KR20090057970A - Ｃｄ63의 세포 표면 발현을 증명하는 세포독성 중재 - Google Patents

Abstract

본 발명은 암 질환의 치료 및 진단, 특히 원발성 및 전이성 사람 종양 세포의 세포 독성 중재; 좀더 특별하게는 분리된 단클론 항체 또는 이의 암 질환 변환 항체(CDMAB)와 선택적으로 하나 또는 그 이상의 화학요법제와 복합하여 이와 같은 사람 종양 가령, 간세포로부터 기인된 임의 원발성 또는 전이성 종양에서 세포독성 반응을 개시하는 수단으로의 이용에 관계한다. 본 발명은 또한 본 발명의 CDMAB를 이용한 결합 검사에 관계한다.

Description

ＣＤ63의 세포 표면 발현을 증명하는 세포독성 중재{CYTOTOXICITY MEDIATION OF CELLS EVIDENCING SURFACE EXPRESSION OF CD63}

본 발명은 암 질환의 진단 및 치료, 특히 종양 세포의 세포 독성 중재에 관계하고; 좀더 구체적으로는 암 질환 변경 항체(CDMAB)의 이용, 세포 독성 반응을 개시하는 수단으로써 하나 또는 그 이상의 화학치료제와 선택적으로 복합하여 CDMAB의 이용에 관계한다. 본 발명은 또한 본원의 CDMAB을 이용하는 결합 검사에 추가적으로 관련된다.

암에서 CD63: CD63는 테트라스파닌(tetraspanin) 패밀리의 타입 III 막 단백질로, 이들 패밀리의 30개 멤버가 4개 막통과(transmembrane) 단편이 존재하는 것으로 특징된다. 활성화시킨 혈소판, 과립구 및 흑색종 세포의 전체 세포 준비물에 대해 생성된 항체를 이용하여 몇 개 그룹에서 독립적으로 CD63을 동정하였다. 이들 동일한 기원의 당단백질의 해당 cDNA의 클로닝으로 상이한 항원들이 하나의 그리고 동일한 분자라는 인식하게 되었다. 백혈구세포 타이핑에 대한 6차 국제 워크샵(1996)에서 이드 항체를 CD63 항체로 분류하였다. 1996년 워크샵 전까지, CD63는 여러 가지 이름으로 공지되었는데(흑색종 1 항원, 안구 흑색종-연관된 항원, 흑색종 연관된 항원 ME491, 리소좀-연관된 막 당단백질 3, 그래뉼로피 신(granulophysin), 흑색종-연관된 항원 MLAl), 이들은 어느 정도 부분적으로 특징화되고 동정된 상기 항체와 연관되었다. 따라서, CD63를 항원 ME491 (MAb ME491), 신경샘(neuroglandular) 항원 (MAbs LS59, LS62, LS76, LSI 13, LS 140 and LS 152), Pltgp40 (MAbs H5C6, H4F8 and H5D2), 사람 골수 기질(stromal) 세포 항원 (MAb 12Fl 2), 골전구세포-특이적 마커 (MAb HOP-26), 그리고 인테그린-연관된 단백질 (MAb 6Hl )로도 명명되었다. 사람 CD63과 교차 반응을 하는 다른 항체들은 8-1H, 8-2A (ME491와 교차 반응성), NKI/C-3 및 NKI/black-13 (Vennegoor et al. Int J 암 35(3):287-95 (1985); Vennegoor and Rumke, 암 Immunol Immunother. 23(2):93-100 (1986); Demetrick et al, J Natl 암 Inst 84(6):422-9 (1992); Wang et al., Arch Ophthalmol. 1 10(3):399-404 (1992))이다. 면역친화적으로 정제된 NKI/C3 항원에 대해 생성된, 토끼 다클론 항체 RaC3로 한 작업에서, 표면 분자량이 약 20kDa인 그리고 N-연겨된 탄수화물에 의해 상당히 전사후 변형되는 코어 폴리펩티드로 표적 단백질을 밝혔다(Gruters et al., 암 Res 49(2):459-65(l 989)).

CD63은 사람 피부를 해치는(cutaneous) 흑색종 세포 주 SK Mel 23 준비물에 대해 생성된 다수의 항체 중 하나인 MAb ME491을 이용하여 흑색종 cDNA 라이브러리로부터 처음으로 클론시켰고, 흑색종 세포에 겨합에 대해 스크리닝되었다. Immunoprecipitation from ¹²⁵I-락토퍼옥시다제-라벨된 흑색종 세포로부터 면역침전에 의해 세포 표면에 존재하는 30- 6OkDa 단백질을 밝혔다. 이 항체에 의해 인지된 항원은 해독후 상당히 변형되는 단백질인 것으로 나타났다. 면역조직화학에 의해, 항체는 주변의 정상적으로 보이는 세포가 아니라, 종양 조직에 있는 흑색종 세포를 인지하는 것으로 밝혀졌고, 따라서 이 항체는 잠재적으로 종양-특이적 항원 결정부위(determinant)를 인지한다고 제시되었다(Atkinson et al., 하이브리도마 4, 243-255 (1984)). 이 항체는 또한 포도막 흑색종의 87%에 흑색종 세포를 착색시키고, 풍선(balloon) 세포가 존재하는 경우, 86%에서 풍선 세포를 착색시켰다. 이 연구에서, 정상 안구 조직의 착색은 다양하였고, 정상 경우에서 몇가지만 포지키브이며, 형태학적으로 정상인 멜라닌형성세포에서는 거의 드물었다(Folberg et al., Arch Ophthalmol 103(2):275-9 (1985)). 별도의 시험에서, 단클론 항체 MAb6-Fl, MAb8-lH 및 MAb8-2A(SK Mel 23 세포주에 대해 생성된)는 동일한 항원을 인지하고, MAb ME491로 얻은 것과 유사한 면역조직화학적 착색 패턴을 나타내었다. 또한, 이들 항체들은 원발성 맥락막 흑색종이 있는 환자에서 정상적인 간 세포는 착색시키지 않았지만 간 전이 종양 조직을 착색시켰다. 사람 흑색종 생검의 또 다른 연구에서, MAb ME491의 반응성은 흑색종 진행과 역 관계가 있는 것으로 나타났다. ME491 항체의 반응성은 정상 멜라닌형성세포에서는 낮았지만 흑색종 진행의 초기 단계에서는 더 높았고(이형성 모반[dysplastic nevi] 및 반경 생장 상태[radial growth phase (RGP)] 종양), 절정의 생장상(VGP) 및 전이 종양과 같은 좀더 진행된 흑색종 종양에서는 감소되거나 심지어 없었다. 원발성 사람 포도막 흑색종 세포에 대해 생성된 또 다른 단클론 항체 (MAb 4A3)는 이들 세포에 존재하는 항원을 특이적으로 인지하는 것으로 나타났고, 건강한 개체의 임파세포에 결합은 기본 배경 수준인 것으로 밝혀졌다. 흑색종 조직의 웨스턴 이뮤노블랏팅을 이용하여 이들 항 체에 의해 감지되는 항원은 약 표면 분자량이 55kDa의 이중항(doublet)으로 구성되며, 이는 이 항체가 인지하는 항원은 항-CD63으로 클러스터된 항체가 인지하는 것과 동일하지 않다고 제안되었다. (Damato et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 27(9): 1362-7 (1986)).

CD63는 또한 트롬빈-활성화된 혈소판에 대해 생성된 단클론 항체를 이용하여 사람 혈소판에서 발견되었고, 부분적으로 특징화되었다(MAbs 2.28, 2.19, 5.15, 5dlO). 트롬빈 활성화시에 결합 부위의 수가 증가된 것으로(10배이상) 설명되는 것과 같이 이들 항체들은 활성화-의존성 혈소판 막 53 kDa 당단백질을 감지한다. 경쟁 검사에서, 이들 항체드이 서로 결합을 차단하여, 이들이 동일한 또는 공간적으로 근접한 항원 결정부위를 인지하였다는 것을 시사한다. 혈소판 응집 실험 결과로부터 이들 항체는 바로(per se) 혈소판 응집을 일으키거나 아데노신-이 인산염(ADP), 트롬빈, 콜라겐, 리스토세틴(ristocetin) 및 에피네프린에 의해 유도되는 응집을 간섭하지는 않는 것으로 나타났다. 전자 현미경 데이터에서, 휴지(resting) 혈소판에서 이들 항체들이 리소좀 막에 국소화된 항원을 인지한다는 것을 시사하였다. 면역조직화학적 데이터에서, 이들 항체들은 비장, 림프구, 흉선 및 내피세포의 제한된 부위에 존재하는 항원을 인지하였다는 것을 말해주었다. 또 다른 연구에서, MAb 2.28는 휴지 혈소판, 거핵구(megakaryocyte) 및 내피 세포에 내부 미립(granule) 또한 라벨시켰고, 거핵구와 내피세포에서는 항체가 리소좀 격실의 공지 마커인 효소 카텝신 D에 대한 항체와 함께 국소화되었다. 항체 클러스터링과 발현 클로닝에 대한 후속 연구는 CD63으로써 이 항체에 의해 인지되는 항원 을 동정하게 되었으며, 리소좀 격실에 이의 존재를 확인하였으며, 리소좀 격실에서는 격실-특이적 마커 LAMP-1과 LAMP-2로 함께 국소화되었다. 이 분자의 클로닝으로 항체가 CD63으로 확인되었으며, 테트라스파닌(tetraspanin) 패밀리에 포함이 허용되었다.

CD63의 발현은 상이한 많은 조직 및 세포 타입에서 감지되었다. 세포 수준에서, 혈장막과 연관됨이 밝혀졌고, 세포내 후기 엔도좀 소포 구조와 연관된다는 것이 밝혀졌다. 특정 경구에, 세포 활성화는 CD63의 세포내 축적의 동원에 의해 표면 발현을 증가시켰다. CD63는 B-임파세포, 특히 엔도좀, 표면으로 MHC 클라스 II를 보내는 것에 관계하는 엑소좀, 그리고 신비의 소포(secreted vesicles)에서 MHC 클라스 II와 함께 국소화되고, 물리적으로 연관되는 것으로 밝혀졌다. CD63은 또한 B 임파세포 및 T 임파세포, 호중구, 유방암 및 흑색종 세포을 포함한 다양한 세포 타입에서 다른 테트라스파닌 페밀리 예를 들면, CD9, CD81 , CDl1 (인테그린 쇄 OIM,L,X), CD18 (인테그린 쇄 β2), CD49c (VLA-3 또는 인테그린 쇄 α3), CD49d (인테그린 쇄 α4), CD49f (VLA- 6 또는 인테그린 쇄 α6) 그리고 CD29 (인테그린 쇄 β₁)와 상호작용하는 것으로 밝혀졌다. 비록 CD63이 혈소판 및 과립세포 활성화, MHC 클라스 II-의존성 항원 제공, 인테그린 의존성 세포 흡착 및 이동 그리고 특정 타입의 암에서 종양 발달과 같은 다양한 사건에 관계된 몇 가지 별개 그룹에 의해 처음으로 발견되었지만, 이의 기능이 아직 완전히 밝혀지지는 않았다. 현재 증거로 다양한 세포 생리학적 과정에 역할을 뒷받침하지만 이들 기능이 서로 독립된 것인 지 또는 CD63이 관계한 통상의 세포 기전이 있는 것인지에 대해 아직 분명하지는 않다. 몇몇 그룹들이 CD63과 특정 종양 타입, 특히 흑색종과의 연관성에 대해 조사하였다. 다양한 진행 단계의 종양을 가진 환자들로부터 얻은 암 샘플의 IHC(immunohistochemical) 착색을 위해 Mab ME491에 추가하여 다수의 다른 항-CD63 단클론 항체를 개발하였다. 연구자들의 해석에 따르면, CD63의 발현 감소를 반영하는 착색의 감소는 아마도 종양의 전이 특징과 진행된 발달 연관된다는 것이 관측되었다.

좀더 최근 연구에서 CD63을 포함하는 테트라스파닌 패밀리 몇 개 멤버의 겉보기 발현 수준의 감소(mRNA 정량후)와 몇 가지 유선 암종-유도된 세포주와의 의미있는 상관관계를 설명하였다. 또 다른 연구에서는 에스트로겐 박탈시키는 배양된 유방 암세포에서 분별 디스플레이에 의한 CD63를 확인하였다. 이는 CD63 발현이 스테로이드-호르몬 조절될 수 있으며, 변형된 CD63 풍부함 및/또는 기능이 유방 종양 진행과 연관되었을 것이라는 것을 나타내는 것이다.

대조적으로, 항-CD63 단클론 항체 MAb FC-5.01로의 작업에서 이의 반응성 에피토프는 상이한 정상 조직들에서 가변적으로 발현되었다는 것이 밝혀졌다. 이와 같은 항체가 CD63을 인지하는 것으로 밝혀졌지만, 전이 흑색종을 포함하는 초기 흑색종과 좀더 진행된 흑색종간을 구별하지는 못하였고, 이는 CD63 항원이 좀더 진행된 흑색종에 존재하나 이의 일부 에피토프는 상이한 단계의 종양에 세포에서 감춰져 있을 것이라고 암시하였다. 이는 코어 CD63 폴리펩티드의 해독후 변형된 변형 또는 CD63와 다른 분자의 상호작용 때문인 것으로 보이는데, 이는 항체 인지 및 결 합에 대한 특정 에피토프의 이용성에 영향을 끼질 수 있을 것이다. 이와 같은 결과들은 Si and Hersey, Int J 암 54(l):37-43 (1993)에서 설명하는 관찰을 뒷받침하는데, 항-CD63 MAb NKI-C3으로 착색으로 상이한 진행 단계, 예를 들면 원발, 방사성 생장 상, 수직 생장 상, 전이 흑색종의 단계들에서 조직 단편을 구별하지는 못하였다는 것이다. 다른 연구에서(Adachi el al, J Clin Oncol 16(4): 1397-406 (1998); Huang et al., Am J Pathol 153(3):973-83 (1998)) 유방 및 비-소-세포 폐암으로부터 정량 PCR으 통한 mRNA 분석의해 두 개 테트라스파닌 패밀리 멤버(CD9 및 CD82)에 대해 이들 발현 수분과 종양 진행 및 환자 예후간에 상당한 상관관계가 있고, 이와 같은 상관관계는 CD63에서는 발견되지 않았다(이의 발현은 모든 샘플에서 유사하였다)는 것이 밝혀졌다. 이와 같은 결과로부터, 표면적으로 충돌되는 결과로써, CD63와 암의 연관성을 단정지을 수 있는 강력하고 일관된 데이터는 없다.

현재까지 CD63와 이 분자의 최종 종양 억제 기능간에 연결을 확립하려는 in vivo 연구가 거의 시도되지 않았었다. 이들 연구중에 하나에서, 사람 CD63-과다발현되는 H-ras-형질변환된 NIH-3T3 세포를 흉선이 제거된 생쥐(athymic mice)의 피하 및 복막으로 주사하여, 부모계 비-CD63 과다발현 세포의 거동과 비교하였을 때,종양 크기가 감소되고, 전이 가능성이 감소되었으며 뿐만 아니라 생존 시간이 증가된 것으로 나타나는 것과 같이, 악성/종양 표현형이 감소되었다. 이는 형질변환된 세포에 사람 CD63의 존재가 이들의 악성 거동을 억제할 것이라고 암시하였다. 좀더 최근에, CD63을 발현하고, CD63에 대한 내성을 유도하기 위해 개발된 유전자전이 생쥐 모델을 이용한 연구에서, 백시나아 바이러스에 융합된 사람 CD63로 면역주 사시에, 공동 감염시킨 CD63-MHC 클라스 I(H-2K^b) 공동-전이감염된 뮤린 흑색종 세포주의 종양 생장이 저해될 수 있으며, 생존이 증가되었다고 나타났다. 저자는 치료 효과는 T-임파세포-의존적이며, 내생성 항-CD63 항체는 이와 같은 보호 효과에 관여하지 않는 것으로 보이는데, 그 이유는 종양 생장 저해가 CD63-MHC 클라스 I 공동 전이감염된 세포에서만 일어나며, CD63 만을 전이감염시킨 세포주에서는 일어나지 않기 때문이라고 제안하였다. 이와 같은 해석은 정제된 사람 CD63으로 사전 면역화시키고, 항-사람 CD63 항체가 발생된 것으로 보이는 야생형 동물에서, 종양 세포 생장에 대항하는 보호 효과가 없다는 사실에 의해 뒷받침된다. 처음에는 사람 기원인 것으로 간주했으나, 후에 쥐 계통으로 특징화된 KM3 세포주를 사람 CD63로 전이감염시켜 이를 이용한 Radford et al, Int J 암 62(5):631 -5 (1995)의 작업에서, 무흉선 생쥐의 피부로 투여하였을 때, 다양한 전이감염된 세포주와 감염안된 세포주간에 in vitro 생장에는 유의적인 차이가 없었지만, 부모계 비-전이감염된 MK3 세포를 이용하여 관찰된 것에 대해, 이 단백질의 발현으로 이들 세포의 생장 및 전이 포텐셜이 감소되었다고 제안하였다. 이와 같은 관찰은 종양 세포의 in vivo 및 in vitro 생장 모두에 영향을 주는 것으로 알려진 다른 종양 억제물질 유전자의 잠재 효과와 CD63의 잠재효과가 구별되었다. 또한, in vitro 검사(Radford et al., J Immunol 158(7):3353-8 (1997))에서 무작위 이동성의 감소에 의해 동일 세포상에 기능적 효과를 가지는 것으로 발견된 항-CD63 단클론 항체 ME491를 추가해도 이들의 in vitro 생장 속도에 영향을 주지 못하였다.

이와 같은 연구는 EH한 라미닌, 피브로넥틴, 콜라겐 및 비트로넥틴과 같은 세포외 매트릭스(ECM)-유도된 화학적 유도물질에 반응하여 CD63가 이동을 촉진시키고, 그 효과는 비록 인테그린에 대한 항체가 이와 같은 효과를 차단할 수는 없지만,β₁-타입 인테르린의 기능적 관련에 의해 중개된다는 관찰을 설명하였다. 그러나, 비트로넥틴-중개된 시그날링(인테그린 α_vβ₅에 대한 공지의 리간드)의 역할과 다른 EMC 성분들 예를 들면, CD63 전이감염된 세포상에 피브로넥틴, 라미닌 및 콜라겐 등에 의해 중재된 시그날링의 역할 사이에 상반되는 효과가 있는 것으로 보여졌다. 이는 특정 조건하에, ECM 성분들 존재하에 CD63의 발현이 이동의 감소를 유도하고, 이는 흡착과 이동간에 미세한 균형에 의존한다고 제안되었다. 또 다른 연구에서, 항-CD63 단클론 항체 (MAb 710F)는 PMA-처리된 HL-60 세포의 흡착 및 스프레딩을 강화시켰고, 반면 다른 항-CD63 단클론 항체 (MAb 2.28)는 휴사한 효과를 촉진시켰으나, 세포 군에서 훨씬 작은 부분에만 국한되며, 훨씬 많은 양을 첨가하는 경우에만 나타났다. 이와 같은 결과들로 CD63에 대한 많은 항체들이 개발되었지만, 이들의 기능적 효과들은 상당히 상이하다는 것을 보여주었다.

테트라스파닌는 세포 증식에도 관여할 수 있다. Oren et al. Mol Cell Biol 10(8):4007-l 5 (1990)에서는 뮤린 MAb 5A6의 항-증식성 효과를 설명하였는데, 뮤린 MAb 5A6는 임파종 세포주에서 CD81 (TAPA-1)을 인지한다. 다른 연구에서, 사람 임파세포에 CD37을 항체에 결찰시키면 CD37-유도된 증식을 차단시켰다. 좀더 최근에, CD37 발현이 부족한(CD37 녹아웃) 동물 모델을 이용한 연구에서, 이 동물의 T- 임파세포는 콘카나발린 A 활성화 및 CD3/T 세포 수용체 연결에 반응하여 와일드 타입 동물의 것과 비교하였을 때 과다증식성으로 나타났다. 따라서, 세포 생장 및 증식에서 기능적 역할은 테트라스파닌 패밀리의 공통적인 특징일 것이라고 제안되었었다. 최근 헤파토블라스토마와 간세포 암종 세포의 연구에서, 이들 세포가 항-CD81 단클론 항체에 연결로 Erk/MAP 카이나제 경로의 활성화를 유도한다는 것이 밝혀졌다. 이와 같은 시그날링 경로는 세포 생장 및 증식 사건에 관계 있는 것으로 보여진다. 병행 작업에서, CD81을 과다발현시키는 전이감염된 세포주는 가짜-전이감염된 대조 세포에 대해 상대적으로 증식성이 증가되었다. 따라서, 이용가능한 증거로 일반적으로 테트라스파닌의 역할, 특히 세포 생장 증식과, 세포 흡착/이동성과 연관된 사건에서의 CD63의 역할에 대해 지적하였다. 이들 두 가지 타입의 세포 사건은 종양 진행 및 전이에서 이들 모두 중요한 역할을 하기 때문에 연구의 강력한 표적이 되고 있다.

아미노산 서열 결정 및 분석에서 테트라스파닌과 다른 단백질 패밀리의 상동성이 밝혀지지는 않았고 또는 임의 기존의 특징화된 기능적 모듈로도 기존의 공지된 효소적 활성에 대한 암시가 없었다. 그 결과, 시그날 변환 경로의 조절(modulation)에서 이와 같은 패밀리 단백질의 역할을 연구하는 것이 매우 어려웠다. 그러나, 세포 생리를 변화시키는 그리고 시그날 변환 경로의 조절에 직접적으로 연관되는 테트라스파닌-특이적 시약을 이용하여 얻은 증거로 테트라스파닌은 시그날 변환 성질을 가진다고 제시되었다. CD63은 물리적 그리고 기능적으로 2차 메신져 시그날의 생성에 관여하는 효소들인 다수의 분자들과 연합되거나 또는 이와 같은 효소와 물리적 또는 기능적으로 연관된 것으로 보인다. 염증 반응의 초기 단계중에 하나인 사람 호중구와 내피 세포의 상호작용을 조절하는 기전을 분석하기 위해 고안된 실험에서 호중구를 몇 가지 항-CD63 단클론 항체(AHN-16, AHN-16.1, AHN-16.2, AHN-16.3, AHN-16-5)로 선처리하면 배양된 내피 세포 층에 이들의 흡착이 촉진되었던 것으로 밝혀졌다. 또한, 이와 같은 효과는 많은 세포내 시그날링 경로의 조절물질로 공지된 칼슘이온(Ca^{2 +})의 존재에 상당히 의존적이고, 자극 항체에 세포가 노출되는 특정 시기에 제한적이었다. 항체에 장기 노출후에, 내피 세포에 호중구의 흡착이 Ca^{2 +}의 추후 추가에 대해 무감각해지고, 따라서, 이는 역동적이고 일시적으로 조절된(일과성) 사건임을 나타낸다. 또한, CD63는 CDl1/CD18 단백질 복합체와 물리적으로 상호작용하고, 이 복합체에 특이적으로 표적하는 물질이 조절 시그날을 중개하는 것으로 밝혀졌다. 이와 같은 연구에서, 효소 티로신 키나제 Lck 및 Hck를 포함하는 복합체 또는 이의 일부에 물리적으로 연합된 것으로 밝혀졌다. 이들 효소들은 특정 표면 수용체의 활성화시에 세포 조절 시그날의 중재에 중추적인 역할을 하고, 세포 특이적 물리적 변화를 결과하는 시그날링 경로의 카스케이드의 일부가 되는 단백질류의 멤버이다. 또 다른 연구에서 테트라스파닌(CD63을 포함)이 단클론 항체에 공동-결찰되면, 콜라겐 기질에 MDA-MB-231 유방암 세포의 흡착에 의해 유도되는 효소 병소 흡착 키나제(FAK)의 활성화 또는 포스포릴화를 강화하는 것으로 제안하였다. 이는 인테그린-중개된 티로신 키나제 시그날링 경로의 조절에 CD63( 및 다른 테트라스파닌 페밀리 멤버)의 직접적인 관련을 말하는 것이다. 항-CD63 단클론 항체 MAb 710F에 의해 표면 CD63의 존재와 결찰과 기능적으로 교차할 수 있는 시그날링 경로들은 세포내 시그날링 경로의 또 다른 공지된 조절물질인 효소 단백질 키나제 C(PKC)에 의한 포스포릴화 조절에 의존적인 것으로 보인다. 여기에서 MAb 710F에 의한 골수 세포주 HL-60에서 형태학적 변화와 흡착의 강화는 PKC의 일시적 연관이 최종적으로 설명되지는 않았지만 포르볼 미리스테이트 아세테이트(PMA)로 세포의 전-처리에 의존적이었다. 그러나, 별개 집단에 의한 후반 작업에서, PMA-유도된 HL-60 분화는 PKC-활성 의존적이었는데, 그 이유는 이 효소의 특정 저해물질인 분자 Ro31 - 8220가 PMA의 효과를 차단하였기 때문이다.

CD63과 다른 테트라스파닌 패밀리 멤버들이 시그날 변환 경로와의 연합한다는 것을 지원하는 추가 증거들이 CD63(그리고 CD53) 분자와 티로신 포스파타제 화성사이에 초분자 복합체의 일부로써 또는 직접적으로 물리적 연합을 설명하는 작업에서 나왔다. 이 연구에서, 항-CD63 항체로 분리된 면역침전 복합체는 비록 티로신 포스파타제 CD45와 연합된 것으로 나타난 CD53과는 달리 티로신 포스파타제 활성과 연관된 것으로 보였고, CD63-연관된 포스파타제를 동정하는 것은 불가능하였다. 좀더 최근에 테트라스파닌 패밀리의 몇 가지 멤버들이 타입 II 포스파티딜 이노시톨 4-키나제(type II PI 4-K) (Berditchevski et al., J Biol Chem 272(5):2595-8 (1997))와 연관된 것으로 밝혀졌다. 이와 같은 상호작용은 매우 특이적인 것으로 보이는데, 그 이유는 CD9, CD63, CD81, CDl 51 및 A15/TALLA에 대해서만 동정되었고, CD37, CD52, CD82, 또는 NAG-2으로는 발생된 것이 관찰되지 않았기 때문이다. 또한, 테트라스파닌 패밀리 멤버와 PI-4K의 연합은 상호 배타적인데, 그 이유는 각 PI-4 키나제-포함 복합체가 단일 테트라스파닌 패밀리 멤버에 제한되기 때문이다. 특히, 다른 테트라스파닌 멤버들과 형성되는 것과는 달리, 지질 raft-유사 도메인에서 세포내 격실에서 CD63-PI-4 키나제 복합체들이 거의 발견되었다. 이와 같은 관찰은 PI-4 키나제와 상호작용하는 것으로 밝혀진 CD63 분취물이 2차 메신져 분자로써의 기능에 추가하여(Martin Annu. Rev. 세포. Dev Biol 14:231 -64 (1998)), 막 trafficking(엔도사이토시스 및 엑소사이토시스)의 조절 그리고 세포 골격 재조직화에 완련된 것으로 알려진 포스포이노시티드 생합성 경로에 관련되거나 이에 의존하는 특정 세포내 과정(Claas et al., J Biol Chem 276(1 1 ):7974-84 (2001))이라고 제안되었다.

시그날링 경로의 조절에서 CD63이 직접적으로 연관된 것으로 지금까지 밝혀진 모든 효소의 직접적이고 중요한 관련으로 시그날 변환 경로의 조절에 조절물질로써 또는 이들 효소들의 활성으로부터 하류 효과 분자로써 CD63의 연합됨을 지원하는 추가 증거들이 제공되었다.

종양 진행을 유도하는 기전을 밝히는 것은 매우 어렵고, 표면적으로 상충되는 관찰들에 의해 흔히 복합 거동이 되어, 이와 같은 관찰들이 효과적 요법으로 성공적으로 옮겨지는 경우는 매우 드물다. 종양 진행과 전이와 CD63의 연관성 및 시그날 변환 기전과의 CD63의 연관성에 대해 현재 알려진 것으로, 이의 기능이 종양 세포에서 변화될 가능성이 있다.

인지된 항원들을 발현시키는 세포에 결합하여, 종양 세포에 세포독성 효과를 가지는, 그리고 이 자체로 또는 다른 분자와 연합하여 세포 및 in vivo 생리적 활 성을 보유하는 항원-특이적 시약, 이들 시약들이 정상 세포 군에는 심각한 유해한 효과없이 종양 세포 생장, 진행 및 전이를 저해하게 되는 시약의 개발은 잠재적 치료요법제로 그리고 진단 도구로 상당히 유익할 것이다. 최근에 새로운 데이터에서 정상 세포 생리 조절에 CD63의 중요한 작용 모드를 지적하여, 이들이 변형되었을 때 암을 포함하는 병인 상태하에서 세포의 거동에 중요한 영향을 줄 수 있을 것으로 지적되었다.

유방암 세포에서 CD63의 내화를 일으키는 것으로 공지된 MAb 항체 Fc-5.01를 이용하여 사람 수지상 세포(DCs)에서 CD63의 표면 발현 수준 및 내화를 결정하였다(Mantezazza et al, Blood 104(4): 1 183-90 (2004)). CD63은 세포 표면 및 세포내에서 엔도좀 및 리소좀 마커와 함께 공동 국소화를 통하여 모두 국소화되는 것으로 밝혀졌다. 고유 항체와 이의 Fab 단편들은 CD63의 내화를 유도할 수 있었다. 동시에, Fc-5.01에 의해 촉진된 내화로 몇 가지 인테그린 분자들, CD11b, CD 18, CD29 및 α5의 표면 발현의 감소를 결과하나 β3 또는 HLA-II 분자의 표면 발현 감소가 되지는 않았다. 케모탁시스 검사 결과에서, 이들 항체 및 테트라스파닌 패밀리 단백질의 다른 멤버들을 인지하는 다른 항체는 화학적 유인물질을 향하여 막 장벽을 가고질러 이동되는 세포들의 수를 증가시켰다. 이들 세포(미숙 DCs)에서, β1,3-글리칸 수용체에 의해 중개되는 이스트 식작용(yeast 식균작용)는 세포 표면 CD63의 수준을 감소시켰으나, 테트라스파닌 CD9, CD81, CD82, 또는 HLA-II 분자의 수준 감소는 수반하지 않았다. 한편, 대식세포 만노스 수용체(MMR)에 의해 중개된 덱스트란-FITC에 의해 유도되는 내화반응(internalization)으로 CD63의 표면 발현 또는 CD9, CD81 , CD82, HLA-I 및 HLA-II 분자의 표면 발현의 감소를 결과하지는 않았다. 따라서, CD63는 특정 수용체와 연관되며, 일부의 경우에 β1,3-글리칸 수용체 덱틴-1으로, 그리고 내화 과정에 참여하는 것으로 보인다. 몇 가지 인테그린 분자의 표면 발현이 항체-유도된 CD63의 내화시에 감소된다는 사실은 이와 같은CD63-의존성 사건이 세포 표면 수용체 조성물에 상당한 효과를 가지며 따라서, DC 이동 검사에 효과로 설명되는 것과 같이 이들 세포 집단의 생리에도 영향을 준다는 것을 시사한다.

또 다른 연구에서, 막 타입-1 메탈로프로테나제(MT1-MMP)의 내화반응은 CD63에 의해 영향을 받은 것으로 밝혀졌다. 이 연구에서 FLAG-테그된 MTl-MMP이 내화되어 확산 세포질 분포를 얻고, 이는 세포 표면 수준의 감소가 수반되었다. 공지의 리소좀 프로테아제 저해물질인 클로로퀸의 첨가로 이와 같은 세포 표면 MT1-MMP의 내화-의존성 사라짐이 부분적으로 저해되었고, 동시에 MT1-MMP가 CD63 포지티브 내부 과립형 구조와 연합된 상태로 유지되는 방식으로 내화-의존성 세포질 분포가 동시에 변경되었다. 세포를 MT1-MMP와 CD63으로 공동 전이감염시키면 이와 같은 메탈로프로테아제의 세포 표면 수준이 감소되나 전체적인 MMP 활성과는 무관한데 이는 이들 분자의 저해물질인 BB94가 이와 같은 감소에 어떠한 영향도 주지 않기 때문이나, 크로로퀸은 영향을 준다. 이와 같은 관찰로, CD63 발현 증가는 MT1-MMP의 턴오버/내화/분해를 가속화시킬 수 있다는 것으로 암시되었다. MT1-MMP의 증가된 내화/분해는 MT1-MMP와 CD63의 직접적인 상호작용에 의존하였다. 이와 같은 타입의 기능은 기존의 관찰들, 즉, CD63가 어뎁터 단백질 AP-2 및 AP-3의 μ2와 μ3와 직접적 으로 상호작용하고, 엔도좀 및 리소좀으로의 단백질 소팅에 관여한다는 관찰에 의해 추가 뒷받침되었다. MT1-MMP의 세포질 꼬리가 이 분자의 내화에 중요하며, 이는 침투-촉진 활성의 조절에 중요한 역할을 한다는 것이 이미 밝혀져 있었다. MTl -MMP는 또한 악성 종양 세포들의 침투에 중요한 역할을 하는 것으로 간주된다. 따라서, 이의 전반적 수준의 조절은 CD63와 연합한 상호작용 및 내화에 따라 달라질 가능성이 있다.

최근의 공개 문헌(Xu et al, Embo J23(4):81 1-22 (2004))에서 망막 퇴행에 관련된 것으로 보이는 초파리(Drosophila) 눈에 많은 유전자에 대한 유전자 스크린에서 다수의 유전자들이 동정되었는데, 이중 테트라스파닌-유사 분자 즉, 'sunglasses' ('sun')가 동정되었다. 가장 밀접하게 관련된 포유류 단백질이 테트라스파닌 CD63이다. CD63와 유사하게, 'sun'은 면역전자현미경으로 관찰하였을 때, 리소좀에 농후한 것으로 밝혀졌다. 이 작업의 결과로부터, 다른 G-단백질 결합된 수용체의 전형적인 아레스틴(arrestin) 중개된 기전과는 무관하게, 'sun' 이 Rh1 시그날링의 정상 하향 조절에 관여한다는 것이다. 추가로, 'sun'은 활성화된 Rh1의 일상 턴오버에 중요할 뿐만 아니라, 이 과정에 아마도 의존적인 것으로 보이는 라도머(rhabdomer) 구조에는 상당한 영향을 주어, 돌연변이 파리에서 급격한 sww-의존적 망막 퇴행을 결과한다. 데이터로 단백질의 정상적인 삽입(trafficking) 의존성 턴오버에서 이와 같은 동족체 포유류 CD63와 발현/기능에서의 비정상성이 생리적 비정상을 결과한다는 것을 암시한다.

수용체 내화반응에서 CD63의 역할에 대한 또 다른 공개문헌에서는 이들 두 가지 분자로 공동 전이감염된 COS 세포에스 테트라스파닌과 위 이온 펌프 H, K-ATPase의 β 소단위의 공동-국소화에 대해 설명하였다. 이 연구에서 또한 H,K-ATPase β 소단위는 CD63 발현 의존성 내화의 강화 및 리소좀-유사 세포질 과립 구조로의 내화를 실행하는 것으로 밝혀졌다.

상기에서 설명하는 작업으로부터 얻은 모든 데이터에서 CD63가 내화 및 리소좀-의존성 분해에 참여하여, 정상 세포의 생리 조절에 참여함으로써, 세포 표면 분자들의 정상적인 턴오버에 관계한다는 것이 제안되었었다. 따라서, CD63의 기능 조절이 특정 분자의 또는 분자 군의 활성에 의존적인 과정을 조절하는 중요한 도구가 될 수 있으며, 이때 문자의 표면 발현 또는 기능이 암과 같은 병인 상태에서 비정상적 거동에 기여하거나 변경된 것들이다. 최근까지, 종양 세포의 in vitro 및 in vivo 생장 특징에 영향을 주고, 종양 생장의 동물 모델 생존에 영향을 가지는, CD63를 발현시키는 세포를 특정하게 표적하는 항-CD63 항체 또는 다른 물질이 보고된 적이 없었다. 공개된 미국 특허 출원 10/810,751에서는 사람 암세포에 대항하여 in vitro 및 in vivo 효과를 설명하는 이와 같은 두 가지 항-CD63 항체에 대해 설명하였다.

암 치료법으로써 단클론 항체: 암이 있는 각 개체는 독특하며, 개인의 성향에 따라 다른 암과는 구별되는 암을 가진다. 이와 같은 사실에도 불구하고, 현재 요법은 동일 단계에 동일 타입의 암을 가진 모든 환자를 동일한 방법으로 처리한다. 이들 환자의 최소 30%는 제1차 요법에서 실패할 것이고, 추가 처리 과정을 받아야 하며, 치료 실패, 전이 및 극단적으로 사망하게 되는 가능성이 증가된다. 처 리에 우위적인 방법은 특정 개인에 대해 치료법을 맞추는 것일 것이다. 환자에 맞춤이 되는 유일한 현재 치료는 외과술이다. 화학요법 및 방사능 요법은 환자에 맞출 수 없고, 외과술 자체도 대부분의 경우 치료에 부적합하다.

단클론 항체의 도입으로, 환자에 맞춤 요법을 위한 방법 개발 가능성이 좀더현실적으로 되었는데, 그 이유는 각 항체가 단일 에피토프로 향하기 때문이다. 또한, 특정 개인의 종양을 독특하게 규정하는 에피토프 무리로 향하는 항체 복합물을 만드는 것도 가능하다.

암과 정상세포간에 유의적인 차이는 암세포에는 형질변환된 세포에 특이적인 항원이 포함되어 있다는 것을 인지하면, 과학단체들은 이들 암 항원에 특이적으로 결합함으로써 형질변환된 세포만을 특이적으로 표적하는 단클론 항체를 고안할 수 있어, 단클론 항체가 암 세포를 제거하는 “기적의 탄환”으로 기능을 할 수 있을 것이라고 믿음을 가지고 있었다. 그러나, 모든 암의 경우에 하나의 단클론 항체가 작용할 수 없으며, 한 종류로 단클론 항체가 표적화된 암 치료에 이용될 수 있을 것이라고 널리 인식되고 있다. 본 발명에 따른 분리된 단클론 항체은 암 질환 과정을 환자에게 유익한 방법, 예를 들면, 종양 유해물질을 감소시키는 방향으로 변형시키는 것으로 보였는데, 이는 암질환 변경 항체 (CDMAB) 또는 "항-암" 항체라고 다양하게 불릴 수 있을 것이다. 현재, 암 환자가 선택할 수 있는 치료는 몇 가지 되지 않는다. 암 치료법에 조직화된 방법이 세계적으로 생존 및 사망률에 개선을 가져왔다. 그러나, 특정 개인에게 이와 같은 개선된 통계학적 수치가 이들의 개인 상태에 개선과 반드시 연관되지는 않는다.

따라서, 의사가 동일한 집단에서 다른 환자와는 독립되는 각 종양을 치료할 수 있는 방법이 있다면, 이는 한 개인에 맞는 맞춤 치료의 독특한 방법을 허용하는 것이 될 수 있을 것이다. 이상적으로, 이와 같은 과정의 치료는 치유률을 증가시키고, 더 나은 결과를 만들고, 오랫동안 절실히 필요한 것을 만족시킬 것이다.

역사적으로, 다클론 항체를 이용한 사람 암 치료에서 제한된 성공을 보여주었다. 임파종 및 백혈병은 사람 혈장으로 치료하였으나 연장된 완화 또는 반응은 드물었다. 또한, 재생성이 부족하였고, 화학요법과 비교하여 추가적인 이익도 없었다. 충실성 종양 예를 들면, 유방암, 흑색종, 및 신장 세포 암종은 사람 혈액, 침팬지 혈청, 사람 혈장, 말 혈청으로 치료하였으나 예측불가하며 효과적인 결과는 없었다.

충실성 종양에 대한 단클론 항체를 이용한 많은 임상적 시도가 있었다. 1980년대에 사람 유방암에 대한 최소 4가지 임상 시도가 있었는데, 조직 선택성에 근거한 또는 특이적 항원에 대한 항체를 이용하여 최소 47명의 환자중에 한명만이 반응하였다. 1998년까지 시스플라틴과 복합한 인화 항-Her2/neu 항체(Herceptin)를 이용한 성공적인 시도이외에는 없었다. 이와 같은 임상 시도에서, 37명의 환자에서 반응을 평가하였는데, 약 1/4이 부분적인 반응을 보였고, 추가 1/4이 미미한 또는 안정적인 질환 진행을 보였다. 반응자에서 진행으로의 중앙 값은 8.4개월이며, 중앙 반응기간은 5.3월이다.

Herceptin은 Taxol과 복합하여 제1 라인에 사용이 1998년에 승인받았다. 임상 연구 결과에서 Taxol만을 제공받은 군(3.0 months)과 비교하였을 때, 항체 요법 과 Taxol을 함께 받은 환자군에서 질병 진행으로의 중앙 값(6.9 months)이 증가되었다는 것을 알 수 있다. 중간 생존에서 약간의 증가도 있었다; Herceptin+ Taxol치료는 22개월이며 Taxol단독 치료는 18개월이었다. 또한, Taxol단독과 비교하였을 때 항체+ Taxol복합 군에서 환전한 반응군(8:2%)과 부분적 반응군(34%:15%)으로 두 경우 모두 증가되었다. 그러나, Herceptin+ Taxol로의 처리는 Taxol만으로 처리한 것과 비교하였을 때, 심독성 발생 경우가 훨씬 높았다(13%:1%). 또한, Herceptin요법은 공지된 기능 또는 생물학적으로 중요한 리간드에 대해 알려지지 않고; 전이 유방암을 가진 환자의 약 25%에 있는 수용체인 사람 상피 생장 인자 수용체 2 (Her2/neu)를 과다발현하는(IHC 분석을 통하여 측정된) 환자들에게만 효과가 있었다. 따라서, 유방암 환자에게는 여전히 채워지지 않은 요구가 있다. Herceptin치료로 효과를 얻은 환자들 조차도 여전히 화학요법이 필요하면, 결국 치료의 부작용을 어느 정도 다룰 필요가 있을 것이다.

직장암을 연구하는 임상 시도는 당단백질 및 글리코리피드 표적에 대한 항체와 관련된다. 선암종에 특이성을 가지는 17-1 A와 같은 항체는 60명 이상의 환자에서 Phase 2 임상 시험을 하였는데, 1명만 부분적인 반응을 보였다. 사이클로포스파미드를 이용하는 다른 시험에서, 52명의 환자중에서 17-1 A를 이용한 결과 1명이 완전한 반응을 그리고 2명의 미미한 반응을 보였다. 현재까지 17-1의 Phase III 임상 시험에서 단계 III 결장 암에 어쥬번트 요법으로 개선된 효과를 설명하지는 못하였다. 이미징으로 초기 승인받은 뮤린 인화 단클론 항체를 이용하였을 때 종양 진행이 일어나지는 않았다. 최근에야 단클론 항체를 이용한 결장암 임상 연구에서 임의 포지티드한 결과를 얻었다. 2004년에 ERBITUX가 이리노테칸(irinotecan)계 화학요법에 내화성있는 EGFR 발현 전이 결장암 환자에 제2 라인 치료제로 승인받았다. two-arm Phase II 임상 연구 및 single arm 연구 결과에서, 이리노테칸과 복합하여 ERBITUX처리하면, 질환 진행으로의 중앙 시간이 각각 4.1 및 6.5개월이며, 반응률이 23%와 15%인 것으로 나타났다. 동일한 two-arm Phase II 임상 연구 및 또 다른 single arm 연구 결과에서, ERBITUX만으로 처리한 결과, 반응률이 각 11%와 9%이고, 질병 진행으로의 중앙 시간이 각각 1.5개월과 4.2개월이었다. 스위스와 미국에서, 이리노테칸과 복합한 ERBITUX치료, 미국에서 ERBITUX단독 치료는 제1 이리노테칸 요법에 실폐한 결장암 환자의 제2라인 치료로 승인받았다. 따라서, Herceptin와 같이, 스위스에서 치료는 단클론 항체와 화학요법의 복합으로만 승인된다. 또한, 스위스와 미국 모두에서 치료는 제2라인 요법으로만 환자에 사용을 승인받았다. 2004년에 AVASTIN은 전이 결장암 치료의 제1라인 치료로 정맥내 5-플루오르우라실 계 화학요법과 복합하여 사용하는 경우에 승인받았다. Phase III 임상 결과에서 AVASTIN+ 5-플루오르우라실로 치료를 받은 환자의 중앙 생존이 5-플루오르우라실만으로 치료받은 환자보다 더 연장되었다(각 20개월과 16개월). 그러나, Herceptin및 ERB1TUX와 유사하게, 단클론 항체와 화학요법을 복합하여 사용하는 경우의 치료만 승인된다.

폐, 뇌, 난소, 췌장, 전립선 및 위암에서는 여전히 나쁜 결과가 지속되었다. 비-소세포 폐암에 대한 가장 최근의 유망한 결과는 Phase II 임상 시험에서 나왔는데, 치료는 화학요법제 TAXOTERE와 복합한 세포-치사 약물 독소루비신에 콘쥬게이 트된 단클론 항체 (SGN-15; dox-BR96, 항-Sialyl-LeX)와 관계한다. TAXOTERE는 폐암의 제2라인 치료용 화학요법에만 FDA 승인받았다. 초기 데이터에서 TAXOTERE단독과 비교하였을 때 전반적으로 생존이 개선되었다. 연구를 위해 모집한 62명의 환자에서 2/3은 TAXOTERE와 복합하여 SGN-15를 투여받았고, 나머지 1.3은 TAXOTERE만을 투여받았다. TAXOTERE와 복합하여 SGN-15를 투여받은 환자에서, 전반적인 생존의 중앙 값은 7.3개월이고, TAXOTERE만을 투여받은 환자의 경우는 5.9개월이었다. 1년과 18개월에서 전반적인 생존은 TAXOTERE와 복합하여 SGN-15를 투여받은 환자에서 29%와 18%이며, TAXOTERE만을 제공받은 환자에서는 24%와 8%였다. 추가 임상 시험도 계획한다.

선임상적으로, 흑색종에 단클론 항체의 이용으로 일부 제한된 성공이 있었다. 이들 항체중 매우 소수만 임상 시험을 하였고, 데이터에서 Phase III 임상 시험에 양호한 결과 또는 승인된 것은 없었다.

질환 병인에 명백하게 기여하는 30,000 알려진 유전자 산물중에 관련 표적의 동정이 부족하여 질환을 치료하기 위한 새로운 약물의 개발이 방해를 받는다. 종양학 연구에서, 종양 세포에서 과다발현되는 사실로만 잠재적인 약물 표적으로 단순히 선택된다. 따라서 확인된 표적을 다중 화합물과의 상호작용에 대해 스크리닝한다. 잠재적 항체 요법의 경우에 이와 같은 후보 화합물은 주로 Kohler and Milstein (1975, Nature, 256, 495-497, Kohler and Milstein)에 의해 산출된 기분 원칙에 따라 통상의 단클론 항체 생성으로부터 유도된다. 비장 세포는 항원(예를 들면, 온전한 세포, 세포 분취물, 정제된 항원)으로 면역화된 생쥐로부터 수득하 고, 불사화된 하이브리도마 파트너와 융합시킨다. 생성된 하이브리도마를 표적에 가장 활달하게 결합하는 항체의 분비에 대해 스크리닝하고 선별한다. Herceptin^R 및 RITUXIMAB을 포함하는 암세포에 대한 많은 치료 및 진단 항체가 이와 같은 방법에 의해 만들어졌고, 이들의 친화성에 근거하여 선택되었다. 이 전략에 단접은 두 부분이다. 첫째는 진단 또는 치료 항체 결합을 위한 적절한 표적의 선택이 조직 특이적 암 발생 과정의 지식 부족 및 이들 표적의 동정에 의한 과다 발현에 의한 선택과 같은 결과적으로 간단한 방법에 의해 제한된다. 둘째는 최대 친화력으로 수용체에 결합하는 약물 분자가 시그날을 개시하거나 저해하는 최대 가능성을 가질 것이라는 가정이 항상 맞는 것이 아니라는 것이다.

유방 및 결장 암 치료의 일부 진전에도 불고하고, 단일 물질로던 또는 공동 치료로던 효과적인 항체 요법의 확인 및 개발이 모든 타입의 암에 부적절하다는 것이었다.

선행 특허:

U.S. 특허 No. 5,296,348에서는 내화되는 암 세포 표면 항원에 특이적인 단클론 항체를 선별하는 방법 및 세포 대사에 항-전사 및/또는 항-복제 효과를 가지는 단클론 항체를 확인하는 방법에 대해 설명한다. 예를 들면, ME491 항체는 W9, WM35, WM983 흑색종 세포, 그리고 SW948 결장 암종 세포에서 내화되는 것으로 보였다. 또한, ME491 항체는 SW948 세포에서 전사 및 세포 증식을 감소시키는 것으로 보였다. 특허 출원 US2003021 1498A1 (그리고 이의 관련 출원: WO0175177A3, WO0175177A2, AU0153140A5)은 CD63 항원을 포함하는 군에서 선택된 난소 종양 마커 유전자에 의해 인코드되는 난소 종양 마커 폴리펩티드에 결합하는 항체로 난소 종양 또는 전이를 저해하는 방법을 설명한다. 난소 암을 이용한 유전자 바현의 일련 분석을 실시하여 후보물질로 CD63를 동정하게 되는 난소 종양 마커 유전자를 확인하였다. 특허 출원 WO02055551A1 ( 및 이와 연관된 출원 CN 1364803 A)에서는 새로운 폴리펩티드-사람 CD63 항원 56.87를 주장하였다. 특허 출원 CN1326962A에서는 새로운 폴리펩티드-사람 CD63 항원 14.63를 주장하였다. 특허 출원 CN1326951A에서는 새로운 폴리펩티드-사람 CD63 항원 15.07를 주장하였다. 특허 출원 CN 1351054A에서는 새로운 폴리펩티드-사람 CD63 항원 11.11을 주장하였다. 이들 특허 및 특허 출원에서 CD63 항원 및 항체를 확인하였으나 본원 발명의 분리된 단클론 항체 또는 본원 발명의 분리된 단클론 항체의 유용성에 대해서는 설명하지 못하였다.

ME491 폴리펩티드 항원을 인코드하는 유전자를 클론하였고, 서열은 1988년 2월 24일에 공개를 위해 제공받았다(Can Res 48:2955, 1988, June 1 ); CD63을 인코드하는 유전자가 크론되었고, 서열은 1991년 2월에 공개되었고(JBC 266(5):3239-3245, 1991), CD63와 ME491의 동정을 명백하게 설명하였다.

WO2004041 170.89 (Sequence ID No.: 89, 우선권 출원일: 29-JUN- 2004), WO2003068268-A2 (Sequence ID No.: 1 , 우선권 출원일: 13-FEB-2003(2003WO-EPOO 1461 ); 다른 우선권 주장일: 14-FEB-2002(2002GB-00003480)), WO2003057160-A29 (Sequence ID No.: 40, 우선권 출원일: 30-DEC-2002(2002WO- US041798); 다른 우선권 주장일: 02-JAN-2002(2002US-0345444P))에서 모두 CD63에 100% 서열 상동성을 가지는 폴리펩티드를 주장한다.

WO2003016475-A2 (Sequence ID No.: 9787&12101, 우선권 출원일: 14-AUG-2002 (2002WO-US025765); 다른 우선권 주장일: 14-AUG-2001 (2001US- 0312147P)에서는 CD63으로 구성된 238개 아미노산에서 237개 아미노산과 100% 서열 상동성을 가지는 폴리펩티드를 주장한다.

WO2003070902-A2 (Sequence ID No.:27, 우선권 출원일: 18-FEB-2003(2003WO-US004902); 다른 우선권 주장일: 20-FEB-2002 (2002US-0358279P))에서는 CD63으로 구성된 238개 아미노산에서 224개 아미노산과 94% 서열 상동성을 가지는 폴리펩티드를 주장한다.

EP1033401 -A2 (Sequence ID No.: 4168&4913, 우선권 출원일: 21 - FEB-2000 (2000EP-00200610); 다른 우선권 주장일: 26-FEB- 1999 (99US-0122487P))에서는 CD63으로 구성된 238개 아미노산에서 205개 아미노산과 그리고 94개 아미노산과 각 100% 서열 상동성을 가지는 폴리펩티드를 주장한다.

WO200257303-A2 (Shigella ospG#26에 대한 사람 prey 단백질, 우선권 출원일: 1l-JAN-2002 (2002WO-EP000777); 다른 우선권 주장일: 12-JAN-2001 (2001US-0261 130P))에서는 CD63으로 구성된 238개 아미노산에서 103개 아미노산과 100% 서열 상동성을 가지는 폴리펩티드를 주장한다.

WO200055180-A2 (Sequence ID No.: 756, 우선권 출원일: 08-MAR- 2000(2000 WO-US005918); 다른 우선권 주장일: 12-MAR-1999 (99US-0124270P))에서는 CD63으로 구성된 238개 아미노산에서 127개 아미노산과 99% 서열 상동성을 가지는 폴리펩티 드를 주장한다.

WO200200677-A1 (Sequence ID No.:3203, 우선권 출원일: 07-JUN- 2001 (2001 WO-USO 18569); 다른 우선권 주장일: 07-JUN-2000 (2000US-0209467P))에서는 CD63으로 구성된 238개 아미노산에서 132개 아미노산과 97% 서열 상동성을 가지는 폴리펩티드를 주장한다.

WO9966027-A1 (사람 CD63 단백질로부터 거대 세포외 루프 서열, 우선권 출원일: 15-JUN-1999 (99WO-US013480); 다른 우선권 주장일: 15- JUN-1998(98US-0089226P)에서는 CD63으로 구성된 238개 아미노산에서 99개 아미노산과 100% 서열 상동성을 가지는 폴리펩티드를 주장한다.

WO200270539-A2 (Sequence ID No.: 1207, 우선권 출원일: 05-MAR- 2002 (2002WO-US005095); 다른 우선권 주장일: 05-MAR-2001 (2001 US-00799451))에서는 CD63으로 구성된 238개 아미노산에서 102개 아미노산과 86% 서열 상동성을 가지는 폴리펩티드를 주장한다.

EP 1033401 -A2 (Sequence ID No.: 4169, 21 -FEB-2000(2000EP- 00200610); 다른 우선권 주장일: 26-FEB- 1999(99US-0122487P)에서는 CD63으로 구성된 238개 아미노산에서 74개 아미노산과 100% 서열 상동성을 가지는 폴리펩티드를 주장한다.

이들 특허출원들은 CD63 항원에 다양한 서열 상동성을 가지는 폴리펩티드를 동정하였다. 대부분의 경우, 이들 출원은 이 폴리펩티드 및 이의 동사체에 상응하는 항체 및 항체 유도체를 주장하였으나, 본 발명의 분리된 단클론 항체 및 단클론 항체의 사람 폐, 전립선, 결장 및 다른 사람 암에 대해 유용성에 대해서는 설명하지 못하였다. 중요한 것은 상기 모든 출원이 CD63을 인코드하는 폴리펩티드의 서열 공개후에 출원된 것들이었다.

발명의 요약

이 출원은 U.S. 6,180,357에서 설명한 것과 같이, 암질환 변경 단클론 항체를 인코드하는 하이브리도마 세포주를 분리하기 위한 환자 특이적 항암 항체를 만드는 방법을 이용한다. 이들 항체는 하나의 종양에 특이적이며, 암 치료의 환자 맞춤이 가능하다. 이 출원 내용 범위안에서, 세포-치사(세포독성) 또는 세포-생장 저해(세포정균) 성질을 가지는 항-암 세포를 세포 독성이라고 한다. 이들 항체는 암의 단계 결정, 진단에 도움이 될 수 있으며, 종양 전이 치료에 이용될 수도 있다. 이들 항체를 이용하여 예방 치료방법으로 암을 예방할 수도 있다. 통상적인 약물 개발 파라다임에 따라 생성된 항체와는 달리, 이와 같은 방법으로 만들어진 항체는 종양 조직의 생장 및/생존에 필요한 것으로 기존에 보이지 않았던 분자 및 경로를 표적으로 할 수도 있다. 또한, 이들 항체의 결합 친화력은 더 강력한 친화력 상호작용을 수용하지 않을 수 있는 세포독성 과정의 개시를 위한 요구에 적합하다. 또한, 본 발명의 범위내에 본 발명의 CDMAB와 방사선 핵종과 같은 표준 화학요법 모달리티를 콘쥬게이트 하는 것이 속하여, 이와 같은 화학치료법의 이용도 포함된다. CDMAB를 독소, 세포독성 모이어티, 효소 가령, 바이오틴 콘쥬게이트된 효소 또는 조혈 세포에 콘쥬게이트하여, 항체 콘쥬게이트를 만들 수도 있다.

개인 맞춤화된 항암 치료 전망으로 환자를 관리하는 방식으로 변화를 가져올 것이다. 있음직한 임상 시나리오는 종양 샘플을 프리젠테이션 시점에서 구하여 은행에 보관한다. 이 샘플에서, 기존의 암질환 변경 항체 패널로부터 종양의 종류를 타입핑할 수 있을 것이다. 환자를 편리하게 연출될 수 있을 것이고, 이용가능한 항체는 환자의 추가 연출을 위해 이용될 것이다. 환자는 즉시 기존 항체로 치료를 받을 것이며, 종양에 특이적 항체 패널은 여기에서 제시하는 방법 또는 여기에서 설명하는 스크리닝 방법과 파아지 디스플레이 라이브러리를 이용하여 만들 수 있을 것이다. 다른 종양들은 치료되는 종양과 동일한 에피토프의 일부를 가지고 있을 가능성이 있기 때문에 생성된 모든 항체를 항-암 항체의 라이브러리에 추가할 수 있을 것이다. 이와 같은 방법에 따라 생산된 항체는 이들 항체에 결합하는 암을 가지는 임의의 환자에서 암 질환 치료에 유용할 수 있을 것이다.

항-암 항체에 추가하여, 환자는 치료의 다중-형태 계획의 일부로 현재 추천되는 치료법을 수용하는가를 선택할 수 있다. 현재 방법을 통하여 분리된 항체는 비-암세포에 상대적으로 비독성이라는 사실이 이용될 수 있는 높은 약량에서 항체 단독 또는 통상의 치료법과 병행하는 것을 허용한다. 높은 치료 지수는 치료 저항 세포의 출현 가능성을 감소시켜야 하는 단시간 규모에서 재-치료를 허용할 수도 있다.

환자가 치료의 초기 과정을 감당할 수 없거나 또는 전이가 발생되면, 종양에 특이적 항체를 발생시키는 과정을 재-치료를 위해 반복시킬 수 있다. 또한, 항-암 항체를 한자로부터 수득한 적혈구 세포와 콘쥬게이트 시키고, 전이 치료를 위해 재-주입시킬 수 있다. 전이 암에 효과적인 치료는 거의 없고, 전이는 통상 나쁜 결과 를 의미하고, 결국 사망에 이른다. 그러나, 전이 암은 통상 혈관조직이 잘 발달되어, 적혈구 세포에 의한 항-암 항체의 운반이 종양 부위에 항체를 집중시키는 효과를 가질 것이다. 전이 전에, 대부분의 암 세포는 세포 생존을 위해 숙주의 혈액 공급에 의존하여, 적혈구 세포에 콘쥬게이트된 항-암 항체는 종양에 효과적일 수 있다. 또는 항체를 다른 조혈성 세포 예를 들면, 임파세포, 대식세포, 단세포, NK 세포 등에 콘쥬게이트할 수도 있을 것이다.

다섯가지 항체 종류가 있으며, 이 각각은 중쇄에 기능이 부여되어 있다. 일반적으로 네이키드 항체에 의한 암 세포 치사는 항체 의존성 세포의 세포독성 또는 컴플리먼트(complement) 의존성 세포독성을 통하여 중개되는 것으로 보고 있다. 예를 들면, 뮤린 IgM 및 IgG2a는 컴플리먼트 시스템의 C-1 성분의 결합으로, 컴플리번트 활성화의 고유 경로를 활성화시켜, 종양 분해를 유도함으로써 사람 컴플리먼트를 활성화시킬 수 있다. 사람 항체의 경우, 가장 효과적인 컴플리먼트 활성화 항체는 일반적으로 IgM 과 IgGl 이다. 뮤린 항체 IgG2a 및 IgG3 이소타입은 Fc 수용체를 가지고 있어, 단세포, 대식세포, 과랍세포 및 일부 임파세포에 의한 세포 치사를 유도할 수 있는 세포 독성 세포를 모집하는데 효과가 있다. 사람 항체의 IgGl 및 IgG3 이소타입은 ADCC 중개한다. 항체 중개된 암 치사의 또 다른 가망 기전은 세포막 및 이에 연합된 당단백질 또는 글리코리피드에 있는 다양한 화학 결합의 가수분해를 촉매하는 기능을 가진, 소위, 촉매 항체를 이용하여 이루어 질 수 있을 것이다.

항체-중개된 암 세포 치사에는 추가 세가지 기전이 있다. 첫째는 백신으로 항체를 이용하여 암 세포에 있는 가망 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 것이다. 둘째는 항체를 성장 수용체를 표적화시키고, 이들의 기능을 간섭하거나 또는 수용체를 하향 조절하여 기능을 효과적으로 상실하는데 이용하는 것이다. 셋째는 이와 같은 항체의 효과를 세포 표면 모이어티의 직접 결찰에 투어 세포 사망을 직접적으로 유도하는데, 죽음 수용체 예를 들면, TRAIL Rl 또는 TRAIL R2, 또는 인테그린 분자 예를 들면, 알파 V 베타 3 및 이와 유사한 수용체의 결찰로 세포 사망을 유도하는 것이다.

암 약물의 임상적 유용성은 환자에게 수용가능한 위험 프로파일하에 약물의 잇점에 근거하는 것이다. 암 치료에서, 생존이 일반적으로 찾는 최종 목표가 되어 왔지만, 생명 연장에 추가하여 다른 잘 인식되어온 장점들이 있다. 치료가 생존에 부작용을 주지 않는 경우 다른 잇점들로는 증상 완화, 부작용으로부터 보호, 재발시간까지의 연장 또는 질환없는 생존, 그리고 진행까지의 시간 연장 등이 포함된다. 이와 같은 기준은 일반적으로 수용되는 것이며, 미국 FDA와 같은 규제 단체는 이와 같은 장점을 가지는 약물들을 승인한다(Hirschfeld et al. Critical Reviews in Oncology/Hematolgy 42: 137-143 2002). 이와 같은 기준에 추가하여 이와 같은 형태의 장점을 예지할 수 있는 다른 결과변수도 있다는 것은 인지되고 있는 것들이다. 일부, 미국 FDA에 의해 신속한 승인 과정은 환자의 장점을 예측할 수 있는 대리(surrogate)가 있다는 것을 인지한다. 2003년 말에, 이 과정으로 승인된 약물이 16가지 인데, 이들중 4가지가 완전한 승인을 받았고, 후속 연구에서 대리결과변수(surrogate endpoint)에 의해 예상된 바와 같이 직접적인 환자 장점들을 설명하 였다. 충실성 종양에서 약물 효과를 결정하는 한 가지 중요한 결과변수는 치료에 반응을 측정함으로써 종양 적하(tumor burden)를 평가하는 것이다(Therasse et al. Journal of the National cancer Institute 92(3):205-216 2000). 이와 같은 평가의 임상 기준 (RECIST criteria)은 암에서 국제적인 전문가 집단인 Solid Tumors Working Group에서의 Response Evaluation Criteria에 의해 발표되었다. RECIST 기준에 따른 객관적인 반응으로 볼 수 있는 것과 같이 종양 적하에 설명된 효과를 가지는 약물은 적절한 대조군과 비교하였을 때 궁극적으로 환자에 직접적인 잇점을 만든다. 전임상(pre-clinical) 세팅에서, 종양 적하는 일반적으로 평가하고 서류화하는데 더 간단하다. 이와 같은 전임상에서, 연구는 임상 세팅으로 해석될 수 있으며, 전임상 모델에서 생존 연장을 초래하는 약물이 최대 기대되는 임상 유용성을 가진다. 임상 처리에 포지티브 반응을 만드는 유사체, 전임상 세팅에서 종양 적하를 감소시키는 약물이 질환에 의미있는 직접적인 영향을 줄 것이다. 생존 연장이 암 약물 치료로부터 얻은 임상 결과에 최종 목표가 되겠지만, 임상 유용성을 가지는 다른 장점들도 있고, 종양 부하 감소는 질환 진행에서 지연과 관계있을 수 있으며, 이는 직접적 잇점과 임상적 효과로 이어질 수도 있다(Eckhardt et al. Developmental Therapeutics: Successes and Failures of Clinical Trial Designs of Targeted Compounds; ASCO Educational Book, 39th Annual Meeting, 2003, pages 209-219).

US 6,180,357의 공정을 실질적으로 이용하고, U.S.특허 7,009,040에서 설명하고 있는 것과 같이(이들 각 내용은 참고문헌으로 첨부됨), 생쥐 단클론 항체 7BD-33-11A는 환자의 유방 종양 생검으로부터 얻은 세포로 생쥐를 면역화시켜 얻었다. 7BD-33-11A 항원은 상이한 기원의 조직으로부터 방대한 사람 세포주의 세포 표면에서 발현된다. 유방 암 세포주 MCF-7과 전립선 암 세포주 PC-3는 시험관에서 7BD-33-11A의 세포 독성 효과에 민감하였다.

배양물에서 유방 및 전립선 암 세포에 대한 7BD-33-11A 세포 독성은 생체에서 이들 암 징후에 대한 이의 항암 활성으로 추가 확장되었다 (미국 특허7,009,040, S.N. 10/603,006 및 S.N. 10/810,751에서 설명됨).

7BD-33-11A은 사람 유방암의 생체 모델에서 MB-231 예방에서 종양 생장 및 종양 부하를 저해하였다. 처리후 30일간 모니터링을 지속하였다. 7BD-33-11A으로 처리된 생쥐에서는 종양이 발생되지 않았으며, 7BD-33-11A 처리군의 87.5%는 전이후 9개월이상 생존하였다(생쥐들 중에 하나는 종양과 무관한 원인으로 죽었다). 거꾸로 말하면, 이소타입 대조군은 72일(치료후 23일)에 100% 사망하였다. 따라서, 7BD-33-11A는 유방암 모델에서 생존을 강화시키고, 종양 생장을 저해하였다(따라서, 질병 진행이 지연됨).

7BD-33-11A는 또한 사람 유방암의 생체 모델에서 종양 생장을 상당히 억제시키고, 종양 부하를 감소시켰다. 80일경에 (처리후 23일), 7BD-33-11A으로 처리된 생쥐에서는 이소타입 대조군과 비교하였을 때 종양 용적이 83% 낮아졌다(p=0.001). 항체 효과를 측정하는 수단으로 생존을 이용하여, 7BD-33-11A 처리군에서 사망 위험은 처리후 60일까지 이소타입 대조 군의 약 16%(p=0.0006)이었다. 이소타입 대조군의 100%가 처리후 50일에 사망하였다. 이 데이터에서, 7BD-33-11A 처리는 대조군 처리 군과 비교하였을 때 생존 잇점을 부여하고 종양 부하를 감소시켰다.

7BD-33-11A 처리는 체중 감소 및 임상적 스트레스를 포함하는 임의 세포독성 징후를 유도하지 않기 때문에 안전한 것으로 보였다. 따라서, 7BD-33-11A 및 1 A245.6 처리는 사람 유방암의 잘 확립된 모델에서 대조 처리군과 비교하였을 때 종양 생장을 지연시키고, 생존을 강화시켰기 때문에 효과가 있었다. 2004년 3월 26일 출원된 계류 출원 S.N. 10/810,751에서 설명된 바와 같이(이의 내용은 참고문헌으로 첨부됨), 화학요법 약물(시스플라틴) 치료 단독으로 또는 복합한 치료와 비교하였을 때 7BD-33-11A의 효과를 두 가지 상이하게 확립된 유방암 이종이식 모델에서 결정하였다.

MB-231 모델에서, 83일째에 (처리후 20일), 7BD-33-11A 처리로 완충액 대조 처리된 동물에 대해 종양 생장이 83% 감소되었다 (p=0.002). 시스플라틴 단독 처리로 대조군에 비해 종양 크기가 77% 감소되었고, 7BD-33-11A와 복합하여 시스플라틴으로 처리한 경우 대조군에 비해 종양 크기가 88% 감소되는 결과를 얻었다(p=0.006).

MDA-MB-468 (MB-468) 모델에서, 62일 째에(처리후 12일), 7BD-33-11A와 시스플라틴 치료를 복합하였을 때, 종양 생장의 최대 감소(97 percent, p=0.001)가 관찰되었다. 시스플라틴 단독으로 치료하면 완충액 대조군과 비교하였을 때 종양 생장이 95% 감소되었고, 7BD-33-11A 단독으로 치료하였을 경우에 약 37%(p=0.046) 감소가 관찰되었다.

MB-231 및 MB-468 모델에서, 7BD-33-11A으로 치료하면 체중을 측정하였을 경 우, 시스플라틴으로의 치료에 비교하여 동물이 편안하도록 유도하였다. 이와 같은 결과는 MB-231 모델에서 7BD-33-11A 치료가 시스플라틴 단독 치료와 비교하였을 때 더 큰 효과를 가지며, 두 가지 유방암 모델에서 시스플라틴 보다는 체중 감소와 같은 부작용에 더 나은 내성을 가졌다.

다양한 약량에서 7BD-33-11A의 효과를 결정하기 위해, 예방 유방암 이종이식 모델(S.N. 10/810,751에서 설명하고 있음)에서 약량 반응 실험을 실행하였다. 55일째에(처리후 5일째), 0.2 mg/kg 처리군은 이소타입 대조군 처리에 비해 약 85%의 종양 생장이 감소되었다. 또한 55일째에, 2mg/kg 및 20 mg/kg 처리군에서는 아직 종양이 발생되지 않았다. 125일에(처리후 75일)에 유사한 결과를 얻었는데, 20 mg/kg 처리군에서는 아직 종양이 발생하지 않았고, 2 mg/kg 처리군에서는 일부 초기 종양 생장이 있었다. 7BD-33-11A 처리는 생존 잇점을 증거하였다. 이소타입 대조군에 모든 생쥐는 104일(처리후 54일)까지 죽었으나, 0.2 mg/kg 7BD-33-11A 처리군은 197일(처리후 147일)까지 생존하였다. 2.0mg/kg 및 20 mg/kg 처리군에서 더 큰 생존 잇점이 관찰되었다; 2.0 mg/kg 처리군의 50%만이 290일(처리후 240일)에 사망하였고, 20 mg/kg 처리군에서는 290일까지 어느 것도 죽지 않았다. 따라서, 7BD-33-11A 처리는 종양 생장의 상당한 감소 및 세 가지 모든 약량에서 생존이 증가되었고, 최대 약량에서 최대 효과가 나타났다.

유방암의 생체 종양 모델에서 유익한 효과에 추가하여, 7BD-33-11A 처리는 생체 전립선 암 모델(S.N. 10/603,006 및 S.N.10/810,751에서 설명됨, 이의 내용은 참고문헌으로 첨부됨)에서 PC-3 세포에 대해 항종양 효과를 가졌다. 7BD-33-11A 및 1A245.6 처리는 이소타입 대조군 항체보다 치료 기간 직후에 종양 생장을 얻제하는데 상당히 더 효과적이었다(각각 p=0.001 및 0.017) 치료 기간 종료시에 7BD-33-11A을 제공받은 생쥐에서는 이소타입 대조군의 약 31%에 상응하는 수준으로 자란 종양을 가졌다.

PC-3 SCID 이종이식편 모델에서, 체중은 질병 진행의 대행 지표로써 이용되었다. 52일째에, 7BD-33-11A 처리는 이소타입 대조군과 비교하였을 때 체중 감소를 상당히 저해시켰다(p=0.002). 처리후 생존에 대해 생쥐를 모니터하였다. 처리후 11일 째에, 이소타입과 완충액 대조군 생쥐는 100% 치사율에 이르렀다. 역으로, 7BD-33-11A는 치료후 38일째에 100% 치사율에 이르렀고, 이는 대조군보다 3배 긴 시간이다. 따라서, 사람 전립선 암 모델에서 7BD-33-11A 처리는 이소타입 처리된 대조군과 비교하였을 때, 종양 생장 지연, 체종 감소 예방 및 생존을 연장시키는데 효과적이었다.

전립선 암 생체 모델 예방에 추가하여, 7BD-33-11A는 생체 종양 모델에서 PC-3에 대해서 항암 활성을 증명하였다(계류 출원 S.N. 10/603,006, June 23, 2003, 및 S.N. 10/810,751, 이의 내용은 참고문헌으로 첨부됨). 7BD-33-11A 치료를 이소타입 대조군과 다시 비교하였다. 처리 직후 7BD-33-11A 처리군은 이소타입 대조군에 비해 종양 용적이 상당히 작았다(p<0.024). 7BD-33-11A 처리로 이소타입 대조군과 비교하여 36% 종양 억제를 중재하였다. 유방 및 전립선 암 생체 모델에 유익한 효과에 추가하여, 7BD-33-11A 처리군은 췌장 암 생체 모델에서 BxPC-3 세포에 대해서는 항-종양 활성을 가졌다(S.N. 11/321 ,624에서 설명). 7BD-33-11A 처리 는 완충액 대조군보다 처리 직후에 종양 생장 억제에 훨씬 효과적이다(71 percent, p=0.0009). 또한, 7BD-33-11A 처리는 완충액 대조군에 비교하여 생존 잇점을 부여한다. 7BD-33-11A 처리군에서 생쥐의 40%는 완충액 대조군 생쥐가 모두 죽은 2주 이상까지도 생존하였다.

유방, 전립선 및 췌장 암의 종양 생체 모델에서 유익한 효과에 추가하여, 7BD-33-11A 처리는 두 가지 별개 흑색종 종양 모델에서 예방에 대해 A2058 및 A375 세포에 대해 항-종양 활성을 가졌다(S.N. 11/321 ,624에서 설명). A2058 및 A375 모델에서, 7BD-33-11A 처리는 완충액 대조군보다 종양 생장 억제에 훨씬 효과적이다(각각 72%, p=0.011 및 63%, p=0.0006). 흑색종 및 유방, 췌장 암 모델에서 7BD-33-11A의 항-종양 활성은 매력적인 항암 치료제가 된다.

사람 흑색종 생체 예방 모델에서 설명된 유익한 효과에 추가하여, 7BD-33-11A 처리는 두 가지 별개의 생체 흑색종 암 모델에서 A2058 및 A375 세포에 대해 항-종양 활성을 가졌다(2005년 12월 29일날 출원된 S.N. 11/321 ,624,에서 설명됨). A2058 및 A375 모델에서 7BD-33-11A 처리 및 7BD-33-11A과 다카르바진 처리에서 종양 생장이 상당히 저해되었다. A2058 모델에서, 평균 종양 용적이 대조군의 30.87%(p<.0443)였다. A375 모델에서, 7BD-33-11 A/다카르바진 복합 처리군에서는 평균 TTE (time-to-endpoint)이 39.1일로 결과되며, 이는 종양 생장에서 147%의 상당한 지연에 상응한다(p < 0.01 ). 이들 모델 어느 것에서도 독성으로 인한 사망은 관찰되지 않았다. 따라서, 7BD-33-11A 처리는 사람 암의 유방 및 흑색종 생체 모델의 치료에 안전한 효과를 가지는 것으로 보였다.

생체에서 7BD-33-11A에 의해 설명되는 효과가 ADCC 활성의 전부 또는 일부에 의한 것인지를 결정하기 위해, NOD SCID 및 SCID 생쥐(S.N. 11/321,624에서 설명됨)의 종양 모델에서 MB-231 세포에 대해 7BD-33-11A의 항-종양 활성을 측정하였다. NOD SCID 생쥐는 NK(natural killer) 세포에 기능적 결함이 있고, 순환하는 컴플리먼트가 부족하며, 기능적으로 완성된 대식세포 군을 가지며, SCID 생쥐는 컴플리먼트 및 왕성한 NK 세포 활성을 모두 가진다. 7BD-33-11A는 뮤린 IgG2a 단클론 항체이고, 따라서 생체에서 ADCC 활성을 가진다. 7BD-33-11A의 항-종양 활성은 완충액 대조 및 이소타입에 근거하여 ADCC를 통하여 활성을 나타내지 않는 뮤린 IgG1 단클론 항체인 H460-22-2과 비교하였다. 54일에(최종 처리후 4일), SCID 처리군에서, 7BD-33-11A 및 H460-22-1 처리된 생쥐는 완충액 처리된 대조군의 평균 종양 용적의 단지 1.9%와 3.6%dml 종양을 발달시켰다. 역으로 말하면, NOD SCID 처리된 군에서 54일에(처리후 4일), 7BD-33-11A 처리된 생쥐는 완충액 처리된 대조군의 평균 종양 용적의 67%인 종양 생장이 있었다. H460-22-1 처리된 생쥐는 SCID 생쥐와 유사한 효과를 나타내었다; 종양 생장은 완충액 처리된 대조군의 평균 종양 용적의 1.4%였다. 결과적으로 생체에서 7BD-33-11A의 활성은 일부 ADCC 활성으로 인한 것으로 보이며, H460-22-1의 항-종양 활성은 ADCC와는 무관한 것으로 보인다.

약물 표적으로 7BD-33-11A 에피토프를 실증하기 위해, 보통의 사람 조직에서 표적 항원의 발현을 결정하였다. S.N. 10/603,006 및 S.N. 10/810,751에서 설명된 것과 같이(각 문헌의 내용은 참고문헌으로 첨부됨),정상 사람 조직에 대한 7BD-33- 11A의 결합을 결정하였다. IHC 착색에 의해 신장, 심장, 폐와 같은 주요 기관을 포함하여 조직의 대부분은 7BD-33-11A 항원 발현을 실패하였다. 7BD-33-11A 는 타액선, 간, 체장, 위, 전립선, 십이지장에는 착색되었고, 편도선은 강하게 착색되었다. 조직 착색 결과로 7BD-33-11A는 다양한 세포 형에 제한된 결합을 보였고, 침윤성 대식세포, 임파세포 및 섬유아세포에도 결합하였다. 7BD-33-11A는 막과 세포직 착색 패턴을 나타내었다. S.N. 10/810,751에서 설명하는 것과 같이(이의 내용은 참고문헌으로 첨부함), 7BD-33-11A를 시판되는 항-CD63 항체(RF AC4 및 H5C6)와 비교하였다. 정상 사람 조직 착색 결과로부터, 7BD-33-11A는 다양한 세포 타입에 제한된 결합을 보였고, 침윤성 대식세포, 임파세포 및 섬유아세포에도 결합하였다. RFAC4 및 H5C6 항체들도 서로 비교하였을 때 유사한 착색 패턴을 나타내었다. 그러나, RFAC4 및 H5C6의 착색 패턴은 7BD-33-11A에서 관찰된 것과는 상당히 달랐다. 특히, RFAC4 및 H5C6 항체는 더 넓은 범위의 정상 조직에 결합하고, 조직에서의 착색 강도도 더 높았고, 7BD-33-11A은 포지티브이며, 침윤성 대식세포, 임파세포 및 섬유아세포 뿐만 아니라 조직의 대부분에 상피에도 결합하였다.

유방암 환자 가운데 집단에서의 7BD-33-11A 항원의 국소화 및 이의 보급에 대한 결정은 이 항체의 치료학적 용도 및 효과적인 임상 시험을 고안하는데 중요하다. 암 환자의 유방 종양에서 7BD-33-11A 항원 발현을 제기하기 위해, 98명의 개별 유방암 환자의 종양 조직 샘플에서 7BD-33-11A 항원의 발현에 대해 스크리닝하였다(환자 50명의 결과는 S.N. 10/603,006 및 S.N. 10/810,751에서 설명하며, 이의 내용은 참고문헌으로 첨부함).

이 연구 결과에서 조직 샘플의 37%는 7BD-33-11A 항원에 대해 포지티브하게 착색되었음을 확인하였다. 환자 샘플에서 7BD-33-11A의 발현은 착색이 악성 세포에 국한되기 때문에 암 세포에 특이적인 것으로 보인다. 또한, 7BD-33-11A는 유방 암 환자의 정상 조직 샘플 20개중 어느 것도 착색시키지 않았다. 7BD-33-11A 항원의 유방 종양 발현은 종양 세포의 세포 막과 세포질에 국소화된 것으로 보이며, 이는 CD63가 치료를 위한 매력적인 표적임을 말하는 것이다.

S.N. 10/810,751에서 설명하는 것과 같이(이의 내용은 참고문헌으로 첨부함), 7BD-33-11A 는 RFAC4 및 H5C6와 그리고 항-Her2 항체(c-erbB-2)와 비교하였다. 현재 연구의 결과는 기존 결과와 유사하여, 종양 조직 샘플의 36%가 7BD-33-11A 항원에 대해 포지티브 착색되었고, 유방 종양 조직의 94% 및 85%가 H5C6 및 RFAC4에 대해 포지티브 착색되었다. 착색이 종양 세포에 한정되기 때문에, 환자 샘플내에 7BD-33-11A의 발현은 종양 세포 특이적인 것으로 보인다. 또한, 7BD-33-11A는 유방암 환자의 정상 조직의 10개 샘플중 어느 것도 착색시키지 않은 반면에, H5C6 및 RFAC4는 정상 유방 조직의 8개 샘플에 7개를 착색시켰다. c-erbB-2와는 대조적으로, 7BD-33-11A는 완전하게 상이한 착색 프로파일을 나타내는데, 7BD-33-11A 항원에 포지티브한 유방 암 조직 샘플의 절반이 Her2 발현에 대해서는 네가티브였고, 이는 7BD-33-11A이 기존 항체 요법에 의해 제공되지 못하는 환자군을 표적한다는 것을 말한다. 7BD-33-11A 및 Her 2에 포지티브한 유방 암 조직 섹션간에도 착색 강도의 차이가 있었다. c-erbB-2 항체는 정상 유방 조직 단편중 하나를 포지티브하게 착색시켰다.

S.N. 10/603,006, S.N. 10/810,751 및 S.N. 11/321,624에서 설명하는 것과 같이, 이의 내용은 참고문헌으로 첨부함, 7BD-33-11A 발현을 유방 종양의 발달, 치료 및 예후에 중요한 역할을 하는 호르몬 에스트로겐 및 프로게스테론에 대한 수용체의 유방 종양 발현에 근거하여 평가하였다. 에스트로겐 수용체의 부재와 프로게스테론 수용체의 존재, 그리고 7BD-33-11A의 발현간에 약간의 상관관계가 있었다. 종양을 이들의 단계 또는 종양의 진행 정도로 분석하였을 때, 결과에서 7BD-33-11A에 대해 종양 단계가 높으면 포지티브 발현이 더 큰 경향이 있었다. RFAC4으로 유사한 결과를 얻었다. H5C6는 에스트로겐 또는 프로게스테론 수용체 발현과 매우 약한 관계가 있었으나, 종양 단계와는 관련이 없어, 이는 매우 작은 샘플 크기로 인해 제한되었다.

전립선 암 환자에서 7BD-33-11A 항원의 국소화와 이의 분포는 전립선 암 환자에 7BD-33-11A 면역 요법의 잇점을 평가하고, 효과적인 임상 시험을 고안하는데 중요하다. 암 환자로부터 전립선 종양에서 7BD-33-11A 항원 발현을 제기하기 위해 51명의 개별 전립선 암 환자로부터 종양 조직 샘플에서 7BD-33-11A 항원의 발현을 스크리닝하였다(S.N. 10/810,751에서 설명함, 이의 내용은 참고문헌으로 첨부됨). 연구 결과에서 조직 샘플의 88%가 7BD-33-11A 항원에대해 포지티브하게 착색되었다. 7BD-33-11A가 높은 강도로 정상 조직 단편을 착색하였지만, 정상 샘플과 비교하여 종양 조직 샘플에서 더 높은 강도의 막 착색이 있었다. 7BD-33-11A에 대해 착색하지 않은 배아 횡문근육종(rhabdomyosarcroma)이 있었다. 테스트된 작은 샘플 크기에서, 종양 단계와 7BD-33-11A 항원 존재에 대해 직접적인 관계가 있는 것으로 보이지는 않았다.

흑색종 암 환자에서 7BD-33-11A 항원의 국소화와 이의 퍼짐은 흑색종 암환자에 7BD-33-11A 면역 요법의 잇점을 평가하고, 효과적인 임상 시도를 고안하는데 중요하다. 암 환자로부터 흑색종 종양에서 7BD-33-11A 항원 발현을 제기하기 위해, 39명의 흑색종 환자에서 종양 조직 샘플을 7BD-33-11A 종양의 발현에 대해 스크리닝하였다(S.N. 11/321,624에서 설명함). 연구 결과에서 조직 샘플의 90%는 7BD-33-11A 항원에 대해 포지티브 착색하였다. 이와 같은 작은 샘플에서, 종양 단계와 7BD-33-11A 항원 존재간에 직접적인 상관관계는 없는 것으로 보였다.

7BD-33-11A의 잠재적인 치료 잇점을 추가 확장시키기 위해, 다양한 종양 조직내에 항원의 빈도와 국소화를 결정하였다(S.N. 10/603,006, S.N. 10/810,751 그리고 S.N. 11 /321,624, 이의 내용은 참고문헌으로 첨부함). 유방암 및 전립선 암에 추가하여 몇 가지 암 타입이 7BD-33-11A 항원을 발현시켰다. 포지티브 사람 암 타입에는 피부(1/2), 폐(3/4), 간(2/3), 위(4/5), 갑상선 (2/2), 자궁(4/4) 그리고 신장(3/3)이 포함된다. 일부 암에서는 이 항원이 발현되지 않았다; 여기에는 난소(0/3),고환(0/1), 뇌(0/2) 및 임파구(0/2)가 포함된다. 사람의 유방 암 조직, 전립선 암 조직 및 흑색종 암 조직에서와 같이, 7BD-33-11A의 국소화는 이들 종양 타세포의 막과 세포질 모두에서 일어났다. 따라서, 시험관내 암 세포주에 7BD-33-11A 항체 결합에 추가하여, 항원이 사람의 다양한 타입의 암에서 발현된다는 증거가 있다. S.N. 10/810,751에서 설명된 것과 같이(이의 내용은 참고문헌으로 첨부됨), 생화학적 뎅이타는 7BD-33-11A에 의해 인지되는 항원이 CD63이라는 것을 말한 다. 이는 단클론 항체 RFAC4(CD63에 반응성인)가 면역침전에 의해 7BD-33-11A에 결합된 단백질들을 확인한다는 것을 보여준 연구로 뒷받침된다. 또한, 세균적 발현 연구에서 7BD-33-11A는 CD63의 세포외 루프에 결합된다고 밝혀졌다. 7BD-33-11A 에피토프는 또한 형태학적으로 의존적인 것으로 구별된다. 이들 IHC 및 생화학적 결과에서 7BD-33-11A가 CD63 항원에 결합한다는 것을 설명한다. 따라서, 다수의 증거로 7BD-33-11A는 CD63에 존재하는 독특한 형태의 에피토프의 결찰을 통하여 항-종양 효과를 중재한다는 것을 보여준다. 본 발명의 목적을 위해, 이와 같은 에피토프를 하이브리도마 세포주 7BD-33-11A, 이의 항원성 결합 단편 또는 이의 항체 콘쥬게이트에 의해 인코드되는 단클론 항체에 결합하는 능력으로 특징화되는 “CD63 항원성 모이어티”로 정의한다.

전체로써, 이 데이터는 7BD-33-11A 항원이 암 연관 항원이며, 사람에서 발현되고 이는 병리학적으로 관련된 암 표적이라는 것을 설명한다. 추가로, 이 데이터는 사람 암 조직에 7BD-33-11A 항체의 결합을 설명하고, 이는 진단, 치료의 예측 또는 예후가 될 수 있는 검사에 적절하게 이용될 수 있다. 또한, 이 항원의 세포 막 국소화는 대부분의 비-악성 세포에서 항원의 상대적으로 드물게 발현되는 것으로 인하에 세포의 암 상태의 지표가 되며, 이와 같은 관측은 이 항원, 이 유전자 또는 유도체, 또는 이의 단백질 또는 변이체를 진단, 요법의 예측 또는 예후가 되는 검사에 다양하게 이용하는 것을 허용한다.

본 발명은 또한 7BD-33-11A의 발달 및 미국 특허 US 6,180,357에서 설명하는 과정에 의해 발생된 7BD-33-11A의 용도에 대해 설명하고, 세포 독성 검사, 동물 모 델에서 종양 생장, 그리고 암 질환으로 고통받은 환자의 생존 시간의 연장에 이의 효과를 확인하였다.

본 발명은 암 치료 분야에 발전을 나타내는데, 이 발명에서는 표적 분자, CD63상에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하고, 정상 세포가 아닌 악성 간 종양 세포에 대해서는 in vitro 항-전이 성질을 가지고, 사람 간암의 in vivo 모델에서 종양 생장의 저해, 전이 및 생존의 연장을 직접적으로 중개하는 물질을 설명한다. 여기에서 설명하는 여러 증거들은 7BD-33-11A가 간암에서 발현되는 CD63에 존재하는 에피토프의 결찰을 통하여 항-암 효과를 중재한다는 것을 설명하고, 이는 간세포로부터 발생되는 임의 원발성 또는 전이성 종양 부위가 포함된다는 것을 인지할 것이다. 이 출원에서는 간 암 환자에서, CD63 발현이 전반적인 환자의 생존과 역 관계에 있다는 것을 설명한다. 또한 원발성 사람 간 암 조직 샘플 및 세포주와 비교하여 전이성 간암 조직 샘플과 세포주에서 CD63의 더 높은 수준 발현이 관찰되었다. 본 발명은 또한 7BD-33-11A가 in vitro에서 CD63⁺ 사람 간암 세포의 생장, 이동, 침윤을 감소시키고, 종양 부하를 감소시키고, in vivo 사람 간암의 전이 가능성을 감소시킨다고 설명한다. 이는 어떤 것도 유사한 성질을 가지지 않는 것으로 나타났기 때문에 항-CD63 항체를 설명하는 임의 기존의 것에 대해 발전된 것이다. 또한 명백하게 CD63이 특정 타입의 종양 생장 및 발달과 직접적인 연관을 분명하게 설명하기 때문에 이 분야에서 진전을 제공한다. 또한, 환자에서 유사한 항-암 성질을 나타내는 가능성을 가지고 있기 때문에 암 치료에 발전도 의미한다. 항-암 항체 라이브러리에서 이들 항체들의 포함은 종양의 표적화 및 종양의 생장 및 발달을 저해시키는데 가장 효과적인 것을 발견하기 위해, 상이한 항-암 항체의 적절한 복합으로 결정되는 상이한 항원 마커를 발현시키는 종양의 표적화 가능성을 강화시시키는데 큰 진전이 있다.

이 모두에서, 본 발명은 치료요법제의 표적으로 7BD-33-11A 항원의 이용에 대해 설명하는데, 투여하였을 때 종양 부하를 감소시키고, 포유류에서 항원 발현시키는 암의 전이 가능성을 감소시키고, 그리고 처리된 포유류의 생존을 연장시킬 수 있을 것이다.

따라서, 본 발명의 목적은 하이브리도마 세포주를 분리하고, 이에 상응하는 하이브리도마 세포주에 의해 인코드된 단클론 항체 및 이의 항원 결합 단편의 분리를 위해, 특정 개체에서 유도된 암 세포 또는 특정 암 세포주 하나 이상에 대해 생성된 암 질환 변화 항체(CDMAB)를 생산하는 방법을 이용하는 것이고, 이때 CDMAB는 암 세포에 대해서는 세포독성이며, 비-암 세포에 대해서는 상대적으로 비-독성이다.

본 발명의 추가 목적은 암 질환 변환 항체, 리간드, CDMAB 및 이의 항원 결합 단편을 교수하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 항체의 세포 독성이 항체 의존성 세포 독성을 통하여 중개되는 암질환 변경 항체를 생산하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 항체의 세포 독성이 컴플리먼트 의존성 세포 독성을 통하여 중개되는 암질환 변경 항체를 생산하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 항체의 세포독성이 세포 화학 결합의 가수분해를 촉매하는 이들의 능력이 되는 암질환 변경 항체를 생산하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 암의 진단, 예후, 모니터링을 위한 결합 검사에 유용한 암질환 변경 항체 및 CDMAB를 생산하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 장점들은 여기에서 제시하는 다음의 설명, 실시예 및 특정 구체예를 통하여 명백하게 나타날 것이다.

특허 또는 출원 파일에는 컬러로 된 최소 한가지 도면이 포함된다. 컬러 도면이 있는 특허 또는 특허 출원 공개의 사본은 필요시 비용 지불후 오피스에서 제공할 수 있다.

도 1은 사람 간 종양 및 정상 조직 마이크로어래이에서 7BD-33-11A의 결합을 요약한 것이다.

도 2는 7BD-33-11A으로 수득한 간 종양 조직에서 결합 패턴을 나타내는 대표적인 현미경 사진이다: 간 세포 암종(A) 에 7BD-33-11A으로 수득된 간 종양 조직상의 결합 패턴 또는 간세포 암종(C) 상에 이소타입 대조 항체로 수득된 간 종양 조직상의 결합 패턴 또는 전이성 담관암종(C) 상에 7BD-33-11A으로 수득된 간 종양 조직상의 결합 패턴 또는 전이성 담관암종(C) 상에 이소타입 대조 항체의 결합 패턴을 나타낸 것이다. 7BD-33-11A는 종양 세포들에서 강력한 포지티브 착색을 나타내었다. 확대 200X.

도 3은 원발성 HCC와 이와 매취되는 전이 종양 60쌍을 포함하는 조직 마이크 로어래이상에 CD63와 HCC 전이간에 상관관계를 설명한다.

도 4는 간세포 암종(HCC) 조직의 마이크로어래이에서 CD63의 발현을 나타낸다.

도 5는 HCC에서 CD63 과다 발현의 임상적 의미를 설명한다.

도 6은 HCC 환자에서 CD63의 과다 발현과 임상병리적 특징적 상관관계를 나타낸다.

도 7은 다양한 HCC 세포주에서 CD63의 과다발현과 전이 가능성간에 상관관계를 설명한다.

도 8은 Hep3B HCC 세포주에서 CD63의 in vitro 기능적 역할을 설명한다.

도 9는 MHCC 97H HCC 세포주상에 7BD-33-11A의 in vitro 효과를 설명한다.

도 10은 확립된 정위(orthotopic) HCC 종양 모델에서 HCC 종양 생장에서 7BD-33-11A의 효과를 설명한다. 데이터는 평균 +/- SEM으로 나타낸다.

도 11은 확립된 정상 HCC 종양 모델에서 간 내부 및 폐 전이에서 7BD-33-11A의 효과를 설명한다. 데이터는 평균 +/- SEM으로 나타낸다.

도 12는 확립된 전이 HCC 종양 모델에서 HCC 전이에 7BD-33-11A의 효과를 설명한다. 데이터는 평균 +/- SEM으로 나타낸다.

일반적으로 다음의 단어 또는 구는 요약, 명세서, 실시예 및 청구범위에서 사용되었을 때 다음의 정의를 가진다.

"항체"는 광범위한 의미는 사용되며, 특히 단일 단클론 항체 (항진, 길항, 중화 항체, 탈면역화된, 뮤린, 키메라 또는 인화 항체를 포함), 폴리펩티드 특이성을 가지는 항체 조성물, 단일 쇄 항체, 면역콘쥬게이트 및 항체의 단편(하기 참고)를 포함한다.

여기에서 사용된 "단클론 항체"는 실질적으로 상동성 항체 군으로부터 수득한 항체를 말하는데, 예를 들면, 군을 이루는 개별 항체들은 소량으로 존재할 수도 있는 자연적으로 발생하는 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단클론 항체는 단일 항원 부위에 대해 매우 특이적이다. 또한, 상이한 결정부위(에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체 준비물과는 달리, 각 단클론 항체는 항원에서 단일 결정부위에 대한 것이다. 이들의 특이성에 추가하여, 단클론 항체는 다른 항체에 오염되지 않고 합성될 수 있는 장점이 있다. 변형물질 "단클론"은 항체의 실질적으로 상동성 군으로부터 얻은 항체의 특징을 나타내는데, 이는 임의 특정 방법에 의해 항체의 생산을 요구하지 않는 것으로 추정하지는 않는다. 예를 들면, 본 발명에 따라 이용될 수 있는 단클론 항체는 Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)에 의해 처음으로 설명된 하이브리도마 방법(뮤린 또는 사람)으로 만들 수 있거나 또는 재조합 DNA 방법으로 만들 수도 있다(see, e.g., U.S. Pat. No.4,816,567). "단클론 항체"는 예를 들면, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581 -597 (1991)에서 설명하는 기술을 이용하여 파아지 항체 라이브러리로부터 분리할 수도 있다.

"항체 단편"은 고유 항체의 일부분으로 구성되는데, 바람직하게는 항원-결합 부위 또는 이의 가변 부위로 구성된다. 항체 단편의 예로는 전장보다 짧은 항체, Fab, Fab', F(ab')₂, 및 단편; 이중특이성항체(diabodies); 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자; 단일-쇄 항체, 단일 도메인 항체 분자, 융합 단백질, 재조합 단백질 및 항체 단편들로부터 형성된 멀티특이적 항체가 포함된다. "고유" 항체는 항원-결합 가변 부위와 경쇄 항상성 도메인(CL) 및 중쇄 항상성 도메인, C_H1, C_H2, C_H3으로 구성된 것이다. 항상성 도메인은 고유 서열 항상성 도메인(예를 들면 사람 고유 서열 항상성 도메인) 또는 이의 아미노산 가변부위가 될 수 있다. 적절하게는 고유 항체는 하나 또는 그이상의 효과물질 기능을 가진다. 이들의 중쇄 항상성 도메인의 아미노산 서열에 따라, 고유 항체를 상이한 “류별”로 분류할 수 있을 것이다. 고유 항체에는 다섯가지 주요 류별이 있는데; IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, 그리고 이들중 일부를 다시 하위류별 "subclasses" (이소타입), 예를 들면, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgA2로 추가 분류할 수 있다. 항체의 상이한 류별에 상응하는 중쇄 항상성 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, μ로 부른다. 하위 단위 및 이뮤노글로블린의 상이한 종류의 3차원 모양은 공지되어 있다.

항체 "효과물질 기능"은 항체의 Fc 부분(고유 서열 Fc 부분 또는 아미노산 서열 가변 Fc 부분)에 기여하는 생물학적 활성을 말한다. 항체 효과물질 기능의 예로는 C1q 결합; 컴플리먼트 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포- 중개된 세포독성 (ADCC); 식균작용(phagocytosis); 세포 표면 수용체(e.g. B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등이 포함된다.

"항체-의존성 세포-중개된 세포독성" 및 "ADCC" 는 세포-중개된 반응을 말하는데, Fc 수용체(FcRs) (예를 들면, Natural Killer (NK) 세포, 호중구, 그리고 대식세포)를 발현하는 비-특이적인 세포독성 세포가 표적 세포상에 결합 항체를 인지하고, 연속하여 표적 세포의 용해의 원인이 된다. ADCC, NK 세포를 중개하기 위한 원발성(primary) 세포들은 FcγRIII만을 발현하고, 반면 단세포(monocytes)는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포에서 FcR 발현은 Ravetch and Kinet, Aram. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)의 p464의 표 3에 요약되어있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, U.S. Pat. No. 5,500,362 또는 5,821,337에서 설명된 것과 같이 in vitro ADCC 검사를 실행할 수도 있다. 이와 같은 검사에 유용한 효과물질 세포에는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 Natural Killer (NK) 세포가 포함된다. 대안으로 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)에서 설명하는 것과 같이 동물 모델에서 평가할 수도 있다.

"효과물질 세포"는 하나 또는 그이상의 FcRs를 발현시키고, 효과물질 기능을 실행하는 백혈구세포이다. 적절하게는, 세포들은 최소한 FcγRIII를 발현시키고, ADCC 효과물질 기능을 수행한다. ADCC를 중개하는 사람 백혈구의 예로는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), natural killer (NK) 세포, 단세포, 세포독성 T 세포 및 호중구가 포함되나; PBMCs 및 NK 세포가 적절하다. 효과물질 세포를 여기에서 설명한 것과 같이 혈액 또는 PBMC와 같은 고유 소스로부터 분리해낼 수도 있다.

"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fe 부분에 결합하는 수용체를 설명할 때 이용된다. 적절한 FcR은 고유 서열의 사람 FcR이다.

또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체(감마 수용체)에 결합하는 것이고, 수용체의 FcγRI, FcγRII, Fcγ RIII 하위류별, 대립형질 변이체 또는 이들 수용체의 대안적으로 슬라이스된 형태(alternatively spliced forms)가 포함된다. FcγRII 수용체에는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("저해 수용체")가 포함되는데, 이들은 세포질 도메인에서 주로 상이한, 유사 아미노산 서열을 가진다. 활성화 수용체 FcγRIIA에는 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-계 활성화 모티프 (ITAM)를 포함한다. 저해 수용체 FcγRIIB에는 세포질 도메인에 면역수용체 티로신- 계 저해 모티프 (ITIM)를 포함한다( M. in Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcRs are reviewed in Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al, Immunomethods 4:25-34 (1994); and de Haas et al, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). 앞으로 확인될 수 있는 것들을 포함하여 다른 FcRs도 여기 “FcR"에 포함된다. 이 용어에는 신생아 수용체, FcRn이 포함되는데, 이는 모체 IgG를 태아로 운반하는 책임을 맞고 있다(Guyer et al, J. Immunol. 1 17:587 (1976) and Kim et al., Eur. J. Immunol. 24:2429 (1994)).

"컴플리먼트 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 컴플리먼트 존재하에 표적을 용해시키기 위한 분자의 능력을 말한다. 컴플리먼트 활성화 경로는 컴플리먼트 시스템(C1q)의 제1 성분이 동종 항원과 복합된 분자(예를 들면 항체)에 결합함으로써 개시된다. 컴플리먼트 활성화를 평가하기 위해, Gazzano-Santoro et al, J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)에서 설명하는 것과 같은 CDC 검사를 실시할 수도 있다.

"가변(variable)"은 항체가운데 가변 도메인의 특정 부분이 서열에서 상당히 상이한 것을 말하고, 이는 특정 항원에 각 특정 항체의 결합 및 특이성에 이용된다. 그러나, 변이성이 항체의 가변 도메인을 통하여 고르게 분포되는 것은 아니다. 경쇄와 중쇄 가변 도메인에 초가변 부위(hypervariable region)라고 부르는 세가지 단편에 집중된다. 가변 도메인의 매우 보존된 부분을 프레임워크 부분(FRs)이라고 한다. 고유 중쇄 및 경쇄의 가변 부분은 네 가지 FR로 구성되는데, 대부분 β-쉬트 모양을 취하고, 일부의 경우에는 >쉬트 구조를 형성하기도 한다. 각 쇄의 초가변 부분은 FR에 근접하게 있으며, 다른 쇄의 초가변부분과 함께 항체의 항원 결합 부위를 형성하는데 기여한다(Kabat et al, Sequences of 단백질s of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). 항상성 도메인은 항원에 항체가 결합하는데 직접적으로 관여하지는 않지만 다양한 효과물질 기능 예를 들면, 항체 의존성 세포의 세포독성(ADCC)에 참여한다.

여기에서 사용된 "초가변부분(hypervariable region)"은 항원 결합을 책임지는 항체의 아미노산 잔기를 말한다. 초가변 부분은 일반적으로 “상보성 결정 부위(complementarity determining region)" 또는 "CDR"의 아미노산 잔기로 구성된다(예를 들면, 경쇄 가변 도메인에서 잔기 24-34 (Ll), 50-56 (L2), 89-97 (L3) 그리고 중쇄 가변 도메인에서 31 -35 (Hl), 50-65 (H2), 95-102 (H3)); Kabat el al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) 그리고/또는 ”초가변 루프의 아미노산 잔기 (예를 들면, 경쇄 가변 도메인에서 잔기 2632 (Ll), 50-52 (L2), 91 -96 (L3) 그리고 중쇄 가변 도메인에서 26-32 (Hl), 53-55 (H2), 96-101 (H3); Chothia and Lesk J. MoI. Biol. 196:901 -917 (1987)). "프레임워크 부분" 또는 "FR" 잔기는 여기에서 정의된 바의 초가변 부분 잔기이외의 가변 도메인 잔기다. 항체를 파파인으로 처리하면 두 개의 동일한 항원-결합 단편, 즉, "Fab" 단편을 얻는데, 이들 각각은 하나의 항원-결합 부위와 나머지 "Fc" 단편을 만드는데, 이 이름은 바로 결정화될 수 있는 능력을 반영한 것이다. 펩신 처리로 두 개의 항원-결합 부위를 가지는 F(ab')₂ 단편을 만드는데, 이것은 항원에 교차-연결될 수 있다.

"Fv" 는 완전한-항원 인지 및 항원-결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이 부위는 하나의 중쇄와 하나의 경쇄 가변 부분 도메인이 단단하게비-공유적으로 연합된 이량체로 구성된다. 이 모양에서 각 가변 도메인의 세 개 초가변 부위가 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면상에 항원-결합 부위를 한정한다. 집합적으로, 6개 초가변 부위는 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인(Fv의 절반은 항원에 특이적인 세가지 가변 부분으로만 구성된다)은 전체적인 결합 부위보다는 낮은 친화성을 가지나 항원을 인지하고 결합하는 능력을 가진다. Fab 단편에는 또한 경쇄의 항상성 도메인과 중쇄의 제1 항상성 도메인(CH1)을 포함한다. Fab' 단편은 항체의 힌지 부분으로부터 하나 또는 그이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇 개 잔기가 추가되어 Fab 단편과는 상이하다. Fab'-SH는 Fab'에 항상성 도메인의 시스테인 잔기가 최소 한 개의 자유 티올기를 가지는 것을 말한다. F(ab')₂ 항체 단편들은 원래 Fab' 단편 사이에 힌지 시스테인을 가지는 Fab'의 쌍으로 생성된다. 항체 단편들의 다른 화학 커플링 또한 공지되어 있다.

임의 척추동물의 항체의 “경쇄”는 항상성 도메인의 아미노산 서열에 근거하여, 두 개의 명백하게 별개의 타입 카파 (K) 와 람다(λ)중 하나가 된다.

"하나의 -쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편들은 항체의 VH 와 VL 도메인으로 구성되는데, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재한다. 바람직하게는 Fv 폴리펩티드는 항원 겨합을 위한 원하는 구조를 scFv가 형성할 수 있도록 VH와 VL 도메인사이에 폴리펩티드 링크를 포함한다. scFv에 대해서는 Plckthun in The Pharmacology of monoclonal antiboty, vol. 1 13, Rosenburg and Moore eds., Springer- Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)을 참고한다.

이중특이성항체("diabodies")는 두 개의 항원-결합 부위를 가지는 작은 항체 단편을 말하는데, 이때 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄(V_H-V_L)에서 가변 경쇄 도메인(V_L)에 연결된 가변 중쇄 도메인(V_H)로 구성된다. 동일한 쇄에서 두 개 도메인사이에 짝을 만들기에는 너무 짧은 링커를 이용하여 도메인은 다른 쇄의 상보적인 도메인과의 쌍을 이루도록 함으로써 두 개의 항원-결합 부위가 생겨한다. 이중특이성항체에 대해서 예를 들면 EP 404,097; WO 93/1 1 161 ; and Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. ScL USA, 90:6444-6448 (1993)에서 상세하게 설명하고 있다.

"분리된(isolated)" 항체는 동정되고, 자연 환경 성분으로 분리되거나 회수한 것을 말한다. 자연 환경의 오염 성분들은 항체에 대해 진단 또는 치료 용도를 간섭할 수 있는 물질을 말하며, 여기에는 효소, 호르몬 및 다른 단백질 또는 비-단백질 용질이 포함된다. 분리된 항체에는 항체의 자연 환경의 최소 하나의 성분이 없을 수 있기 때문에 재조합 세포내에 원래 위치한(in situ) 항체를 포함한다. 그러나, 보통은 분리된 항체는 최소 하나의 정제 단계에 의해 준비될 것이다.

소요의 항원 예를 들면 CD63 항원 모이어티에 “결합하는”항체는 충분한 친화성을 가지고 항원에 결합할 수 있는 것으로, 항체는 항원을 발현하는 세포를 표적하여 치료 또는 진단 물질로써 유용하다. 항체는 CD63 항원 모이어티에 결합하여 다른 수용체와는 반대로 CD63 항원 모미어티에 적절하게 결합하고, 비-특이적 Fc 접촉을 포함하는 우연한 결합이 포함되지 않거나 또는 다른 항원에 통상적인 전사후 변형에 대한 결합이 포함되지 않고, 다른 단백질과 유의적인 교차 반응을 하지 않는 것이다. 원하는 항원에 결합하는 항체를 감지하는 방법들이 당분야에 공지되어 있으나 FACS, 세포 ELISA 및 Western blot를 포함하나 이에 한정시키지는 않는다.

여기에서 사용된 바와 같이, "세포", "세포주", "세포 배양물"은 서로 상호호환적으로 사용되며, 이들 모두 자손을 포함한다. 모든 자손이 DNA 함량에서 정확하게 일치하지 않을 수도 있는데, 그 이유는 계획된 또는 부적절한 돌연변이 때문이다. 고유적으로 형질변환된 세포에 대해 스크린된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 가지는 돌연변이 후손이 포함된다. 별개의 명칭을 사용하고자 하는 경우는 설명에서 분명하게 할 것이다.

처리("Treatment")는 치료요법적 치료, 예방 또는 저지 수단을 마하는데, 목적은 표적이 되는 병인 상태 또는 질환을 방해하거나 경감시키는 것이다. 치료를 요하는 개체에는 이미 이 질병을 가진 개체 뿐만 아니라 질환이 있을 가능성이 있거나 이 질환을 예방하고자 하는 개체가 포함된다. 여기에서, 치료되는 포유류는 질환을 가지고 있는 것으로 진단을 받거나 또는 이 질환에 잘 걸릴 것으로 보이는 개체가 될 수 있다. "암" 및 "암의(cancerous)"는 제어안된 세포 생장 또는 죽음을 특징으로 하는 포유류에 생리학적 상태를 말하거나 설명하는 것이다. 암에는 암종, 임파종, 아세포종(blastoma), 육종(sarcoma), 백혈졍 또는 임파계 악성종양을 포함한다. 이와 같은 암의 특정 예로는 비늘성(squamous) 세포 암 (예를 들면 상피 비늘성 세포 암), 소-세포 폐암, 폐의 선암, 폐의 비늘성 암종을 포함하는 폐암, 복막암, 간세포암, 위장 또는 위암(위내장 암을 포함하는), 췌장암, 신경교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 직장암, 결장암, 자궁내막 또는 자궁암종, 타액선 암종, 신장 또는 콩팥암, 전립선암, 외음부 암, 갑상선 암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종 및 머리 및 목 암등이 포함된다.

"치료요법제(chemotherapeutic agent)"는 암 치료에 유용한 화학물질이다. 치료요법제의 예로는 티오테파(thiotepa) 및 사이클로포스파미드(CYTOXAN™)와 같은 알킬화 물질; 알킬 설포네이트 예를 들면, 부술판(busulfan), 임프로술판(improsulfan) 및 피포술판(piposulfan); 아지르딘 예를 들면 벤조도파(benzodopa), 카르보퀴논(carboquone), 메투어도파(meturedopa), 및 우레도파(uredopa); 에틸렌이민 및 메틸렌이민(알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸올멜라민 포함); 니트로젠 무스타드 예를 들면, 클로람부칠, 클로나파진, 클로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로로에타민, 메클로로에타민 옥시드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레디니무스틴, 트로포르파미드, 우라실 무스타드; 니트로조우레아 예를 들면, 카르무스틴, 크로로조토신, 페토무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제 예를 들면, 아클라치노미신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리체미친, 카라비친, 카르노마이신, 카르지노필린, 클로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르우리신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 퀘엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물질 예를 들면, 메토트렉세이트 및 5-플루오르우라실(5-FU); 엽산 유사체 예를 들면, 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테인, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체 예를 들면, 플루다라빈, 6-멀캅토퓨린, 티아미피린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체 예를 들면, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아주리딘, 카르모퓨르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 도시플루리딘, 에노시타빈, 플록소루비딘, 5-FU; 안드로겐 예를 들면 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-아드레날 예를 들면, 아미노글루테티미드, 미토탄, 트리로스탄; 엽산 공급물 예를 들면, 프로린산; 아세갈락톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린 산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트라세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지퀴논; 엘포르미틴; 엘리프리니움 아세테이트; 에토글루시드; 갈리움 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미토산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카르바진; PSK; 라조산; 시조피란; 스피로게르마니움; 텐우라존산; 트리아지퀴논; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토부로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁산, 예를 들면, 파클리탁셀 (TAXOL, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ.) 및 도쎄탁셀(TAXOTERE, Aventis, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로로암부실; 젬시타빈; 6-티오구아닌; 멀캅도퓨린; 메토트렉세이트; 플라티늄 유사체 예를 들면, 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈들라스틴; 플라티늄; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미토산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 셀로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소메라제 저해물질 RFS 2000; 디플로로메틸오르니틴(DMFO); 레티논산; 에스페라미신; 카페시타빈; 그리고 상기 물질의 제약학적으로 수용가능한 염, 산 또는 이의 유도체. 또한 이 정의예는 종양에 ghmahs 작용을 조절 또는 저해하는 항-호르몬 물질도 포함되는데 예를 들면, 탐옥시펜, 라록시펜, 아로메타제 예를 들면 4(5)-이미다졸, 4-하이드록시탐옥시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LYl 17018, 오나프리스톤 및 토레미펜(Fareston); 그리고 항-안드로겐 예를 들면, 플루타미드, 니루타미드, 비칼루타미드, 루프로리드 및 고세레린; 상기 물질의 제약학적으로 수용가능한 염, 산 또는 이의 유도체가 포함된다.

치료를 목적으로 하는 “포유류”는 포유류로 분류되는 임의 동물을 말하는데, 사람, 생쥐, SCID 또는 누드 생쥐 또는 생쥐의 계통, 농장 동물 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물 예를 들면, 양, 개, 말, 고양이, 소 등이 포함된다. 바람직하게는 여기에서 포유류는 사람이다.

"올리고뉴클레오티드(Oligonucleotides)"는 공지의 방법으로 화학적으로 합성된 짧은 길이의, 단일 또는 이중 스트랜드의 폴리데옥시뉴클레오티드인데 이때 방법은 EP 266,032, published 4 May 1988에서 설명된 것과 같이 고형상 기술을 이용하여 포스포트리에스터, 포스파이트 또는 포스포라미디트 화학물질과 같이 또는 Froehler et al., Nucl. Acids Res., 14:5399-5407, 1986에서 설명하는 데옥시뉴클레오시드 H-포스포네이트 중간생성물을 통하여 합성된다. 이를 그 다음 폴리아크릴아미드 겔상에서 정제한다.

다른 언급이 없는 한, “CD63 항원성 모이어티"는 여기에서 테트라스파닌 패밀리의 타입 III 막 단백질을 말하며, 또한 흑색종 1 항원, 안구 흑색종-연관된 항원, 흑색종 연관된 항원 ME491, 리소좀-연관된 막 당단백질 3, 그래뉼로피신(granulophysin), 흑색종- 연관된 항원 MLA 1을 말하기도 한다.

"키메라(Chimeric)" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄가 특정 종에서 유도된 또는 특정 항체 류 또는 아류에 속하는 항체 또는 원하는 생물학적 활성을 나타낸다면 이들 항체의 단편에 상응하는 서열과 동일하거나 유사하나 쇄의 나머지는 다른 종에서 유도된 또는 다른 항체 류 또는 아류에 속하는 항체 원하는 생물학적 활성을 나타낸다면 이들 항체의 단편에 상응하는 서열과 동일하거나 유사한 이뮤노글로블린이다(U.S. Pat. No. 4,816,567 and Morrison et al, Proc. Natl. Acad. ScL USA, 81 :6851-6855 (1984)).

비-사람(예를 들면, 뮤린) 항체의 "인화(humanized)" 형태는 사람의 것이 아닌 이뮤노글로블린으로부터 유도된 최소 서열을 포함하는 특이적 키메라 이뮤노글로블린, 이뮤노글로블린 쇄 또는 이의 단편들(예를 들면 Fv, Fab, Fab', F(ab)₂ 또는 항체의 다른 항원-결합 부분열(subsequences))이다. 대부분의 경우에, 인화 항체는 수용 항체의 상보성 결정 부위(CDRs)를 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하는 생쥐, 쥐 또는 토기와 같은 사람이 아닌 종(도너 항체)의 잔기로 치환한 사람 이뮤노글로블린(수용 상체)이다. 일부 경우에, 사람 이뮤노글로블린의 Fv 프레임워크 부분(FR) 잔기는 사람의 것이 아닌 FR 잔기로 대체된다. 또한, 인화 항체는 수용 항체에서 또는 도입된 CDR 또는 FR 서열에서 볼 수 없는 잔기를 포함할 수 있다. 이와 같은 변형을 만들어 항체를 개량하고 항체 성능을 최적화한다. 일반적으로, 인화 항체는 실질적으로 최소한 한 개, 일반적으로 두 개의 가변 도메인으로 구성되는데 이때 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 부분은 비-사람 이뮤노글로블린에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 잔기는 사람 이뮤노글로블린 콘센선스 서열의 것에 이다. 인화 항체는 적절하게는 이뮤노글로블린 항상성 부분(Fc)의 최소한 일부, 일반적으로 사람 이뮤노글로블린의 것으로 구성될 것이다.

"면역해제(De-immunized)" 항체는 주어진 종에 면역원성이 없거나 적은 이뮤노글로블린을 말한다. 항체의 구조적 변형을 통하여 면역해제(De- immunization)시킬 수 있다. 당분야에 공지된 임의 면역해제 기술을 이용할 수 있다. 면역 해제 항체의 임의 적절한 기술은 WO 00/34317 published June 15, 2000에 설명되어 있다.

상동성("Homology")은 아미노산 서열 변이체에서 서열을 배열하고, 필요한 경우, 최대 상동성 비율을 얻기 위해 갭을 도입시킨 후에 동일한 잔기의 비율을 말한다. 배열을 하는 방법 및 컴퓨터 프로그램은 당분야에 공지되어 있다.

본 명세서를 통하여 하이브리도마 세포주 및 이로부터 생성되는 분리된 단클론 항체는 내부적으로 7BD-33-11A 또는 수탁명 ATCC PTA-4890이라 한다.

여기에서, “항체-리간드”에는 표적 항원에 결합 특이성을 보이는 모이어티를 포함하는데, 여기에는 고유 항체 분자, 항체 단편, 최소한 항원-결합 부분 또는 이의 일부분(예를 들면 항체 분자의 가변 부분) 가령, Fv 분자, Fab 분자, Fab' 분자, F(ab').sub.2 분자, 이중특이성 항체, 융합 단백질 또는 ATCC PTA-4890(ATCC PTA-4890 항원)으로 지적된 하이브리도마 세포주에 의해 생산되는 분리된 단클론 항체에 결합되는 항원을 특이적으로 인지하고 결합하는 유전공학적으로 조작된 분자가 될 수 있다.

여기에서 이용된 바와 같이, "암질환 변환 항체" (CDMAB)는 환자에게 유익함을 주는 방법으로 예를 들면 종양 부하를 감소시키거나 종양을 가진 개체의 생존을 연장시킴으로써 유익함을 주는 암질환 과정을 변형시키는 단클론 항체 또는 이의 단편을 말한다.

여기에서 사용된 것과 같이, "항원-결합 부분"은 표적 항원을 인지하는 분자의 일부분을 의미한다.

여기에서 사용된 것과 같이, 경쟁적으로 저해하는("competitively inhibits")의 의미는 통상의 상호 항체 경쟁 검사(Belanger L., Sylvestre C. and Dufour D. (1973), Enzyme linked immunoassay for alpha fetoprotein by competitive and sandwich procedures. Clinica Chimica Acta 48, 15)를 이용하여, ATCC PTA-4890(ATCC PTA-4890 항체)로 지정된 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 단클론 항체가 향하는 결정 부위를 인지하고 결합하는 능력을 말한다.

여기에서 사용된 것과 같이 “표적 항원”은 ATCC PTA-4890 항원 또는 이의 일부분을 말한다.

여기에서 사용된 바와 같이 “면역콘쥬게이트("immunoconjugate")는 세포독소, 방사능활성 물질, 효소, 톡신, 효소, 항-종양 약물 또는 치료제에 화학적으로 또는 생물학적으로 결합된 항체와 같은 CDMAB 또는 임의 분자를 말한다. 항체 또는 CDMAB는 세포독소, 방사능활성 물질, 항-종양 약물 또는 치료제의 임의 위치에서 표적에 결합할 수 있는 한 결합된 것을 말한다. 면역콘쥬게이트의 예로는 항체 독소 화학 콘쥬게이트, 항체-독소 융합 단백질을 포함한다.

여기에서 사용된 바와 같이, 융합 단백질("fusion protein")은 항원 결합 부분이 독소, 효소 또는 단백질 약물과 같은 생물학적으로 활성 분자에 연결된 임의 키메라 단백질을 말한다. 여기에서 본 발명으 충분히 이해하도록 하기 위해 다음의 설명을 제공한다.

본 발명은 ATCC PTA-4890 항원을 특이적으로 인지하고 결합하는 CDMABs (예를 들면, ATCC PTA-4890 CDMAB)를 제공한다.

ATCC에 기탁번호 PTA-4890으로 기탁된 하이브리도마에 의해 생산되는 분리된 단클론 항체의 CDMAB는 표적 항원에 하이브리도마 ATCC PTA-4890에 의해 생산된 분리된 단클론 항체에 면역 특이적 결합을 경쟁적으로 저해하는 항원-결합 부분이 있는 한 임의 형태가 될 수 있다. 따라서, ATCC PTA-4890 항체와 동일한 결합 특이성을 가지는 임의 재조합 단백질 (가령, 항체가 제2 단백질 가령 임포카인 또는 종양 저해 생장 인자와 같은 것에 복합된 융합 단백질)은 본 발명의 범위에 속한다.

한 구체예에서, CDMAB는 ATCC PTA-4890 항체이다.

다른 구체예에서, CDMAB는 ATCC PTA-4890 항체의 Fv 분자(예를 들면 단일 쇄 Fv 분자), Fab 분자, Fab' 분자, F(ab')₂ 분자, 융합 단백질, 이중특이적 항체, 헤테로항체 또는 이 항체의 항원-결합 부분을 가지는 임의 재조합 분자가 되는 항원 결합 단편이다. 본 발명의 CDMAB는 ATCC PTA-4890 단클론 항체가 향하는 에피토프에 향한다.

본 발명의 CDMAB는 분자내에 아미노산 변형에 의해 유도체 분자를 만들어 변형될 수도 있다. 화학적 변형도 가능하다.

유도체 분자는 폴리펩티드의 기능성 성질 즉, 치환체를 가지는 분자가 ATCC PTA-4890 항원 또는 이의 일부분에 폴리펩티드 결합을 여전히 허용할 것이다.

이와 같은 아미노산 치환에는 보존성("conservative")과 같은 공지의 아미노산 치환이 포함되나 반드시 이에 한정되지는 않는다.

예를 들면, 단백질의 모양 또는 기능을 변화시키지 않고 단백질에 특정 아미노산 치환 “보존성 아미노산 치환”의 단백질 화학 원리가 잘 확립되어 있다.

이와 같은 변화에는 소수성 아미노산에 대해 이소루이신(I), 발린(V), 루이신(L)의 치환; 글루타민산(E)에 대한 아스파르트산(D)의 치환 및 이의 역; 아스파라진(N)에 대한 글루타민(Q)의 치환 및 이의 역; 그리고 트레오닌(T)에 대한 세린(S)의 치환 및 이의 역과 같은 치환을 포함한다. 단백질의 3차원 구조에서 특정 아미노산의 환경 및 이의 역할에 따라 다른 치환도 보존성으로 간주할 수 있을 것이다. 예를 들면, 글리신(G) 및 알라닌(A)은 흔히 알라닌과 발린(V)으로 상호 교환될 수 있다. 상대적으로 소수성인 메티오닌(M)은 루이신 및 이소루이신 그리고 종종 발린으로 상호교환될 수 있다. 리신(K) 과 아르기닌(R)은 아미노산 잔기의 중요한 특징이 이의 전하이고, 이들 아미노산 잔기의 상이한 pK 값이 유의성이 없는 위치에서 흔히 상호교환가능하다. 특정 환경에서는 다른 변화도 “보존성”으로 간주될 수 있다.

항체가 제공되면, 당업자는 동일한 에피토프를 인지하는 예를 들면, 경쟁 항체와 같은 경쟁적으로 저해하는 CDMAB를 만들 수 있다(Belanger et al., 1973). 한 방법은 항체가 인지하는 항원을 발현시키는 이뮤노겐으로 면역화시키는 것이다. 샘플에는 조직, 분리된 단백질 또는 세포주가 포함되나 이에 국한되지는 않는다. 생성된 하이브리도마는 경쟁 검사로 스크리닝될 수 있는데, 이중 하나는 ELISA, FACS 또는 면역침전과 같은 테스트 항체의 결합을 저해하는 항체를 동정하는 것이다. 또 다른 방법은 이 항원을 인지하는 항체에 대한 파아지 디스플레이 라이브러지 및 패닝을 이용하는 것이다 (Rubinstein et al., 2003). 어떤 경우이든, 하이브리도마는 표적 항원에 대해 고유 항체의 결합을 경쟁하는 능력에 근거하여 선택된다. 이와 같은 하이브리도마는 고유 항체와 동일한 항원을 인지하고 좀더 구체적으로는 동일한 에피토프를 인지하는 특징을 보유하게 될 것이다.

실시예 1

사람 산 종양 조직 착색

사람의 간 종양 조직에 7BD-33-11A의 결합을 평가하기 위해 IHC 연구를 실행하였다. IHC 최적화 연구는 추가 실험을 위한 조건을 결정하기 위해 미리 실시하였다.

조직 단편들은 1시간 동안 58℃ 오븐에서 건조시켜 파라핀을 제거하였고, 매번 4분씩 5회 실렌에 담구어 왁스를 제거하였다. 등급화된 에탄올로 일련의 세척을 통하여(100%-75%) 처리한 후에 조직 단편들을 물에 재수화시켰다. 슬라이드는 pH6에서 10mM 구연산 완충액에 담구고, 매회 5분씩 고전류, 중전류 및 저전류 세팅하에 마이크로웨이브시키고, 실온에 15분간 둔 후에, 매회 5분씩 PBS로 3회 세척하였다. 슬라이드를 10분간 3% 과산화수소에 담구고, 매회 5분씩 PBS로 3회 세척시키고, Universal 블락킹 용액(Dako, Toronto, Ontario)으로 실온에서 5분간 항온처리하였다. 7BD-33-11A, 단클론 생쥐 항-알파 페토프로테인(Abeam, Cambridge, MA) 또는 이소타입 대조 항체(아스퍼질러스 나이져(Aspergillus niger) 포도당 산화효 소, 이 효소는 포유류 조직에 존재하지도 않고 유도되지도 않는 효소에 대한 항체)를 각 항체에 대해 작업 농도(5㎍/㎖)로 항체 희석 완충액(Dako, Toronto, Ontario)으로 희석하고 단, 항-알파 페토 단백질은 데이터 쉬트 추천에 따라 희석하여(10㎍/㎖), 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 슬라이드를 매회 5분씩 3회 PBS로 세척하였다. 1차 항체의 면역반응성은 HRP 콘쥬게이트된 2차 항체(Dako Envision System, Toronto, Ontario)로 실온에서 30분간 감지하거나/가시화할 수 있다. 이 단계후에, 슬라이드는 매회 5분씩 PBS로 3회 세척하고, 발색 반응은 실온에서 10분간 면역과산화효소를 위해 DAB(3,3'-디아미노벤지딘 테트라하이드라클로라이드, Dako, Toronto, Ontario)로 생성시킨다. 슬라이드를 수돗물로 세척하여 발색 반응을 종료시킨다. Meyer's 헤마토실린(Sigma Diagnostics, Oakville, ON)으로 카운터착색(counterstaining) 후에, 슬라이드는 등급화된 에탄올(75-100%)로 탈수시키고, 실렌으로 제거하였다. 장착 매체(mounting media (Dako Faramount, Toronto, Ontario))를 이용하여 슬라이드에 커브를 덮는다. 슬라이드는 Axiovert 200 (Zeiss Canada, Toronto, ON)를 이용하여 현미경으로 검사하고, 디지털 이미지를 얻고, 이를 Northern Eclipse Imaging Software (Mississauga, ON)를 이용하여 저장하였다. 결과를 판독하고, 기록하고, 조직병리학자가 해석하였다. 49개 사람 간 종양(45개 간세포 암종 및 4개 담관암종)에 항체들의 결합 및 9개 비-신형성 간 조직에 대한 항체 결합은 사람 간, (정위 및 종양) 조직 마이크로어래이를 이용하여 실시하였다(Imgenex, San Diego, CA). 도 1은 사람의 비-신형성 간 조직과 종양 간 조직의 어래이에서 7BD-33-11A 착색 결과를 요약한 것이다. 각 비-신형성 샘 플 또는 조직 샘플은 하나의 점으로 나타내었다. 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 7BD-33-11A는 사람 간 종양 조직 마이크로어래이상에 39/49 부분(80%)에 결합하였다. 항체는 강력한((+++)) 착색(3/49부분), 중간(++) 착색(15/49부분), 약한(+) 착색(18/49 부분) 및 확실치 않은(+/-) 착색(3/49 부분)을 보였다. 결합은 종양 세포와 일부 종양에 염증 세포에 한정되었다. 세포 국소화는 과립 착색 패턴을 가진 세포질 및 막에 있다. 이형성 결합이 종양 세포에서 <10% 내지 >50% 범위로 관찰되었다. 조직 마이크로어래이상에서 이용할 수 있는 간 종양의 조직학적 타입에 따라, 간세포 암종의 80%(36/45)에 결합과 담관암종의 75%(3/4)에 결합되었다. 7BD-33-11A는 전이성 간 종양에 결합 선호도를 나타내었다. 원발성 간세포 암종의 78%(29/37)과 비교하여 전이성 간 세포 암종의 88%(7/8)의 결합이 있었고, 원발성 담관 암종의 50%(1/2)와 비교하여 전이성 담관암종의 100%(2/2)에 결합이 있었다. 비-신형성 간 조직의 100%(9/9)에 결합이 있었고, 결합은 간세포였다. 세포 국소화는 과립형 착색 패턴으로 세포질과 막이었다(도 2).

원발성 간 세포 암종의 종양 분화와 관련하여, 잘 분화되지 않은 암종, 중간정도로 분화된 암종, 잘 분화된 원발성 간세포 암종에서 각각 100%(4/4), 16/19(84%), 4/5(80%) 결합이 있었기 때문에 7BD-33-11A는 분화가 덜 된 종양에 더 많은 결합을 하는 경향을 보였다.

간 암의 AJCC 단계와 관련하여, 각각 단계 I, II, III, IV로부터 단편에 1/2 (50%), 15/17 (88%), 12/16 (75%), 5/8 (63%)의 결합이 있었다. 따라서, 항체 결합과 TNM 단계사이에 관련성이 발견되지 않을 것이다. 이와 같은 연관성 부족은 일 부 암 단계에서 샘플 사이즈가 작기 때문일 수도 있다.

따라서, 7BD-33-11A 항원은 전이성 간 종양 조직에 대해 일부 선호 결합을 가지면서 간 종양 조직상에 발현되는 것으로 보인다. 덜 분화된 원발성 간세포 암종에 결합 정도가 더 높은 경향도 있다. 따라서, 7BD-33-11A는 간세포 암종의 진단 물질로써의 용도와 간 암 치료의 치료 약물로써의 양도를 가진다.

실시예 2

간세포 암종 조직 마이크로어레이상에 면역 착색

실시예 1에서 얻은 결론에 대해 추가 연구를 위해, 7BD-33-11A 결합을 사람의 원발성 간세포 암종 조직과 전이성 간세포 암종 조직과 직접적으로 비교하였다. 도 3을 참고하면, 사람 간세포 암종(HCC) 조직 마이크로어레이는 하기와 같이 만들었다. 간략하게 설명하면, 1995년부터 1999년까지 Eastern Hepato-biliary Surgery Hospital (Shanghai, China) 로부터 조직 샘플을 구하여, 표준 프로토콜에 따라 파라핀에 묻어두었다. 포매(embedded) 조직 샘플을 새로이 절단하고, 헤마토실린 및 에오신으로 착색시켰다. 병소의 대표 부분을 조심해서 검토하고, 두명의 병리학자가 정의를 내렸다. 임상병리학적 정보에 근거하여 견본들은 조직 실린더내에 분류시켰고, 도너 블록의 선택 부분에서 0.6㎜ 직경을 취하고 조직 어래이 도구(Beecher Instruments, Silver Spring, MD)를 이용하여 수용 파라핀 블록에 정확하게 펀치해서 넣었다. 마이크로톰으로 마이크로어레이 블록의 연속 5㎛ 단편을 만들었다. 최종적으로, 원발성 그리고 이에 매취되는 전이성 HCC 샘플(31개 간세포내 전이와 29개 간세포외 전이를 포함) 60쌍의 TMA 부분을 만들었다.

HCC 전이에서 CD63의 가능한 역할을 결정하기 위해, 7BD-33-11A 항체로 면역 착색시켜 HCC 조직 마이크로어레이상에서 CD63 발현을 평가하였다. Twist 발현을 보이는 원발성 HCC 및 이와 매취되는 전이성 종양 60쌍을 포함하는 조직 어레이 단편의 전체적인 개관을 도 3A에 나타내었다. 원발성 HCC 및 이와 매취되는 전이성 종양 60쌍에서 세포질 CD63 발현은 각각 원발성 HCC 및 전이성 HCC에서 26/54 (48 %) 및 43/57 (75%)으로 높게 감지될 것이다. 원발성 HCC 및 이와 매취되는 전이성 종양 60개 경우가 조직 마이크로어레이에서 점으로 나타내었지만, 원발성 HCC와 전이성 HCC의 경우에 각각 54 민 57개 경우로 발견되었다. CD63 발현은 HCC 전이와 상당히 연관되어 있었다(p<0.001). 원발성 HCC와 이에 상응하는 전이성 HCC에서 CD63 단백질 발현을 도 4에 요약하였다. 7BD-33-11A은 HCC의 진단에 유용성이 있다.

실시예 3

파라핀- 포매된 HCC 종양 조직 50경우에서 면역 착색

CD63의 발현과 몇 가지 임상 병리학적 특징간에 상관관계를 결정하기 위해, 1999년부터 2001년까지 Department of Surgery, University of Hong Kong Medical Centre, Queen Mary Hospital, Hong Kong으로부터 수득된 파라핀-포매된 사람 HCC 임상 샘플 50경우에서 7BD-33-11A 항체로 면역 착색을 실행하였다(도 5). CD63의 세포질 발현은 착색된 종양 세포의 비율과 착색 강도를 시각적으로 평가한 두 사람의 관측자에 의해 결정되었다. 포지티브 세포 비율은 다음과 같이 등급매겼다; 2점, 11-50 % 포지티브 종양 세포; 3점, 51-80% 포지티브 세포; 그리고 4점, >81% 포지티브 세포. 착색 강도는 다음과 같이 등급매겼다; 1점, 약한 강도; 2점, 중간 강도; 3점, 강한 강도. 포지티브 세포의 발현 및 비율에 대한 포인트를 추가하고, 견본은 이들 전체적인 등급에 따라 4군으로 나눈다; 네가티브, 강도와 관계없이 포지티브 착색된 세포가 ≤ 10%; 약한 발현, 3점; 중간 발현, 4-5점; 강한 발현 6-7점. 약한 CD63 발현에 네가티브는 그룹 1로써, CD63 발현이 낮음을 나타내며; 중간내지 강력한 CD63 발현은 그룹 2로 분류하고, 이는 CD63 발현이 높음을 나타낸다.

정상적인 건강한 제공자의 간에서 세포질 착색이 없었다. 비-종양 조직(비-간경변성 및 경변성)에서, CD63 발현은 샘플의 30%(15/30)에서 감지되었다. 7BD-33-11A의 30%가 비-신형성 간 부분에 결합은 실시예 1에서 볼 수 있는 것보다 낮았다. 이는 조직 샘플링의 차이, 착색 방법 또는 기록 시스템의 차이로 인한 것일 것이다.

HCC에서,50경우중 48 경우(96%)에서 HCC에 포지티브 세포질 착색이 나타났다(도 3A). 도 6에는 CD63 발현과 임상 병리학적 특징과의 상관관계를 요약하였다. CD63 발현이 높은 39가지 경우는 첫해 동안 암의 재발(p=0.001), 진전된 종양 단계(p=0.014), 및 정맥 침윤(p=0.001)과 상당한 연관성이 있었다. 질병이 없는 생존 (DFS)과 전반적인 생존(OS)은 종양 세포에서 CD63 발현의 높거나 낮은 HCC 환자들을 비교하여 분석하였다. Kaplan-Meier 분석(도 5B)에 따르면, CD63 발현이 높은 환자는 CD63 발현이 없거나 낮은 환자(p=0.0065)보다 더 짧은 DFS를 가진다. 또한, 일정하게 CD63 발현이 높은 환자는 CD63 발현이 낮은 환자들보다 OS가 더 짧았 다(p=0.0085). 따라서, 이 데이터는 CD63 발현이 암의 재발, 진행된 암 단계, 정맥 침윤 가능성이 더 높은 것과 관련되며, 질병없는 그리고 전체 생존이 더 나쁜 것과 연관이 있다는 것을 설명한다. 결과적으로 7BD-33-11A는 암 재발, 진행된 암 단계, 정맥 침윤의 가능성은 더 크고, HCC와 연관하여 질병-없는 그리고 전반적인 생존이 더 나쁜 연관성을 결정하는데 유용하다.

실시예 4

다양한 HCC 암세포의 전이 가능성과 CD63 의 관계

실시예 2와 3에서, 임상 샘플에서 CD63 발현과 HCC 전이간에 상관관계가 있다는 것이 설명되었다. in vivo에서 이와 같은 상관관계를 추가 평가하기 위해서, 다양한 전이 가능성을 가지는 6개의 HCC 세포주, HepG2 와 Hep3B (American Type Culture Collection, Manassas, VA), Huh-7 (Dr. H. Nakabayashi, Hokkaido University School of Medicine, Sapporo, Japan의 선물), PLC (Japanese Cancer Research Bank, Tokyo, Japan), MHCC-97L 및 MHCC-97H (Liver Cancer Institute, Fudan University, Shanghai, China)에서 7BD-33-11A을 이용한 유동 세포측정기를 이용하여 CD63 발현을 평가하였다. 다양한 HCC 세포주에서 CD63 발현을 감지하기 위해, 세포를 7BD-33-11A 또는 이소타입 대조군(IgG2a, clone eBM2a, eBioscience, San Diego, CA; 10 ㎍/㎖)으로 1시간 동안 착색시키고, 1㎍ 염소 항-생쥐 FITC-콘쥬게이트된 2차 항체(eBioscience, San Diego, CA)로 30분간 항온처리하였다. 그 다음 샘플을 FACS로 분석하였다.

유동 세포측정기에 의하면 CD63 단백질 수준은 원발성 비-전이 세포 주(HepG2, Hep3B, Huh-7, PLC)와 비교하였을 때, 전이성 HCC 세포주(MHCC-97L 및 MHCC-97H)에서 더 높은 것으로 나타났다(도 7). 이는 CD63의 과도한 발현이 진행된 HCC와 관련되며, 결과적으로 이와 같은 결정에 7BD-33-11A가 이용될 수 있다는 것을 설명한다. 이 증거는 실시예 2와 3의 것과 일관성있다.

실시예 5

세포 소팅에 의해 HCC 에서 CD63 의 기능적 분석

도 8을 참고하면, HCC 세포주에서 CD63 과다 발현의 기능적 역할을 세포 소팅으로 검사하였다. Hep3B 세포를 우선 1㎍ 항-CD63 항체로 1시간 동안 라벨시켰다(MX-49.129.5, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). CD63 포지티브 세포를 FACSCalibur 기계(BD Biosciences, San Jose, CA)로 소트하였다. CD63⁺ 와 CD63^-세포를 10% FBS를 가진 DMEM 배지로 소트하였다. 증식 검사, 상처 치유 검사 및 침 투성 검사를 실행하여, 소트된 세포의 증식성, 이동성 및 침투성을 평가하였다.

증식성 검사에서 세포를 웰당 1000개 세포로 6개 웰 플레이트상에 도말하였다. 콜로니 생장은 Giema 착색후 2주에 검사하였다. 세포 이동은 200개 ㎕ 피펫 튜브에 의해 만들어진 벗겨진(scraped), 무세포(acellular) 지역으로의 이동을 측정하고(0시간), 그리고 24시간 후에 상처 봉합 속도를 모니터하여 평가하였다. 침투성 검사는 무혈청 DME에 5X10⁴ 세포를 이용하여 24-well BioCoat Matrigel Invasion Chambers (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ)에서 실행하고, 대조군 또는 마트리겔(matrigel)-피복된 필터상으로 도말하였다. PLC 또는 PLC- Twist 세포로부터 조건화 배지를 화학유인물로 하부 챔버에 둔다. 배양 22시간후에, 세포를 필터의 상측면으로부터 면봉으로 긁어내어 제거하였다. 마트리겔을 통하여 침투하고, 막의 바닥에 흡착된 세포들은 크리스탈 바이올렛 용액으로 착색되었다. 세포-연합된 착색은 10% 아세트산으로 용출시키고, 595nm에서 이의 OD값을 결정하였다. 각 실험은 3회 반복하고, 평균 값 ±SEM으로 나타내었다.

세포 소팅후에, Hep3B 세포의 두 집단의 순도는 유동 세포측정기로 결정하였다. 세포의 CD63⁺ 집단은 92% 순수한 반면, CD63^- 집단의 순도는 86%였다(도 8A).콜로니 형성 검사에서, CD63^- 세포와 비교하여, CD63⁺ 세포는 세포 증식 속도가 더 빨랐다(도 8B). 침투성 검사로 평가된 HCC 세포 침투성에서 CD63⁺ 세포는 CD63^- 세포와 비교하여, 침투성이 증가되었다는 것을 알 수 있다(도 8C). 도 8D에서 볼 수 있는 것과 같이, 상처 치유 검사에서 CD63⁺ Hep3B 세포의 이동 속도는 CD63^- 세포보다 더 빨랐다. 화살표는 두 세포 집단에서 차등되는 이동 속도를 나타낸다. 요약하면, 이들 결과에서 HCC 세포에서 CD63 발현은 세포 증식, 침투성 증가, 더 높은 이동성과 상관관계가 있으며, 7BD-33-11A가 이와 같은 감지에 유용하다는 것을 보여준다.

실시예 6

사람 MHCC-97H HCC 세포의 성장, 이동성과 침입에 대한 7BD-33-11A의 시험관내 효능

Hep3B 세포주로 실시예 5에서 획득된 결과를 더욱 확증하기 위하여, 7BD-33-11A를 콜로니 형성(colony formation) 검사의 경우에 2주 동안, 그리고 상처 치유와 침입 검사의 경우에 48시간 동안 2, 10과 20 ㎍/㎖의 용량으로 MHCC-97H 세포에 추가하였다(도 9). 콜로니 형성, 세포 이동성과 침입 검사는 사람 MHCC-97H HCC 세포의 증식, 세포 이동성과 침입에 대한 7BD-33-11A의 효과를 평가하기 위하여 앞서 기술된 바와 같이 이용되었다. 7BD-33-11A는 용량-의존성 방식(dose-dependent manner)으로 MHCC-97H 성장을 억제하였다(도 9A). 이에 더하여, 7BD-33-11A는 각각, 상처 치유와 침입 검사에서 확인되는 바와 같이, MHCC-97H 세포 이동성과 침입을 유의하게 억제하였다(각각, 도 9B와 9C). 이들 결과는 실시예 5로부터 결론을 뒷받침하고, 사람 전이성 HCC 세포의 성장, 이동과 침입을 감소시키는데 있어 7BD-33-11A의 직접적인 유용성을 더욱 증명한다.

실시예 7

MHCC-97H 세포로 정위(orthotopic) HCC 종양 모형

생체내에서 사람 전이성 간 세포에 대한 7BD-33-11A의 효과를 결정하기 위하여, 0.2 ㎖의 배양 배지에서 대략 1 X 10⁷개 사람 전이성 HCC MHCC-97H 세포를 5주령 수컷 누드 생쥐(University of Hong Kong의 Lab Animal Unit, Hong Kong)의 오른쪽 옆구리 내로 피하(s.c.) 주입하고, 이후 종양 발생의 징후를 매일 관찰하였다(도 10과 11). 종양이 1 내지 1.5 ㎝ 직경의 크기에 도달하면, 종양은 떼어내고 대략 1- 내지 2-㎜ 입방체로 절단하고, 이들 입방체는 앞서 기술된 방법(Lee et al., 2005)을 이용하여 5주령 수컷 누드 생쥐의 왼쪽 간엽(liver lobe) 내로 이식하였다. 10일후, 이들 누드 생쥐는 각 5마리의 6개 군으로 무작위 분할하고 2, 5 또는 10 ㎎/㎏의 이소타입 대조(IgG2a, 클론 eBM2a, eBioscience, San Diego, CA), 또는 7BD-33-11A로 치료하였다. 7BD-33-11A 시험 항체는 2.7 mM KCl, 1 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl과 20 mM Na₂HPO₄를 포함하는 희석제로 원액 농도(stock concentration)로부터 희석후, 200 ㎕ 부피로 각 무리에 복강내 투여하였다. 이들 항체는 이후, 이식후 50일까지 동일한 방식으로 총 12회 투약을 위하여 주2회 투여하였다. 이들 동물의 체중은 연구 기간 동안 주1회 기록하였다. 50일에, 모든 동물은 Committee on the Use of Live Animals in Teaching and Research of the University of Hong Kong의 가이드라인에 따라 안락사시켰다. 종양 성장은 방정식 길이 X 너비² x 0.5를 이용하여 산정하였다.

7BD-33-11A는 사람 HCC의 확립된 모형에서 종양 부하를 유의하게 감소시켰다. 종양 이식후 50일 시점에, 7BD-33-11A는 이소타입 대조와 비교하여 원발성 간 종양 체적을 감소시켰다(2, 10과 20 ㎎/㎏ 투약시에 각각, 1,559 ± 252 내지 854 ± 86, 346.5 ± 24 ㎣ 및 65 ± 3.4 ㎣)(p=0.0012, 도 1OA와 10B). 도 10A에서 화살표는 간내 전이(intrahepatic metastasis)를 지시한다. 주 간격으로 측정된 체중은 생존(well-being)과 생존 실패에 대한 대리자로서 이용되었다. 연구 기간 동안 이들 두 군 사이에 평균 체중에서 유의한 차이는 관찰되지 않았다.

이에 더하여, 7BD-33-11A는 사람 HCC의 확립된 정위 모형에서 간내와 폐 전 이를 유의하게 억제하였다. 치료군과 이소타입 대조군에서 폐와 간내 전이를 나타내는 생쥐의 수는 도 11B에 도시된다. 도 11A에서 화살표는 폐 전이를 지시한다. 7BD-33-11A는 2 ㎎/㎏의 용량에서 4/5(80%)에서 1/5(20%)로 간내 전이를 유의하게 억제하였다. 7BD-33-11A는 또한, 2 ㎎/㎏ 용량에서 5/5(100%)에서 1/5(20%)로 폐 전이를 유의하게 억제하였다. 이소타입 대조군에서 모든 생쥐는 신장 또는 비장 전이를 보이지 않았다.

요약하면, 7BD-33-11A는 충분히 관용되고, 확립된 사람 정위 HCC 종양 모형에서 종양 부하 및 간내와 폐 전이의 가능성(probability)을 감소시켰다.

실시예 8

MHCC-97H 세포를 이용한 전이성 HCC 종양 모형

상기 모형에서 폐와 간내 전이에 대한 7BD-33-11A의 효과는 간접적인 효과의 결과일 수도 있다; 원발성 종양의 감소는 아마도 더욱 적은 전이를 결과한다. HCC에 대한 7BD-33-11A의 항-전이 효능을 더욱 평가하고 7BD-33-11A가 전이의 존재에 직접적인 영향을 주는 지를 결정하기 위하여, 전이성 HCC 종양 모형을 이용하였다. 도 12를 참조하면, 0.1 ㎖의 배양 배지에서 대략 2 X 10⁶개 사람 전이성 MHCC-97H 세포를 꼬리 정맥 주사를 통하여, 5주령 수컷 누드 생쥐(University of Hong Kong의 Lab Animal Unit, Hong Kong)의 정맥내 주입하였다. 그 다음날, 이들 누드 생쥐는 각 5마리의 군으로 무작위 분할하고 이소타입 대조(concentration , what antibody , from where), 또는 5 또는 10 ㎎/㎏ 7BD-33-11A로 치료하였다. 7BD-33- 11A 시험 항체는 2.7 mM KCl, 1 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl과 20 mM Na₂HPO₄를 포함하는 희석제로 원액 농도(stock concentration)로부터 희석후, 200 ㎕ 부피로 각 무리에 복강내 투여하였다. 이들 항체는 이후, 2개월동안 동일한 방식으로 총 12회 투약을 위하여 주2회 투여하였다. 2개월후, 이들 동물은 희생시키고, 부검하고, 누드 생쥐의 폐와 간 모두에서 종양 형성을 검사하였다.

7BD-33-11A는 확립된 전이성 HCC 종양 모형에서 간과 폐 전이를 유의하게(p<O.001) 억제하였다. 7BD-33-11A는 5와 10 ㎎/㎏의 용량 각각에서, 간 전이를 5/5(100%)에서 1/5(20%)와 0/5(0%)로 유의하게 억제하였다(도 12A와 12C). 7BD-33-11A는 5와 10 ㎎/㎏의 용량 각각에서, 폐 전이를 5/5(100%)에서 0/5(0%)와 0/5(0%)로 유의하게 억제하였다(도 12B와 12C).

요약하면, 7BD-33-11A는 충분히 관용되고, 확립된 사람 정위 HCC 종양 모형에서 간내와 폐 전이의 가능성을 감소시켰다. 이는 실시예 7로부터 데이터를 더욱 뒷받침하고, 7BD-33-11A 치료가 원발성 종양의 종양 크기를 감소시킬 뿐만 아니라 이차 부위에서 종양의 개시를 예방한다는 것을 증명한다.

이러한 우세한 증거는 7BD-33-11A가 간암에서 발현되는 CD63에 존재하는 에피토프의 결찰을 통하여 항암 효과를 전달하는 것을 증명한다. 간암 환자의 경우에, CD63 발현은 전체 환자 생존(overall patient survival)과 반비례하는 것으로 밝혀졌다. 이에 더하여, 원발성 사람 간암 조직 샘플과 세포주에 비하여 전이성 간암 조직 샘플과 세포주에서 CD63의 더욱 높은 발현이 관찰된다. 또한, 7BD-33-11A 는 시험관내에서 CD63⁺ 사람 간암 세포의 성장, 이동과 침입을 감소시키고, 생체내에서 사람 간암의 종양 부하와 전이 가능성을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 이런 이유로, 7BD-33-11A는 넓은 의미에서 간세포(hepatocyte)로부터 발생하는 임의의 원발성 또는 전이성 종양 부위를 포함하는 것으로 이해되는 간암의 진단과 치료를 위한 치료 포텐셜(therapeutic potential)을 갖는다.

본 명세서에 언급된 모든 특허와 간행물은 본 발명이 속하는 당분야에서 당업자의 수준을 지시한다. 모든 특허와 간행물은 본 명세서에서 독립적으로, 동일한 정도로 참조로서 편입된다.

본 발명의 특정 형태가 예시되긴 하지만, 본 발명은 본 명세서에 기술되고 도시된 특정 형태 또는 일부 배열에 한정되지 않는다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 다양한 개변이 가능하고, 본 발명은 본 명세서에 기술되고 도시된 것에 한정되지 않는다. 당업자는 본 발명이 본 명세서에 언급된 것뿐만 아니라 여기에 내재된 목적을 수행하고 이점을 획득하기 위하여 개조될 수 있음을 용이하게 인지할 것이다. 본 명세서에 기술된 임의의 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 생물학적으로 관련된 화합물, 방법, 절차 및 기술은 바람직한 구체예를 대표할 뿐이며, 본 발명의 범위를 한정하지 않는다. 본 발명의 기술적 사상 내에 포섭되고 첨부된 특허청구범위에 의해 정의되는 변화 및 다른 용도는 당업자에게 자명할 것이다. 본 발명이 특정의 바람직한 구체예와 관련하여 기술되긴 했지만, 청구되는 본 발명은 이런 특정 구체예에 부당하게 한정되지 않는다. 실제로, 당업자에게 명백한, 본 발명을 수행하기 위한 앞서 기술된 양식의 다양한 개변은 아래의 특허청구범위 내에 속하는 것으로 간주된다.

Claims (22)

1. 원발성 사람 종양 부위 및 전이성 부위를 치료하는 방법에 있어서, 원발성 사람 종양 또는 전이성 종양은 ATCC에 기탁된 기탁번호 PTA-4890 또는 이의 CDMAB의 클론에서 생산되는 분리된 단클론 항체에 특이적으로 결합하는 항원의 최소 한 개의 에피토프를 발현시키고, 이 항원은 분리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB가 이의 표적 항원에 결합을 경쟁적으로 저해하는 능력이 있으며, 치료 방법은 포유류에 분리된 단클론 항체 항체 또는 이의 CDMAB를 포유류의 종양 부하 감소를 결과하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계로 구성된 방법.
2. 청구항 1항에 있어서, 분리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB는 세포독성 모이어티에 콘쥬게이트 된 방법.
3. 청구항 1항에 있어서, 세포독성 모이어티는 방사능활성 동위원소인 방법.
4. 청구항 1항에 있어서, 분리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB는 컴플리먼트를 활성화시키는 방법.
5. 청구항 1항에 있어서, 분리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB는 항체 의존적 세포의 세포독성을 중재하는 방법.
6. 청구항 1항에 있어서, 분리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB는 인화항체인 방법.
7. 청구항 1항에 있어서, 분리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB는 키메라형인 방법.
8. 포유류에서 항체 유도된 세포의 세포독성에 민감한 원발성 사람 종양 부위 및 전이성 부위를 치료하는 방법에 있어서, 원발성 사람 종양 또는 전이성 종양은 ATCC에 기탁된 기탁번호 PTA-4890 또는 이의 CDMAB의 클론에서 생산되는 분리된 단클론 항체에 특이적으로 결합하는 항원의 최소 한 개의 에피토프를 발현시키고, 이 항원은 분리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB가 이의 표적 항원에 결합을 경쟁적으로 저해하는 능력이 있으며, 치료 방법은 포유류에 분리된 단클론 항체 항체 또는 이의 CDMAB를 포유류의 종양 부하 감소를 결과하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계로 구성된 방법.
9. 청구항 8항에 있어서, 분리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB는 세포독성 모이어티에 콘쥬게이트 된 방법.
10. 청구항 8항에 있어서, 세포독성 모이어티는 방사능활성 동위원소인 방법.
11. 청구항 8항에 있어서, 분리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB는 컴플리먼트를 활성화시키는 방법.
12. 청구항 8항에 있어서, 분리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB는 항체 의존적 세포의 세포독성을 중재하는 방법.
13. 청구항 8항에 있어서, 분리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB는 인화항체인 방법.
14. 청구항 8항에 있어서, 분리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB는 키메라형인 방법.
15. ATCC에 기탁된 기탁번호 PTA-4890의 하이브리도마 세포주 7BD-33-11A에 의해 생산된 분리된 단클론 항체에 특이적으로 결합하는 사람 CD63의 에피토프를 발현시키는 사람 암 종양을 치료하는 방법에 있어서,

    상기 사람 암으로 고통을 받은 개체에 분리된 최소 한 개 단클론 항체 또는 ATCC에 기탁된 기탁번호 PTA-4890의 하이브리도마 세포주 7BD-33-11A에 의해 생산된 분리된 단클론 항체가 인지하는 동일한 에피토프를 인지하는 이의 CDMAB를 투여하고;

    에피토프의 결합으로 종양 부하(tumor burden)의 감소를 결과하는 것으로 구성된 방법.
16. ATCC에 기탁된 기탁번호 PTA-4890의 하이브리도마 세포주 7BD-33-11A에 의해 생산된 분리된 단클론 항체에 특이적으로 결합하는 사람 CD63의 에피토프를 발현시키는 사람 암 종양을 치료하는 방법에 있어서,

    상기 사람 암으로 고통을 받은 개체에 분리된 최소 한 개 단클론 항체 또는 ATCC에 기탁된 기탁번호 PTA-4890의 하이브리도마 세포주 7BD-33-11A에 의해 생산된 분리된 단클론 항체가 인지하는 동일한 에피토프를 인지하는 이의 CDMAB를 투여하고;

    투여로 종양 부하(tumor burden)의 감소를 결과하는 것으로 구성된 방법.
17. 사람 암 종양에서 선택된 조직 샘플에서 암 세포의 존재를 결정하는 결합 검사에서, 암세포는 ATCC에 기탁된 기탁번호 PTA-4890의 하이브리도마 세포주 7BD-33-11A에 의해 생산된 분리된 단클론 항체가 특이적으로 결합하는 사람 CD63 항원의 에피토프를 발현시키며;

    이 검사 방법은

    상기 최소 하나의 분리된 단클론 항체 또는 ATCC에 기탁된 기탁번호 PTA-4890의 하이브리도마 세포주 7BD-33-11A에 의해 생산된 분리된 단클론 항체가 인지하는 것과 동일한 에피토프를 인지하는 CDMAB를 제공하고;

    최소 하나의 분리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB와 사람 조직 샘플을 접촉시키고; 그리고

    최소 하나의 분리된 단클론 항체 또는 이의 CDMAB와 사람 조직 샘플의 결합을 측정하고, 이때 결합은 조직 샘플에서의 암 세포 존재의 지표가 되는 것으로 구성된 검사 방법.
18. 청구항 1항에 있어서, 원발성 사람 종양 부위 또는 전이성 부위는 간 세포에서 유래된 방법.
19. 청구항 8항에 있어서, 원발성 사람 종양 부위 또는 전이성 부위는 간 세포에서 유래된 방법.
20. 청구항 15항에 있어서, 사람 암 종양은 간세포에서 유래된 방법.
21. 청구항 16항에 있어서, 사람 암 종양은 간세포에서 유래된 방법.
22. 청구항 17항에 있어서, 사람 암 종양은 간세포에서 유래된 방법.

Images