KR20090058566A

KR20090058566A - 상피 성장 인자 수용체 항체에 대항하는 항체 치료의 효과를 개선하기 위한 치료 조성물

Info

Publication number: KR20090058566A
Application number: KR1020097007699A
Authority: KR
Inventors: 루이스 엔리께 페르난데스 모리나; 그레타 갈리도 이달고; 롤란도 페레스 로드리구에스; 벨린다 산체스 라미레스; 오드리 페르난데스 고메스; 알레한드로 로페스 레께나; 아이린 보솔레이 델가도
Original assignee: 센트로 데 인무노로지아 몰레큘라
Priority date: 2006-09-29
Filing date: 2007-09-27
Publication date: 2009-06-09
Also published as: CL2007002797A1; US20100047207A1; WO2008037225A1; KR101482957B1; CN101678099A; CO6160338A2; CA2664795C; AU2007302429B2; CR10753A; AR063011A1; CA2664795A1; PE20080674A1; CU23612A1; EP2070547B1; MX2009003159A; AU2007302429A1; CN102940883A; BRPI0717142A2; UY30616A1; TN2009000104A1

Abstract

본 발명은 타입 I IFN들과 조합하여 상피 성장 인자 수용체(EGFR)에 대한 모노크로날 항체를 사용한 치료적 처리의 효능성을 증가하는 특정한 치료적 조성물을 기술한다.

IFN, 상피 성장 인자 수용체, 모노크로날 항체

Description

상피 성장 인자 수용체 항체에 대항하는 항체 치료의 효과를 개선하기 위한 치료 조성물 {THERAPEUTIC COMPOSITIONS FOR BOOSTING THE EFFECT OF ANTIBODY THERAPY AGAINST THE EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR}

본 발명은 생명공학 분야, 특히 특정 암 면역치료법에 관한 것이다. 본 발명은 항-상피 성장 인자 수용체 모노크로날 항체(항-EGFR Mabs)와 타입 I 인터페론(IFNs)의 조합의 전이 성장에 대한 상승적인 효과에 기초된다. 따라서, 본 발명은 anti-EGFR 단일 치료의 제한을 극복하는 치료적 도구를 제공한다.

항-EGFR 모노크로날 항체(monoclonal antibodies)

EGFR 및 그 리간드는 조혈세포의 배제로 정상 조직에서 발현된다 ( Carpenter G. Annu Rev Biochem 1987; 56:881-914). 이들 단백질의 과발현은 많은 인간 상피 종양에서 검출되어졌다 (Salomon DS et al . Crit Rev Oncol Hematol 1995; 19:183-232). 예비-임상 연구는 EGFR-리간드 오토크린 및 파라크린 루프가 증식 및 종양세포 전이능을 조절한다는 것을 입증하였다 ( Verbeek BS et al . FEBS Lett 1998; 425:145-50; O- Charoenrat P et al . Int J Cancer 2000; 86:307-17; Radinsky R et al . Clin 20 Cancer Res 1995; 1:19-31). 결과적으로, 강력하고 선택적인 EGFR 안타고니스트가 현재 임상시도에 있다 ( Pal SK , Pegram M. Anticancer Drugs 2005; 16:483-94).

오늘날, 임상적 전개에서 가장 성공적인 치료법은 이종혼합(chimeric) Mab IMC-C225/Cetuximab이다. Cetuximab는 수용체의 세포외 영역의 서브도메인 III에 결합하고, 리간드와 경쟁하고 그리고 수용체 이합체화에 영향을 미침으로써 수용체의 활성을 차단한다. 또한, Cetuximab는 EGFR의 내재화 및 분해를 유도한다 (Shiqing L et al . Cancer Cell 2005; 7:301-11). 부가하여, 나라무라(Naramura)와 그 공동연구자들은 환자의 말초혈액 단일세포의 활성화를 통해 Cetuximab이 항체-의존성 세포질의 세포독성을 유도할 수 있다는 것을 입증하여, 이 메커니즘이 이 항-EGFR Mab의 항-종양 활성에 기여할 수 있다는 것을 제안한다 (Naramura M et al . Cancer Immunol Immunother 1993; 37:343-9). Cetuximab을 사용한 예비-임상적 연구는 EGFR을 발현함을 통해 인간 제노그라프트 종양의 완전한 퇴화를 제공하였다 (Goldstein J et al . J Immunol 1997; 158:872-9).

말기 EGFR-발현 고형종양이 있는 환자에 있어서 I 단계 임상적 시도는 Cetuximab이 아주 내성적이다라는 것을 입증하였다 (Robert F et al . J Clin Oncol 2001; 19:3234-43; Baselga J et al . J Clin Oncol 2000; 18:904-14; Shin DM et al . Clin Cancer Res 2001; 7:1204-13). Cetuximab에 기인할 수 있는 가장 임상학적으로 관련된 부작용은 알러지 반응과 피부 독성이다 ( Shin DM et al . Clin Cancer Res 2001; 7:1204-13). Cetuximab은 검지할 수 있는 EGFR 발현이 있는 말기 콜론 직장암 환자의 치료를 위해 단일 치료뿐 아니라 이리노테칸(irinotecan)과 조합하여 최근에 미국 식품의약청(FDA)에 의해 승인되었다 ( ImClone Systems , Erbitux ( Cetuximab ). US Prescribing IFNormation. ImClone System , 2004). 부가하여, Cetuximab을 임상적으로 시험하는 포괄적 II 및 III 단계가 췌장 암종 환자( Xiong HQ et al . J Clin Oncol 2004; 22:2610-6), 비소세포 폐암(NSCLC) 환자( Lynch TJ et al . Proc Am Soc Clin Oncol 2004; Rosell R et al . Proc . Am . Soc Clin . Oncol . 2004) 및 머리와 목의 평판세포 암종(SCCHN) 환자 (Bonner JA et al. Proc . Am . Soc . Clin . Oncol . 2004)에서 지속되었다.

또한, 인체화 항체 h-R3/TheraCIM (Center of Molecular Immunology)이 평가되었다. 이 Mab은 EGFR/EGF 결합을 저해하는 원래의 뮤어라인 항체에 유사한 능력을 가진다 ( Mateo C et al . Immunotechnology 1997; 3:71-81). 단일 층에서 A431 세포 라인의 증식을 저해하는 h-R3 능력은 Cetuximab에 유사하다. h-R3을 사용한 예비 임상연구에서, EGFR 발현을 통해 인간 종양 제노그라프트의 완전한 퇴화가 얻어졌다 ( Viloria - Petit A et al . Cancer Res 2001; 61:5090-101). h-R3은 말기 머리와 목 암 환자의 치료를 위해 쿠바의 약물품질 제어 센터(CECMED)에 등록되었다 ( Crombet T et al . J Clin Oncol 2004; 22:1646-54). 또한, h-R3을 시험하는 임상적 시도가 뇌, 유방, 전립선 및 폐와 같은 다른 국소조직에서 지속되어 지고 있다 (Crombet T, personal communication).

유사한 작용 메커니즘을 가지는 기타 항-EGFR Mab들이 현재 임상적인 연구에 있다. ABX-EGF는 리간드-의존성 수용체 활성화를 저해하고 인간 종양 제노그라프트의 성장을 저해하는 전적으로 인간 IgG2 항-EGFR Mab이다 ( Yang X et al . Cancer Res 1999; 59:1236-43). 근래에 콜론 직장암 환자에 ABX-EGF를 임상적 시험하는 단 계 III의 긍정적인 결과가 보고되었다 ( Tyagi P. Clin Colorectal Cancer 2005; 5:21-3). 더욱이, 직장암 및 NSCLC 환자에 이 Mab으로 II 단계 임상 실험이 진행 중이다 (Tiseo M et al. Curr Med Chem Anticancer Agents 2004; 4:139-48). EMD 72000 (humanized anti-EGFR Mab)은 췌장암 환자에서 평가되었다 (Graeven U et al . Br J Cancer 2006; 94:1293-9). 그러나, 항-EGFR Mab으로 치료된 전이 암 환자는 유의성 있는 생존의 이점에 도달하지 않았다. 예를 들어, Cetuximab으로 치료된 이리노테칸-내성 콜론 직장암 환자는 질환 안정화를 가지지만 생존율의 증가에 도달하지는 않았다 ( Cunningham D et al . N. Engl . J. Med . 2004; 351: 337-345). 이들 결과는 항-EGFR Mab 효용성을 증가하게 하는 치료적 조합의 연구를 이끈다.

Mab-기재 수동형 치료법에 의한 세포독성 T 림프구 유발

교차초회항원자극(Cross-priming)이 25년도 더 전에 Michael Bevan에 의해 기술되었다 ( Bevan MJ . J Exp Med 1976; 143: 1283-88). 이 현상은 외부 공여 세포로부터 포획된 극소 조직적합성 항원에 대한 수위 세포독성의 T 림프구(CTL) 반응에 항원-존재 세포(APC)의 능력에 기초된다. 다수의 인자들이 수상 세포(DC)의 MHC class-I 내재화 경로에 항원의 전달을 증진하고 개선하는 것이 동정되어 졌다. 이들 중 열-충격 단백질( Suto R, Srivastava PK . Science 1995; 269: 1585-88), 엑소솜( Wolfers J et al . Nature Medicine 2001: 7: 297-303), 및 면역 복합체들( Regnault A et al . J Exp Med 25 1999; 189: 371-80)이 있다. 사멸 및 괴사 세포 염색은 크로스-내재화에 항원의 특별한 매력적인 소재이다. DC에 의한 사멸/괴사 세포질 물질의 주입의 면역학적 결론은 논쟁이 있다 ( Russo V et al . PNAS 2000; 97: 2185-90; Yrild BU et al . J Exp Med 2000; 191: 613-21). 일반적으로, 괴사 세포물질은 면역원인 것으로 생각되어 지는 반면, 사멸 세포물질은 면역학적으로 무해하거나 더욱이 내성이 있는 것으로 생각된다. 그러나, 어떤 모델 시스템에서는 이것이 성숙에 대해 "위험 신호"를 방출하기 때문에 사멸 세포 사(死)가 CTL의 교차초회항원자극에 대해 매력적인 면역원성 항원 원인 것으로 나타났다 (Lake RA , Robinson BWS . Nature Reviews 2005; 5: 397-405).

C2B8 (리툭시맙; Rituximab)은 CD20에 대한 이종혼합 마우스-인간 MAb이다 (Relf Meet et al. Blood 1994; 83: 435-45). 이 제제는 약 50%의 반응율과 12개월까지 질병의 진보 없는 간격으로 정상 및 종양 B 세포의 신속하고 효율적인 방혈을 증진하는 B-세포 타입의 비호지킨스 림프종의 치료에 사용된다 (Maloney DG. Curr Opin Haematol 1998; 5:237-43; Coiffier B et al. Blood 1998; 92:1927-32; Hainsworth JD et al. Blood 2000; 95:3052-56). 몇몇 연구는 리툭시맙 치료에 대해 최대 임상적이고 분자적 반응이 수 개월이 걸리는 것을 나타내어, 어팝토시스, 보체-의존성 세포독성 (CDC), 및 ADCC와 같은 단-기간 세포용혈 메커니즘이 단 하나도 포함되어 지지 않는다는 것을 제시한다. 이들 후자 메커니즘의 어떤 것을 통한 림프종 세포의 리툭시맙 증진된 용혈은 DC에 의해 림프종 세포-유래 펩티드의 수취 및 크로스-내재화를 증진하여, 이들의 성숙을 유도하고 특이적 CTL의 발생을 가능하게 한다 (Selenko N et al. J. Clin. Oncol 2002; 3:124-130). 리툭시맙에 의해 유도된 "백신 효과"는 엄격하게는 연구되지 않았다. 랜덤화된 임상적 시도가 이 어프로치의 임상적 임팩트를 확인하기 위해 필요되어 진다.

항-종양 치료법으로 알파/베타 타입 I 인터페론

알파/베타 타입 I IFN (IFNs-α/β)들은 멜라노마 및 신장 암종 환자에 특이적으로 항-암 치료에 사용되어 진다 ( Agarwala SS , Kirkwood JM . Semin . Surg . Oncol . 1998; 14: 302-310; Vlock DR et al . J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol . 1996; 19:433-442; Kirkwood JM et al . Semen . Oncol . 1997; 24: 16-23; Kirkwood JM et al. J Clin. Oncol 1996; 14: 7-17). IFN-α는 재조합 DNA 기술에 의해 생산된 제일 사이토킨으로, 증식 및 종양 분화를 조절하는 것이 입증되어 졌다 ( Hertzog et al . J Biol Chem 1994; 269:14088-93). 또한, 이것은 어팝토시스 유도( Clemens MJ . J Interferon Cytokine Res 2003; 23:277-92) 및 종양형성 저해( Sidky YA et al . Cancer Res 1987; 47:5155- 61)에 있어서의 그 효과가 보고되었다. 종양 세포에 대한 INFs-a/b 효과에 부가하여, INFs-α/β는 숙주 면역 세포 상에 몇 가지 효과를 보여 주어, 항-종양 면역 반응에 있어서 중요한 역할을 할 수 있다 ( Belardelli F. APMIS . 1995; 103:161-179). 그러나, 고형 종양에서 IFN-α 임상적 유효성으로부터의 데이터는 일치하지 않는다. 사실, 특정 종양이 있는 환자 만이 이점을 가지는 반면 나머지들은 이 치료법에 부분적으로 또는 전체적으로 저항적이다.

종양 세포 상에 EGFR 발현의 조절에서 INF-α 역할에 대한 연구가 공개되었다 (Budillon A et al. Cancer Res 1991; 51: 1294-9; Caraglia M et al. Int J Cancer 1995; 4: 309-16; Heise H et al . Anti Cancer Drugs 1995, 6;686-92; Scambia G et al . Int J Cancer 1994; 58: 769-73; Yang JL et al . Gut 2004; 53: 123-129; Qu XJ et al . J Urology 2004; 172: 733-738). 몇몇 종양에서 발현과 EGFR 활성을 증가하는 INF-α 능력을 입증하는 보고에 기초하여, 다른 저자들은 조합된 치료법에 대해 항-종양 이점을 얻는 EGFR 티로신 키나제 저해제(EGFR TKIs)와 INF-α의 조합을 연구하였다 ( Yang JL et al . Oncology 2005; 69: 224-238; Brucese Fet al. Clin Cancer Res 2006; 12: 617-625; Yang JL et al. Cancer Letters 2005; 225: 61-74). 그럼에도 불구하고, 이들 연구는 종양 세포에서 EGFR 발현에 대한 IFN-α 효과가 아주 다양하기 때문에 일반화되어 질 수 없다 ( Scambia G et al . Int JCancer 1994; Yang JL et al . Gut 2004; 53: 123-129; Qu XJ et al . J Urology 2004; 172: 733-738). 이 현상은 환자의 생태적 지위에 대한 INF-α 치료의 이점을 제한할 수 있었다. 한편, IFN-α는 정상 조직에서 주요한 조직적합성 복합체 클래스 I (MHC I) 분자를 증가할 수 있다 ( Cho HJet al . J Immunology 2002; 168: 4907-13; Lang KS et al . Nature Medicine 2005; 11: 138-44). 본 발명에서는, 종양세포에 INF-α 적용이 비록 종양이 면역학적 효과에 대한 탈출 메커니즘으로 MHC I 분자를 감소하더라도 MHC I 발현을 증가할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 결론적으로, IFN-α/항-EGFR Mab 조합은 IFN-α/EGFR TKI 조합보다 더 유익할 수 있는데 이는 항-EGFR Mab들이 CTL 반응을 유도할 수 있고 그리고 이 효과는 EGFR TKI들에 대해 기술되어 지지 않았기 때문이다.

본 발명은 이전의 기술에서는 기술되어 지지 않았을 뿐 아니라 제안되지도 않은 두 가지의 생물학적 이벤트에 기초되어 진다. 첫 번째로, 항-EGFR Mab-기재 치료법은 CD8⁺ T 세포 의존성이다. 특별하게는, 항-EGFR Mab들의 항-전이 효과는 CD8⁺ T 세포 의존성이다. 두 번째로, 종양세포의 타입 I IFN 치료는 MHC I 발현을 증가한다. 이들 사실의 조합된 적용은 항-EGFR Mab 및 타입 I IFN의 항암 치료 효과를 현저하게 증가하는 것을 가능하게 한다.

본 발명은 항-EGFR Mab 및 타입 I IFN의 동시적 또는 순차적 투여(한번 또는 수번)를 포함하는 암 치료에 유용한 치료 조성물에 관한 것으로, 여기서 항-EGFR Mab은 이종혼합 또는 인체화 항체이다. 특히, 본 발명은 EGFR를 인지하고, 기탁 번호 ECACC 951110101로 세포 라인에 의해 생산된 인체화 h-R3Mab을 포함하는 치료적 조성물에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명의 치료적 조성물은 타입 I IFN들을 포함하고, 그리고 더욱 특히 이 조성물은 IFN-α, 더욱 자세하게는 재조합 인간 IFN-α를 포함한다.

부가하여, 본 발명은 여기에 기술된 치료적 조성물의 투여 스케쥴에 관한 것으로, 이것은 동시에 또는 순차적으로 될 수 있다.

또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 항-EGFR Mab을 갖는 컨테이너, 하나 또는 다수 IFN를 갖는 하나 또는 다수 컨테이너 및 라벨이나 복용량 및 용도에 대한 기타 지시로 구성된 약학적 키트에 관한 것이다.

윤리적 이유에 기인하여, 이것은 인간에 대한 실험이 불가능하여 본 발명은 더욱이 본 발명에 의해 개시된 기술적 해결을 "생체 내"에서 입증하기 위한 실험적 모델에 관한 것이다. 이 실험적 모델은 뮤어라인 EGF 수용체에 대한 뮤어라인 항체뿐 아니라 종양 세포라인의 성장에 대한 항체의 생물학적 효과를 포함한다.

항- EGFR Mab 처리의 항-전이 효과의 평가

8 내지 12주령의 Balb/c 또는 C57BL/6 마우스들이 항-EGFR Mab 처리의 항-전이적 효과의 평가를 위한 실험적 모델로 사용되었다.

마우스는 뮤어라인 EGFR 또는 대조 Mab(각 종양에 무관한 항-EGFR Mab의 동일한 이소타입을 갖는 항체)의 세포외 도메인에 특이적인 Mab로 1 내지 25 mg/kg 사이의 복용량을 사용하여 처리되었다. 항체는 정맥 내 또는 복강내 주사에 의해 접종되었다. 투여 프로토콜은 다른 방식으로 수행되어 질 수 있다:

ㆍ종양 챌린지 전에 시작하고 종양 챌린지 후 1, 2, 3일 지속함. 6일차 후에, 치료는 분석 종료 시까지 주 당 세 번 복용으로 다시 시작되었다.

ㆍ종양 챌린지 후 2일차에 시작하고 3일 차에 부가적 복용. 6일차 후에, 투여는 분석 종료 시까지 주 당 세 번 복용으로 다시 시작되었다.

ㆍ분석 종료 시까지 주 당 세 번 복용으로 종양 챌린지 후 6일차에 시작됨.

EGFR를 발현하는 뮤어라인 종양 세포(폐, 가슴, 콜론, 전립선, 뇌, 방광 및 머리&목 종양)는 0일에 마우스에 접종되었다. 접종된 종양 세포의 양은 마우스 당 1 x 10³ 내지 1 x 10⁶이다. 종양 세포는 폐나 간으로 전이를 위하여 정맥 내, 피하로 또는 근육 내 주사로 투여되어 질 수 있다. 마우스는 경추 탈골에 의해 희생되었다(종양 챌린지 후 20 내지 45일). 각 조직에 대한 전이는 실체현미경을 사용하여 계산되었다.

항- EGFR Mab 의 항-전이 효과에 있어서 CD8 ⁺ T 세포 역할의 측정

마우스는 상술한 바와 같이 종양 세포로 접종되었다(0 일). 마우스는 CD8 양성 세포를 제거할 수 있는 CD8 분자에 특이적인 Mab의 정맥 내 또는 복강 내 주입을 수용한다 (5-50 mg/Kg). 항-CD8 Mab 투여가 -1일에서 6일까지 시작하여 매 4일 간격으로 분석 종료 시까지 지속된다. 또한, 마우스는 상술한 바와 같이 항-EGFR Mab으로 처리된다. 마우스는 경추 탈골에 의해 희생되었다(종양 챌린지 후 20 내지 45일). 각 조직에 대한 전이는 실체현미경을 사용하여 계산되었다.

IFN -α/항- EGFR Mab 조합의 항-전이 효과의 평가

마우스는 상술한 바와 같이 종양 세포 및 항-EGFR Mab으로 접종되었다. 더욱이, 이들 마우스는 정맥 내, 복강 내 또는 피하로 주입에 의해 뮤어라인 IFN-α (5 x 10⁵- 5 x 10⁶U/Kg)로 처리된다. 투여 프로토콜은 다른 방식에 의해 수행되어 질 수 있다: (a) 항-EGFR Mab 및 IFN-α 동시적으로, (b) 예비 처리 (IFN-α) 및 처리 (항-EGFR Mab) 또는 (c) 예비 처리 (IFN-α) 및 처리 (항-EGFR Mab + IFN-α). 마우스는 경추 탈골에 의해 희생되었다(종양 챌린지 후 20 내지 45일). 각 조직에 대한 전이는 실체현미경을 사용하여 계산되었다.

항 인간 EGF-R 항체 및 α-INF를 포함하는 면역치료적 조성물

본 발명의 조성물은 진단 및/또는 수술적 치료 후 즉시 환자에게 투여되어 지는 α-INF와 함께 인간 EGF-R의 세포 외 도메인에 대해 특정 MAb들로 긍정적인 면역치료법을 포함한다. 본 발명의 조성물은 치료하에 있는 이들 개개인들에 있어서 CD8+ T 세포-기재 면역 반응을 유도한다.

항 EGF-R 항체 및 α-INF를 포함하는 치료적 조성물은 폐 전이 전개에 대해 상승적인 효과를 가진다.

절차는 상피 유래의 말기 암을 가진 환자에 100 내지 400 mg의 항-EGFR MAb과 인간 재조합 α-INF를 10 - 30 x 10⁶ IU/ m²/일 사이의 복용량으로 투여하는 것으로 구성된다. 주입은 몇 가지 스케쥴에 따를 수 있다. 바람직하기로는, 본 발명의 치료 조성물은 다음의 스케쥴의 어느 하나에 따른다: (a) 일 주 동안 한 달에 한번 주입 또는 (b) 매 3개월 4연속 주. 치료는 부분적 또는 완전한 종양 퇴화가 있거나 또는 치료 중단을 요하는 어떤 부작용이 나타날 때까지 지속될 것이다.

도 1은 7A7 Mab의 중 가변 영역을 코드하는 cDNA의 핵산 및 연역된 아미노산 시퀀스이다. 아미노산은 Kabat에 따라 열거되었다. 공간은 어라인먼트를 최대화하기 위해 도입되었다. 각 코돈에 의해 코드된 아미노산 잔기는 핵산 시퀀스 위에 주어졌다.

도 2는 7A7 Mab의 경 가변 영역을 코드하는 cDNA의 핵산 및 연역된 아미노산 시퀀스이다. 아미노산은 Kabat에 따라 열거되었다. 공간은 어라인먼트를 최대화하기 위해 도입되었다. 각 코돈에 의해 코드된 아미노산 잔기는 핵산 시퀀스 위에 주어졌다.

도 3은 D122 종양에 대한 7A7 Mab 항-전이 효과이다. C57BL/6 마우스는 D122 세포(실험적 전이 모델)로 접종되고 그리고 7A7 또는 대조 Mab으로 처리되었다. 종양 주입 3주 후, 마우스가 희생되고, 그리고 폐가 제거되었다. D122 폐 전이의 수가 계수되었다.

도 4는 D122 종양에 대한 7A7 Mab 항-전이 효과가 CD8⁺ T 세포 의존적인 것이다. C57BL/6 마우스는 D122 세포(실험적 전이 모델)로 접종되고 그리고 7A7 또는 대조 Mab으로 처리되었다. 마우스는 항-CD8 Mab을 사용하여 CD8 양성 세포 군집을 방혈하였다. 종양 주입 3주 후, 마우스가 희생되고, 그리고 폐가 제거되었다. D122 폐 전이의 수가 계수되었다.

도 5는 IFN-α 처리에 의해 D122 및 MB16F10 세포에서 증가된 MHC I 준위이다. D122 및 MB16F10 세포는 12시간 동안 IFN-α로 처리되었다. 마지막으로, 세포는 용합된 H-2kb 분자 FITC에 특이적인 Mab으로 배양되었다. H-2kb 양성 세포의 백분율은 FACS에 의해 측정되었다.

도 6은 IFN-α 처리가 D122 세포에 대한 EGFR 발현을 변화시키지 않는다는 것이다. D122 세포는 48시간 동안 α-IFN으로 처리되었다. 마지막으로, 세포는 7A7 Mab으로 배양되었다. EGFR 양성 세포의 백분율은 FACS에 의해 측정되었다.

도 7은 7A7 Mab/α-IFN 조합 처리의 항-전이 효과는 독립적인 처리에 비해 월등하다는 것이다. C57BL/6 마우스는 D122 세포(실험적 전이 모델)로 접종되고 그리고 7A7 또는 α-IFN으로 처리되었다. 종양 주입 3주 후, 마우스가 희생되고, 그리고 폐가 제거되었다. D122 폐 전이의 수가 계수되었다.

실시예 1: 항-뮤어라인 EGFR Mab 획득.

Balb/c 마우스가 프로인트 어쥬번트에 유화된 뮤어라인 EGFR (Sanchez B et al. Int J Cancer 2006; 119:2190-2199)의 세포 외 도메인의 재조합 단백질로 면역되어졌다. 혈청은 0일과 60일에 가공되었다. 단백질 재조합에 대한 특정 항체가 ELISA에 의해 측정되었다. 접종된 마우스 전개 높이 혈청 IgG는 재조합 단백질에 대해 (1:80 000-1:100 000) 수준으로 되었다. 재조합 단백질에 대해 가장 높은 항체 역가를 나타내는 마우스가 융합 실험을 위해 선택되었다. 뮤어라인 EGFR의 세포외 도메인에 대해 특이적인 Mab인 7A7 (IgG1)이 얻어졌다 ( Garrido G et al . Hybridoma and Hybridomics 2004; 23 (3): 168-175). 이 Mab은 특이적으로 웨스턴 블럿, FACS 및 면역세포화학과 같은 다른 기술에 의해 종양 세포에 존재하는 뮤어라인 EGFR을 인지한다.

7A7 Mab의 중 사슬 가변영역의 연역된 아미노산 시퀀스와 핵산 시퀀스(GenBank access number: DQ437656)는 도 1에 도시되어 있다. 7A7 Mab의 경 사슬 가변영역(Vk)의 연역된 아미노산 시퀀스와 핵산 시퀀스(GenBank access number: DQ437657)는 도 2에 도시되어 있다.

실시예 2: D122 종양에 대한 7A7 Mab 항-전이 효과.

D122 세포 (2.5 x 10⁵) [D122 종양이 루이스 폐 암종의 전이성 크론임]가 C57BL/6 마우스의 외측 꼬리 정맥으로 주입되었다. 7A7 및 대조 Mab (100 ml PBS 내 28 mg/kg)이 종양 챌린지 6일 후에 투여되고 주당 3회 복용이 지속되었다. 종양 주입 삼 주 후, 마우스가 희생되고, 그리고 폐가 제거되었다. D122 폐 전이의 수가 계수되었다. 7A7 Mab의 투여는 대조 Mab에 비하여 D122 폐 전이의 수를 유의적으로 감소하였으며(도 3), 이 차이는 통계적으로 유의성이 있다 (Mann-Whitney test, p < 0.0001).

실시예 3: D122 종양에 대한 7A7 Mab 항-전이 효과는 CD8⁺ T 세포 의존적임.

D122 세포 (2.5 x 10⁵)가 C57BL/6 마우스의 외측 꼬리 정맥으로 주입되었다. 7A7 및 대조 Mab (100 ml PBS 내 28 mg/kg)이 종양 챌린지 6일 후에 투여되고 주당 3회 복용이 지속되었다. 특정 항체(복강 내 주입)에 의한 CD8⁺ 세포의 방혈이 종양 챌린지 6일 후에 시작되어 분석 종료 시까지 지속되었다. 방혈의 유효성이 마우스의 지라 및 폐에서 시금되었다. 종양 주입 삼 주 후, 마우스가 희생되고, 그리고 폐가 제거되었다. D122 폐 전이의 수가 계수되었다.

이 실험에서, 대조 마우스에 비하여 7A7-처리 마우스에서 D122 폐 전이의 수에서의 유의적 감소가 관찰되어 D122 종양에 대한 7A7 Mab 항-전이 효과가 입증되 었다 (Dunn test, p < 0.01) (도 4/ 표1). CD8⁺세포 방혈은 대조군에 대한 폐 전이 수의 중앙 값보다 큰 7A7 군에 대한 폐 전이 수의 중앙 값을 얻는 7A7 Mab 항-전이 효과를 파기 하였다 (Dunn test, p < 0.05) (도 4/표 1).

실험군의 전이 수 중앙 값

중앙값
7A7 Mab	대조 Mab	7A7 Mab + 방혈	대조 Mab + 방혈
7	44	49	44

실시예 4: IFN-α 처리에 의한 D122 및 MB16F10 세포에 발현된 MHC I 준위.

D122 및 MB16F10 세포 (0.25 x 10⁶/ 6-웰 플레이트)가 IFN-α (1000 U/ml)로 12 시간 동안 처리되었다. 다음으로, 세포막 상에 MHC I 발현 준위가 FACS에 의해 처리 및 비처리 세포에서 결정되었다. 세포 (2 x 10⁵)는 4℃에서 15분 동안 1% BSA (B 용액) 및 0.1% NaN₃을 함유하는 PBS에서 배양되었다. 이어서, 세포는 B 용액 (1:200, Pharmingen, EEUU)에 희석된 H-2kb 분자에 대해 특이적인 Mab으로 염색된다. 수세 후, 10⁴세포가 FACScan 플로우 사이토메터 (Becton Dickison)를 사용하여 수득되었다. 얻어진 데이터는 WinMDI 소프트웨어(version 2.8)를 사용하여 분석되었다. IFN-α 처리는 D122 및 MB16F10 세포의 멤브레인에서 MHC I 발현의 증가를 불러일으켰고, 이 처리는 또한 IFN-α 양성 세포의 백분율을 증가하였다(도 5).

실시예 5: D122 세포에서 EGFR 발현에 대한 α-IFN 처리의 효과.

D122 세포 (0.25 x 10⁶/ 6-웰 플레이트)가 IFN-α (1000 U/ml)로 48 시간 동안 처리되었다. 다음으로, 세포막 상에 EGFR 발현 준위가 FACS에 의해 처리 및 비처리 세포에서 결정되었다. 세포 (2 x 10⁵)는 4℃에서 15분 동안 1% BSA (B 용액) 및 0.1% NaN₃을 함유하는 PBS에서 배양되었다. 이어서, 세포는 B 용액에 희석된 7A7 Mab (1 mg/ml)으로 4℃에서 15분 동안 염색된다. 수세 후, 융합 고트 항-마우스 토탈 Igs FITC가 부가된다(1:200; Pharmingen, EEUU). 수세 후, 10⁴세포가 FACScan 플로우 사이토메터 (Becton Dickison)를 사용하여 수득되었다. 얻어진 데이터는 WinMDI 소프트웨어(version 2.8)를 사용하여 분석되었다. D122 세포의 IFN-α 처리는 EGFR 발현을 변화시키지 않았다 (도 6).

실시예 6: D122 종양에 대한 7A7 Mab/ α-IFN 조합의 항-전이 효과.

D122 세포 (2.5 x 10⁵)가 C57BL/6 마우스(그룹 당 10 마리)의 외측 꼬리 정맥으로 주입되었다. IFN-α (5 X 10⁵ U/Kg, 복강 내 주입)와 7A7 Mab (1 mg/kg, 정맥 내 주입)의 공동 주입이 종양 챌린지 6일 후에 시작되었고 분석 종료 시까지 주당 3회 복용이 지속되었다. 종양 주입 삼 주 후, 마우스가 희생되고, 그리고 폐가 제거되었다. D122 폐 전이의 수가 계수되었다. PBS 또는 7A7 Mab이나 α-IFN으로 처리된 마우스가 대조로 사용되었다.

이 실험에서, PBS-처리 마우스에 비하여 7A7-처리 마우스 및 α-IFN-처리 마우스에서 D122 폐 전이의 수에서의 감소가 관찰되어 D122 종양에 대한 7A7 Mab 및 α-IFN-항-전이 효과가 입증되었다 (단일치료법으로) (도 4/ 표1). 그러나, 이 항-전이 효과는 마우스가 조합된 치료법을 받을 때 유의적으로 증가되었다 (도 7/표 2) (PBS vs. AcM 7A7+α-IFN: p< 0,001; AcM 7A7 vs AcM 7A7+α-IFN: p< 0,05; α-IFN vs AcM 7A7+α-IFN: p< 0,05, Dunn test).

실험군의 전이 수 중앙 값

중앙값
PBS	7A7 Mab	α-IFN	7A7 Mab +α-IFN
103	42	36	2

Claims

항-EGFR Mab 및 하나 또는 몇 가지 타입 I IFN의 동시적 또는 순차적 투여를 포함하는 암 치료에 유용한 치료적 조성물.
제 1항에 있어서, EGFR에 대한 모노크로날 항체, 인터페론 및 정맥으로 주입을 위해 적절한 부형제를 포함함을 특징으로 하는 치료적 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 EGFR에 대한 모노크로날 항체는 이종혼합 항체임을 특징으로 하는 치료적 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 EGFR에 대한 모노크로날 항체는 인체화 항체임을 특징으로 하는 치료적 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 EGFR에 대한 모노크로날 항체는 기탁번호 ECACC 951110101를 갖는 세포 라인에 의해 생산된 인체화 항체 h-R3임을 특징으로 하는 치료적 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 인터페론은 타입 I 인터페론임을 특징으로 하는 치료적 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 인터페론은 인간 α-INF임을 특징으로 하는 치료적 조성물.
제 7항에 있어서, 상기 인터페론은 인간 재조합 α-INF임을 특징으로 하는 치료적 조성물.
기탁번호 ECACC 951110101를 갖는 세포 라인에 의해 생산된 항 EGFR 인체화 항체 h-R3와 인간 재조합 α-INF를 포함함을 특징으로 하는 치료적 조성물.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서 항체 및 인터페론의 순차적 투여를 포함하는 치료적 조성물.
항-EGFR Mab을 갖는 컨테이너, 하나 또는 다수 IFN를 갖는 하나 또는 다수 컨테이너 및 라벨이나 복용량 및 용도에 대한 부가적 지시로 구성된 약학적 키트.