CN109781988A - 采用her2基因扩增法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法 - Google Patents

采用her2基因扩增法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法 Download PDF

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CN109781988A
CN109781988A CN201910151700.3A CN201910151700A CN109781988A CN 109781988 A CN109781988 A CN 109781988A CN 201910151700 A CN201910151700 A CN 201910151700A CN 109781988 A CN109781988 A CN 109781988A
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侯净
魏娜
朱海振
戴民
陈欢
陆婧
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Abstract

本发明公开了采用HER2基因扩增法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法,所述方法包括以下步骤:S1:采集乳腺癌患者的外周血,并将外周血中的乳腺癌循环肿瘤细胞进行分离,得到乳腺癌循环肿瘤细胞;S2:对分离得到的乳腺癌循环肿瘤细胞进行检验,检验其是否存在;S3:对乳腺癌循环肿瘤细胞进行培养扩增;S4:将培养扩增后的乳腺癌循环肿瘤细胞制成检测切片;S5:检测乳腺癌循环肿瘤细胞的HER2表达情况。本发明方法操作简单,检测准确度高,可以避免假阴性等情况,提高对乳腺癌的排查准确度。

Description

采用HER2基因扩增法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法
技术领域
本发明涉及分子生物学检验技术领域,具体是涉及一种采用HER2基因扩增法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法。
背景技术
恶性肿瘤都会通过血液传播转移到身体的其他器官,而肿瘤转移是导致肿瘤患者死亡的主要原因。肿瘤细胞侵入到原发肿瘤细胞的周围组织中,进入血液和淋巴管系统,形成循环肿瘤细胞CTC,并转运到远端组织,再渗出,适应新的微环境,最终“播种”、“增殖”、“定植”、形成转移灶。因此早期发现血液中的CTC,对于患者预后判断、疗效评价和个体化治疗都有着重要的指导作用。
HER2是重要的乳腺癌预后判断因子,HER2也称c-erbB-2基因。原癌基因人类表皮生长因子受体2基因,即c-erbB-2基因,定位于染色体17q12-21.32上,编码相对分子质量为185000的跨膜受体样蛋白,具有酪氨酸激酶活性。检测方法有免疫组化、FISH等。
随着女性乳腺癌死亡率的逐年上升,乳腺癌已成为女性死亡的重要原因,但是现有技术中对乳腺癌的检测、预后判断等仍有一定的不足。因此,为了提高对乳腺癌的检测,通过更精准有效的检测排查乳腺癌,进而降低乳腺癌的死亡率,减少乳腺癌对女性的伤害,现需要一种采用HER2基因扩增法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的方法来解决改善这一问题。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明提供了一种采用HER2基因扩增法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法。
本发明的技术方案是:一种采用HER2基因扩增法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法,所述方法包括以下步骤:
S1:采集乳腺癌患者的外周血,并将外周血中的乳腺癌循环肿瘤细胞进行分离,得到乳腺癌循环肿瘤细胞;
S2:对分离得到的乳腺癌循环肿瘤细胞进行检验,检验其是否存在;
S3:若存在,对乳腺癌循环肿瘤细胞进行培养扩增;若不存在,重复步骤S1~S2;
S4:将培养扩增后的乳腺癌循环肿瘤细胞制成检测切片;
S5:检测乳腺癌循环肿瘤细胞的HER2表达情况。
进一步地,所述步骤S1中具体为:采集乳腺癌症患者外周血8~10ml,并将采集的血样与裂解液按照1:(5~8)混合,混合均匀后升温至23~28℃并加入占其体积百分比为2.5%的戊二醛,保温1~2分钟后,以2~3℃的速度降温至15~17℃,降温期间滴加占其体积百分比为1.5%的谷氨酸钠,并静置2~3min,用PBS液洗涤离心得到乳腺癌循环肿瘤细胞。通过该配比下裂解液与血样混合,补加该剂量的戊二醛并在该温度范围下进行混合,可以显著提高分离效果,速率降温期间添加该剂量的谷氨酸钠可以起到保护乳腺癌循环肿瘤细胞及促进分离的作用,通过本方法进行乳腺癌循环肿瘤细胞的分离,乳腺癌循环肿瘤细胞的质量高,分离效果好,可以提高乳腺癌循环肿瘤细胞的数量,避免多次采集影响患者及增加工作人员工作难度。
更进一步地,所述裂解液为红细胞裂解液,且内含有占其体积百分比为0.5%的甘草酸二甲。添加该剂量的甘草酸二甲可以对乳腺癌循环肿瘤细胞起到一定辅助保护作用,同时可以促进戊二醛的效果。
进一步地,所述步骤S2中具体为:
(1)将乳腺癌循环肿瘤细胞的样本进行离心去上清,然后加入温度为38.5℃的0.09mol/L KCl溶液12~15mL,振荡混匀后以0.5℃/min降温至36.5℃静置15~20min;通过两段式变温进行混合,可以提高乳腺癌循环肿瘤细胞与KCl溶液的混合度。
(2)加入3ml的戊二醛和0.7ml的羟甲基纤维素钠,离心吸去上清液,加入适量丙烯醛,制成浓度适中的悬浊细胞液;加入该剂量比的戊二醛和羟甲基纤维素钠对细胞处理效果更优,相对于传统的固定剂处理,固定剂使用剂量减少,同时可有效的保护细胞,保障后续步骤检测准确度。
(3)吸取4~6μL悬浊细胞液滴至防脱载玻片上,老化处理后,依次向玻片加入封闭液和穿孔剂,多次漂洗直至干净,将玻片脱水后自然干燥;
(4)将CEA抗原和C-MET探针混合液在24℃±0.5℃下自然混合,待混合均匀后进行离心,取8μL滴在杂交区域,并迅速盖上盖玻片,将玻片置于杂交仪上进行杂交孵育;通过CEA与C-MET探针联合鉴定乳腺癌循环肿瘤细胞,检测速度快,操作简便,检测准确度高,适用性强。
(5)取出孵育后的玻片,将玻片置于56~61℃的PBS液中振荡5~8s脱去盖玻片,然后以3℃/min速度降温至28~33℃,取出玻片,以35℃的蒸馏水冲洗3~5次,每次2min,然后置于暗处自然干燥玻片;以速率降温的方式降温至28~33℃,随后配合温差在2~7℃的蒸馏水冲洗,可以有效保护玻片,同时减少对乳腺癌循环肿瘤细胞的影响,提高检测精度。
(6)滴加8uL复染剂,并在荧光显微镜下观察玻片,若CEA未被染色,且非巨大裸核可以判断为乳腺癌循环肿瘤细胞。本方法通过CEA与C-MET探针联合鉴定乳腺癌循环肿瘤细胞,检测速度快,检测准确度高。
更进一步地,所述杂交孵育的条件为:65℃变性50s后快速升温至72℃保持2min,随后以5℃/min降温至36℃孵育50~85min。通过两个阶段条件的变性处理,可以提高杂交孵育的效果,提高观察效果,增强检测精度。
进一步地,所述步骤S3具体为:将乳腺癌循环肿瘤细胞悬浮于含有5~15%FBS的培养液中,然后置于CO2细胞培养箱中进行培养两个阶段培养,一阶段为培养温度在23~28℃下培养4~6h后,加入300~500粒的纳米磁性小球并继续培养8~10h,以0.5℃/h降温至18~21℃后进入二阶段培养,二阶段为每隔12~16h更换一次培养液,并每间隔20~30min施加4~5T的恒定磁场5~10min,培养液更换3~4次后得到培养扩增细胞,再加入占其总体积2~3倍的秋水仙素中培养1~2h,形成培养扩增后的乳腺癌循环肿瘤细胞。通过加入纳米磁性小球,同时配合两个阶段的培养,可以显著提高乳腺癌循环肿瘤细胞的培养扩增效果及细胞活性,同时施加该条件下的恒定磁场可以辅助配合纳米磁性小球的作用,进一步增强使用效果。
更进一步地,所述纳米磁性小球为四氧化三铁、汝铁硼磁铁按照7:1组合而成,且外层包覆有厚度为0.03mm的纳米陶瓷。该比例下配制的纳米磁性小球磁性强,使用效果好,同时外层包覆有纳米陶瓷可以有效避免四氧化三铁、汝铁硼磁铁成分对乳腺癌循环肿瘤细胞的影响。
进一步地,所述步骤S4具体为:收集培养扩增后的乳腺癌循环肿瘤细胞,依次经过固定、脱水、透明化处理、石蜡包埋、切片,制成检测切片。
进一步地,所述步骤S5具体为:
1)将检测切片脱蜡、水化,使用去离子水冲洗3~5次直到各溶液冲净,将检测切片置于磷酸盐缓冲液700~900ml中,180KPa压强下蒸煮3~5min,冷却至室温,使用去离子水冲洗2~3次;再使用含有2.6%H2O2的蒸馏水浸泡检测切片8min,使用PBS液冲洗2~3次;
2)首先滴加HER2单抗,36.8℃下静置2~3h然后迅速降温至10℃静置0.5~1h,使用PBS液冲洗2~3次;继续滴加SPG-抗体多聚体,在常温下静置15min,使用PBS液冲洗2~3次;去除PBS残留液,在显微镜观察下在切片上滴加DAB溶液至显色;
3)依次经过蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明封片;阅片检测乳腺癌循环肿瘤细胞的HER2表达情况。
本发明的有益效果是:
(1)本发明采用采用HER2基因扩增法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法对乳腺癌进行检测,操作简单,检测准确度高,可以避免假阴性等情况,提高对乳腺癌的排查准确度。
(2)本发明的方法进行乳腺癌循环肿瘤细胞的分离,乳腺癌循环肿瘤细胞的质量高,分离效果好,可以提高乳腺癌循环肿瘤细胞的数量,避免多次采集影响患者及增加工作人员工作难度。
(3)本发明对乳腺癌循环肿瘤细胞的鉴定方法通过CEA与C-MET探针联合鉴定乳腺癌循环肿瘤细胞,检测速度快,检测准确度高。
(4)本发明的培养扩增方法通过加入纳米磁性小球,同时配合两个阶段的培养,可以显著提高乳腺癌循环肿瘤细胞的培养扩增效果及细胞活性,同时施加该条件下的恒定磁场可以辅助配合纳米磁性小球的作用,进一步增强检测效果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式来对本发明进行更进一步详细的说明,以更好地体现本发明的优势。
实施例1
一种采用HER2基因扩增法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法,包括以下步骤:
S1:采集乳腺癌症患者外周血8ml,并将采集的血样与裂解液按照1:5混合,混合均匀后升温至23℃并加入占其体积百分比为2.5%的戊二醛,保温1分钟后,以2℃的速度降温至15℃,降温期间滴加占其体积百分比为1.5%的谷氨酸钠,并静置2min,用PBS液洗涤离心得到乳腺癌循环肿瘤细胞;裂解液为红细胞裂解液,且内含有占其体积百分比为0.5%的甘草酸二甲。
S2:对分离得到的乳腺癌循环肿瘤细胞进行检验,检验其是否存在,具体为:
(1)将乳腺癌循环肿瘤细胞的样本进行离心去上清,然后加入温度为38.5℃的0.09mol/L KCl溶液12mL,振荡混匀后以0.5℃/min降温至36.5℃静置15min;
(2)加入3ml的戊二醛和0.7ml的羟甲基纤维素钠,离心吸去上清液,加入适量丙烯醛,制成丙烯醛质量浓度为2.3%的悬浊细胞液;
(3)吸取4μL悬浊细胞液滴至防脱载玻片上,老化处理后,依次向玻片加入封闭液和穿孔剂,多次漂洗直至干净,将玻片脱水后自然干燥;
(4)将CEA抗原和C-MET探针混合液在23.5℃下自然混合,待混合均匀后进行离心,取8μL滴在杂交区域,并迅速盖上盖玻片,将玻片置于杂交仪上进行杂交孵育;杂交孵育的条件为:65℃变性50s后快速升温至72℃保持2min,随后以5℃/min降温至36℃孵育50min;
(5)取出孵育后的玻片,将玻片置于56℃的PBS液中振荡5s脱去盖玻片,然后以3℃/min速度降温至28℃,取出玻片,以35℃的蒸馏水冲洗3次,每次2min,然后置于暗处自然干燥玻片;
(6)滴加8uL复染剂,并在荧光显微镜下观察玻片,CEA未被染色,且非巨大裸核,则为乳腺癌循环肿瘤细胞,进行下一个步骤。
S3:将乳腺癌循环肿瘤细胞悬浮于含有5%FBS的培养液中,然后置于CO2细胞培养箱中进行培养两个阶段培养,一阶段为培养温度在23℃下培养4h后,加入300粒的纳米磁性小球并继续培养8h,以0.5℃/h降温至18℃后进入二阶段培养,二阶段为每隔12h更换一次培养液,并每间隔20min施加4T的恒定磁场5min,培养液更换3次后得到培养扩增细胞,再将其加入占其总体积2倍的秋水仙素中培养1h,形成培养扩增后的乳腺癌循环肿瘤细胞。纳米磁性小球为四氧化三铁、汝铁硼磁铁按照7:1组合而成,且外层包覆有厚度为0.03mm的纳米陶瓷。
S4:收集培养扩增后的乳腺癌循环肿瘤细胞,依次经过固定、脱水、透明化处理、石蜡包埋、切片,制成检测切片;
S5:检测乳腺癌循环肿瘤细胞的HER2表达情况,具体为:
1)将检测切片脱蜡、水化,使用去离子水冲洗3次直到各溶液冲净,将检测切片置于磷酸盐缓冲液700ml中,180KPa压强下蒸煮3min,冷却至室温,使用去离子水冲洗2次;再使用含有2.6%H2O2的蒸馏水浸泡检测切片8min,使用PBS液冲洗2次;
2)首先滴加HER2单抗,36.8℃下静置2h然后迅速降温至10℃静置0.5h,使用PBS液冲洗2次;继续滴加SPG-抗体多聚体,在常温下静置15min,使用PBS液冲洗2次;去除PBS残留液,在显微镜观察下在切片上滴加DAB溶液至显色;
3)依次经过蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明封片;阅片检测乳腺癌循环肿瘤细胞的HER2表达情况,检测结果呈阳性。
实施例2
一种采用HER2基因扩增法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法,包括以下步骤:
S1:采集乳腺癌症患者外周血9ml,并将采集的血样与裂解液按照1:7混合,混合均匀后升温至25℃并加入占其体积百分比为2.5%的戊二醛,保温1.5分钟后,以3℃的速度降温至16℃,降温期间滴加占其体积百分比为1.5%的谷氨酸钠,并静置2.5min,用PBS液洗涤离心得到乳腺癌循环肿瘤细胞;裂解液为红细胞裂解液,且内含有占其体积百分比为0.5%的甘草酸二甲。
S2:对分离得到的乳腺癌循环肿瘤细胞进行检验,检验其是否存在,具体为:
(1)将乳腺癌循环肿瘤细胞的样本进行离心去上清,然后加入温度为38.5℃的0.09mol/L KCl溶液13mL,振荡混匀后以0.5℃/min降温至36.5℃静置17min;
(2)加入3ml的戊二醛和0.7ml的羟甲基纤维素钠,离心吸去上清液,加入适量丙烯醛,制成丙烯醛质量浓度为2.5%的悬浊细胞液;
(3)吸取5μL悬浊细胞液滴至防脱载玻片上,老化处理后,依次向玻片加入封闭液和穿孔剂,多次漂洗直至干净,将玻片脱水后自然干燥;
(4)将CEA抗原和C-MET探针混合液在24℃下自然混合,待混合均匀后进行离心,取8μL滴在杂交区域,并迅速盖上盖玻片,将玻片置于杂交仪上进行杂交孵育;杂交孵育的条件为:65℃变性50s后快速升温至72℃保持2min,随后以5℃/min降温至36℃孵育65min;
(5)取出孵育后的玻片,将玻片置于59℃的PBS液中振荡6s脱去盖玻片,然后以3℃/min速度降温至31℃,取出玻片,以35℃的蒸馏水冲洗4次,每次2min,然后置于暗处自然干燥玻片;
(6)滴加8uL复染剂,并在荧光显微镜下观察玻片,CEA未被染色,且非巨大裸核,则为乳腺癌循环肿瘤细胞,进行下一个步骤。
S3:将乳腺癌循环肿瘤细胞悬浮于含有11%FBS的培养液中,然后置于CO2细胞培养箱中进行培养两个阶段培养,一阶段为培养温度在26℃下培养5h后,加入450粒的纳米磁性小球并继续培养9h,以0.5℃/h降温至20℃后进入二阶段培养,二阶段为每隔14h更换一次培养液,并每间隔25min施加5T的恒定磁场7min,培养液更换4次后得到培养扩增细胞,再将其加入占其总体积3倍的秋水仙素中培养1.4h,形成培养扩增后的乳腺癌循环肿瘤细胞。纳米磁性小球为四氧化三铁、汝铁硼磁铁按照7:1组合而成,且外层包覆有厚度为0.03mm的纳米陶瓷。
S4:收集培养扩增后的乳腺癌循环肿瘤细胞,依次经过固定、脱水、透明化处理、石蜡包埋、切片,制成检测切片;
S5:检测乳腺癌循环肿瘤细胞的HER2表达情况,具体为:
1)将检测切片脱蜡、水化,使用去离子水冲洗4次直到各溶液冲净,将检测切片置于磷酸盐缓冲液825ml中,180KPa压强下蒸煮4min,冷却至室温,使用去离子水冲洗3次;再使用含有2.6%H2O2的蒸馏水浸泡检测切片8min,使用PBS液冲洗2次;
2)首先滴加HER2单抗,36.8℃下静置2.5h然后迅速降温至10℃静置0.7h,使用PBS液冲洗3次;继续滴加SPG-抗体多聚体,在常温下静置15min,使用PBS液冲洗3次;去除PBS残留液,在显微镜观察下在切片上滴加DAB溶液至显色;
3)依次经过蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明封片;阅片检测乳腺癌循环肿瘤细胞的HER2表达情况,检测结果呈阳性。
实施例3
一种采用HER2基因扩增法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法,包括以下步骤:
S1:采集乳腺癌症患者外周血10ml,并将采集的血样与裂解液按照1:8混合,混合均匀后升温至28℃并加入占其体积百分比为2.5%的戊二醛,保温2分钟后,以3℃的速度降温至17℃,降温期间滴加占其体积百分比为1.5%的谷氨酸钠,并静置3min,用PBS液洗涤离心得到乳腺癌循环肿瘤细胞;裂解液为红细胞裂解液,且内含有占其体积百分比为0.5%的甘草酸二甲。
S2:对分离得到的乳腺癌循环肿瘤细胞进行检验,检验其是否存在,具体为:
(1)将乳腺癌循环肿瘤细胞的样本进行离心去上清,然后加入温度为38.5℃的0.09mol/L KCl溶液15mL,振荡混匀后以0.5℃/min降温至36.5℃静置20min;
(2)加入3ml的戊二醛和0.7ml的羟甲基纤维素钠,离心吸去上清液,加入适量丙烯醛,制成丙烯醛质量浓度为2.8%的悬浊细胞液;
(3)吸取6μL悬浊细胞液滴至防脱载玻片上,老化处理后,依次向玻片加入封闭液和穿孔剂,多次漂洗直至干净,将玻片脱水后自然干燥;
(4)将CEA抗原和C-MET探针混合液在24.5℃下自然混合,待混合均匀后进行离心,取8μL滴在杂交区域,并迅速盖上盖玻片,将玻片置于杂交仪上进行杂交孵育;杂交孵育的条件为:65℃变性50s后快速升温至72℃保持2min,随后以5℃/min降温至36℃孵育85min;
(5)取出孵育后的玻片,将玻片置于61℃的PBS液中振荡8s脱去盖玻片,然后以3℃/min速度降温至33℃,取出玻片,以35℃的蒸馏水冲洗5次,每次2min,然后置于暗处自然干燥玻片;
(6)滴加8uL复染剂,并在荧光显微镜下观察玻片,CEA被染色,且为巨大裸核,则非乳腺癌循环肿瘤细胞,重复步骤S1~S2,直到检测出乳腺癌循环肿瘤细胞,再进行下一个步骤。
S3:将乳腺癌循环肿瘤细胞悬浮于含有15%FBS的培养液中,然后置于CO2细胞培养箱中进行培养两个阶段培养,一阶段为培养温度在28℃下培养6h后,加入500粒的纳米磁性小球并继续培养10h,以0.5℃/h降温至21℃后进入二阶段培养,二阶段为每隔16h更换一次培养液,并每间隔30min施加5T的恒定磁场10min,培养液更换4次后得到培养扩增细胞,再将其加入占其总体积3倍的秋水仙素中培养2h,形成培养扩增后的乳腺癌循环肿瘤细胞。纳米磁性小球为四氧化三铁、汝铁硼磁铁按照7:1组合而成,且外层包覆有厚度为0.03mm的纳米陶瓷。
S4:收集培养扩增后的乳腺癌循环肿瘤细胞,依次经过固定、脱水、透明化处理、石蜡包埋、切片,制成检测切片;
S5:检测乳腺癌循环肿瘤细胞的HER2表达情况,具体为:
1)将检测切片脱蜡、水化,使用去离子水冲洗5次直到各溶液冲净,将检测切片置于磷酸盐缓冲液900ml中,180KPa压强下蒸煮5min,冷却至室温,使用去离子水冲洗3次;再使用含有2.6%H2O2的蒸馏水浸泡检测切片8min,使用PBS液冲洗3次;
2)首先滴加HER2单抗,36.8℃下静置3h然后迅速降温至10℃静置1h,使用PBS液冲洗3次;继续滴加SPG-抗体多聚体,在常温下静置15min,使用PBS液冲洗3次;去除PBS残留液,在显微镜观察下在切片上滴加DAB溶液至显色;
3)依次经过蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明封片;阅片检测乳腺癌循环肿瘤细胞的HER2表达情况,检测结果呈阳性。
实施例4
一种采用HER2基因扩增法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法,包括以下步骤:
S1:采集乳腺癌症患者外周血9ml,并将采集的血样与裂解液按照1:7混合,混合均匀后升温至25℃并加入占其体积百分比为2.5%的戊二醛,保温1.5分钟后,以3℃的速度降温至16℃,降温期间滴加占其体积百分比为1.5%的谷氨酸钠,并静置2.5min,用PBS液洗涤离心得到乳腺癌循环肿瘤细胞;裂解液为红细胞裂解液,且内含有占其体积百分比为0.5%的甘草酸二甲。
S2:对分离得到的乳腺癌循环肿瘤细胞进行检验,检验其是否存在,具体为:
(1)将乳腺癌循环肿瘤细胞的样本进行离心去上清,然后加入温度为38.5℃的0.09mol/L KCl溶液13mL,振荡混匀后以0.5℃/min降温至36.5℃静置17min;
(2)加入3ml的戊二醛和0.7ml的羟甲基纤维素钠,离心吸去上清液,加入适量丙烯醛,制成丙烯醛质量浓度为2.5%的悬浊细胞液;
(3)吸取5μL悬浊细胞液滴至防脱载玻片上,老化处理后,依次向玻片加入封闭液和穿孔剂,多次漂洗直至干净,将玻片脱水后自然干燥;
(4)将CEA抗原和C-MET探针混合液在24℃下自然混合,待混合均匀后进行离心,取8μL滴在杂交区域,并迅速盖上盖玻片,将玻片置于杂交仪上进行杂交孵育;杂交孵育的条件为:65℃变性50s后快速升温至72℃保持2min,随后以5℃/min降温至36℃孵育65min;
(5)取出孵育后的玻片,将玻片置于59℃的PBS液中振荡6s脱去盖玻片,然后以3℃/min速度降温至31℃,取出玻片,以35℃的蒸馏水冲洗4次,每次2min,然后置于暗处自然干燥玻片;
(6)滴加8uL复染剂,并在荧光显微镜下观察玻片,CEA未被染色,且非巨大裸核,则为乳腺癌循环肿瘤细胞,进行下一个步骤。
S3:将乳腺癌循环肿瘤细胞悬浮于含有11%FBS的培养液中,然后置于CO2细胞培养箱中进行培养两个阶段培养,一阶段为培养温度在26℃下培养5h后,加入450粒的纳米磁性小球并继续培养9h,以0.5℃/h降温至20℃后进入二阶段培养,二阶段为每隔14h更换一次培养液,并每间隔25min施加5T的恒定磁场7min,培养液更换4次后得到培养扩增细胞,再将其加入占其总体积3倍的秋水仙素中培养1.4h,形成培养扩增后的乳腺癌循环肿瘤细胞。纳米磁性小球为四氧化三铁、汝铁硼磁铁按照7:1组合而成,且外层包覆有厚度为0.03mm的纳米陶瓷。
S4:收集培养扩增后的乳腺癌循环肿瘤细胞,依次经过固定、脱水、透明化处理、石蜡包埋、切片,制成检测切片;
S5:检测乳腺癌循环肿瘤细胞的HER2表达情况,具体为:
1)将检测切片脱蜡、水化,使用去离子水冲洗4次直到各溶液冲净,将检测切片置于磷酸盐缓冲液825ml中,180KPa压强下蒸煮4min,冷却至室温,使用去离子水冲洗3次;再使用含有2.6%H2O2的蒸馏水浸泡检测切片8min,使用PBS液冲洗2次;
2)首先滴加HER2单抗,36.8℃下静置2.5h然后迅速降温至10℃静置0.7h,使用PBS液冲洗3次;继续滴加SPG-抗体多聚体,在常温下静置15min,使用PBS液冲洗3次;去除PBS残留液,在显微镜观察下在切片上滴加DAB溶液至显色;
3)依次经过蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明封片;阅片检测乳腺癌循环肿瘤细胞的HER2表达情况,检测结果呈阴性。
最后应说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.一种采用HER2基因扩增法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
S1:采集乳腺癌患者的外周血,并将外周血中的乳腺癌循环肿瘤细胞进行分离,得到乳腺癌循环肿瘤细胞;
S2:对分离得到的乳腺癌循环肿瘤细胞进行检验,检验其是否存在;
S3:若存在,对乳腺癌循环肿瘤细胞进行培养扩增;若不存在,重复步骤S1~S2;
S4:将培养扩增后的乳腺癌循环肿瘤细胞制成检测切片;
S5:检测乳腺癌循环肿瘤细胞的HER2表达情况。
2.根据权利要求1所述的一种采用HER2基因扩增法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法,其特征在于,所述步骤S1中具体为:采集乳腺癌症患者外周血8~10ml,并将采集的血样与裂解液按照1:(5~8)混合,混合均匀后升温至23~28℃并加入占其体积百分比为2.5%的戊二醛,保温1~2分钟后,以2~3℃的速度降温至15~17℃,降温期间滴加占其体积百分比为1.5%的谷氨酸钠,并静置2~3min,用PBS液洗涤离心得到乳腺癌循环肿瘤细胞。
3.根据权利要求2所述的一种采用HER2基因扩增法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法,其特征在于,所述裂解液为红细胞裂解液,且内含有占其体积百分比为0.5%的甘草酸二甲。
4.根据权利要求2所述的一种采用HER2基因扩增法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法,其特征在于,所述采集乳腺癌症患者外周血与红细胞裂解液按照1:(5~8)混合。
5.根据权利要求1所述的一种采用HER2基因扩增法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法,其特征在于,所述步骤S2中具体为:
(1)将乳腺癌循环肿瘤细胞的样本进行离心去上清,然后加入温度为38.5℃的0.09mol/L KCl溶液12~15mL,振荡混匀后以0.5℃/min降温至36.5℃静置15~20min;
(2)加入3ml的戊二醛和0.7ml的羟甲基纤维素钠,离心吸去上清液,加入适量丙烯醛,制成浓度适中的悬浊细胞液;
(3)吸取4~6μL悬浊细胞液滴至防脱载玻片上,老化处理后,依次向玻片加入封闭液和穿孔剂,多次漂洗直至干净,将玻片脱水后自然干燥;
(4)将CEA抗原和C-MET探针混合液在24℃±0.5℃下自然混合,待混合均匀后进行离心,取8μL滴在杂交区域,并迅速盖上盖玻片,将玻片置于杂交仪上进行杂交孵育;
(5)取出孵育后的玻片,将玻片置于56~61℃的PBS液中振荡5~8s脱去盖玻片,然后以3℃/min速度降温至28~33℃,取出玻片,以35℃的蒸馏水冲洗3~5次,每次2min,然后置于暗处自然干燥玻片;
(6)滴加8uL复染剂,并在荧光显微镜下观察玻片,若CEA未被染色,且非巨大裸核可以判断为乳腺癌循环肿瘤细胞。
6.根据权利要求5所述的一种采用HER2基因扩增法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法,其特征在于,所述杂交孵育的条件为:65℃变性50s后快速升温至72℃保持2min,随后以5℃/min降温至36℃孵育50~85min。
7.根据权利要求1所述的一种采用HER2基因扩增法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法,其特征在于,所述步骤S3具体为:将乳腺癌循环肿瘤细胞悬浮于含有5~15%FBS的培养液中,然后置于CO2细胞培养箱中进行培养两个阶段培养,一阶段为培养温度在23~28℃下培养4~6h后,加入纳米磁性小球并继续培养8~10h,以0.5℃/h降温至18~21℃后进入二阶段培养,二阶段为每隔12~16h更换一次培养液,并每间隔20~30min施加4~5T的恒定磁场5~10min,培养液更换3~4次后得到培养扩增细胞,再将其加入秋水仙素,培养1~2h,形成培养扩增后的乳腺癌循环肿瘤细胞。
8.根据权利要求1所述的一种采用HER2基因扩增法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法,其特征在于,所述步骤S4具体为:收集培养扩增后的乳腺癌循环肿瘤细胞,依次经过固定、脱水、透明化处理、石蜡包埋、切片,制成检测切片。
9.根据权利要求1所述的一种采用HER2基因扩增法检测乳腺癌循环肿瘤细胞的特异性方法,其特征在于,所述步骤S5具体为:
1)将检测切片脱蜡、水化,使用去离子水冲洗3~5次直到各溶液冲净,将检测切片置于磷酸盐缓冲液700~900ml中,180KPa压强下蒸煮3~5min,冷却至室温,使用去离子水冲洗2~3次;再使用含有2.6%H2O2的蒸馏水浸泡检测切片8min,使用PBS液冲洗2~3次;
2)首先滴加HER2单抗,36.8℃下静置2~3h然后迅速降温至10℃静置0.5~1h,使用PBS液冲洗2~3次;继续滴加SPG-抗体多聚体,在常温下静置15min,使用PBS液冲洗2~3次;去除PBS残留液,在显微镜观察下在切片上滴加DAB溶液至显色;
3)依次经过蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明封片;阅片检测乳腺癌循环肿瘤细胞的HER2表达情况。
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