KR20090055387A - 아보카도 추출물을 포함하는 기능성 식품 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항산화 활성 및 아포토시스(apoptosis) 유도 활성을 갖는 기능성 식품 조성물을 제공하는바, 아보카도의 메탄올 추출물을 함유함으로써, 궁극적으로는 암, 심장병, 노화 등의 예방에 효과적이면서, 특히 호르몬 비의존성 유방암의 예방에 효과적인 식품을 제공할 수 있다.
아보카도, 항산화제, 총 폴리페놀, 아포토시스
Description
본 발명은 아보카도 추출물을 포함하여 항산화 활성 및 아포토시스(apoptosis) 유도 활성을 갖는 기능성 식품 조성물에 관한 것이다.
암과 심장병을 포함하는 만성적인 질환들은 세포에 산화적 손상을 수반하는 것으로 알려져 있다. DNA에 손상을 유발할 수 있는 프리라디칼(free-radical)은 발암, 심장병 그리고 노화에 관계된 다른 많은 건강상의 문제를 유발하고 있다(Cadenas E, Davies KJA. Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging. Free Radical Biol. Med. 29: 222-230 (2000); Marnett L. Oxyradicals and DNA damage. Carcinogenesis 21: 361-370 (2000); Uchida K. Role of reactive aldehyde in cardiovascular diseases. Free Radical Biol. Med. 28: 1685-1696 (2000) 등 참조). 이러한 프리라디칼은 자외선, 전리방사선, 화학반응 그리고 신진대사 과정에서 생성된다(Visioli F, Kearey JF, Halliwell B. Antioxidant and cardiovascular diseases: panaceas or tonics for tired sheep. Cardiovasc. Res. 47: 409 (2000) 참조).
프리라디칼에는 superoxide radical anion (·O2 -), hydroxyl radicals (·OH), singlet oxygen (1O2), hydrogen peroxide (H2O2) 가 있고, 이들 가운데 hydroxyl radicals (·OH)의 손상 반응이 가장 강하게 작용하는 것으로 알려져 있다(Liu F, Ng TB. Antioxidative and free radical scavenging activities of selected medicinal herbs. Life Sci. 66: 725-735 (2000) 참조).
생체에는 이러한 프리라디칼에 방어하는 Superoxide dismutase (SOD), Glutathione peroxidase (GPX), Catalase (CAT), Methionine reductase, Ascorbate peroxidase, Glutathione-S-transferase 등의 항산화 효소를 가지고 있어 산소 상해에 대한 방어기능을 하고 있지만(Aischer RG, Hess JL. Antioxidants in higher plants, CRC Press. Boca Raton. 1-17 (1993) 참조), 과도한 스트레스에 노출되어 있는 현대인의 복잡한 생활 속에서 더욱 효과적이고 안전한 식이성 항산화제의 필요가 절실해지고 있다. 그러므로 천연물질을 대상으로 항산화, 항암성에 대한 연구가 시도되고 있으며 항산화와 항암에 우수한 물질을 찾아내고(Cheng GC, Lee JY, Kim DC, Suh SO and Hwang WI. Inhibitory effect of Salvia miltiorhiza extract on growth of some cancer cells. J. Kor. Soc. Food Sci. Nutr. 29: 726-731 (2000) 참조), 그에 대한 생리 활성을 조사하여 천연물에서 추출하는 연구가 활발 하게 이루어지고 있다(Ji WD, Jeong HAC, Lee SJ, Chun, YG. Antimicrobial activity and distilled components of garlic and ginger. J. Agric. Chem. Biotechnol. 40: 514-518 (1997) 참조).
한편 아보카도( Persea americana Mill.)는 식물학적으로 Lauraceae과에 속하는 과수로서, 멕시코와 중앙 아메리카 일대에서 유래되었다고 알려져 있다. 아보카도의 품종은 약 50여개로 알려져 있으며, 모두가 Perse a americana Mill. Syn. P. gratissima Gaertn에 속한다(Brucher H. Tropische Nutzpflanzen. Springer, Berlin, 348-351 (1977); Lahav E, Kadman A. Avocado Fertilisation, IPI-Bullectin No. 6, Bern (1980); Rehm S, Espig G. Die Kulturpflanzen der Tropen und Subtropen. Ulmer, Stuyygart, 159-182 (1984) 참조).
아보카도는 유질(油質)의 과일이며(Lewis CE, Morris R, O'Brien K. The oil content of avocado mesocarp. J. Sci. Food Agric. 29: 943-949 (1978) 참조), 이 중 식용되는 부분의 지질함량이 25%정도이며(Hierro MT, Tomas MC, Fernandez-Martin F, Santa-Maria G. Determination of the triglyceride composition of avocado oil by highperformance liquid chromatography using a light-scattering detector. J. Chromatogr. 607: 329-338 (1992) 참조), 아보카도의 지질 중 가장 우수한 지방산은 단일불포화 지방산이다(Swhisher HE. Avocado oil from food use to skin care. J. Am. Oil Chem. Soc. 65: 1704-1706 (1988) 참조). 이와 같은 단일불포화 지방산은 혈청지질을 포함한 심혈관 질환에 이익을 주기위해 연구되어오고 있다(Alvizouri-Munoz M, Carracza-Madrigal J, Herrera-Abarca JE, Chavez- Carbajal F, Amezcua-Gastelum JL. Effects of avocado as a source of monounsaturated fatty acids on plasma lipid levels. Arch. Med. Res. 23: 163-167 (1992); Carranza J, Alvizouri M, Alvarado MR, Chavez F, Gomez M, Herrera JE. Effects of avocado on the level of blood lipids in patients with phenotype Ⅱ and Ⅳdyslipidemias. Arch. Inst. Caridiol. Mex. 65: 342-348 (1995); Colquhoun DM, Moores D, Somerset SM, Humphries JA. Comparison of the effects on lipoproteins and apolipoproteins of a diet high in monounsaturated fatty acids, enriched with avocado, and a highcarbohydrate diet. Am. J. Clin. Nutr. 56: 671-677 (1992) 참조).
아보카도는 단일불포화 지방산의 함량이 높고, 카로티노이드류, 비타민 B, C, E, 테르페노이드류, D-만노-헵툴로즈(D-manno-heptulose), β-시토스테롤(sitosterolβ-sitosterol), 페르세논 A, B(persenone A,B), 페놀류 등의 생물체에 작용하는 화학물질이 들어있는 것으로 알려져 있는데(Lassen D, Bacon K, Sutherland J. Chromatographic investigation of the carotenoid pigments of the avocado. Food Res. 9: 427-433 (1994); Slater GG, Shankman S, Shepherd JS, Alfin-Slater RB. Seasonal variation in the composition of California avocados. J. Agric. Food Chem. 23: 468-474 (1975); Moreno AO, Dorantes L, Galindez J, Guzman RI. Effect of different extraction methods on fatty acids, volatile compounds, and physical and chemical properties of avocado (Persea americana Mill.) oil. J. Agric. Food Chem. 51: 2216-2221 (2003); Shaw PE, Wilson Ⅲ CW, Knight JRJ. High-performance liquid chromatographic analysis of D-manno-heptulose, perseitol, glucose, and fructose in avocado cultivars. J. Agric. Food Chem. 28: 379-462 (1980); Duester KC. Avocado fruit is a rich source of beta-sitosterol. J. Am. Diet Assoc. 101: 404-405 (2001); Kim OK, Murakami A, Nakamura Y, Takeda N, Yoshizumi H, Ohigashi H. Novel nitric oxide and superoxide generation inhibitors, persenone A and B, from avocado fruit. J. Agric. Food Chem. 48: 1557-1563 (2001); Vinson JA, Su X, Zubik L, Bose P. Phenol antioxidant quantity and quality in foods: fruits. J. Agric. Food Chem. 49: 5315-5321 (2000) 참조), 아보카도 과일 그리고 추출물 혹은 각각의 성분 안에 포함된 이러한 화학 물질들은 항산화, acetyl CoA carboxylase 저해, 항균활성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다(Kim OK, Murakami A, Nakamura Y, Ohigashi H. Screening of edible Japanese plants for nitric oxide generation inhibitory activities in RAW 264.7 cells. Cancer Lett. 125: 199-207 (1998); Hashimura H, Ueda C, Kawabata J, Kasai T. Acetyl-CoA carboxylase inhibitors from avocado (Persea americana Mill.) fruits. Biosci. Biotechnol. Biochenol. Biochem. 65: 1656-1658 (2001); Prusky D, Kobiler I, Fishman Y, Sims JJ, Midland SL, Keen NT. Identification of an antifungal compound in unripe avocado fruits and its possible involvement in the quiescent infections of Collectotrichum gloeosporioides. J. Phytophanthol 132: 319-27 (1991) 참조).
게다가 아보카도는 저칼로리, 저염, 그리고 저지방을 제공하는 과일로, 현대인의 식생활에 건강 식이로 기대되고 있는 식품이다.
본 발명은 아보카도의 기능성 소재로서의 이용가능성을 알아보기 위해, 아보카도의 과육, 씨, 껍질을 각각 분리한 후 추출물을 제조하여 이들 각각의 항산화 효과를 연구하고, 인간유래 유방암 세포주인 MDA-MB-231 세포주를 사용하여 항암활성을 살핌으로써, 이를 포함하는 기능성 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 한 구현 예에서는 아보카도의 메탄올 추출물을 포함하는 항산화 활성 및 아포토시스 유도 활성을 갖는 기능성 식품 조성물을 제공한다.
이때, 아보카도의 메탄올 추출물을 0.15중량% 이상으로 포함할 수 있다.
또한, 아보카도의 메탄올 추출물을 0.7중량% 이상으로 포함할 수 있다.
또한, 아보카도의 메탄올 추출물을 17.9중량% 이상으로 포함할 수 있다.
본 발명의 어떤 한 구현 예에서는 아보카도의 메탄올 추출물은 아보카도 껍질의 메탄올 추출물일 수 있다.
본 발명의 다른 한 구현 예에서는, 아보카도의 메탄올 추출물은 아보카도 씨의 메탄올 추출물일 수 있다.
본 발명의 또 다른 한 구현 예에서는, 아보카도의 메탄올 추출물은 아보카도 과육의 메탄올 추출물일 수 있다.
본 발명의 구현 예에서는, 식품학적으로 허용가능한 첨가제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 기능성 식품 조성물은 호르몬 비의존성 유방암 MDA-MB-231 세포주의 아포토시스 유도 활성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명에 따르면, 특히 아보카도의 씨 추출물을 포함하는 기능성 식품 조성물은 호르몬 비의존성 유방암 MDA-MB-231 세포주의 아포토시스 유도 활성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명에 따르면 항산화 활성을 가지면서 아포토시스 유도 활성을 갖는 아보카도 메탄올 추출물을 제공하고, 이를 식품 조성물 중에 첨가함으로써 궁극적으로는 암, 심장병, 노화 등의 예방에 효과적인 식품을 제공할 수 있고, 특히 호르몬 비의존성 유방암의 예방에 효과적인 식품을 제공할 수 있다.
또한 향후 본 발명에 뒤따라 이들 활성성분들의 규명과 인체실험과 더불어 아보카도 씨에 대한 독성평가가 병행된다면 항암과 관련된 기능성 식품과 치료제 등의 개발에 있어 천연소재로서 아보카도 씨의 유용성을 기대할 수 있다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 아보카도 추출물을 포함하는 기능성 식품 조성물, 특히 아보카도의 메탄올 추출물을 포함하는 항산화 활성 및 아포토시스 유도 활성을 갖는 기능성 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 기능성 식품 조성물에 있어서 항산화 활성 및 아포토시스 유도 활성의 효능을 발현하기 위한 최소의 함량은 전체 조성 중 0.15중량% 이상일 수 있는데, 항산화 활성 및 아포토시스 유도 활성의 정도에 따라서 부위별로 그 함량은 다소 달라질 수 있다. 좋기로는 껍질로부터 유래된 추출물의 경우는 전체 조성물 중 0.15중량% 이상이며, 씨의 추출물인 경우는 전체 조성 중 0.7중량% 이상이며, 그리고 과육 추출물의 경우는 전체 조성물 중 17.9중량% 이상이면 목적하는 활성의 발현을 기대할 수 있다.
특히 본 발명에서 아포토시스 유도 활성은 호르몬 비의존성 유방암 MDA-MB-231 세포주의 아포토시스 유도에 큰 영향을 미친다.
아포토시스(apoptosis)는 세포가 유전자에 의해 제어되어 죽는 방식의 한 형태로, 세포의 괴사나 병적인 죽음인 네크로시스와는 구별된다. 아포토시스는 발생 과정에서 몸의 형태 만들기를 담당하고, 성체에서는 정상적인 세포를 갱신하거나 이상이 생긴 세포를 제거하는 일을 담당하고 있다.
1972년 Kerr 등이 쥐의 유방암세포가 죽는 것을 관찰한 후 Shrinkage necrosis라고 표현하였다가 그리스어의 falling off 뜻을 가진 apo(off)와 ptosis(falling)의 합성어인 apoptosis라고 처음 명명하였다.
이하에서는 아보카도로부터 추출물을 얻는 방법, 그리고 이에 대한 효능 효과 실험에 대해 구체 기술한다.
재료 및 방법
시료제조
본 실험에서 사용한 아보카도는 일반 대형마트에서 구매한 것으로 깨끗이 수세하여 과육과 씨, 껍질로 각각 분리한 후 분쇄기로 각각 분쇄하여 80% 메탄올로 3회 반복 추출하였고 추출액은 여과지 (Whatman No.3 England)를 사용하여 여과하고 rotary vacuum evaporator (BUCHI Rotavapor R-205 Switzerland)로 감압농축한 후 동결 건조하여 아포토시스(apoptosis) 유도와 항산화 활성검정에 사용하였다.
분석 및 평가방법
(1) 총 폴리페놀 함량
총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법(Folin O, Denis W. On phosphotungstic-phosphomolybdic compounds as color reagents. J. Biol. Chem. 12: 239-249 (1912) 참조)을 응용하였다. 각 메탄올 추출물 시료 1 mg을 증류수 1 mL에 녹이고 10배 희석한 희석액 2 mL에 2배 희석한 Folin 시약 2 mL을 첨가하고 잘 혼합한 후 3분간 방치한 후 10% Na2CO3 2 mL을 넣고 1시간 반응시킨 다음 UV/Visible spectrophotometer(UVIKON 922, Kontron, Italy)를 사용하여 700 nm에서 흡광도를 측정하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다. 이때 탄닌산(tannic acid)을 이용한 표준곡선은 탄닌산의 최종농도가 5, 25, 50 μg/mL가 되도록 하여 위와 같은 방법으로 700 nm에서 흡광도를 측정하여 작성하였다.
(2) 총 플라보노이드 함량
시료 중의 총 플라보노이드 함량은 Nieva Moreno 등의 방법(Nieva MM, Sampietro AR, Vattuone MA. Comparison of the free radical-scavenging activity of propolis from several regions of Argentina. J. Ethnopharmacol. 71: 109-114 (2000) 참조)을 이용하여 측정하였다.
각 시료 추출물 0.1 mL와 80% 에탄올 0.9 mL을 혼합한 혼합물 0.5 mL에 10% 알루미늄 니트레이트(aluminium nitrate)와 1 M 포타슘 아세테이트 0.1 mL, 그리고 80% 에탄올 4.3 mL을 가하여 실온에 40분 방치한 뒤 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 총 플라보노이드 함량은 쿼세틴(quercetin)을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다.
(3) α-α-Diphenyl-β-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거활성
시료의 프리라디칼 소거 활성은 안정한 라디칼(stable radical)인 α-α-Diphenyl-β-picrylhydrazyl(DPPH)에 대한 환원력을 측정한 것으로, 99% 메탄올에 각 시료를 녹여 농도별로 희석한 희석액 800 μL와 메탄올에 녹인 0.15 mM DPPH 용액 200 μL를 가하여 실온에 30분 방치한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료 추출물의 자유라디칼 소거활성은 시료를 첨가하지 않은 대조구의 흡광도를 1/2로 환원시키는데 필요한 시료의 농도인 RC50 값으로 나타내었다. 이때 활성비교를 위하여 BHA와 아스코르브산(ascorbic acid)을 사용하였다.
(4) ABTS 라디칼 소거활성
ABTS 라디칼을 이용한 항산화력 측정은 ABTS+ · cation decolorization assay 방법(Re R, Pellegrini N, Proteggente A, Pannala A, Yang M, Rice-Evans C. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radical Biol. Med. 26: 1231-1237 (1999) 참조)에 의하여 시행하였다. 7 mM 2,2-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-술폰산)(2,2-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid), ABTS, Sigma Chemical Co., USA)와 2.45 mM 포타슘 퍼설페이트를 최종농도로 혼합하여 실온인 암소에서 24시간 동안 방치하여 ABTS+·을 형성시킨 후 732 nm에서 흡광도 값이 0.70(± 0.02)이 되게 포스페이트 완충액(phosphate buffer saline, PBS, pH 7.4)로 희석하였다. 희석된 용액 990 μL에 sample 10 μL를 가하여 정확히 1분 동안 방치한 후 흡광도를 측정하였으며 모든 실험은 3회 반복 측정하였다.
(4) 아포토시스 유도 효과
MDA-MB-231 세포주를 6-well plate에 1× 106 cells/5mL로 분주하고 아보카도 추출물을 처리한 후 24시간 배양하였다. 배양한 세포를 120× g에서 1분간 원심분리하여 상등액을 제거한 다음 그 침전물에 라이시스 완충액(lysis buffer, 50mM Tris-CI, 1mM EDTA, 1% Triton X-100, 0.16 μM PMSF) 50 μL를 첨가하여 -70℃에서 라이시스(lysis)시킨다. 4℃에서 16,609× g로 10분간 원심분리하여 그 상등액으로 BCA kit를 사용하여 단백질을 정량하여 Wstern blotting법 이용하여 아포토시스 유도 효과를 관찰하였다.
(5) DNA 분절화 분석(fragmentation assay)
아보카도 추출물에 의해 아포토성(apoptotic) DNA 분절(fragmentation)이 일어나는지 알아보기 위해 DNA 분절 분석(fragmentation assay)을 실행하였다. MDA-MB-231 세포주를 6-well plate에 1× 106 cells/5mL로 분주하고 아보카도 추출물을 처리한 후 24시간 배양하였다. 그리고 세포를 수확한 다음 차가운 PBS를 넣고 원심 분리하여 배지를 제거한 후 침전된 세포를 25 mM EDTA, 0.5% SDS가 첨가된 100 mM Tris-HCl (pH 8.0)를 이용하여 재현탁(resuspension)한 후 65℃에서 5분 동안 방치시켰다. 페놀/클로로포름 (1:1)과 클로로포름/이소아밀 알콜(1:24)을 이용하여 DNA를 추출하였고, 여기에 95% 에탄올을 첨가하고 원심 분리하여 DNA를 침전시키고 상층액을 제거한 후 10분 동안 반응시켜 RNA를 완전히 가수분해 시키고 2% 아가로즈 겔에 DNA를 전기 영동하여 DNA ladder를 확인하였다.
결과 및 고찰
(1) 폴리페놀 및 플라보노이드 함량
폴리페놀 화합물이나 플라보노이드류는 여러 가지 식품에 분포되어 있으며 천연항산화제로 작용할 수 있다는 연구들이 행해져 왔다(Sato M, Ramarathnam N, Suzuki Y, Ohkubo T, Takeuchi M, Ochi H. Varietal differences in the phenolic content and superoxide radical scavenging potential of wines from different sources. J. Agric. Food Chem. 44: 37-41 (1996); Bors W. Saran M. Radical scavenging by flavonoid antioxidants. Free Rad. Res. Comm. 2: 289-294 (1987) 참조).
먼저 아보카도의 과육과 씨 및 껍질의 메탄올 추출물에 존재하는 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 각각 탄닌산(tannic acid), 쿼세틴(quercetin)을 기준물질로 하여 측정하였다. 그 결과를 다음 표 1로 나타내었다.
| 추출 부위 | 총 폴리페놀 함량1) (μg/mg) | 총 플라보노이드 함량2) (μg/mg) | |
| 아보카도 | 과육 | 13.89± 4.983) | 4.03± 1.80 |
| 씨 | 137.2± 9.72 | 5.69± 1.20 | |
| 껍질 | 223.45± 19.20 | 13.60± 0.37 |
1) 탄닌산을 기준물질로 한 값.
2) 쿼세틴을 기준물질로 한 값.
3) 각 값은 평균± 표준편차(n≥3).
상기 표 1의 결과로부터, 아보카도과육 추출물의 총 폴리페놀 함량은 13.89 μg/mg, 아보카도씨 추출물은 137.2 μg/mg, 아보카도껍질 추출물은 223.45 μg/mg으로 아보카도과육에 비해 아보카도씨와 껍질에서 높은 폴리페놀 함량을 보임을 알 수 있다. 또한 총 플라보노이드 함량은 아보카도 과육과 씨, 껍질 추출물에서 각각 4.03, 5.69, 13.6 μg/mg으로 아보카도껍질 추출물에서 가장 높은 함량을 보였다. 그러나 플라보노이드 함량은 높은 폴리페놀 함량에 비해서 낮게 나타났다.
결과적으로 아보카도 씨와 껍질 추출물은 과육에 비해 상당히 많은 폴리페놀을 함유하고 있는 것으로 나타났다.
(2) DPPH 자유라디칼 소거활성
시료의 자유라디칼 소거활성 측정은 안정한 라디칼인 DPPH(α, α-diphenly-β-picrylhydrazyl radicals)를 소거하는 항산화물질 활성을 측정하는 것으로, DPPH는 짙은 자색을 띄는 비교적 안정한 자유라디칼로서 항산화제, 방향족 아민류 등에 의해 환원되어 색이 탈색되는 것을 이용하여 항산화물질을 검색하는데 이용되고 있다.
아보카도 과육과 씨 및 껍질의 메탄올 추출물과 BHA(butylated hydroxyanisole), 아스코르브산의 DPPH 소거 활성을 농도별로 측정하여 비교하여 다음 표 2로 나타내었다.
| 구분 | 추출부위 | 농도 (μg/mL) | 소거효율(%) | RC50 1) (μg/mL) |
| 아보카도 | 과육 | 100 | 21.39± 1.582) | 179.92± 14.73 |
| 200 | 58.62± 3.60 | |||
| 씨 | 5 | 30.42± 5.04 | 7.78± 0.81 | |
| 10 | 70.10± 8.07 | |||
| 껍질 | 1 | 15.04± 1.42 | 3.83± 0.76 | |
| 5 | 60.42± 0.12 | |||
| BHA | 1 | 25.45± 8.21 | 3.11± 1.15 | |
| 10 | 96.34± 0.29 | |||
| 아스코르브산 | 1 | 14.27± 1.26 | 2.09± 1.03 | |
| 10 | 96.52± 1.3 |
1) 반응 개시 후 30분에서의, DPPH· 의 50% 소거를 위해 요구되는 농도
2)각 값은 평균± 표준편차(n≥3).
상기 표 2에서와 같이, 10 μg/mL의 농도에서 아보카도 씨가 70%, 5 μg/mL에서 껍질이 60% 정도의 소거능을 보였고, BHA와 아스코르브산(10 μg/mL)에서 96% 정도의 항산화능을 보였다. 그리고 아보카도 씨와 껍질 메탄올 추출물의 RC50 값이 각각 7.78, 3.83 μg/mL으로 합성 항산화제인 BHA의 RC50 값인 3.11 μg/mL과 비슷한 값을 나타내는 것으로 보아 아보카도의 씨와 껍질에서 우수한 소거활성능을 가지고 있음을 확인하였다.
(3) ABTS free radical 소거활성
ABTS+· 소거활성은 ,2′-azino-bis(3-ethlbenzthiazoline-6-sulfonic acid)의 색을 띤 양이온 라디칼의 감소에 근거하여 항산화력을 검사하고자하는 시료와 표준물질인 트롤록스(Trolox)의 값과 비교하여 항산화능을 측정하는 방법으로 추출물의 항산화력에 의해 ABTS+·이 소거되어 청록색으로 탈색된 자유라디칼의 제거 정도를 흡광도 값으로 나타내어 ABTS+·의 소거활성능을 측정할 수 있고 탈색 반응이 1분 안에 종료되어 단시간에 측정 가능하다.
본 실험에서는 아보카도 과육과 씨 및 껍질의 메탄올 추출물과 Trolox, BHA, 아스코르브산의 ABTS+· 소거활성을 비교 측정하였다. 그 결과를 다음 표 3에 나타내었다.
| 구분 | 추출부위 | 농도(μg/mL) | 소거 효율(%) |
| 트롤록스 | 15 μM | 63.24± 0.941) | |
| 아보카도 | 과육 | 200 | 38.44± 2.27 |
| 300 | 51.30± 3.26 | ||
| 씨 | 10 | 36.98± 2.51 | |
| 20 | 67.76± 5.18 | ||
| 껍질 | 1 | 6.68± 0.79 | |
| 10 | 60.41± 2.64 | ||
| BHA | 1 | 19.04± 3.10 | |
| 10 | 99.38± 0.81 | ||
| 아스코르브산 | 1 | 25.57± 0.27 | |
| 10 | 99.86± 0.17 |
1)각 값은 평균± 표준편차(n≥3).
ABTS+· 소거활성법에서 표준물질로 사용되는 Trolox는 15 μM에서 63% 정도의 소거활성능을 보였고, BHA와 아스코르브산은 10 μg/mL에서 99% 이상의 우수한 소거활성능을 보였다. 아보카도 추출물에서는 씨가 20 μg/mL에서 67%, 껍질이 10 μg/mL에서 60%의 ABTS+·의 소거활성능을 보였다. 이는 DPPH 라디칼의 소거활성에 비해 그 활성능은 떨어지지만, DPPH 라디칼의 소거활성과 마찬가지로 껍질에서 더 우수하게 나타났다.
(4) 아보카도 추출물이 아포토시스 관련 단백질 발현에 미치는 영향
세포사멸 기전은 카스파아제(caspase)라고 하는 단백질 분해효소에 의해 세포 내 단백질이 분해되면서 신호가 전달되는 과정으로 여러 종류의 카스파아제들이 세포사멸에 관여하며 카스파아제의 활성을 통해 세포사멸의 정도를 파악할 수 있다(Alnemri ES. Mammalian cell death proteases: a family of highly conserved aspartate specific cysteine proteases. J. Cell Biochem. 64: 33-42 (1997) 참조). 최종적으로 활성화된 카스파아제-3는 바로 PARP를 활성화시키기도 하고 카스파아제-7을 활성화시킨 후 활성화된 카스파아제-7이 PARP를 활성화시키기도 한다. 이렇게 활성화된 PARP는 DNA 분절화 현상과 핵의 응축을 유도하면서 세포사멸을 일으키는 것으로 보고되고 있다(Soldani C, Scovassi AI. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 cleavage during apoptosis: an update. Apoptosis 7: 321-328 (2002) 참조).
아보카도 씨, 껍질 추출물이 아포토시스를 유도하는지 관찰하기 위하여 Western blot 방법을 시행하였다.
씨 추출물 처리군의 결과는 도 1에 나타내었고, 껍질 추출물 처리군의 결과는 도 2에 나타내었다.
도 1을 참조하면, 먼저 아보카도 씨 추출물을 처리한 실험군에서 카스파아제-3, -7의 단백질의 발현이 증가되는 것을 보였고, 아울러 세포사멸 기전의 최종 단계라고 볼 수 있는 PARP 단백질의 발현을 관찰한 결과 카스파아제 결과와 유사하게 증가되는 경향을 보였으며, 모두 200 μg/mL의 농도에서 단백질 발현이 나타나는 것을 알 수 있다.
도 2를 참조하면, 아보카도 껍질 추출물 처리군에서는 카스파아제-3 단백질의 발현이 나타났지만, 카스파아제-7에는 아무런 영향을 미치치 않았으며, 카스파아제-3가 직접적으로 PARP을 활성화시킨 것으로 보인다.
(5) DNA 분절화에 미치는 영향
아포토시스의 유도에 따라 핵은 엔도지니어스 뉴클레아제(endogeneous nuclease)의 활성에 의해 DNA 변성이 시작되어 응축이 일어나고 대부분의 세포에서 DNA가 변성되면 올리고뉴클레오좀(oligonucleosome) 정도의 크기로 분절된 DNA를 볼 수 있는데, DNA는 세포사가 일어나기 전 180~200 bp 길이로 단편화 된다고 한다. 이 DNA 단편의 역할은 아직 명확하게 규명되지는 않았지만 DNA 단편화가 아포토시스 현상 규명에 이용되고 있다(White E. Death-defying acts: A meeting reviwe on apoptosis. Genes cells 7: 2277 (1993) 참조).
아보카도 씨, 껍질 추출물에 의한 아포토시스를 확인하기 위하여 씨와 껍질 추출물을 농도 별로 처리하고 DNA 분절 현상을 조사하였다. 그 결과를 도 3으로 나타내었다.
껍질에서는 분절 현상이 나타나지 않았지만 씨 추출물의 100, 200 μg/mL의 농도에서 DNA 분절 현상이 명확히 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
결과적으로 아보카도 씨 추출물은 아포토시스 유도하는 유전자인 카스파아제에 영향을 미치는 것으로 보여지며, 순차적으로 DNA 분절을 활성화시켜 호르몬 비의존성 유방암 MDA-MB-231 세포주의 아포토시스의 유도에 큰 영향을 미치는 것으로 나타났다.
실시예 1: 기능성 음료의 제조
상기 시료제조에서와 같은 방법으로부터 얻어진 아보카도 메탄올 추출물(씨 추출물)을 분말화한 아보카도 추출물 분말 0.7중량%와 식용색소 0.05중량%, 오렌지 에센스 0.05중량%, 과당 7.0중량%, 구연산 0.1중량%, 비타민 C 0.05중량%를 포함하는 일반 기능성 음료 베이스를 첨가한 조성물을 제조한 다음, 정제수를 가하여 음료를 제조하였다.
실시예 2: 약술의 제조
탈취 정제된 40중량%의 알코올을 증류수로 희석하고, 상기 시료제조에서와 같은 방법으로부터 얻어진 아보카도 메탄올 추출물(껍질 추출물)을 분말화한 아보카도 추출물 분말 0.15중량%를 첨가하고, 스테비오사이드, 고과당, 아미노산, 구연산, 소금 등을 첨가하여 알코올 함유 농도 15 내지 30중량%로 제조하였다.
실시예 3: 건강 식품의 제조
상기 시료제조에서와 같은 방법으로부터 얻어진 아보카도 메탄올 추출물(씨 추출물)을 분말화한 아보카도 추출물 분말 1,000mg, 적량의 비타민 혼합물(비타민 A 아세테이트 70㎍, 비타민 E 1.0mg, 비타민 B1 0.13mg, 비타민 B2 0.15mg, 비타민 B6 0.5mg, 비타민 B12 0.2㎍, 비타민 C 10mg), 비오틴 10㎍, 니코틴산아미드 1.7mg, 엽산 50㎍, 판토텐산 칼슘 0.5mg, 적량의 무기질 혼합물(황산제1철 1.75mg, 산화아연 0.82mg, 탄산마그네슘 25.3mg, 제1인산칼륨 15mg, 제2인산칼슘 55mg, 구연산칼륨 90mg, 탄산칼슘 100mg, 염화마그네슘 24.8mg)을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용한다.
도 1은 MDA-MB-231 세포 내에서 카스파아제-3, 카스파아제-7 및 PARP의 단백질 농도에 아보카도 씨의 메탄올 추출물이 미치는 영향을 확인한 것으로, 이때 세포들은 서로 다른 아보카도 씨의 메탄올 추출물 농도((0, 10, 50, 100, 200 μg/mL)로 24시간 동안 처리한 것이다.
도 2는 MDA-MB-231 세포 내에서 카스파아제-3, 카스파아제-7 및 PARP의 단백질 농도에 아보카도 껍질의 메탄올 추출물이 미치는 영향을 확인한 것으로, 이때 세포들은 서로 다른 아보카도 껍질의 메탄올 추출물 농도((0, 10, 50, 100, 200 μg/mL)로 24시간 동안 처리한 것이다.
도 3은 아보카도 씨의 메탄올 추출물로 처리된 MDA-MB-231 세포주의 아포토시스성 DNA 분절화를 확인한 것으로, 이때 세포들은 서로 다른 아보카도 껍질의 메탄올 추출물 농도((0, 10, 50, 100, 200 μg/mL)로 24시간 동안 처리한 것이다.
Claims (10)
- 아보카도의 메탄올 추출물을 포함하는 항산화 활성 및 아포토시스 유도 활성을 갖는 기능성 식품 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 아보카도의 메탄올 추출물을 0.15중량% 이상으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화 활성 및 아포토시스 유도 활성을 갖는 기능성 식품 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 아보카도의 메탄올 추출물을 0.7중량% 이상으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화 활성 및 아포토시스 유도 활성을 갖는 기능성 식품 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 아보카도의 메탄올 추출물을 17.9중량% 이상으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화 활성 및 아포토시스 유도 활성을 갖는 기능성 식품 조성물.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 아보카도의 메탄올 추출물은 아보카도 껍질의 메탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 항산화 활성 및 아포토시스 유도 활성을 갖는 기능성 식품 조성물.
- 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 아보카도의 메탄올 추출물은 아보카도 씨의 메탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 기능성 식품 조성물.
- 제 1 항 또는 제 4 항에 있어서, 아보카도의 메탄올 추출물은 아보카도 과육의 메탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 기능성 식품 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 식품학적으로 허용가능한 첨가제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화 활성 및 아포토시스 유도 활성을 갖는 기능성 식품 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 기능성 식품 조성물은 호르몬 비의존성 유방암 MDA-MB-231 세포주의 아포토시스 유도 활성을 갖는 것임을 특징으로 하는 기능성 식품 조성물.
- 제 6 항에 있어서, 기능성 식품 조성물은 호르몬 비의존성 유방암 MDA-MB-231 세포주의 아포토시스 유도 활성을 갖는 것임을 특징으로 하는 기능성 식품 조성물.
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