KR20090083149A - 커큐민을 유효성분으로 함유하며, 신경줄기세포 증식을촉진하는 신경세포 재생용 약학조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 커큐민을 유효성분으로 함유하며, 신경줄기세포 증식을 촉진하는 신경세포 재생용 약학조성물에 관한 것으로, 상기 커큐민은 신경줄기세포에서 특이적으로 세포외 신호조절 키나아제(extracellular signal regulated kinases; ERK) 및 p38 MAP 키나아제를 활성화함으로써 신경줄기세포의 증식을 특이적으로 유발하며 성체해마의 신경신생성(Hippocampal Neurogenesis)을 증진할 수 있다.

커큐민, 신경줄기세포, ERK, p38 MAPK, 신경신생성

Description

커큐민을 유효성분으로 함유하며, 신경줄기세포 증식을 촉진하는 신경세포 재생용 약학조성물{Pharmaceutical composition comprising curcumin for regulating cell proliferation of neural stem cell}

본 발명은 신경가소성 증진 및 손상된 신경세포의 복구에 있어서 신경줄기세포의 증식 촉진을 통하여 학습능력 감퇴, 기억력 감퇴, 우울증, 노화 등의 질환을 예방하거나 치료할 수 있는 커큐민을 유효성분으로 함유하는 신경세포 재생용 약학조성물에 관한 것이다.

신경줄기세포(neural stem cell; NSC)는 배아의 발달시 모든 뇌 영역을 형성하는 신경 및 신경교세포의 근원이다. 그러나, 성인 뇌는 해마와 대뇌피질의 측뇌실 영역(subventricular region)에 국한하여 NSC를 보유하여 성체에서도 꾸준히 신경으로 분할, 이주 및 분화할 수 있다.

성체의 NSC는 신체 운동, 식이제한, 손상 등과 같은 다양한 환경적 자극에 반응하여 신생 신경의 증식 및 생존을 증가시킨다. 한편, 만성적인 스트레스는 해마 신경신생성을 손상시킬 수 있다.

따라서 신경신생 및 이를 일으키는 세포 및 분자적 기전에 영향을 미치는 요 소에 대한 바람직한 이해가 중추신경계 손상, 알츠하이머병과 같은 퇴행성신경질환, 학습능력 감퇴, 기억력 감퇴, 우울증, 노화 등에 대한 치료에 효과적일 수 있다.

증식촉진물질 활성 단백질 키나아제(mitogen-activated protein kinase; MAPK) 계열에는 세포외 신호조절 키나아제(extracellular signal-regulated kinase; ERK), p38 MAPK 등이 이에 속한다.

이러한 MAPK 전달계는 세포 외부로부터의 자극을 전달하여 세포내 반응을 일으키는데 있어서 매우 중요한 역할을 하는 것으로 보고되어 있다.

ERK는 성장인자, 산화 스트레스, 세포내 칼슘 증가 혹은 글루타메이트 수용체의 자극 등에 의하여, p38 MAPK은 사이토카인, 열쇼크, 자외선 및 허혈 등에 의하여 활성화되는 것으로 알려져 있다.

한편, 커큐민(curcumin)은 심황(Curcuma longa Linn)의 뿌리로부터 분리된 페놀성 노란색 향신료로서, 이러한 향신료는 산화 스트레스 및 염증과 관련된 질환의 치료에 효과적인 것으로 알려져 있으나 아직까지 신경줄기세포의 조절이나 성체의 해마에서 발생하는 신경신생에 있어서 커큐민의 효과를 검토한 적이 없다.

본 발명은 마우스 다분화능 신경줄기세포(neural stem cell; NSC) 및 성체 해마신경생성에 대한 커큐민의 효과를 최초로 검토하였으며 상대적으로 소량의 커큐민이 세포외 신호조절 키나아제(extracellular signal regulated kinases; ERK) 및 p38 MAP 키나아제와 같은 세포 신호전달 기전을 조절하여 신경줄기세포만의 증식을 특이적으로 촉진하며 성체의 해마신경신생성을 증진하는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 신경가소성 증진 및 손상된 신경세포의 복구에 있어서 신경줄기세포의 증식 촉진을 통하여 학습능력 감퇴, 기억력 감퇴, 우울증, 노화 등 질환을 예방하거나 치료할 수 있는 커큐민을 유효성분으로 함유하는 신경세포 재생용 약학조성물을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 커큐민을 유효성분으로 함유하며, 신경줄기세포 증식을 촉진하는 것을 특징으로 하는 신경세포 재생용 약학조성물을 제공한다.

상기 커큐민은 세포외 신호조절 키나아제(extracellular signal regulated kinases; ERK) 및 p38 MAP 키나아제를 활성화하는 것을 특징으로 하며, 암세포의 증식에는 영향을 주지 않고 신경줄기세포 특이적으로 증식을 촉진시키는 농도인 0.1 내지 0.5μM 의 농도로 함유되는 것이 바람직하다.

이때, 커큐민이 상기 함량범위보다 상당히 많이 함유되면 신경줄기세포에 세 포독성을 유발하여 세포사를 야기할 수 있고, 적게 함유되면 신경줄기세포의 증식촉진의 유효성이 없는 문제가 야기될 수 있다.

이러한 본 발명의 약학조성물은 학습능력 감퇴, 기억력 감퇴, 우울증, 노화 등과 같은 질환을 예방하고 치료할 수 있다.

본 발명에 따른 신경줄기세포 증식 촉진을 통한 신경세포 재생용 약학조성물의 적용량 및 적용방법은 제형 및 사용목적에 따라 다를 수 있다.

또한, 본 발명의 신경줄기세포 증식 촉진을 통한 신경세포 재생용 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 신경줄기세포 증식 촉진을 통한 신경세포 재생용 약학조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 신경줄기세포 증식 촉진을 통한 신경세포 재생용 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 신경줄기세포 증식 촉진을 통한 신경세포 재생용 약학조성물은 환 자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.1 내지 0.2 mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.　

또한, 그 약학조성물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 신경줄기세포 증식 촉진을 통한 신경세포 재생용 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular)주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 커큐민을 유효성분으로 함유하며 성체의 신경줄기세포 증식을 촉진하는 것을 특징으로 하는 건강식품을 제공한다. 이러한 건강식품은 학습능력 및 기억력을 향상시킬 수 있고, 우울증 및 뇌의 노화를 개선할 수 있다.

상기 건강식품은 커큐민 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 건강식품에 함유된 커큐민의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있 음은 확실하다.

상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.

본 발명에 따른 신경줄기세포 증식 촉진을 통한 신경세포 재생용 약학조성물은 세포외 신호조절 키나아제(extracellular signal regulated kinases; ERK) 및 p38 MAP 키나아제와 같은 세포 신호전달 기전을 조절함으로써 손상된 신경세포를 복구하여 새로운 신경세포를 재생하여 학습능력 감퇴, 기억력 감퇴, 우울증, 노화 등과 같은 질환을 예방하고 치료하는 데에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 하기 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 설명일 뿐 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 신경줄기세포 배양

C17.2 NSC 세포주(C. Cepko로부터 제공받음)는 10% 태아 소혈청, 5% 말혈청, 2mM L-글루타민을 함유한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)을 배지로 이용하여 37℃, 5% CO₂ 및 95% 공기로 구성된 가습 분위기 하에서 플라스틱 배양 플라 스크에서 배양되었다.

초대 배아 피질 신경줄기세포의 배양을 위해, 임신한 C57BL/6 마우스를 임신 13일째에 경추탈골로 희생시키고, 배아(embryo)를 얻었다. 배아로부터 뇌를 분리하고, 0.1mg/ml 겐타마이신을 함유한 아이스 콜드 Ca²⁺ 및 Mg²⁺ 프리 HBSS(Hank's Balanced Saline Solution, WelGENE Inc.)에 보관하였다.

뇌로부터 뇌막을 분리하고, 피질 신경상피를 절개하여 콜드 HBSS에 모았다. 원심분리 후, 뇌조직을 2mg/ml 트립신/EDTA 용액에서 재현탁하였다. 트립신 처리는 실온에서 12-15분 동안 온화한 교반 하에서 수행되었고, 1.5mg/ml 트립신 저해제(in HBSS)를 가함으로써 반응이 종결되었다.

파이어 폴리싱 파스퇴르 피펫을 이용한 온화한 분쇄에 의해 세포들이 분리되어 단세포 또는 작은 세포군의 현탁액을 얻었다. 분리된 세포를 B27 부가물 및 bFGF(40ng/ml, Gibco/BRL)를 함유한 배양 배지 DMEM/F12(WelGNEN Inc.)에 희석하고 원하는 세포 농도로 96웰 플레이트 또는 플라스틱 배양 디쉬에 분주하였다.

<실시예 2> 세포 증식 분석

세포 증식은 MTT 분석을 이용한 비색정량법으로 검토하였다. 즉, 완전한 세포의 미토콘드리아 가수분해효소에 의해 MTT가 불용성 자주빛 포마존 산물로 환원되는 것을 근거로 하여 세포 증식을 분석하였다.

앞서 준비된 세포를 96웰 플레이트에서 1X10⁴ 세포의 농도로 분주되고, 24시간 후 0.1, 0.5, 1, 10, 20 및 50μM의 커큐민을 각각 처리하였다. 커큐민 처리 후, 커큐민을 함유한 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 2회 세정하고, PBS에 용해된 0.5mg/ml MTT 200μl를 각 웰에 가하고 37℃에서 4시간 동안 배양하였다.

그 후, 용해용액(디메틸설폭사이드 및 에탄올, 1:1 부피비)에서 각 세포를 분쇄 및 용해하고, 살아있는 세포에 의해 생성된 포마존염을 560nm에서 ELISA 마이크로플레이트 리더로 정량하였다.

도 1a에 도시된 바와 같이, 저농도의 커큐민 투여에 의해 NSC 증식이 증가되었으나, 10 μM 이상의 고농도에서는 세포독성이 나타나서 NSC 증식이 억제되었다.

또한, 도 1b에 도시된 바와 같이, 커큐민 처리 후 2일까지도 NSC 증식이 증가하였다.

<실시예 3> BrdU 면역세포화학

NSC 세포의 표식을 위해, 37℃에서 2시간 동안 BrdU를 최종농도 20μM이 되도록 배지에 첨가하고, BrdU 없는 배지로 세정하였다. 그후, 실시예 1에서 준비된 NSC 세포를 비히클(vehicle) 또는 커큐민 중 어느 하나로 처리하였다.

24시간 후, 배양된 세포를 PBS(pH 7.3)에 용해된 4% 파라포름알데히드에 고정시키고, PBS로 세정하였다. 면역염색을 위해 고정된 세포를 -20℃에서 20분 동안 70% 에탄올(in 50mM 글리신 버퍼, pH 2.0)로 후고정하였다.

그후, TBS에 용해된 0.6% H₂O₂를 가하여 내인성 퍼옥시다아제를 블로킹하였다. 세포를 열(65℃), 산(2M HCl) 및 염기(0.1M 보레이트 완충액)에 순차적으로 노출시켜 DNA를 변경시켰다. 1차 BrdU 항체(랫트 모노클론, Accurate Chemicals, 1:400)를 가하고, 4℃에서 밤새토록 배양하였다.

그후, TBS로 세포를 세정하고 비오틴 표식된 2차 항체의 존재 하에서 2시간 동안 배양하였다. 그후, 세포를 실온에서 1시간 동안 ABC 용액(Vector Laboratories)과 반응시켰다. DAB 키트를 이용하여 제작자의 지시에 따라 색전개를 측정하였다. Zeiss 510 CSLM 현미경을 이용하여 세포를 가시화하여 이미지를 얻었다.

그 결과, 도 2a 및 도 2b에 도시된 바와 같이, 500nm의 커큐민을 처리함으로써 의미있게 상승된 NSC 증식을 확인할 수 있었다.

<실시예 4> MAP 키나아제 활성화 검토

단백질 농도는 BSA를 표준물질로 이용한 로리법에 의해 정량되었다. 각 시간별로 커큐민 처리된 NSC로부터 얻은 전 세포 추출액을 균질화한 시료를 겔 로딩 버퍼(125mM 트리스-HCl, 4% 소듐 도데실 설페이트(SDS), 10% 2-메르캅토에탄올 및 0.2% 브로모페놀블루, pH 6.8)에서 5분 동안 끓였다. 이때, 시료 대 버퍼의 비율이 1:1이었다.

동량의 단백질(whole cell extract, 35μg/레인)을 6-17% 겔을 이용한 SDS-PAGE로 분리하였다. 단백질을 겔에서 Immobilon-P^SQ 전이막(Millipore Corp)으로 옮겼다. 이러한 막을 즉시 실온에서 1시간 동안 블로킹 용액(10mM 트리스, 100mM NaCl 및 0.1% 트윈20을 함유한 TBS-트윈(TBS-T) 버퍼(pH 7.5)에 용해된 5% 무지방 분유)에 방치하였다.

그후, TBS-T 버퍼에서 30분 동안 세정한 막을 실온에서 4시간 동안 제1항체와 배양하였다. 이러한 막을 TBS-T 버퍼로 30분씩 2회 세정한 후, 실온에서 2시간 동안 제2항체와 다시 배양하였다.

TBS-T 버퍼로 40분 동안 세정한 후, 전기화학발광에 의해 항체 표식을 검출하고 방사선 투과막에 노출시켰다. 분자량 산출을 위하여, 전염색 블루 단백질 마커를 이용하였다.

제1항체로는 포스포-ERK44/42, 포스포-p38, 포스포-JNK54/46에 대한 마우스 모노클론 항체(Santa Cruz Biotechnology, 1:500 dilution); ERK, p38, JNK에 대한 토끼 폴리클론 항체(Cell Signaling Technology, 1:500 dilution); β-액틴에 대한 마우스 모노클론 항체(Cell Signaling Technology, 1:2500 dilution)를 사용하였다.

도 3은 커큐민으로 처리된 NSC에서 MAP 키나아제(MAPK)의 활성화를 검토한 것으로, 커큐민의 처리로 인해 포스포-ERK가 30분 이내에 증가하기 시작하여 1시간 이내에 최고로 증가하여 6시간 동안 증가상태를 유지하였다.

또한, 포스포-p38도 커큐민 처리된 NSC에서 증가하였으나, 포스포-JNK는 커큐민 처리에 의해 영향을 받지 않았다. 이때, β-액틴은 단백질 로딩 생존율에 관한 대조군을 의미한다.

<실시예 5> MAP 키나아제 저해제의 효과 검토

실시예 1에서 준비된 C17.2 NSC에 다음과 같은 10μM의 MAPK 저해제를 12시간 동안 처리한 후, 500nM의 커큐민을 24시간 처리하고, 실시예 2와 동일하게 MTT 분석을 수행하였다.

이때, 사용한 MAPK 저해제는 각각 SB203580(p38 MAP 키나아제 저해제, Sigma), PD98059(MEK/ERK 저해제, Sigma), SP600125(JNK 저해제, Sigma)를 사용하였다.

그 결과, 도 4에 도시된 바와 같이, p38 MAP 키나아제 저해제 SB203580, MEK/ERK 저해제 PD98059는 커큐민 유도 NSC의 증식을 완전하게 억제하지만, JNK 저해제 SP600125는 커큐민 유도 세포 증식을 전혀 억제하지 못하였다.

<실시예 6> 커큐민의 세포 증식활성에 대한 세포 특이성 검토

인간 간암세포 HepG2, 마우스 간암세포 H1c1c7, 배아암종 P19, 신경교종 C6를 포함한 4종의 종양세포와 신경줄기세포 C17.2 NSC를 각각 96웰 플레이트에 분주하고 24시간 동안 배양하였다.

그 후, 각 세포에 500nM의 커큐민을 24시간 동안 처리하고 세포 증식을 MTT 분석을 이용하여 정량하였다.

그 결과, 도 5a에 도시된 바와 같이 어떠한 종양세포에서도 커큐민에 의한 증식활성을 관찰할 수 없었고, 따라서 커큐민의 세포 증식활성은 NSC 특이적인 것을 확인할 수 있었다.

또한, 종양세포로부터 얻어진 전 세포 추출액(whole cell extract, 35μg/레인)을 이용하여 실시예 4와 동일하게 웨스턴 블롯을 실시하였다.

그 결과, 도 5b에 도시된 바와 같이 커큐민은 종양세포에서 MAPK 시그널을 활성화하지 않았다.

<실시예 7> 배아 피질 신경줄기세포 증식효과 검토

실시예 1에서 준비한 배아 피질 신경줄기세포(neural stem cell, NSC)를 2일 동안 배양한 후, 500nM의 커큐민을 24시간 동안 처리하였다.

그 결과, 뉴로스피어스(neurospere)의 형성이 증가되었고(도 6a 참조), 뉴로스피어스로부터 얻어진 SEM을 근거로 측정한 뉴로스피어스 직경에서도 대조군보다 커큐민 처리군이 더 증가되었다(도 6b 참조).

또한, 뉴로스피어스를 24시간 동안 배양한 후, MTT 용액에 노출하여 얻어진 이미지 사진 및 MTT 분석에 의한 정량으로부터 커큐민의 뉴로스피어스에 대한 증식효과를 확인할 수 있었다(도 6c 및 도 6d 참조).

또한, 2시간 동안 500nM의 커큐민으로 처리된 NSC로부터 얻어진 전 세포 추출액을 실시예 4와 동일하게 웨스턴 블롯을 실시하였고, 그 결과 도 7a에 도시된 바와 같이 커큐민이 ERK 및 p38 키나아제를 강하게 활성화하는 반면, JNK에는 어떠한 영향도 주지 않았다.

또한, 실시예 1에서 준비한 배아 피질 신경줄기세포(neural stem cell, NSC)에서의 커큐민에 의한 증식효과에 대한 MAP 키나아제 저해제의 억제활성을 실시예 5와 동일한 방법으로 검토하였고, 그 결과 도 7b에 도시된 바와 같이 p38 MAP 키나아제 저해제 SB203580, MEK/ERK 저해제 PD98059는 커큐민 유도 NSC의 증식을 의미있게 억제하였다.

<실시예 8> 해마 신경신생 효과 검토

1) 조직 준비

어덜트(7주령) 수컷 C57BL/6 마우스를 대한 바이오링크(전북)로부터 구매하여 온도 및 빛이 제어된 조건(20-23℃, 12-hr light/12-hr dark cycle)에서 사육하고, 자유롭게 사료 및 물을 제공하였다.

마우스를 대조군(비히클만 투여한 군) 및 커큐민 투여군으로 나누고 커큐민 투여 전 1주일 동안 적응시켰다. 커큐민을 4일 동안 하루에 한번씩 0.2mg/kg의 용량으로 복강투여하였고, 대조군으로는 생리식염수가 사용되었다.

신경신생(neurogenesis)을 평가하기 위하여, 각 군의 마우스에 3일동안 하루 2회씩 브로모데옥시우리딘(BrdU, 50mg/kg)을 복강주사하였다. 각 군의 반은 마지막 BrdU 주사 후 하루만에 안락사시키고, 나머지 반은 마지막 BrdU 주사후 4주 지나서 안락사시켰다.

커큐민 주입 후, 하루 또는 4주 후 마우스를 마취하고, 0.34% L-라이신(Sigma)을 함유한 PBS(pH 7.4)에 용해된 4% 파라포름알데히드(PFA)로 심장내 관류하였다.

고정액 관류 후, 두개골에서 뇌를 분리하여 4℃에서 밤새토록 동일한 고정액에 보관하고, 30% 수크로스 용액으로 옮겼다. 냉동보존된 뇌를 냉동 조직 절편기(MICROM)를 이용하여 관상면으로 40μm씩 순차적으로 절개하고, 0.1% 소듐 아자이드를 함유한 용액에 모아 4℃에서 보관하였다. 해마 신경신생을 포함한 모든 절개부위가 모아졌다.

2) 새로 형성된 신경세포 정량

BrdU 항체로 뇌 절개부위를 면역염색하는 방법은 이전에 알려진 방법(J Neurobiol, 39(4), 569-578, 1999)과 유사하다. 즉, 부착없이 자유롭게 떠있는 절개부위를 트리스-버퍼 생리식염수(TBS, pH 7.5)에 용해된 0.6% H₂O₂로 처리하여 내인성 퍼옥시다아제를 블로킹한 후, 열, 산 및 염기에 순차적으로 노출시켜 DNA를 변성시켰다.

이러한 절개부위를 TBS/0.1% 트리톤 X-100/3% 염소 혈청(TBS-TS)에서 30분 동안 배양하고, TBS-TS에 용해된 1차 항-BrdU 항체(랫트 모노클론, Accurate Chemicals, 1:400)에서 4℃, 밤새토록 배양하였다.

다시 비오틴 표식된 2차 염소 항-랫트 IgG 항체(Vector Laboratories, 1:200), 아비딘-퍼옥시다아제 복합체 및 디아미노벤지딘을 이용하여 절개부위를 처리하였다.

염색된 절개부위를 슬라이드에 올리고, 크레실 바이올렛으로 역염색하여 과립형 세포층 영역을 측정하였다.

그 결과, 도 8a 및 도 8b에 도시된 바와 같이 커큐민 1일 처리군에서는 비히클만 처리한 대조군보다 월등하게 해마 치상회에서 BrdU 양성세포의 수를 증가시켰고, 한편 커큐민 4주 처리군에서는 대조군보다 약간 높게 해마 치상회에서 BrdU 양성세포의 수를 증가시켰다.

커큐민 투여 후 4주경에는 BrdU 표식 세포들이 완전한 과립형 세포층으로 분화되고 핵이 크고 둥글게 되는 성숙 과립형 신경의 특징을 나타낸 것이다.

<실시예 9> 이중 표식 면역염색

새로 형성된 세포의 유전형을 검토하기 위하여, BrdU 및 신경 마커 NeuN의 이중 표식을 수행하였다.

3% 정상 염소 혈청(Vector Laboratories)을 이용하여 블로킹하였고, 준비된 뇌 절개부위를 랫트 폴리클론 항-BrdU 항체(Accurate Chemical & Scientific Corporation, 1:500 희석) 및 마우스 모노클론 항-NeuN 항체(Chemicon, 1:500 희석)에서 4℃, 밤새토록 배양하였다.

그후, 뇌 절개부위는 TBS로 세정되고, Alexia Fluor-488로 표식된 항-마우스 IgG 및 Alexia Fluor-568로 표식된 항-랫트 IgG의 존재 하에서 2시간 동안 배양되었다. Zeiss 510 CSLM 현미경으로 형광 이미지를 얻었다.

도 9a와 같이, BrdU 투여 후 첫째날에는 치상회의 과립세포하층에서 많은 양의 BrdU 양성 세포를 관찰할 수 있고, 도 9b에서 BrdU 투여 후 4주째에는 치상회를 통해 BrdU 양성 세포가 흩어진 것을 관찰할 수 있었으며 대부분의 BrdU 양성 세포는 신경특이 마커인 NeuN에도 양성으로 나타나 신경세포로 분화된 것을 확인할 수 있다.

따라서, 커큐민 처리군에서 이중 표식된 세포(새로 신생된 신경)의 수가 크게 증가하므로, 커큐민 투여가 어덜트 마우스에서 해마신경신생을 증진시킴을 알 수 있다.

하기에 본 발명에 따른 신경줄기세포 증식 촉진을 통한 신경세포 재생용 약학조성물 또는 건강식품의 제제예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아 닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

< 제제예 1> 산제의 제조

커큐민 10 mg, 유당 100 mg 및 탈크 10 mg을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

< 제제예 2> 정제의 제조

커큐민 10 mg, 옥수수전분 100 mg, 유당 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 2 mg을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

< 제제예 3> 캅셀제의 제조

커큐민 10 mg, 옥수수전분 100 mg, 유당 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 2 mg을 통상의 캡슐제 제조방법에 따라 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

< 제제예 4> 주사제의 제조

커큐민 10 mg, 주사용 멸균 증류수 적량 및 pH 조절제 적량을 통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.

< 제제예 5> 액제의 제조

커큐민 200 mg, 이성화당 10 g, 만니톨 5 g 및 정제수 적량을 통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.

<제제예 6> 건강식품의 제조

커큐민 5 ㎎, 비타민 혼합물 적량(비타민 A 아세테이트 70 ㎍, 비타민 E 1.0 ㎎, 비타민 B 1 0.13 ㎎, 비타민 B 2 0.15 ㎎, 비타민 B 6 0.5 ㎎, 비타민 B 12 0.2 ㎍, 비타민 C 10 ㎎, 비오틴 10 ㎍, 니코틴산아미드 1.7 ㎎, 엽산 50 ㎍, 판토텐산 칼슘 0.5 ㎎) 및 무기질 혼합물 적량(황산제1철 1.75 ㎎, 산화아연 0.82 ㎎, 탄산마그네슘 25.3 ㎎, 제1인산칼륨 15 ㎎, 제2인산칼슘 55 ㎎, 구연산칼륨 90 ㎎, 탄산칼슘 100 ㎎, 염화마그네슘 24.8 ㎎)을 혼합한 다음 과립을 제조하고 통상의 방법에 따라 건강식품을 제조하였다.

도 1a는 NSC 증식에 대한 각 농도별 커큐민의 효과를 검토한 것이고,

도 1b는 NSC 증식에 대한 커큐민의 지속효과를 검토한 것이고,

도 2a 및 도 2b는 NSC 증식에 대한 커큐민의 효과를 BrdU 면역세포화학법으로 검토한 것이고,

도 3은 커큐민으로 처리된 NSC에서 MAP 키나아제(MAPK)의 활성화를 검토한 것이고,

도 4는 커큐민으로 처리된 NSC에서 MAP 키나아제 저해제의 효과를 검토한 것이고,

도 5a 및 도 5b는 커큐민의 세포 증식활성에 대한 세포 특이성을 검토한 것이고,

도 6a 내지 도 6d는 커큐민의 배아 피질 신경줄기세포에 대한 증식효과를 검토한 것이고,

도 7a는 커큐민으로 처리된 NSC에서 MAP 키나아제의 활성화를 검토한 것이고,

도 7b는 커큐민으로 처리된 NSC에서 MAP 키나아제 저해제의 효과를 검토한 것이고,

도 8a 및 도 8b는 커큐민 투여에 따른 해마 치상회에서의 신경형성 효과를 정량적으로 검토한 것이고,

도 9a 및 도 9b는 커큐민 투여에 따른 해마 치상회에서의 신경세포 형성 효 과를 형광이미지로 확인한 사진이다.

Claims (5)

1. 커큐민을 유효성분으로 함유하며, 신경줄기세포 증식을 촉진하는 것을 특징으로 하는 신경세포 재생용 약학조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 커큐민이 세포외 신호조절 키나아제(extracellular signal regulated kinases; ERK) 및 p38 MAP 키나아제를 활성화하는 것을 특징으로 하는 신경세포 재생용 약학조성물.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 커큐민이 0.1 내지 0.5μM 의 농도로 함유되는 것을 특징으로 하는 신경세포 재생용 약학조성물.
4. 제 3항에 있어서, 상기 약학조성물이 학습능력 감퇴, 기억력 감퇴, 우울증 및 노화로 이루어진 군에서 선택된 질환을 예방하고 치료하는 것을 특징으로 하는 신경세포 재생용 약학조성물.
5. 커큐민을 유효성분으로 함유하고, 신경줄기세포 증식을 촉진하는 것을 특징으로 하는 학습능력 향상, 기억력 향상, 우울증 개선 또는 노화 개선용 건강식품.

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