KR20090065673A - 얄로위아 리포리티카 균주로부터 알칼리성 리파아제의제조방법 - Google Patents

얄로위아 리포리티카 균주로부터 알칼리성 리파아제의제조방법 Download PDF

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이건호
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경북대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 얄로위아 리포리티카 균주로부터 알칼리성 리파아제의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 탄소원, 질소원 및 금속이온을 함유하는 배양액에서 얄로위아 리포리티카(Yallowia lipolytica) 효모 균주를 배양하는 단계 및 상기 효모 균주가 배양된 배양액으로부터 알칼리성 리파아제를 수득하는 단계를 포함하는 알칼리성 리파아제 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 알칼리 조건에서 활성을 갖는 리파아제를 효모 균주를 이용하여 생산할 수 있으며, 이러한 알칼리성 리파아제를 생산할 수 있는 효모 균주를 배양하는 최적 조건을 개발하였다. 따라서 본 발명의 제조방법을 이용하여 생산된 알칼리성 리파아제는 알칼리성 조건에서 리파아제의 활성을 필요로 하는 산업에서 매우 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
얄로위아 리포리티카, 리파아제, 탄소원, 질소원, 금속이온, pH

Description

얄로위아 리포리티카 균주로부터 알칼리성 리파아제의 제조방법 {Production method of a alkaline lipase from Yarrowia lipolytica}
본 발명은 얄로위아 리포리티카 균주로부터 알칼리성 리파아제의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 탄소원, 질소원 및 금속이온을 함유하는 배양액에서 얄로위아 리포리티카(Yallowia lipolytica) 효모 균주를 배양하는 단계 및 상기 효모 균주가 배양된 배양액으로부터 알칼리성 리파아제를 수득하는 단계를 포함하는 알칼리성 리파아제 제조방법에 관한 것이다.
리파아제(Lipase)는 에스터결합(ester bond)의 가수분해 및 탈수축합반응을 촉매하는 효소로서, 오일의 가수분해를 통한 지방산의 생산을 비롯하여 에스터결합치환반응, 에스터화합물 생산반응 등을 통한 산업적으로 유용한 다양한 생성물을 만들어 내는데 이용된다. 따라서 리파아제는 식품, 의약, 화학산업 등에서 높은 잠재력을 가지고 산업적으로 매우 유용한 효소로 이용되고 있다(A. Pandey, et al., 1999, Biotechnol. Appl. Biochem. 29:119-131).
그러나 산업과 과학의 발달과 더불어 리파아제의 생물공학적 다양성이 알려지면서 이들의 사용영역은 생물의약, 농약, 화장품, 향수, 바이오센서(biosensor), 세제, 가죽산업, 식품 및 산업폐기물처리 등으로 크게 확대되어 나가고 있고 그 외에도 표백, 제지, 플라스틱, 윤활제 등에도 사용될 수 있을 것으로 기대되고 있다(R. Sharma, et al., 2001, Biotechnol. Adv. 19:627-662).
리파아제는 동물, 식물, 미생물 등에서 모두 발견되고 있지만 미생물로부터 생산되는 리파아제의 경우 그들의 다양성과 유용성 등으로 인해 산업적으로 높은 관심을 갖게 한다. 리파아제를 생산하는 다양한 미생물들(G.T. Eom, et al., 2006. J. Microbiol. Biotechnol. 16(9):1422-1428)이 알려져 있지만, 리파아제의 사용영역이 확대되면서 특수한 목적에 부합되는 새로운 리파아제의 개발이 지속적으로 요구되고 있다. 이는 리파아제가 가지고 있는 몇 가지 문제점, 즉 불충분한 이성질체선택성, 극한 반응조건에서의 제한된 활성도, 재생의 어려움 등의 이유 때문이다. 특히 높은 알칼리성 조건에서 활성을 갖는 리파아제의 경우 세제산업에서 매우 유용하게 이용될 수 있는데 그 이유는 직물에 묻어 있는 오일때를 리파아제를 이용하여 제거하기 위해서는 알칼리조건이 훨씬 유리하기 때문이다. 그 동안 세균이나 곰팡이균주에서 알칼리성 리파아제가 생산된 예가 보고되어 있기는 하지만(Kanwar L, et al., 2002. Bioresource Technol 84, 207-211), 효모균주로부터 알칼리성 리파아제를 생산하는 예는 없었다. 특히 효모균주 얄로위아 리포리티카로부터 알칼리성 리파아제가 생산되는 것은 아직까지 보고된 바가 없다. 따라서 얄로위아 리포리티카로부터 알칼리성 리파아제의 생산을 확인하고 이를 생산하는 최적의 제조방법을 개발한다면 세제산업을 비롯하여 알칼리성 리파아제를 필요로 하는 산업에 매우 유용하게 이용될 수 있을 것이라 판단된다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 알칼리성 리파아제를 생성할 수 있는 얄로위아 리포리티카 균주의 최적의 배양조건 및 영양조건을 확립함으로써, 높은 효율로 알칼리성 리파아제 생산할 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 얄로위아 리포리티카(Yallowia lipolytica) 효모 균주를 배양한 배양액으로부터 알칼리성 리파아제를 수득하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 알칼리성 리파아제 및 이를 함유하는 세제 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 탄소원, 질소원 및 금속이온을 함유하는 배양액에서 얄로위아 리포리티카(Yallowia lipolytica) 효모 균주를 배양하는 단계 및 상기 효모 균주가 배양된 배양액으로부터 알칼리성 리파아제를 수득하는 단계를 포함하는 알칼리성 리파아제 제조방법을 제공한다.
본 발명에서, 상기 “알칼리성 리파아제”란 알칼리성 조건에서 높은 활성을 갖는 리파아제를 포함하는 배양액 또는 효모 균체를 제거한 배양액을 의미하는 것으로, 구체적으로 효모 균체 배양후, 원심분리 또는 여과를 이용하여 균체만을 제거한 배양액을 말한다. 상기 효모 균체를 제거한 배양액은 리파아제 활성이 높아 정제과정을 거치지 않더라도 산업에서 용이하게 사용될 수 있으며, 알칼리 조건에서 리파아제의 작용을 필요로 하는 산업분야 예컨대, 세제산업, 유기물 분해산업, 폐수처리 등 그 적용이 용이한 산업에서 사용될 때, 일반적으로 특정 효소의 활성 을 나타내는 배양액에서 균체를 제거한 후, 그 상등액을 동결건조 과정을 거쳐 특정 효소 활성을 가지는 분말 형태로 사용될 수 있다. 만약 고순도의 리파아제를 필요로 하는 제약, 식품 등의 분야에서는 필요한 경우 상기 리파아제가 함유된 배양액을 여러 정제단계를 수행한 후 사용할 수 있다. 따라서 상기 효모 균주 배양액으로부터 알칼리성 리파아제를 수득하는 단계는 효모 균주의 배양액으로부터 원심분리 또는 여과를 이용하여 균체를 제거하는 단계 이외에 상등액을 당업계에서 공지된 정제방법으로 알칼리성 리파아제를 정제하는 것을 더 포함할 수 있다. 그 정제방법은 특별히 한정되지 않으며, 일례로 효모 균주 배양액을 원심분리하여 균체를 제거하고 그 상등액을 적절한 칼럼(예를 들어, 이온교환수지가 충진된 칼럼)을 이용하여 리파아제 활성이 높은 분획을 취하는 정제방법이 사용될 수 있다.
본 발명의 알칼리성 리파아제 제조방법에서, 상기 효모 균주는 얄로위아 리포리티카(Yallowia lipolytica)에 속하는 어떠한 균주일 수 있으나, 바람직하게는 미국농산부연구소에 기탁된 얄로위아 리포리티카 NRRL Y-2178인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 알칼리성 리파아제 제조방법에서, 상기 효모 균주의 배양은 배양온도 20-35℃, 배양시간 24-120 h 및 배지의 pH5-10 조건에서 수행하는 것이 바람직하다. 상기 배양온도와 배양시간 범위에서 온도와 시간이 증가할수록 효모 균주의 성장과 리파아제 효소 활성은 증가하였으나 상기 배양온도와 배양시간 범위보다 높은 경우 효모 균체와 효소활성이 급격히 감소하였다. 또한 상기 pH 범위 이외에서는 효모 균체의 성장과 리파아제 효소의 활성이 거의 없었다.
본 발명의 알칼리성 리파아제 제조방법에서, 상기 알칼리성 리파아제는 효소활성이 pH6-9에서 증가하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서 리파아제 활성은 기질로서 p-nitrophenybutyrate(p-NPB)를 사용한 spectrophotometer 방법을 통해 확인하였으며, 그 결과 측정된 효소활성은 pH 7.0 이하에서 보다 pH 7.0 이상에서 높게 나타남을 확인하였다.
본 발명의 알칼리성 리파아제 제조방법에서, 상기 탄소원은 포도당(glucose), 과당(fructose), 설탕(sucrose), 글리세롤(glycerol), 자일로스(xylose), 갈락토오스(galactose), 말토오스(maltose) 및 유당(lactose)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것이 바람직하다.
본 발명의 알칼리성 리파아제 제조방법에서, 상기 질소원은 효모추출물(yeast extract), 맥아추출물(malt extract), 글루타민(glutamine), 질산암모늄(NH4NO3), 펩톤(peptone), 트립톤(tryptone), 염화암모늄, 황산암모늄, 인산암모늄 및 요소(urea)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것이 바람직하다.
본 발명의 알칼리성 리파아제 제조방법에서, 상기 금속이온은 철, 아연, 알루미늄, 칼슘, 마그네슘, 망간, 은, 금, 코발트 및 구리로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 알칼리성 조건에서 활성을 갖는 리파아제을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 리파아제를 유효성분으로 함 유하는 세제 조성물을 제공한다.
본 발명의 세제 조성은 하나 이상의 계면활성제를 포함할 수 있다. 계면활성제는 음이온성, 비-이온성, 양이온성, 양쪽성 또는 양이온성형태(zwitter ionic type), 또는 이것들의 혼합물일 수 있다. 음이온성 계면활성제의 대표적인 예로는 선형 알킬벤젠술폰산염(LAS), 알킬황산염(AS), 알파올레핀술폰산염(AOS), 알코올에톡시황산염(AES) 및 천연지방산의 알칼리금속염을 들 수 있다. 비-이온성 계면활성제의 예로는 알킬폴리에틸렌글리콜에테르, 노닐페놀 폴리에틸렌글리콜 에테르, 수크로스와 글루코스의 지방산에스테르, 및 폴리에톡실화 알킬글루코시드의 에스테르가 있다.
본 발명의 세제 조성물은 또한 연마제, 표백제, 표면활성제, 부식방지제, 금속봉쇄제, 얼룩-재침착 방지제, 향수, 효소 및 표백제의 안정화제, 제형 보조제, 광증백제, 거품부스터, 킬레이트화제, 충전제, 직물연화제등과 같은 당업계에서 공지된 다른 세제 성분들을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 세제 조성물은 분제, 액제 등의 임의의 편리한 형태로 제형화될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 본 발명의 효모 균주 준비 및 리파아제 활성 측정방법
얄로위아 리포리티카 Y-2178(미국농산부연구소 기탁번호 NRRL Y-2178)를 입수하여, 사용하기 전에 0.4ml 글리세롤과 0.6ml YM배지(1% glucose, 0.3% yeast extract, 0.3% malt extract, 0.5% peptone, w/w)를 포함한 냉동바이알(cryogenic vial)에서 -70℃ 조건으로 보존하였다(stock culture). 실험에 사용된 Chemicals는 다른 언급이 없는 한, Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)으로부터 구입하였다.
상기 보존배양(stock culture)의 2%를 접종물(inoculum)로 하여, 150 rpm의 reciprocal shaking을 25℃에서 48시간 조건에서 50ml YM 배지가 들어있는 100ml 플라스크에 접종함으로서 배양(seed culture)하였다. 리파아제 생산을 위한 본 배양(main culture)은 종균배양의 일부(2%, v/v)를 100ml의 리파아제 생산용 배지(1%(v/v) 대두유(soybean oil)가 첨가된 YM 배지)가 포함된 250ml 삼각플라스크(conical flask)에 접종하고 reciprocal shaking 인큐베이터에서 적절한 시간동안 배양하였다(25℃, 150rpm). YM media를 기본배지로 사용하였고, 배지조성은 배양조건의 최적화 실험에 따라 변화를 주었다.
리파아제 활성을 위한 최적 pH 실험을 위해, 분석혼합물(assay mixture)의 pH는 50mM sodium-phosphate buffer(pH3.0-7.0)와 50mM Tris buffer(pH7.0-10.0)에서 조정되었다. 세포성장(cell growth)은 증류수로 세척하고 재현탁시킨 후 spectrophotometer(Jasco V-530, Tokyo, Japan)로 610mm에서 세포의 흡광도를 측정 함으로서 결정하였다. 건세포중량(Dry cell weight, DCW)은 표준곡선(standard curve)을 사용하여 흡광도 값으로부터 계산되었다.
리파아제 활성은 기질로서 p-nitrophenybutyrate(p-NPB)를 이용한 파라나이트로페놀(p-nitrophenol)의 생성반응을 수행한 후, spectrophotometer 방법에 의해 측정하였다. 구체적으로 분석혼합물(assay mixture)은 효소시료(효모 균주 배양액) 0.1ml과 기질용액(working substrate solution) 0.9ml로 만들었으며, 상기 기질용액은 100% 차가운 에탄올에 녹인 10mM p-NPB를 0.05M sodium-phosphate buffer(pH7.0)로 10번 희석하여 제조하였다. 분석혼합물을 spectrophotometer cell에 즉시 옮긴 후, 효소가 들어있지 않은 대조군(YM 배지)에 대하여 410nm에서 360초간 37℃에서의 흡광도 증가량을 측정하였다.
본 발명에서 효소활성의 “unit”는 분당 p-NPB로부터 1 nmol의 p-nitrophenol을 유리시키는 효소 양으로 정의하였다. 본 발명의 각 실험에서 표시되는 값은 다른 설명이 없는 한, 두 번의 평균이다.
실시예 2. 얄로위아 리포리티카 Y-2178로부터 리파아제의 생성 확인
상기 배양액에서 5일 동안 배양하면서 매 24시간 마다 배양액을 취하여 효소시료를 준비하고, 리파아제 효소활성을 확인한 결과, 도 1에서와 같이 배양 시작 후 미생물의 농도는 지속적으로 증가하여 배양 후 96시간에 최고가 되었으며, 효소활성의 경우도 배양 후부터 증가하여 72시간에 최고 값(200 unit/ml)을 나타내었다. 이러한 결과를 통해 배양액 내에 리파아제가 효과적으로 생성됨을 확인하였다.
실시예 3. 얄로위아 리포리티카 Y-2178로부터 생성된 리파아제의 알칼리성 확인
실시예 2에서 생성된 리파아제의 알칼리성을 확인하기 위해서, 실시예 2에서와 같이, 효소활성이 가장 높았던 배양시간인 72시간 동안 배양하여 생성된 리파아제 시료(효모 균주 배양액)를 준비하였다. 준비된 리파아제 시료와 기질용액으로 구성된 효소활성 분석혼합액(효소시료 0.1ml + 기질용액 0.9ml)의 pH를 변화시키면서 리파아제 활성을 확인한 결과, 도 2에서 보여주는 것과 같이 pH 5.0 에서부터 pH 9.0 사이에서 효소활성이 확인되었으나 pH가 증가하면서 효소활성이 급격히 증가하여 pH 8.0에서 효소활성이 가장 높게 나타났으므로 생성된 리파아제가 알칼리성인 것을 확인하였다.
실시예 4. 얄로위아 리포리티카 Y-2178로부터 알칼리성 리파아제의 생산을 위한 배양의 최적화 조건 조사
본 발명의 배양온도 변화에 따른 얄로위아 리포리티카 Y-2178로부터 알칼리성 리파아제의 생산량변화를 알아보기 위하여 도 3에서 보여주는 것처럼 배양온도를 20℃에서부터 35℃까지 변화시키면서 생산되는 리파아제의 활성을 조사하여 본 결과, 미생물의 농도는 20℃에서부터 30℃까지 큰 변화가 없었으나 효소활성의 경우 27.5℃에서 가장 높게 나타났고 35℃ 이상에서는 활성이 거의 나타나지 않았다. 이러한 결과는 미생물의 성장보다는 알칼리성 리파아제의 생성이 온도변화에 민감하게 반응하고 있다는 것을 알 수 있다.
본 발명에 사용된 배지의 초기 pH 변화에 따른 얄로위아 리포리티카 Y-2178로부터 알칼리성 리파아제의 생산량변화를 나타낸 결과가 도 4에 나타나 있다. 도 4에서, 1% 대두유가 첨가된 대조군(control medium)이 기본배지(basal medium)로 사용되었으며, 배지의 초기 pH는 1N HCl 또는 1N NaOH로 조정하였다. 검은색 원(closed circle)은 리파아제 생성량, 흰색 원(open circle)은 세포성장을 나타낸다. Final pH(closed triangle)는 접종 72시간 후 pH를 나타낸다.
도 4에서 보여주는 것처럼 배지의 초기 pH가 3.0에서부터 10.0까지 변화하는 동안 미생물의 성장은 상당한 수준으로 이루어졌지만 알칼리성 리파아제의 경우 pH 5.0 이하에서는 매우 낮은 수준으로 생산되었고 pH 5.0에서부터 pH 증가에 따라 생산량도 크게 증가하여 pH 9.0에서 가장 높은 생산량을 나타내었다. 그러나 pH 10.0에서는 생산량이 급격히 감소하였다. 이러한 결과로 미루어 배지의 초기 pH값이 얄로위아 리포리티카 Y-2178로부터 알칼리성 리파아제를 생산하는데 매우 중요함을 알 수 있다.
실시예 5. 얄로위아 리포리티카 Y-2178로부터 알칼리성 리파아제의 생산을 위한 배지의 최적화 조건 조사
본 발명의 배지에 사용된 탄소원과 질소원의 종류에 따른 얄로위아 리포리티카 Y-2178로부터 알칼리성 리파아제의 생산량변화를 조사하였다. 사용된 각 탄소원의 농도는 배지의 1%(w/v)로 하였으며, 배지의 조성은 기본배지의 Dextrose 대신 각각의 탄소원으로 대치하여 사용하였다. 질소원은 효모추출물(yeast extract)과 펩톤(peptone)은 각각의 질소원으로 대치하여 사용하였다.
도 5에서 나타난 바와 같이 탄소원이 포도당(glucose)과 글리세롤(glycerol)인 경우, 알칼리성 리파아제 생산량이 비슷한 정도로 높게 나타났고 그 다음이 과당(fructose), 갈락토오스(galactose)의 순으로 나타났다. 설탕(sucrose), 말토오스(maltose), 자일로스(xylose)의 경우 상대적으로 낮은 생산량을 보였다.
질소원의 종류에 있어서, 단일 질소원을 사용한 경우에 비해 효모추출물과 펩톤을 함께 동일한 농도로 사용한 경우 효소생산량이 획기적으로 높게 나타남을 하기 표 1에서 확인할 수 있다. 무기질소원의 경우 효소생산량이 매우 낮게 나타났다.
[표 1]. 질소원의 종류에 따른 Y. lipolytica NRRL Y-2178로부터 생산되는 알칼리성 리파아제의 생산량변화
Figure 112007090906904-PAT00001
anitrogen source of YM medium was replaced with individual nitrogen source.
bDCW represents dried cell weight.
cNC represents negative control (no nitrogen source was used)
dcontrol represents YM medium.
또한, 본 발명의 배지에 사용된 금속이온의 종류에 따른 얄로위아 리포리티카 Y-2178로부터 알칼리성 리파아제 생산량변화를 조사하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 각 금속이온은 기본배지(YM 배지)에 염화염 형태로 첨가하였다.
[표 2]. 금속이온의 종류에 따른 Y. lipolytica NRRL Y-2178로부터 생산되는 알칼리성 리파아제의 생산량변화
Figure 112007090906904-PAT00002
aEach metal ion in chloride salt was added to YM medium.
bDCW represents dried cell weight.
cControl represents YM medium.
표 2에 나타나 있는 것처럼 칼슘, 칼륨, 나트륨등이 높은 효소생산량을 나타내었고 코발트와 철의 경우 매우 낮은 효소생산량을 보였다. 철의 경우 미생물의 성장은 다른 효과적인 메탈이온들과 비슷한 정도의 값을 나타내었지만 효소의 생산량은 매우 낮게 나타나 메탈이온이 미생물의 성장과는 별개로 효소의 생성에 중요한 요소로 작용하고 있음을 알 수 있다.
제조예 1. 본 발명의 알칼리성 리파아제를 이용한 세제 조성물의 제조
Figure 112007090906904-PAT00003
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 알칼리 조건에서 활성을 갖는 리파아제를 얄로위아 리포리티카 효모 균주를 이용하여 생산할 수 있으며, 이러한 알칼리성 리파아제를 생산할 수 있는 효모 균주를 배양하는 최적 조건을 개발하였다. 이러한 알칼리성 리파아제는 세제 산업을 비롯하여 알칼리성 조건에서 리파아제의 활성을 필요로 하는 산업에서 다양하게 적용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 얄로위아 리포리티카로부터 생산되는 리파아제의 배양시간에 따른 생산량변화를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 얄로위아 리포리티카로부터 생산된 리파아제의 pH 변화에 따른 활성변화를 나타내는 그래프이다.
도 3는 본 발명의 얄로위아 리포리티카로부터 생산되는 알칼리성 리파아제의 배양온도에 따른 생산량변화를 나타내는 그래프이다.
도 4은 본 발명의 얄로위아 리포리티카로부터 리파아제를 생산하는데 사용된 배지의 초기 pH 변화에 따른 리파아제 생산변화를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 배지에 사용된 탄소원의 종류에 따른 얄로위아 리포리티카로부터 알칼리성 리파아제의 생산량변화를 나타내는 그래프이다.

Claims (9)

  1. 탄소원, 질소원 및 금속이온을 함유하는 배양액에서 얄로위아 리포리티카(Yallowia lipolytica) 효모 균주를 배양하는 단계 및 상기 효모 균주가 배양된 배양액으로부터 알칼리성 리파아제를 수득하는 단계를 포함하는 알칼리성 리파아제 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 효모 균주는 얄로위아 리포리티카 NRRL Y-2178인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 효모 균주의 배양은 배양온도 20-35℃, 배양시간 24-120 h 및 배지의 pH5-10 조건에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 알칼리성 리파아제는 효소활성이 pH6-9에서 증가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 탄소원은 포도당(glucose), 과당(fructose), 설탕(sucrose), 글리세롤(glycerol), 자일로스(xylose), 갈락토오스(galactose), 말토오스(maltose) 및 유당(lactose)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서. 상기 질소원은 효모추출물(yeast extract), 맥아추출물(malt extract), 글루타민(glutamine), 질산암모늄(NH4NO3), 펩톤(peptone), 트립톤(tryptone), 염화암모늄, 황산암모늄, 인산암모늄 및 요소(urea)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 금속이온은 철, 아연, 알루미늄, 칼슘, 마그네슘, 망간, 은, 금, 코발트 및 구리로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 제조된 알칼리성 조건에서 활성을 갖는 리파아제.
  9. 제 8항의 리파아제를 유효성분으로 함유하는 세제 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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EP3106520A1 (en) * 2015-06-17 2016-12-21 Institut National De La Recherche Agronomique Mutant yarrowia strain capable of degrading galactose

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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