라서, PAX2의 발현을 억제함으로써 대상에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 의해 치료되는 암의 예는 전립선암이다. 본 발명의 방법은 후기 전립선암의 치료를 위해 특히 효과적이다.
개시된 암 치료 방법에서, PAX2의 발현을 억제하는 방법은 PAX2에 대한 siRNA를 코딩하는 핵산의 투여에 의할 수 있다. 다마콘 (Dharmachon)이 상기 siRNA의 상업적인 공급처이다.
예를 들어, 본 방법에서 사용하기 위한 siRNA는 하기 서열 2, 4, 6, 8, 또는 그의 적어도 10개의 핵산의 단편 및 보존적 변이체를 포함한 그의 조합을 포함할 수 있다:
AUAGACUCGACUUGACUUCUU (서열 2),
AUCUUCAUCACGUUUCCUCUU (서열 4),
GUAUUCAGCAAUCUUGUCCUU (서열 6),
GAUUUGAUGUGCUCUGAUGUU (서열 8).
PAX2를 억제하는 분자에 대한 표적 서열의 추가의 예는 다음을 포함한다:
#1 ACCCGACTATGTTCGCCTGG (서열 56),
#2 AAGCTCTGGATCGAGTCTTTG (서열 57), 및
#4 ATGTGTCAGGCACACAGACG (서열 58). #4는 또한 PAX2를 억제하는 것으로 나타났다 (Davies et al., Hum. Mol. Gen Jan. 15, 13(2); 235).
또다른 논문 (Muratovska et al., Paired-Box genes are frequently expressed in cancer and often required for cancer cell survival Oncogene (2003) 22, 7989-7997)에는 다음 siRNA가 개시되어 있다: GUCGAGUCUAUCUGCAUCCTT (서열 59) 및 GGAUGCAGAUAGACUCGACTT (서열 60).
Pax2 발현을 하향-조절하기 위해, 폰사토 (Fonsato) 등은 종양-유래된 내피 세포를 안티센스 PAX2 벡터로 형질감염시켰다 (상기 분자의 설명에 대하여 본원에 참고로 포함된 문헌 [Fonsato V. et al. Am J Pathol. 2006;168(2):706-1] 참조). 이와 유사하게, 후버 (Hueber) 등은 PAX2 안티센스 cDNA 및 PAX2-작은 간섭 RNA (100 nM)가 내인성 PAX2 단백질을 감소시키는 것으로 교시하였다 (PAX2 안티센스 및 PAX2 siRNA의 교시에 관하여 본원에 참고로 포함된 문헌 [Hueber et al. Kidney Int. 2006] 참조).
현재 개시된 방법에서 DEFB1 발현을 증가시키기 위해, PAX2 발현 또는 DEFB1 프로모터에 대한 PAX2의 결합의 추가의 억제제가 제공된다. 예를 들어, DEFB1 프로모터에 대한 PAX2의 결합을 저해하거나 억제하기 위해 본 연구를 기초로 하여 소분자 및 항체를 설계할 수 있다.
본원에서 제시된 바와 같이, PAX2는 DEFB1의 발현을 억제하고, DEFB1은 종양 세포 치사 활성을 갖는 것으로 나타났다. 따라서, DEFB1을 투여함으로써 대상에서 암을 치료하는 방법을 또한 제공한다. 본 발명의 방법에 의해 치료되는 암의 예는 전립선암이다.
이와 유사하게, 대상에서 DEFB1의 발현을 증가시킴으로써 대상에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. DEFB1을 투여하거나 그의 발현을 증가시키는 본 발명의 방법은 후기 전립선암의 치료를 위해 특히 효과적이다.
DEFB1을 투여하거나 DEFB1 발현을 증가시킴으로써 (예를 들어, PAX2의 발현 또는 결합을 억제함으로써) 암을 치료하기 위한 본 발명의 방법의 한 실시태양에서, 대상은 전립선암으로 진단받은 대상이다. DEFB1을 투여하거나 DEFB1 발현을 증가시킴으로써 (예를 들어, PAX2의 발현 또는 결합을 억제함으로써) 암을 치료하기 위한 본 발명의 방법의 추가의 실시태양에서, 대상은 진행 (후기) 전립선암으로 진단받은 대상이다.
DEFB1의 발현을 증가시키는 방법에서, 이는 DEFB1 프로모터에 대한 PAX2의 결합을 차단함으로써 증가시킬 수 있다. DEFB1 프로모터에 대한 PAX2의 결합의 차단은 DEFB1의 PAX2 DNA 결합 부위를 함유하는 올리고뉴클레오티드의 투여에 의할 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 DEFB1 프로모터에 결합하는 PAX2의 서열에 상보성일 수 있다. 별법으로, 올리고뉴클레오티드는 DEFB1에 대한 결합을 억제하는 방식으로 PAX2와 상호작용할 수 있다. 상기 상호작용은 1차 뉴클레오티드 서열보다는 3차원 구조에 기반할 수 있다.
PAX 단백질은 진화 동안 보존된 전사 인자의 패밀리이고, "페어드 도메인" 및 "호메오도메인"으로 불리는 도메인을 통해 특이적 DNA 서열에 결합할 수 있다. 페어드 도메인 (PD)은 특정 PAX 단백질 (예를 들어, PAX2 및 PAX6)에 의해 공유되는 컨센서스 서열이다. PD는 α3-나선 형성 DNA-단백질 복합체에 위치하는 아미노산의 DNA 결합을 지시한다. PAX2에 대해, HD 내의 아미노산은 CCTTG (서열 1) DNA 코어 서열을 인식하고 특이적으로 상호작용한다. 상기 서열 또는 그의 상보체를 포함하는 길이가 64개 염기 이하이거나 그를 초과하는 올리고뉴클레오티드가 억제제인 것으로 예상된다.
PAX-8 페어드 도메인의 DNA-결합 특이성을 조사하였다. 부위 선택 실험은 PAX-8이 PAX-2 및 PAX-5가 결합하는 것과 유사한 컨센서스 서열에 결합함을 보여주었다. 각종 페어드 도메인의 컨센서스 서열을 페어드-도메인-DNA 상호작용을 설명하는 최근의 구조 연구 (Xu, et al. 1995)에 비추어 관찰하면, 마이너 그루브 내에 접촉된 염기쌍은 보존되는 반면, 메이저 그루브 내에 접촉된 염기쌍의 대부분은 그렇지 않은 것으로 보인다. 따라서, 특이적 마이너 그루브 접촉의 네트워크는 페어드-도메인-DNA 상호작용의 공통적인 특징이다. 상기 네트워크의 기능적 중요성은 DEFB1 프로모터의 PAX2 결합 부위에 대한 컨센서스-기반 돌연변이의 효과를 분석함으로써 성공적으로 시험할 수 있다.
DEFB1의 PAX2 DNA 결합 부위는 서열 1 (CCTTG)을 포함할 수 있다.
DEFB1의 PAX2 DNA 결합 부위를 포함하는 올리고뉴클레오티드는
X1-CCTTG (서열 1)-X2 (식에서, X1은 DEFB1의 1 내지 35개의 인접하는 뉴클레오티드이고, X2는 1 내지 35개 뉴클레오티드이다)로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 뉴클레오티드는 정상적으로 DEFB1의 PAX2 DNA 결합 부위에 인접하는 인접 뉴클레오티드일 수 있다. 별법으로, 이들은 DEFB1과 비관련되고, 인식 서열과의 간섭을 피하기 위해 일상적으로 선택될 수 있다.
예를 들어, 억제성 올리고뉴클레오티드는 다음 서열로 이루어지는 군 중에서 선택될 수 있다:
CTCCCTTCAGTTCCGTCGAC (서열 9),
CTCCCTTCACCTTGGTCGAC (서열 10),
ACTGTGGCACCTCCCTTCAGTTCCGTCGACGAGGTTGTGC (서열 12),
ACTGTGGCACCTCCCTTCACCTTGGTCGACGAGGTTGTGC (서열 13).
개시된 조성물은 암과 같은 비제어된 세포 증식이 일어나는 임의의 질병을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 상이한 종류의 암의 비-제한적인 종류는 다음과 같다: 림프종 (호지킨 (Hodgkin) 및 비-호지킨), 백혈병, 암종, 고형 조직의 암종, 편평 세포 암종, 선암종, 육종, 신경아교종, 고등급 신경아교종, 모세포종, 신경모세포종, 형질세포종, 조직구종, 흑색종, 선종 (adenoma), 저산소성 종양, 골수종, AIDS-관련 림프종 또는 육종, 전이성 암 또는 일반적인 암.
치료를 위해 개시된 조성물을 사용할 수 있는 암의 대표적이지만 비-제한적인 종류는 다음과 같다: 림프종, B 세포 림프종, T 세포 림프종, 균상식육종, 호지킨 병, 골수성 백혈병, 방광암, 뇌암, 신경계암, 두경부암, 두경부의 편평 세포 암종, 신장암, 폐암, 예를 들어 소세포 폐암 및 비-소세포 폐암, 신경모세포종/아교모세포종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 간암, 흑색종, 입, 인후, 후두, 및 폐의 편평 세포 암종, 결장암, 자궁경부암, 자궁경부 암종, 유방암 및 상피암, 신암, 비뇨생식기암, 폐암, 식도 암종, 두경부 암종, 대장암, 조혈암; 정소암; 결장 및 직장암, 전립선암 또는 췌장암. 본원에 개시된 화합물은 또한 자궁경부 및 항문 형성이상, 다른 형성이상, 중증 형성이상, 과다형성, 비정형 과다형성 및 신생물과 같은 전암 상태의 치료를 위해 사용될 수 있다. 또한, 만성 염증으로부터 유래하는 많은 질병, 예를 들어, 전립선염 및 양성 전립선 비대 (BPH), 및 전립선의 각종 암이 본 발명의 방법 및 화합물에 의해 영향을 받을 수 있다.
DEFB1의 유전자 로커스 (8p23.3)은 결실에 대한 빈발점 (hotspot)이고, 보다 불량한 예후의 환자와 연관되었다. 따라서, DEFB1 (및 아마도 PAX2)는 예를 들어, 전립선암의 조기 검출을 위한 스크리닝에서 바이오마커로서 사용될 수 있다. 또한, 본원에 제시된 데이타는 그의 손실이 PIN과 같이 초기에 (또는 심지어 그 전에) 일어날 수 있고, 전립선암 발병의 주요 기여 인자일 수 있음을 나타낸다.
B. 조성물
1. 면역분석
개시된 방법에서 사용될 수 있는 당업계에 공지되거나 새로 발견된, 분석물, 예를 들어 단백질, 예를 들어 PAX2 및/또는 DEFB1을 검출하기 위한 수많은 방법이 존재한다. 예를 들어, PAX2 및/또는 DEFB1은 표준 면역검출 방법을 이용하여 검출할 수 있다. 각종 유용한 면역검출 방법의 단계는 예를 들어, 특히 면역검출 방법에 관한 교시 내용에 대하여 각각 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 문헌 ([Maggio et al., Enzyme-Immunoassay (1987)] 및 [Nakamura, et al., Enzyme Immunoassays: Heterogeneous and Homogeneous Systems, Handbook of Experimental Immunology, Vol. 1: Immunochemistry, 27.1-27.20 (1986)])과 같은 학술 문헌에 설명되었다. 면역분석은 가장 간단하고 직접적인 의미에서 항체와 항원 사이의 결합을 포함한 결합 분석이다. 많은 종류 및 포맷의 면역분석이 공지되어 있고, 모두 개시된 바이오마커를 검출하기 위해 적합하다. 면역분석의 예는 효소 연결 면역흡착 분석 (ELISA), 방사성 면역분석 (RIA), 방사성 면역 침전 분석 (RIPA), 면역비드 포획 분석, 웨스턴 (Western) 블로팅, 도트 (dot) 블로팅, 겔 이동 (gel-shift) 분석, 유동 세포측정, 단백질 어레이, 다중 (multiplexed) 비드 어레이, 자기 포획, 생체내 영상화, 형광 공명 에너지 전이 (FRET), 및 광표백 후 형광 회복/국소화 (FRAP/FLAP)이다.
일반적으로, 면역분석은 면역복합체의 형성을 허용하기에 효과적인 조건 하에 경우에 따라 관심있는 분자 (예를 들어 개시된 바이오마커)를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 관심있는 분자에 대한 항체와 접촉시키거나, 관심있는 분자에 대한 항체 (예를 들어 개시된 바이오마커에 대한 항체)를 항체에 의해 결합될 수 있는 분자와 접촉시키는 것을 포함한다. 샘플을 관심있는 분자에 대한 항체와 또는 관심있는 분자에 대한 항체에 의해 결합될 수 있는 분자와 면역 복합체 (1차 면역 복합체)의 형성을 허용하기 위해 효과적인 조건 하에 충분한 시간 동안 접촉시키는 것은 일반적으로 간단히 분자 또는 항체 및 샘플을 접촉시키고, 혼합물을 항체가 항체가 결합할 수 있는 존재하는 임의의 분자 (예를 들어, 항원)와 면역 복합체를 형성하기에, 즉 그에 결합하기에 충분한 시간 동안 인큐베이팅하는 문제이다. 많은 형태의 면역분석에서, 이어서, 1차 면역 복합체 내에 특이적으로 결합된 항체만이 검출되도록 임의의 비-특이적으로 결합된 항체 종을 제거하기 위해 샘플-항체 조성물, 예를 들어 조직 절편, ELISA 플레이트, 도트 블롯 또는 웨스턴 블롯은 세척될 수 있다.
면역분석은 샘플 내의 관심있는 분자 (예를 들어 개시된 바이오마커 또는 그들의 항체)의 양을 검출 또는 정량하기 위한 방법을 포함할 수 있고, 상기 방법은 일반적으로 결합 과정 동안 형성된 임의의 면역 복합체의 검출 또는 정량을 포함한다. 일반적으로, 면역복합체 형성의 검출은 당업계에 잘 알려져 있고, 수많은 방법의 적용을 통해 달성할 수 있다. 이들 방법은 일반적으로 표지 또는 마커, 예를 들어 임의의 방사성, 형광, 생물학적 또는 효소적 태그 또는 임의의 다른 공지된 표지의 검출에 기반한다. 예를 들어, 특히 면역검출 방법 및 표지에 관한 교시 내용에 대해 각각 그 전문을 본원에 참고로 포함하는 미국 특허 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 및 4,366,241을 참조한다.
본원에서 사용될 때, 표지는 예를 들어 착색된 기질 또는 형광을 생성함으로써 검출될 수 있는 분자와 특이적으로 상호작용할 수 있는 형광 염료, 결합쌍의 멤버, 예를 들어 비오틴/스트렙타비딘, 금속 (예를 들어, 금), 또는 에피토프 태그를 포함할 수 있다. 단백질을 검출가능하게 표지하기 위해 적합한 물질은 형광 염료 (본원에서 또한 플루오로크롬 및 형광단으로도 공지됨) 및 비색 기질과 반응하는 효소 (예를 들어, 호스래디시 (horseradish) 퍼옥시다제)를 포함한다. 형광 염료는 매우 소량에서 검출될 수 있으므로 본 발명의 실시에서 일반적으로 바람직하다. 또한, 다수의 항원이 단일 어레이와 반응하는 경우에, 각각의 항원은 동시 검출을 위해 구분되는 형광 화합물로 표지될 수 있다. 어레이 상의 표지된 지점은 형광분석기를 사용하여 검출하고, 신호의 존재는 특이적 항체에 결합된 항원을 나타낸다.
형광단은 발광하는 화합물 또는 분자이다. 대개, 형광단은 하나의 파장에서 전자기 에너지를 흡수하고, 제2 파장에서 전자기 에너지를 방출한다. 대표적인 형광단은 1,5-IAEDANS; 1,8-ANS; 4-메틸움벨리페론; 5-카르복시-2,7-디클로로플루오레세인; 5-카르복시플루오레세인 (5-FAM); 5-카르복시나프토플루오레세인; 5-카르복시테트라메틸로다민 (5-TAMRA); 5-히드록시트립타민 (5-HAT); 5-ROX (카르복시-X-로다민); 6-카르복시로다민 6G; 6-CR 6G; 6-JOE; 7-아미노-4-메틸쿠마린; 7-아미노액티노마이신 D (7-AAD); 7-히드록시-4--메틸쿠마린; 9-아미노-6-클로로-2-메톡시아크리딘 (ACMA); ABQ; 애시드 푸크신 (Acid Fuchsin); 아크리딘 오렌지; 아크리딘 레드; 아크리딘 옐로우; 아크리플라빈; 아크리플라빈 페울겐 SITSA; 애쿠오린 (발광단백질); AFP - 자가형광 단백질 - (콴텀 바이오테크놀로지스 (Quantum Biotechnologies)) (예를 들어 sgGFP, sgBFP); 알렉사 플루오르 (Alexa Fluor) 350™; 알렉사 플루오르 430™; 알렉사 플루오르 488™; 알렉사 플루오르 532™; 알렉사 플루오르 546™; 알렉사 플루오르 568™; 알렉사 플루오르 594™; 알렉사 플루오르 633™; 알렉사 플루오르 647™; 알렉사 플루오르 660™; 알렉사 플루오르 680™; 알리자린 컴플렉손; 알리자린 레드; 알로피코시아닌 (APC); AMC, AMCA-S; 아미노메틸쿠마린 (AMCA); AMCA-X; 아미노액티노마이신 D; 아미노쿠마린; 아닐린 블루; 안트로실 스테아레이트; APC-Cy7; APTRA-BTC; APTS; 아스트라존 (Astrazon) 브릴리언트 레드 4G; 아스트라존 오렌지 R; 아스트라존 레드 6B; 아스트라존 옐로우 7 GLL; 아타브린; ATTO-TAG™ CBQCA; ATTO-TAG™ FQ; 아우라민; 아우로포스핀 G; 아우로포스핀; BAO 9 (비스아미노페닐옥사디아졸); BCECF (높은 pH); BCECF (낮은 pH); 베르베린 술페이트; 베타 락타마제; BFP 블루 이동 GFP (Y66H); 블루 형광 단백질; BFP/GFP FRET; 비메인; 비스벤제미드; 비스벤지미드 (획스트 (Hoechst)); 비스-BTC; 블랑코포르 FFG; 블랑코포르 SV; BOBO™-1; BOBO™-3; 보디피 (Bodipy) 492/515; 보디피 493/503; 보디피 500/510; 보디피 505/515; 보디피 530/550; 보디피 542/563; 보디피 558/568; 보디피 564/570; 보디피 576/589; 보디피 581/591; 보디피 630/650-X; 보디피 650/665-X; 보디피 665/676; 보디피 Fl; 보디피 FL ATP; 보디피 Fl-세라미드; 보디피 R6G SE; 보디피 TMR; 보디피 TMR-X 컨쥬게이트; 보디피 TMR-X, SE; 보디피 TR; 보디피 TR ATP; 보디피 TR-X SE; BO-PRO™-1; BO-PRO™-3; 브릴리언트 술포플라빈 FF; BTC; BTC-5N; 칼세인; 칼세인 블루; 칼슘 크림슨-; 칼슘 그린; 칼슘 그린-1 Ca2 + 염료; 칼슘 그린-2 Ca2 +; 칼슘 그린-5N Ca2 +; 칼슘 그린-C18 Ca2 +; 칼슘 오렌지; 칼코플루오르 화이트; 카르복시-X-로다민 (5-ROX); 캐스케이드 블루™; 캐스케이드 옐로우; 카테콜라민; CCF2 (진블레이저 (GeneBlazer)); CFDA; CFP (시안 형광 단백질); CFP/YFP FRET; 클로로필; 클로모마이신 A; 클로모마이신 A; CL-NERF; CMFDA; 코엘렌테라진; 코엘렌테라진 cp; 코엘렌테라진 f; 코엘렌테라진 fcp; 코엘렌테라진 h; 코엘렌테라진 hcp; 코엘렌테라진 ip; 코엘렌테라진 n; 코엘렌테라진 O; 쿠마린 팔로이딘; C-피코시아닌; CPM I 메틸쿠마린; CTC; CTC 포르마잔; Cy2™; Cy3.1 8; Cy3.5™; Cy3™; Cy5.1 8; Cy5.5™; Cy5™; Cy7™; 시안 GFP; 시클릭 AMP 플루오로센서 (FiCRhR); 답실; 단실; 단실 아민; 단실 카다베린; 단실 클로라이드; 단실 DHPE; 단실 플루오라이드; DAPI; 다폭실; 다폭실 2; 다폭실 3'DCFDA; DCFH (디클로로디히드로플루오레세인 디아세테이트); DDAO; DHR (디히드로로다민 123); 디-4-ANEPPS; 디-8-ANEPPS (비-비율); DiA (4-디 16-ASP); 디클로로디히드로플루오레세인 디아세테이트 (DCFH); DiD-리포필릭 트레이서; DiD (DilC18(5)); DIDS; 디히드로로다민 123 (DHR); Dil (DilC18(3)); I 디니트로페놀; DiO (DiOC18(3)); DiR; DiR (DilC18(7)); DM-NERF (높은 pH); DNP; 도파민; DsRed; DTAF; DY-630-NHS; DY-635-NHS; EBFP; ECFP; EGFP; ELF 97; 에오신; 에리트로신; 에리트로신 ITC; 에티듐 브로마이드; 에티듐 호모다이머-1 (EthD-1); 유크리신; EukoLight; 유로퓸 (111) 클로라이드; EYFP; 패스트 블루; FDA; 페울겐 (파라로사닐린); FIF (포름알데히드 유도된 형광); FITC; 플라조 (Flazo) 오렌지; 플루오 (Fluo)-3; 플루오-4; 플루오레세인 (FITC); 플루오레세인 디아세테이트; 플루오로-에메랄드; 플루오로-골드 (히드록시스틸바미딘); 플루오르-루비; 플루오르X; FM 1-43™; FM 4-46; 푸라 (Fura) 레드™ (높은 pH); 푸라 레드™/플루오-3; 푸라-2; 푸라-2/BCECF; 게나크릴 (Genacryl) 브릴리언트 레드 B; 게나크릴 브릴리언트 옐로우 10GF; 게나크릴 핑크 3G; 게나크릴 옐로우 5GF; 진블레이저; (CCF2); GFP (S65T); GFP 레드 이동 (rsGFP); GFP 야생형의 비-UV 여기 (wtGFP); GFP 야생형, UV 여기 (wtGFP); GFPuv; 글록살산; 그래눌라 (Granular) 블루; 헤마토포피린; 획스트 33258; 획스트 33342; 획스트 34580; HPTS; 히드록시쿠마린; 히드록시스틸바미딘 (플루오로골드); 히드록시트립타민; 인도 (Indo)-1, 고 칼슘; 인도-1 저 칼슘; 인도디카르보시아닌 (DiD); 인도트리카르보시아닌 (DiR); 인트라화이트 Cf; JC-1; JO JO-1; JO-PRO-1; 레이저프로 (LaserPro); 라우로단; LDS 751 (DNA); LDS 751 (RNA); 류코포르 (Leucophor) PAF; 류코포르 SF; 류코포르 WS; 리사민 (Lissamine) 로다민; 리사민 로다민 B; 칼세인/에티듐 호모다이머; LOLO-1; LO-PRO-1; 루시퍼 (Lucifer) 옐로우; 라이소 트래커 (Lyso Tracker) 블루; 라이소 트래커 블루-화이트; 라이소 트래커 그린; 라이소 트래커 레드; 라이소 트래커 옐로우; 라이소센서 (LysoSensor) 블루; 라이소센서 그린; 라이소센서 옐로우/블루; 마그 (Mag) 그린; 마그달라 (Magdala) 레드 (플록신 B); 마그-푸라 (Mag-Fura) 레드; 마그-푸라-2; 마그-푸라-5; 마그-인도-1; 마그네슘 그린; 마그네슘 오렌지; 말라카이트 (Malachite) 그린; 마리나 블루; I 막실론 (Maxilon) 브릴리언트 플라빈 10 GFF; 막실론 브릴리언트 플라빈 8 GFF; 메로시아닌; 메톡시쿠마린; 미토트래커 (Mitotracker) 그린 FM; 미토트래커 오렌지; 미토트래커 레드; 미트라마이신; 모노브로모비메인; 모노브로모비메인 (mBBr-GSH); 모노클로로비메인; MPS (메틸 그린 피로닌 스틸벤); NBD; NBD 아민; 나일 (Nile) 레드; 니트로벤족세디돌; 노르아드레날린; 뉴클레어 (Nuclear) 패스트 레드; i 뉴클레어 옐로우; 나일로산 (Nylosan) 브릴리언트 래빈 E8G; 오레곤 (Oregon) 그린™; 오레곤 그린™ 488; 오레곤 그린™ 500; 오레곤 그린™ 514; 퍼시픽 (Pacific) 블루; 파라로사닐린 (페울겐); PBFI; PE-Cy5; PE-Cy7; PerCP; PerCP-Cy5.5; PE-텍사스레드 (Red 613); 플록신 B (마그달라 레드); 포르와이트 (Phorwite) AR; 포르와이트 BKL; 포르와이트 Rev; 포르와이트 RPA; 포스파인 (Phosphine) 3R; 포토레지스트; 피코에리쓰린 B [PE]; 피코에리쓰린 R [PE]; PKH26 (시그마 (Sigma)); PKH67; PMIA; 폰토크롬 (Pontochrome) 블루 블랙; POPO-1; POPO-3; PO-PRO-1; PO-I PRO-3; 프리물린 (Primuline); 프로시온 (Procion) 옐로우; 프로피듐 요오다이드 (PI); PyMPO; 파이렌; 피로닌; 피로닌 B; 파이라잘 (Pyrozal) 브릴리언트 플라빈 7GF; QSY 7; 퀴나크릴 머스타드; 레소루핀; RH 414; Rhod-2; 로다민; 로다민 110; 로다민 123; 로다민 5 GLD; 로다민 6G; 로다민 B; 로다민 B 200; 로다민 B 엑스트라; 로다민 BB; 로다민 BG; 로다민 그린; 로다민 팔리시딘; 로다민: 팔로이딘; 로다민 레드; 로다민 WT; 로즈 벵갈 (Rose Bengal); R-피코시아닌; R-피코에리트린 (PE); rsGFP; S65A; S65C; S65L; S65T; 사파이어 (Sapphire) GFP; SBFI; 세로토닌; 세브론 (Sevron) 브릴리언트 레드 2B; 세브론 브릴리언트 레드 4G; 세브론 I 브릴리언트 레드 B; 세브론 오렌지; 세브론 옐로우 L; sgBFP™ (수퍼 글로우 (glow) BFP); sgGFP™ (수퍼 글로우 GFP); SITS (프리뮬린; 스틸벤 이소티오술폰산); SNAFL 칼세인; SNAFL-1; SNAFL-2; SNARF 칼세인; SNARFl; 소듐 그린; 스펙트럼아쿠아 (SpectrumAqua); 스펙트럼그린; 스펙트럼오렌지; 스펙트럼 레드; SPQ (6-메톡시-N-(3-술포프로필)퀴놀리늄); 스틸벤; 술포로다민 B 및 C; 술포로다민 엑스트라; 사이토 (SYTO) 11; 사이토 12; 사이토 13; 사이토 14; 사이토 15; 사이토 16; 사이토 17; 사이토 18; 사이토 20; 사이토 21; 사이토 22; 사이토 23; 사이토 24; 사이토 25; 사이토 40; 사이토 41; 사이토 42; 사이토 43; 사이토 44; 사이토 45; 사이토 59; 사이토 60; 사이토 61; 사이토 62; 사이토 63; 사이토 64; 사이토 80; 사이토 81; 사이토 82; 사이토 83; 사이토 84; 사이토 85; 사이톡스 (SYTOX) 블루; 사이톡스 그린; 사이톡스 오렌지; 테트라사이클린; 테트라메틸로다민 (TRITC); 텍사스 레드™; 텍사스 레드-X™ 컨쥬게이트; 티아디카르보시아닌 (DiSC3); 티아진 레드 R; 티아졸 오렌지; 티오플라빈 5; 티오플라빈 S; 티오플라빈 TON; 티올라이트 (Thiolyte); 티오졸 오렌지; 티노폴 (Tinopol) CBS (칼코플루오르 화이트); TIER; TO-PRO-1; TO-PRO-3; TO-PRO-5; TOTO-1; TOTO-3; 트리칼라 (TriColor) (PE-Cy5); TRITC 테트라메틸로다민이소티오시아네이트; 트루 (True) 블루; 트루 레드; 울트라라이트; 유라닌 (Uranine) B; 유비텍스 (Uvitex) SFC; wt GFP; WW 781; X-로다민; XRITC; 자일렌 오렌지; Y66F; Y66H; Y66W; 옐로우 GFP; YFP; YO-PRO-1; YO-PRO 3; YOYO-1; Y0Y0-3; Sybr 그린; 티아졸 오렌지 (인터킬레이팅 염료); 반도체 나노입자, 예를 들어 광자점 (quantum dot); 또는 케이즈드 (caged) 형광단 (이는 빛 또는 다른 전자기 에너지원을 사용하여 활성화될 수 있음) 또는 그의 조합을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
표지는 직접적 또는 간접적일 수 있다. 직접 표지에서, 검출하는 항체 (관심있는 분자에 대한 항체) 또는 검출하는 분자 (관심있는 분자에 대한 항체가 결합할 수 있는 분자)는 표지를 포함한다. 표지의 검출은 검출하는 항체 또는 검출하는 분자의 존재를 나타내고, 이는 다시 각각 관심있는 분자 또는 관심있는 분자에 대한 항체의 존재를 나타낸다. 간접 표지에서, 추가의 분자 또는 모이어티 (moiety)가 면역복합체와 접촉하게 되거나 면역복합체의 부위에서 생성된다. 예를 들어, 신호-생성 분자 또는 모이어티, 예를 들어 효소는 검출하는 항체 또는 검출하는 분자에 부착하거나 회합될 수 있다. 이어서, 신호-생성 분자는 면역복합체의 부위에서 검출가능한 신호를 생성할 수 있다. 예를 들어, 효소는 적합한 기질과 함께 공급될 때 면역복합체의 부위에서 가시적인 또는 검출가능한 생성물을 생산할 수 있다. ELISA는 상기 종류의 간접 표지를 이용한다.
간접 표지의 다른 예로서, 관심있는 분자 또는 관심있는 분자에 대한 항체 (1차 항체), 예를 들어 1차 항체에 대한 제2 항체에 결합할 수 있는 추가의 분자 (이는 결합제로서 칭할 수 있다)가 면역복합체와 접촉될 수 있다. 추가의 분자는 표지 또는 신호-생성 분자 또는 모이어티를 가질 수 있다. 추가의 분자는 항체일 수 있고, 따라서 이를 2차 항체로 부를 수 있다. 1차 항체에 대한 2차 항체의 결합은 제1 (또는 1차) 항체 및 관심있는 분자와 소위 샌드위치 (sandwich)를 형성할 수 있다. 면역 복합체는 2차 면역 복합체의 형성을 허용하도록 효과적인 조건 하에 충분한 시간 동안 표지된 2차 항체와 접촉될 수 있다. 이어서, 2차 면역 복합체는 임의의 비-특이적으로 결합된 표지된 2차 항체를 제거하기 위해 일반적으로 세척될 수 있고, 이어서 2차 면역 복합체 내에 남아있는 표지를 검출할 수 있다. 추가의 분자는 또한 서로 결합할 수 있는 분자 또는 모이어티 쌍, 예를 들어 비오틴/아비딘 쌍 중 하나일 수 있거나 그를 포함할 수 있다. 상기 방식에서, 검출하는 항체 또는 검출하는 분자는 그 쌍의 다른 멤버를 포함해야 한다.
다른 방식의 간접 표지는 2 단계 방안에 의한 1차 면역 복합체의 검출을 포함한다. 예를 들어, 관심있는 분자 또는 상응하는 항체에 대한 결합 친화도를 갖는 분자 (이는 제1 결합제로서 칭할 수 있다), 예를 들어 항체는 상기 설명된 바와 같이 2차 면역 복합체를 형성하도록 사용될 수 있다. 세척 후에, 2차 면역 복합체는 제1 결합제에 대한 결합 친화도를 갖는 다른 분자 (이는 제2 결합제로서 칭할 수 있다)와 다시 면역 복합체의 형성을 허용하도록 효과적인 조건 하에 충분한 시간 동안 접촉될 수 있다 (따라서 3차 면역 복합체를 형성한다). 제2 결합제는 검출가능한 표지 또는 신호-생성 분자 또는 모이어티에 연결되어, 그렇게 형성된 3차 면역 복합체의 검출을 허용할 수 있다. 상기 시스템은 신호 증폭을 제공할 수 있다.
단백질 또는 특이적 단백질에 대한 항체와 같은 물질의 검출을 포함하는 면역분석은 무-표지 (label-free) 분석, 단백질 분리 방법 (즉, 전기영동), 고체 지지체 포획 분석, 또는 생체내 검출을 포함한다. 무-표지 분석은 일반적으로 샘플 내에서 특이적 단백질, 또는 특이적 단백질에 대한 항체의 존재 또는 부재를 결정하는 진단 수단이다. 단백질 분리 방법은 추가로 단백질의 물리적인 특성, 예를 들어 크기 또는 순전하를 평가하기 위해 유용하다. 포획 분석은 일반적으로 샘플 내에서 특이적 단백질, 또는 특이적 단백질에 대한 항체의 농도를 정량적으로 평가하기 위해 보다 유용하다. 마지막으로, 생체내 검출은 물질의 공간적 발현 패턴, 즉, 물질이 대상, 조직 또는 세포에서 발견될 수 있는 장소를 평가하기 위해 유용하다.
농도가 충분하다면, 항체-항원 상호작용에 의해 생성된 분자 복합체 ([Ab-Ag]n)는 맨눈에 가시적이지만, 보다 소량이 또한 광선을 산란시키는 그들의 능력으로 인해 검출되고 측정될 수 있다. 복합체의 형성은 두 반응물이 존재하는 것을 나타내고, 면역침전 분석에서, 일정 농도의 시약 항체를 사용하여 특이적 항원 ([Ab-Ag]n)을 측정하고, 시약 항원을 사용하여 특이적 항체 ([Ab-Ag]n)를 검출한다. 시약 종이 미리 세포 상에 (적혈구응집 분석에서와 같이) 또는 매우 작은 입자 (라텍스 응집 분석에서와 같이) 코팅되면, 코팅된 입자의 "응괴 (clumping)"는 훨씬 더 낮은 농도에서 가시적이다. 오크터로니 (Ouchterlony) 면역확산 분석, 로켓 (rocket) 면역전기영동, 및 면역비탁법 및 네펠로법 (nephelometric) 분석을 포함한 상기 기본 원리에 기초한 다양한 분석이 일반적으로 사용되고 있다. 상기 분석의 주요 한계는 표지를 사용하는 분석에 비교하여 제한된 감도 (검출 하한), 및 일부 경우에, 매우 고농도의 분석물이 실제로 복합체 형성을 억제할 수 있다는 사실이고, 이는 절차를 보다 복잡하게 만드는 보호수단을 필요로 한다. 이들 그룹 1 분석의 일부는 항체의 발견까지 거슬러 올라가고, 이들은 실제 "표지"를 갖지 않는다 (예를 들어 Ag-enz). 무-표지의 다른 종류의 면역분석은 면역센서에 의존하고, 항체-항원 상호작용을 직접 검출할 수 있는 다양한 기구가 현재 상업적으로 이용가능하다. 대부분은 고정된 리간드를 갖는 센서 표면 상에 소실파를 생성하는 것에 의존하고, 이는 리간드에 대한 결합의 연속 모니터링을 허용한다. 면역센서는 운동학적 상호작용의 용이한 조사를 허용하고, 보다 저렴한 전문 기구의 출현으로 미래에는 면역분석에서 광범한 용도를 발견할 수 있다.
특이적 단백질을 검출하기 위한 면역분석의 사용은 전기영동에 의한 단백질의 분리를 포함할 수 있다. 전기영동은 전기장에 반응한 용액 내의 전하를 띈 분자의 이동이다. 그들의 이동 속도는 전기장의 강도; 분자의 순전하, 크기 및 형상과 또한 그 내부에서 분자가 이동하는 매질의 이온 강도, 점도 및 온도에 의해 좌우된다. 분석 도구로서, 전기영동은 간단하고, 신속하고, 감도가 높다. 전기영동은 전하를 띈 단일 물질종의 특성을 연구하기 위해 분석적으로, 및 분리 기술로서 사용된다.
일반적으로, 샘플은 지지 매트릭스, 예를 들어 종이, 셀룰로스 아세테이트, 전분 겔, 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 겔 내에서 진행한다. 매트릭스는 가열에 의해 유발되는 대류 혼합을 억제하고, 전기영동 진행의 기록을 제공하고: 진행의 끝에, 매트릭스는 염색하고 스캐닝 (scanning), 자가방사기록 또는 보관을 위해 사용할 수 있다. 또한, 가장 일반적으로 사용되는 지지체 매트릭스 (아가로스 및 폴리아크릴아미드)는 다공성 겔인 점에서 크기에 의해 분자를 분리하는 수단을 제공한다. 다공성 겔은 보다 작은 분자가 자유롭게 이동하도록 하면서 큰 거대분자의 이동을 지체시키거나 일부 경우에 완전히 차단함으로써 체로서 역할을 할 수 있다. 묽은 아가로스 겔은 일반적으로 동일한 농도의 폴리아크릴아미드보다 더 경질이고 취급하기 쉽기 때문에, 아가로스는 보다 큰 거대분자, 예를 들어 핵산, 큰 단백질 및 단백질 복합체를 분리하기 위해 사용된다. 취급하기 쉽고 보다 고 농도로 만들기 쉬운 폴리아크릴아미드는 지체를 위해서 작은 겔 공극 크기를 요구하는 대부분의 단백질 및 작은 올리고뉴클레오티드를 분리하기 위해 사용된다.
단백질은 양쪽성 (amphoteric) 화합물이고; 따라서, 그들의 순전하는 그들이 현탁되는 배지의 pH에 의해 결정된다. 그의 등전점을 초과하는 pH의 용액 내에서, 단백질은 순 음전하를 갖고, 전기장 내에서 애노드를 향해 이동한다. 그의 등전점 미만에서, 단백질은 양전하를 띄고 캐소드를 향해 이동한다. 단백질에 의해 운반되는 순전하는 또한 그의 크기에 무관하고 - 즉, 분자의 단위 질량 (또는 단백질 및 핵산이 선형 거대분자인 경우에 길이) 당 운반되는 전하는 단백질마다 상이하다. 따라서, 주어진 pH에서 및 비-변성 조건 하에, 단백질의 전기영동적 분리는 분자의 크기 및 전하 모두에 의해 결정된다.
소듐 도데실 술페이트 (SDS)는 폴리펩티드 백본을 "둘러쌈으로써 (wrapping around)" 단백질을 변성시키는 음이온성 세제이고, SDS는 단백질에 1.4:1의 질량 비로 상당히 특이적으로 결합한다. 이렇게 함으로써, SDS는 그의 길이에 비례하여 폴리펩티드에 음전하를 부여한다. 또한, 크기에 의한 분리를 위해 필요한 랜덤-코일 입체형태를 취하기 전에 단백질 (변성) 내의 디술피드 다리를 환원시키는 것이 대체로 필요하고; 이는 2-머캅토에탄올 또는 디티오트레이톨 (DTT)을 사용하여 이루어진다. 따라서, 변성 SDS-PAGE 분리에서, 이동은 폴리펩티드의 고유 전하에 의해서가 아니라, 분자량에 의해 결정된다.
분자량의 결정은 특성화할 단백질과 함께 공지 분자량의 단백질의 SDS-PAGE에 의해 이루어진다. SDS-변성 폴리펩티드, 또는 천연 핵산의 분자량의 로그 (logarithm)와 그의 Rf 사이에는 선형 관계가 존재한다. Rf는 분자에 의해 이동된 거리 대 마커 염료-전면에 의해 이동된 거리의 비로서 계산된다. 전기영동에 의한 상대적인 분자량 (Mr)을 결정하는 간단한 방식은 공지의 샘플에 대한 이동된 거리 대 log10MW의 표준 곡선을 플롯팅하고, 동일한 겔 상에 이동된 거리를 측정한 후 샘플의 logMr을 판독하는 것이다.
2차원 전기영동에서, 단백질을 먼저 하나의 물리적 특성에 기초하여 분별하고, 제2 단계에서 다른 특성을 기초로 하여 분별한다. 예를 들어, 편리하게 튜브 (tube) 겔 내에서 수행되는 등전 초점화를 제1 차원에 대해 사용할 수 있고, 슬랩 (slab) 겔 내에서 SDS 전기영동을 제2 차원에 대해 사용할 수 있다. 절차의 일례는 2차원 전기영동 방법에 관한 그의 교시 내용에 대해 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 문헌 [O'Farrell, P.H., High Resolution Two-dimensional Electrophoresis of Proteins, J. Biol. Chem. 250:4007-4021 (1975)]에 기재된 것이다. 다른 예는 전기영동 방법에 관한 교시 내용에 대해 각각 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 문헌 ([Anderson, L and Anderson, NG, High resolution two-dimensional electrophoresis of human plasma proteins, Proc. Natl. Acad. Sci. 74:5421-5425 (1977)], [Ornstein, L., Disc electrophoresis, L. Ann. N.Y. Acad. Sci. 121:321349 (1964)])에 기재된 것을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
전기영동 방법에 관한 교시 내용에 대해 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Laemmli, U.K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature 227:680 (1970)]에서는 SDS로 변성된 단백질을 분할하기 위한 불연속 시스템을 개시한다. 래믈리 (Laemmli) 버퍼 시스템 내의 앞 (leading) 이온은 클로라이드이고, 뒤 (trailing) 이온은 글라이신이다. 따라서, 분할 겔 및 적층 (stacking) 겔은 Tris-HCl 버퍼 (상이한 농도 및 pH의) 내에 구성되는 한편, 탱크 (tank) 버퍼는 Tris-글라이신이다. 모든 버퍼는 0.1% SDS를 함유한다.
현재의 방법에서 고려되는 전기영동을 이용하는 면역분석의 일례는 웨스턴 블롯 분석이다. 웨스턴 블로팅 또는 면역블로팅은 단백질의 분자 질량의 결정 및 상이한 샘플 내에 존재하는 단백질의 상대적인 양의 측정을 허용한다. 검출 방법은 화학발광 및 발색 (chromagenic) 검출을 포함한다. 웨스턴 블롯 분석에 대한 표준 방법은 예를 들어, 각각 웨스턴 블롯 방법에 관한 교시 내용에 대해 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 문헌 ([D.M. Bollag et al., Protein Methods (2d edition 1996)] 및 [E. Harlow & D. Lane, Antibodies, a Laboratory Manual (1988)]), 미국 특허 4,452,901에서 찾을 수 있다. 일반적으로, 단백질은 겔 전기영동, 대체로 SDS-PAGE에 의해 분리된다. 다른 종류의 종이 또는 막이 사용될 수 있지만 단백질은 특수 압지, 예를 들어, 니트로셀룰로스의 시트로 전달된다. 단백질은 겔 상에서와 동일한 분리 패턴을 보유한다. 블롯을 니트로셀룰로스 상의 임의의 남아있는 점착성 장소에 결합하도록 일반 단백질 (예를 들어 우유 단백질)과 함께 인큐베이팅한다. 이어서, 그의 특이적 단백질에 결합할 수 있는 항체를 용액에 첨가한다.
고정된 특이적 항원에 대한 특이적 항체의 부착은 간접 효소 면역분석 기술에 의해, 대체로 발색 기질 (예를 들어 알칼린 포스파타제 또는 호스래디시 퍼옥시다제) 또는 화학발광 기질을 사용하여 쉽게 가시화될 수 있다. 프로빙을 위한 다른 가능성은 형광 또는 방사성동위원소 표지 (예를 들어, 플루오레세인, 125I)의 사용을 포함한다. 항체 결합의 검출을 위한 프로브는 컨쥬게이팅된 항-면역글로불린, 컨쥬게이팅된 스타필로코커스 단백질 A (IgG에 결합함), 또는 비오티닐화된 1차 항체에 대한 프로브 (예를 들어, 컨쥬게이팅된 아비딘/스트렙타비딘)일 수 있다.
상기 기술의 능력은 그의 항원성 및 그의 분자 질량에 의한 특이적 단백질의 동시 검출에 있다. 단백질은 먼저 SDS-PAGE에 의해 질량에 의해 분리된 후, 면역분석 단계에서 특이적으로 검출된다. 따라서, 이종 샘플 내의 관심있는 단백질의 분자 질량을 어림하기 위해 단백질 표준품 (래더 (ladder))이 동시에 진행될 수 있다.
DNA 결합 단백질과 그들의 동족 (cognate) DNA 인식 서열 사이의 상호작용을 정성적 및 정량적 방식으로 검출하기 위해 겔 이동 분석 또는 전기영동 이동성 이동 분석 (EMSA)을 사용할 수 있다. 예시적인 기술은 겔 이동 분석에 관한 교시 내용에 대해 각각 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 문헌 ([Ornstein L., Disc electrophoresis - I: Background and theory, Ann. NY Acad. Sci. 121:321-349 (1964)] 및 [Matsudiara, PT and DR Burgess, SDS microslab linear gradient polyacrylamide gel electrophoresis, Anal. Biochem. 87:386-396 (1987)])에 기재되어 있다.
일반적인 겔 이동 분석에서, 정제된 단백질 또는 조야한 세포 추출물을 표지된 (예를 들어, 32P-방사성 표지된) DNA 또는 RNA 프로브와 함께 인큐베이팅한 후, 비변성 폴리아크릴아미드 겔을 통해 유리 프로브로부터 복합체를 분리시킬 수 있다. 복합체는 겔을 통해 비결합된 프로브보다 더 느리게 이동한다. 결합 단백질의 활성에 따라, 표지된 프로브는 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있다. DNA 결합 단백질, 예를 들어 전사 인자의 검출을 위해, 정제된 또는 부분적으로 정제된 단백질, 또는 핵 세포 추출물을 사용할 수 있다. RNA 결합 단백질의 검출을 위해, 정제된 또는 부분적으로 정제된 단백질, 또는 핵 또는 세포질 세포 추출물을 사용할 수 있다. 추정 결합 부위에 대한 DNA 또는 RNA 결합 단백질의 특이성은 관심있는 단백질에 대한 결합 부위를 함유하는 DNA 또는 RNA 단편 또는 올리고뉴클레오티드, 또는 다른 비관련 서열을 사용하는 경쟁 실험에 의해 확립된다. 특이적 및 비특이적 경쟁자의 존재 하에 형성된 복합체의 성질 및 강도의 차이는 특이적 상호작용의 확인을 허용한다. 겔 이동 방법에 관한 교시 내용에 대해 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Promega, Gel Shift Assay FAQ, <http://www.promega.com/faq/gelshfaq.html> (2005년 3월 25일자)에서 입수가능함]을 참고한다.
겔 이동 방법은 예를 들어, 폴리아크릴아미드 전기영동 겔과 같은 겔 내에서 단백질을 검출하기 위해 콜로이드 형태의 COOMASSIE (임페리얼 케미칼스 인더스트리즈, 엘티디 (Imperial Chemicals Industries, Ltd)) 청색 염색을 사용하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 예를 들어 겔 이동 방법에 관한 교시 내용에 대해 각각 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 문헌 ([Neuhoff et al., Electrophoresis 6:427-448 (1985)] 및 [Neuhoff et al., Electrophoresis 9:255-262 (1988)])에 기재되어 있다. 상기 참고한 통상적인 단백질 분석 방법에 추가로, 조합 세정 및 단백질 염색 조성물이 겔 이동 방법에 관한 그의 교시 내용에 대해 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 5,424,000에 기재되어 있다. 용액은 인산, 황산 및 질산, 및 애시드 바이올렛 (Acid Violet) 염료를 포함할 수 있다.
방사성 면역 침전 분석 (RIPA)은 혈청 내에 특이적 항체를 검출하기 위해 방사성 표지된 항원을 사용하는 예민한 분석이다. 항원은 혈청과 반응하도록 허용된 후, 특수 시약, 예를 들어, 단백질 A 세파로스 비드를 사용하여 침전된다. 이어서, 결합된 방사성 표지된 면역침전물은 겔 전기영동에 의해 일반적으로 분석된다. 방사성 면역 침전 분석 (RIPA)은 HIV 항체의 존재를 진단하기 위한 확인 시험으로서 종종 사용된다. RIPA는 또한 당업계에서 파르 (Farr) 분석, 침전소 (Precipitin) 분석, 방사성 면역 침전소 분석; 방사성 면역침전 분석; 방사성 면역침전 분석, 및 방사성 면역 침전 분석으로서 불린다.
관심있는 특이적 단백질을 분리하고 검출하기 위해 전기영동을 이용하는 상기 면역분석은 단백질 크기의 평가를 허용하지만, 이들은 단백질 농도를 평가하기 위해 아주 예민하지는 않다. 그러나, 샘플로부터 각각 항체 또는 관심있는 단백질을 포획하기 위해 단백질 또는 단백질에 특이적인 항체가 고체 지지체 (예를 들어, 튜브, 웰, 비드 또는 셀 (cell))에 결합되는 면역분석이 또한 지지체 상의 단백질 또는 단백질에 특이적인 항체를 검출하는 방법과 조합으로 고려된다. 상기 면역분석의 예는 방사성 면역분석 (RIA), 효소-연결 면역흡착 분석 (ELISA), 유동 세포측정, 단백질 어레이, 다중 비드 분석 및 자기 포획을 포함한다.
방사성 면역분석 (RIA)는 특이적 항체 또는 다른 수용체 시스템에 대한 비표지된 물질의 결합을 특정하기 위해 직접 또는 간접적으로 방사성 표지된 물질 (방사성 리간드)를 사용하는 항원-항체 반응의 검출을 위한 전통적인 정량 분석이다. 방사성 면역분석은 예를 들어, 생물학적 검정을 사용할 필요 없이 혈액 내의 호르몬 수준을 시험하기 위해 사용된다. 또한, 항체 형성을 유도할 수 있는 보다 큰 캐리어 단백질 (예를 들어, 소 감마-글로불린 또는 인간 혈청 알부민)에 커플링되면 비-면역원성 물질 (예를 들어, 합텐)이 또한 측정될 수 있다. RIA는 방사성 항원 (요오드 원자가 단백질 내의 티로신 잔기 내로 도입될 수 있는 용이성으로 인해, 방사성 동위원소 125I 또는 131I가 종종 사용된다)을 그 항원에 대한 항체와 혼합하는 것을 포함한다. 항체는 일반적으로 고체 지지체, 예를 들어 튜브 또는 비드에 연결된다. 이어서, 비표지된 또는 "냉 (cold)" 항원이 공지의 양으로 첨가되고, 치환되는 표지된 항원의 양을 측정한다. 초기에, 방사성 항원은 항체에 결합된다. 냉 항원이 첨가되면, 둘이 항체 결합 부위에 대해 경쟁하고, 보다 고 농도의 냉 항원이 항체에 더 많이 결합하여, 방사성 변이체를 치환한다. 결합된 항원은 용액 내에서 비결합된 것으로부터 분리되고, 각각의 방사성을 사용하여 결합 곡선을 플로팅한다. 상기 기술은 극도로 예민하면서 특이적이다.
효소-연결 면역흡착 분석 (ELISA), 또는 보다 유전적인 용어인 EIA (효소 면역분석)는 단백질에 특이적인 항체를 검출할 수 있는 면역분석이다. 상기 분석에서, 항체-결합 또는 항원-결합 시약에 결합된 검출가능한 표지는 효소이다. 그의 기질에 노출될 때, 상기 효소는 예를 들어, 분광광도 측정, 형광 측정 또는 시각적 수단에 의해 검출될 수 있는 화학 모이어티를 생산하는 방식으로 반응한다. 검출에 유용한 시약을 검출가능하게 표지하기 위해 사용될 수 있는 효소는 호스래디시 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타제, 글루코스 옥시다제, β-갈락토시다제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라제, 말레이트 데히드로게나제, 스타필로코커스 뉴클레아제, 아스파라기나제, 효모 알콜 데히드로게나제, 알파.-글리세로포스페이트 데히드로게나제, 트리오스 포스페이트 이소머라제, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 글루코아밀라제 및 아세틸콜린에스테라제를 포함하고 이로 제한되지 않는다. ELISA 절차의 설명에 대해서는, 특히 ELISA 방법에 관한 교시에 대해 각각 그 전부가 본원에 참고로 포함되는 문헌 ([Voller, A. et al., J. Clin. Pathol. 31:507-520 (1978)]; [Butler, J.E., Meth. Enzymol. 73:482-523 (1981)]; [Maggio, E. (ed.), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, 1980]; [Butler, J.E., In: Structure of Antigens, Vol. 1 (Van Regenmortel, M., CRC Press, Boca Raton, 1992, pp. 209-259]; [Butler, J.E., In: van Oss, C.J. et al., (eds), Immunochemistry, Marcel Dekker, Inc., New York, 1994, pp. 759-803]; [Butler, J.E. (ed.), Immunochemistry of Solid-Phase Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, 1991)]; [Crowther, "ELISA: Theory and Practice," In: Methods in Molecule Biology, Vol. 42, Humana Press; New Jersey, 1995]); 미국 특허 4,376,110을 참조한다.
ELISA 기술의 변형은 당업자에게 알려져 있다. 한 변형에서, 단백질에 결합할 수 있는 항체가 단백질 친화도를 보이는 선택된 표면, 예를 들어 폴리스티렌 미세적정 플레이트 내의 웰상에 고정될 수 있다. 이어서, 마커 항원을 함유하는 것으로 의심되는 시험 조성물을 웰에 첨가할 수 있다. 결합 및 비-특이적으로 결합된 면역복합체를 제거하기 위한 세척 후, 결합된 항원을 검출할 수 있다. 검출은 검출가능한 표지에 연결되는 표적 단백질에 특이적인 제2 항체의 첨가에 의해 달성할 수 있다. 상기 종류의 ELISA는 간단한 "샌드위치 ELISA"이다. 검출은 또한 제2 항체의 첨가 후, 제2 항체에 대한 결합 친화도를 갖는 제3 항체의 첨가에 의해 달성할 수 있고, 상기 제3 항체는 검출가능한 표지에 연결된다.
다른 변형은 경쟁 ELISA이다. 경쟁 ELISA에서, 시험 샘플은 공지량의 표지된 항원 또는 항체와 결합을 위해 경쟁한다. 샘플 내의 반응성 종의 양은 샘플을 코팅된 웰을 사용하여 인큐베이팅하기 전에 또는 하는 동안 공지의 표지된 종과 혼합함으로써 결정할 수 있다. 샘플 내의 반응성 종의 존재는 웰에 대한 결합에 이용가능한 표지된 종의 양을 감소시키는 역할을 하고, 따라서 궁극적인 신호를 감소시킨다.
사용된 포맷과 무관하게, ELISA는 공통으로 몇몇 특징, 예를 들어 코팅, 인큐베이팅 또는 결합, 비-특이적으로 결합된 종을 제거하기 위한 세척, 및 결합된 면역 복합체의 검출을 갖는다. 항원 또는 항체는 플레이트, 비드, 딥스틱 (dipstick), 막 또는 컬럼 매트릭스 형태와 같은 고체 지지체에 연결될 수 있고, 분석할 샘플은 고정된 항원 또는 항체에 적용될 수 있다. 플레이트를 항원 또는 항체로 코팅하는데 있어서, 일반적으로 플레이트의 웰을 항원 또는 항체의 용액과 함께 철야로 또는 명시된 시간 동안 인큐베이팅할 것이다. 이어서, 불완전하게 흡착된 물질을 제거하기 위해 플레이트의 웰을 세척할 수 있다. 이어서, 웰의 임의의 남아있는 이용가능한 표면은 시험 항혈청에 관하여 항원상 중성인 비특이적 단백질로 "코팅될" 수 있다. 이들은 소 혈청 알부민 (BSA), 카제인 및 분유의 용액을 포함한다. 코팅은 고정하는 표면 상에서 비특이적인 흡착 부위의 차단을 허용하고, 따라서 표면 상으로 항혈청의 비특이적인 결합에 의해 유발된 배경을 감소시킨다.
ELISA에서, 직접적인 절차보다는 2차 또는 3차 검출 수단이 또한 사용될 수 있다. 따라서, 웰에 대한 단백질 또는 항체의 결합, 배경을 감소시키기 위한 비-반응성 물질로의 코팅, 및 비결합된 물질을 제거하기 위한 세척 후, 고정화 표면은 시험할 대조 임상 또는 생물학적 샘플과 면역복합체 (항원/항체) 형성을 허용하기에 효과적인 조건 하에 접촉시킨다. 이어서, 면역복합체의 검출은 표지된 2차 결합제 또는 2차 결합제를 표지된 제3 결합제와 함께 필요로 한다.
"면역복합체 (항원/항체) 형성을 허용하기에 효과적인 조건 하에"는 조건이 비-특이적 결합을 감소시키고 적당한 신호 대 노이즈 (noise) 비를 촉진하도록 항원 및 항체를 BSA, 소 감마 글로불린 (BGG) 및 포스페이트 완충 염수 (PBS)/Tween과 같은 용액으로 희석하는 것을 포함함을 의미한다.
적합한 조건은 또한 인큐베이션이 효과적인 결합을 허용하기에 충분한 온도에서 충분한 시간 동안임을 의미한다. 인큐베이션 단계는 대개 약 20 내지 30℃의 온도에서 약 1분 내지 12시간 동안일 수 있거나, 약 0℃ 내지 약 10℃에서 철야일 수 있다.
ELISA에서 모든 인큐베이션 단계 후, 접촉된 표면은 비-복합된 물질을 제거하도록 세척될 수 있다. 세척 절차는 용액, 예를 들어 PBS/Tween 또는 보레이트 버퍼로 세척하는 것을 포함할 수 있다. 시험 샘플과 원래 결합된 물질 사이의 특이적 면역복합체의 형성 및 후속적인 세척 후, 심지어 미소량의 면역복합체의 산출을 결정할 수 있다.
검출 수단을 제공하기 위해, 제2 또는 제3 항체는 상기 설명된 바와 같이 검출을 허용하기 위해 회합된 표지를 가질 수 있다. 이는 적절한 발색 기질과 함께 인큐베이팅할 때 발색할 수 있는 효소일 수 있다. 따라서, 예를 들어, 제1 또는 제2 면역복합체를 표지된 항체와 접촉시키고 추가의 면역복합체 형성의 발생에 유리한 조건 하에 시간 동안 인큐베이팅할 수 있다 (예를 들어, 2시간 동안 실온에서 PBS-함유 용액, 예를 들어 PBS-Tween 내에서 인큐베이션).
표지된 항체와 함께 인큐베이팅하고, 후속적으로 비결합된 물질을 제거하기 위해 세척한 후, 표지의 양을 예를 들어, 발색 기질, 예를 들어 우레아 및 브로모크레졸 퍼플 또는 2,2'-아지도-디-(3-에틸-벤즈티아졸린-6-술폰산 [ABTS] 및 효소 표지로서 퍼옥시다제의 경우에 H2O2와 함께 인큐베이팅함으로써 정량할 수 있다. 이어서, 정량은 예를 들어, 가시 스펙트럼 분광광도계를 사용하여 발색 정도를 측정함으로써 달성할 수 있다.
단백질 어레이는 유리, 막, 미세적정 웰, 질량 분광계 플레이트, 및 비드 또는 다른 입자를 포함하는 표면 상에 고정된 단백질을 사용하는 고체-상 리간드 결합 분석 시스템이다. 분석은 고도로 평행성이고 (다중), 종종 소형화된다 (마이크로어레이, 단백질 칩). 이들의 잇점은 신속하고 자동화가능하고, 고감도일 수 있고, 시약이 경제적이고, 단일 실험에 대해 풍부한 데이타를 제공하는 것을 포함한다. 생물정보학의 지원이 중요하고; 데이타 취급에는 복잡한 소프트웨어 및 데이타 비교 분석을 필요로 한다. 그러나, 소프트웨어는 DNA 어레이에 대해 사용된 것으로부터 채용할 수 있고, 많은 하드웨어 및 검출 시스템도 그럴 수 있다.
주요 포맷 중 하나는 포획 어레이이고, 여기서 리간드-결합 시약 (통상 항체이지만 또한 대체 단백질 스캐폴드 (scaffold), 펩티드 또는 핵산 앱타머 (aptamer)일 수 있음)이 혼합물, 예를 들어 혈장 또는 조직 추출물 내에서 표적 분자를 검출하기 위해 사용된다. 진단에서, 포획 어레이는 예를 들어 개별 혈청 내에서 몇몇 분석물을 시험하는 및 많은 혈청 샘플을 동시에 시험하는 다수의 면역분석을 평행으로 수행하기 위해 사용될 수 있다. 단백체학에서, 포획 어레이는 건강한 및 질병에 걸린 상이한 샘플 내의 단백질의 수준을 정량하고 비교하기 위해, 즉 단백질 발현 프로파일링 (profiling)을 위해 사용된다. 특정한 리간드 결합물질 외의 단백질은 단백질-단백질, 단백질-DNA, 단백질-약물, 수용체-리간드, 효소-기질 등과 같은 시험관내 기능적 상호작용 스크린을 위한 어레이 포맷에서 사용된다. 포획 시약 자체는 많은 단백질에 대해 선택되고 스크리닝되고, 이는 또한 다수의 단백질 표적에 대한 다수의 어레이 포맷으로 수행될 수 있다.
어레이의 제작을 위해, 단백질의 공급원은 재조합 단백질을 위한 세포 기반 발현 시스템, 천연 공급원으로부터의 정제, 무-세포 번역 시스템에 의한 시험관 내 생산, 및 펩티드에 대한 합성 방법을 포함한다. 많은 상기 방법들은 고효율 생산을 위해 자동화될 수 있다. 포획 어레이 및 단백질 기능 분석을 위해, 단백질이 정확하게 접히고 기능적이어야 하는 것이 중요하고; 이는 예를 들어 재조합 단백질이 변성 조건 하에 세균으로부터 추출되는 경우에서와 같이 항상 그러한 것은 아니다. 그럼에도 불구하고, 변성된 단백질의 어레이는 교차-반응성에 대해 항체를 스크리닝하고, 자가항체를 확인하고 리간드 결합 단백질을 선택하는데 있어서 유용하다.
단백질 어레이는 종종 형광 판독을 이용하고, 다수의 분석이 병행으로 수행되도록 로봇 공학 및 고효율 검출 시스템에 의해 촉진되는 ELISA 및 도트 블로팅과 같은 친숙한 면역분석 방법의 소형화로서 설계되었다. 일반적으로 사용되는 물리적 지지체는 유리 슬라이드, 실리콘, 마이크로웰, 니트로셀룰로스 또는 PVDF 막 및 자기 및 다른 마이크로비드를 포함한다. 평면 표면 상으로 전달된 단백질의 미세액적 (microdrop)이 가장 친숙한 포맷이지만, 대체 구조는 미세유동학에서의 발달에 기초한 CD 원심분리 장치 (기로스 (Gyros, 미국 뉴저지주 몬마우쓰 정션)) 및 전문화된 칩 디자인, 예를 들어 플레이트 내의 공학처리된 마이크로채널 (예를 들어, The Living Chip™, 비트로브 (Biotrove, 미국 매사추세츠주 워번)) 및 실리콘 표면 상의 작은 3D 기둥 (자이오믹스 (Zyomyx, 미국 캘리포니아주 헤이워드))을 포함한다. 현탁액 내의 입자가 또한 확인을 위해 코드화된다면 어레이의 기초로서 사용될 수 있고; 시스템은 마이크로비드 (루미넥스 (Luminex, 미국 텍사스주 오스틴); 바이오-라드 래보래토리즈 (Bio-Rad Laboratories)) 및 반도체 나노결정 (예를 들어, QDots™, 퀀텀 도트 (Quantum Dot, 미국 캘리포니아주 헤이워드))을 위한 색상 코딩, 및 비드 (UltraPlex™, 스마트비드 테크놀로지스 엘티디 (SmartBead Technologies Ltd, 영국 캠브리지 바브라함)) 및 다중금속 마이크로로드 (microrod) (예를 들어, Nanobarcodes™ 입자, 나노플렉스 테크놀로지스 (Nanoplex Technologies, 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰))를 위한 바코딩을 포함한다. 비드는 또한 반도체 칩 (립스 테크놀로지 (LEAPS technology), 바이오어레이 설루션스 (BioArray Solutions, 미국 뉴저지주 워렌)) 상에서 평면 어레이 내로 조립될 수 있다.
단백질의 고정화는 커플링 시약 및 커플링되는 표면의 성질을 모두 포함한다. 우수한 단백질 어레이 지지체 표면은 커플링 절차 전후에 화학적으로 안정하고, 우수한 스폿 (spot) 형태를 허용하고, 최소의 비특이적 결합을 나타내고, 검출 시스템에서 배경에 기여하지 않고, 상이한 검출 시스템과 상용성이다. 사용된 고정화 방법은 재현가능하고, 상이한 특성 (크기, 친수성, 소수성)의 단백질에 적용가능하고, 고효율 및 자동화가 가능하고, 충분한 기능성 단백질 활성의 보유와 상용성이다. 표면-결합된 단백질의 배향은 그를 활성 상태의 리간드 또는 기질에 제시하는데 있어서 중요한 인자로서 인정되고; 포획 어레이에 대해, 가장 효율적인 결합 결과는 배향된 포획 시약을 사용하여 얻어지고, 이는 일반적으로 단백질의 부위-특이적 표지를 필요로 한다.
단백질 고정화의 공유 및 비공유 방법이 모두 사용되고, 다양한 찬반양론이 있다. 표면에 대한 수동 흡착은 방법론적으로 단순하지만, 정량적 또는 배향적 제어가 거의 없고; 단백질의 기능적 특성을 변경할 수 있거나 그렇지 않을 수 있고, 재현성 및 효율이 가변적이다. 공유 커플링 방법은 안정한 연결을 제공하고, 다양한 단백질에 적용될 수 있고, 우수한 재현성을 갖지만; 배향은 가변적일 수 있고, 화학적 유도체화는 단백질의 기능을 변경시킬 수 있고, 안정한 상호작용 표면을 요구한다. 단백질 상에 태그를 이용하는 생물학적 포획 방법은 안정한 연결을 제공하고, 단백질에 특이적이고 재현가능한 배향으로 결합하지만, 생물학적 시약은 먼저 적절하게 고정되어야 하고, 어레이는 특별한 취급을 필요로 하고 가변적인 안정성을 가질 수 있다.
몇몇 고정화 화학 및 태그가 단백질 어레이의 제작에 대해 설명되었다. 공유 부착을 위한 기질은 아미노- 또는 알데히드-함유 실란 시약으로 코팅된 유리 슬라이드를 포함한다. Versalinx™ 시스템 (프로링스 (Prolinx, 미국 워싱턴주 보델)에서, 가역적 공유 커플링은 페닐디보론산으로 유도체화된 단백질과 지지체 표면 상에 고정된 살리실히드록삼산 사이의 상호작용에 의해 달성된다. 또한, 이는 낮은 배경 결합과 낮은 고유 형광을 갖고, 고정된 단백질이 기능을 보유하도록 허용한다. 비변형된 단백질의 비공유 결합이 3차원 폴리아크릴아미드 겔에 기초하여, 다공성 구조, 예를 들어 HydroGel™ (퍼킨엘머 (PerkinElmer, 미국 매사추세츠주 웰즐리)) 내에서 일어나고; 상기 기질은 유리 마이크로어레이 상에서 특히 낮은 배경을 제공하는 것으로 보고되었고, 높은 용량 및 단백질 기능의 보유를 갖는다. 널리 사용되는 생물학적 커플링 방법은 비오틴/스트렙타비딘 또는 헥사히스티딘/Ni 상호작용을 통한 것이고, 단백질을 적절하게 변형시킨다. 비오틴은 이산화티탄 (지오믹스 (Zyomyx)) 또는 오산화탄탈 (젭토센스 (Zeptosens, 스위스 비터스빌))과 같은 표면 상에 고정된 폴리-라이신 백본에 컨쥬게이팅될 수 있다.
어레이 제작 방법은 로봇 접촉 인쇄, 잉크-제팅, 압전 (piezoelectric) 스포팅 및 사진평판을 포함한다. 많은 시판 정렬기 (arrayer) [예를 들어 패커드 바이오사이언시스 (Packard Biosciences)] 및 수동식 장비 [브이 앤 피 사이언티픽 (V & P Scientific)]가 이용가능하다. 세균 콜로니는 계내 단백질 발현의 유도를 위해 PVDF 막 상으로 로봇 공학적으로 그리딩 (gridding)될 수 있다.
스폿 크기 및 밀도의 한계에서 나노어레이가 도입되었고, 이는 나노미터 공간 규모 상에 스폿을 갖고, 수천 개의 반응이 1 mm2 미만의 단일 칩 상에서 수행될 수 있도록 한다. 바이오포스 래보래토리즈 (BioForce Laboratories)에서는 광학 검출에 대한 한계에서 85 제곱미크론 내에 1521개의 단백질 스폿 (제곱cm 당 2천5백만개의 스폿에 상당함)을 갖는 나노어레이를 개발하였고; 그의 판독 방법은 형광 및 원자력 현미경 (AFM)이다.
형광 표지 및 검출 방법은 널리 사용된다. DNA 마이크로어레이를 판독하기 위해 사용된 것과 동일한 기구가 단백질 어레이에 적용가능하다. 차등적 디스플레이를 위해, 포획 (예를 들어, 항체) 어레이를 2개의 상이한 세포 상태로부터의 형광 표지된 단백질로 프로빙할 수 있고, 여기서 세포 용해물은 상이한 형광단 (예를 들어 Cy-3, Cy-5)과 직접 컨쥬게이팅되고 혼합되어, 색상이 표적 풍부도의 변화에 대한 판독으로서 작용하도록 한다. 형광 판독 감도는 타이라미드 (tyramide) 신호 증폭 (TSA) (퍼킨엘머 라이프사이언시스 (PerkinElmer Life Sciences))에 의해 10-100배 증폭될 수 있다. 평면 도파관 (waveguide) 기술 (젭토센스)은 초감도 형광 검출을 가능하게 하고, 이는 개재하는 세척 절차가 없다는 추가의 잇점을 갖는다. 또한, 고감도는 표지로서 피코에리트린 (루미넥스) 또는 반도체 나노결정의 특성 (퀀텀 도트)을 이용하여, 현탁액 비드 및 입자를 사용하여 달성할 수 있다. 많은 신규한 대체 판독법이 특히 상업적인 생명기술의 장에서 개발되었다. 이들은 표면 플라즈몬 공명 (HTS Biosystems, 인트린식 바이오프로브스 (Intrinsic Bioprobes, 미국 아리조나주 템페), 롤링 써클 (rolling circle) DNA 증폭 (몰레큘라 스테이징 (Molecular Staging, 미국 커넥티컷주 뉴 헤븐)), 질량 분광법 (인트린식 바이오프로브스; 사이퍼젠 (Ciphergen, 미국 캘리포니아주 프레몬트)), 공명 광 산란 (제니콘 사이언시스 (Genicon Sciences, 미국 캘리포니아주 샌디에고)) 및 원자력 현미경 [바이오포스 래보래토리즈]의 채용을 포함한다.
포획 어레이는 발현 프로파일링을 위한 진단적 칩 및 어레이의 기초를 형성한다. 이들은 특징적 표적 리간드에 고효율 방식으로 결합하고 검출하기 위해 고친화도 포획 시약, 예를 들어 통상적인 항체, 단일 도메인, 공학처리된 스캐폴드, 펩티드 또는 핵산 앱타머를 사용한다.
항체 어레이는 특이성 및 허용가능한 배경의 요구되는 특성을 갖고, 일부는 상업적으로 이용가능하다 (비디 바이오사이언시즈 (BD Biosciences, 미국 캘리포니아주 산호세); 클론테크 (Clontech, 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰)); 바이오라드 (BioRad); 시그마 (미국 미저리주 세인트루이스)). 포획 어레이를 위한 항체는 통상적인 면역화 (폴리클로날 혈청 및 하이브리도마)에 의해, 또는 파지 또는 리보좀 디스플레이 라이브러리로부터의 선택 후에 대체로 이. 콜라이 (E. coli)에서 발현된 재조합 단편으로서 제조된다 (캠브리지 안티바디 테크놀로지 (Cambridge Antibody Technology, 영국 캠브리지); 바이오인벤트 (BioInvent, 스웨덴 룬트); 아피테크 (Affitech, 미국 캘리포니아주 월넛 크리크); 바이오사이트 (Biosite, 미국 캘리포니아주 샌디에고)). 통상적인 항체에 추가로, Fab 및 scFv 단편, 카멜리드 (camelid) 또는 공학처리된 인간 동등물로부터의 단일 V-도메인 (도만티스 (Domantis, 미국 매사추세츠주 월탐)도 어레이에서 또한 유용할 수 있다.
용어 "스캐폴드"는 단백질의 리간드-결합 도메인을 나타내고, 이는 항체와 유사한 특이성 및 친화도 특성을 갖는 다양한 표적 분자에 결합할 수 있는 다수의 변이체로 공학처리된다. 변이체는 유전자 라이브러리 포맷에서 생산되고 파지, 세균 또는 리보좀 디스플레이에 의해 개별 표적에 대해 선택될 수 있다. 상기 리간드-결합 스캐폴드 또는 프레임워크는 스타필로코커스 아우레우스 (Staph . aureus) 단백질 A에 기초한 '아피바디 (Affibody)' (아피바디 (Affibody, 스웨덴 브롬마)), 피브로넥틴에 기초한 '트리넥틴 (Trinectin)' (필로스 (Phylos, 미국 매사추세츠주 렉싱톤)) 및 리포칼린 구조에 기초한 '안티칼린 (Anticalin)' (피에리스 프로테오랩 (Pieris Proteolab, 독일 프라이징-바이헨슈테판))을 포함한다. 이들은 항체와 유사한 방식으로 포획 어레이 상에서 사용될 수 있고, 강건함 및 생산의 용이성의 잇점을 가질 수 있다.
단백질 리간드에 높은 특이성 및 친화도로 결합하는 비단백질 포획 분자, 특히 단일 가닥 핵산 앱타머가 또한 어레이에서 사용된다 (소마로직 (SomaLogic, 미국 콜로라도주 불더). 앱타머는 Selex™ 절차에 의해 올리고뉴클레오티드의 라이브러리로부터 선택되고, 단백질과 그들의 상호작용은 브롬화 데옥시우리딘 및 UV-활성화된 가교결합 (포토앱타머 (photoaptamer))의 포함을 통한 공유 부착에 의해 향상될 수 있다. 리간드에 대한 광가교결합은 특수한 입체 요건 때문에 앱타머의 교차-반응성을 감소시킨다. 앱타머는 자동화 올리고뉴클레오티드 합성에 의한 생산의 용이성 및 DNA의 안정성 및 강건함의 잇점을 갖고; 포토앱타머 어레이 상에서, 결합을 검출하기 위해 범용 형광 단백질 스테인이 사용될 수 있다.
항체 어레이에 대한 단백질 분석물 결합은 직접적으로 또는 2차 항체를 통해 샌드위치 분석에서 검출할 수 있다. 직접적 표지는 상이한 색상을 갖는 상이한 샘플의 비교를 위해 사용된다. 동일한 단백질 리간드에서 지정된 항체의 쌍이 이용가능한 경우에, 샌드위치 면역분석은 높은 특이성 및 감도를 제공하고, 따라서 저풍부도 단백질, 예를 들어 사이토킨에 대해 선택되는 방법이고; 이들은 또한 단백질 변형의 검출 가능성을 제공한다. 질량 분광법, 표면 플라즈몬 공명 및 원자력 현미경을 포함하는 무-표지 검출 방법은 리간드의 변경을 피한다. 임의의 방법에서 요구되는 것은 최적 감도 및 특이성이고, 여기서 높은 신호 대 노이즈를 제공하기 위해 낮은 배경을 갖는다. 분석물 농도는 넓은 범위를 포함하기 때문에, 감도는 적절하게 맞추어져야 하고; 샘플의 연속 희석 또는 상이한 친화도의 항체의 사용이 상기 문제에 대한 해결책이다. 사이토킨 또는 세포 내의 낮은 발현 생성물과 같은 관심있는 단백질은 종종 체액 및 추출물 내에 낮은 농도로 존재하고, 이는 pg 범위 또는 그보다 낮은 범위의 검출을 필요로 한다.
포획 분자의 어레이에 대한 대안은 '분자 각인 (imprinting)' 기술을 통하여 이루어지는 것이고, 여기서 펩티드 (예를 들어, 단백질의 C-말단 구역으로부터)가 중합가능한 매트릭스 내에 구조적으로 상보성인 서열-특이적 캐비티 (cavity)를 생성하기 위해 템플레이트 (template)로서 사용되고; 이어서, 캐비티는 적절한 1차 아미노산 서열을 갖는 (변성된) 단백질을 특이적으로 포획할 수 있다 (ProteinPrint™, 아스피라 바이오시스템즈 (Aspira Biosystems, 미국 캘리포니아주 벌링에임)).
진단학적으로 및 발현 프로파일링에서 사용될 수 있는 다른 방법은 ProteinChip(등록상표) 어레이 (사이퍼젠)이고, 여기서 고체상 크로마토그래피 표면이 혈장 또는 종양 추출물과 같은 혼합물로부터 유사한 전하 또는 소수성의 특징을 갖는 단백질에 결합하고, SELDI-TOF 질량 분광법을 사용하여 보유된 단백질을 검출한다.
대규모 기능적 칩이 다수의 정제된 단백질을 고정화시킴으로써 구성되었고, 매우 다양한 생화학적 기능, 예를 들어 다른 단백질과의 단백질 상호작용, 약물-표적 상호작용, 효소-기질 등을 분석하기 위해 사용되었다. 일반적으로, 이들은 발현 라이브러리를 필요로 하고, 상기 발현 라이브러리는 이. 콜라이, 효모 등 내로 클로닝된 후, 그로부터 발현된 단백질을 예를 들어 His 태그를 통해 정제하고, 고정화시킨다. 무-세포 단백질 전사/번역은 세균 또는 다른 생체내 시스템에서 잘 발현하지 않는 단백질의 합성을 위한 실용적인 대안이다.
단백질-단백질 상호작용을 검출하기 위해, 단백질 어레이는 세포 기반 효모 2-하이브리드 시스템에 대한 시험관 내 대안일 수 있고, 분비된 단백질 또는 디술피드 다리를 갖는 단백질을 포함하는 상호작용과 같은 후자가 결핍되는 경우에 유용할 수 있다. 어레이 상에서 생화학적 활성의 고속 분석은 효모 단백질 키나제에 대해 및 효모 프로테옴 (proteome)의 다양한 기능 (단백질-단백질 및 단백질-지질 상호작용)에 대해 설명되었고, 여기서 모든 효모 개방-판독 프레임의 대부분은 마이크로어레이 상에서 발현되고 고정되었다. 대규모 '프로테옴 칩'은 기능적 상호작용의 확인, 약물 스크리닝 등에서 매우 유용할 것으로 보인다 (프로테오메트릭스 (Proteometrix, 미국 커넥티컷주 브랜포드)).
개별 요소의 2차원 디스플레이로서, 단백질 어레이는 항체, 합성 스캐폴드, 펩티드 및 앱타머를 포함한 특이적 결합 파트너를 선택하도록 파지 또는 리보좀 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방식으로, '라이브러리 대 라이브러리' 스크리닝이 수행될 수 있다. 게놈 프로젝트로부터 확인된 단백질 표적의 어레이에 대한 조합 화학 라이브러리에서 약물 후보의 스크리닝은 상기 방안의 다른 용도이다.
예를 들어, BD™ Cytometric Bead 어레이와 같은 다중 비드 분석은 가용형 분석물을 포획하고 정량하기 위해 사용될 수 있는 일련의 스펙트럼이 구분되는 입자이다. 이어서, 분석물은 형광-기반 방출의 검출 및 유동 세포측정 분석에 의해 측정된다. 다중 비드 분석은 ELISA 기반 분석에 상당하는 데이타를 "다중" 또는 동시 방식으로 생성한다. 미지물의 농도는 세포측정 비드 어레이에 대해 임의의 샌드위치 포맷 분석에서와 같이, 즉 공지의 표준물을 사용하고 표준 곡선에 대해 미지물을 플로팅하여 계산된다. 또한, 다중 비드 분석은 샘플 부피 제한으로 인해 이전에 고려되지 않은 샘플 내의 가용형 분석물의 정량을 허용한다. 정량적 데이타에 추가로, 사용자에게 한눈에 추가의 정보를 제공하는 독특한 프로파일 또는 시그너쳐 (signature)를 밝히는 강력한 시각적 영상이 생성될 수 있다.
2. 항체
본원에 개시된 진단학적 방법에서 샘플 내의 PAX2 또는 DEFB1을 검출하기 위해 사용될 수 있거나, 본원에 개시된 전립선암 또는 PIN의 치료 또는 예방 방법에서 PAX2와 DEFB1 사이의 상호작용을 억제하기 위해 사용될 수 있는, PAX2 또는 DEFB1에 특이적으로 결합하는 항체를 본원에서 개시한다.
용어 "항체"는 본원에서 넓은 의미로 사용되고, 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 포두 포함한다. 무손상 면역글로불린 분자에 추가로, 용어 "항체"에는 PAX2와 DEFB1의 상호작용이 억제되도록, 예를 들어 PAX2 또는 DEFB1과 상호작용하는 그들의 능력에 대해 선택되는 한, 상기 면역글로불린 분자의 단편 또는 중합체, 및 면역글로불린 분자의 인간 또는 인간화 버전 또는 그의 단편이 또한 포함된다. PAX2와 DEFB1 사이의 상호작용에 관여되는 PAX2 또는 DEFB1의 개시된 구역에 결합하는 항체를 또한 개시한다. 항체는 본원에 설명된 시험관내 분석을 이용하여 또는 유사한 방법에 의해 그들의 요구되는 활성에 대해 시험될 수 있고, 그 후 그들의 생체내 치료 및/또는 예방 활성을 공지의 임상 시험 방법에 따라 시험한다.
용어 "모노클로날 항체"는 본원에서 사용될 때 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 얻어진 항체를 나타내고, 즉, 집단 내의 개별 항체는 항체 분자의 작은 하위세트 내에 존재할 수 있는 가능한 자연발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 본원에서 구체적으로 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이거나 또는 특정 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 한편, 나머지 사슬(들)은 다른 종으로부터 유래하는 항체 내의 상응하는 서열에 동일하거나 또는 상동성이거나 또는 다른 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 "키메라" 항체, 및 요구되는 길항 활성을 보인다면 상기 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 4,816,567 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)] 참조).
개시된 모노클로날 항체는 모노클로날 항체를 생산하는 임의의 절차를 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 개시된 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 예를 들어 문헌 [Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)]에 기재된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 포유동물을 대개 면역화제에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도하기 위해 면역화제로 면역화시킨다. 별법으로, 림프구는 예를 들어 본원에 설명된 HIV Env-CD4-코-수용체 복합체를 사용하여 시험관 내에서 면역화될 수 있다.
모노클로날 항체는 재조합 DNA 방법, 예를 들어 미국 특허 4,816,567 (Cabilly 등)에 기재된 방법에 의해서도 제조할 수 있다. 개시된 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 쉽게 단리되고, 통상적인 절차를 사용하여 (예를 들어, 쥐 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 서열 결정할 수 있다. 또한, 예를 들어 미국 특허 5,804,440 (Burton 등) 및 미국 특허 6,096,441 (Barbas 등)에 기재된 바와 같이 항체 또는 활성 항체 단편의 라이브러리를 생성하고 파지 디스플레이 기술을 사용하여 스크리닝할 수 있다.
시험관내 방법은 또한 1가 항체를 제조하기에 적합하다. 그의 단편, 특히, Fab 단편을 생산하기 위한 항체의 소화는 당업계에 공지된 일상적인 기술을 이용하여 달성할 수 있다. 예를 들어, 소화는 파파인을 사용하여 수행할 수 있다. 파파인 소화의 예는 1994년 12월 22일 공개된 WO 94/29348 및 미국 특허 4,342,566에 기재되어 있다. 항체의 파파인 소화는 대개 각각 단일 항원 결합 부위를 갖는 Fab 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편, 및 잔여 Fc 단편을 생성시킨다. 펩신 처리는 2개의 항원 결합 부위를 갖고 여전히 항원에 가교결합할 수 있는 단편을 생성시킨다.
다른 서열에 부착되었는지 여부에 상관없이, 단편은 항체 또는 항체 단편의 활성이 비-변형된 항체 또는 항체 단편에 비해 유의하게 변경되거나 손상되지 않는다면 특정 구역 또는 특이적 아미노산 잔기의 삽입, 결실, 치환 또는 다른 선택된 변형을 또한 포함할 수 있다. 이들 변형은 몇몇 추가의 특성, 예를 들어 디술피드 결합할 수 있는 아미노산의 제거/부가, 그의 생체 수명의 증가, 그의 분비 특성의 변경 등을 제공할 수 있다. 어느 경우에도, 항체 또는 항체 단편은 생활성 특성, 예를 들어 그의 동족 항원에 대한 특이적 결합을 보유해야 한다. 항체 또는 항체 단편의 기능적 또는 활성 구역은 단백질의 특정 구역의 돌연변이 유발에 이어, 발현된 폴리펩티드의 발현 및 시험에 의해 확인할 수 있다. 그러한 방법은 당업자가 쉽게 알 수 있고, 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 핵산의 부위-특이적 돌연변이 유발을 포함할 수 있다 (Zoller, M.J. Curr. Opin. Biotechnol. 3:348-354, 1992).
본원에서 사용될 때, 용어 "항체(들)"은 인간 항체 및/또는 인간화 항체를 또한 나타낼 수 있다. 많은 비-인간 항체 (예를 들어, 마우스, 래트 또는 토끼로부터 유래된 것)는 인간에서 자연적으로 항원성이고, 따라서 인간에게 투여될 때 바람직하지 않은 면역 반응을 유발할 수 있다. 따라서, 방법에서 인간 또는 인간화 항체를 사용하면 인간에게 투여된 항체가 바람직하지 않은 면역 반응을 유발할 가능성을 감소시킨다.
개시된 인간 항체는 임의의 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 인간 모노클로날 항체 생산을 위한 기술의 예는 문헌 ([Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77, 1985] 및 [Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95, 1991])에 기재된 것을 포함한다. 또한, 인간 항체 (및 그의 단편)도 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 제조할 수 있다 ([Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381, 1991]; [Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581, 1991]).
개시된 인간 항체는 또한 트랜스제닉 포유동물로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 면역화에 반응하여 인간 항체의 전체 레파토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 돌연변이체 마우스가 문헌에 기재되었다 (예를 들어, 문헌 ([Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-255 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)]; [Bruggermann et al., Year in Immunol., 7:33 (1993)]) 참조). 구체적으로, 이들 키메라 및 생식계열 (germ-line) 돌연변이체 마우스에서 항체 중쇄 연결 구역 (J(H)) 유전자의 동종접합성 (homozygous) 결실은 내인성 항체 생산을 완전 억제하고, 인간 생식계열 항체 유전자 어레이를 상기 생식계열 돌연변이체 마우스 내로 성공적으로 전달하면 항원 챌린지 (challenge)시에 인간 항체를 생산한다. 요구되는 활성을 갖는 항체는 본원에 설명된 바와 같은 Env-CD4-코-수용체 복합체를 사용하여 선택한다.
항체 인간화 기술은 일반적으로 항체 분자의 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 DNA 서열을 조작하기 위한 재조합 DNA 기술의 사용을 수반한다. 따라서, 비-인간 항체 (또는 그의 단편)의 인간화 형태는 인간 (수용) 항체의 프레임워크 내에 통합된, 비-인간 (공여) 항체로부터의 항원 결합 부위의 일부를 함유하는 키메라 항체 또는 항체 사슬 (또는 그의 단편, 예를 들어 Fv, Fab, Fab', 또는 항체의 다른 항원-결합 부분)이다.
인간화 항체를 생성하기 위해서, 수용 (인간) 항체 분자의 하나 이상의 상보성 결정 구역 (CDR)으로부터의 잔기를 요구되는 항원 결합 특징 (예를 들어, 표적 항원에 대한 특정 수준의 특이성 및 친화도)을 갖는 것으로 알려진 공여 (비-인간) 항체 분자의 하나 이상의 CDR로부터의 잔기로 교체한다. 일부 예에서, 인간 항체의 Fv 프레임워크 (FR) 잔기를 상응하는 비-인간 잔기로 교체한다. 또한, 인간화 항체는 수용 항체 또는 도입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 함유할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체에는 비-인간의 공급원으로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입된다. 실제로, 인간화 항체는 대개 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체 내의 유사한 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다. 인간화 항체는 일반적으로 항체 불변 구역 (Fc)의 적어도 일부, 대개 인간 항체의 것을 함유한다 ([Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)], [Reichmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)] 및 [Presta, Curr. Opin. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)]).
비-인간 항체의 인간화 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 인간화 항체는 윈터 (Winter) 및 동료들의 방법에 따라 ([Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)], [Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)], [Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)]) 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 인간 항체의 상응하는 서열을 치환함으로써 생성될 수 있다. 또한, 인간화 항체를 생산하기 위해 사용될 수 있는 방법은 미국 특허 4,816,567 (Cabilly 등), 미국 특허 5,565,332 (Hoogenboom 등), 미국 특허 5,721,367 (Kay 등), 미국 특허 5,837,243 (Deo 등), 미국 특허 5,939,598 (Kucherlapati 등), 미국 특허 6,130,364 (Jakobovits 등)와 미국 특허 6,180,377 (Morgan 등)에 기재되어 있다.
항체의 투여는 본원에 개시된 바와 같이 수행할 수 있다. 항체 전달을 위한 핵산 방안도 또한 존재한다. 중화 범위가 큰 항 PAX2 또는 DEFB1 항체 및 항체 단편이 또한 환자 또는 대상 자신의 세포가 핵산을 흡수하여 코딩된 항체 또는 항체 단편을 생산하고 분비하도록 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 핵산 제제 (예를 들어, DNA 또는 RNA)로서 환자 또는 대상에게 투여될 수 있다. 핵산의 전달은 예를 들어 본원에 개시된 바와 같은 임의의 수단에 의해 수행할 수 있다.
3. 서열 유사성
본원에서 논의된 바와 같이, 상동성 및 동일성이라는 용어의 사용은 유사성과 동일한 것을 의미함이 이해된다. 따라서, 예를 들어, 단어 "상동성"이 2개의 비-천연 서열들 사이에서 사용되는 경우에, 상동성은 반드시 이들 2개의 서열 사이의 진화적 관계를 나타내는 것이 아니라, 오히려 핵산 서열들 사이의 유사성 또는 관련성을 제시하는 것으로 이해된다. 2개의 진화상 관련된 분자들 사이의 상동성을 결정하는 많은 방법이 진화상 관련되거나 관련되지 않거나 상관없이 서열 유사성을 측정하기 위해 목적으로 통상적으로 임의의 2개 이상의 핵산 또는 단백질에 적용된다.
일반적으로, 본원에서 개시된 유전자 및 단백질의 임의의 공지의 변이체 및 유도체 또는 발생할 수 있는 것을 규정하는 한 방법은 변이체 및 유도체를 특정 공지 서열에 대한 상동성의 측면에서 규정하는 것을 통하는 것임이 이해된다. 본원에 개시된 특정 서열의 상기 동일성은 또한 본원의 다른 부분에서도 논의된다. 일반적으로, 본원에 개시된 유전자 및 단백질의 변이체는 일반적으로 진술된 서열 또는 천연 서열에 대해 적어도 약 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 상동성을 갖는다. 당업자는 2개의 단백질 또는 핵산, 예를 들어 유전자의 상동성을 결정하는 방법을 쉽게 이해할 것이다. 예를 들어, 상동성은 상동성이 최고 수준이 되도록 2개의 서열을 정렬시킨 후 계산될 수 있다.
상동성을 계산하는 다른 방식은 공개된 알고리즘에 의해 수행할 수 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 국소 상동성 알고리즘 [Smith and Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)], 상동성 정렬 알고리즘 [Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)], 유사성 검색 방법 [Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444 (1988)], 상기 알고리즘의 컴퓨터에 의한 실행 (제네틱스 컴퓨터 그룹 (Genetics Computer Group, 미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575)의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지 (Wisconsin Genetics Software Package)에서 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA), 또는 정밀조사에 의해 수행할 수 있다.
동일한 유형의 상동성은 예를 들어 적어도 핵산 정렬에 관련된 물질에 대해 본원에 참고로 포함되는 문헌 ([Zuker, M. Science 244:48-52, 1989], [Jaeger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7706-7710, 1989], [Jaeger et al Methods Enzymol. 183:281-306, 1989])에 개시된 알고리즘에 의해 핵산에 대해 얻을 수 있다. 대개 임의의 방법들을 사용할 수 있고, 특정 경우에 상기 다양한 방법들의 결과가 상이할 수 있음이 이해되지만, 당업자는 상기 방법들 중 적어도 하나에서 동일성이 발견되면 그 서열은 진술된 동일성을 갖는 것으로 말해질 것이고, 본원에 개시됨을 이해할 것이다.
예를 들어, 본원에서 사용될 때, 다른 서열에 대해 특정 상동성 %를 갖는 것으로 언급된 서열은 임의의 하나 이상의 상기 설명된 계산 방법에 의해 계산될 때 언급된 상동성을 갖는 서열을 나타낸다. 예를 들어, 주커 (Zuker) 계산 방법을 사용할 때 제1 서열이 제2 서열에 대해 80% 상동성을 갖는다면 임의의 다른 계산 방법에 의해 계산될 때 제1 서열이 제2 서열에 대해 80% 상동성을 갖지 않더라도, 제1 서열은 제2 서열에 대해 본원에 정의된 바와 같이 80% 상동성을 갖는다. 다른 예로서, 주커 계산 방법 및 피어슨 (Pearson) 및 립만 (Lipman) 계산 방법을 모두 사용할 때 제1 서열이 제2 서열에 대해 80% 상동성을 갖는다면, 스미스 (Smith) 및 워터만 (Waterman) 계산 방법, 니들만 (Needleman) 및 분쉬 (Wunsch) 계산 방법, 재거 (Jaeger) 계산 방법, 또는 임의의 다른 계산 방법에 의해 계산할 때 제1 서열이 제2 서열에 대해 80% 상동성을 갖지 않더라도, 제1 서열은 제2 서열에 대해 본원에 정의된 바와 같이 80 상동성을 갖는다. 또 다른 예로서, 각각의 계산 방법을 사용할 때 제1 서열이 제2 서열에 대해 80% 상동성을 갖는 것으로 계산되면 (실제에서는 상이한 계산 방법은 종종 상이한 계산된 % 상동성을 생성할 것이지만), 제1 서열은 제2 서열에 대해 본원에 정의된 바와 같이 80% 상동성을 갖는다.
4. 혼성화 /선택적 혼성화
용어 혼성화는 대개 적어도 2개의 핵산 분자, 예를 들어 프라이머 또는 프로브와 유전자 사이의 서열 구동된 상호작용을 의미한다. 서열 구동된 상호작용은 2개의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 뉴클레오티드 유도체 사이에서 뉴클레오티드 특이적 방식으로 일어나는 상호작용을 의미한다. 예를 들어, C와 G 상호작용 또는 T와 A 상호작용은 서열 구동된 상호작용이다. 대개, 서열 구동된 상호작용은 뉴클레오티드의 왓슨-크릭 (Watson-Crick) 페이스 (face) 또는 후그스틴 (Hoogsteen) 페이스 상에서 발생한다. 2개의 핵산의 혼성화는 당업자에게 공지된 많은 조건 및 파라미터에 의해 영향을 받는다. 예를 들어, 반응물의 염 농도, pH 및 온도 모두가 2개의 핵산 분자의 혼성화 여부에 영향을 준다.
2개의 핵산 분자 사이의 선택적 혼성화를 위한 파라미터는 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 선택적 혼성화 조건은 엄격한 혼성화 조건으로 규정될 수 있다. 예를 들어, 혼성화의 엄격도는 혼성화 및 세척 단계 중 어느 하나 또는 둘 모두의 온도 및 염 농도에 의해 제어된다. 예를 들어, 선택적 혼성화를 달성하기 위한 혼성화 조건은 Tm (분자의 절반이 그들의 혼성화 파트너로부터 해리하는 용융 온도)보다 약 12-25℃ 낮은 온도에서 높은 이온 강도 용액 (6X SSC 또는 6X SSPE) 중에서 혼성화한 후, 세척 온도가 Tm보다 약 5℃ 내지 20℃ 낮도록 선택된 온도 및 염 농도의 조합에서 세척하는 것을 포함할 수 있다. 온도 및 염 조건은 필터 상에 고정시킨 참조 DNA 샘플을 관심있는 표지된 핵산에 혼성화시킨 후, 상이한 엄격도의 조건 하에 세척하는 예비 실험으로 실험적으로 쉽게 결정된다. 혼성화 온도는 대개 DNA-RNA 및 RNA-RNA 혼성화에 대한 것보다 더 높다. 조건은 엄격도를 달성하기 위해 상기 설명된 바와 같이 또는 당업계에 공지된 바와 같이 사용될 수 있다 (적어도 핵산의 혼성화에 관련된 물질에 대해 본원에 참고로 포함되는 문헌 ([Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989]; [Kunkel et al. Methods Enzymol. 1987:154:367, 1987]) 참조). DNA:DNA 혼성화를 위한 바람직한 엄격한 혼성화 조건은 6X SSC 또는 6X SSPE 중에서 약 68℃ (수용액 중)에 이어, 68℃에서 세척일 수 있다. 필요한 경우에, 혼성화 및 세척의 엄격도는 요구되는 상보성 정도가 감소함에 따라 및 또한 그에 대해 변동성이 검색되는 임의의 영역의 G-C 또는 A-T 풍부도에 따라 감소될 수 있다. 이와 마찬가지로, 필요한 경우에, 혼성화 및 세척의 엄격도는 당업계에 공지된 바와 같이 요구되는 상동성이 증가함에 따라 및 또한 높은 상동성이 요구되는 임의의 영역의 G-C 또는 A-T 풍부도에 따라 따라서 증가될 수 있다.
선택적 혼성화를 규정하기 위한 다른 방법은 다른 핵산에 결합된 하나의 핵산의 양 (백분율)을 구하는 것이다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 선택적 혼성화 조건은 적어도 약 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100%의 제한 핵산이 비-제한 핵산에 결합될 때 존재할 것이다. 대개, 비-제한 프라이머는 예를 들어, 10 또는 100 또는 1000배 과량으로 존재한다. 상기 종류의 분석은 제한 및 비-제한 프라이머 모두가 예를 들어 그들의 kd의 10배 또는 100배 또는 1000배 미만이거나, 두 핵산 분자들 중 하나만 10배 또는 100배 또는 1000배이거나, 하나 또는 두 핵산 분자가 그들의 kd를 초과하는 조건 하에 수행될 수 있다.
선택적 혼성화를 규정하는 다른 방법은 요구되는 효소에 의한 조작을 촉진하기 위해 혼성화가 요구되는 조건 하에 효소에 의해 조작된 프라이머의 백분율을 구하는 것이다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 선택적 혼성화 조건은 효소에 의한 조작을 촉진하는 조건 하에 적어도 약 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100%의 프라이머가 효소에 의해 조작될 때 존재할 것이고, 예를 들어 효소에 의한 조작이 DNA 연장이면, 선택적 혼성화 조건은 적어도 약 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100%의 프라이머 분자가 연장될 때 존재할 것이다. 바람직한 조건은 또한 조작을 수행하는 효소에 적절한 것으로서 제조사에서 제안되거나 당업계에 지시된 것을 포함한다.
상동성과 마찬가지로, 2개의 핵산 분자들 사이의 혼성화 수준을 결정하기 위한 본원에 개시된 다양한 방법이 존재함이 이해된다. 이들 방법 및 조건은 2개의 핵산 분자들 사이에서 상이한 백분율의 혼성화를 제공할 수 있음이 이해되지만, 달리 지시되지 않으면 임의의 방법의 파라미터를 충족시키는 것이 충분할 것이다. 예를 들어, 80% 혼성화가 요구되면, 혼성화가 이들 방법 중 임의의 하나에서 요구되는 파라미터 내에서 발생하는 한 이는 본원에 개시된 것으로 간주된다.
당업자가 조성물 또는 방법이 종합적으로 또는 단독으로 혼성화를 결정하기 위한 임의의 하나의 상기 기준을 충족시키면, 조성물 또는 방법은 본원에 개시되는 것임을 이해하는 것으로 이해된다.
5. 핵산
핵산 기반의 다양한 분자가 본원에 개시된다. 개시된 핵산은 예를 들어 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 또는 뉴클레오티드 치환체로 구성된다. 이들 및 다른 분자의 비-제한적인 예가 본원에서 논의된다. 예를 들어, 벡터가 세포 내에서 발현될 때, 발현된 mRNA는 대개 A, C, G 및 U로 구성될 것으로 이해된다. 마찬가지로, 예를 들어, 안티센스 분자가 예를 들어 외인성 전달을 통해 세포 또는 세포 환경 내로 도입되면, 안티센스 분자는 세포성 환경 내에서 안티센스 분자의 분해를 감소시키는 뉴클레오티드 유사체로 이루어지는 것이 유리할 것으로 이해된다.
i. 뉴클레오티드 및 관련 분자
뉴클레오티드는 염기 모이어티, 당 모이어티 및 포스페이트 모이어티를 함유하는 분자이다. 뉴클레오티드는 뉴클레오시드간 연결을 생성하는 그들의 포스페이트 모이어티와 당 모이어티를 통해 함께 연결될 수 있다. 뉴클레오티드의 염기 모이어티는 아데닌-9-일 (A), 시토신-1-일 (C), 구아닌-9-일 (G), 우라실-1-일 (U) 및 티민-1-일 (T)일 수 있다. 뉴클레오티드의 당 모이어티는 리보스 또는 데옥시리보스이다. 뉴클레오티드의 포스페이트 모이어티는 5가 포스페이트이다. 뉴클레오티드의 비-제한적인 예는 3'-AMP (3'-아데노신 모노포스페이트) 또는 5'-GMP (5'-구아노신 모노포스페이트)일 것이다. 매우 다양한 상기 종류의 분자가 당업계에서 이용가능하고 본원에서 이용가능하다.
뉴클레오티드 유사체는 염기, 당 또는 포스페이트 모이어티 상에 일부 종류의 변형을 함유하는 뉴클레오티드이다. 뉴클레오티드에 대한 변형은 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어, 5-메틸시토신 (5-me-C), 5-히드록시메틸 시토신, 잔틴, 하이포잔틴 및 2-아미노아데닌과 당 또는 포스페이트 모이어티에서의 변형을 포함할 것이다. 매우 다양한 상기 종류의 분자가 당업계에서 이용가능하고 본원에서 이용가능하다.
뉴클레오티드 치환체는 뉴클레오티드에 유사한 기능적 특성을 갖지만, 포스페이트 모이어티를 함유하지 않는 분자, 예를 들어 펩티드 핵산 (PNA)이다. 뉴클레오티드 치환체는 핵산을 왓슨-크릭 또는 후그스틴 방식으로 인식할 것이지만, 포스페이트 모이어티 이외의 모이어티를 통해 함께 연결되는 분자이다. 뉴클레오티드 치환체는 적절한 표적 핵산과 상호작용할 때 이중 나선형 구조에 부합할 수 있다. 매우 다양한 상기 종류의 분자가 당업계에서 이용가능하고 본원에서 이용가능하다.
예를 들어, 세포성 흡수를 향상시키기 위해 다른 종류의 분자 (컨쥬게이트)를 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체에 연결하는 것이 또한 가능하다. 컨쥬게이트가 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체에 화학적으로 연결될 수 있다. 그러한 컨쥬게이트는 지질 모이어티, 예를 들어 콜레스테롤 모이어티를 포함하고, 이로 제한되지 않는다 (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989,86, 6553-6556). 매우 다양한 상기 종류의 분자가 당업계에서 이용가능하고 본원에서 이용가능하다.
왓슨-크릭 상호작용은 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체 또는 뉴클레오티드 치환체의 왓슨-크릭 페이스와의 적어도 하나의 상호작용이다. 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체 또는 뉴클레오티드 치환체의 왓슨-크릭 페이스는 푸린 기반 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체 또는 뉴클레오티드 치환체의 C2, N1 및 C6 위치 및 피리미딘 기반 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체 또는 뉴클레오티드 치환체의 C2, N3, C4 위치를 포함한다.
후그스틴 상호작용은 이중체 DNA의 메이저 그루브 내에서 노출되는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체의 후그스틴 페이스에서 일어나는 상호작용이다. 후그스틴 페이스는 푸린 뉴클레오티드의 N7 위치, 및 C6 위치에서 반응성 기 (NH2 또는 O)를 포함한다.
ii . 서열
본원에 개시된 신호 전달 경로에 관여되는 단백질 분자에 관련된 다양한 서열, 예를 들어 PAX2, 또는 PAX2를 제조하기 위해 본원에 개시된 임의의 핵산이 존재하고, 이들은 모두 핵산에 의해 코딩되거나 핵산이다. 상기 유전자의 인간 유사체, 및 다른 유사체, 및 상기 유전자의 대립유전자, 및 스플라이스 변이체와 다른 종류의 변이체에 대한 서열이 Genbank를 포함한 다양한 단백질 및 유전자 데이타베이스에서 이용가능하다. Genbank에서 본원의 출원 시에 이용가능한 서열은 그 전체가 및 그에 포함된 개별적인 하위서열이 본원에 참고로 포함된다. Genbank는 http://www.ncbi.nih.gov/entrez/query.fcgi에서 이용할 수 있다. 당업자는 이들 서열의 불일치 및 차이를 분석하는 방법 및 다른 관련 서열에 대해 특정 서열을 관련시키는 조성물 및 방법을 조정하는 방법을 알고 있다. 프라이머 및/또는 프로브는 본원에 개시되고 당업계에 공지되어 있는 정보를 통해 임의의 서열에 대하여 설계될 수 있다.
iii . 기능적 핵산
제공된 방법의 PAX2 억제제는 기능적 핵산일 수 있다. 기능적 핵산은 표적 분자에 결합하거나 특이적 반응을 촉매하는 것과 같은 특수한 기능을 갖는 핵산 분자이다. 기능적 핵산 분자는 다음 카테고리로 나누어질 수 있고, 이는 제한을 의미하지 않는다. 예를 들어, 기능적 핵산은 안티센스 분자, 앱타머, 리보자임, 삼중체 형성 분자, RNAi 및 외부 가이드 (external guide) 서열을 포함한다. 기능적 핵산 분자는 표적 분자가 갖는 특이적 활성의 작용제, 억제제, 조정제 및 자극제로서 작용할 수 있거나, 기능적 핵산 분자는 임의의 다른 분자와 무관하게 드 노보 (de novo) 활성을 가질 수 있다.
기능적 핵산 분자는 임의의 거대분자, 예를 들어 DNA, RNA, 폴리펩티드 또는 탄수화물 사슬과 상호작용할 수 있다. 따라서, 기능적 핵산은 PAX2의 mRNA 또는 PAX2의 게놈 DNA와 상호작용할 수 있거나, 폴리펩티드 PAX2와 상호작용할 수 있다. 종종 기능적 핵산은 표적 분자와 기능적 핵산 분자 사이의 서열 상동성을 기초로 하여 다른 핵산과 상호작용하도록 설계된다. 다른 상황에서, 기능적 핵산 분자와 표적 분자 사이의 특이적 인식은 기능적 핵산 분자와 표적 분자 사이의 서열 상동성을 기초로 하지 않고, 오히려 특이적인 인식이 발생하도록 허용하는 3차 구조의 형성을 기초로 한다.
안티센스 분자는 표준 (canonical) 또는 비-표준 염기쌍 형성을 통해 표적 핵산 분자와 상호작용하도록 설계된다. 안티센스 분자 및 표적 분자의 상호작용은 예를 들어 RNAseH 매개 RNA-DNA 하이브리드 분해를 통해 표적 분자의 파괴를 촉진하도록 설계된다. 별법으로, 안티센스 분자는 표적 분자에 대해 정상적으로 발생하는 처리 기능, 예를 들어 전사 또는 복제를 방해하도록 설계된다. 안티센스 분자는 표적 분자의 서열에 기초하여 설계될 수 있다. 표적 분자의 가장 접근가능한 구역을 발견함으로써 안티센스 효율의 최적화를 위한 많은 방법이 존재한다. 예시적인 방법은 시험관내 선택 실험 및 DMS 및 DEPC를 사용한 DNA 변형 연구이다. 안티센스 분자가 10-6, 10-8, 10-10 또는 10-12 이하의 해리 상수 (Kd)로 표적 분자에 결합하는 것이 바람직하다. 안티센스 분자의 설계 및 사용을 돕는 방법 및 기술의 대표적인 예는 미국 특허 5,135,917, 5,294,533, 5,627,158, 5,641,754, 5,691,317, 5,780,607, 5,786,138, 5,849,903, 5,856,103, 5,919,772, 5,955,590, 5,990,088, 5,994,320, 5,998,602, 6,005,095, 6,007,995, 6,013,522, 6,017,898, 6,018,042, 6,025,198, 6,033,910, 6,040,296, 6,046,004, 6,046,319, 및 6,057,437에서 볼 수 있다.
앱타머는 바람직하게는 특이적인 방식으로 표적 분자와 상호작용하는 분자이다. 일반적으로, 앱타머는 규정된 2차 및 3차 구조, 예를 들어 스템-루프 (stem-loop) 또는 G-4분체 (quartet)로 폴딩되는, 15-50개 염기 길이의 작은 핵산이다. 앱타머는 소분자, 예를 들어 ATP (미국 특허 5,631,146) 및 테오필린 (미국 특허 5,580,737), 및 대분자, 예를 들어 역전사효소 (미국 특허 5,786,462) 및 트롬빈 (미국 특허 5,543,293)에 결합할 수 있다. 앱타머는 10-12 M 미만의 Kd로 표적 분자에 매우 단단히 결합할 수 있다. 앱타머가 10-6, 10-8, 10-10 또는 10-12 미만의 Kd로 표적 분자에 결합하는 것이 바람직하다. 앱타머는 매우 높은 특이성 정도로 표적 분자에 결합할 수 있다. 예를 들어, 분자 상의 하나의 위치만 상이한 다른 분자와 표적 분자 사이의 결합 친화도 차이가 10,000배를 초과하는 앱타머가 단리되었다 (미국 특허 5,543,293). 앱타머는 배경 결합 분자에 대한 Kd보다 적어도 10, 100, 1000, 10,000, 또는 100,000배 더 낮은 표적 분자에 대한 Kd를 갖는 것이 바람직하다. 예를 들어, 폴리펩티드에 대한 비교를 수행할 때, 배경 분자가 상이한 폴리펩티드인 것이 바람직하다. 다양한 상이한 표적 분자에 결합하는 앱타머의 제조 및 사용 방법의 대표적인 예는 미국 특허 5,476,766, 5,503,978, 5,631,146, 5,731,424, 5,780,228, 5,792,613, 5,795,721, 5,846,713, 5,858,660, 5,861,254, 5,864,026, 5,869,641, 5,958,691, 6,001,988, 6,011,020, 6,013,443, 6,020,130, 6,028,186, 6,030,776, 및 6,051,698에서 볼 수 있다.
리보자임은 분자 내에서 또는 분자 사이에서 화학 반응을 촉매할 수 있는 핵산 분자이다. 따라서, 리보자임은 촉매 활성의 핵산이다. 리보자임이 분자간 반응을 촉매하는 것이 바람직하다. 망치머리형 (hammerhead) 리보자임 (미국 특허 5,334,711, 5,436,330, 5,616,466, 5,633,133, 5,646,020, 5,652,094, 5,712,384, 5,770,715, 5,856,463, 5,861,288, 5,891,683, 5,891,684, 5,985,621, 5,989,908, 5,998,193, 5,998,203; 국제 특허 출원 WO 9858058 (Ludwig and Sproat), WO 9858057 (Ludwig and Sproat), 및 WO 9718312 (Ludwig and Sproat)), 헤어핀 리보자임 (예를 들어, 미국 특허 5,631,115, 5,646,031, 5,683,902, 5,712,384, 5,856,188, 5,866,701, 5,869,339, 및 6,022,962), 및 테트라히메나 (tetrahymena) 리보자임 (예를 들어, 미국 특허 5,595,873 및 5,652,107)과 같은 자연계에서 발견되는 리보자임을 기초로 하여, 뉴클레아제 또는 핵산 중합효소 유형의 반응을 촉매하는 많은 상이한 유형의 리보자임이 존재한다. 또한, 자연계에서 발견되지 않지만, 특이적 반응을 드 노보로 촉매하도록 공학처리된 많은 리보자임도 존재한다 (예를 들어, 미국 특허 5,580,967, 5,688,670, 5,807,718, 및 5,910,408). 바람직한 리보자임은 RNA 또는 DNA 기질을 절단하고, 보다 바람직하게는 RNA 기질을 절단한다. 리보자임은 일반적으로 표적 기질의 인식 및 결합, 및 후속적인 절단을 통해 핵산 기질을 절단한다. 상기 인식은 종종 대부분 표준 또는 비-표준 염기쌍 상호작용을 기초로 한다. 표적 기질의 인식이 표적 기질 서열을 기초로 하기 때문에, 상기 특성을 갖는 리보자임은 핵산의 표적 특이적 절단을 위한 특히 우수한 후보이다. 다양한 상이한 반응을 촉매하는 리보자임의 제조 및 사용 방법의 대표적인 예는 미국 특허 5,646,042, 5,693,535, 5,731,295, 5,811,300, 5,837,855, 5,869,253, 5,877,021, 5,877,022, 5,972,699, 5,972,704, 5,989,906, 및 6,017,756에서 볼 수 있다.
삼중체 형성 기능적 핵산 분자는 이중 가닥 또는 단일 가닥 핵산과 상호작용할 수 있는 분자이다. 삼중체 분자가 표적 구역과 상호작용할 때, 삼중체로 불리는 구조가 형성된다. 왓슨-크릭 및 후그스틴 염기쌍 형성 모두에 의존하여 복합체를 형성하는 3개의 DNA 가닥이 존재한다. 높은 친화도 및 특이성으로 표적 구역에 결합할 수 있기 때문에, 삼중체 분자가 바람직하다. 삼중체 형성 분자가 10-6, 10-8, 10-10 또는 10-12 미만의 Kd로 표적 분자에 결합하는 것이 바람직하다. 다양한 상이한 표적 분자에 결합하는 삼중체 형성 분자의 제조 및 사용 방법의 대표적인 예는 미국 특허 5,176,996, 5,645,985, 5,650,316, 5,683,874, 5,693,773, 5,834,185, 5,869,246, 5,874,566, 및 5,962,426에서 볼 수 있다.
외부 가이드 서열 (EGS)은 복합체를 형성하는 표적 핵산 분자에 결합하는 분자이고, 상기 복합체는 표적 분자를 절단하는 RNase P에 의해 인식된다. EGS는 선택되는 RNA 분자를 특이적으로 표적화하도록 설계될 수 있다. RNAse P는 세포 내에서 수송 RNA (tRNA)의 처리를 돕는다. 세균 RNAse P는, 표적 RNA:EGS 복합체가 천연 tRNA 기질을 모방하도록 유도하는 EGS를 사용함으로써 실질적으로 임의의 RNA 서열을 절단하도록 동원될 수 있다 (WO 92/03566 (Yale), 및 [Forster and Altman, Science 238:407-409 (1990)]).
이와 유사하게, RNA의 진핵 EGS/RNAse P-지시된 절단을 이용하여 진핵 세포 내의 요구되는 표적을 절단할 수 있다 ([Yuan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8006-8010 (1992)]; WO 93/22434 (Yale); WO 95/24489 (Yale); [Yuan and Altman, EMBO J 14:159-168 (1995)], 및 [Carrara et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 92:2627-2631 (1995)]). 다양한 상이한 표적 분자의 절단을 용이하게 하기 위해 EGS 분자를 제조하고 사용하는 방법의 대표적인 예는 미국 특허 5,168,053, 5,624,824, 5,683,873, 5,728,521, 5,869,248, 및 5,877,162에서 볼 수 있다.
또한, 유전자 발현은 RNA 간섭 (RNAi)을 통해 매우 특이적인 방식으로 효과적으로 침묵시킬 수 있다. 상기 침묵은 본래 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 부가시에 관찰되었다 ([Fire,A., et al. (1998) Nature, 391:806-11]; [Napoli, C, et al. (1990) Plant Cell 2:279-89]; [Harmon, G.J. (2002) Nature, 418:244-51]). dsRNA는 세포 내로 들어가면, RNase III-유사 효소인 다이서 (Dicer)에 의해, 3' 말단에 2개의 뉴클레오티드 오버행 (overhang)을 함유하는, 길이가 21-23개 뉴클레오티드인 이중 가닥의 작은 간섭 RNA (siRNA)로 절단된다 ([Elbashir, S.M., et al. (2001) Genes Dev., 15:188-200]; [Bernstein, E., et al. (2001) Nature, 409:363-6]; [Hammond, S.M., et al. (2000) Nature, 404:293-6]). ATP 의존 단계에서, siRNA는 일반적으로 siRNA를 표적 RNA 서열로 유도하는 RNAi 유발 침묵 복합체 (RISC)로 알려진 다중-서브유닛 단백질 복합체로 통합된다 (Nykanen, A., et al. (2001) Cell, 107:309-21). 일부 지점에서, siRNA 이중체가 풀리고, 안티센스 가닥이 RISC에 결합된 상태로 유지되고, 엔도 및 엑소뉴클레아제의 조합에 의한 상보성 mRNA 서열의 분해를 지시하는 것으로 보인다 (Martinez, J., et al. (2002) Cell, 110:563-74). 그러나, iRNA 또는 siRNA의 효과 또는 그들의 사용은 임의의 종류의 메카니즘에 제한되지 않는다.
짧은 간섭 RNA (siRNA)는 서열-특이적 전사후 유전자 침묵을 유도하여 유전자 발현을 감소시키거나 심지어 억제할 수 있는 이중 가닥 RNA이다. 하나의 예에서, siRNA는 siRNA와 표적 RNA 사이의 서열 동일성 구역 내의 상동성 RNA 분자, 예를 들어 mRNA의 특이적 분해를 촉발한다. 예를 들어, 상기 siRNA의 제조 방법에 대해 본원에 참고로 포함되는 WO 02/44321은 3' 오버행 단부와 염기쌍 형성될 때 표적 mRNA의 서열-특이적 분해를 유발할 수 있는 siRNA를 개시하고 있다. 서열 특이적 유전자 침묵은 효소 다이서에 의해 생산된 siRNA를 모방하는 짧은 합성 이중 가닥 RNA를 사용하여 포유동물 세포에서 달성할 수 있다 ([Elbashir, S.M., et al. (2001) Nature, 411:494 498], [Ui-Tei, K., et al. (2000) FEBS Lett 479:79-82]). siRNA는 화학적으로 또는 시험관 내에서 합성될 수 있거나 또는 세포 내에서 siRNA 내로 처리되는 짧은 이중 가닥 헤어핀-유사 RNA (shRNA)의 결과물일 수 있다. 합성 siRNA는 일반적으로 알고리즘 및 통상적인 DNA/RNA 합성기를 사용하여 설계된다. 공급처는 앰비온 (Ambion, 미국 텍사스주 오스틴), 켐진스 (ChemGenes, 미국 매사추세츠주 애쉬랜드), 다마콘 (Dharmacon, 미국 콜로라도주 라파예트), 글렌 리써치 (Glen Research, 미국 버지니아주 스털링), MWB 바이오테크 (MWB Biotech, 독일 에스베르스베르크), 프로리고 (Proligo, 미국 콜로라도주 불더), 및 퀴아겐 (Qiagen, 네덜란드 벤토)을 포함한다. 또한, siRNA는 앰비온의 SILENCER(등록상표) siRNA 제작 키트와 같은 키트를 사용하여 시험관 내에서 합성될 수 있다. PAX2의 서열을 기초로 하여 상기한 바와 같이 설계된 임의의 siRNA가 본원에 개시된다.
벡터로부터 siRNA의 생산은 보다 통상적으로 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)의 전사를 통해 이루어진다. 예를 들어 임제넥스 (Imgenex)의 GENESUPPRESSOR™ 제작 키트 및 인비트로겐의 BLOCK-IT™ 유도가능 RNAi 플라스미드 및 렌티바이러스 벡터와 같은, shRNA를 포함하는 벡터의 생산을 위한 키트가 이용가능하다. 본원에 개시된 염증 매개체에 대한 서열을 기초로 하여 상기한 바와 같이 설계된 임의의 shRNA가 본원에 개시된다.
6. 세포 전달 시스템
시험관 내에서 또는 생체 내에서 세포에 핵산을 전달하기 위해 사용될 수 있는 조성물 및 방법이 많이 있다. 이들 방법 및 조성물은 크게는 2개의 클래스, 즉 바이러스 기재 전달 시스템과 비-바이러스 기재 전달 시스템으로 나누어질 수 있다. 예를 들어, 핵산은 많은 직접 전달 시스템, 예를 들어 전기천공, 리포펙션 (lipofection), 인산칼슘 침전, 플라스미드, 바이러스 벡터, 바이러스 핵산, 파지 핵산, 파지, 코스미드를 통하여, 또는 세포 또는 담체, 예를 들어 양이온성 리포좀 내의 유전자 물질의 전달을 통하여 전달될 수 있다. 형질감염에 대한 적절한 수단, 예를 들어 바이러스 벡터, 화학적 형질감염체, 또는 물리-기계적 방법, 예를 들어 전기천공 및 DNA의 적접 확산은 예를 들어 문헌 ([Wolff, J. A., et al., Science, 247, 1465-1468, (1990)]; 및 [Wolff, J. A. Nature, 352, 815-818, (1991)])에 설명되어 있다. 상기 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 본원에서 설명되는 조성물 및 방법에도 쉽게 적용될 수 있다. 특정 경우에, 방법은 큰 DNA 분자를 사용하여 특이적으로 기능하도록 변형될 것이다. 또한, 이들 방법은 담체의 표적화 특징을 사용함으로써 특정 질병 및 세포 집단을 표적화하는 데 사용될 수 있다.
i. 핵산 기재 전달 시스템
전달 벡터는 세포 (예를 들어, 플라스미드)에 유전자를 전달하기 위해 사용되는 임의의 뉴클레오티드 구성체이거나, 또는 유전자를 전달하기 위한 일반적인 전략의 일부, 예를 들어 재조합 레트로바이러스 또는 아데노바이러스의 일부일 수 있다 (Ram et al. Cancer Res. 53:83-88, (1993)).
본원에서 사용되는 플라스미드 또는 바이러스 벡터는 개시된 핵산, 예를 들어 PAX2 siRNA를 분해 없이 세포에 수송하는 물질이고, 그 내부로 전달되는 세포에서 유전자의 발현을 유도하는 프로모터를 포함한다. 일부 실시태양에서, 벡터는 바이러스 또는 레트로바이러스로부터 유도된다. 바이러스 벡터는 예를 들어 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스, 우두 바이러스, 폴리오 바이러스, AIDS 바이러스, 뉴런에 영향을 주는 바이러스, 신드비스 및 다른 RNA 바이러스, 및 HIV 골격을 갖는 상기 바이러스이다. 또한, 벡터로서 사용하기에 적합하게 만드는 상기 바이러스의 특성을 공유하는 임의의 바이러스 패밀리도 바람직하다. 레트로바이러스는 쥐 말로니 백혈병 바이러스, MMLV, 및 벡터로서 MMLV의 바람직한 특성을 발현하는 레트로바이러스를 포함한다. 레트로바이러스 벡터는 다른 바이러스 벡터보다 더 큰 하중 (payload)의 유전자, 즉 도입유전자 (transgene) 또는 마커 유전자를 운반할 수 있고, 이러한 이유로 통상적으로 사용되는 벡터이다. 그러나, 이들은 비-증식성 세포에서는 유용하지 못하다. 아데노바이러스 벡터는 비교적 안정하며, 활용하기가 용이하고, 고역가를 가지고 있고, 에어로졸 제형으로 전달될 수 있으며, 비-분열 세포를 형질감염시킬 수 있다. 수두 바이러스 벡터는 크고 유전자를 삽입하기 위한 여러 개의 부위를 가지며, 열에 안정하고 실온에서도 보관할 수 있다. 또한, 바람직한 실시태양은 바이러스 항원에 의해 유도된, 숙주 유기체의 면역 반응을 억제하도록 공학처리된 바이러스 벡터이다. 바람직한 벡터는 인터루킨 8 또는 10의 코딩 구역을 운반할 것이다.
바이러스 벡터는 유전자를 세포에 도입하기 위한 화학적 또는 물리적 방법보다 더 큰 상호작용 (유전자를 도입하는 능력) 능력을 가질 수 있다. 전형적으로, 바이러스 벡터는 비구조적 조기 유전자, 구조적 후기 유전자, RNA 중합효소 III 전사체, 복제 및 외피형성 (encapsidation)에 필요한 도립된 (inverted) 말단 반복 부위, 및 바이러스 게놈의 전사 및 복제를 제어하기 위한 프로모터를 함유한다. 벡터로서 공학처리될 때, 바이러스는 일반적으로 하나 이상의 조기 유전자가 제거되고, 유전자 또는 유전자/프로모터 카세트가 제거된 바이러스 DNA 대신에 바이러스 게놈 내에 삽입된다. 이 유형의 구성체는 약 8 kb의 외래 유전자 물질을 운반할 수 있다. 제거된 조기 유전자의 필요한 기능은 전형적으로 조기 유전자의 유전자 생성물을 트랜스로 (in trans) 발현하도록 공학처리된 세포주에 의해 공급된다.
a. 레트로바이러스 벡터
레트로바이러스는 임의의 종류, 서브패밀리, 속, 또는 향성 (tropism)을 포함하는, 레트로비리대 (Retroviridae)의 바이러스 패밀리에 속하는 동물 바이러스이다. 레트로바이러스 벡터는 일반적으로 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Verma, I.M., Retroviral vectors for gene transfer. In Microbiology-1985, American Society for Microbiology, pp. 229-232, Washington (1985)]에 기재되어 있다. 유전자 요법을 위해 레트로바이러스 벡터를 사용하는 방법의 예는 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 4,868,116 및 4,980,286; PCT 출원 WO 90/02806 및 WO 89/07136; 및 문헌 [Mulligan, Science 260:926-932 (1993)]에 기재되어 있다.
레트로바이러스는 본질적으로 그 안에 핵산 화물 (cargo)을 채워넣는 패키지이다. 핵산 화물은 복제된 딸분자가 패키지 코트 내에 효과적으로 패키지될 것을 보장하는 패키징 신호를 그와 함께 운반한다. 패키지 신호 외에, 레트로바이러스에는 복제 및 복제된 바이러스의 패키징을 위해 시스로 (in cis) 필요한 많은 분자가 있다. 전형적으로, 레트로바이러스 게놈은 단백질 코트의 제조에 관련되는 gag, pol, 및 env 유전자를 함유한다. 전형적으로 표적 세포에 전달되어야 하는 외래 DNA에 의해 대체되는 것은 바로 gag, pol, 및 env 유전자이다. 레트로바이러스 벡터는 전형적으로 패키지 코트 안에 통합하기 위한 패키징 신호, gag 전사 단위의 개시를 알려주는 서열, 역전사에 필요한 요소, 예를 들어 역전사의 tRNA 프라이머에 결합하기 위한 프라이머 결합 부위, DNA 합성 중에 RNA 가닥의 스위치를 안내하는 말단 반복 서열, DNA 합성시의 제2 가닥의 합성을 위한 프라이밍 부위로서 작용하는, 5'에서 3' 방향의 퓨린 풍부 서열 LTR, 및 숙주 게놈에 삽입하기 위하여 레트로바이러스의 DNA 상태의 삽입을 가능하게 하는 LTR의 단부들 근처의 특정 서열을 함유한다. gag, pol 및 env 유전자의 제거로 약 8 kb의 외래 서열이 바이러스 게놈 안에 삽입되고, 역전사가 이루어지며, 복제시 새로운 레트로바이러스 입자 안에 패키지되는 것이 가능해진다. 이러한 핵산의 양은 각 전사체의 크기에 따라 한 유전자 내지 많은 유전자를 전달하기에 충분하다. 삽입체 내에 다른 유전자와 함께 선택가능한 양성 또는 음성 마커를 포함하는 것이 바람직하다.
대부분의 레트로바이러스 벡터에서 복제 기구 및 패키징 단백질이 제거되었기 때문에 (gag, pol 및 env), 벡터는 전형적으로 그들을 패키징 세포주 내에 넣음으로써 생성된다. 패키징 세포주는 복제 및 패키징 기구를 함유하지만 어떠한 패키징 신호도 없는 레트로바이러스로 형질감염되거나 형질전환된 세포주이다. 선택된 DNA를 운반하는 벡터가 이들 세포주로 형질감염될 때, 관심있는 유전자를 함유하는 벡터는 헬퍼 세포에 의해 시스로 제공되는 기구에 의해 복제되고 새로운 레트로바이러스 입자로 패키지된다. 기구에 대해 게놈은 필요한 신호를 갖고 있지 않기 때문에 패키지되지 않는다.
b. 아데노바이러스 벡터
복제-결함 아데노바이러스의 제작은 문헌에 기재되어 있다 ([Berkner et al., J. Virology 61:1213-1220 (1987)]; [Massie et al., Mol. Cell. Biol. 6:2872-2883 (1986)]; [Haj-Ahmad et al., J. Virology 57:267-274 (1986)]; [Davidson et al., J. Virology 61:1226-1239 (1987)]; [Zhang "Generation and identification of recombinant adenovirus by liposome-mediated transfection and PCR analysis" BioTechniques 15:868-872 (1993)]). 이들 바이러스를 벡터로서 사용하는 이점은, 그것들이 초기 감염된 세포 내에서 복제할 수 있지만 새로운 감염성 바이러스 입자를 형성할 수는 없기 때문에, 다른 세포 종류에 확산될 수 있는 정도가 제한된다는 것이다. 재조합 아데노바이러스는 생체 내에서 기도 상피, 간세포, 혈관 내피, CNS 실질 및 많은 다른 조직 부위들에 직접 전달된 후에 높은 효율의 유전자 전달을 달성하는 것으로 밝혀졌다 ([Morsy, J. Clin. Invest. 92:1580-1586 (1993)]; [Kirshenbaum, J. Clin. Invest. 92:381-387 (1993)]; [Roessler, J. Clin. Invest. 92:1085-1092 (1993)]; [Moullier, Nature Genetics 4:154-159 (1993)]; [La Salle, Science 259:988-990 (1993)]; [Gomez-Foix, J. Biol. Chem. 267:25129-25134 (1992)]; [Rich, Human Gene Therapy 4:461-476 (1993)]; [Zabner, Nature Genetics 6:75-83 (1994)]; [Guzman, Circulation Research 73:1201-1207 (1993)]; [Bout, Human Gene Therapy 5:3-10 (1994)]; [Zabner, Cell 75:207-216 (1993)]; [Caillaud, Eur. J. Neuroscience 5:1287-1291 (1993)]; 및 [Ragot, J. Gen. Virology 74:501-507 (1993)]). 재조합 아데노바이러스는 특정 세포 표면 수용체에 결합한 후, 바이러스가 야생형 또는 복제-결함 아데노바이러스에서와 동일한 방식으로 수용체-매개 세포내이입 (endocytosis)에 의해 내재화됨으로써 유전자 형질도입을 달성한다 ([Chardonnet and Dales, Virology 40:462-477 (1970)]; [Brown and Burlingham, J. Virology 12:386-396 (1973)]; [Svensson and Persson, J. Virology 55:442-449 (1985)]; [Seth, et al., J. Virol. 51:650-655 (1984)]; [Seth, et al., Mol. Cell. Biol. 4:1528-1533 (1984)]; [Varga et al., J. Virology 65:6061-6070 (1991)]; [Wickham et al., Cell 73:309-319 (1993)]).
바이러스 벡터는 E1 유전자가 제거된 아데노바이러스를 기초로 한 것이며, 이들 비리온은 인간 293 세포주와 같은 세포주에서 생성된다. 다른 바람직한 실시태양에서, E1과 E3 유전자는 둘 다 아데노바이러스 게놈으로부터 제거된다.
c. 아데노 -연관 바이러스 벡터
바이러스 벡터의 다른 유형은 아데노-연관 바이러스 (AAV)를 기초로 한 것이다. 이 결함 파르보바이러스는 많은 세포 유형을 감염시킬 수 있고, 사람에게는 비병원성이기 때문에 바람직한 벡터이다. AAV 유형 벡터는 약 4 내지 5 kb를 수송할 수 있고, 야생형 AAV는 염색체 19 내로 안정적으로 삽입되는 것으로 알려져 있다. 상기 부위 특이적 통합 특성을 함유하는 벡터가 바람직하다. 상기 벡터 유형의 특히 바람직한 실시태양은 아비겐 (Avigen, 미국 캘리포니아주 샌프란시스코)에 의해 생산된, 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제 유전자, 즉 HSV-tk, 및/또는 마커 유전자, 예를 들어 초록 형광 단백질, GFP를 코딩하는 유전자를 함유할 수 있는 P4.1 C 벡터이다.
다른 유형의 AAV 바이러스에서, AAV는 이종성 유전자에 작동가능하게 연결된 세포-특이적 발현을 지시하는 프로모터를 함유하는 적어도 하나의 카세트가 인접하는 한 쌍의 도립된 말단 반복 부위 (ITR)를 함유한다. 이 맥락에서 이종성이라 함은 AAV 또는 B19 파르보바이러스에 고유하지 않은 임의의 뉴클레오티드 서열 또는 유전자를 의미한다.
전형적으로 AAV 및 B19 코딩 영역이 결실되었고, 그 결과 안전하고 비세포독성인 벡터가 얻어졌다. AAV ITR, 또는 그의 변형체는 감염성 및 부위-특이적 통합을 제공하지만, 세포독성이 없으며, 프로모터는 세포-특이적 발현을 지시한다. 미국 특허 6,261,834는 AAV 벡터에 관련된 물질에 대해 본원에 참고로 포함된다.
따라서, 개시된 벡터는 실질적인 독성 없이 포유동물 염색체 내에 통합될 수 있는 DNA 분자를 제공한다.
바이러스 및 레트로바이러스에 삽입된 유전자는 통상 요구되는 유전자 생성물의 발현 조절을 돕기 위하여 프로모터, 및/또는 인핸서를 함유한다. 프로모터는 일반적으로 전사 개시 부위와 관련하여 상대적으로 고정된 위치에 있을 때 기능하는 DNA의 서열 또는 서열들이다. 프로모터는 RNA 중합효소와 전사 인자의 기본적인 상호작용에 필요한 핵심 요소들을 함유하며, 상류 요소 및 반응 요소들을 함유할 수 있다.
d. 큰 하중 바이러스 벡터
큰 사람 헤르페스바이러스를 사용한 분자 유전 실험은 큰 이종성 DNA 단편을 헤르페스바이러스로 감염될 수 있는 세포에서 클로닝하고, 증식하고, 확립할 수 있는 방법을 제공하였다 ([Sun et al., Nature genetics 8: 33-41, 1994]; [Cotter and Robertson,. Curr Opin Mol. Ther 5: 633-644, 1999]). 상기 큰 DNA 바이러스 (단순 헤르페스바이러스 (HSV) 및 엡스타인-바 바이러스 (EBV))는 특정 세포에 대하여 150 kb 초과의 인간 이종성 DNA의 단편을 전달할 수 있다. EBV 재조합체는 감염된 B-세포에서 에피좀 DNA로서 DNA의 큰 조각을 유지할 수 있다. 개별적인 클론은 유전학상 안정한 것으로 보이는 330 kb 이하의 인간 게놈 삽입체를 운반하였다. 이들 에피좀의 유지는 EBV로 감염되는 동안 구성적으로 발현되는 특이적인 EBV 핵 단백질인 EBNA1을 필요로 한다. 추가로, 이들 벡터는 형질감염에 사용될 수 있는데, 다량의 단백질이 일시적으로 시험관 내에서 생성될 수 있다. 헤르페스바이러스 앰플리콘 시스템은 또한 220 kb 초과의 DNA 조각을 패키지하고, 에피좀으로서 DNA를 안정하게 유지할 수 있는 세포를 감염하기 위해 사용될 수 있다.
다른 유용한 시스템으로는 예를 들어 복제 및 숙주-제한된 비-복제 우두 바이러스 벡터를 들 수 있다.
ii . 비-핵산 기재 시스템
개시된 조성물은 다양한 방법으로 표적 세포에 전달될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 전기천공을 통해, 또는 리포펙션을 통해, 또는 인산칼슘 침전을 통해 전달될 수 있다. 선택되는 전달 메커니즘은 부분적으로는 표적이 되는 세포 유형 및 전달이 예를 들어 생체 내에서 일어나는지 또는 시험관 내에서 일어나는지에 따라 좌우될 것이다.
따라서, 조성물은 지질, 예를 들어 리포좀, 예를 들어 양이온성 리포좀 (예를 들어 DOTMA, DOPE, DC-콜레스테롤) 또는 음이온성 리포좀을 포함할 수 있다. 리포좀은 필요에 따라 특정 세포를 표적화하는 것을 용이하게 하는 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 화합물 및 양이온성 리포좀을 포함하는 조성물의 투여는 표적 장기에 구심성인 혈액에 투여되거나 호흡관의 세포를 표적화하기 위해 호흡관 안에 흡입될 수 있다. 리포좀에 대해서는 예를 들어 문헌 ([Brigham et al. Am. J. Resp. Cell. Mol. Biol. 1:95-100 (1989)]; [Feigner et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:7413-7417 (1987)]; 미국 특허 4,897,355호)을 참조한다. 또한, 화합물은 특정 세포 유형, 예를 들어 대식세포에 대해, 또는 화합물의 확산 또는 마이크로캡슐로부터 화합물의 전달이 특정 비율 또는 용량으로 디자인되는 경우 표적화될 수 있는 마이크로캡슐의 성분으로서 투여될 수 있다.
대상의 세포에 외인성 DNA를 투여하고 흡수시키는 것을 포함하는 상기 설명된 방법 (즉, 유전자 형질도입 또는 형질감염)에 있어서, 세포에 대한 조성물의 전달은 다양한 메커니즘을 통해 이루어질 수 있다. 한 실례로서, 전달은 상업적으로 이용가능한 리포좀 제제, 예를 들어 LIPOFECTIN, 리포펙타민 (깁코-비알엘, 인크.), SUPERFECT (퀴아겐, 인크) 및 TRANSFECTAM (프로메가 바이오텍, 인크.), 및 당업계의 표준 절차에 따라 개발된 다른 리포좀을 사용하여 리포좀을 통해 이루어질 수 있다. 또한, 개시된 핵산 또는 벡터는 생체 내에서 전기천공 (그에 대한 기술은 제네트로닉스, 인크. (Genetronics, Inc., 미국 캘리포니아주 샌디에고)로부터 이용가능함) 및 SONOPORATION 기기 (이막스 파마슈티칼 코퍼레이션 (ImaRx Pharmaceutical Corp., 미국 아리조나주 턱슨)에 의해 전달될 수 있다.
물질은 용액 또는 현탁액 (예를 들어 마이크로입자, 리포좀, 또는 세포에 혼입됨)으로 존재할 수 있다. 이들은 항체, 수용체, 또는 수용체 리간드를 통해 특정 세포 유형에 대해 표적화될 수 있다. 다음 참고문헌은 종양 조직에 특정 단백질을 표적화하기 위해 상기 기술을 사용한 예이다: [Senter, et al., Bioconjugate Chem., 2:447-451, (1991)]; [Bagshawe, K.D., Br. J. Cancer, 60:275-281, (1989)]; [Bagshawe, et al., Br. J. Cancer, 58:700-703, (1988)]; [Senter, et al., Bioconjugate Chem., 4:3-9, (1993)]; [Battelli, et al., Cancer Immunol. Immunother., 35:421-425, (1992)]; [Pietersz and McKenzie, Immunolog. Reviews, 129:57-80, (1992)]; 및 [Roffler, et al., Biochem. Pharmacol, 42:2062-2065, (1991)]. 상기 기술은 다양한 다른 세포 유형에 대해 사용될 수 있다: 비히클, 예를 들어 "스텔스 (stealth)" 및 다른 항체 컨쥬게이팅된 리포좀 (결장 암종에 대한 지질 매개 약물 표적화를 포함), 세포 특이적 리간드를 통한 DNA의 수용체 매개 표적화, 림프구 지시된 종양 표적화 및 생체 내에서 쥐의 신경아교종 세포의 고도로 특이적인 치료 목적의 레트로바이러스 표적화. 다음의 참고문헌은 종양 조직에 대해 특정 단백질을 표적화하기 위해 상기 기술을 사용한 예이다: [Hughes et al., Cancer Research, 49:6214-6220, (1989)]; 및 [Litzinger and Huang, Biochimica et Biophysica Acta, 1104:179-187, (1992)]. 일반적으로, 수용체는 구성적으로 또는 리간드 유도 방식으로 세포내이입 경로에 포함된다. 이들 수용체는 클라트린-코팅된 구멍에 모여 클라트린-코팅된 소포를 통해 세포 안으로 들어간 후, 그 안에서 수용체가 분류되는 산성화된 엔도좀을 통과한 다음, 세포 표면으로 재순환하여 세포 내에서 저장되거나, 또는 리소좀에서 분해된다. 내재화 경로는 다양한 기능을 나타내는데, 예를 들어 영양분 흡수, 활성화된 단백질의 제거, 거대분자의 제거, 바이러스 및 독소의 기회 유입, 리간드의 해리 및 분해, 및 수용체-수준의 조절들이다. 많은 수용체가 세포 유형, 수용체 농도, 리간드 유형, 리간드 원자가, 및 리간드 농도에 따라 두 가지 이상의 세포내 경로를 따른다. 수용체-매개 세포내이입의 분자 및 세포 메커니즘에 대해서는 문헌에 요약되어 있다 (Brown and Greene, DNA and Cell Biology 10:6, 399-409 (1991)).
숙주 세포 게놈에 통합될 세포에 전달되는 핵산은 전형적으로 통합 서열을 함유한다. 이들 서열은, 특히 바이러스 기재 시스템이 사용될 때 종종 바이러스 관련 서열이다. 이들 바이러스 통합 시스템은 또한 비-핵산 기재 전달 시스템, 예를 들어 리포좀을 사용하여 전달되는 핵산에 통합되어, 전달 시스템에 함유된 핵산이 숙주 게놈에 통합될 수 있다.
숙주 게놈에 통합하기 위한 다른 일반적인 기술로는 예를 들어 숙주 게놈과의 상동성 재조합을 촉진하기 위해 디자인된 시스템을 들 수 있다. 이들 시스템은 전형적으로 벡터 핵산과 표적 핵산 사이의 재조합이 일어나서 전달된 핵산이 숙주 게놈에 통합되는 것을 유발하는 숙주 세포 게놈 안에 있는 표적 서열과 충분히 상동성을 갖는 발현될 핵산에 인접한 서열에 의존한다. 이들 시스템 및 상동성 재조합을 촉진하기 위해 필요한 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
iii . 생체 내/생체 외
상기 설명된 바와 같이, 조성물은 제약상 허용되는 담체 내에서 투여될 수 있고, 당업계에 잘 알려져 있는 다양한 메커니즘 (예를 들어 네이키드 (naked) DNA의 흡수, 리포좀 융합, DNA의 유전자 총을 통한 근내 주사, 세포내이입 등)에 의해 생체 내에서 및/또는 생체 외에서 대상의 세포에 전달될 수 있다.
생체외 방법이 사용된다면, 세포 또는 조직은 당업계에 잘 알려져 있는 표준 프로토콜을 따라 제거되어 신체 밖에서 유지될 수 있다. 조성물은 임의의 유전자 전달 메커니즘, 예를 들어 인산칼슘 매개 유전자 전달, 전기천공, 마이크로주사 또는 프로테오리포좀을 통해 세포에 도입될 수 있다. 이어서, 형질도입된 세포는 주입되거나 (예를 들어 제약상 허용되는 담체를 통해) 또는 세포 또는 조직 유형에 대한 표준 방법에 따라 대상에게 다시 동위적으로 (homotopically) 이식될 수 있다. 대상에게 다양한 세포의 이식 또는 주입을 위한 표준 방법은 공지되어 있다.
7. 키트
상기 설명된 물질뿐만 아니라 다른 물질도 본원에 개시된 방법을 수행하거나 수행하는 것을 돕는데 유용한 키트로서 임의의 적합한 조합으로 함께 패키지될 수 있다. 주어진 키트 안의 키트 성분이 본 발명의 방법에 함께 사용하기 위해 디자인되고 채용된다면 그 키트는 유용하다. 예를 들어, 본원에는 전립선암 또는 PIN의 검출, 치료 또는 예방을 위한, PAX2 및 DEFB1에 특이적으로 결합하는 펩티드 또는 항체를 포함하는 키트가 개시된다.
8. 발현 시스템
세포에 전달되는 핵산은 전형적으로 발현 제어 시스템을 함유한다. 예를 들어, 바이러스 및 레트로바이러스 시스템에 삽입된 유전자는 통상 프로모터, 및/또는 원하는 유전자 생성물의 발현을 조절하는 것을 보조하기 위한 인핸서를 함유한다. 프로모터는 일반적으로 전사 개시 부위에 대하여 비교적 고정된 위치에 있을 때 기능하는 DNA의 서열 또는 서열들이다. 프로모터는 RNA 중합효소 및 전사 인자의 기본적인 상호작용에 필요한 핵심 요소들을 함유하고, 상류 요소와 반응 요소들을 함유할 수 있다.
i. 바이러스 프로모터 및 인핸서
포유동물 숙주 세포의 벡터로부터의 전사를 조절하는 바람직한 프로모터는 다양한 공급원, 예를 들어 폴리오마, 시미안 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 가장 바람직하게는 사이토메갈로바이러스와 같은 바이러스의 게놈으로부터, 또는 이종성 포유동물 프로모터, 예를 들어 베타 액틴 프로모터로부터 얻을 수 있다. SV40의 조기 및 후기 프로모터는 편리하게도 SV40 바이러스 복제 기점을 또한 함유하는 SV40 제한 단편으로서 얻어질 수 있다 (Fiers et al., Nature, 273: 113 (1978)). 인간 사이토메갈로바이러스의 최조기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 얻어진다 (Greenway, P.J. et al., Gene 18: 355-360 (1982)). 물론 숙주 세포 또는 관련 종으로부터의 프로모터도 본원에서 유용하다.
인핸서는 일반적으로 전사 개시 부위로부터 고정되지 않은 거리에서 기능하는 DNA의 서열이며, 전사 단위에 대해 5'이거나 (Laimins, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 993 (1981)) 또는 3' (Lusky, M.L., et al., Mol. Cell Bio. 3: 1108 (1983)) 일 수 있다. 또한, 인핸서는 인트론 안에 (Banerji, J.L. et al., Cell 33:729 (1983)) 있을 수 있을 뿐만 아니라 코딩 서열 자체 내에도 있을 수 있다 (Osborne, T.F., et al., Mol. Cell Bio. 4: 1293 (1984)). 이들은 통상 10 내지 300 bp의 길이이고, 시스로 기능한다. 인핸서는 프로모터 근처로부터 전사를 증가시키기 위하여 작용한다. 또한, 인핸서는 종종 전사 조절을 매개하는 반응 요소를 함유한다. 또한, 프로모터는 전사의 조절을 매개하는 반응 요소를 함유한다. 인핸서는 종종 유전자 발현의 조절을 결정한다. 많은 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린)로부터 알려져 있지만, 전형적으로 일반적인 발현을 위해서는 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 바람직한 예는 복제 기점 후기의 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 조기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 후기에 있는 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서이다.
프로모터 및/또는 인핸서는 빛 또는 그들의 기능을 촉발하는 특이적인 화학적 사건에 의해 특이적으로 활성화될 수 있다. 시스템은 테트라사이클린 및 덱사메타손과 같은 시약에 의해 조절될 수 있다. 또한, 방사선 조사, 예를 들어 감마선 조사, 또는 알킬화 화학요법 약물에 대한 노출에 의해 바이러스 벡터 유전자 발현을 향상시키는 방법도 있다.
특정 실시태양에서 프로모터 및/또는 인핸서 구역은 전사될 전사 단위의 구역의 발현을 최대화하기 위하여 구성적 프로모터 및/또는 인핸서로서 작용할 수 있다. 특정 구성체에서 프로모터 및/또는 인핸서 구역은 특정 시간에 특정 유형의 세포에서만 발현될지라도 모든 진핵세포 유형에서 활성을 갖는다. 이런 유형의 바람직한 프로모터는 CMV 프로모터 (650개 염기)이다. 다른 바람직한 프로모터는 SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 (전장 프로모터), 및 레트로바이러스 벡터 LTR이다.
모든 특이한 조절 요소는 클로닝될 수 있으며, 흑색종 세포와 같은 특이한 세포 유형에서 선택적으로 발현되는 발현 벡터를 구성하기 위해 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 아교 섬유성 산성 단백질 (GFAP) 프로모터가 아교 기원의 세포에서 유전자를 선택적으로 발현하기 위해 사용되어 왔다.
진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 포유동물, 사람 또는 유핵 (nucleated) 세포)에서 사용된 발현 벡터는 또한 mRNA 발현에 영향을 줄 수 있는 전사의 종결에 필요한 서열을 함유할 수 있다. 이들 영역은 조직 인자 단백질을 코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화된 절편으로서 전사된다. 3' 비번역 구역은 또한 전사 종료 부위를 포함한다. 전사 단위는 또한 폴리아데닐화 구역을 함유하는 것이 바람직하다. 상기 구역의 한 가지 잇점은 전사된 단위가 mRNA처럼 처리되고 수송될 가능성을 증가시킨다는 것이다. 폴리아데닐화 신호의 발현 구성체에서의 확인 및 사용에 대해서는 잘 정립되어 있다. 상동성 폴리아데닐화 신호는 도입유전자 구성체에서 사용되는 것이 바람직하다. 특정 전사 단위에서는, 폴리아데닐화 구역이 SV40 조기 폴리아데닐화 신호로부터 유도되고 약 400개의 염기로 구성된다. 전사된 단위는 다른 표준 서열을 단독으로 또는 구성체로부터의 발현을 개선하거나 구성체의 안정성을 개선하는 상기의 서열과 조합하여 함유하는 것이 바람직하다.
ii . 마커
바이러스 벡터는 마커 생성물을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이 마커 생성물은 유전자가 세포에 전달되었고 일단 전달되면 발현되는 지를 측정하기 위해 사용된다. 마커 유전자의 예로는 β-갈락토시다제를 코딩하는 이. 콜라이 lacZ 유전자, 및 녹색 형광 단백질을 들 수 있다.
일부 실시태양에서, 마커는 선택가능한 마커일 수 있다. 포유동물 세포에 대해 적합한 선택가능한 마커의 예는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR), 티미딘 키나제, 네오마이신, 네오마이신 유사체 G418, 히드로마이신, 및 푸로마이신을 포함한다. 상기 선택가능한 마커가 성공적으로 포유동물 숙주 세포에 전달될 때, 형질전환된 포유동물 숙주 세포는 선택적 압력 하에서 생존할 수 있다. 선택 방식에 대해 광범위하게 사용되는 구분되는 2개의 카테고리가 있다. 제1 카테고리는 세포의 대사작용 및 보충된 배지와 무관하게 성장할 수 있는 능력이 결핍된 돌연변이 세포주의 사용을 기초로 한다. 여기에는 두 예가 존재한다: CHO DHFR-세포 및 마우스 LTK-세포. 이들 세포는 티미딘 또는 하이포잔틴과 같은 영양분이 참가되지 않으면 성장할 수 있는 능력이 없다. 이들 세포는 완전한 뉴클레오티드 합성 경로에 필요한 특정 유전자들이 없기 때문에, 빠져있는 뉴클레오티드가 보충된 배지에 제공되지 않으면 생존할 수 없다. 배지를 보충하는 것을 대체하는 방법은 무손상 DHFR 또는 TK 유전자를 각각의 유전자가 없는 세포에 도입함으로써, 그의 성장 요건을 변경시키는 것이다. DHFR 또는 TK 유전자로 형질전환되지 않은 각 세포들은 비-보충 배지에서 생존할 수 없을 것이다.
제2 카테고리는 임의의 세포 유형에서도 사용되고 돌연변이 세포주를 사용할 필요가 없는 선택 계획을 의미하는 우성 선택이다. 이들 계획은 전형적으로 숙주 세포의 성장을 정지시키기 위한 약물을 사용한다. 신규한 유전자를 갖는 세포는 단백질 수송 약물 내성을 발현할 것이고, 선택에도 생존할 것이다. 그러한 우성 선택의 예는 약물 네오마이신을 사용하거나 (Southern P. and Berg, P., J. Molec. Appl. Genet. 1:327 (1982)), 미코페놀산을 사용하거나 (Mulligan, R.C. and Berg, P. Science 209: 1422 (1980)), 또는 하이그로마이신을 사용한다 (Sugden, B. et al., Mol. Cell. Biol. 5: 410-413 (1985)). 상기 세 가지 예는 적절한 약물 G418 또는 네오마이신 (제네티신), xgpt (미코페놀산) 또는 히그로마이신 각각에 대한 내성을 수송하기 위해 진핵세포 제어 하에 세균 유전자를 사용한다. 다른 것으로는 네오마이신 유사체 G418 및 푸라마이신이 있다.
9. 제약학적 담체
개시된 조성물은 제약상 허용되는 담체와 조합되어 치료 목적으로 사용될 수 있다. "제약상 허용되는"은 생물학적이 아니거나 그렇지 않으면 바람직하지 않은 물질을 의미한다. 즉, 물질은 대상에게 핵산 또는 벡터와 함께, 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 유발하거나 그것이 함유된 제약 조성물의 임의의 다른 성분들과 해로운 방식으로 상호작용하지 않으면서 대상에게 투여될 수 있다. 담체는 당업자에게 잘 알려져 있는 바와 같이, 활성 성분의 임의의 분해를 최소화하고 대상에서 임의의 해로운 부작용이라도 최소화하기 위해 선택될 것이다.
적당한 담체 및 그의 제형에 대해서 문헌에 설명되어 있다 (Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19th ed.) ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995). 전형적으로 적절한 양의 제약상 허용되는 염이 제형을 등장성이 되도록 하기 위해 제형에 사용된다. 제약상 허용되는 담체의 예는 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 용액의 pH는 바람직하게는 약 5 내지 약 8, 보다 바람직하게는 약 7 내지 약 7.5이다. 또한, 담체는 지속 방출 제제, 예를 들어 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하는데, 그러한 매트릭스는 성형품 (shaped article)의 형태, 예를 들어 필름, 리포좀 또는 마이크로입자들이다. 당업자는 특정 담체가 예를 들어 투여 경로 및 투여되는 조성물의 농도에 따라 더 바람직할 수 있음을 명백하게 알 것이다.
제약학적 담체는 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 가장 일반적으로는 인간에게 약물을 투여하기 위한 표준 담체, 예를 들어 멸균수, 염수, 및 생리학적 pH에서 완충된 용액과 같은 용액일 것이다. 조성물은 근육 내로 또는 피하로 투여될 수 있다. 다른 화합물들은 당업자에 의해 사용되는 표준 절차에 따라 투여될 것이다.
제약 조성물은 선택된 분자에 추가하여 담체, 농축제, 희석제, 완충제, 보존제, 표면 활성제 등을 포함할 수 있다. 제약 조성물은 또한 하나 이상의 활성 성분, 예를 들어 항미생물 제제, 소염제, 진통제 등을 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제는 멸균 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액, 및 에멀션을 포함한다. 비-수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물유, 예를 들어 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트를 포함한다. 수성 담체는 물, 알콜성/수성 용액, 에멀션 또는 현탁액, 예를 들어 염수 및 완충된 배지를 포함한다. 비경구용 비히클로는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이트화된 링거액, 또는 고정된 오일을 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양분 보충제, 전해질 보충제 (예를 들어 링거 덱스트로스를 기재로 한 것들) 등을 포함한다. 보존제 및 다른 첨가제, 예를 들어 항미생물제, 항산화제, 킬레이팅제, 및 불활성 가스 등이 또한 존재할 수 있다.
국소 투여를 위한 제형은 연고, 로션, 크림, 겔, 점적액, 좌제, 스프레이, 액체 및 분말을 포함할 수 있다. 종래의 제약학적 담체, 수성, 분말 또는 유성 베이스, 농축제 등은 필요하거나 바람직할 수 있다.
경구 투여를 위한 조성물은 분말 또는 과립, 물 또는 비-수성 매질 중의 현탁액 또는 용액, 캡슐, 향낭, 또는 정제를 포함한다. 농축제, 풍미제, 희석제, 유화제, 분산 보조제 또는 결합제가 바람직할 수 있다.
일부 조성물은 잠재적으로 무기산, 예를 들어 염산, 브롬화수소산, 과염소산, 질산, 티오시안산, 황산, 및 인산, 및 유기산, 예를 들어 포름산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 옥살산, 말론산, 숙신산, 말레산, 및 푸마르산과의 반응에 의해, 또는 무기 염기, 예를 들어 수산화나트륨, 수산화암모늄, 수산화칼륨, 및 유기 염기, 예를 들어 모노-, 디-, 트리알킬 및 아릴 아민과 치환된 에탄올아민과의 반응에 의해 형성된 제약상 허용되는 산- 또는 염기-부가 염으로서 투여될 수 있다.
물질은 용액 또는 현탁액 (예를 들어 마이크로입자, 리포좀, 또는 세포에 혼입됨)으로 존재할 수 있다. 이들은 항체, 수용체, 또는 수용체 리간드를 통해 특정 세포 유형에 대해 표적화될 수 있다. 다음 참고문헌은 종양 조직에 특정 단백질을 표적화하기 위해 상기 기술을 사용한 예이다: [Senter, et al., Bioconjugate Chem., 2:447-451, (1991)]; [Bagshawe, K.D., Br. J. Cancer, 60:275-281, (1989)]; [Bagshawe, et al., Br. J. Cancer, 58:700-703, (1988)]; [Senter, et al., Bioconjugate Chem., 4:3-9, (1993)]; [Battelli, et al., Cancer Immunol. Immunother., 35:421-425, (1992)]; [Pietersz and McKenzie, Immunolog. Reviews, 129:57-80, (1992)]; 및 [Roffler, et al., Biochem. Pharmacol, 42:2062-2065, (1991)]: 비히클, 예를 들어 "스텔스 (stealth)" 및 다른 항체 컨쥬게이팅된 리포좀 (결장 암종에 대한 지질 매개 약물 표적화를 포함), 세포 특이적 리간드를 통한 DNA의 수용체 매개 표적화, 림프구 지시된 종양 표적화 및 생체 내에서 쥐의 신경아교종 세포의 고도로 특이적인 치료 목적의 레트로바이러스 표적화. 다음 참고문헌은 종양 조직에 대해 특정 단백질을 표적화하기 위해 상기 기술을 사용한 실례들이다: [Hughes et al., Cancer Research, 49:6214-6220, (1989)]; 및 [Litzinger and Huang, Biochimica et Biophysica Acta, 1104:179-187, (1992)]. 일반적으로, 수용체는 구성적으로 또는 리간드 유도 방식으로 세포내이입 경로에 포함된다. 이들 수용체는 클라트린-코팅된 구멍에 모여 클라트린-코팅된 소포를 통해 세포 안으로 들어간 후, 그 안에서 수용체가 분류되는 산성화된 엔도좀을 통과한 다음, 세포 표면으로 재순환하여 세포 내에서 저장되거나, 또는 리소좀에서 분해된다. 내재화 경로는 다양한 기능을 나타내는데, 예를 들어 영양분 흡수, 활성화된 단백질의 제거, 거대분자의 제거, 바이러스 및 독소의 기회 유입, 리간드의 해리 및 분해, 및 수용체-수준의 조절들이다. 많은 수용체가 세포 유형, 수용체 농도, 리간드 유형, 리간드 원자가, 및 리간드 농도에 따라 두 가지 이상의 세포내 경로를 따른다. 수용체-매개 세포내이입의 분자 및 세포 메커니즘에 대해서는 문헌에 요약되어 있다 (Brown and Greene, DNA and Cell Biology 10:6, 399-409 (1991)).
10. 조합 화학
개시된 조성물은 요구되는 방식으로 개시된 조성물과 상호작용하는 분자 또는 거대분자성 분자를 확인하기 위해 임의의 조합 기술의 표적으로서 사용될 수 있다. 또한, PAX2 서열 또는 그의 일부 (예를 들어, PAX2 DNA-결합 도메인)로서 개시된 조성물이 조합 또는 스크리닝 프로토콜에서 표적으로서 사용되는 조합 기술 또는 스크리닝 기술을 통해 확인된 조성물이 개시된다.
조합 기술 또는 스크리닝 방법에 개시된 조성물을 사용할 때, 표적 분자의 기능의 억제 또는 자극과 같은 특히 요구되는 특성을 갖는 분자, 예를 들어 거대분자성 분자가 확인될 것으로 이해된다. 개시된 조성물을 사용하여 확인되고 단리된 분자, 예를 들어, DEFB1 또는 PAX2도 개시된다. 따라서, 개시된 조성물을 이용하는 조합 또는 스크리닝 방법을 사용하여 생산된 생성물도 본원에 개시된 것으로 간주된다.
예를 들어, DEFB1 프로모터와 PAX2 사이의 상호작용을 억제하는 분자를 확인하기 위한 개시된 방법은 고속 처리 수단을 사용하여 수행될 수 있음이 이해된다. 예를 들어, 추정 억제제는 상호작용을 신속하게 확인하기 위해 형광 공명 에너지 전이 (FRET)를 사용하여 확인될 수 있다. 기술의 기반이 되는 이론은 2개의 분자가 공간 상에서 근접할 때, 즉 배경을 초과하는 수준에서 상호작용할 때, 신호가 생성되거나 또는 신호가 소멸될 수 있다는 것이다. 이어서, 예를 들어 추정 억제제의 첨가를 포함하여 다양한 실험이 수행될 수 있다. 억제제가 2개의 신호 전달 분자들 사이의 상호작용과 경쟁하면, 신호가 공간에서 서로로부터 제거될 것이고, 이것은 사용된 신호의 종류에 따라 신호의 감소 또는 증가를 야기한다. 상기 신호의 감소 또는 증가는 추정 억제제의 존재 또는 부재와 상호 관련될 수 있다. 임의의 신호 전달 수단을 사용할 수 있다. 예를 들어, 임의의 2개의 개시된 분자 사이의 상호작용의 억제제를 확인하는 방법이 개시되고, 이 방법은 추정 억제제의 존재 하에 제1 분자 및 제2 분자를 함께 접촉시키고, 여기서 제1 분자 또는 제2 분자는 형광 공여자를 포함하고, 일반적으로 공여자를 포함하지 않는 제1 또는 제2 분자는 형광 수용자를 포함하고; 추정 억제제의 존재 하에 및 추정 억제제의 부재 하에 형광 공명 에너지 전이 (FRET)를 측정하는 것을 포함하고, 여기서 그의 부재 하에서의 FRET 측정치에 비해 추정 억제제의 존재 하에서의 FRET의 감소는, 추정 억제제가 2개의 분자 사이의 결합을 억제함을 나타낸다. 상기 유형의 방법은 세포 시스템을 사용하여 수행될 수도 있다.
조합 화학은 일반적으로 반복적인 공정으로 소분자 또는 다른 거대분자에 결합할 수 있는 소분자 또는 거대분자를 단리하기 위한 모든 방법을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 단백질, 올리고뉴클레오티드 및 당이 거대분자의 예이다. 예를 들어, 제시된 기능, 촉매 활성 또는 리간드-결합능을 갖는 올리고뉴클레오티드 분자는 "시험관내 유전학 (in vitro genetics)" (Szostak, TIBS 19:89, 1992)으로 언급되는 방식으로 랜덤 올리고뉴클레오티드의 복잡한 혼합물로부터 단리될 수 있다. 랜덤 및 규정된 서열을 함유하는 큰 풀의 분자를 합성하고, 복잡한 혼합물, 예를 들어 100 ㎍의 100개 뉴클레오티드의 RNA 중의 약 1015개의 개별적인 서열을 몇몇 선택 및 농축 과정에 적용할 수 있다. 컬럼 상의 리간드에 결합된 분자의 친화도 크로마토그래피 및 PCR 증폭의 반복된 사이클을 통해, 엘링톤 등 (Ellington and Szostak (1990))은 소분자에 결합하는 방식으로 폴딩된 1010 RNA 분자 중의 하나가 염색된 것으로 추정하였다. 상기 리간드-결합 거동을 보이는 DNA 분자도 단리되었다 ([Ellington and Szostak, 1992]; [Bock et al, 1992]). 유사한 목적을 위한 기술이 작은 유기 분자, 단백질, 항체 및 당업자에게 공지된 다른 거대분자에 대해 존재한다. 작은 유기 라이브러리, 올리고뉴클레오티드, 또는 항체를 기초로 하여 요구되는 활성에 대한 분자의 스크리닝 세트가 대체로 조합 화학으로 언급된다. 조합 기술은 분자들 사이의 결합 상호작용을 규정하기 위해 및 거대분자가 핵산일 때 종종 앱타머로 불리는, 특이적 결합 활성을 갖는 분자를 단리하기 위해 특히 적합하다.
드 노보 활성 또는 변형된 활성을 갖는 단백질을 단리하기 위한 많은 방법이 존재한다. 예를 들어, 특이적인 표적과 상호작용하는 수많은 펩티드를 단리하기 위해 파지 디스플레이 라이브러리가 사용되었다 (예를 들어, 파지 디스플레이에 관련된 물질 및 조합 화학에 관련된 방법에 대해 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 6,031,071; 5,824,520; 5,596,079; 및 5,565,332 참조).
제시된 기능을 갖는 단백질을 단리하기 위한 바람직한 방법은 문헌에 기재되어 있다 (Roberts R. W. and Szostak J. W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94(23)12997-302 (1997). 상기 조합 화학 방법은 단백질의 기능적인 능력과 핵산의 유전적 능력을 연결시킨다. 푸로마이신 분자가 RNA 분자의 3'-말단에 공유 부착된 RNA 분자가 생성된다. 상기 변형된 RNA 분자의 시험관내 번역은 RNA에 의해 코딩되는 정확한 단백질이 번역되도록 한다. 또한, 연장될 수 없는 펩티딜 수용자인 푸로마이신의 부착 때문에, 성장하는 펩티드 사슬은 RNA에 부착된 푸로마이신에 부착된다. 따라서, 단백질 분자는 그를 코딩하는 유전 물질에 부착된다. 현재 기능적 펩티드를 단리하기 위해 통상적인 시험관내 선택 절차를 수행할 수 있다. 펩티드 기능에 대한 선택 절차가 완료된 후, 선택된 기능적 펩티드를 코딩하는 핵산을 증폭하기 위해 전통적인 핵산 처리 절차를 수행된다. 유전 물질의 증폭 후에, 푸로마이신이 3'-말단에 존재하는 새로운 RNA가 전사되고, 새로운 펩티드가 번역되고, 다른 기능적 라운드의 선택이 수행된다. 따라서, 단백질 선택은 핵산 선택 기술처럼 반복적인 방식으로 수행될 수 있다. 번역된 펩티드는 푸로마이신에 부착된 RNA의 서열에 의해 제어된다. 상기 서열은 최적 번역을 위해 공학처리된 (즉, 정지 코돈 미함유 등) 랜덤 서열로부터의 임의의 서열일 수 있거나 또는 공지의 펩티드의 개선된 또는 변경된 기능을 찾기 위해 공지의 RNA 분자의 다의성 (degenerate) 서열일 수 있다. 핵산 증폭 및 시험관내 번역 조건은 당업자에게 잘 알려져 있고, 바람직하게는 문헌 [Roberts R. W. and Szostak J.W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94(23)12997-302 (1997)]에 기재된 바와 같이 수행된다.
펩티드를 단리하기 위해 설계된 조합 방법의 다른 바람직한 방법은 문헌 [Cohen B.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(24):14272-7 (1998)]에 기재되어 있다. 상기 방법은 2-하이브리드 기술을 이용하여 변형시킨 것이다. 효모 2-하이브리드 시스템은 단백질:단백질 상호작용의 검출 및 분석에 유용하다. 효모 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)에서 처음으로 설명된 2-하이브리드 시스템이 관심있는 단백질에 특이적인 새로운 조절 분자를 확인하기 위한 강력한 분자 유전학 기술이다 (Fields and Song, Nature 340:245-6 (1989)). 코헨 (Cohen) 등은 선택되는 분자에 결합하는 합성 또는 공학처리된 펩티드 서열 사이의 신규한 상호작용이 확인될 수 있도록 상기 기술을 변형하였다. 상기 유형의 기술의 잇점은 선택이 세포내 환경에서 수행된다는 점이다. 이 방법은 산성 활성화 도메인에 부착된 펩티드 분자의 라이브러리를 이용한다.
다양한 조합 라이브러리와 함께, 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 요구되는 표적에 결합하거나 상호작용하는 소분자 또는 거대분자를 단리하고 특성화할 수 있다. 당업자에게 잘 알려진 경쟁적 결합 연구를 사용하여 상기 화합물의 상대적인 결합 친화도를 비교하고, 최적 화합물을 확인할 수 있다.
조합 라이브러리의 제조 기술 및 요구되는 표적에 결합하는 분자를 단리하기 위한 조합 라이브러리의 스크리닝은 당업자에게 잘 알려져 있다. 대표적인 기술 및 방법은 미국 특허 5,084,824, 5,288,514, 5,449,754, 5,506,337, 5,539,083, 5,545,568, 5,556,762, 5,565,324, 5,565,332, 5,573,905, 5,618,825, 5,619,680, 5,627,210, 5,646,285, 5,663,046, 5,670,326, 5,677,195, 5,683,899, 5,688,696, 5,688,997, 5,698,685, 5,712,146, 5,721,099, 5,723,598, 5,741,713, 5,792,431, 5,807,683, 5,807,754, 5,821,130, 5,831,014, 5,834,195, 5,834,318, 5,834,588, 5,840,500, 5,847,150, 5,856,107, 5,856,496, 5,859,190, 5,864,010, 5,874,443, 5,877,214, 5,880,972, 5,886,126, 5,886,127, 5,891,737, 5,916,899, 5,919,955, 5,925,527, 5,939,268, 5,942,387, 5,945,070, 5,948,696, 5,958,702, 5,958,792, 5,962,337, 5,965,719, 5,972,719, 5,976,894, 5,980,704, 5,985,356, 5,999,086, 6,001,579, 6,004,617, 6,008,321, 6,017,768, 6,025,371, 6,030,917, 6,040,193, 6,045,671, 6,045,755, 6,060,596, 및 6,061,636에서 볼 수 있고, 이로 제한되지 않는다.
조합 라이브러리는 많은 상이한 합성 기술을 사용하여 광범위한 분자로부터 제조할 수 있다. 예를 들어, 융합된 2,4-피리미딘디온 (미국 특허 6,025,371), 디히드로벤조피란 (미국 특허 6,017,768 및 5,821,130), 아미드 알콜 (미국 특허 5,976,894), 히드록시-아미노산 아미드 (미국 특허 5,972,719), 탄수화물 (미국 특허 5,965,719), 1,4-벤조디아제핀-2,5-디온 (미국 특허 5,962,337), 시클릭 화합물 (미국 특허 5,958,792), 바이아릴 아미노산 아미드 (미국 특허 5,948,696), 티오펜 (미국 특허 5,942,387), 트리시클릭 테트라히드로퀴놀린 (미국 특허 5,925,527), 벤조푸란 (미국 특허 5,919,955), 이소퀴놀린 (미국 특허 5,916,899), 히단토인 및 티오히단토인 (미국 특허 5,859,190), 인돌 (미국 특허 5,856,496), 이미다졸-피리도-인돌 및 이미다졸-피리도-벤조티오펜 (미국 특허 5,856,107), 치환된 2-메틸렌-2,3-디히드로티아졸 (미국 특허 5,847,150), 퀴놀린 (미국 특허 5,840,500), PNA (미국 특허 5,831,014), 태그 (미국 특허 5,721,099), 폴리케티드 (미국 특허 5,712,146), 모르폴리노-서브유닛 (미국 특허 5,698,685 및 5,506,337), 술파미드 (미국 특허 5,618,825), 및 벤조디아제핀 (미국 특허 5,288,514)을 함유하는 라이브러리가 존재한다.
DEFB1 발현의 PAX2 억제의 억제에 대해 개시된 siRNA 분자와 유사한 분자를 스크리닝하는 것은 요구되는 화합물을 단리하는 방법이다.
단리된 분자는 경쟁적 억제제 또는 비-경쟁적 억제제일 수 있다.
또다른 실시태양에서, 억제제는 비-경쟁적 억제제이다. 비-경쟁적 억제제의 한 종류는 알로스테릭 (allosteric) 재배열을 유도할 것이다.
본원에서 사용될 때, 조합 방법 및 라이브러리는 전통적인 스크리닝 방법 및 라이브러리뿐만 아니라 반복적인 과정에 사용되는 방법 및 라이브러리를 포함하였다.
11. 컴퓨터 이용 약물 설계
개시된 조성물은 개시된 조성물의 구조를 확인하거나 또는 요구되는 방식으로 개시된 조성물과 상호작용하는 잠재적인 또는 실재하는 분자, 예를 들어 소분자를 확인하기 위한 임의의 분자 모델링 기술의 표적으로서 사용될 수 있다. 핵산, 펩티드, 및 본원에 개시된 관련 분자는 임의의 분자 모델링 프로그램 또는 방법에서 표적으로서 사용될 수 있다.
개시된 조성물을 모델링 기술에 사용할 때, 특정한 요구되는 특성, 예를 들어 표적 분자 기능의 억제 또는 자극능을 갖는 분자, 예를 들어 거대분자성 분자가 확인될 것으로 이해된다. 개시된 조성물, 예를 들어, 서열 1을 사용하여 확인되고 단리된 분자도 개시된다. 따라서, 개시된 조성물, 예를 들어, 서열 1을 포함하는 분자 모델링 방법을 이용하여 생산된 생성물도 본원에 개시된 것으로 간주된다.
따라서, 선택되는 분자에 결합하는 분자를 단리하는 한 방법은 합리적인 설계를 통해 수행된다. 이것은 구조 정보 및 컴퓨터 모델링을 통해 이루어진다. 컴퓨터 모델링 기술을 통해, 선택된 분자의 3차원 원자 구조를 가시화하고, 분자와 상호작용하는 새로운 화합물을 합리적으로 설계할 수 있다. 3차원 구성체는 일반적으로 선택된 분자의 x-선 결정 분석 또는 NMR 영상화로부터의 데이타에 의해 결정된다. 분자 동역학은 역장 데이타를 필요로 한다. 컴퓨터 그래픽 시스템은 새로운 화합물이 표적 분자에 연결되는 방식의 예측을 가능하게 하고, 결합 특이성을 완전하게 하기 위해 화합물과 표적 분자의 구조를 실험을 통해 처리할 수 있도록 한다. 분자 및 화합물 중의 어느 하나 또는 둘 모두에 작은 변화가 존재할 때 분자-화합물 상호작용이 어떻게 되는지를 예측하기 위해서는, 대체로 분자 설계 프로그램과 사용자 사이의 사용자에게 편리한 메뉴 기반 인터페이스 (menu-driven interface)와 커플링된 분자 역학 소프트웨어 및 연산집약적 (computationally intensive) 컴퓨터가 필요하다.
분자 모델링 시스템의 예는 CHARMm 및 QUANTA 프로그램 (폴리겐 코퍼레이션 (Polygen Corporation, 미국 매사추세츠주 월담))이다. CHARMm은 에너지 최소화 및 분자 동역학 기능을 수행한다. QUANTA는 분자 구조의 제작, 그래픽 모델링 및 분석을 수행한다. QUANTA는 분자의 상호작용성 제작, 변형, 가시화, 및 분자의 서로에 대한 거동의 분석을 가능하게 한다.
많은 문헌에서 특정 단백질과 상호작용성인 약물에 대한 컴퓨터 모델링을 검토한 바 있다 (예를 들어 [Rotivinen, et al., 1988 Acta Pharmaceutica Fennica 97, 159-166]; [Ripka, New Scientist 54-57 (June 16, 1988)]; [McKinaly and Rossmann, 1989 Annu. Rev. Pharmacol. Toxiciol. 29, 111-122]; [Perry and Davies, QSAR: Quantitative Structure-Activity Relationships in Drug Design pp. 189-193 (Alan R. Liss, Inc. 1989)]; [Lewis and Dean, 1989 Proc. R. Soc. Lond. 236, 125-140 and 141-162]; 및 핵산 성분에 대한 효소의 모델링에 대해서는 [Askew, et al., 1989 J. Am. Chem. Soc. 111, 1082-1090] 참조). 화학적 물질을 스크리닝하고 그림으로 도시하는 다른 컴퓨터 프로그램은 바이오디자인, 인크. (BioDesign, Inc., 미국 캘리포니아주 파사데나), 알레릭스, 인크. (Allelix, Inc., 캐나다 온타리오주 미시사우가) 및 하이퍼큐브, 인크. (Hypercube, Inc., 캐나다 온타리오주 캠브릿지)와 같은 회사로부터 이용가능하다. 이들은 주로 특정 단백질에 특이적인 약물에 적용하기 위해 설계되지만, DNA 또는 RNA의 특정 구역이 확인된 후에 이들 구역과 특이적으로 상호작용하는 분자의 설계에 적용될 수 있다.
결합을 변경시킬 수 있는 화합물의 설계 및 생성에 대해 상기 설명하였지만, 공지의 화합물, 예를 들어 천연 생성물 또는 합성 화학물질, 및 생물학적 활성 물질, 예를 들어 단백질의 라이브러리를 기질 결합 또는 효소적 활성을 변경시키는 화합물에 대해 스크리닝할 수 있다.
12. 컴퓨터 판독 매체
개시된 핵산 및 단백질이 아미노산의 뉴클레오티드로 구성된 서열로 제시될 수 있음이 이해된다. 이들 서열을 디스플레이하기 위한 다양한 방식이 존재한다. 예를 들어, 뉴클레오티드 구아노신은 G 또는 g로 제시될 수 있다. 마찬가지로, 아미노산 발린은 Val 또는 V로 제시될 수 있다. 당업자는 각각 본원에 개시된 것으로 간주되는 기존의 방식의 임의의 변형 방법으로 임의의 핵산 또는 단백질 서열을 디스플레이하고 표현하는 방법을 이해할 것이다. 컴퓨터 판독 매체, 예를 들어, 상업적으로 이용가능한 플로피 디스크, 테이프, 칩, 하드 드라이브, 컴팩트 디스크, 및 비데오 디스크, 또는 다른 컴퓨터 판독 매체 상의 상기 서열의 디스플레이가 본원에서 구체적으로 고려된다. 또한, 개시된 서열의 2원 코드 표시도 개시된다. 당업자는 어떠한 컴퓨터 판독 매체를 사용할 것인지를 이해할 것이다. 따라서, 핵산 또는 단백질 서열이 기록되고, 보관되거나 저장되는 컴퓨터 판독 매체를 선택할 수 있다.
본원에서 제시된 서열 및 서열에 대한 정보를 포함하는 컴퓨터 판독 매체가 개시된다. 또한, 서열 및 제시된 서열에 대한 정보를 포함하는 컴퓨터 판독 매체도 개시된다.
C. 방법
1. 투여
본원에 개시된 조성물은 국소 또는 전신 치료가 요구되는지에 따라, 및 치료되는 영역에 따라 많은 방식으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 경구로, 비경구로 (예를 들어, 정맥내, 피하, 복강내, 또는 근내 주사), 흡입에 의해, 체외 (extracorporeally), 국소 (경피, 눈, 질, 직장, 비내 투여 포함) 등으로 투여될 수 있다.
본원에서 사용되는 "국소 비내 투여"는 조성물을 한쪽 또는 양쪽 콧구멍을 통해 코 및 비강 내로 전달하는 것을 의미하며, 분무 메커니즘 또는 비말 (droplet) 메커니즘에 의해, 또는 핵산 또는 벡터의 에어로졸화를 통한 전달을 포함할 수 있다. 흡입제에 의한 조성물의 투여는 분무 또는 비말 메카니즘에 의한 전달에 의해 코 또는 입을 통해 이루어질 수 있다. 전달은 또한 삽관법을 통하여 호흡계 (예를 들어, 폐)의 임의의 영역에 직접적으로 이루어질 수 있다.
조성물의 비경구 투여는, 사용되는 경우 일반적으로 주사에 의하여 이루어지는 것을 특징으로 한다. 주사가능한 것은 통상적인 형태로, 액체 용액 또는 현탁액으로서, 주사 전에 액체 중의 현탁 용액에 적당한 고체 형태, 또는 에멀젼으로서 제조될 수 있다. 보다 최근에 고안된 비경구 투여를 위한 방법은 서방 또는 지속 방출 시스템을 사용함으로써 일정한 용량이 유지되도록 하는 것을 포함한다 (예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 3,610,795 참조).
필요한 조성물의 정확한 양은 대상의 종, 연령, 체중 및 일반적인 상태, 치료되고 있는 알레르기 질환의 심도, 사용되는 특정 핵산 또는 벡터, 그의 투여 방식 등에 따라 대상마다 다를 것이다. 그러므로, 모든 조성물에 대하여 정확한 양을 특정하는 것은 불가능하다. 그러나, 적절한 양은 본원에서 제공되는 교시 내용에 따라 단지 통상적인 실험에 의해서 당업자에 의해 결정될 수 있다. 따라서, 조성물을 투여하기에 효과적인 용량 및 스케줄은 실험적으로 결정될 수 있으며, 상기 결정은 당업계의 기술 범위 내에 포함된다. 조성물의 투여를 위한 용량 범위는 증상 질환이 영향을 받는 요구되는 효과가 발생할 정도로 충분히 큰 것이다. 용량은 해로운 부작용, 예를 들어 원하지 않는 교차-반응, 과민성 반응 등을 일으킬 정도로 크지 않아야 한다. 일반적으로, 용량은 환자의 연령, 상태, 성별 및 질병의 정도, 투여 경로, 또는 다른 약물이 요법에 포함되는지의 여부에 따라 달라질 것이며, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 용량은 임의의 금기 사항의 경우에는 개별 의사에 의해 조정될 수 있다. 용량은 달라질 수 있고, 하루 또는 여러 날 동안 1일 1회 이상의 용량으로 투여될 수 있다. 제시된 종류의 제약 제품에 대한 적절한 용량에 대한 지침을 문헌에서 찾아볼 수 있다.
예를 들어, 단독으로 사용되는 개시된 조성물의 전형적인 1일 용량은 상기한 요인에 따라 1일당 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 체중이거나 이보다 많을 수 있다.
전립선암 또는 PIN의 치료, 억제 또는 예방을 위해 개시된 조성물을 투여한 후에, 치료제의 효능을 당업자에게 잘 알려진 다양한 방식으로 평가할 수 있다. 예를 들어, 당업자는 조성물이 PSA 항원을 감소시키거나 또는 전립선 종양의 크기의 증가를 억제하는 것을 관찰함으로써 본원에 개시된 조성물이 대상에서 전립선암을 치료하거나 억제하는데 있어서 효능이 있음을 이해할 것이다. PSA 항원은 당업자에게 공지된 방법에 의해, 예를 들어 대상 또는 환자의 샘플 (예를 들어, 비제한적으로 혈액) 내에서 PSA 단백질의 존재를 검출하는 항체 분석을 사용하여 또는 환자에서 순환 PSA 수준을 측정함으로써 측정할 수 있다.
본원에 개시된 상호작용을 억제하는 조성물은 전립선암의 위험이 있거나 또는 PIN 또는 전립선암으로 새로 진단받은 환자 또는 대상에게 예방 차원에서 투여될 수 있다.
특정 제약학적 기능을 갖지 않지만, 예를 들어 세포 염색체 내의 변화를 추적하거나 진단 도구의 전달을 위해 사용될 수 있는, 상호작용을 억제하기 위해 PSA 또는 DEFB1과 상호작용하는 다른 분자가 제약 제품에 대해 설명된 바와 유사한 방식으로 전달될 수 있다.
2. 제조
본 발명의 조성물 및 본 발명의 방법을 수행하기 위해 필요한 조성물은 특별히 다른 언급이 없는 한 특정 시약 또는 화합물에 대하여 당업자들에게 공지되어 있는 임의의 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
i. 핵산 합성
예를 들어, 핵산, 예를 들어, 프라이머로서 사용되는 올리고뉴클레오티드는 표준 화학적 합성법을 사용하여 제조되거나 효소적 방법 또는 임의의 다른 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 그러한 방법은 표준 효소적 소화 후의 뉴클레오티드 단편 단리 방법 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) Chapters 5, 6)으로부터 순수한 합성 방법, 예를 들어 밀리겐 (Milligen) 또는 벡크만 시스템 (Beckman System) 1과 DNA 합성기 (예를 들어, 밀리겐-바이오리서치 (Milligen-Biosearch, 미국 매사추세츠주 버링턴)의 모델 8700 자동 합성기, 또는 ABI 모델 380B)를 함께 사용하는 시아노에틸 포스포라미다이트 방법에 이르기까지 다양하다. 올리고뉴클레오티드를 제조하는 데 유용한 합성 방법도 문헌에 설명되어 있다 ([Ikuta et al., Ann. Rev. Biochem. 53:323-356 (1984)] (포스포트리에스테르 및 포스파이트-트리에스테르 방법), 및 [Narang et al., Methods Enzymol, 65:610-620 (1980)] (포스포트리에스테르 방법)). 단백질 핵산 분자는 닐센 (Nielsen) 등에 의해 설명된 것과 같은 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다 (Nielsen et al, Bioconjug. Chem. 5:3-7 (1994)).
ii . 펩티드 합성
개시된 단백질, 예를 들어 서열 23을 제조하는 한 가지 방법은 2 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드를 함께 단백질 화학 기술에 의해 연결하는 것이다. 예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드는 현재 이용가능한 실험 장치를 사용하여 Fmoc (9-플루오레닐메틱옥시카르보닐) 또는 Boc (tert-부틸옥시카르보닐) 화학을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다 (어플라이드 바이오시스템즈, 인크. (Applied Biosystems, Inc., 미국 캘리포니아주 포스터 시티)). 당업자는 개시된 단백질에 상응하는 펩티드 또는 폴리펩티드가 표준 화학 반응에 의해 합성될 수 있음을 쉽게 인지할 것이다. 예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드는 합성되고, 그의 합성 수지로부터 절단될 수 없는 반면에, 펩티드 또는 단백질의 다른 단편은 합성되고 계속해서 수지로부터 절단됨으로써, 기능적으로 차단된 말단기가 다른 단편에 노출된다. 펩티드 축합 반응에 의해, 이들 두 단편은 각각 그들의 카르복실 및 아미노 말단에서 펩티드 결합을 통해 공유 연결되어 항체 또는 그의 단편을 형성할 수 있다 ([Grant GA (1992) Synthetic Peptides: A User Guide. W.H. Freeman and Co., N. Y. (1992)]; [Bodansky M and Trost B., Ed. (1993) Principles of Peptide Synthesis. Springer-Verlag Inc., NY) (적어도 펩티드 합성에 관련된 물질에 대해 본원에 참고로 포함됨). 별법으로, 펩티드 또는 폴리펩티드는 본원에서 설명된 바와 같이 생체 내에서 독립적으로 합성된다. 일단 단리된 후에는, 이들 독립적인 펩티드 또는 폴리펩티드는 유사한 펩티드 축합 반응을 통하여 결합되어 펩티드 또는 그의 단편을 형성할 수 있다.
예를 들어, 클로닝되거나 합성된 펩티드 절편의 효소적 라이게이션으로 인하여 상대적으로 짧은 펩티드 단편이 결합하여 더 큰 펩티드 단편, 폴리펩티드 또는 전체 단백질 도메인을 생성하는 것이 가능해진다 (Abrahmsen L et al., Biochemistry, 30:4151 (1991)). 별법으로, 합성 펩티드의 천연 화학적 라이게이션이 더 짧은 펩티드 단편으로부터 큰 펩티드 또는 폴리펩티드를 합성 방식으로 제조하기 위해 사용될 수 있다. 이 방법은 두 단계의 화학 반응으로 구성된다 (Dawson et al. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science, 266:776-779 (1994)). 제1 단계는 비보호된 합성 펩티드-티오에스테르와 아미노-말단 Cys 잔기를 함유하는 다른 비보호된 펩티드 절편과의 화학선택적 반응으로서, 초기의 공유 생성물로서 티오에스테르-연결된 중간체가 생성된다. 반응 조건을 변화시키지 않은 상태에서, 상기 중간체는 자발적이고 신속한 분자내 반응을 거쳐, 라이게이션 부위에 천연 펩티드 결합을 형성한다 ([Baggiolini M et al. (1992) FEBS Lett. 307:97-101]; [Clark-Lewis I et al., J. Biol. Chem., 269:16075 (1994)]; [Clark-Lewis I et al., Biochemistry, 30:3128 (1991)]; [Rajarathnam K et al., Biochemistry 33:6623-30 (1994)]).
별법으로, 비보호된 펩티드 절편은 화학적으로 연결되고, 여기서 화학적 라이게이션의 결과로서 펩티드 절편들 사이에 형성된 결합은 비천연적인 (비-펩티드) 결합이다 (Schnolzer, M et al. Science, 256:221 (1992)). 이 기술은 단백질 도메인의 유사체뿐만 아니라 완전한 생물학적 활성을 갖는 다량의 비교적 순수한 단백질을 합성하기 위하여 사용되었다 (deLisle Milton RC et al., Techniques in Protein Chemistry IV. Academic Press, New York, pp. 257-267 (1992)).
D. 정의
다른 규정이 없는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 학술 용어들은 개시된 방법 및 조성물이 속하는 기술 분야의 숙련자들에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 갖는다. 비록 본원에 설명된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질도 본 발명의 방법 및 조성물의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 특히 유용한 방법, 장치, 및 물질은 설명된 바와 같다. 본원에 인용된 간행물 및 간행물에 언급된 물질은 본원에 참조로 구체적으로 포함된다. 본원에 기재된 그 어느 것도, 본 발명이 선행 발명에 의한 개시 내용보다 앞섰다고 말할 자격이 없다고 인정하는 것으로 생각되지 않아야 한다. 어떠한 참고문헌도 선행 기술을 구성한다고 인정되지 않는다. 참고문헌의 논의는 그 저자가 주장하고, 출원인이 인용된 문헌의 정확성과 적절성을 의심할 권리를 보유하는 것이 무엇인지를 제시하는 것이다.
본원에서 및 청구의 범위에서 사용되는 바와 같이, 단일 형태 ("a", "an" 및 "the")는 분명하게 다른 언급이 없는 한 복수의 참조물을 포함하는 것으로 주지되어야 한다. 따라서, 예를 들어 "펩티드"에 대한 언급은 다수의 상기 펩티드를 포함하고, "펩티드"는 하나 이상의 펩티드 및 당업자에게 공지되어 있는 그의 동등물 등을 언급하는 것이다.
"임의의" 또는 "임의로"는 계속해서 설명되는 사건, 상황, 또는 물질이 일어날 수도 있고 일어나지 않을 수도 있거나 또는 존재할 수 있도 있고 존재하지 않을 수도 있으며, 그 설명이 사건, 상황, 또는 물질이 일어나거나 존재하는 상황 및 일어나지 않거나 존재하지 않는 상황을 포함함을 의미한다.
범위는 본원에서 "약" 하나의 특정 값으로부터, 및/또는 "약" 다른 하나의 특정 값으로 표시될 수 있다. 이러한 범위가 표시될 때, 다른 실시태양은 한 특정 값으로부터 및/또는 다른 특정 값까지를 포함한다. 이와 유사하게, 값이 앞에 "약"을 사용하여 대략적으로 표시될 때, 특정 값이 다른 실시태양을 형성한다는 것이 이해될 것이다. 또한, 각 범위의 종점은 다른 종점에 관련하여 둘 다 유의하고, 다른 종점과 무관하다는 것이 이해될 것이다. 또한, 본원에 개시된 많은 값이 존재하고, 각각의 값이 그 값 자체 이외에 "약" 특정 값으로서 개시됨이 이해된다. 예를 들어, 값 "10"이 개시되면, "약 10"도 개시되는 것이다. 또한, 특정 값이 개시될 때, 당업자에 의해 적절하게 이해되는 바와 같이 그 값 "이하", 값 "이상" 및 값 사이의 가능한 범위도 개시됨이 이해된다. 예를 들어, 값 "10"이 개시되면, "10 이하" 및 "10 이상"도 개시되는 것이다. 또한, 본원 전체에 걸쳐서, 데이타는 많은 상이한 포맷으로 제시되고, 상기 데이타는 종점 및 출발점, 및 데이타 점의 임의의 조합 범위를 나타내는 것으로 이해된다. 예를 들어, 특정 데이타 점 "10" 및 특정 데이타 점 "15"가 개시될 경우, 10 및 15을 초과하는 값, 10 및 15 이상, 미만, 이하의 값, 10 및 15와 동일한 값, 및 10과 15 사이의 값이 개시된 것으로 간주됨이 이해된다. 또한, 2개의 특정 단위 사이의 각각의 단위도 개시된 것으로 이해된다. 예를 들어, 10과 15가 개시되면, 11, 12, 13, 및 14도 개시된 것이다.
본 명세서의 상세한 설명과 청구항 전체에 걸쳐, 단어 "포함하다" 및 그의 변용 형태, 예를 들어 "포함하는" 및 "포함"은 "포함하고, 그로 제한되지 않음"을 의미하며, 예를 들어 다른 첨가제, 성분, 정수 또는 단계를 배제하는 것으로 의도되지 않는다.
본원 전체에 걸쳐 다양한 간행물이 참조된다. 이들 간행물의 개시 내용은 본 발명이 속하는 기술 상태를 보다 충분히 설명하기 위해서 그 전부가 본원에 참고로 포함된다. 또한, 개시된 참고문헌은 참고문헌이 기초로 하는 문장에서 논의되는, 참고문헌에 포함된 내용에 대해 개별적으로 및 구체적으로 본원에 참고로 포함된다.
E. 실시예
1. 실시예 1: 인간 베타 데펜신 -1은 후기 전립선암에 세포독성이고, 전립선암 종양 면역에서 일정 역할을 한다
요약
DEFB1을 정상 전립선 상피 세포, 및 안드로겐 수용체 양성 (AR+) 및 안드로겐 수용체 음성 (AR-) 전립선암 세포주에 대해 어떠한 효과를 갖는지 검사하기 위해 유도가능한 발현 시스템 내로 클로닝하였다. DEFB1 발현의 유도는 AR- 세포 DU145 및 PC3에서 세포 성장을 감소시켰지만, AR+ 전립선암 세포 LNCaP의 성장에는 효과가 없었다. DEFB1은 또한 카스파제-매개된 세포자멸의 신속한 유도를 유발하였다. 본원에 제시된 데이타는 처음으로 선천 종양 면역에서 그의 역할에 대한 증거를 제공하고, 그의 손실이 전립선암에서 종양 진행에 기여함을 나타낸다.
물질 및 방법
세포주: 세포주 DU145를 DMEM 배지 내에서 배양하고, PC3을 F12 배지 내에서 성장시키고, LNCaP를 RPMI 배지 (라이프 테크놀로지스, 인크. (Life Technologies, Inc., 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드)) 내에서 성장시켰다. 3개의 모든 세포주에 대한 성장 배지에 10% (v/v) 태송아지 혈청 (라이프 테크놀로지스)를 보충하였다. hPrEC 세포를 전립선 상피 기초 배지 (캄브렉스 바이오 사이언스, 인크. (Cambrex Bio Science, Inc., 미국 메릴랜드주 워커스빌) 내에서 배양하였다. 모든 세포주를 37℃ 및 5% CO2에서 유지하였다.
조직 샘플 및 레이저 포획 미세절제: 근치적 전립선절제술을 받은 동의한 환자로부터 입수된 전립선 조직을 임상시험 심사위원회 (Institutional Review Board)-승인된 프로토콜에 따라 홀링스 암센터 (Hollings Cancer Center) 종양 뱅크로부터 획득하였다. 이는 샘플의 처리, 절편생성, 조직학적 특성화, RNA 정제 및 PCR 증폭을 위한 지침을 포함한다. 동결된 조직 절편의 병리학적 검사 후, 분석된 조직 샘플이 양성 전립선 세포의 순수 집단으로 구성되도록 레이저 포획 미세절제 (LCM)를 수행하였다. 분석된 각각의 조직 절편에 대해, 양성 조직을 함유하는 3개의 상이한 구역에서 LCM을 수행한 후, 수집된 세포를 모았다.
DEFB1 유전자의 클로닝: DEFB1 cDNA를 RNA로부터 역전사-PCR에 의해 생성하였다. PCR 프라이머는 ClaI 및 KpnI 제한 부위를 함유하도록 설계하였다. DEFB1 PCR 생성물을 ClaI 및 KpnI로 제한 소화시키고, TA 클로닝 벡터 내로 라이게이팅하였다. 이어서, TA/DEFB1 벡터를 열 충격에 의해 이. 콜라이 내로 형질감염시키고, 개별 클론을 선택하고 팽창시켰다. 플라스미드를 Cell Culture DNA Midiprep (퀴아겐 (Qiagen, 미국 캘리포니아주 발렌시아))에 의해 단리하고, 서열 통합성을 자동화 서열결정에 의해 확인하였다. 이어서, DEFB1 유전자 단편을 ClaI 및 KpnI로 소화시킨 pTRE2 내로 라이게이팅하였고, 이는 배향 목적을 위한 중간체 벡터로서 역할을 하였다. 이어서, pTRE2/DEFB1 구성체를 ApaI 및 KpnI로 소화시켜 DEFB1 삽입체를 삭제하였고, 이를 또한 ApaI 및 KpnI로 이중 소화시킨 엑디손 (Ecdysone) 유도가능 발현 시스템 (인비트로겐 (Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스바드))의 pIND 벡터 내로 라이게이팅하였다. 구성체를 이. 콜라이 내로 다시 형질감염시키고, 개별 클론을 선택하고 팽창시켰다. 플라스미드를 단리하고, pIND/DEFB1의 서열 통합성을 다시 자동화 서열결정에 의해 확인하였다.
형질감염: 세포 (1 x 106)를 100-mm 페트리 (Petri) 접시 상에 접종하고, 철야 성장시켰다. 이어서, 세포를 리포펙타민 2000 (인비트로겐)을 사용하여 1 ㎍의 pVgRXR 플라스미드 (이는 이종이량체성 엑디손 수용체를 발현한다), 및 1 ㎍의 pIND/DEFB1 벡터 구성체 또는 빈 (empty) pIND 대조 벡터로 Opti-MEM 배지 (라이프 테크놀로지스, 인크.) 내에서 동시-형질감염시켰다.
RNA 단리 및 정량적 RT - PCR: DEFB1 구성체로 형질감염된 세포에서 DEFB1 단백질 발현을 입증하기 위해, 포나스테론 A (Pon A)를 사용한 24시간 유도 기간 후 RNA를 수집하였다. 간단히 설명하면, 트립신 처리에 의해 수거한 약 1 x 106 세포로부터 SV 총 RNA 단리 시스템 (프로메가)를 사용하여 총 RNA를 단리하였다. 여기서, 세포를 용해시키고, 총 RNA를 스핀 (spin) 컬럼을 통한 원심분리에 의해 단리하였다. LCM에 의해 수집한 세포에 대해, 총 RNA는 제조사의 프로토콜에 따라 PicoPure RNA 단리 키트 (아크투러스 바이오사이언시스 (Arcturus Biosciences, 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰))를 사용하여 단리하였다. 두 공급원으로부터의 총 RNA (반응 당 0.5 ㎍)를 랜덤 프라이머 (프로메가)를 이용하여 cDNA로 역전사시켰다. 제조사의 프로토콜에 따라 제1 가닥 합성을 위해 AMV 역전사효소 II 효소 (반응 당 500 단위; 프로메가)를 사용하고, 제2 가닥 합성을 위해 Tfl DNA 중합효소 (반응 당 500 단위; 프로메가)를 사용하였다. 각각의 경우에, 50 pg의 cDNA를 후속 PCR 반응에 대해 사용하였다. 2-단계 QRT-PCR을 TaqMan 역전사 시스템으로부터의 MultiScribe 역전사효소 및 SYBR 그린 PCR 마스터 믹스 (Master Mix) (어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 생성된 cDNA에 대해 수행하였다.
DEFB1에 대한 프라이머 쌍 (표 2)을 공개된 DEFB1 서열 (GenBank 기탁 번호 U50930)로부터 생성하였다. 56℃의 어닐링 온도를 이용하는 표준 조건 하에 40 사이클의 PCR을 수행하였다. 또한, 총 cDNA의 초기 함량을 표준화하기 위해 β-액틴 (표 2)를 하우스키핑 (housekeeping) 유전자로서 증폭하였다. DEFB1 발현은 DEFB1과 β-액틴 사이의 상대적인 발현비로서 계산하고, DEFB1 발현에 대해 유도된 및 유도되지 않은 세포주에서 및 LCM 양성 전립선 조직에서 비교하였다. 음성 대조군으로서, cDNA 템플레이트를 사용하지 않는 QRT-PCR 반응을 또한 수행하였다. 모든 반응은 삼중으로 3회 실행하였다.
MTT 세포 생존율 분석: 세포 성장에 대한 DEFB1의 효과를 검사하기 위해, 대사적 3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드 (MTT) 분석을 수행하였다. pVgRXR 플라스미드 및 pIND/DEFB1 구성체 또는 빈 pIND 벡터로 동시-형질감염시킨 PC3, DU145 및 LNCaP 세포를 96-웰 플레이트 상에 1-5 x 1O3 세포/웰로 접종하였다. 접종 24시간 후에, DEFB1 발현을 유도하기 위해 10 μM 포나스테론 A를 함유하는 신선한 성장 배지를 매일 24, 48 및 72시간 동안 첨가하고, 그 후 MTT 분석을 제조사의 지시 (프로메가)에 따라 수행하였다. 반응은 삼중으로 3회 수행하였다.
유동 세포측정: DEFB1 발현 시스템으로 동시-형질감염시킨 PC3 및 DU145 세포를 60-mm 접시에서 성장시키고, 10 μM 포나스테론 A로 12, 24 및 48시간 동안 유도하였다. 각각의 인큐베이션 기간 후, 플레이트로부터 배지를 수집하고 (임의의 탈착된 세포를 보유하기 위해), 플레이트를 세척하기 위해 사용된 PBS와 합하였다. 남아있는 부착된 세포는 트립신 처리에 의해 수거하고, 탈착된 세포 및 PBS와 합하였다. 이어서, 세포를 4℃ (500 x g)에서 5 min 동안 펠렛화하고, PBS 내에 2회 세척하고, 5 ㎕의 아넥신 V-FITC 및 5 ㎕의 PI를 함유하는 100 ㎕의 1x 아넥신 결합 버퍼 (0.1 M Hepes/NaOH (pH 7.4), 1.4 M NaCl, 25 mM CaCl2) 내에 재현탁하였다. 세포를 RT에서 15 min 동안 암소에서 인큐베이팅한 후, 400 ㎕의 1x 아넥신 결합 버퍼로 희석하고, FACscan (벡톤 디킨슨 (Becton Dickinson, 미국 캘리포니아주 산 호세))에 의해 분석하였다. 모든 반응을 3회 수행하였다.
현미경 분석: 세포 형태를 위상 대조 현미경에 의해 분석하였다. 벡터를 함유하지 않는, 또는 빈 플라스미드 또는 DEFB1 플라스미드를 함유하는 DU145, PC3 및 LNCaP 세포를 6 웰 배양 플레이트 (비디 팔콘 (BD Falcon, 미국))에 접종하였다. 다음날, 플라스미드-함유 세포를 48h 동안 10 μM 포나스테론 A를 함유하는 배지로 유도한 반면, 대조군 세포에는 신선한 배지를 제공하였다. 이어서, 세포를 도립 Zeiss EVI 35 현미경 (칼 자이스 (Carl Zeiss, 독일)) 하에 관찰하였다. 세포 영역의 위상 대조 사진은 SPOT Insight Mosaic 4.2 카메라 (다이어그노스틱 인스트루먼츠 (Diagnostic Instruments, 미국))를 사용하여 얻었다. 세포를 위상 대조 현미경에 의해 32X 배율 하에 검사하고, 디지탈 영상을 비압축 TIFF 화일로서 저장하고, 영상 처리 및 하드 카피 제시 (presentation)를 위해 Photoshop CS 소프트웨어 (어도비 시스템즈 (Adobe Systems, 미국 캘리포니아주 산 호세))로 익스포팅하였다.
카스파제 검출
전립선암 세포주에서 카스파제 활성의 검출을 APO LOGIX™ 카르복시플루오레신 카스파제 검출 키트 (셀 테크놀로지 (Cell Technology, 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰))를 사용하여 수행하였다. 활성 카스파제는 활성 카스파제에 비가역적으로 결합하는 FAM-VAD-FMK 억제제를 사용하여 검출하였다. 간단히 설명하면, DEFB1 발현 시스템을 함유하는 DU145 및 PC3 세포 (1.5-3 X 105)를 35 mm 유리 바닥 마이크로웰 접시 (마텍 (Matek, 미국 매사추세츠주 애쉬랜드))에 플레이팅하고, 24시간 동안 배지 단독으로 또는 앞서 설명된 바와 같이 PonA를 함유하는 배지로 처리하였다. 이어서, 카르복시플루오레세인 표지된 펩티드 플루오로메틸 케톤 (FAM-VAD-FMK)의 30X 작업 희석액 10 ㎕을 300 ㎕의 배지에 첨가하고, 각각 35 mm 접시에 첨가하였다. 이어서, 세포를 1시간 동안 37℃에서 5% CO2 하에 인큐베이팅하였다. 이어서, 배지를 흡인하고, 세포를 2 ml의 1X 작업 희석액 세척 버퍼로 2회 세척하였다. 세포를 차등 간섭 대비 (DIC) 하에 또는 488 nm에서 레이저 여기 하에 관찰하였다. 형광 신호를 Vario 2 RGB 레이저 스캐닝 모듈을 갖는 공초점 현미경 (Zeiss LSM 5 Pascal) 및 63X DIC 오일 렌즈를 사용하여 분석하였다.
통계학적 분석
통계학적 차이를 언페어드 (unpaired) 값에 대한 스튜던트 t-시험을 이용하여 평가하였다. P 값은 양측 (two-sided) 계산에 의해 결정하고, 0.05 미만의 P 값을 통계학상 유의한 것으로 간주하였다.
결과
전립선 조직 및 세포주에서 DEFB1 발현: DEFB1 발현 수준을 양성 및 악성 전립선 조직, hPrEC 전립선 상피 세포 및 DU145, PC3 및 LNCaP 전립선암 세포에서 QRT-PCR에 의해 측정하였다. DEFB1 발현은 양성 임상 샘플 모두에서 검출되었다. DEFB1의 상대적인 발현의 평균량은 0.0073이었다. 또한, hPrEC 세포에서 DEFB1의 상대적인 발현은 0.0089이었다. 양성 전립선 조직 샘플 및 hPrEC에서 검출된 DEFB1 발현에서 통계학적 차이가 없었다 (도 1A). 전립선암 세포주에서 상대적인 DEFB1 발현 수준의 분석을 통해 DU145, PC3 및 LNCaP에서 유의하게 더 낮은 수준이 밝혀졌다. 추가의 평가 기준으로서, 상대적인 DEFB1 발현을 환자 #1215로부터의 전립선 조직의 인접한 악성 절편에서 측정하였다. 환자 #1215로부터의 악성 전립선 조직에 비해 3개의 전립선암 세포주에서 관찰된 DEFB1 발현 수준의 유의한 차이가 없었다 (도 1B). 또한, 4개의 모든 샘플에서 발현 수준은, 내인성 DEFB1 발현이 거의 또는 전혀 없음을 확인한 템플레이트가 없는 음성 대조군에 가까웠다 (데이타를 보이지 않음). DEFB1 발현 시스템으로 형질감염된 전립선암 세포주에 대해 QRT-PCR을 또한 수행하였다. 24시간 유도 기간 후, 상대적인 발현 수준은 DU145에서 0.01360, PC3에서 0.01503 및 LNCaP에서 0.138이었다. 증폭 생성물을 겔 전기영동에 의해 확인하였다.
QRT-PCR을 양성, PIN 및 암을 함유하는 LCM 조직 구역에 대해 수행하였다. DEFB1의 상대적인 발현은 악성 구역에서 0.0009에 비해 양성 구역에서 0.0146이었다 (도 1C). 이는 94% 감소를 나타내고, 이는 다시 발현의 유의한 하향조절을 입증한다. 또한, PIN의 분석으로 DEFB1 발현 수준이 70% 감소한 0.044임을 밝혀졌다. 환자 #1457에서의 발현을 6명의 다른 환자의 양성 구역에서 발견된 평균 발현 수준 (도 1A)에 비교하면 1.997의 비가 밝혀졌고, 이는 발현이 거의 2배 많은 것을 나타낸다 (도 1D). 그러나, 발현비는 양성 조직에서의 평균 발현 수준에 비해 PIN에서 0.0595이고, 악성 조직에서 0.125이었다.
DEFB1 은 세포 막 투과성 및 러플링을 유발한다: 전립선암 세포주에서 DEFB1의 유도는 DU145 및 PC3에서 세포수를 유의하게 감소시켰지만, LNCaP에서는 세포 증식에 효과가 없었다 (도 2). 음성 대조군으로서, 세포 증식을 빈 플라스미드를 함유하는 3개의 모든 세포주에서 모니터링하였다. PonA의 첨가 후 DU145, PC3 또는 LNCaP 세포에서 세포 형태의 관찰가능한 변화가 없었다. 또한, DEFB1 유도는 DU145 및 PC3 모두에서 형태적 변화를 일으켰다. 여기서, 세포는 보다 둥글게 보이고, 세포 사멸의 표시인 막 러플링을 나타냈다. 세포자멸체가 또한 두 세포주 모두에 존재하였다.
DEFB1 의 발현은 세포 생존율을 감소시켰다: MTT 분석으로 PC3 및 DU145 세포에서 DEFB1에 의한 세포 생존율이 감소하지만, LNCaP 세포에 유의한 효과가 없음을 보여주었다 (도 3). 24시간 후, 상대적인 세포 생존율은 DU145에서 72% 및 PC3에서 56%이었다. 유도 48시간 후 분석하여 DU145에서 49% 세포 생존율 및 PC3에서 37% 세포 생존율을 밝혔다. DEFB1 발현의 72시간 후에 DU145 및 PC3 세포에서 각각 44% 및 29% 상대적인 세포 생존율이 나타났다.
DEFB1 은 후기 전립선암 세포에서 신속한 카스파제 - 매개된 세포자멸을 유발한다: PC3 및 DU145에 대한 DEFB1의 효과가 세포증식 억제성인지 세포독성인지 결정하기 위해, FACS 분석을 수행하였다. 정상 성장 조건 하에, PC3 및 DU145 배양액의 90% 초과가 생존가능하고 비-세포자멸성이고 (하부 좌측 4분면), 아넥신 V 또는 PI로 염색되지 않았다 (도 4). PC3 세포에서 DEFB1 발현을 유도한 후, 세포자멸성 세포의 수 (하부 및 상부 우측 4분면)는 총계가 12시간에서 10%, 24시간에서 20% 및 48시간에서 44%이었다. DU145 세포에 대해, 세포자멸성 세포의 수는 총계가 12시간 후 12%, 24시간에서 34% 및 유도 48시간 후 59%이었다. 빈 플라스미드를 함유하는 세포에서는 PonA로 유도한 후 세포자멸에서 증가가 관찰되지 않았다 (데이타를 보이지 않음).
카스파제 활성을 공초점 레이저 현미경 분석에 의해 결정하였다 (도 5). DU145 및 PC3 세포를 DEFB1 발현에 대해 유도하고, 활성을 활발하게 세포자멸을 겪는 세포에서 카스파제에 대한 녹색 형광 FAM-VAD-FMK의 결합에 기초하여 모니터링하였다. DIC 하의 세포의 분석은 0시간에서 생존가능한 대조군 DU145 (A), PC3 (E) 및 LNCaP (I) 세포의 존재를 보여주었다. 488 nm에서 공초점 레이저에 의한 여기는 검출가능한 녹색 염색을 생산하지 않았고, 이는 DU145 (B), PC3 (F) 또는 LNCaP (J)에서 카스파제 활성이 없는 것을 나타낸다. 24시간 동안 유도한 후, DU145 (C), PC3 (G) 및 LNCaP (K) 세포는 다시 DIC 하에 가시적이었다. 형광 하의 공초점 분석은 DU145 (D) 및 PC3 (H) 세포에서 녹색 염색을 보여주었고, 이는 카스파제 활성을 나타낸다. 그러나, LNCaP (L)에서 녹색 염색이 없었고, 이는 DEFB1에 의해 세포자멸이 유도되지 않았음을 나타낸다.
결론
그의 기능적 역할을 평가하기 위해, DEFB1 유전자를 엑디손 유도가능 발현 시스템 내로 클로닝하고, 전립선암 세포에 대한 그의 효과를 검사하였다. 본 데이타는 후기 안드로겐 수용체 음성 호르몬 불응성 전립선암 세포에 대한 DEFB1 세포독성 활성을 입증한다. 결론적으로, 본 연구는 전립선암에서 DEFB1의 기능적 역할을 제공한다. 또한, 이들 발견은 DEFB1이 종양 면역에 관여되는 선천 면역계의 일부임을 보여준다. 본원에 제시된 데이타는 생리학적 수준에서 발현된 DEFB1이 AR- 호르몬 불응성 전립선암 세포에는 세포독성이지만, AR+ 호르몬 감수성 전립선암 세포 또는 정상 전립선 상피 세포에는 세포독성이 아님을 입증한다. DEFB1이 세포독성 없이 정상 전립선 세포에서 구성적으로 발현된다는 사실이 주어지면, 후기 AR- 전립선암 세포는 이들을 DEFB1 세포독성에 감수성으로 만드는 구분되는 표현형 특징을 가질 수 있다. 따라서, DEFB1은 후기 전립선암의 치료를 위한 실용적인 치료제이다.
2. 실시예 2: PAX2 발현의 siRNA 매개된 녹다운은 p53 상태에 무관한 전립선암 세포 사멸을 일으킨다.
요약
본 실시예는 p53 유전자 상태가 상이한 전립선암 세포에서 RNA 간섭에 의해 PAX2 발현을 억제하는 효과를 검사한다. 이들 결과는 PAX2의 억제가 p53 상태에 무관한 세포 사멸을 일으킴을 입증하고, 이는 전립선암에서 PAX2에 의해 억제되는 추가의 종양 서프레서 유전자 또는 세포 사멸 경로가 존재함을 나타낸다.
물질 및 방법
세포주: 세포주 PC3, DU145 및 LNCaP를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, 미국 메릴랜드주 록빌))으로부터 입수하였다. PC3 세포를 모두 10% (v/v) 태송아지 혈청을 보충한 F-12 배지에서, DU145를 DMEM에서, LNCaP를 RPMI에서 성장시켰다. 세포를 37℃에서 5% CO2 내에 유지하였다.
PAX2 의 siRNA 침묵: 효율적인 유전자 침묵을 달성하기 위해, 인간 PAX2 mRNA (기탁 번호 NM_003989.1)를 표적화하는 4개의 상보성 짧은 간섭 리보뉴클레오티드 (siRNA)의 풀을 합성하였다 (다마콘 리써치 (Dharmacon Research, 미국 콜로라도주 라파예트)). 4개의 siRNA의 제2 풀을 PAX2 siRNA의 특이성에 대해 시험하기 위해 내부 대조군으로서 사용하였다. 합성된 서열 중 2개는 GL2 루시퍼라제 mRNA (기탁 번호 X65324)를 표적화하고, 2개는 비-서열-특이적이었다 (표 3). siRNA의 어닐링을 위해, 35 M의 단일 가닥을 어닐링 버퍼 (100 mM 아세트산칼륨, 30 mM HEPES-KOH (pH 7.4), 2 mM 아세트산마그네슘) 내에서 1 min 동안 90℃에서 인큐베이팅한 후 37℃에서 1 h 인큐베이팅하였다.
웨스턴 분석: 간단히 설명하면, 세포를 트립신 처리에 의해 수거하고, PBS로 2회 세척하였다. 용해 버퍼를 제조사의 지시 (시그마)에 따라 제조한 후, 세포에 첨가하였다. 4℃에서 회전식 진탕기 (orbital shaker) 상에서 15분 인큐베이션 기간 후, 세포 용해물을 수집하고 10분 동안 12000xg에서 원심분리하여 세포 파편을 펠렛화하였다. 이어서, 단백질-함유 상등액을 수집하고 정량하였다. 이어서, 25 ㎍ 단백질 추출물을 8-16% 구배 SDS-PAGE (노벡스 (Novex)) 상에 로딩하였다. 전기영동 후, 단백질을 PVDF 막에 전달한 후, TTBS (0.05% Tween 20 및 100mM Tris-Cl) 중의 5% 무지방 건조 우유로 1시간 동안 차단시켰다. 이어서, 블롯을 토끼 항-PAX2 1차 항체 (자이메드 (Zymed, 미국 캘리포니아주 샌프란시스코))로 1:2000 희석으로 프로빙하였다. 세척 후, 막을 호스래디시 퍼옥시다제 (HRP)에 컨쥬게이팅된 항-토끼 항체 (희석 1:5000; 시그마)와 함께 인큐베이팅하고, 신호 검출을 화학발광 시약 (피어스 (Pierce))을 사용하여 Alpha Innotech Fluorchem 8900 상에서 가시화하였다. 대조군으로서, 블롯을 스트리핑하고 마우스 항-β-액틴 1차 항체 (1:5000; 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich)) 및 HRP-컨쥬게이팅된 항-마우스 2차 항체 (1:5000; 시그마-알드리치)로 재프로빙하고, 신호 검출을 다시 가시화하였다.
위상 대조 현미경: 세포 성장에 대한 PAX2 녹다운의 효과를 위상 대조 현미경에 의해 분석하였다. 여기서, 1-2 x 104 세포를 6 웰 배양 플레이트 (비디 팔콘) 상에 접종하였다. 다음날, 세포를 배지 단독으로, 음성 대조군 비-특이적 siRNA 또는 PAX2 siRNA로 처리하고, 6일 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 세포를 도립 Zeiss IM 35 현미경 (칼 자이스) 하에 32x 배율에서 관찰하였다. 세포 영역의 위상 대조 사진은 SPOT Insight Mosaic 4.2 카메라 (다이어그노스틱 인스트루먼츠)를 사용하여 얻었다.
MTT 세포독성 분석: DU145, PC3 및 LNCaP 세포 (1x105)를 제조사의 프로토콜 (프로메가)에 따라 Codebreaker 형질감염 시약을 사용하여 0.5 ㎍의 PAX2 siRNA 풀 또는 대조군 siRNA 풀로 형질감염시켰다. 이어서, 세포 현탁액을 희석하고 96-웰 플레이트 상으로 1-5 x1O3 세포/웰로 접종하고, 2, 4 또는 6일 동안 성장시켰다. 배양 후, 세포 생존율을 3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드, MTT (프로메가)의 착색된 포르마잔 생성물로의 전환을 측정함으로써 결정하였다. 흡광도는 540 nm에서 스캐닝 다중웰 분광광도계 상에서 판독하였다.
팬- 카스파제 검출: 전립선암 세포주에서 카스파제 활성의 검출은 APO LOGIX™ 카르복시플루오레신 카스파제 검출 키트 (셀 테크놀로지)을 사용하여 수행하였다. 활성 카스파제는 활성 카스파제에 비가역적으로 결합하는 FAM-VAD-FMK 억제제를 사용하여 검출하였다. 간단히 설명하면, 세포 (1-2X104)를 35 mm 유리 바닥 마이크로웰 접시 (마텍) 상에 플레이팅하고, 배지 단독으로 또는 앞서 설명된 바와 같이 PAX2 siRNA로 처리하였다. 이어서, 카르복시플루오레세인 표지된 펩티드 플루오로메틸 케톤 (FAM-VAD-FMK)의 30X 작업 희석액 10 ㎕을 300 ㎕의 배지에 첨가하고, 각각 35 mm 접시에 첨가하였다. 이어서, 세포를 1시간 동안 37℃에서 5% CO2 하에 인큐베이팅하였다. 이어서, 배지를 흡인하고, 세포를 2 ml의 1X 작업 희석액 세척 버퍼로 2회 세척하였다. 세포를 차등 간섭 대비 (DIC) 하에 또는 488 nm에서 레이저 여기 하에 관찰하였다. 형광 신호를 Vario 2 RGB 레이저 스캐닝 모듈을 갖는 공초점 현미경 (Zeiss LSM 5 Pascal) 및 63X DIC 오일 렌즈를 사용하여 분석하였다.
정량적 실시간 RT - PCR: PC3, DU145 및 LNCaP 세포주에서 PAX2 siRNA 처리 후 유전자 발현을 입증하기 위해 정량적 실시간 RT-PCR을 수행하였다. SV 총 RNA 단리 시스템 (프로메가)를 사용하여 총 RNA를 단리하였다. 간단히 설명하면, 약 1 x 106 세포를 트립신 처리에 의해 수거하고, PBS 내에 세정하였다. 이어서, 세포를 용해시키고, 총 RNA를 스핀 컬럼을 통한 원심분리에 의해 단리하였다. 총 RNA (반응 당 0.5 ㎍)를 제조사의 프로토콜에 따라 제1 가닥 합성을 위해 Oligo (dT) 15 프라이머 (프로메가) 및 AMV 역전사효소 II 효소 (반응 당 500 단위; 프로메가)를 및 제2 가닥 합성을 위해 Tfl DNA 중합효소 (반응 당 500 단위; 프로메가)를 사용하여 cDNA로 역전사하고, 동일한 대조 샘플을 RT 효소 없이 처리하였다. 대개, 50 pg의 각각의 cDNA를 뒤이은 PCR 반응에 대해 사용하였다. 2-단계 QRT-PCR을 TaqMan 역전사 시스템으로부터의 MultiScribe 역전사효소 및 SYBR 그린 PCR 마스터 믹스 (피이 바이오시스템 (PE Biosystem))를 사용하여 생성된 cDNA에 대해 수행하였다. BAX, BID 및 BAD에 대한 프라이머 쌍을 공개된 서열로부터 생성하였다 (표 3). 반응을 MicroAmp 광학 96-웰 반응 플레이트 (피이 바이오시스템)에서 수행하였다. 60℃의 어닐링 온도를 이용하는 표준 조건 하에 40 사이클의 PCR을 수행하였다. 정량화는 지수 증폭이 시작되는 사이클수 (역치 값)에 의해 결정하고, 삼중 반복으로부터 얻은 값으로부터 평균하였다. 메세지 수준과 역치 값 사이에 역 관계가 존재하였다. 또한, 총 cDNA의 초기 함량을 표준화하기 위해 GAPDH를 하우스키핑 유전자로서 사용하였다. 유전자 발현은 세포자멸 촉진 유전자와 GAPDH 사이의 상대적인 발현비로서 계산하였다. 모든 반응은 삼중으로 수행하였다.
결과
PAX2 단백질의 siRNA 억제: siRNA가 PAX2 mRNA를 효과적으로 표적화하는지 확인하기 위해, 6일의 처리 기간에 걸쳐 PAX2 단백질 발현 수준을 모니터링하기 위해 웨스턴 분석을 수행하였다. 세포를 PAX2 siRNA의 풀로 단일 라운드 형질감염시켰다. 결과는 DU145에서 4일 (도 6a) 및 PC3에서 6일 (도 6b)에 PAX2 단백질의 녹다운을 보여줌으로써 PAX2 mRNA의 특이적 표적화를 확인하였다.
PAX2 의 녹다운은 전립선암 세포 성장을 억제한다: 세포를 배지 단독, 음성 대조군 비-특이적 siRNA 또는 PAX2 siRNA로 6일 처리 기간 후 분석하였다 (도 7). DU145 (a), PC3 (d) 및 LNCaP (g) 세포는 모두 배지 단독을 함유하는 배양 접시에서 적어도 90% 융합도에 도달하였다. DU145 (b), PC3 (e) 및 LNCaP (h)를 음성 대조군 비-특이적 siRNA로 처리하면 세포 성장에는 효과가 없었고, 세포는 다시 6일 후 융합도에 도달하였다. 그러나, PAX2 siRNA로 처리하면 세포수를 유의하게 감소시켰다. DU145 세포는 약 15% 융합하고 (c), PC3 세포는 단지 10% 융합하였다 (f). LNCaP 세포는 siRNA 처리 후 5% 융합하였다.
세포독성 분석: 세포 생존율을 2, 4 및 6일 노출 시간 후 측정하고, 처리된 세포의 570-630 nm 흡광도를 비처리된 대조군 세포의 값으로 나눈 비로서 표현하였다 (도 8). 처리 2일 후 상대적인 세포 생존율은 LNCaP에서 77%, DU145에서 82% 및 PC3에서 78%이었다. 4일 후, 상대적인 세포 생존율은 LNCaP에서 78%, DU145에서 53% 및 PC3에서 63%이었다. 처리 6일 후, 상대적인 세포 생존율은 LNCaP에서 31%, PC3에서 37%로 감소하였고, DU145에서는 53%이었다. 음성 대조군으로서, 세포 생존율을 음성 대조군 비-특이적 siRNA 또는 형질감염 시약 단독으로 6일의 처리 기간 후에 측정하였다. 두 조건 모두에 대해, 정상 성장 배지에 비해 세포 생존율의 통계학상 유의한 변화가 없었다.
팬- 카스파제 검출: 카스파제 활성을 공초점 레이저 현미경 분석에 의해 검출하였다. DU145, PC3 및 LNCaP 세포를 PAX2 siRNA로 처리하고, 활성을 녹색 형광을 낼 활발하게 세포자멸을 겪는 세포에서 카스파제에 대한 FAM-표지된 펩티드의 결합에 기초하여 모니터링하였다. DIC 하에 배지만을 사용한 세포를 분석하면 0시간에서 생존가능한 DU145 (A), PC3 (E) 및 LNCaP (I) 세포의 존재를 보여준다 (도 9). 488 nm에서 공초점 레이저에 의한 여기는 검출가능한 녹색 염색을 생산하지 않았고, 이는 비처리된 DU145 (B), PC3 (F) 또는 LNCaP (J)에서 카스파제 활성이 없는 것을 나타낸다. PAX2 siRNA로 처리한 4일 후, DU145 (C), PC3 (G) 및 LNCaP (K) 세포는 DIC 하에 다시 가시적이었다. 형광 하에, 처리된 DU145 (D), PC3 (H) 및 LNCaP (L) 세포는 녹색 염색을 나타냈고, 이는 카스파제 활성을 나타낸다.
세포자멸 촉진 인자에 대한 PAX2 억제의 효과:
세포 사멸 경로를 모니터링하기 위해 DU145, PC3 및 LNCaP 세포를 PAX2에 대한 siRNA로 6일 동안 처리하고, p53 전사 조절에 의존적 및 비의존적인 세포자멸 촉진 유전자의 발현을 측정하였다. BAX에 대해 LNCaP에서 1.81배 증가, DU145에서 2.73배 증가 및 PC3에서 1.87배 증가하였다 (도 10a). BID의 발현 수준은 LNCaP에서 1.38배 및 DU145에서 1.77배 증가하였다 (도 10b). 그러나, BID 발현 수준은 처리 후 PC3에서 1.44배 감소하였다 (도 10c). BAD의 분석은 LNCaP에서 발현의 2.0배 증가, DU145에서 1.38배 증가 및 PC3에서 1.58배 증가를 보여주었다.
결론
암 요법에서 유의한 진보에도 불구하고, 진행된 질병의 치료에 있어서는 여전히 거의 진행되지 않았다. 전립선암의 성공적인 약물 치료에는 숙주에 대한 최소 임상 효과를 유지하면서 표적 세포에 특이적인 효과를 갖는 치료제의 사용을 요구한다. 암 요법의 목표는 종양-선택적인 세포 사멸을 촉발하기 위한 것이다. 따라서, 상기 사멸에 대한 메카니즘을 이해하는 것은 특이적 치료의 효력을 결정하는데 중요하다.
PAX2 발현에 대한 전립선암 세포 생존의 의존성은 본원에서 제시된다. p53-발현 세포주 LNCaP, p53-돌연변이주 DU145, 및 p53-없는 세포주 PC3에서 관찰된 사멸 사이를 구분하기 위해, PAX2 녹다운의 결과로서 p53 활성화에 이어 일어나는 하류 사건을 검사하였다. 카스파제 활성은 3개의 모든 세포주에서 검출되었고, 이는 프로그래밍된 세포 사멸의 개시를 표시한다. 이와 함께, 세포자멸 촉진 유전자의 발현의 변화를 검사하였다. 여기서, BAX 발현은 3개의 모든 세포주에서 p53 상태에 무관하게 상향조절되었다. 세포자멸 촉진 인자 BAD의 발현은 PAX2 억제 후에 3개의 모든 세포주에서 증가하였다. PAX2 siRNA로 처리한 후, BID 발현은 LNCaP 및 DU145에서 증가하였지만, PC3에서 실제로 감소하였다. 이는 전립선암에서 관찰된 세포 사멸은 p53 발현에 의해 영향을 받지만 그에 의존성이 아님을 나타낸다. p53 상태에 무관한 상이한 세포 사멸 경로를 통한 전립선암 세포에서 세포자멸의 개시는 PAX2가 다른 종양 서프레서를 억제함을 나타낸다.
3. 실시예 3: PAX2 종양유전자의 억제는 전립선암 세포의 DEFB1 - 매개된 사멸을 일으킨다
요약
새로운 암 약물의 개발을 위한 표적으로서 역할을 하는 종양-특이적 분자의 확인은 암 연구에서 주요 목표인 것으로 여겨진다. 실시예 1에서는 전립선암에서 고빈도의 DEFB1 발현 손실이 존재하고, DEFB1 발현의 유도가 안드로겐 수용체 음성-단계 전립선암에서 신속한 세포자멸을 일으킴을 입증하였다. 이들 데이타는 DEFB1이 전립선 종양 억제에서 일정 역할을 하는 것을 보여준다. 또한, DEFB1이 정상 전립선 상피의 면역계의 자연발생 성분인 사실을 감안하면, DEFB1은 부작용이 거의 또는 전혀 없는 실용적인 치료제인 것으로 예상된다. 실시예 2에서는 PAX2 발현의 억제가 p53에 무관하게 전립선암 세포 사멸을 일으킴을 입증하였다. 상기 데이타는 PAX2에 의해 억제되는 추가의 세포자멸 촉진 인자 또는 종양 서프레서가 존재함을 나타낸다. 또한, 데이타는 전립선암에서 과다-발현되는 발암 인자 PAX2가 DEFB1의 전사 억제자임을 보여준다. 본 연구의 목적은 DEFB1 발현 소실이 PAX2 종양유전자의 이상 발현으로 인한 것인지, 및 PAX2를 억제하면 DEFB1-매개된 세포 사멸을 일으키는지의 여부를 결정하기 위한 것이다.
데이타는 DEFB1 발현의 손실이 전사 수준에서 일어남을 보여준다. 또한, DEFB1 프로모터의 컴퓨터에 의한 분석을 통해 DEFB1 TATA 박스 다음에 PAX2 전사 억제자에 대한 GTTCC DNA 결합 부위가 존재함이 밝혀졌다 (도 1). 여기서 제시된 결과는 PAX2 및 DEFB1이 세포 사멸 억제시의 역할을 포함하여 적합한 암 표적의 몇몇 속성을 나타냄을 보여준다. 따라서, DEFB1은 종양 면역에서 일정 역할을 하고, 그의 발현은 PAX2 종양유전자의 치료적 하향조절을 통해 조정된다.
물질 및 방법
RNA 단리 및 정량적 RT - PCR: DEFB1 발현 수준의 변화를 입증하기 위해, PAX2 siRNA 처리 4일 후에 RNA를 수집하였다. 간단히 설명하면, 트립신 처리에 의해 수거한 약 1 x 106 세포로부터 SV 총 RNA 단리 시스템 (프로메가)를 사용하여 총 RNA를 단리하였다. 여기서, 세포를 용해시키고, 총 RNA를 스핀 컬럼을 통한 원심분리에 의해 단리하였다. 두 공급원으로부터의 총 RNA (반응 당 0.5 ㎍)를 랜덤 프라이머 (프로메가)를 이용하여 cDNA로 역전사시켰다. 제조사의 프로토콜에 따라 제1 가닥 합성을 위해 AMV 역전사효소 II 효소 (반응 당 500 단위; 프로메가)를 사용하고, 제2 가닥 합성을 위해 Tfl DNA 중합효소 (반응 당 500 단위; 프로메가)를 사용하였다. 각각의 경우에, 50 pg의 cDNA를 뒤이은 PCR 반응에 대해 사용하였다. 2-단계 QRT-PCR을 TaqMan 역전사 시스템으로부터의 MultiScribe 역전사효소 및 SYBR 그린 PCR 마스터 믹스 (어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 생성된 cDNA에 대해 수행하였다.
DEFB1에 대한 프라이머 쌍을 공개된 DEFB1 서열 (기탁 번호 U50930)로부터 생성하였다. 56℃의 어닐링 온도를 이용하는 표준 조건 하에 40 사이클의 PCR을 수행하였다. 또한, 총 cDNA의 초기 함량을 표준화하기 위해 GAPDH를 하우스키핑 유전자로서 증폭하였다. DEFB1 발현은 DEFB1과 GAPDH 사이의 상대적인 발현비로서 계산하고, PAX2 발현의 siRNA 녹다운 전후의 세포주에서 비교하였다. 모든 반응은 삼중으로 3회 실행하였다.
DEFB1 리포터 구성체의 생성: DEFB1 리포터 활성을 모니터링하기 위해 pGL3 루시퍼라제 리포터 플라스미드를 사용하였다. 여기서, 구역은 DEFB1 전사 개시 부위의 160개 염기 상류이고, DEFB1 TATA 박스를 포함하였다. 구역은 또한 PAX2 결합을 위해 필요한 GTTCC 서열을 포함하였다. PCR 프라이머는 KpnI 및 NheI 제한 부위를 함유하도록 설계하였다. DEFB1 프로모터 PCR 생성물을 KpnI 및 NheI로 제한 소화시키고, 유사하게 제한 소화된 pGL3 플라스미드 내로 라이게이팅하였다 (도 2). 구성체를 이. 콜라이 내로 형질감염시키고, 개별 클론을 선택하고 팽창시켰다. 플라스미드를 단리하고, DEFB1/pGL3 구성체의 서열 통합성을 자동화 서열결정에 의해 확인하였다.
루시퍼라제 리포터 분석: 여기서, 1 ㎍의 DEFB1 리포터 구성체 또는 대조 pGL3 플라스미드를 1x106 DU145 세포 내로 형질감염시켰다. 이어서, 0.5x103 세포를 96-웰 플레이트의 각각의 웰 상에 접종하고, 철야 성장시켰다. 이어서, PAX2 siRNA를 함유하는 신선한 배지 또는 배지 단독을 첨가하고, 세포를 48시간 동안 인큐베이팅하였다. 루시퍼라제를 제조사의 프로토콜 (프로메가)에 따라 BrightGlo 키트에 의해 검출하였고, 플레이트를 Veritas 자동화 96-웰 발광분석기 상에서 판독하였다. 프로모터 활성을 상대적인 발광으로서 표현하였다.
막 투과성의 분석: 세포막 통합성의 변화를 확인하고, 또한 응축된 염색질을 염색함으로써 세포자멸성 세포를 확인하기 위해 아크리딘 오렌지 (AO)/에티듐 브로마이드 (EtBr) 이중 염색을 수행하였다. AO는 생존가능한 세포뿐만 아니라 초기 세포자멸성 세포를 염색하는 반면, EtBr은 막 투과성을 잃은 후기 세포자멸성 세포를 염색한다. 간단히 설명하면, 세포를 2 챔버 (chamber) 배양 슬라이드 (비디 팔콘) 내로 접종하였다. 빈 pIND 플라스미드/pVgRXR 또는 pIND DEFB1/pVgRXR로 형질감염된 세포를 10 μM 포나스테론 A를 함유하는 배지로 24 또는 48 h 동안 유도하였다. 대조군 세포에는 24 및 48h에 신선한 배지를 제공하였다. 막 통합성에 대한 PAX2 억제의 효과를 결정하기 위해, DU145, PC3 및 LNCaP를 함유하는 별도의 배양 슬라이드를 PAX2 siRNA로 처리하고, 4일 동안 인큐베이팅하였다. 이후, 세포를 PBS로 1회 세척하고, AO (시그마) 및 EtBr (프로메가) (5 ㎍/ml) 용액의 혼합물 (1:1) 2 ml로 5 min 동안 염색하였다. 염색 후에, 세포를 PBS로 다시 세척하였다. 형광을 Zeiss LSM 5 Pascal Vario 2 레이저 스캐닝 공초점 현미경 (칼 자이스)에 의해 관찰하였다. 여기 색상환은 BS505-530 (녹색) 및 LP560 (적색) 필터 블록을 함유하고, 이는 AO로부터의 방출된 녹색광을 녹색 채널 (channel) 내로 및 EtBr로부터의 적색광을 적색 채널 내로 분리를 허용한다. 각각의 개별 실험 내의 레이저 출력 (power output) 및 이득 (gain) 제어 세팅은 대조군과 DEFB1 유도된 세포 사이에 동일하였다. 여기는 Kr/Ar 혼합 기체 레이저에 의해 AO에 대해 543 nm 및 EtBr에 대해 488 nm의 파장에서 제공되었다. 슬라이드를 40X 배율 하에 분석하고, 디지탈 영상을 비압축 TIFF 화일로서 저장하고, 영상 처리 및 하드 카피 제시를 위해 Photoshop CS 소프트웨어 (어도비 시스템즈)로 익스포팅하였다.
PAX2 의 ChIP 분석: 염색질 면역침전 (ChIP)은 전사 인자에 의한 프로모터의 생체내 점유 및 면역침전에 의한 전사 인자 결합된 염색질의 농축에 기초하여 DNA-결합 단백질에 대한 결합 부위의 확인을 허용한다. 판햄 (Farnham) 실험실에서 설명된 프로토콜의 변형을 이용하였다 (또한, http://mcardle.oncology.wisc.edu/farnham/ 참조). DU145 및 PC3 세포주는 PAX2 단백질을 과다발현하지만, DEFB1을 발현하지 않는다. 세포를 1.0% 포름알데히드를 함유하는 PBS와 함께 10분 동안 인큐베이팅하여 단백질을 DNA에 가교결합시켰다. 이어서, 샘플을 초음파처리하여 평균 길이 600 bp의 DNA를 수득하였다. 단백질 A Dynabead로 회복시킨 (precleared) 초음파처리된 염색질을 PAX2-특이적 항체 또는 "항체 없는" 대조군 [이소형-매칭된 대조 항체]와 함께 인큐베이팅하였다. 이어서 세척한 면역침전물을 수집하였다. 가교결합의 역전 후, DNA를 DEFB1이 PAX2-면역침전된 샘플 내에서 나타나는지 결정하기 위해 프로모터-특이적 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 분석하였다. 프라이머는 DEFB1 TATA 박스 및 기능적 GTTCC PAX2 인식 부위를 함유한 DEFB1 mRNA 개시 부위의 바로 상류의 160 bp 구역을 증폭하기 위해 설계하였다. 이들 연구에 대해, 양성 대조군은 입력 염색질 (면역침전 전에, 그러나 가교결합이 역전된)의 분취물의 PCR을 포함하였다. 모든 단계를 프로테아제 억제제의 존재 하에 수행하였다.
결과
PAX2 의 siRNA 억제는 DEFB1 발현을 증가시킨다: siRNA 처리 전 DEFB1 발현의 QRT-PCR 분석을 통해 DU145에서 0.00097, PC3에서 0.00001 및 LNCaP에서 0.00004의 상대적인 발현 수준이 밝혀졌다 (도 13). PAX2의 siRNA 녹다운 후, 상대적인 발현은 DU145에서 0.03294 (338배 증가), PC3에서 0.00020 (22.2배 증가) 및 LNCaP에서 0.00019 (4.92배 증가)이었다. 음성 대조군으로서, PAX2 없는 인간 전립선 상피 세포주 (hPrEC)는 처리 전에 0.00687 및 siRNA 처리 후 0.00661의 발현 수준을 밝혔고, 이는 DEFB1 발현에서 통계학적 변화가 없음을 확인한 것이다.
DEFB1 은 세포막 투과성을 일으킨다: 막 통합성을 공초점 분석에 의해 모니터링하였다 (도 14). 여기서, 무손상 세포는 막 투과성인 AO 때문에 녹색으로 착색한다. 또한, 손상된 혈장 막을 갖는 세포는 막 불투과성인 EtBr에 의해 적색으로 착색할 것이다. 여기서, 유도되지 않은 DU145 (A) 및 PC3 (D) 세포는 AO로 명확하게 염색되고 녹색을 방출하였지만, EtBr로 염색되지 않았다. 그러나, DU145 (B) 및 PC3 (E) 모두에서 DEFB1 유도는 24시간에 세포질 내에 EtBr의 축적을 일으켰고, 이는 적색 염색으로 표시된다. 48시간에, DU145 (C) 및 PC3 (F)는 응축된 핵을 갖고 황색으로 보였고, 이는 각각 AO 및 EtBr의 축적으로 인한 녹색 및 적색 염색의 존재 때문이다.
PAX2 의 억제는 막 투과성을 일으킨다: 세포를 PAX2 siRNA로 4일 동안 처리하고, 막 통합성을 공초점 분석에 의해 다시 모니터링하였다. 여기서, DU145 및 PC3은 모두 응축된 핵을 갖고 황색으로 보였다. 그러나, LNCaP 세포의 세포질 및 핵은 siRNA 처리 후 녹색으로 남아있었다. 또한, 세포 주변에서 적색 염색은 세포막 통합성의 유지를 나타낸다. 이들 발견은 PAX2의 억제가 DU145 및 PC3에서 특이적으로 DEFB1-매개 세포 사멸을 일으키지만, LNCaP 세포에서는 그렇지 않음을 나타낸다. LNCaP에서 관찰된 사멸은 PAX2 억제 후 LNCaP에서 기존의 야생형 p53의 전사활성화로 인한 것이다.
PAX2 의 siRNA 억제는 DEFB1 프로모터 활성을 증가시킨다: DEFB1/pGL3 구성체를 함유하는 DU145 세포에서 DEFB1 프로모터 활성의 분석에 의해, 비처리된 세포에 비해 처리 48시간 후에 상대적인 광 단위가 2.65배 증가함이 밝혀졌다. PC3 세포에서, 상대적인 광 단위는 비처리된 세포에 비해 3.78배 증가하였다.
PAX2 는 DEFB1 프로모터에 결합한다: PAX2 전사 억제자가 DEFB1 프로모터에 결합하는지 결정하기 위해 DU145 및 PC3 세포에 대해 ChIP 분석을 수행하였다 (도 15). 레인 1은 100 bp 분자량 마커를 함유한다. 레인 2는 가교결합 및 면역침전 전에 DU145로부터 증폭된 DEFB1 프로모터의 160 bp 구역을 나타내는 양성 대조군이다. 레인 3은 DNA 없이 수행된 PCR을 나타내는 음성 대조군이다. 레인 4 및 5는 각각 가교결합된 DU145 및 PC3으로부터 IgG를 사용하여 수행한 면역침전으로부터 PCR을 나타내는 음성 대조군이다. 가교결합 후 항-PAX2 항체로 면역침전시킨 25 pg의 DNA (레인 6 및 8) 및 50 pg의 DNA (레인 7 및 9)의 PCR 증폭은 DU145 및 PC3에서 각각 160 bp 프로모터 단편을 보여준다.
결론
본 발명의 신규한 데이타는 처음으로 전립선암 종양 면역에서 DEFB1의 역할을 개시한다. 데이타는 또한 발암 인자 PAX2가 DEFB1 발현을 억제하는 것을 보여준다. 데펜신 세포독성의 특성 중 하나는 막 통합성의 파괴이다. 본 발명의 결과는 전립선암 세포에서 DEFB1의 이소성 발현이 손상된 세포막으로 인해 막 전위의 손실을 일으킴을 보여준다. PAX2 단백질 발현을 억제한 후 동일한 현상이 관찰된다. ChIP 분석을 또한 수행하였고, PAX2가 DEFB1 프로모터에 결합하여 DEFB1 발현의 억제를 일으키는 것을 확인하였다. 따라서, PAX2 발현 또는 기능의 억제는 DEFB1 발현의 재-확립 및 후속적으로 DEFB1-매개된 세포 사멸을 일으킨다. 또한, 본 발명의 데이타는 선천 면역을 통한 전립선암 치료를 위한 지향된 요법으로서 DEFB1의 효용성을 확립한다.
4. 실시예 4: DEFB1 의 발현은 종양 축소를 일으킨다
DEFB1을 과다발현하는 종양 세포를 누드 마우스에 주사함으로써 DEFB1의 항-종양 능력을 평가하였다. DEFB1을 양방향성 (bidirectional) 테트라사이클린 책임 (responsible) 프로모터를 갖는 pBI-EGFP 벡터 내로 클로닝하였다. Tet-Off 세포주는 pTet-Off를 DU145, PC3 및 LNCaP 세포 내로 형질감염시키고, G418을 사용하여 선택함으로써 생성하였다. pBI-EGFP-DEFB1 플라스미드를 pTK-Hyg와 함께 Tet-off 세포주 내로 동시-형질감염시키고, 히그로마이신을 사용하여 선택하였다. 생존율이 >90%인 단일-세포 현탁액만을 사용하였다. 각각의 포유동물에 약 500,000 세포를 암컷 누드 마우스의 우측 옆구리 내로 피하 투여하였다. 2개의 군이 존재하였고, 대조군에는 벡터만의 클론을 주사하고, 실험군에는 DEFB1 과다-발현 클론을 주사하였다. 통계학자가 결정한 각각의 군에 35마리의 마우스를 포함시켰다. 동물을 매주 2회 계량하고, 종양 성장을 캘리퍼스 (caliper)로 모니터링하고, 다음 식을 이용하여 종양 부피를 결정하였다: 부피 = 0.5 x (폭)2 x 길이. 종양 크기가 2 mm3에 도달하거나 이식 6개월 후 모든 포유동물을 CO2 과다투여로 희생시키고; 종양을 절제하고, 계량하고, 병리학적 검사를 위해 중성 완충 포르말린 내에 저장하였다. 군들 사이의 종양 성장의 차이는 요약 통계학 및 그래픽 디스플레이를 통해 서술적으로 특성화된다. 통계학적 유의성은 t-시험 또는 비-변수적 동등물 (non-parametric equivalent)로 평가하였다.
5. 실시예 5: PAX2 siRNA 의 발현은 생체 내에서 DEFB1 발현의 상향-조절 및 종양 축소를 일으킨다
시험관내 연구에서 사용된 헤어핀 PAX2 siRNA 템플레이트 올리고뉴클레오티드를 생체 내에서 DEFB1 발현의 상향-조절의 효과를 검사하기 위해 사용하였다. 센스 및 안티센스 가닥 (표 3 참조)을 어닐링시키고, 인간 U6 RNA pol III 프로모터의 제어 하에 pSilencer 2.1 U6 hygro siRNA 발현 벡터 (앰비온) 내로 클로닝하였다. 클로닝된 플라스미드를 서열결정하고, 확인하고, PC3, DU145 및 LNCaP 세포주 내로 형질감염시켰다. 스크램블드 (scrambled) shRNA를 클로닝하고, 본 연구에서 음성 대조군으로서 사용하였다. 히그로마이신 내성 콜로니를 선택하고, 세포를 마우스에 피하 도입시키고, 종양 성장을 상기 설명된 바와 같이 모니터링하였다.
6. 실시예 6: PAX2 결합의 소분자 억제제는 생체 내에서 DEFB1 발현의 상향-조절 및 종양 축소를 일으킨다
PAX2 결합에 대한 DNA 인식 서열은 DEFB1 프로모터 내에 뉴클레오티드 -75 및 -71 사이에 위치한다 [+1은 전사 개시 부위를 나타낸다]. PAX2 DNA-결합 도메인에 대해 상보성인 짧은 올리고뉴클레오티드를 제공하였다. 상기 올리고뉴클레오티드의 예는 아래에 제공된 GTTCC 인식 서열을 함유하는 20량체 및 40량체 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 상기 길이를 무작위로 선택하였고, 다른 길이는 결합의 차단제로서 효과적인 것으로 예상된다. 음성 대조군으로서, 특이성을 입증하기 위해 스크램블드 서열 (CTCTG)를 갖는 올리고뉴클레오티드를 설계하였다. 올리고뉴클레오티드를 리포펙타민 시약 또는 Codebreaker 형질감염 시약 (프로메가, 인크.)를 사용하여 전립선암 세포 및 HPrEC 세포 내로 형질감염시켰다. DNA-단백질 상호작용을 확인하기 위해, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 [32P] dCTP로 표지할 것이고, 전기영동 이동성 이동 분석을 수행하였다. 또한, 올리고뉴클레오티드로 처리한 후 DEFB1 발현을 QRT-PCR 및 웨스턴 분석에 의해 모니터링하였다. 마지막으로, 세포 사멸을 앞서 설명된 바와 같이 MTT 분석 및 유동 세포측정에 의해 검출하였다.
인식 서열 #1: CTCCCTTCAGTTCCGTCGAC (서열 9)
인식 서열 #2: CTCCCTTCACCTTGGTCGAC (서열 10)
스크램블 ( Scramble ) 서열 #1: CTCCCTTCACTCTGGTCGAC (서열 11)
인식 서열 #3: ACTGTGGCACCTCCCTTCAGTTCCGTCGACGAGGTTGTGC (서열 12)
인식 서열 #4: ACTGTGGCACCTCCCTTCACCTTGGTCGACGAGGTTGTGC (서열 13)
스크램블 서열 #2: ACTGTGGCACCTCCCTTCACTCTGGTCGACGAGGTTGTGC (서열 14)
본 발명의 올리고뉴클레오티드의 추가의 예는 다음의 것을 포함한다:
인식 서열 #1: 5'-AGAAGTTCACCCTTGACTGT-3' (서열 24)
인식 서열 #2: 5'-AGAAGTTCACGTTCCACTGT-3' (서열 25)
스크램블 서열 #1: 5'-AGAAGTTCACGCTCTACTGT-3' (서열 26)
인식 서열 #3: 5'-TTAGCGATTAGAAGTTCACCCTTGACTGTGGCACCTCCC-3' (서열 27)
인식 서열 #4: 5'-GTTAGCGATTAGAAGTTCACGTTCCACTGTGGCACCTCCC-3' (서열 28)
스크램블 서열 #2: 5'-GTTAGCGATTAGAAGTTCACGCTCTACTGTGGCACCTCCC-3' (서열 29)
상기 세트의 대안적인 억제성 올리고뉴클레오티드는 PAX2 결합 도메인 및 호메오박스 (homeobox)에 대한 인식 서열 (CCTTG 코어 서열과 함께)을 나타낸다. 이들은 DEFB1 프로모터로부터의 실제 서열을 포함한다.
PAX2 유전자는 전립선을 포함한 각종 암세포의 성장 및 생존에 요구된다. 또한, PAX2 발현의 억제는 선천 면역 성분 DEFB1에 의해 매개된 세포 사멸을 일으킨다. DEFB1 발현 및 활성의 억제는 PAX2 단백질을 DEFB1 프로모터 내의 GTTCC 인식 부위에 결합시켜 달성된다. 따라서, 상기 경로는 전립선암의 치료를 위한 실용적인 치료 표적을 제공한다. 상기 방법에서, 서열은 PAX2 DNA 결합 부위에 결합하고, DEFB1 프로모터에 대한 PAX2의 결합을 차단하여, DEFB1 발현 및 활성을 허용한다. 상기 설명된 올리고뉴클레오티드 서열 및 실험은 PAX2 억제제 약물의 예이고, 추가의 PAX2 억제제 약물의 설계를 위한 모델을 나타낸다.
GTTCC 서열이 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인슐린 수용체 등에 존재한다는 사실을 감안할 때, PAX2는 이들의 발현 및 활성도 조절한다. 따라서, 본원에 개시된 PAX2 억제제는 전립선염 및 양성 전립선 비대 (BPH)를 포함한 염증에 관련된 것을 포함한 많은 다른 질병에서 효용을 갖는다.
7. 실시예 7: DEFB1 발현의 손실은 종양발생을 증가시킨다
기능 손실 마우스의 생성: Cre/loxP 시스템은 전립선 발암의 기초를 이루는 분자 메카니즘을 설명하는데 유용하였다. 여기서, DEFB1 Cre 조건적 KO를 전립선 내에서 유도가능한 파괴를 위해 사용한다. DEFB1 Cre 조건적 KO는 DEFB1 코딩 엑손에 인접하는 loxP 부위를 함유하는 표적화 벡터의 생성, 상기 벡터를 사용한 ES 세포의 표적화, 및 상기 표적화된 ES 세포를 사용하는 생식계열 키메라 마우스의 생성을 포함한다. 이종접합체 (heterozygote)를 전립선-특이적 Cre 트랜스제닉에 교배시키고, 이종접합 잡종을 사용하여 전립선-특이적 DEFB1 KO 마우스를 생성하였다. 4가지 유전자독성 화학적 화합물이 설치류에서 전립선 암종을 유도하는 것으로 밝혀졌다: N-메틸-N-니트로소우레아 (MNU), N-니트로소-비스(2-옥소프로필)아민 (BOP), 3,2-디메틸-4-아미노-비페닐 (MAB) 및 2-아미노-1-메틸-6-페닐이미다졸 [4,5-비]피리딘 (PhIP). DEFB1-트랜스제닉 마우스를 전립선 선종 및 선암종 유도 연구를 위해 이들 발암 화합물로 위내 투여 또는 i.v. 주사를 통해 처리하였다. 전립선 샘플을 조직학적, 면역조직학적, mRNA 및 단백질 분석을 통해 종양 성장의 차이 및 유전자 발현의 변화에 대해 연구하였다.
GOF 마우스의 생성: PAX2 유도가능한 GOF 마우스를 위해, PAX2 GOF (이중-트랜스제닉) 및 야생형 (모노-트랜스제닉) 한배 새끼들에게 전립선-특이적 PAX2 발현을 유도하기 위해 독시사이클린 (Dox)을 5주령에서부터 투여하였다. 간단히 설명하면, PROBASIN-rtTA 모노-트랜스제닉 마우스 (tet-의존 rtTA 유도제의 전립선 세포-특이적 발현)를 본 발명자들의 PAX2 트랜스제닉 응답주에 이종교배하였다. 유도를 위해, 이중-트랜스제닉 마우스에게 음용수를 통해 Dox를 제공하였다 (매주 2회 새로 제조된 500 mg/L). 초기의 실험은 이중-트랜스제닉 마우스에서 트랜스제닉 계통유지주 (founder line)를 사용하여 낮은 배경 수준, 우수한 유도가능성, 및 PAX2 및 EGFP 리포터의 세포-종류 특이적 발현을 확인하였다. 실험군 크기에 관하여, 각 군 (야생형 및 GOF)에서 5-7마리의 연령 및 성별-매칭된 개체가 통계학적 유의성을 허용한다. 본 연구에서 모든 포유동물에 대해, 발암 시간 파라미터를 결정하기 위해 전립선 조직을 분석 및 비교를 위해 초기에 매주 간격으로 수집하였다.
PCR 유전자형 결정, RT - PCR 및 qPCR: PROBASIN-rtTA 트랜스제닉 마우스의 유전자형을 다음 PCR 프라이머 및 조건을 이용하여 결정하였다:
PROBASIN5 (전방향) 5'-ACTGCCCATTGCCCAAACAC-3' (서열 48);
RTTA3 (역방향) 5'-AAAATCTTGCCAGCTTTCCCC-3' (서열 49);
5 min 동안 95℃ 변성 후, 95℃에서 30 sec, 57℃에서 30 sec, 72℃에서 30 sec의 30 사이클 후, 72℃에서 5 min 연장하여 600 bp 생성물을 얻었다. PAX2 유도가능 트랜스제닉 마우스의 유전자형을 다음 PCR 프라이머 및 조건을 이용하여 결정하였다:
PAX2For 5'-GTCGGTTACGGAGCGGACCGGAG-3' (서열 50);
Rev5'IRES 5'-TAACATATAGACAAACGCACACCG-3' (서열 51);
5 min 동안 95℃ 변성 후, 95℃에서 30 sec, 63℃에서 30 sec, 72℃에서 30 sec의 34 사이클 후, 72℃에서 5 min 연장하여 460 bp 생성물을 얻었다. 임모토마우스 (immortomouse) 반접합체를 다음 PCR 프라이머 및 조건을 이용하여 유전자형 결정하였다:
Immol1, 5'-GCGCTTGTGTC GCCATTGTATTC-3' (서열 52);
Immol2, 5'-GTCACACCACAGAAGTAAGGTTCC-3' (서열 53);
94℃ 30 sec, 58℃ 1 min, 72℃ lmin 30 sec, 30 사이클로 ~1kb 도입유전자 밴드를 얻었다. PAX2 녹아웃 마우스를 유전자형 결정하기 위해, 다음 PCR 프라이머 및 조건을 사용하였다:
PAX2For 5'-GTCGGTTACGGAGCGGACCGGAG-3' (서열 54);
PAX2Rev 5'-CACAGAGCATTGGCGATCTCGATGC-3' (서열 55);
94℃ 1 min, 65℃ 1 min, 72℃ 30 sec, 36 사이클로 280 bp 밴드를 얻었다.
DEFB1 펩티드 동물 연구: 찰스 리버 래보래토리즈 (Charles River Laboratories)로부터 구입한 6주령 수컷 무흉선 (누드) 마우스에 106 생존가능한 PC3 세포를 어깨뼈 위에 피하 주사하였다. 주사 1주 후에, 동물을 3개의 군 중 하나에 무작위로 배분하였다 - 제I군: 대조군; 제II군: DEFB1의 복강내 주사, 100 ㎍/일, 매주 5일, 2-14주 동안; 제III군: DEFB1의 복강내 주사, 100 mg/일, 매주 5일, 8-14 동안. 동물을 멸균 하우징 내에, 4마리의 동물을 하나의 케이지에 유지하였고, 매일 관찰하였다. 10일 간격으로, 종양을 캘리퍼스를 사용하여 측정하고, 종양의 부피를 식: V = (L x W2)/2를 이용하여 계산하였다.
QRT-PCR 프라이머의 서열.
센스 (5'-3')
β-액틴 5'-CCTGGCACCCAGCACAAT-3' 서열 30
DEFB1 5'-GTTGCCTGCCAGTCGCCATGAGAACTTCCTAC-3' 서열 31
안티센스 (5'-3')
β-액틴 5'-GCCGATCCACACGGAGTACT-3' 서열 32
DEFB1 5'-TGGCCTTCCCTCTGTAACAGGTGCCTTGAATT-3' 서열 33
PAX2 siRNA 서열. PAX2 단백질 발현 억제에 4개의 siRNA의 풀을 사용.
센스 (5'-3')
서열 A 5'-GAAGUCAAGUCGAGUCUAUUU-3' 서열 15
서열 B 5'-GAGGAAACGUGAUGAAGAUUU-3' 서열 3
서열 C 5'-GGACAAGAUUGCUGAAUACUU-3' 서열 5
서열 D 5'-CAUCAGAGCACAUCAAAUCUU-3' 서열 7
안티센스 (5'-3')
서열 A 5'-AUAGACUCGACUUGACUUCUU-3' 서열 2
서열 B 5'-AUCUUCAUCACGUUUCCUCUU-3' 서열 4
서열 C 5'-GUAUUCAGCAAUCUUGUCCUU-3' 서열 6
서열 D 5'-GAUUUGAUGUGCUCUGAUGUU-3' 서열 8
정량적 RT-PCR 프라이머. PAX2 및 GAPDH 증폭에 사용된 프라이머의 뉴클레오티드 서열.
센스 (5'-3')
GAPDH 5'-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3' 서열 16
BAD 5'-CTCAGGCCTATGCAAAAAGAGGA-3' 서열 17
BID 5'-AACCTACGCACCTACGTGAGGAG-3' 서열 18
BAX 5'-GACACCTGAGCTGACCTTGG-3' 서열 19
안티센스 (5'-3')
GAPDH 5'-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCAACC-3' 서열 20
BAD 5'-GCCCTCCCTCCAAAGGAGAC-3' 서열 21
BID 5'-CGTTCAGTCCATCCCATTTCTG-3' 서열 22
BAX 5'-GAGGAAGTCCAGTGTCCAGC-3' 서열 23
8. 실시예 8: 상피내 종양 및 암의 화학예방을 위한 PAX2 발현의 표적화
요약
돌연변이의 축적 및 세포성 제어 기능의 손실은 정상 조직으로부터 초기 전암, 예를 들어 상피내 종양 (IEN)에서 점점 중증 IEN에서 표재 암에서 마지막으로 침습성 질병으로 진행하는 표현형 변화를 일으킨다. 상기 과정은 일부 경우에 비교적 침습성일 수 있지만, 일반적으로 수년 및 심지어 수십년에 걸쳐 비교적 느리게 일어난다. 바인스타인 (Weinstein) 등에 의해 설명된 바와 같이, 종양유전자 중독은 악성 표현형을 유지하기 위해 단일 종양유전자의 지속적인 활성화 또는 과다발현에 대한 암 세포의 생리학적 의존성이다. 상기 의존성은 신생물성 진행을 표시하는 다른 변화의 환경에서 일어난다. 성장 및 세포 생존을 위한 PAX2 종양유전자에 대한 암 세포의 중독 및 의존이 하나의 그러한 예이다. 이와 반대로, PAX2에 의해 전사상 억제되는 DEFB1과 같은 종양 서프레서 유전자의 부재 유사한 전-암 중독을 부여한다.
암 화학예방은 암의 예방 또는 전-암 상태 또는 훨씬 더 초기의 치료로서 정의된다. 침습성 암으로의 장기간의 진행은 후보 화학예방 약물의 임상 이익을 보여주는 주요한 과학적 기회이지만 또한 경제적인 문제를 야기한다. 따라서, 최근에 화학예방제 개발 연구의 중요한 구성요소는 물질의 임상 이익 또는 암 발생-감소 효과를 정확하게 예측하는 보다 초기의 (암보다) 종점 또는 바이오마커를 확인하는 것이었다. 많은 암에서, IEN은 전립선에서와 같이 초기 종점이다. PAX2/DEFB1 경로가 IEN 동안 및 아마도 훨씬 더 초기의 조직병리학적 상태에서 탈조절된다는 사실이 그를 암의 화학예방을 위한 강력한 예측적 바이오마커 및 뛰어난 표적으로 만든다. 전립선암을 위한 화학예방제로서 효용을 가질 수 있는, PAX2를 억제하고 DEFB1 발현을 증가시키는 많은 화합물을 보여준다.
배경
PAX 유전자는 세포 성장 및 세포자멸을 조절하여, 전립선암에서 강한 생존 신호를 생성시키는 전사 인자 및 유전자의 구조 변경을 통해 원-종양유전자로서 작용할 수 있다. 또한, 몇몇 암은 이상 PAX2 발현을 갖는 것으로 보였다 (도 18). 안지오텐신 II (AngII)는 혈압 및 심혈관 항상성의 주요 조절인자이고, 강력한 미토겐으로서 인정된다. AngII는 G-단백질-커플링된 수용체의 수퍼패밀리에 속하지만 상이한 조직 분포 및 세포내 신호 전달 경로를 갖는 2개의 수용체 아형, 즉, 안지오텐신 타입 I 수용체 (AT1R) 및 안지오텐신 타입 II 수용체 (AT2R)에 대한 결합을 통해 그의 생물학적 효과를 매개한다. 혈압에 대한 그의 효과에 추가로, AngII는 조직 재형성, 예를 들어 상처 치유, 심장 비대 및 발달을 포함한 각종 병리학적 상황에서 일정 역할을 하는 것으로 나타났다. 실제로, 최근의 연구에서는 전립선을 포함한 각종 암 세포 및 조직에서 레닌-안지오텐신 시스템 (RAS)의 몇몇 성분의 국소 발현을 밝혔다. AT1R의 상향조절은 세포자멸 및 성장 조절 요소를 피하는 것을 습득하는 암 세포에 상당한 잇점을 제공한다.
본 연구는 전립선암에서 PAX2 종양유전자의 상향조절이 탈조절된 RAS 신호 전달로 인한 것임을 입증한다. PAX2 발현은 안지오텐신 타입 I 수용체에 의해 매개되는 ERK 1/2 신호전달 경로에 의해 조절된다. 또한, AT1R을 로사르탄 (Los)으로 차단하면 PAX2 발현을 억제한다. 또한, AMPK 활성인자인 AICAR는 또한 잠재적인 PAX2 억제제로서 유망한 것으로 나타났다. 종합하면, 이들 연구는 이들 클래스의 약물을 PAX2 발현의 잠재적인 서프레서로서 및 궁극적으로 신규한 화학예방제로서 역할을 할 수 있음을 강하게 시시한다 (표 5).
화학예방 전략을 위한 후보로서 PAX2 발현 암
PAX2 발현 암 미국에서 추정된새로운 환자22 미국에서 추정된사망22 전세계의 추정된새로운 환자 전세계의 추정된사망
전립선암 234,460 27,350 679,023 221,002
유방암 214,600 41,430 1,151,298 410,712
난소암 20,180 15,310 204,500 124,860
신암 38,890 12,840 208,479 101,895
뇌암 12,820 18,820 189,485 141,650
자궁경부암 9,710 3,700 493,243 273,505
방광암 61,420 13,060 356,556 145,009
백혈병 35,020 22,280 300,522 222,506
카포시 육종 데이타가 이용가능하지 않음 데이타가 이용가능하지 않음 데이타가 이용가능하지 않음 데이타가 이용가능하지 않음
총 (근사치) 627,100 154,790 3,583,106 1,641,139
지금까지, 많은 암은 PAX2를 비정상으로 발현하는 것으로 나타났다. PAX2 발현을 표적화하는 것을 통한 화학예방은 암 관련 사망에 유의한 효과를 가질 수 있다.
물질 및 방법
세포 배양액: 세포주 DU145를 DMEM 배지 내에서 배양하고, PC3을 F12 배지 (라이프 테크놀로지스, 인크.) 내에서 성장시켰다. 3개의 모든 세포주에 대한 성장 배지에 10% (v/v) 태송아지 혈청 (라이프 테크놀로지스)를 보충하였다. hPrEC 세포를 전립선 상피 기초 배지 (캄브렉스 바이오 사이언스, 인크.) 내에서 배양하였다. 모든 세포주를 37℃ 및 5% CO2에서 유지하였다.
시약 및 처리: 세포를 5 또는 10 μM의 AngII, 5 μM의 ATR1 길항제 Los, 5 μM의 ATR2 길항제 PD123319, 25 μM의 MEK 억제제 U0126, 20 μM의 MEK/ERK 억제제 PD98059 또는 250 μM의 AMP 키나제 유도제 AICAR로 처리하였다.
웨스턴 분석: 간단히 설명하면, 세포를 트립신 처리에 의해 수거하고, PBS로 2회 세척하였다. 용해 버퍼를 제조사의 지시 (시그마)에 따라 제조한 후, 세포에 첨가하였다. 4℃에서 회전식 진탕기 상에서 15분의 인큐베이션 기간 후, 세포 용해물을 수집하고 10분 동안 12000xg에서 원심분리하여 세포 파편을 펠렛화하였다. 이어서, 단백질-함유 상등액을 수집하고 정량하였다. 이어서, 25 ㎍ 단백질 추출물을 8-16% 구배 SDS-PAGE (노벡스) 상에 로딩하였다. 전기영동 후, 단백질을 PVDF 막에 전달한 후, TTBS (0.05% Tween 20 및 100mM Tris-Cl) 중의 5% 무지방 건조 우유로 1시간 동안 차단시켰다. 이어서, 블롯을 1차 항체 (항-PAX2, -포스포-PAX2, -JNK, -포스포-JNK, -ERK1/2 또는 -포스포-ERK1/2) (자이메드)로 1:1000-2000 희석으로 프로빙하였다. 세척 후, 막을 호스래디시 퍼옥시다제 (HRP)에 컨쥬게이팅된 항-토끼 항체 (희석 1:5000; 시그마)와 함께 인큐베이팅하고, 신호 검출을 화학발광 시약 (피어스)을 사용하여 Alpha Innotech Fluorchem 8900 상에서 가시화하였다. 대조군으로서, 블롯을 스트리핑하고 마우스 항-β-액틴 1차 항체 (1:5000; 시그마-알드리치) 및 HRP-컨쥬게이팅된 항-마우스 2차 항체 (1:5000; 시그마-알드리치)로 재프로빙하고, 신호 검출을 다시 가시화하였다.
QRT - PCR 분석: PC3 및 DU145 전립선암 세포주 및 hPrEC 정상 전립선 상피 세포에서 PAX2 녹다운 후 유전자 발현의 변화를 확인하기 위해 정량적 실시간 RT-PCR을 수행하였다. 약 1 x 106 세포를 트립신 처리에 의해 수거하고, 세포를 PBS 내에 세정하였다. 이어서, 세포를 용해시키고, SV 총 RNA 단리 시스템 (프로메가)을 사용하여 스핀 컬럼을 통한 원심분리에 의해 총 RNA를 단리하였다. cDNA는 제조사의 프로토콜에 따라 제1 가닥 합성을 위해 Oligo (dT) 15 프라이머 (프로메가) 및 AMV 역전사효소 II 효소 (반응 당 500 단위; 프로메가)에 의한 및 제2 가닥 합성을 위해 Tfl DNA 중합효소 (반응 당 500 단위; 프로메가)에 의한 역전사에 의해 생성하였다 (반응 당 0.5 ㎍). 대개, 50 pg의 각각의 cDNA를 뒤이은 PCR 반응에 대해 사용하였다. 2-단계 QRT-PCR을 TaqMan 역전사 시스템으로부터의 MultiScribe 역전사효소 및 SYBR 그린 PCR 마스터 믹스 (피이 바이오시스템)를 사용하여 생성된 cDNA에 대해 수행하였다. 반응을 MicroAmp 광학 96-웰 반응 플레이트 (피이 바이오시스템) 내에서 수행하였다. 60℃의 어닐링 온도를 이용하는 표준 조건 하에 40 사이클의 PCR을 수행하였다. 정량화는 지수 증폭이 시작되는 사이클수 (역치 값)에 의해 결정하고, 삼중 반복으로부터 얻은 값으로부터 평균하였다. 메세지 수준과 역치 값 사이에 역 관계가 존재하였다. 또한, 총 cDNA의 초기 함량을 표준화하기 위해 GAPDH를 하우스키핑 유전자로서 사용하였다. 상대적인 발현은 각각의 유전자와 GAPDH 사이의 비로서 계산하였다. 모든 반응은 삼중으로 수행하였다.
티미딘 혼입: 세포의 증식은 DNA 내로 [3H] 티미딘 리보타이드 ([3H] TdR) 혼입에 의해 결정하였다. 0.5 x 106 세포/웰의 현탁액 DU145 세포를 그들의 적절한 배지 내에 플레이팅하였다. 세포를 72 h동안 지시된 농도에서 AngII의 존재 하에 또는 부재 하에 인큐베이팅하였다. 세포를 동일한 배지 내의 37 kBq/ml [메틸-3H] 티미딘에 6 h 동안 노출시켰다. 부착 세포를 5% 트리클로로아세트산에 의해 고정하고, SDS/NaOH 용해 버퍼 내에 철야 용해시켰다. 방사성을 베크만 (Beckman) LS3801 액체 섬광 계수기 (캐나다)에 의해 측정하였다. 현탁액 세포 배양액을 세포 수거기 (패커드 인스트루먼트 코. (Packard instrument Co., 미국 커넥티컷주 메리덴))에 의해 수거하고, 방사성을 1450 마이크로베타 액체 섬광 계수기 (퍼킨엘머 라이프 사이언시스)에 의해 측정하였다.
통계학적 분석: 통계학적 차이를 언페어드 값에 대한 스튜던트 t-시험을 이용하여 평가하였다. P 값은 양측 계산에 의해 결정하고, 0.05 미만의 P 값을 통계학상 유의한 것으로 간주하였다.
결과
DU145 전립선암 세포에서 PAX2 발현에 대한 AngII의 효과를 조사하기 위해, AngII로 30 min 내지 48시간 기간에 걸쳐 처리한 후 PAX2 발현을 검사하였다. 도 19에 나타낸 바와 같이, PAX2 발현은 AngII 처리 후 시간이 지남에 따라 점진적으로 증가하였다. DU145를 Los로 처리함으로써 RAS 신호 전달을 차단시키면 PAX2 발현을 유의하게 감소시켰다 (도 20A). 여기서, PAX2 발현은 비처리된 대조군 DU145 세포에 비해 Los 처리의 48시간 후 37%이고, 72시간 후 50%이었다 (도 21). AT2R 수용체가 AT1R의 작용을 방해한다는 것이 공지되어 있다. 따라서, PAX2 발현에 대한 AT2R 수용체를 차단한 효과를 검사하였다. DU145를 AT2R 차단제 PD123319로 처리하면 처리 48시간 후 PAX2 발현을 7배 증가시키고, 96시간 후 8배 증가시켰다 (도 20B). 종합하면, 이들 발견은 PAX2 발현이 ATR1 수용체에 의해 조절되는 것을 입증한다.
AngII는 MAPK의 AT1R-매개된 활성화 및 STAT3 인산화를 통해 전립선암 세포의 증식에 직접적으로 영향을 미치는 것으로 공지되어 있다. DU145를 AngII로 처리하면 증식 속도가 2 내지 3배 증가되었다 (도 21). 그러나, Los로 처리하면 증식 속도가 50% 감소되었다. 또한, Los로 30 min 동안 예비-처리하여 AT1R 수용체를 차단하면 증식에 대한 AngII의 효과가 억제되었다.
PAX2 발현 및 활성화의 조절에서 AT1R 신호 전달의 역할을 더욱 검사하기 위해, PAX2 발현에 대한 MAP 키나제 신호 전달 경로의 다양한 성분을 차단한 효과를 검사하였다. 여기서, MEK 억제제 U0126으로 처리한 DU145 세포에서는 PAX2 발현이 유의하게 감소하였다 (도 22). 또한, MEK/ERK 억제제 PD98059로 처리하면 또한 PAX2가 감소되었다. DU145 세포를 Los로 처리하면 ERK 단백질 수준에 대해 효과가 없지만, 포스포-ERK의 양이 감소되었다 (도 23A). 그러나, DU145를 Los로 처리하면 PAX2 발현이 유의하게 감소되었다. U0126 및 PD98059에서 유사한 결과가 관찰되었다. PAX2 발현은 ERK의 하류 표적인 STAT3에 의해 조절되는 것이 또한 공지되어 있다. DU145를 Los, U0126 및 PD98059로 처리하면 포스포-STAT3 단백질 수준이 감소되었다 (도 23C). 이들 결과는 전립선암 세포에서 PAX2가 AT1R을 통해 조절됨을 입증한다.
또한, JNK에 의한 PAX2 활성화에 대한 AT1R 신호 전달의 효과를 검사하였다. DU145를 Los, U0126 및 PD98059로 처리하면 모두 포스포-PAX2 단백질 수준을 유의하게 감소 또는 억제시켰다 (도 24A). 그러나, Los 및 U0126은 포스포-JNK 단백질 수준을 감소시키지 않았다 (도 24B). 따라서, 포스포-PAX2의 감소는 감소된 PAX2 수준으로 인한 것이고 감소된 인산화로 인한 것이 아닌 것으로 보인다.
5-아미노이미다졸-4-카르복스아미드-1-β-4-리보푸라노시드 (AICAR)가 AMP-키나제 활성인자로서 널리 사용되고, 이는 에너지 항상성 및 대사 스트레스에 대한 반응을 조절한다. 최근의 연구에서는 약물을 사용하여 활성화된 AMPK의 항증식 및 세포자멸 촉진 작용 또는 AMPK 과다발현을 나타냈다. AMPK 활성화는 지방산 합성효소 경로의 억제 및 스트레스 키나제 및 카스파제 3의 유도를 포함하는 다양한 메카니즘에 의해 인간 위암 세포, 폐암 세포, 전립선암, 췌장 세포 및 간 암종 세포에서 세포자멸을 유도하고, 마우스 신경모세포종 세포에서 산화 스트레스 유도된 세포자멸을 향상시키는 것으로 나타났다. 또한, PC3 전립선암 세포를 처리하면 p21, p27 및 p53 단백질의 발현이 증가하고 PI3K-Akt 경로가 억제되었다. 이들 경로는 모두 PAX2에 의해 직접 또는 간접적으로 조절된다. 전립선암 세포를 AICAR로 처리하면 PAX2 발현이 억제되고 (도 23B), 또한 그의 활성화된 형태인 포스포르-PAX2가 억제되었다 (도 24A). 또한, PAX2 발현을 조절하는 포스포-STAT3도 억제되었다 (도 23C).
마지막으로, PAX2의 상향조절 및 과다발현을 일으키는 이상 RAS 신호 전달은 DEFB1 종양 서프레서 유전자의 발현을 억제하는 것으로 가정되었다. 이를 조사하기 위해, 정상 전립선 상피 1차 배양액 hPrEC를 AngII로 처리하고, PAX2 및 DEFB1 발현 수준을 모두 검사하였다. DEFB1과 PAX2 발현 사이의 역관계는 정상 전립선 세포 대 전립선암 세포에서 발견되었다. 비처리된 hPrEC는 PC3 전립선암 세포에서 발현에 비해 10% 상대적인 PAX2 발현을 나타냈다. 이와 반대로, 비처리된 PAX2는 hPrEC에서 발현에 비해 단지 2% 상대적인 DEFB1 발현을 나타냈다. 10 μM의 AngII로 처리한 72시간 후, 비처리된 hPrEC에 비해 DEFB1 발현이 35% 감소하였고, 96시간에는 비처리된 hPrEC 세포에 비해 DEFB1 발현이 50% 감소하였다. 그러나, 72시간에서 비처리된 hPrEC 세포에 비해 PAX2 발현은 66% 증가하였고, 96시간에는 PAX2 발현이 79% 감소하였다. 또한, 72시간 후 hPrEC에서 PAX2 발현의 증가는 PC3 전립선암 세포에서 관찰된 PAX2 수준의 77%이었다. AngII 처리의 96시간 후, PAX2 발현은 PC3에서 PAX2 발현의 89%이었다. 이들 결과는 탈조절된 RAS 신호 전달이 전립선 세포에서 PAX2 발현의 상향조절을 통해 DEFB1 발현을 억제함을 입증한다.
논의
레닌-안지오텐신 시스템 AngII는 혈압 및 심혈관 항상성의 주요 조절인자이고, 강력한 미토겐으로서 인정된다. AngII는 G-단백질-커플링된 수용체의 수퍼패밀리에 속하지만 상이한 조직 분포 및 세포내 신호 전달 경로를 갖는 2개의 수용체 아형, 즉, AT1R 및 AT2R에 대한 결합을 통해 그의 생물학적 효과를 매개한다. AT1R의 상향조절은 세포자멸 및 성장 조절 요소를 피하는 것을 습득하는 암 세포에 상당한 잇점을 제공한다. 또한, 정상 인간 전립선에서 발현 수준에 비해 AT1R의 증가된 발현이 전립선암 조직에서 검출되었다.
현재 AT1R이 대체로 성장 인자 자극과 연관된 단백질 키나제의 다양한 세포내 케스케이드를 활성화함으로써, 인간 암세포를 포함한 다양한 세포 모델에서 세포 증식을 유도하는 것은 잘 확립되어 있다. 가장 특히, AT1R은 전립선암 세포에서 EGFR을 전사활성화시켜, 세포외-조절된 키나제 (ERK) 활성화, 신호 전달자 (Signal Transducer) 및 전사 활성인자 3 (STAT3)의 인산화를 일으킨다. EGFR 증폭이 종종 종양 진행과 연관되기 때문에, EGFR의 AT1R-매개된 전사활성화는 특히 암에 관련된다. 실제로, EGFR에 대한 모노클로날 항체, 예를 들어 Herceptin(등록상표) (제넨테크, 인크. (Genentec, Inc.))을 사용하는 효율적인 항암 전략이 현재 개발되고 있다.
항암 요법에서 항고혈압 약물의 가능한 역할에 최근 관심이 집중되었다. 예를 들어, 실험적 포유동물 모델에서 ACE의 사용은 종양 발달에 대한 이들 약물의 보호 효과를 나타낸다. 또한, 모두 AT1R 길항제인 Los 및 칸데사르탄은 인간 전립선암 세포의 이종이식편 모델에서 종양 성장 및 혈관생성을 감소시키는 것으로 나타났다. 또한, ACE의 상향조절은 양성 전립선 비대에서 검출되었다. PAX2는 PIN 및 전립선암의 환자의 양성 구역에서 상향조절되었다. 따라서, PAX2가 전립선암의 병리생물학에서 개시 사건이고, 전립선암 발달의 예방을 위한 실용적인 화학예방 표적일 수 있다는 것은 타당한 것이다.
세포자멸의 억제는 전립선암의 발달에 기여하는 중요한 병태생리학 인자이다. 암 치료제에서 유의한 진보에도 불구하고, 진행된 질병의 치료에 있어서는 거의 진행되지 않았다. 발암이 다년의 다단계 다경로 질병의 진행임을 고려할 때, 상기 과정을 억제하거나 지연시키거나 역전시키는 약물 또는 다른 물질의 사용을 통한 화학예방은 암 연구의 매우 유망한 영역으로서 인정되었다. 전립선암의 화학예방을 위한 성공적인 약물 치료에는 암 발달을 억제하는 전체 목표를 갖고 숙주에 대한 최소 임상 효과를 유지하면서 표적 세포에 특이적 효과를 갖는 치료제의 사용을 요구한다. 따라서, 초기 발암에서 메카니즘을 이해하는 것은 특이적 치료의 효력을 결정하는데 중요하다. 이상 PAX2 발현 및 그의 세포자멸 폐기와 종양 형성에 대한 후속적인 기여의 중요성은 전립선암 치료를 위한 적합한 표적일 수 있음을 제안한다. PAX2는 전립선암에서 AT1R에 의해 조절된다 (도 26). 이러한 점에서, 탈조절된 RAS 신호 전달은 PAX2 종양유전자 발현을 증가시키고, DEFB1 종양 서프레서의 발현을 감소시켰다. 따라서, AT1R 길항제의 사용은 PAX2 발현을 감소시키고, DEFB1의 재-발현을 통해 전립선암 세포 사멸을 증가시킨다 (도 27). 이들 결과는 레닌-안지오텐신 신호 전달 경로, AMP 키나제 경로, 또는 PAX2 단백질의 불활성화를 포함한 다른 방법 (즉, 항-PAX2 항체 예방접종)을 통해 PAX2 발현을 표적화하는 것이 암 예방을 위한 실용적인 표적일 수 있다는 신규한 발견을 제공한다 (표 6).
화학예방을 위해 PAX2 발현을 억제하기 위해 사용되는 화합물
약물명 약물 클래스
약물 1 로사르탄 안지오텐신 타입 1 수용체 차단제
약물 2 PD123319 안지오텐신 타입 2 수용체 차단제
약물 3 U0126 MEK 억제제
약물 4 PD98059 MEK/ERK 억제제
약물 5 AICAR AMP 키나제 유도제
표적 약물 기능
약물 A 항-PAX2 항체 PAX2 백신
약물 B 안지오텐시노겐 레닌-AngII 경로 억제제
약물 C 안지오텐신 전환 효소 레닌-AngII 경로 억제제
9. 실시예 9: 전립선 조직에 대한 등급화 도구 및 전립선암 발달의 예측인자로서의 PAX2 - DEFB1 발현 수준
물질 및 방법
QRT - PCR 분석: 전립선 절편을 근치적 전립선절제술을 받은 환자로부터 수집하였다. 병리학적 검사 후, 레이저 포획 미세절제를 수행하여 정상, 증식성 상피내 종양 (PIN) 및 암성 조직의 영역을 단리하였다. 앞서 설명된 바와 같이 QRT-PCR을 수행하여 각각의 구역 내의 DEFB1 및 PAX2 발현을 평가하고, GAPDH를 내부 대조군으로서 사용하였다.
혈액 수집 및 RNA 단리: QRT-PCR을 위해, 각각의 개체로부터 혈액 (2.5 ml)을 제조사의 프로토콜에 따라 PAXgene™ 혈액 RNA 튜브 (퀴아겐) 내로 수집하였다. 전체 혈액을 PAXgene 안정화 시약과 충분히 혼합하고, RNA 추출 전에 실온에서 6시간 동안 저장하였다. 이어서, 제조사의 지시 (퀴아겐)에 따라 PAXgene™ 혈액 RNA 키트를 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 오염시키는 게놈 DNA를 제거하기 위해, PAXgene™ 혈액 RNA 시스템 스핀 컬럼에 흡착시킨 총 RNA 샘플을 DNase I (퀴아겐)과 함께 25℃에서 20 min 동안 인큐베이팅하여 게놈 DNA를 제거하였다. 총 RNA를 용출시키고, 정량하고, PAX2 및 DEFB1 발현비를 비교하기 위해 앞서 언급한 바와 같이 QRT-PCR을 수행하였다.
결과
LCM 정상 조직의 QRT-PCR 분석으로 상대적인 DEFB1 발현 수준이 0.005를 초과하는 환자가 발현 수준이 0.005보다 더 낮은 환자에 비해 더 낮은 글리슨 스코어를 갖는 것을 입증하였다 (도 28A). 따라서, DEFB1 발현과 글리슨 스코어 사이에 역관계가 존재한다. 이와 반대로, 악성 전립선 조직 및 PIN에서 PAX2 발현과 글리슨 스코어 사이에 정 상관관계가 존재하였다 (도 28B).
별도의 환자로부터의 정상, PIN 및 암성 조직에서 PAX2 및 DEFB1 발현 수준을 계산하고 비교하였다 (도 29). 종합하면, GAPDH 내부 대조군에 상대적인 PAX2 발현 수준은 정상 (양성) 조직에서 0 내지 0.2, PIN에서 0.2 내지 0.3 및 암성 (악성) 조직에서 0.3 내지 0.5이었다 (도 30). DEFB1에 대해, PAX2에 비해 역관계가 존재하였다. 여기서, GAPDH 내부 대조군에 상대적인 DEFB1 발현 수준은 정상 (양성) 조직에서 0.06 내지 0.005, PIN에서 0.005 내지 0.003 및 암성 (악성) 조직에서 0.003 내지 0.001이었다. 따라서, 양성, 전암성 (PIN) 및 악성 전립선 조직의 예후인자로서 PAX2-DEFB1 발현비를 이용하는 예측 스케일 (DPF)을 개시한다. DPF에 기초하여 PAX2-DEFB1 비가 0 내지 39인 조직은 정상 (병리학적 양성)을 나타낼 것이다. PAX2-DEFB1 비가 40 내지 99인 조직은 DPF 스케일에 기초하여 PIN (전-암성)을 나타낼 것이다. 마지막으로, PAX2-DEFB1 비가 100 내지 500인 조직은 악성일 것이다 (저급 내지 고등급 암).
결론
현재 전립선암 발달에 대한 예측 바이오마커가 매우 필요하다. 전립선암 발병은 현재의 스크리닝 방법, 예를 들어 PSA 시험 또는 직장 수지 검사에 의해 질병을 검출할 수 있기 오래전에 일어나는 것으로 공지되어 있다. 전립선암의 진행 및 초기 발병을 모니터링할 수 있는 신뢰할만한 시험은 보다 효과적인 질병 관리를 통해 사망률을 크게 감소시킬 것으로 생각된다. 의사가 전립선의 병리적 상태에서 진행을 잘 알 수 있도록 하는 예측 지수를 본원에 개시한다. DPF는 전립선 질병 진행과 연관된 PAX2-DEFB1 발현비에서 감소를 측정한다. 이러한 강력한 수단은 환자가 전립선암을 발병할 가능성을 예측할 수 있을 뿐만 아니라, 전-악성 암의 초기 발병을 정확하게 지적할 수 있다. 궁극적으로, 상기 도구를 이용하여 의사는 보다 침습성 질병을 갖는 환자를 그렇지 않은 환자와 분리할 수 있다.
암-특이적 마커의 확인은 또한 순환 종양 세포 (CTC)를 확인하는 것을 돕도록 사용되었다. 말초 혈액에 산재된 종양 세포의 검출이 종양 시기결정, 예후예측, 및 보조 요법의 유효성의 초기 평가를 위한 대용 마커의 확인을 위한 임상적으로 중요한 데이타를 제공할 수 있음을 입증하는 증거가 또한 나타나고 있다. 또한, 모든 순환 세포의 유전자 발현 프로파일링을 비교함으로써, 각각 전립선암의 조기 검출을 위한 예후인자로서 "면역감시" 및 "암 생존"에서 일정 역할을 하는 DEFB1 및 PAX2 유전자의 발현을 검사할 수 있다.
10. 실시예 10: 숙주 방어 펩티드 인간 베타 데펜신 -1의 기능적 분석: 암에서 그의 잠재적인 역할에 대한 새로운 통찰.
물질 및 방법
세포 배양액: 전립선암 세포주를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (미국 버지니아주 매나사스))로부터 입수하였다. DU145 세포를 DMEM 배지 내에서 배양하고, PC3 및 PC3/AR+을 F12 배지 내에서 성장시키고, LNCaP를 RPMI 배지 (라이프 테크놀로지스, 인크.) 내에서 성장시켰다. 3개의 모든 세포주에 대한 성장 배지에 10% (v/v) 태송아지 혈청 (라이프 테크놀로지스)를 보충하였다. hPrEC 1차 배양액을 캄브렉스 바이오 사이언스, 인크.로부터 입수하고, 세포를 전립선 상피 기초 배지 내에서 성장시켰다. 모든 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 유지하였다.
조직 샘플 및 레이저 포획 미세절제: 전립선 조직을 근치적 전립선절제술을 받기 전에 고지에 의한 동의 (informed consent)를 한 환자로부터 입수하였다. 샘플은 임상시험 심사위원회-승인된 프로토콜에 따라 홀링스 암센터 종양 뱅크로부터 획득하였다. 이는 샘플의 처리, 절편생성, 조직학적 특성화, RNA 정제 및 PCR 증폭을 위한 지침을 포함한다. 외과의 및 병리학자로부터 받은 전립선 시료는 OCT 화합물 내에 즉시 동결시켰다. 각각의 OCT 블록을 절단하여 연속 절편을 제공하고, 이를 염색하고 검사하였다. 양성 세포, 전립선 상피내 종양 (PIN) 및 암을 함유하는 영역을 확인하고, Arcturus PixCell II System (미국 캘리포니아주 서니베일)을 사용하여 염색되지 않은 슬라이드로부터 본 발명자들의 선택 구역을 안내하기 위해 사용하였다. 포획된 물질을 함유하는 캡 (cap)을 Arcturus Pico Pure RNA 단리 키트로부터 20 ㎕의 용해물에 노출시키고, 즉시 처리하였다. RNA 양 및 품질은 5' 앰플리콘을 생산하는 프라이머 세트를 이용하여 평가하였다. 세트는 리보솜 단백질 L32 (3' 앰플리콘과 5' 앰플리콘은 298 염기 떨어져 있다), 글루코스 포스페이트 이소머라제 (391 염기 떨어짐) 및 글루코스 포스페이트 이소머라제 (842 염기 떨어짐)에 대한 것을 포함한다. 다양한 제조된 조직으로부터의 샘플을 사용하여 이들 프라이머 세트에 대해 0.95 내지 0.80의 비가 통상적으로 얻어진다. 추가의 종양 및 정상 샘플을 병리학자가 육안 절제하고, 액체 질소 내에 급속 동결시키고, hBD-1 및 cMYC 발현에 대해 평가하였다.
hBD -1 유전자의 클로닝: hBD-1 cDNA를 공개된 hBD-1 서열 (기탁 번호 U50930)로부터 생성된 프라이머를 사용하여 RNA로부터 역전사-PCR에 의해 생성하였다 (Ganz, 2004). PCR 프라이머는 ClaI 및 KpnI 제한 부위를 함유하도록 설계하였다. hBD-1 PCR 생성물을 ClaI 및 KpnI로 제한 소화시키고, TA 클로닝 벡터 내로 라이게이팅하였다. 이어서, TA/hBD1 벡터를 열 충격에 의해 이. 콜라이의 XL-I 블루 균주 내로 형질감염시키고, 개별 클론을 선택하고 팽창시켰다. 플라스미드를 Cell Culture DNA Midiprep (퀴아겐)에 의해 단리하고, 서열 통합성을 자동화 서열결정에 의해 확인하였다. 이어서, hBD-1 유전자 단편을 ClaI 및 KpnI로 소화시킨 pTRE2 내로 라이게이팅하였고, 이는 배향 목적을 위한 중간체 벡터로서 역할을 하였다. pTRE2/hBD-1 구성체를 ApaI 및 KpnI로 소화시켜 hBD-1 삽입체를 삭제하였다. 삽입체를 또한 ApaI 및 KpnI로 이중 소화시킨 엑디손 유도가능 발현 시스템 (인비트로겐)의 pIND 벡터 내로 라이게이팅하였다. 구성체를 이. 콜라이 내로 다시 형질감염시키고, 개별 클론을 선택하고 팽창시켰다. 플라스미드를 단리하고, pIND/hBD-1의 서열 통합성을 다시 자동화 서열결정에 의해 확인하였다.
형질감염: 세포 (1 x 106)를 100-mm 페트리 접시 상에 접종하고, 철야 성장시켰다. 이어서, 세포를 리포펙타민 2000 (인비트로겐)을 사용하여 1 ㎍의 pVgRXR 플라스미드 (이는 이종이량체성 엑디손 수용체를 발현한다) 및 1 ㎍의 pIND/hBD-1 벡터 구성체 또는 pIND/β-갈락토시다제 (β-gal) 대조 벡터로 Opti-MEM 배지 (라이프 테크놀로지스, 인크.) 내에서 동시-형질감염시켰다. 형질감염 효율은 포나스테론 A (PonA)로 β-gal 발현을 유도하고, 세포를 β-갈락토시다제 검출 키트 (인비트로겐)로 염색함으로써 결정하였다. 양성 염색 (청색) 콜로니를 계수함으로써 형질감염 효율의 평가에서는 세포의 60-85%가 세포주에 대해 β-갈락토시다제를 발현하였음을 입증하였다.
면역세포화학: hBD-1 단백질 발현을 입증하기 위해, DU145 및 hPrEC 세포를 2-챔버 배양 슬라이드 (비디 팔콘) 상에 챔버 당 1.5-2 x 104 세포로 접종하였다. pVgRXR 단독으로 (대조군) 또는 hBD-1 플라스미드로 형질감염시킨 DU145 세포를 8 h 동안 10 μM Pon A를 함유하는 배지로 유도시킨 한편, 형질감염되지 않은 세포에는 신선한 성장 배지를 제공하였다. 유도 후, 세포를 1x PBS 내에서 세척하고, 1 h 동안 실온에서 4% 파라포름알데히드로 고정하였다. 이어서, 세포를 1x PBS로 6회 세척하고, 2% BSA, 0.8% 정상 염소 혈청 (벡터 래보래토리즈, 인크. (Vector Laboratories, Inc., 미국 캘리포니아주 벌링에임)) 및 0.4% Triton-X 100을 보충한 1x PBS 내에서 1 h 동안 실온에서 차단하였다. 이어서, 세포를 차단 용액 내에 1:1000의 희석한 1차 토끼 항-인간 BD-1 폴리클로날 항체 (페프로테크 인크. (PeproTech Inc., 미국 뉴저지주 록키 힐)) 내에서 철야 인큐베이팅하였다. 이후, 세포를 차단 용액으로 6회 세척하고, 1 h 동안 실온에서 차단 용액 내에 1:1000의 희석한 알렉사 플루오르 488 염소 항-토끼 IgG (H + L) 2차 항체 내에서 인큐베이팅하였다. 세포를 차단 용액으로 6회 세척한 후, 커버슬립을 Gel Mount (바이오메다 (Biomeda, 미국 캘리포니아주 포스터 시티))를 사용하여 탑재하였다. 마지막으로, 세포를 차등 간섭 대비 (DIC) 하에 및 488 nm에서 레이저 여기 하에 관찰하였다. 형광 신호를 Vario 2 RGB 레이저 스캐닝 모듈을 갖는 63x DIC 오일 렌즈를 사용하는 공초점 현미경 (Zeiss LSM 5 Pascal)에 의해 분석하였다. 디지탈 영상을 영상 처리 및 하드 카피 제시를 위해 Photoshop CS 소프트웨어 (어도비 시스템즈)로 익스포팅하였다.
RNA 단리 및 정량적 RT - PCR: QRT-PCR을 앞서 설명된 바와 같이 수행하였다 (Gibson et al., 2007). 간단히 설명하면, 조직 절편으로부터 총 RNA (반응 당 0.5 ㎍)를 랜덤 프라이머 (프로메가)를 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. 2-단계 QRT-PCR을 TaqMan 역전사 시스템으로부터의 MultiScribe 역전사효소 및 SYBR 그린 PCR 마스터 믹스 (어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 생성된 cDNA에 대해 수행하였다. hBD-1 및 c-MYC에 대한 프라이머 쌍을 공개된 서열 (표 7)로부터 생성하였다. hBD-1 및 c-MYC에 대해 56.4℃ 및 PAX2에 대해 55℃의 어닐링 온도를 이용하는 표준 조건 하에 40 사이클의 PCR을 수행하였다. 또한, 총 cDNA의 초기 함량을 표준화하기 위해 β-액틴 (표 7)을 하우스키핑 유전자로서 증폭하였다. 양성 전립선 조직 샘플에서 유전자 발현은 β-액틴에 비한 발현비로서 계산하였다. 악성 전립선 조직, hPREC 전립선 1차 배양액, 및 유도 전후의 전립선암 세포주에서 hBD-1 발현은 hPrEC 세포에서 hBD-1 발현의 평균 수준에 비해 계산하였다. 음성 대조군으로서, cDNA 템플레이트를 사용하지 않는 QRT-PCR 반응을 또한 수행하였다. 모든 반응은 최소 3회 실행하였다.
MTT 세포 생존율 분석: 세포 성장에 대한 hBD-1의 효과를 검사하기 위해, 대사적 3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드 (MTT) 분석을 수행하였다. pVgRXR 플라스미드 및 pIND/hBD-1 구성체 또는 대조 pVgRXR 플라스미드로 동시-형질감염시킨 DU145, LNCaP, PC3 및 PC3/AR+ 세포를 96-웰 플레이트 상으로 1-5 x 1O3 세포/웰로 접종하였다. 접종 24시간 후에, hBD-1 발현을 유도하기 위해 10 μM Pon A를 함유하는 신선한 성장 배지를 매일 첨가하고, 그의 24, 48 및 72시간 후에 MTT 분석을 제조사의 지시 (프로메가)에 따라 수행하였다. 반응은 삼중으로 3회 수행하였다.
막 통합성의 분석: 세포막 통합성의 변화를 확인하고, 또한 응축된 염색질을 염색함으로써 세포자멸성 세포를 확인하기 위해 아크리딘 오렌지 (AO)/에티듐 브로마이드 (EtBr) 이중 염색을 수행하였다. AO는 생존가능한 세포뿐만 아니라 초기 세포자멸성 세포를 염색하는 반면, EtBr은 손상된 막을 갖는 후기 세포자멸성 세포를 염색한다. 간단히 설명하면, PC3, DU145 및 LNCaP 세포를 2-챔버 배양 슬라이드 (비디 팔콘) 내로 접종하였다. 빈 플라스미드 또는 hBD-1 플라스미드로 형질감염된 세포를 10 μM Pon A를 함유하는 배지로 24 또는 48 h 동안 유도한 한편, 대조군 세포에는 각각의 시점에 신선한 성장 배지를 제공하였다. 유도 후, 세포를 PBS로 1회 세척하고, AO (시그마) 및 EtBr (프로메가) (5 ㎍/ml) 용액의 혼합물 (1:1) 2 ml로 5 min 동안 염색하고, PBS로 다시 세척하였다.
형광을 Zeiss LSM 5 Pascal Vario 2 레이저 스캐닝 공초점 현미경 (칼 자이스)에 의해 관찰하였다. 여기 색상환은 BS505-530 (녹색) 및 LP560 (적색) 필터 블록을 함유하고, 이는 AO로부터의 방출된 녹색광을 녹색 채널 내로 및 EtBr로부터의 적색광을 적색 채널 내로 분리를 허용한다. 각각의 개별 실험 내의 레이저 출력 및 이득 제어 세팅은 대조군과 hBD-1 유도된 세포 사이에 동일하였다. 여기는 Kr/Ar 혼합 기체 레이저에 의해 AO에 대해 543 nm 및 EtBr에 대해 488 nm의 파장에서 제공되었다. 슬라이드를 40x 배율 하에 분석하고, 디지탈 영상을 비압축 TIFF 화일로서 저장하고, 영상 처리 및 하드 카피 제시를 위해 Photoshop CS 소프트웨어 (어도비 시스템즈)로 익스포팅하였다.
QRT-PCR 프라이머의 서열
센스 (5'-3') 안티센스 (5'-3')
β-액틴 CCTGGCACCCAGCACAAT (서열 30) GCCGATCCACACGGAGTACT (서열 32)
hBD-1 TCAGCAGTGGAGGGCAATG (서열 60) CCTCTGTAACAGGTGCCTTGAAT (서열 61)
cMYC ACAGCAAACCTCCTCACAGCC (서열 62) TGGAGACGTGGCACCTCTTG (서열 63)
hBD-1, cMyc, PAX2 및 β-액틴을 증폭하기 위해 사용된 프라이머의 뉴클레오티드 서열
유동 세포측정: hBD-1 발현 시스템으로 형질감염된 PC3 및 DU145 세포를 60-mm 접시에서 성장시키고, 10 μM Pon A로 12, 24 및 48시간 동안 유도하였다. 각각의 인큐베이션 기간 후, 플레이트로부터 배지를 수집하고 (임의의 탈착된 세포를 보유하기 위해), 플레이트를 세척하기 위해 사용된 PBS와 합하였다. 남아있는 부착된 세포는 트립신 처리에 의해 수거하고, 탈착된 세포 및 PBS와 합하였다. 이어서, 세포를 4℃ (500 x g)에서 5 min 동안 펠렛화하고, PBS 내에 2회 세척하고, 5 ㎕의 아넥신 V-FITC 및 5 ㎕의 PI를 함유하는 100 ㎕의 1x 아넥신 결합 버퍼 (0.1 M Hepes/NaOH (pH 7.4), 1.4 M NaCl, 25 mM CaCl2) 내에 재현탁하였다. 세포를 RT에서 15 min 동안 암소에서 인큐베이팅한 후, 400 ㎕의 1x 아넥신 결합 버퍼로 희석하고, FACscan (벡톤 디킨슨)에 의해 분석하였다. 모든 반응을 3회 수행하였다.
카스파제 검출: 전립선암 세포주에서 카스파제 활성의 검출을 APO LOGIX™ 카르복시플루오레신 카스파제 검출 키트 (셀 테크놀로지)를 사용하여 수행하였다. 활성 카스파제는 활성 카스파제에 비가역적으로 결합하는 카르복시플루오레세인 표지된 펩티드 플루오로메틸 케톤 (FAMVAD-FMK)을 사용하여 검출하였다. 간단히 설명하면, hBD-1 발현 시스템을 함유하는 DU145 및 LNCaP 세포 (1.5-3 X 105)를 35 mm 유리 바닥 접시 (마텍)에 플레이팅하고, 24시간 동안 배지 단독으로 또는 앞서 설명된 바와 같이 PonA를 함유하는 배지로 처리하였다. 이어서, FAM-VAD-FMK의 30 x 작업 희석액 10 ㎕을 300 ㎕의 배지에 첨가하고, 각각 35 mm 접시에 첨가하였다. 이어서, 세포를 1 h에서 37℃에서 5% CO2 하에 인큐베이팅하였다. 배지를 흡인하고, 세포를 2 ml의 1 x 작업 희석액 세척 버퍼로 2회 세척하였다. 세포를 차등 간섭 대비 (DIC) 하에 또는 488 nm에서 레이저 여기 하에 관찰하였다. 형광 신호를 상기 설명된 바와 같이 공초점 현미경에 의해 분석하였다.
PAX2 의 siRNA 침묵: siRNA 녹다운 및 확인을 앞서 설명된 바와 같이 수행하였다 (Gibson et al., 2007). 간단히 설명하면, 인간 PAX2 mRNA (기탁 번호 NM_003989.1)를 표적화하는 4개의 상보성 siRNA의 풀을 합성하였다 (다마콘 리써치). 또한, 4개의 비특이적 siRNA의 제2 풀을 PAX2 siRNA의 특이성에 대해 시험하기 위해 내부 대조군으로서 사용하였다. siRNA 분자를 처리 전에 제조사의 지시에 따라 CodeBreaker 형질감염 시약 (프로메가, 인크.)을 사용하여 코팅하였다.
통계학적 분석: 통계학적 차이를 언페어드 값에 대한 스튜던트 t-시험을 이용하여 평가하였다. P 값은 양측 계산에 의해 결정하고, 0.05 미만의 P 값을 통계학상 유의한 것으로 간주하였다. 통계학적 차이는 별표로 표시한다.
결과
전립선 조직에서 hBD -1 발현: 전립선암 동결된 조직 절편의 82%가 hBD-1를 거의 또는 전혀 발현하지 않는 것으로 분석되었다 (Donald et al., 2003). hBD-1 발현 수준을 비교하기 위해, 무작위로 선택된 악성 구역에 인접한 정상 전립선 조직의 육안 절제 또는 LCM에 의해 얻은 정상 전립선 조직에 대해 QRTPCR 분석을 수행하였다. 여기서, hBD-1은 모든 육안 절제된 정상 임상 샘플에서 검출되었고, 발현의 범위는 발현 수준의 약 6.6배 차이를 나타낸다 (도 31A). LCM 포획된 정상 조직 샘플은 발현의 32배 차이를 나타내는 범위의 수준에서 hBD-1을 발현하였다 (도 31B). 샘플 수를 상응하는 환자 프로필에 매칭시키면 대부분의 경우에, hBD-1 발현 수준이 7의 글리슨 스코어를 갖는 환자 샘플에서보다 6의 글리슨 스코어를 갖는 환자 샘플에서 더 높았음이 밝혀졌다. 또한, 동일한 환자 #1343으로부터 육안 절제 및 LCM에 의해 얻은 조직에서 hBD-1 발현 수준의 비교는 2가지 단리 기술 사이에서 발현의 854배 차이를 입증하였다. 따라서, 이들 결과는 LCM이 전립선 조직에서 hBD-1 발현을 평가하기 위해 보다 민감한 기술을 제공함을 나타낸다.
전립선 세포주에서 hBD -1 발현: hBD-1 발현 시스템으로 형질감염시킨 후 전립선암 세포주에서 hBD-1의 상향조절을 확인하기 위해, QRTPCR을 수행하였다. 또한, 템플레이트가 없는 음성 대조군을 또한 수행하였고, 증폭 생성물을 겔 전기영동에 의해 확인하였다. 여기서, hBD-1 발현은 hPrEC 세포에 비해 전립선암 세포주에서 유의하게 더 낮았다. 24 h 유도 기간 후, hBD-1의 상대적인 발현 수준은 hBD-1 유도 전의 세포주에 비해 DU145, PC3 및 LNCaP에서 유의하게 증가하였다 (도 32A).
이어서, hBD-1의 단백질 발현이 면역세포화학에 의해 PonA를 사용한 유도 후 hBD-1 발현 시스템으로 형질감염시킨 DU145 세포에서 확인되었다. 양성 대조군으로서, hBD-1 발현 hPrEC 전립선 상피 세포를 또한 검사하였다. 세포를 hBD-1에 대한 1차 항체로 염색하고, 단백질 발현을 2차 항체의 녹색 형광에 기초하여 모니터링하였다 (도 32B). DIC 하의 세포의 분석으로 18 h에서 hBD-1 발현에 대해 유도된 hPrEC 세포 및 DU145 세포의 존재를 확인하였다. 488 nm에서 공초점 레이저에 의한 여기로 녹색 형광을 생성하였고, 이는 양성 대조군으로서 hPrEC 내에 hBD-1 단백질의 존재를 나타낸다. 그러나, 대조군 DU145 세포 및 빈 플라스미드 유도된 DU145 세포에서 검출가능한 녹색 형광이 없었고, 이는 hBD-1 발현이 없음을 나타낸다. hBD-1 발현을 위해 유도된 DU145 세포의 공초점 분석을 통해 녹색 형광이 밝혀졌고, 이는 Pon A를 사용한 유도 후 hBD-1 단백질의 존재를 나타낸다.
hBD -1의 발현은 세포 생존율을 감소시킨다: DU145, PC3, PC3/AR+ 및 LNCaP 전립선암 세포주에서 상대적인 세포 생존율에 대한 hBD-1 발현의 효과를 평가하기 위해 MTT 분석을 수행하였다. 빈 벡터를 사용하는 MTT 분석에서는 세포 생존율에서 통계학상 유의한 변화를 보이지 않았다. hBD-1 유도 24시간 후, 상대적인 세포 생존율은 DU145에서 72% 및 PC3 세포에서 56%이고, 48 h 후에 세포 생존율은 DU145에서 49% 및 PC3 세포에서 37%로 감소하였다 (도 33A). hBD-1 유도의 72 h 후에, 상대적인 세포 생존율은 DU145에서 44% 및 PC3 세포에서 29%로 더욱 감소하였다. 이와 반대로, LNCaP 세포의 생존율에 대해서는 유의한 효과가 없었다. LNCaP에서 관찰된 hBD-1 세포독성에 대한 내성이 안드로겐 수용체 (AR)의 존재로 인한 것인지를 평가하기 위해, PC3 세포에서 hBD-1 세포독성을 이소성 AR 발현 (PC3/AR+)과 함께 검사하였다. 여기서, PC3/AR+과 PC3 세포 사이에 차이가 없었다. 따라서, 데이타는 hBD-1이 후기 전립선암 세포에 특이적으로 세포독성임을 나타낸다.
PC3 및 DU145에 대한 hBD-1의 효과가 세포증식 억제성인지 세포독성인지 결정하기 위해, 세포 사멸을 측정하기 위해 FACS 분석을 수행하였다. 정상 성장 조건 하에, PC3 및 DU145 배양액의 90% 초과가 생존가능하고 비-세포자멸성이고 (하부 좌측 4분면), 아넥신 V 또는 PI로 염색되지 않았다 (도 4). PC3 세포에서 hBD-1 발현을 유도한 후, 초기 세포자멸 및 후기 세포자멸/괴사를 겪는 세포의 수 (각각 하부 및 상부 우측 4분면)는 총계가 12 h에서 10%, 24 h에서 20% 및 48 h에서 44%이었다. DU145 세포에 대해, 초기 세포자멸 및 후기 세포자멸/괴사를 겪는 세포의 수는 총계가 12 h 후 12%, 24 h에서 34% 및 유도 48 h 후 59%이었다. PonA로 유도한 후 빈 플라스미드를 함유한 세포에서는 세포자멸의 증가가 관찰되지 않았다. 아넥신 V 및 프로피듐 요오다이드 흡수 연구에서는 hBD-1이 DU145 및 PC3 전립선암 세포에 대해 세포독성 활성을 갖고, 결과는 세포 사멸의 메카니즘으로서 세포자멸을 나타냄을 입증하였다.
hBD -1은 막 통합성 및 카스파제 활성화를 변경시킨다: hBD-1 유도 후 전립선암 세포에서 관찰된 세포 사멸이 카스파제-매개된 세포자멸인지 조사하였다. hBD-1 발현에 관여되는 세포성 메카니즘을 보다 잘 이해하기 위해, hBD-1 발현에 대해 유도된 DU145 및 LNCaP 세포에 대해 공초점 레이저 현미경 분석을 수행하였다 (도 5). 활발하게 세포자멸을 겪는 세포에서 카스파제에 대한 녹색 형광을 내는 FAM-VAD-FMK의 결합 및 절단에 기초하여 팬-카스파제 활성화를 모니터링하였다. DIC 하에 세포의 분석은 0 h에서 생존가능한 대조군 DU145 (도 5A) 및 LNCaP (도 5E) 세포의 존재를 보여주었다. 488 nm에서 공초점 레이저에 의한 여기는 검출가능한 녹색 염색을 생산하지 않았고, 이는 DU145 (도 5B) 또는 LNCaP (도 5F) 대조군 세포에서 카스파제 활성이 없음을 나타낸다. 24 h 동안 유도시킨 후, DU145 (도 5C) 및 LNCaP (도 5G) 세포는 다시 DIC 하에 가시적이었다. 형광 하의 공초점 분석을 통해 DU145 (도 5D) 세포에서 녹색 염색이 밝혀졌고, 이는 hBD-1 발현의 유도 후 팬-카스파제 활성을 나타낸다. 그러나, hBD-1 발현에 대해 유도된 LNCaP (도 5H) 세포에서 녹색 염색이 없었다. 따라서, hBD-1의 유도 후 관찰된 세포 사멸은 카스파제-매개된 세포자멸이다.
데펜신 펩티드의 항균 활성의 제안된 메카니즘은 공극 형성으로 인한 미생물 막의 파괴이다 (Papo and Shai, 2005). hBD-1 발현이 막 통합성을 변경시키는지 결정하기 위해, EtBr 흡수를 공초점 분석에 의해 검사하였다. 무손상 세포는 막 투과성인 AO 때문에 녹색으로 착색한 반면, 손상된 혈장 막만을 갖는 세포는 막 불투과성 EtBr의 혼입으로 인해 적색으로 착색하였다. 대조군 DU145 및 PC3 세포는 AO로 양성으로 염색되고 녹색을 방출하였지만, EtBr로 염색되지 않았다. 그러나, DU145 및 PC3 모두에서 hBD-1 유도는 적색 염색으로 표시되는 바와 같이 24 h에 세포질 내에 EtBr을 축적시켰다. 48 h에, DU145 및 PC3은 응축된 핵을 갖고, 각각 AO 및 EtBr로부터의 녹색 및 적색 염색의 동시-국재화로 인해 황색으로 나타났다. 이와 반대로, 유도 48 h 후에 LNCaP 세포에서는 AO를 사용한 양성 녹색 형광, 그러나 적색 EtBr 형광의 결핍으로 표시되는 바와 같이 막 통합성에서 관찰가능한 변경이 없었다. 상기 발견은 hBD-1 발현에 반응한 막 통합성 및 투과성에 대한 변경이 초기 및 후기 전립선암 세포 사이에 상이함을 나타낸다.
hBD -1 및 cMYC 발현 수준의 비교: 3명의 환자로부터의 LCM 전립선 조직 절편에 대해 QRT-PCR 분석을 수행하였다 (도 34). 환자 #1457에서, hBD-1 발현은 정상으로부터 PIN으로 2.7배 감소, PIN으로부터 종양으로 3.5배 감소 및 정상으로부터 종양으로 9.3배 감소를 보였다 (도 34A). 마찬가지로, cMYC 발현은 환자 #1457에서 유사한 발현 패턴을 따랐고, 여기서 발현은 정상으로부터 PIN으로 1.7배, PIN으로부터 종양으로 1.7배 및 정상으로부터 종양으로 2.8배 감소하였다 (도 34B). 또한, 다른 2명의 환자에서 cMYC 발현이 통계학상 유의하게 감소하였다. 환자 #1569에서는 정상으로부터 PIN으로 2.3배 감소한 반면, 환자 #1586에서는 정상으로부터 PIN으로 1.8배 감소, PIN으로부터 종양으로 4.3배 감소 및 정상으로부터 종양으로 7.9배 감소하였다.
PAX2 억제 후 hBD -1 발현의 유도: hBD-1 발현을 조절하는데 있어서 PAX2의 역할을 추가로 검사하기 위해, siRNA를 사용하여 PAX2 발현을 녹다운시키고, hBD-1 발현을 모니터링하기 위해 QRT-PCR을 수행하였다. hPrEC 세포를 PAX2 siRNA로 처리하면 hBD-1 발현에 대해 효과를 나타내지 않았다 (도 35). 그러나, PAX2 녹다운은 비처리된 세포에 비해 hBD-1의 발현을 LNCaP에서 42배 증가, PC3에서 37배 증가 및 DU145에서 1026배 증가시켰다. 음성 대조군으로서, 세포를 비-특이적 siRNA로 처리하였고, 이는 hBD-1 발현에 대해 유의한 효과가 없었다.
11. 실시예 11: PAX2 발현의 억제는 p53 상태가 상이한 전립선암 세포에서 대안적인 세포 사멸 경로를 생성시킨다
물질 및 방법
세포주: 모두 p53 돌연변이 상태가 상이한 암 세포주 PC3, DU145 및 LNCaP를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션으로부터 입수하였다. PC3 세포를 모두 10% (v/v) 태송아지 혈청을 보충한 F-12 배지 내에서, DU145를 DMEM 내에서, LNCaP를 RPMI 내에서 성장시켰다. 전립선 상피 세포주 HPrEC를 캄브렉스 바이오 사이언스, 인크.로부터 입수하고, 전립선 상피 기초 배지 내에서 배양하였다. 세포를 37℃에서 5% CO2 내에서 유지하였다.
PAX2 의 siRNA 침묵: PAX2 의 siRNA 침묵: 효율적인 유전자 침묵을 달성하기 위해, 인간 PAX2 mRNA (기탁 번호 NM_003989.1)를 표적화하는 4개의 상보성 짧은 간섭 리보뉴클레오티드 (siRNA)의 풀을 합성하였다 (다마콘 리써치). 특이성을 보장하기 위해, siRNA는 PAX 패밀리의 다른 멤버의 후속적인 녹다운을 방지하도록 PAX2 서열에 독특한 구역을 표적화하도록 설계하였다. 또한, 4개의 siRNA의 제2 풀을 PAX2 siRNA의 특이성에 대해 시험하기 위해 내부 대조군으로서 사용하였다. 합성된 서열 중 2개는 GL2 루시퍼라제 mRNA (기탁 번호 X65324)를 표적화하고, 다른 2개는 스크램블드 PAX2 mRNA를 표적화하였다 (표 9).
웨스턴 분석: 간단히 설명하면, 세포를 트립신 처리에 의해 수거하고, PBS로 2회 세척하였다. 용해 버퍼를 제조사의 지시 (시그마)에 따라 제조한 후, 세포에 첨가하였다. 4℃에서 회전식 진탕기 상에서 15분 인큐베이션 기간 후, 세포 용해물을 수집하고 10분 동안 12000xg에서 원심분리하여 세포 파편을 펠렛화하였다. 이어서, 단백질-함유 상등액을 수집하고 정량하였다. 이어서, 25 ㎍ 단백질 추출물을 8-16% 구배 SDS-PAGE (노벡스) 상에 로딩하였다. 전기영동 후, 단백질을 PVDF 막에 전달한 후, TTBS (0.05% Tween 20 및 100mM Tris-Cl) 중의 5% 무지방 건조 우유로 1 h 동안 차단시켰다. 이어서, 블롯을 토끼 항-PAX2 1차 항체 (자이메드)를 사용하여 1:1000 희석비로 프로빙하였다. 세척 후, 막을 호스래디시 퍼옥시다제 (HRP)에 컨쥬게이팅된 항-토끼 항체 (희석 1:5000; 시그마)와 함께 인큐베이팅하고, 신호 검출을 화학발광 시약 (피어스)을 사용하여 Alpha Innotech Fluorchem 8900 상에서 가시화하였다. 대조군으로서, 블롯을 스트리핑하고 마우스 항-β-액틴 1차 항체 (1:5000; 시그마-알드리치) 및 HRP-컨쥬게이팅된 항-마우스 2차 항체 (1:5000; 시그마-알드리치)로 재프로빙하고, 신호 검출을 다시 가시화하였다.
전립선암 세포주에서 p53 유전자 돌연변이
세포주 뉴클레오티드 변화 아미노산 변화 유전자 상태 참조문
DU145 CCT-CTT Pro-Leu 기능의 획득/손실 Tepper et al. 2005;Bodhoven et al. 2003
GTT-TTT Val-Phe
PC3 C 결실, GCC-GC 프레임-이동 활성 없음 Isaacs et al. 1991
LNCaP 결실없음, 야생형 - 정상 기능 Carroll et al. 1993
PAX2 siRNA 서열
서열 센스 (5'-3') 안티센스 (5'-3')
A GAAGUCAAGUCGAGUCUAUUU (서열 X) AUAGACUCGACUUGACUUCUU (서열 X)
B GAGGAAACGUGAUGAAGAUUU (서열 X) AUCUUCAUCACGUUUCCUCUU (서열 X)
C GGACAAGAUUGCUGAAUACUU (서열 X) GUAUUCAGCAAUCUUGUCCUU (서열 X)
D CAUCAGAGCACAUCAAAUCUU (서열 X) GAUUUGAUGUGCUCUGAUGUU (서열 X)
위상 대조 현미경: 세포 성장에 대한 PAX2 녹다운의 효과를 위상 대조 현미경에 의해 분석하였다. 여기서, 1-2 x 104 세포를 6-웰 배양 플레이트 (비디 팔콘) 상에 철야 접종하였다. 이어서, 세포를 배지 단독으로, 음성 대조군 비-특이적 siRNA 또는 PAX2 siRNA로 처리하고, 6일 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 세포를 도립 Zeiss IM 35 현미경 (칼 자이스) 하에 관찰하였다. 세포 영역의 위상 대조 사진은 SPOT Insight Mosaic 4.2 카메라 (다이어그노스틱 인스트루먼츠)를 사용하여 얻었다.
MTT 세포독성 분석: DU145, PC3 및 LNCaP 세포 현탁액을 희석하고, 96-웰 플레이트 상에 1-5 x 103 세포/웰로 접종하였다. 이어서, 세포를 제조사의 프로토콜 (프로메가)에 따라 5 pg/세포의 PAX2 siRNA 풀, 대조군 siRNA 풀, 또는 Codebreaker 형질감염 시약 단독으로 형질감염시켰다. 모든 세포를 처리 후 2, 4 또는 6일 동안 성장시켰다. 이어서, 세포 생존율을 3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드, MTT (프로메가)의 착색된 포르마잔 생성물로의 전환을 측정함으로써 결정하였다. 흡광도는 540 nm에서 스캐닝 다중-웰 분광광도계 상에서 판독하였다.
팬- 카스파제 검출: 전립선암 세포주에서 카스파제 활성의 검출을 APO LOGIX™ 카르복시플루오레신 카스파제 검출 키트 (셀 테크놀로지)를 사용하여 수행하였다. 활성 카스파제는 활성 카스파제에 비가역적으로 결합하는 FAMVAD-FMK 억제제를 사용하여 검출하였다. 간단히 설명하면, 1-2 X 104개의 세포를 35 mm 유리 바닥 마이크로웰 접시 (마텍) 상에 플레이팅하고, 배지 단독으로 또는 앞서 설명된 바와 같이 PAX2 siRNA로 처리하였다. 이어서, 300 ㎕의 카르복시플루오레세인 표지된 펩티드 플루오로메틸 케톤 (FAM-VAD-FMK)을 각각의 35 mm 접시에 첨가하고, 1 h 동안 37℃에서 5% CO2 하에 인큐베이팅하였다. 마지막으로, 세포를 2 ml의 세척 버퍼로 2회 세척하고, 차등 간섭 대비 (DIC) 하에 또는 488 nm에서 레이저 여기 하에 관찰하였다. 형광 신호를 Vario 2 RGB 레이저 스캐닝 모듈을 갖는 Zeiss LSM 5 Pascal 공초점 현미경을 사용하여 분석하였다.
정량적 실시간 RT - PCR: PC3, DU145 및 LNCaP 세포주에서 PAX2 녹다운 후 유전자 발현의 변화를 확인하기 위해, 정량적 실시간 RT-PCR을 수행하였다. 약 1 x 106 세포를 트립신 처리에 의해 수거하고, 세포를 PBS 내에 세정하였다. 이어서, 세포를 용해시키고, SV 총 RNA 단리 시스템 (프로메가)을 사용하여 스핀 컬럼을 통한 원심분리에 의해 총 RNA를 단리하였다. cDNA는 제조사의 프로토콜에 따라 제1 가닥 합성을 위해 Oligo (dT) 15 프라이머 (프로메가) 및 AMV 역전사효소 II 효소 (반응 당 500 U; 프로메가)에 의한 및 제2 가닥 합성을 위해 Tfl DNA 중합효소 (반응 당 500 U; 프로메가)에 의한 역전사에 의해 생성하였다 (반응 당 0.5 ㎍). 대개, 50 pg의 각각의 cDNA를 뒤이은 PCR 반응에 대해 사용하였다. 2-단계 QRT-PCR을 TaqMan 역전사 시스템으로부터의 MultiScribe 역전사효소 및 SYBR 그린 PCR 마스터 믹스 (피이 바이오시스템)를 사용하여 생성된 cDNA에 대해 수행하였다. BAX, BID, BCL-2, AKT 및 BAD에 대한 프라이머 쌍을 공개된 서열로부터 생성하였다 (표 10). 반응을 MicroAmp 광학 96-웰 반응 플레이트 (피이 바이오시스템)에서 수행하였다. 60℃의 어닐링 온도를 이용하는 표준 조건 하에 40 사이클의 PCR을 수행하였다. 정량화는 지수 증폭이 시작되는 사이클수 (역치 값)에 의해 결정하고, 삼중 반복으로부터 얻은 값으로부터 평균하였다. 메세지 수준과 역치 값 사이에 역 관계가 존재하였다. 또한, 총 cDNA의 초기 함량을 표준화하기 위해 GAPDH를 하우스키핑 유전자로서 사용하였다. 상대적인 발현은 각각의 유전자와 GAPDH 사이의 비로서 계산하였다. 모든 반응은 삼중으로 수행하였다.
정량적 RT-PCR 프라이머
센스 (5'-3') 안티센스 (5'-3')
GAPDH CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA (서열 16) TCTAGACGGCAGGTCAGGTCAACC (서열 20)
BAD CTCAGGCCTATGCAAAAAGAGGA (서열 17) GCCCTCCCTCCAAAGGAGAC (서열 21)
BID AACCTACGCACCTACGTGAGGAG (서열 18) CGTTCAGTCCATCCCATTTCTG (서열 22)
BAX GACACCTGAGCTGACCTTGG (서열 19) GAGGAAGTCCAGTGTCCAGC (서열 23)
BCL-2 TATGATACCCGGGAGATCGTGATC (서열 65) GTGCAGATGCCGGTTCAGGTACTC (서열 66)
AKT TCAGCCCTGGACTACCTGCA (서열 67) GAGGTCCCGGTACACCACGT (서열 68)
막 투과성 분석: 세포막 통합성의 변화를 확인하고, 또한 응축된 염색질을 염색함으로써 세포자멸성 세포를 확인하기 위해 아크리딘 오렌지 (AO)/에티듐 브로마이드 (EtBr) 이중 염색을 수행하였다. AO는 생존가능한 세포뿐만 아니라 초기 세포자멸성 세포를 염색하는 반면, EtBr은 손상된 막 통합성을 갖는 후기 세포자멸성 세포를 염색한다. 간단히 설명하면, PC3 및 LNCaP 세포를 2-챔버 배양 슬라이드 (비디 팔콘) 내로 접종하고, 세포를 PAX2 siRNA, 비-특이적 siRNA 또는 배지 단독으로 형질감염시켰다. 처리 후, 세포를 PBS로 1회 세척하고, AO (시그마) 및 EtBr (프로메가) (5 ㎍/ml) 용액의 혼합물 (1:1) 2 ml로 5 min 동안 염색하였다. 염색 후, 세포를 PBS로 다시 세척하였다. 형광을 Zeiss LSM 5 Pascal Vario 2 레이저 스캐닝 공초점 현미경 (칼 자이스)에 의해 관찰하였다. 여기 색상환은 BS505-530 (녹색) 및 LP560 (적색) 필터 블록을 함유하고, 이는 AO로부터의 방출된 녹색광을 녹색 채널 내로 및 EtBr로부터의 적색광을 적색 채널 내로 분리를 허용한다. 각각의 개별 실험 내의 레이저 출력 및 이득 제어 세팅은 대조군과 PAX2 siRNA 처리된 세포 사이에 동일하였다. 여기는 Kr/Ar 혼합 기체 레이저에 의해 AO에 대해 543 nm 및 EtBr에 대해 488 nm의 파장에서 제공되었다. 슬라이드를 40X 배율 하에 분석하고, 디지탈 영상을 비압축 TIFF 화일로서 저장하고, 영상 처리 및 하드 카피 제시를 위해 Photoshop CS 소프트웨어 (어도비 시스템즈)로 익스포팅하였다.
통계학적 분석: 통계학적 차이를 언페어드 값에 대한 스튜던트 t-시험을 이용하여 평가하였다. P 값은 양측 계산에 의해 결정하고, 0.05 미만의 P 값을 통계학상 유의한 것으로 간주하였다.
결과
전립선 세포에서 PAX2 단백질 발현의 분석: PAX2 단백질 발현을 HPrEC 전립선 1차 배양액에서 및 LNCaP, DU145 및 PC3 전립선암 세포주에서 웨스턴 분석에 의해 검사하였다. 여기서, PAX2 단백질은 모든 전립선암 세포주에서 검출되었다 (도 36A). 그러나, HPrEC에서 PAX2 단백질이 검출가능하지 않았다. 블롯을 스트리핑하고, 동일한 로딩을 보장하기 위해 내부 대조군으로서 β-액틴에 대해 재-프로빙하였다. DU145, PC3 및 LNCaP 전립선암 세포주에서 PAX2 특이적 siRNA에 의한 선택적인 표적화 및 억제 후 PAX2 단백질 발현을 또한 모니터링하였다. 세포를 6일 처리 기간에 걸쳐 PAX2 siRNA의 풀로 단일 라운드 형질감염시켰다. PAX2 단백질은 배지 단독으로 처리된 대조군 세포에서 발현되었다. PAX2 mRNA의 특이적 표적화는 3개의 모든 세포주에서 PAX2 단백질의 녹다운을 관찰함으로써 확인하였다 (도 36B).
전립선암 세포 성장에 대한 PAX2 녹다운의 효과: 세포수 및 세포 생존율에 대한 PAX2 siRNA의 효과를 광학 현미경 및 MTT 분석을 이용하여 분석하였다. 세포수에 대한 PAX2 siRNA의 효과를 검사하기 위해, PC3, DU145 및 LNCaP 세포주를 6일의 기간에 걸쳐 배지 단독, 비-특이적 siRNA 또는 PAX2 siRNA로 형질감염시켰다. 배지 단독을 함유하는 60 mm 배양 접시에서 각각의 세포주는 80-90%의 융합도에 도달하였다. HPrEC, DU145, PC3 및 LNCaP 세포를 비-특이적 siRNA로 처리하면 배지만으로 처리한 세포에 비해 세포 성장에 대해 효과가 거의 또는 전혀 없는 것으로 나타났다 (각각 도 38A, 38C 및 38E). PAX2-없는 세포주 HPrEC를 PAX2 siRNA로 처리하면 세포 성장에 대해 유의한 효과가 없는 것으로 나타났다 (도 37B). 그러나, 전립선암 세포주 DU145, PC3 및 LNCaP를 PAX2 siRNA로 처리하면 세포수를 유의하게 감소시켰다 (각각 도 38D, 38F 및 38H).
전립선암 세포 생존율에 대한 PAX2 녹다운의 효과: 2, 4 및 6일 노출 시간 후 세포 생존율을 측정하였다. % 생존율은 비처리된 대조군 세포의 값으로 나눈 PAX2 siRNA로 처리된 세포의 570-630 nm 흡광도의 비로서 계산하였다. 음성 대조군으로서, 음성 대조군 비-특이적 siRNA를 사용한 각각의 처리 기간 또는 시약만을 사용한 형질감염 후에 세포 생존율을 측정하였다. 상대적인 세포 생존율은 PAX2 siRNA 처리 후 % 생존율을 비-특이적 siRNA로 처리한 후 % 생존율로 나누어서 계산하였다 (도 38). 처리 2일 후, 상대적인 생존율은 DU145에서 116%, PC3에서 81% 및 LNCaP에서 98%이었다. 처리 4일 후, 상대적인 세포 생존율은 DU145에서 69%, PC3에서 79% 및 LNCaP에서 80%로 감소하였다. 마지막으로, 6일에, 상대적인 생존율은 DU145에서 63%, PC3에서 43% 및 LNCaP에서 44%이었다. 또한, 형질감염 시약 단독으로 처리한 후 세포 생존율을 또한 측정하였다. 여기서, 각각의 세포주는 세포 생존율의 유의한 감소를 보이지 않았다.
팬- 카스파제 활성의 검출: 카스파제 활성을 공초점 레이저 현미경 분석에 의해 결정하였다. LNCaP, DU145 및 PC3 세포를 PAX2 siRNA로 처리하고, 활성을 녹색 형광을 낼 활발하게 세포자멸을 겪는 세포에서 카스파제에 대한 FAM-표지된 펩티드의 결합에 기초하여 모니터링하였다. 배지만을 사용한 세포의 분석에서는 각각 생존가능한 LNCaP, DU145 및 PC3 세포의 존재를 보여준다. 488 nm에서 공초점 레이저에 의한 여기는 검출가능한 녹색 염색을 생산하지 않았고, 이는 비처리된 세포에서 카스파제 활성이 없는 것을 나타낸다 (각각 도 39A, 39C 및 39E). PAX2 siRNA로 처리한 4일 후, LNCaP, DU145 및 PC3 세포는 형광 하에 녹색 염색을 나타냈고, 이는 카스파제 활성을 나타낸다 (각각 도 39B, 39D 및 39F).
세포자멸 인자에 대한 PAX2 억제의 효과: LNCaP, DU145 및 PC3 세포를 PAX2에 대한 siRNA로 4일 동안 처리하고, 세포자멸 촉진 인자 및 항-세포자멸 인자의 발현을 QRTPCR에 의해 측정하였다. PAX2 녹다운 후, BAD의 분석에서는 LNCaP에서 2배, DU145에서 1.58배 및 PC3에서 1.375배임이 밝혀졌다 (도 40A). BID의 발현 수준은 LNCaP에서 1.38배 증가하고 DU145에서 1.78배 증가하였지만, PAX2 발현을 억제시킨 후 PC3에서 관찰된 BID에서 통계학상 유의한 차이가 없었다 (도 40B). 항-세포자멸 인자 AKT의 분석에서는 처리 후 LNCaP에서 발현의 1.25배 감소 및 DU145에서 1.28배 감소가 밝혀졌지만, PC3에서는 변화가 관찰되지 않았다 (도 40C).
막 통합성 및 괴사의 분석: 막 통합성을 LNCaP, DU145 및 PC3 세포에서 공초점 분석에 의해 모니터링하였다. 여기서, 무손상 세포는 막 투과성인 AO 때문에 녹색으로 착색한 반면, 손상된 혈장 막을 갖는 세포는 세포질 내로 막 불투과성 EtBr의 혼입으로 인해 적색으로 및 핵에서 AO 및 EtBr의 동시-국재화로 인해 황색으로 착색할 것이다. 비처리된 LNCaP, DU145 및 PC3 세포는 AO로 양성으로 염색되고 녹색을 방출하지만, EtBr로 염색되지 않았다. PAX2 녹다운 후, AO를 사용할 때 양성 녹색 형광 및 적색 EtBr 형광의 부재로 표시되는 바와 같이 LNCaP 세포에서 막 통합성에 관찰가능한 변경이 없었다. 이들 발견은 더욱 LNCaP 세포가 PAX2 녹다운 후 세포자멸성 세포 사멸을 겪을 수 있지만 괴사성 세포 사멸을 겼지 않음을 나타낸다. 이와 반대로, DU145 및 PC3에서 PAX2 녹다운은 적색 염색으로 표시되는 바와 같이 세포질 내에 EtBr의 축적을 일으켰다. 또한, DU145 및 PC3은 모두 각각 AO 및 EtBr로부터의 녹색 및 적색 염색의 동시-국재화로 인해 황색으로 나타난 응축된 핵을 가졌다. 이들 결과는 DU145 및 PC3이 LNCaP에 비해 괴사성 세포 사멸을 포함한 대안적인 세포 사멸 경로를 겪음을 나타낸다.
F. 참고문헌
G. 서열
관련 출원에 대한 교차 참조
본원은 그 전문이 본원에 참고로 포함되는, 2007년 1월 16일 출원된 미국 특허 가출원 60/885,142를 기초로 한 우선권을 주장한다.
SEQUENCE LISTING <110> MEDICAL UNIVERSITY OF SOUTH CAROLINA CARLTON D. DONALD <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR DIAGNOSING, TREATING AND PREVENTING PROSTATE CONDITIONS <130> 19113.0129P2 <150> 60/885,142 <151> 2007-01-16 <160> 68 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: note = Synthethic Construct <400> 1 ccttg 5 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: note = Synthethic Construct <400> 2 auagacucga cuugacuucu u 21 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: note = Synthethic Construct <400> 3 gaggaaacgu gaugaagauu u 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: note = Synthethic Construct <400> 4 aucuucauca cguuuccucu u 21 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: note = Synthethic Construct <400> 5 ggacaagauu gcugaauacu u 21 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<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: note = Synthethic Construct <400> 12 actgtggcac ctcccttcag ttccgtcgac gaggttgtgc 40 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: note = Synthethic Construct <400> 13 actgtggcac ctcccttcac cttggtcgac gaggttgtgc 40 <210> 14 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: note = Synthethic Construct <400> 14 actgtggcac ctcccttcac tctggtcgac gaggttgtgc 40 <210> 15 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: note = Synthethic Construct <400> 15 gaagucaagu cgagucuauu u 21 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: note = Synthethic Construct <400> 16 ccacccatgg caaattccat ggca 24 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: note = Synthethic 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Construct <400> 23 gaggaagtcc agtgtccagc 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: note = Synthethic Construct <400> 24 agaagttcac ccttgactgt 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: note = Synthethic Construct <400> 25 agaagttcac gttccactgt 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: note = Synthethic Construct <400> 26 agaagttcac gctctactgt 20 <210> 27 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: note = Synthethic Construct <400> 27 ttagcgatta gaagttcacc cttgactgtg gcacctccc 39 <210> 28 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: note = Synthethic Construct <400> 28 gttagcgatt agaagttcac gttccactgt ggcacctccc 40 <210> 29 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: note = Synthethic Construct <400> 29 gttagcgatt agaagttcac gctctactgt ggcacctccc 40 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: note = Synthethic Construct <400> 30 cctggcaccc agcacaat 18 <210> 31 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: note = Synthethic Construct <400> 31 gttgcctgcc agtcgccatg agaacttcct ac 32 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: note = Synthethic Construct <400> 32 gccgatccac acggagtact 20 <210> 33 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: note = Synthethic Construct <400> 33 tggccttccc tctgtaacag gtgccttgaa tt 32 <210> 34 <211> 135 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: note = Synthethic Construct <400> 34 Met Asp Met His Cys Lys Ala Asp Pro Phe Ser Ala Met His Arg His 1 5 10 15 Gly Gly 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gcaccccggc ccggcccacc 6960 gccccggggc cattctgctg accgcccagc cccgagcccc gacagtggca agttgcggct 7020 actgcggttg caagctccgg ccaacccgga ggagccccag cggggagcgc agtgttgcgc 7080 cccccgcccc cgcgcgcgcc gcagcagccg ggcgttcact catcctccct cccccaccgt 7140 ccctcccttt tctcctcaag tcctgaagtt gagtttgaga ggcgacacgg cggcggcggc 7200 cgcgctgctc ccgctcctct gcctccccat ggatatgcac tgcaaagcag accccttctc 7260 cgcgatgcac cgtgagtacc cgcgcccggc tcctgtcccg gctcgggctc tccgtcccaa 7320 ccctgtccag t 7331 <210> 36 <211> 416 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: note = Synthethic Construct <400> 36 Met Asp Met His Cys Lys Ala Asp Pro Phe Ser Ala Met His Pro Gly 1 5 10 15 His Gly Gly Val Asn Gln Leu Gly Gly Val Phe Val Asn Gly Arg Pro 20 25 30 Leu Pro Asp Val Val Arg Gln Arg Ile Val Glu Leu Ala His Gln Gly 35 40 45 Val Arg Pro Cys Asp Ile Ser Arg Gln Leu Arg Val Ser His Gly Cys 50 55 60 Val Ser Lys Ile Leu Gly Arg Tyr Tyr Glu Thr Gly Ser Ile Lys Pro 65 70 75 80 Gly Val Ile Gly Gly 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cttggagagg 240 cccggctccc ctcccggcgc cctctgaccg cccccgcccc gcgcgctctc cgaccaccgc 300 ctctcggatg accaggttcc aggggagctg agcgagtcgc ctcccccgcc cagcttcagc 360 cctggctgca gctgcagcgc gagccatgcg cccccagtgc accccggccc ggcccaccgc 420 cccggggcca ttctgctgac cgcccagccc cgagccccga cagtggcaag ttgcggctac 480 tgcagttgca agctccggcc aacccggagg agccccagcg gggagcgcag tgttgcgccc 540 cccgcccccg cgcgccccgc agcagccggg cgttcactca tcctccctcc cccaccgtcc 600 ctcccttttc tcctcaagtc ctgaagttga gtttgagagg cgacacggcg gcggcggccg 660 cgctgctccc gctcctctgc ctccccatgg atatgcactg caaagcagac cccttctccg 720 cgatgcaccc agggcacggg ggtgtgaacc agctcggggg ggtgtttgtg aacggccggc 780 ccctacccga cgtggtgagg cagcgcatcg tggagctggc ccaccagggt gtgcggccct 840 gtgacatctc ccggcagctg cgggtcagcc acggctgtgt cagcaaaatc ctgggcaggt 900 actacgagac cggcagcatc aagccgggtg tgatcggtgg ctccaagccc aaagtggcga 960 cgcccaaagt ggtggacaag attgctgaat acaaacgaca gaacccgact atgttcgcct 1020 gggagattcg agaccggctc ctggccgagg gcatctgtga caatgacaca gtgcccagcg 1080 tctcttccat caacagaatc atccggacca aagttcagca gcctttccac ccaacgccgg 1140 atggggctgg gacaggagtg accgcccctg gccacaccat tgttcccagc acggcctccc 1200 ctcctgtttc cagcgcctcc aatgacccag tgggatccta ctccatcaat gggatcctgg 1260 ggattcctcg ctccaatggt gagaagagga aacgtgatga agttgaggta tacactgatc 1320 ctgcccacat tagaggaggt ggaggtttgc atctggtctg gactttaaga gatgtgtctg 1380 agggctcagt ccccaatgga gattcccaga gtggtgtgga cagtttgcgg aagcacttgc 1440 gagctgacac cttcacccag cagcagctgg aagctttgga tcgggtcttt gagcgtcctt 1500 cctaccctga cgtcttccag gcatcagagc acatcaaatc agaacagggg aacgagtact 1560 ccctcccagc cctgacccct gggcttgatg aagtcaagtc gagtctatct gcatccacca 1620 accctgagct gggcagcaac gtgtcaggca cacagacata cccagttgtg actggtcgtg 1680 acatggcgag caccactctg cctggttacc cccctcacgt gccccccact ggccagggaa 1740 gctaccccac ctccaccctg gcaggaatgg tgcctgggag cgagttctcc ggcaacccgt 1800 acagccaccc ccagtacacg gcctacaacg aggcttggag attcagcaac cccgccttac 1860 taagttcccc ttattattat agtgccgccc cccggtccgc ccctgccgct gctgccgctg 1920 cctatgaccg ccactagtta ccgcggggac cacatcaagc ttcaggccga cagcttcggc 1980 ctccacatcg tccccgtctg accccacccc ggagggaggg aggaccgacg cgacgcgatg 2040 cctcccggcc accgccccag cctcacccca tcccacgacc cccgcaaccc ttcacatcac 2100 ccccctcgaa ggtcggacag gacgggtgga gccgtgggcg ggaccctcag gcccgggccc 2160 gccgccccca gccccgcctg ccgcccctcc ccgcctgcct ggactgcgcg gcgccgtgag 2220 ggggattcgg cccagctcgt cccggcctcc accaagccag ccccgaagcc cgccagccac 2280 cctgccggac tcgggcgcga cctgctggcg cgcgccggat gtttctgtga cacacaatca 2340 gcgcggaccg cagcgcggcc cagccccggg cacccgcctc ggacgctcgg gcgccaggag 2400 gcttcgctgg aggggctggg ccaaggagat taagaagaaa acgactttct gcaggaggaa 2460 gagcccgctg ccgaatccct gggaaaaatt cttttccccc agtgccagcc ggactgccct 2520 cgccttccgg gtgtgccctg tcccagaaga tggaatgggg gtgtgggggt ccggctctag 2580 gaacgggctt tgggggcgtc aggtctttcc aaggttggga cccaaggatc ggggggccca 2640 gcagcccgca ccgatcgagc cggactctcg gctcttcact gctcctcctg gcctgcctag 2700 ttccccaggg cccggcacct cctgctgcga gacccggctc tcagccctgc cttgccccta 2760 cctcagcgtc tcttccacct gctggcctcc cagtttcccc tcctgccagt ccttcgcctg 2820 tcccttgacg ccctgcatcc tcctccctga ctcgcagccc catcggacgc tctcccggga 2880 ccgccgcagg accagtttcc atagactgcg gactggggtc ttcctccagc agttacttga 2940 tgccccctcc cccgacacag actctcaatc tgccggtggt aagaaccggt tctgagctgg 3000 cgtctgagct gctgcggggt ggaagtgggg ggctgcccac tccactcctc ccatcccctc 3060 ccagcctcct cctccggcag gaactgaaca gaaccacaaa aagtctacat ttatttaata 3120 tgatggtctt tgcaaaaagg aacaaaacaa cacaaaagcc caccaggctg ctgctttgtg 3180 gaaagacggt gtgtgtcgtg tgaaggcgaa acccggtgta cataacccct ccccctccgc 3240 cccgccccgc ccggccccgt agagtccctg tcgcccgccg gccctgcctg tagatacgcc 3300 ccgctgtctg tgctgtgaga gtcgccgctc gctggggggg aaggggggga cacagctaca 3360 cgcccattaa agcacagcac gtcctggggg aggggggcat tttttatgtt acaaaaaaaa 3420 attacgaaag aaaagaaatc tctatgcaaa atgacgaaca tggtcctgtg gactcctctg 3480 gcctgttttg ttggctcttt ctctgtaatt ccgtgttttc gctttttcct ccctgcccct 3540 ctctccctct gcccctctct cctctccgct tctctccccc tctgtctctg tctctctccg 3600 tctctgtcgc tcttgtctgt ctgtctctgc tctttcctcg gcctctctcc ccagacctgg 3660 cccggccgcc ctgtctccgc aggctagatc cgaggtggca gctccagccc ccgggctcgc 3720 cccctcgcgg gcgtgccccg cgcgccccgg gcggccgaag gccgggccgc cccgtcccgc 3780 cccgtagttg ctctttcggt agtggcgatg cgccctgcat gtctcctcac ccgtggatcg 3840 tgacgactcg aaataacaga aacaaagtca ataaagtgaa aataaataaa aatccttgaa 3900 caaatccgaa aaggcttgga gtcctcgccc agatctctct cccctgcgag ccctttttat 3960 ttgagaagga aaaagagaaa agagaatcgt ttaagggaac ccggcgccca gccaggctcc 4020 agtggcccga acggggcggc gagggcggcg agggcgccga ggtccggccc atcccagtcc 4080 tgtggggctg gccgggcaga gaccccggac ccaggcccag gcctaacctg ctaaatgtcc 4140 ccggacggtt ctggtctcct cggccacttt cagtgcgtcg gttcgttttg attctttttc 4200 ttttgtgcac ataagaaata aataataata ataaataaag aataaaattt tgtatgtcaa 4260 aaaaaaaaaa aaaaaa 4276 <210> 38 <211> 393 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: note = Synthethic Construct <400> 38 Met Asp Met His Cys Lys Ala Asp Pro Phe Ser Ala Met His Pro Gly 1 5 10 15 His Gly Gly Val Asn Gln Leu Gly Gly Val Phe Val Asn Gly Arg Pro 20 25 30 Leu Pro Asp Val Val Arg Gln Arg Ile Val Glu Leu Ala His Gln Gly 35 40 45 Val Arg Pro Cys Asp Ile Ser Arg Gln Leu Arg Val Ser His Gly Cys 50 55 60 Val Ser Lys Ile Leu Gly Arg Tyr Tyr Glu Thr Gly Ser Ile Lys Pro 65 70 75 80 Gly Val Ile Gly Gly Ser Lys Pro Lys Val Ala Thr Pro Lys Val Val 85 90 95 Asp Lys Ile Ala Glu Tyr Lys Arg Gln Asn Pro Thr Met Phe Ala Trp 100 105 110 Glu Ile Arg Asp Arg Leu Leu Ala Glu Gly Ile Cys Asp Asn Asp Thr 115 120 125 Val Pro Ser Val Ser Ser Ile Asn Arg Ile Ile Arg Thr Lys Val Gln 130 135 140 Gln Pro Phe His Pro Thr Pro Asp Gly Ala Gly Thr Gly Val Thr Ala 145 150 155 160 Pro Gly His Thr Ile Val Pro Ser Thr Ala Ser Pro Pro Val Ser Ser 165 170 175 Ala Ser Asn Asp Pro Val Gly Ser Tyr Ser Ile Asn Gly Ile Leu Gly 180 185 190 Ile Pro Arg Ser Asn Gly Glu Lys Arg Lys Arg Asp Glu Asp Val Ser 195 200 205 Glu Gly Ser Val Pro Asn Gly Asp Ser Gln Ser Gly Val Asp Ser Leu 210 215 220 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cacctggggc cagcccagag 60 ctgccagcgc cgctcggctc cctccctccc tcccggccct tcggccgcgg cggcgtgcgc 120 ctgccttttc cgggggcggg ggcctggccc gcgcgctccc ctcccgcagg cgccacctcg 180 gacatccccg ggattgctac ttctctgcca acttcgccaa ctcgccagca cttggagagg 240 cccggctccc ctcccggcgc cctctgaccg cccccgcccc gcgcgctctc cgaccaccgc 300 ctctcggatg accaggttcc aggggagctg agcgagtcgc ctcccccgcc cagcttcagc 360 cctggctgca gctgcagcgc gagccatgcg cccccagtgc accccggccc ggcccaccgc 420 cccggggcca ttctgctgac cgcccagccc cgagccccga cagtggcaag ttgcggctac 480 tgcagttgca agctccggcc aacccggagg agccccagcg gggagcgcag tgttgcgccc 540 cccgcccccg cgcgccccgc agcagccggg cgttcactca tcctccctcc cccaccgtcc 600 ctcccttttc tcctcaagtc ctgaagttga gtttgagagg cgacacggcg gcggcggccg 660 cgctgctccc gctcctctgc ctccccatgg atatgcactg caaagcagac cccttctccg 720 cgatgcaccc agggcacggg ggtgtgaacc agctcggggg ggtgtttgtg aacggccggc 780 ccctacccga cgtggtgagg cagcgcatcg tggagctggc ccaccagggt gtgcggccct 840 gtgacatctc ccggcagctg cgggtcagcc acggctgtgt cagcaaaatc ctgggcaggt 900 actacgagac cggcagcatc aagccgggtg tgatcggtgg ctccaagccc aaagtggcga 960 cgcccaaagt ggtggacaag attgctgaat acaaacgaca gaacccgact atgttcgcct 1020 gggagattcg agaccggctc ctggccgagg gcatctgtga caatgacaca gtgcccagcg 1080 tctcttccat caacagaatc atccggacca aagttcagca gcctttccac ccaacgccgg 1140 atggggctgg gacaggagtg accgcccctg gccacaccat tgttcccagc acggcctccc 1200 ctcctgtttc cagcgcctcc aatgacccag tgggatccta ctccatcaat gggatcctgg 1260 ggattcctcg ctccaatggt gagaagagga aacgtgatga agatgtgtct gagggctcag 1320 tccccaatgg agattcccag agtggtgtgg acagtttgcg gaagcacttg cgagctgaca 1380 ccttcaccca gcagcagctg gaagctttgg atcgggtctt tgagcgtcct tcctaccctg 1440 acgtcttcca ggcatcagag cacatcaaat cagaacaggg gaacgagtac tccctcccag 1500 ccctgacccc tgggcttgat gaagtcaagt cgagtctatc tgcatccacc aaccctgagc 1560 tgggcagcaa cgtgtcaggc acacagacat acccagttgt gactggtcgt gacatggcga 1620 gcaccactct gcctggttac ccccctcacg tgccccccac tggccaggga agctacccca 1680 cctccaccct ggcaggaatg gtgcctggga gcgagttctc cggcaacccg tacagccacc 1740 cccagtacac ggcctacaac gaggcttgga gattcagcaa ccccgcctta ctaagttccc 1800 cttattatta tagtgccgcc ccccggtccg cccctgccgc tgctgccgct gcctatgacc 1860 gccactagtt accgcgggga ccacatcaag cttcaggccg acagcttcgg cctccacatc 1920 gtccccgtct gaccccaccc cggagggagg gaggaccgac gcgacgcgat gcctcccggc 1980 caccgcccca gcctcacccc atcccacgac ccccgcaacc cttcacatca cccccctcga 2040 aggtcggaca ggacgggtgg agccgtgggc gggaccctca ggcccgggcc cgccgccccc 2100 agccccgcct gccgcccctc cccgcctgcc tggactgcgc ggcgccgtga gggggattcg 2160 gcccagctcg tcccggcctc caccaagcca gccccgaagc ccgccagcca ccctgccgga 2220 ctcgggcgcg acctgctggc gcgcgccgga tgtttctgtg acacacaatc agcgcggacc 2280 gcagcgcggc ccagccccgg gcacccgcct cggacgctcg ggcgccagga ggcttcgctg 2340 gaggggctgg gccaaggaga ttaagaagaa aacgactttc tgcaggagga agagcccgct 2400 gccgaatccc tgggaaaaat tcttttcccc cagtgccagc cggactgccc tcgccttccg 2460 ggtgtgccct gtcccagaag atggaatggg ggtgtggggg tccggctcta ggaacgggct 2520 ttgggggcgt caggtctttc caaggttggg acccaaggat cggggggccc agcagcccgc 2580 accgatcgag ccggactctc ggctcttcac tgctcctcct ggcctgccta gttccccagg 2640 gcccggcacc tcctgctgcg agacccggct ctcagccctg ccttgcccct acctcagcgt 2700 ctcttccacc tgctggcctc ccagtttccc ctcctgccag tccttcgcct gtcccttgac 2760 gccctgcatc ctcctccctg actcgcagcc ccatcggacg ctctcccggg accgccgcag 2820 gaccagtttc catagactgc ggactggggt cttcctccag cagttacttg atgccccctc 2880 ccccgacaca gactctcaat ctgccggtgg taagaaccgg ttctgagctg gcgtctgagc 2940 tgctgcgggg tggaagtggg gggctgccca ctccactcct cccatcccct cccagcctcc 3000 tcctccggca ggaactgaac agaaccacaa aaagtctaca tttatttaat atgatggtct 3060 ttgcaaaaag gaacaaaaca acacaaaagc ccaccaggct gctgctttgt ggaaagacgg 3120 tgtgtgtcgt gtgaaggcga aacccggtgt acataacccc tccccctccg ccccgccccg 3180 cccggccccg tagagtccct gtcgcccgcc ggccctgcct gtagatacgc cccgctgtct 3240 gtgctgtgag agtcgccgct cgctgggggg gaaggggggg acacagctac acgcccatta 3300 aagcacagca cgtcctgggg gaggggggca ttttttatgt tacaaaaaaa aattacgaaa 3360 gaaaagaaat ctctatgcaa aatgacgaac atggtcctgt ggactcctct ggcctgtttt 3420 gttggctctt tctctgtaat tccgtgtttt cgctttttcc tccctgcccc tctctccctc 3480 tgcccctctc tcctctccgc ttctctcccc ctctgtctct gtctctctcc gtctctgtcg 3540 ctcttgtctg tctgtctctg ctctttcctc ggcctctctc cccagacctg gcccggccgc 3600 cctgtctccg caggctagat ccgaggtggc agctccagcc cccgggctcg ccccctcgcg 3660 ggcgtgcccc gcgcgccccg ggcggccgaa ggccgggccg ccccgtcccg ccccgtagtt 3720 gctctttcgg tagtggcgat gcgccctgca tgtctcctca cccgtggatc gtgacgactc 3780 gaaataacag aaacaaagtc aataaagtga aaataaataa aaatccttga acaaatccga 3840 aaaggcttgg agtcctcgcc cagatctctc tcccctgcga gcccttttta tttgagaagg 3900 aaaaagagaa aagagaatcg tttaagggaa cccggcgccc agccaggctc cagtggcccg 3960 aacggggcgg cgagggcggc gagggcgccg aggtccggcc catcccagtc ctgtggggct 4020 ggccgggcag agaccccgga cccaggccca ggcctaacct gctaaatgtc cccggacggt 4080 tctggtctcc tcggccactt tcagtgcgtc ggttcgtttt gattcttttt cttttgtgca 4140 cataagaaat aaataataat aataaataaa gaataaaatt ttgtatgtca aaaaaaaaaa 4200 aaaaaaa 4207 <210> 40 <211> 396 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: note = Synthethic Construct <400> 40 Met Asp Met His Cys Lys Ala Asp Pro Phe Ser Ala Met His Pro Gly 1 5 10 15 His Gly Gly Val Asn Gln Leu Gly Gly Val Phe Val Asn Gly Arg Pro 20 25 30 Leu Pro Asp Val Val Arg Gln Arg Ile Val Glu Leu Ala His Gln Gly 35 40 45 Val Arg Pro Cys Asp Ile Ser Arg Gln Leu Arg Val Ser His Gly Cys 50 55 60 Val Ser Lys Ile Leu Gly Arg Tyr Tyr Glu Thr Gly Ser Ile Lys Pro 65 70 75 80 Gly Val Ile Gly Gly Ser Lys Pro Lys Val Ala Thr Pro Lys Val Val 85 90 95 Asp Lys Ile Ala Glu Tyr Lys Arg Gln Asn Pro Thr Met Phe Ala Trp 100 105 110 Glu Ile Arg Asp Arg Leu Leu Ala Glu Gly Ile Cys Asp Asn Asp Thr 115 120 125 Val Pro Ser Val Ser Ser Ile Asn Arg Ile Ile Arg Thr Lys Val Gln 130 135 140 Gln Pro Phe His Pro Thr Pro Asp Gly Ala Gly Thr Gly Val Thr Ala 145 150 155 160 Pro Gly His Thr Ile Val Pro Ser Thr Ala Ser Pro Pro Val Ser Ser 165 170 175 Ala Ser Asn Asp Pro Val Gly Ser Tyr Ser Ile Asn Gly Ile Leu Gly 180 185 190 Ile Pro Arg Ser Asn 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: note = Synthethic Construct <400> 41 aggctccagt ctccggccga gtcttctcgc agccgcaacc cacctggggc cagcccagag 60 ctgccagcgc cgctcggctc cctccctccc tcccggccct tcggccgcgg cggcgtgcgc 120 ctgccttttc cgggggcggg ggcctggccc gcgcgctccc ctcccgcagg cgccacctcg 180 gacatccccg ggattgctac ttctctgcca acttcgccaa ctcgccagca cttggagagg 240 cccggctccc ctcccggcgc cctctgaccg cccccgcccc gcgcgctctc cgaccaccgc 300 ctctcggatg accaggttcc aggggagctg agcgagtcgc ctcccccgcc cagcttcagc 360 cctggctgca gctgcagcgc gagccatgcg cccccagtgc accccggccc ggcccaccgc 420 cccggggcca ttctgctgac cgcccagccc cgagccccga cagtggcaag ttgcggctac 480 tgcagttgca agctccggcc aacccggagg agccccagcg gggagcgcag tgttgcgccc 540 cccgcccccg cgcgccccgc agcagccggg cgttcactca tcctccctcc cccaccgtcc 600 ctcccttttc tcctcaagtc ctgaagttga gtttgagagg cgacacggcg gcggcggccg 660 cgctgctccc gctcctctgc ctccccatgg atatgcactg caaagcagac cccttctccg 720 cgatgcaccc agggcacggg ggtgtgaacc agctcggggg ggtgtttgtg aacggccggc 780 ccctacccga cgtggtgagg cagcgcatcg tggagctggc ccaccagggt gtgcggccct 840 gtgacatctc ccggcagctg cgggtcagcc acggctgtgt cagcaaaatc ctgggcaggt 900 actacgagac cggcagcatc aagccgggtg tgatcggtgg ctccaagccc aaagtggcga 960 cgcccaaagt ggtggacaag attgctgaat acaaacgaca gaacccgact atgttcgcct 1020 gggagattcg agaccggctc ctggccgagg gcatctgtga caatgacaca gtgcccagcg 1080 tctcttccat caacagaatc atccggacca aagttcagca gcctttccac ccaacgccgg 1140 atggggctgg gacaggagtg accgcccctg gccacaccat tgttcccagc acggcctccc 1200 ctcctgtttc cagcgcctcc aatgacccag tgggatccta ctccatcaat gggatcctgg 1260 ggattcctcg ctccaatggt gagaagagga aacgtgatga agatgtgtct gagggctcag 1320 tccccaatgg agattcccag agtggtgtgg acagtttgcg gaagcacttg cgagctgaca 1380 ccttcaccca gcagcagctg gaagctttgg atcgggtctt tgagcgtcct tcctaccctg 1440 acgtcttcca ggcatcagag cacatcaaat cagaacaggg gaacgagtac tccctcccag 1500 ccctgacccc tgggcttgat gaagtcaagt cgagtctatc tgcatccacc aaccctgagc 1560 tgggcagcaa cgtgtcaggc acacagacat acccagttgt gactggtcgt gacatggcga 1620 gcaccactct gcctggttac ccccctcacg tgccccccac tggccaggga agctacccca 1680 cctccaccct ggcaggaatg gtgcctgagg ctgcagttgg tccctcatcc tccctcatga 1740 gcaagccggg gaggaagctt gcagaagtgc ccccttgtgt gcaacccact ggagcgagtt 1800 ctccggcaac ccgtacagcc acccccagta cacggcctac aacgaggctt ggagattcag 1860 caaccccgcc ttactaagtt ccccttatta ttatagtgcc gccccccggt ccgcccctgc 1920 cgctgctgcc gctgcctatg accgccacta gttaccgcgg ggaccacatc aagcttcagg 1980 ccgacagctt cggcctccac atcgtccccg tctgacccca ccccggaggg agggaggacc 2040 gacgcgacgc gatgcctccc ggccaccgcc ccagcctcac cccatcccac gacccccgca 2100 acccttcaca tcacccccct cgaaggtcgg acaggacggg tggagccgtg ggcgggaccc 2160 tcaggcccgg gcccgccgcc cccagccccg cctgccgccc ctccccgcct gcctggactg 2220 cgcggcgccg tgagggggat tcggcccagc tcgtcccggc ctccaccaag ccagccccga 2280 agcccgccag ccaccctgcc ggactcgggc gcgacctgct ggcgcgcgcc ggatgtttct 2340 gtgacacaca atcagcgcgg accgcagcgc ggcccagccc cgggcacccg cctcggacgc 2400 tcgggcgcca ggaggcttcg ctggaggggc tgggccaagg agattaagaa gaaaacgact 2460 ttctgcagga ggaagagccc gctgccgaat ccctgggaaa aattcttttc ccccagtgcc 2520 agccggactg ccctcgcctt ccgggtgtgc cctgtcccag aagatggaat gggggtgtgg 2580 gggtccggct ctaggaacgg gctttggggg cgtcaggtct ttccaaggtt gggacccaag 2640 gatcgggggg cccagcagcc cgcaccgatc gagccggact ctcggctctt cactgctcct 2700 cctggcctgc ctagttcccc agggcccggc acctcctgct gcgagacccg gctctcagcc 2760 ctgccttgcc cctacctcag cgtctcttcc acctgctggc ctcccagttt cccctcctgc 2820 cagtccttcg cctgtccctt gacgccctgc atcctcctcc ctgactcgca gccccatcgg 2880 acgctctccc gggaccgccg caggaccagt ttccatagac tgcggactgg ggtcttcctc 2940 cagcagttac ttgatgcccc ctcccccgac acagactctc aatctgccgg tggtaagaac 3000 cggttctgag ctggcgtctg agctgctgcg gggtggaagt ggggggctgc ccactccact 3060 cctcccatcc cctcccagcc tcctcctccg gcaggaactg aacagaacca caaaaagtct 3120 acatttattt aatatgatgg tctttgcaaa aaggaacaaa acaacacaaa agcccaccag 3180 gctgctgctt tgtggaaaga cggtgtgtgt cgtgtgaagg cgaaacccgg tgtacataac 3240 ccctccccct ccgccccgcc ccgcccggcc ccgtagagtc cctgtcgccc gccggccctg 3300 cctgtagata cgccccgctg tctgtgctgt gagagtcgcc gctcgctggg ggggaagggg 3360 gggacacagc tacacgccca ttaaagcaca gcacgtcctg ggggaggggg gcatttttta 3420 tgttacaaaa aaaaattacg aaagaaaaga aatctctatg caaaatgacg aacatggtcc 3480 tgtggactcc tctggcctgt tttgttggct ctttctctgt aattccgtgt tttcgctttt 3540 tcctccctgc ccctctctcc ctctgcccct ctctcctctc cgcttctctc cccctctgtc 3600 tctgtctctc tccgtctctg tcgctcttgt ctgtctgtct ctgctctttc ctcggcctct 3660 ctccccagac ctggcccggc cgccctgtct ccgcaggcta gatccgaggt ggcagctcca 3720 gcccccgggc tcgccccctc gcgggcgtgc cccgcgcgcc ccgggcggcc gaaggccggg 3780 ccgccccgtc ccgccccgta gttgctcttt cggtagtggc gatgcgccct gcatgtctcc 3840 tcacccgtgg atcgtgacga ctcgaaataa cagaaacaaa gtcaataaag tgaaaataaa 3900 taaaaatcct tgaacaaatc cgaaaaggct tggagtcctc gcccagatct ctctcccctg 3960 cgagcccttt ttatttgaga aggaaaaaga gaaaagagaa tcgtttaagg gaacccggcg 4020 cccagccagg ctccagtggc ccgaacgggg cggcgagggc ggcgagggcg ccgaggtccg 4080 gcccatccca gtcctgtggg gctggccggg cagagacccc ggacccaggc ccaggcctaa 4140 cctgctaaat gtccccggac ggttctggtc tcctcggcca ctttcagtgc gtcggttcgt 4200 tttgattctt tttcttttgt gcacataaga aataaataat aataataaat aaagaataaa 4260 attttgtatg tcaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4290 <210> 42 <211> 408 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: note = Synthethic Construct <400> 42 Met Asp Met His Cys Lys Ala Asp Pro Phe Ser Ala Met His Pro Gly 1 5 10 15 His Gly Gly Val Asn Gln Leu Gly Gly Val Phe Val Asn Gly Arg Pro 20 25 30 Leu Pro Asp Val Val Arg Gln Arg Ile Val Glu Leu Ala His Gln Gly 35 40 45 Val Arg Pro Cys Asp Ile Ser Arg Gln Leu Arg Val Ser His Gly Cys 50 55 60 Val Ser Lys Ile Leu Gly Arg Tyr Tyr Glu Thr Gly Ser Ile Lys Pro 65 70 75 80 Gly Val Ile Gly Gly Ser Lys Pro Lys Val Ala Thr Pro Lys Val Val 85 90 95 Asp Lys Ile Ala Glu Tyr Lys Arg Gln Asn Pro Thr Met Phe Ala Trp 100 105 110 Glu Ile Arg Asp Arg Leu Leu Ala Glu Gly Ile Cys Asp Asn Asp Thr 115 120 125 Val Pro Ser Val Ser Ser Ile Asn Arg Ile Ile Arg Thr Lys Val Gln 130 135 140 Gln Pro Phe His Pro Thr Pro Asp Gly Ala Gly Thr Gly Val Thr Ala 145 150 155 160 Pro Gly His Thr Ile Val Pro Ser Thr Ala Ser Pro Pro Val Ser Ser 165 170 175 Ala Ser Asn Asp Pro Val Gly Ser Tyr Ser Ile Asn Gly Ile Leu Gly 180 185 190 Ile Pro Arg Ser Asn Gly Glu Lys Arg Lys Arg Asp Glu Asp Val Ser 195 200 205 Glu Gly Ser Val Pro Asn Gly Asp Ser Gln Ser Gly Val Asp Ser Leu 210 215 220 Arg Lys His Leu Arg Ala Asp Thr Phe Thr Gln Gln Gln Leu Glu Ala 225 230 235 240 Leu Asp Arg Val Phe Glu Arg Pro Ser Tyr Pro Asp Val Phe Gln Ala 245 250 255 Ser Glu His Ile Lys Ser Glu Gln Gly Asn Glu Tyr Ser Leu Pro Ala 260 265 270 Leu Thr Pro Gly Leu Asp Glu Val Lys Ser Ser Leu Ser Ala Ser Thr 275 280 285 Asn Pro Glu Leu Gly Ser Asn Val Ser Gly Thr Gln Thr Tyr Pro Val 290 295 300 Val Thr Gly Arg Asp Met Ala Ser Thr Thr Leu Pro Gly Tyr Pro Pro 305 310 315 320 His Val Pro Pro Thr Gly Gln Gly Ser Tyr Pro Thr Ser Thr Leu Ala 325 330 335 Gly Met Val Pro Gly Ser Glu Phe Ser Gly Asn Pro Tyr Ser His Pro 340 345 350 Gln Tyr 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agccccagcg gggagcgcag tgttgcgccc 540 cccgcccccg cgcgccccgc agcagccggg cgttcactca tcctccctcc cccaccgtcc 600 ctcccttttc tcctcaagtc ctgaagttga gtttgagagg cgacacggcg gcggcggccg 660 cgctgctccc gctcctctgc ctccccatgg atatgcactg caaagcagac cccttctccg 720 cgatgcaccc agggcacggg ggtgtgaacc agctcggggg ggtgtttgtg aacggccggc 780 ccctacccga cgtggtgagg cagcgcatcg tggagctggc ccaccagggt gtgcggccct 840 gtgacatctc ccggcagctg cgggtcagcc acggctgtgt cagcaaaatc ctgggcaggt 900 actacgagac cggcagcatc aagccgggtg tgatcggtgg ctccaagccc aaagtggcga 960 cgcccaaagt ggtggacaag attgctgaat acaaacgaca gaacccgact atgttcgcct 1020 gggagattcg agaccggctc ctggccgagg gcatctgtga caatgacaca gtgcccagcg 1080 tctcttccat caacagaatc atccggacca aagttcagca gcctttccac ccaacgccgg 1140 atggggctgg gacaggagtg accgcccctg gccacaccat tgttcccagc acggcctccc 1200 ctcctgtttc cagcgcctcc aatgacccag tgggatccta ctccatcaat gggatcctgg 1260 ggattcctcg ctccaatggt gagaagagga aacgtgatga agatgtgtct gagggctcag 1320 tccccaatgg agattcccag agtggtgtgg acagtttgcg gaagcacttg cgagctgaca 1380 ccttcaccca gcagcagctg gaagctttgg atcgggtctt tgagcgtcct tcctaccctg 1440 acgtcttcca ggcatcagag cacatcaaat cagaacaggg gaacgagtac tccctcccag 1500 ccctgacccc tgggcttgat gaagtcaagt cgagtctatc tgcatccacc aaccctgagc 1560 tgggcagcaa cgtgtcaggc acacagacat acccagttgt gactggtcgt gacatggcga 1620 gcaccactct gcctggttac ccccctcacg tgccccccac tggccaggga agctacccca 1680 cctccaccct ggcaggaatg gtgcctggga gcgagttctc cggcaacccg tacagccacc 1740 cccagtacac ggcctacaac gaggcttgga gattcagcaa ccccgcctta ctaatgccgc 1800 cccccggtcc gcccctgccg ctgctgccgc tgcctatgac cgccactagt taccgcgggg 1860 accacatcaa gcttcaggcc gacagcttcg gcctccacat cgtccccgtc tgaccccacc 1920 ccggagggag ggaggaccga cgcgacgcga tgcctcccgg ccaccgcccc agcctcaccc 1980 catcccacga cccccgcaac ccttcacatc acccccctcg aaggtcggac aggacgggtg 2040 gagccgtggg cgggaccctc aggcccgggc ccgccgcccc cagccccgcc tgccgcccct 2100 ccccgcctgc ctggactgcg cggcgccgtg agggggattc ggcccagctc gtcccggcct 2160 ccaccaagcc agccccgaag cccgccagcc accctgccgg actcgggcgc gacctgctgg 2220 cgcgcgccgg atgtttctgt gacacacaat cagcgcggac cgcagcgcgg cccagccccg 2280 ggcacccgcc tcggacgctc gggcgccagg aggcttcgct ggaggggctg ggccaaggag 2340 attaagaaga aaacgacttt ctgcaggagg aagagcccgc tgccgaatcc ctgggaaaaa 2400 ttcttttccc ccagtgccag ccggactgcc ctcgccttcc gggtgtgccc tgtcccagaa 2460 gatggaatgg gggtgtgggg gtccggctct aggaacgggc tttgggggcg tcaggtcttt 2520 ccaaggttgg gacccaagga tcggggggcc cagcagcccg caccgatcga gccggactct 2580 cggctcttca ctgctcctcc tggcctgcct agttccccag ggcccggcac ctcctgctgc 2640 gagacccggc tctcagccct gccttgcccc tacctcagcg tctcttccac ctgctggcct 2700 cccagtttcc cctcctgcca gtccttcgcc tgtcccttga cgccctgcat cctcctccct 2760 gactcgcagc cccatcggac gctctcccgg gaccgccgca ggaccagttt ccatagactg 2820 cggactgggg tcttcctcca gcagttactt gatgccccct cccccgacac agactctcaa 2880 tctgccggtg gtaagaaccg gttctgagct ggcgtctgag ctgctgcggg gtggaagtgg 2940 ggggctgccc actccactcc tcccatcccc tcccagcctc ctcctccggc aggaactgaa 3000 cagaaccaca aaaagtctac atttatttaa tatgatggtc tttgcaaaaa ggaacaaaac 3060 aacacaaaag cccaccaggc tgctgctttg tggaaagacg gtgtgtgtcg tgtgaaggcg 3120 aaacccggtg tacataaccc ctccccctcc gccccgcccc gcccggcccc gtagagtccc 3180 tgtcgcccgc cggccctgcc tgtagatacg ccccgctgtc tgtgctgtga gagtcgccgc 3240 tcgctggggg ggaagggggg gacacagcta cacgcccatt aaagcacagc acgtcctggg 3300 ggaggggggc attttttatg ttacaaaaaa aaattacgaa agaaaagaaa tctctatgca 3360 aaatgacgaa catggtcctg tggactcctc tggcctgttt tgttggctct ttctctgtaa 3420 ttccgtgttt tcgctttttc ctccctgccc ctctctccct ctgcccctct ctcctctccg 3480 cttctctccc cctctgtctc tgtctctctc cgtctctgtc gctcttgtct gtctgtctct 3540 gctctttcct cggcctctct ccccagacct ggcccggccg ccctgtctcc gcaggctaga 3600 tccgaggtgg cagctccagc ccccgggctc gccccctcgc gggcgtgccc cgcgcgcccc 3660 gggcggccga aggccgggcc gccccgtccc gccccgtagt tgctctttcg gtagtggcga 3720 tgcgccctgc atgtctcctc acccgtggat cgtgacgact cgaaataaca gaaacaaagt 3780 caataaagtg aaaataaata aaaatccttg aacaaatccg aaaaggcttg gagtcctcgc 3840 ccagatctct ctcccctgcg agcccttttt atttgagaag gaaaaagaga aaagagaatc 3900 gtttaaggga acccggcgcc cagccaggct ccagtggccc gaacggggcg gcgagggcgg 3960 cgagggcgcc gaggtccggc ccatcccagt cctgtggggc tggccgggca gagaccccgg 4020 acccaggccc aggcctaacc tgctaaatgt ccccggacgg ttctggtctc ctcggccact 4080 ttcagtgcgt cggttcgttt tgattctttt tcttttgtgc acataagaaa taaataataa 4140 taataaataa agaataaaat tttgtatgtc aaaaaaaaaa aaaaaaaa 4188 <210> 44 <211> 431 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: note = Synthethic Construct <400> 44 Met Asp Met His Cys Lys Ala Asp Pro Phe Ser Ala Met His Pro Gly 1 5 10 15 His Gly Gly Val Asn Gln Leu Gly Gly Val Phe Val Asn Gly Arg Pro 20 25 30 Leu Pro Asp Val Val Arg Gln Arg Ile Val Glu Leu Ala His Gln Gly 35 40 45 Val Arg Pro Cys Asp Ile Ser Arg Gln Leu Arg Val Ser His Gly Cys 50 55 60 Val Ser Lys Ile Leu Gly Arg Tyr Tyr Glu Thr Gly Ser Ile Lys Pro 65 70 75 80 Gly Val Ile Gly Gly Ser Lys Pro Lys Val Ala Thr Pro Lys Val Val 85 90 95 Asp Lys Ile Ala Glu Tyr Lys Arg Gln Asn Pro Thr 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ctcccggcgc cctctgaccg cccccgcccc gcgcgctctc cgaccaccgc 300 ctctcggatg accaggttcc aggggagctg agcgagtcgc ctcccccgcc cagcttcagc 360 cctggctgca gctgcagcgc gagccatgcg cccccagtgc accccggccc ggcccaccgc 420 cccggggcca ttctgctgac cgcccagccc cgagccccga cagtggcaag ttgcggctac 480 tgcagttgca agctccggcc aacccggagg agccccagcg gggagcgcag tgttgcgccc 540 cccgcccccg cgcgccccgc agcagccggg cgttcactca tcctccctcc cccaccgtcc 600 ctcccttttc tcctcaagtc ctgaagttga gtttgagagg cgacacggcg gcggcggccg 660 cgctgctccc gctcctctgc ctccccatgg atatgcactg caaagcagac cccttctccg 720 cgatgcaccc agggcacggg ggtgtgaacc agctcggggg ggtgtttgtg aacggccggc 780 ccctacccga cgtggtgagg cagcgcatcg tggagctggc ccaccagggt gtgcggccct 840 gtgacatctc ccggcagctg cgggtcagcc acggctgtgt cagcaaaatc ctgggcaggt 900 actacgagac cggcagcatc aagccgggtg tgatcggtgg ctccaagccc aaagtggcga 960 cgcccaaagt ggtggacaag attgctgaat acaaacgaca gaacccgact atgttcgcct 1020 gggagattcg agaccggctc ctggccgagg gcatctgtga caatgacaca gtgcccagcg 1080 tctcttccat caacagaatc atccggacca aagttcagca gcctttccac ccaacgccgg 1140 atggggctgg gacaggagtg accgcccctg gccacaccat tgttcccagc acggcctccc 1200 ctcctgtttc cagcgcctcc aatgacccag tgggatccta ctccatcaat gggatcctgg 1260 ggattcctcg ctccaatggt gagaagagga aacgtgatga agttgaggta tacactgatc 1320 ctgcccacat tagaggaggt ggaggtttgc atctggtctg gactttaaga gatgtgtctg 1380 agggctcagt ccccaatgga gattcccaga gtggtgtgga cagtttgcgg aagcacttgc 1440 gagctgacac cttcacccag cagcagctgg aagctttgga tcgggtcttt gagcgtcctt 1500 cctaccctga cgtcttccag gcatcagagc acatcaaatc agaacagggg aacgagtact 1560 ccctcccagc cctgacccct gggcttgatg aagtcaagtc gagtctatct gcatccacca 1620 accctgagct gggcagcaac gtgtcaggca cacagacata cccagttgtg actggtcgtg 1680 acatggcgag caccactctg cctggttacc cccctcacgt gccccccact ggccagggaa 1740 gctaccccac ctccaccctg gcaggaatgg tgcctgggag cgagttctcc ggcaacccgt 1800 acagccaccc ccagtacacg gcctacaacg aggcttggag attcagcaac cccgccttac 1860 taatgccgcc ccccggtccg cccctgccgc tgctgccgct gcctatgacc gccactagtt 1920 accgcgggga ccacatcaag cttcaggccg acagcttcgg cctccacatc gtccccgtct 1980 gaccccaccc cggagggagg gaggaccgac gcgacgcgat gcctcccggc caccgcccca 2040 gcctcacccc atcccacgac ccccgcaacc cttcacatca cccccctcga aggtcggaca 2100 ggacgggtgg agccgtgggc gggaccctca ggcccgggcc cgccgccccc agccccgcct 2160 gccgcccctc cccgcctgcc tggactgcgc ggcgccgtga gggggattcg gcccagctcg 2220 tcccggcctc caccaagcca gccccgaagc ccgccagcca ccctgccgga ctcgggcgcg 2280 acctgctggc gcgcgccgga tgtttctgtg acacacaatc agcgcggacc gcagcgcggc 2340 ccagccccgg gcacccgcct cggacgctcg ggcgccagga ggcttcgctg gaggggctgg 2400 gccaaggaga ttaagaagaa aacgactttc tgcaggagga agagcccgct gccgaatccc 2460 tgggaaaaat tcttttcccc cagtgccagc cggactgccc tcgccttccg ggtgtgccct 2520 gtcccagaag atggaatggg ggtgtggggg tccggctcta ggaacgggct ttgggggcgt 2580 caggtctttc caaggttggg acccaaggat cggggggccc agcagcccgc accgatcgag 2640 ccggactctc ggctcttcac tgctcctcct ggcctgccta gttccccagg gcccggcacc 2700 tcctgctgcg agacccggct ctcagccctg ccttgcccct acctcagcgt ctcttccacc 2760 tgctggcctc ccagtttccc ctcctgccag tccttcgcct gtcccttgac gccctgcatc 2820 ctcctccctg actcgcagcc ccatcggacg ctctcccggg accgccgcag gaccagtttc 2880 catagactgc ggactggggt cttcctccag cagttacttg atgccccctc ccccgacaca 2940 gactctcaat ctgccggtgg taagaaccgg ttctgagctg gcgtctgagc tgctgcgggg 3000 tggaagtggg gggctgccca ctccactcct cccatcccct cccagcctcc tcctccggca 3060 ggaactgaac agaaccacaa aaagtctaca tttatttaat atgatggtct ttgcaaaaag 3120 gaacaaaaca acacaaaagc ccaccaggct gctgctttgt ggaaagacgg tgtgtgtcgt 3180 gtgaaggcga aacccggtgt acataacccc tccccctccg ccccgccccg cccggccccg 3240 tagagtccct gtcgcccgcc ggccctgcct gtagatacgc cccgctgtct gtgctgtgag 3300 agtcgccgct cgctgggggg gaaggggggg acacagctac acgcccatta aagcacagca 3360 cgtcctgggg gaggggggca ttttttatgt tacaaaaaaa aattacgaaa gaaaagaaat 3420 ctctatgcaa aatgacgaac atggtcctgt ggactcctct ggcctgtttt gttggctctt 3480 tctctgtaat tccgtgtttt cgctttttcc tccctgcccc tctctccctc tgcccctctc 3540 tcctctccgc ttctctcccc ctctgtctct gtctctctcc gtctctgtcg ctcttgtctg 3600 tctgtctctg ctctttcctc ggcctctctc cccagacctg gcccggccgc cctgtctccg 3660 caggctagat ccgaggtggc agctccagcc cccgggctcg ccccctcgcg ggcgtgcccc 3720 gcgcgccccg ggcggccgaa ggccgggccg ccccgtcccg ccccgtagtt gctctttcgg 3780 tagtggcgat gcgccctgca tgtctcctca cccgtggatc gtgacgactc gaaataacag 3840 aaacaaagtc aataaagtga aaataaataa aaatccttga acaaatccga aaaggcttgg 3900 agtcctcgcc cagatctctc tcccctgcga gcccttttta tttgagaagg aaaaagagaa 3960 aagagaatcg tttaagggaa cccggcgccc agccaggctc cagtggcccg aacggggcgg 4020 cgagggcggc gagggcgccg aggtccggcc catcccagtc ctgtggggct ggccgggcag 4080 agaccccgga cccaggccca ggcctaacct gctaaatgtc cccggacggt tctggtctcc 4140 tcggccactt tcagtgcgtc ggttcgtttt gattcttttt cttttgtgca cataagaaat 4200 aaataataat aataaataaa gaataaaatt ttgtatgtca aaaaaaaaaa aaaaaaa 4257 <210> 46 <211> 104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: note = Synthethic Construct <400> 46 ttcacccttg actgtggcac ctcccttcag ttccgtcgac gaggttgtgc aatccaccag 60 tcttataaat acagtgacgc tccagcctct 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Claims (42)

  1. 대상의 전립선으로부터의 세포 내에서 PAX2 및 베타 데펜신-1 (DEFB1)의 수준을 검출하는 것을 포함하고, 여기서 PAX2 대 DEFB1의 비가 적어도 약 100:1인, 대상에서 전립선암을 진단하는 방법.
  2. 대상의 전립선으로부터의 세포 내에서 PAX2 및 베타 데펜신-1 (DEFB1)의 수준을 검출하는 것을 포함하고, 여기서 PAX2 대 DEFB1의 비가 적어도 약 40:1 내지 약 100:1 미만인, 대상에서 전립선 상피내 종양 (PIN)을 진단하는 방법.
  3. 대상의 전립선으로부터의 세포 내에서 PAX2 및 베타 데펜신-1 (DEFB1)의 수준을 검출하는 것을 포함하고, 여기서 PAX2 대 DEFB1의 비가 약 40:1 미만인, 대상을 정상 전립선을 갖는 것으로서 확인하는 방법.
  4. 대상의 전립선으로부터의 세포 내에서 PAX2 및 베타 데펜신-1 (DEFB1)의 수준을 검출하는 것을 포함하고, 여기서 (a) PAX2 대 DEFB1의 비가 약 40:1 미만이면, 정상 전립선 상태가 검출되고; (b) PAX2 대 DEFB1의 비가 적어도 약 40:1 내지 약 100:1 미만이면, 전암성 상태가 검출되고; (c) PAX2 대 DEFB1의 비가 적어도 약 100:1이면, 암성 전립선이 검출되는 것인, 대상에서 정상, 전-암성 및 암성 전립선 상태를 구분하는 방법.
  5. 전립선 상피내 종양 (PIN)으로 진단된 대상에게 PAX2 발현 또는 활성의 억제제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 전립선암을 예방하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 억제제가 안지오텐신 II 또는 안지오텐신-전환 효소 (ACE)의 선택적 길항제인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 억제제가 안지오텐신 II 타입 1 수용체 (AT1R)의 선택적 길항제인 방법.
  8. 제5항에 있어서, 억제제가 미토겐-활성화된 단백질/세포외 신호-조절된 키나제 (MEK)의 선택적 길항제인 방법.
  9. 제5항에 있어서, 억제제가 세포외 신호-조절된 키나제 (ERK)1 및/또는 ERK2의 선택적 길항제인 방법.
  10. 제5항에 있어서, 억제제가 신호 전달자 및 전사 활성인자 3 (STAT3)의 선택적 길항제인 방법.
  11. 제5항에 있어서, 억제제가 페어드 박스 2 (PAX2)의 선택적 길항제인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 억제제가 베타 데펜신-1 (DEFB1) 프로모터에 대한 PAX2의 결합을 차단하는 것인 방법.
  13. (a) 대상을 전립선 상피내 종양 (PIN)으로 진단하고,
    (b) 대상에게 PAX2 발현 또는 활성의 억제제를 포함하는 조성물을 투여하는 것
    을 포함하는, 대상에서 전립선암을 예방하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 대상이 대상의 전립선으로부터의 세포 내에서 PAX2 및 베타 데펜신-1 (DEFB1)의 수준을 검출함으로써 PIN으로 진단받고, 여기서 PAX2 대 DEFB1의 비가 적어도 약 40:1 내지 약 100:1인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 억제제가 안지오텐신 II 또는 안지오텐신-전환 효소 (ACE)의 선택적 길항제인 방법.
  16. 제13항에 있어서, 억제제가 안지오텐신 II 타입 1 수용체 (AT1R)의 선택적 길항제인 방법.
  17. 제13항에 있어서, 억제제가 MEK의 선택적 길항제인 방법.
  18. 제13항에 있어서, 억제제가 ERK1,2의 선택적 길항제인 방법.
  19. 제13항에 있어서, 억제제가 STAT3의 선택적 길항제인 방법.
  20. 제13항에 있어서, 억제제가 PAX2의 선택적 길항제인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 억제제가 베타 데펜신-1 (DEFB1)의 PAX2 프로모터에 대한 결합을 차단하는 것인 방법.
  22. (a) 대상을 PIN으로 진단하고,
    (b) 대상에게 PAX2 발현 또는 활성의 억제제를 포함하는 조성물을 투여하는 것
    을 포함하는, 대상에서 전립선 상피내 종양 (PIN)을 치료하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 대상이 대상의 전립선으로부터의 세포 내에서 PAX2 및 베타 데펜신-1 (DEFB1)의 수준을 검출함으로써 PIN으로 진단받고, 여기서 PAX2 대 DEFB1의 비가 적어도 약 40:1 내지 약 100:1 미만인 방법.
  24. 제22항에 있어서, 억제제가 안지오텐신 II 또는 안지오텐신-전환 효소 (ACE)의 선택적 길항제인 방법.
  25. 제22항에 있어서, 억제제가 안지오텐신 II 타입 1 수용체 (AT1R)의 선택적 길항제인 방법.
  26. 제22항에 있어서, 억제제가 MEK의 선택적 길항제인 방법.
  27. 제22항에 있어서, 억제제가 ERK1,2의 선택적 길항제인 방법.
  28. 제22항에 있어서, 억제제가 STAT3의 선택적 길항제인 방법.
  29. 제22항에 있어서, 억제제가 PAX2의 선택적 길항제인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 억제제가 베타 데펜신-1 (DEFB1)의 PAX2 프로모터에 대한 결합을 차단하는 것인 방법.
  31. (a) 대상을 전립선암으로 진단하고,
    (b) 대상에게 PAX2 발현 또는 활성의 억제제를 포함하는 조성물을 투여하는 것
    을 포함하는, 대상에서 전립선암을 치료하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 대상이 대상의 전립선으로부터의 세포 내에서 PAX2 및 베타 데펜신-1 (DEFB1)의 수준을 검출함으로써 전립선암으로 진단받고, 여기서 PAX2 대 DEFB1의 비가 적어도 약 100:1인 방법.
  33. 제31항에 있어서, 억제제가 안지오텐신 II 또는 안지오텐신-전환 효소 (ACE)의 선택적 길항제인 방법.
  34. 제31항에 있어서, 억제제가 안지오텐신 II 타입 1 수용체 (AT1R)의 선택적 길항제인 방법.
  35. 제31항에 있어서, 억제제가 MEK의 선택적 길항제인 방법.
  36. 제31항에 있어서, 억제제가 ERK1,2의 선택적 길항제인 방법.
  37. 제31항에 있어서, 억제제가 STAT3의 선택적 길항제인 방법.
  38. 제31항에 있어서, 억제제가 PAX2의 선택적 길항제인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 억제제가 베타 데펜신-1 (DEFB1)의 PAX2 프로모터에 대한 결합을 차단하는 것인 방법.
  40. 대상에게 MEK 및/또는 ERK1,2의 선택적 길항제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 전립선암을 치료 또는 예방하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 선택적 길항제가 U0126 또는 PD98059인 방법.
  42. 대상에게 STAT3의 선택적 길항제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 전립선암을 치료 또는 예방하는 방법.
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