KR20090052227A - 경쟁적 증폭 반응을 이용하여 표적 핵산을 검출하는 방법 - Google Patents

경쟁적 증폭 반응을 이용하여 표적 핵산을 검출하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 경쟁적 증폭 반응을 이용하여 표적 핵산을 검출하는 방법에 관한 것이다.
경쟁적 증폭반응, PCR, 프로브

Description

경쟁적 증폭 반응을 이용하여 표적 핵산을 검출하는 방법{Method of detecting a target nucleic acid by using a competitive amplification}
본 발명은 경쟁적 증폭 반응을 이용하여 표적 핵산을 검출하는 방법에 관한 것이다.
증폭반응을 이용한 표적 핵산을 검출하는 방법에는 외부 대조군 핵산을 이용하는 방법과 내부 대조군 핵산을 이용하는 방법이 있다. 외부 대조군 핵산을 이용하는 방법은 예를 들면, 미국특허 제6,358,679호에 개시되어 있다. 미국특허 제6,358,679호에는 표적 핵산 서열을 검출하는 방법으로서, (a) 하나 이상의 반응용기의 제1 세트 중의 프라이머 연장 시약으로 표적 핵산을 증폭하고, 하나 이상의 반응용기의 제2 세트 중의 프라이머 연장 시약으로 외부 대조군 핵산을 증폭하는 단계로서, 상기 프라이머 연장 시약은 포워드 프라이머, 리버스 프라이머, 하나 이상의 검출가능한 프로브, 중합효소, 및 하나 이상의 뉴클레오티드 5'-트리포스페이트를 포함하고, 상기 포워드 프라이머와 검출가능한 프로브는 상기 외부 대조군 핵산, 또는 그 상보체에 혼성화되는 경우 0 내지 5 뉴클레오티드 분리되고, 상기 리버스 프라이머와 검출가능한 프로브는 상기 외부 대조군 핵산, 또는 그 상보체에 혼성화되는 경우 0 내지 5 뉴클레오티드 분리되고, 상기 외부 대조군 핵산은 단일가닥으로서 증폭과정이 개시되고, 상기 외부 대조군 핵산은 표적 핵산 보다 길이가 작은 것이고, (b) 상기 하나 이상의 검출가능한 프로브로부터 신호를 검출하는 단계를 포함하는 방법이 개시되어 있다.
내부 대조군 핵산을 이용하는 방법에는, 미국특허 제5,667,974호 및 일본특허 공개 특개평제10-66597호에 개시된 방법이 있다. 예를 들면, 일본특허 공개 특개평제10-66597호에는, G형 간염 바이러스 게놈 RNA의 5' 말단 비번역 영역인 서열번호 1의 염기서열에 근거하여 설계된 프라이머를 사용하고, 측정대상의 cDNA를 기지량의 내부 표준 cDNA와 함께 경쟁적으로 증폭시켜, 양자 유래의 증폭산물량을 비교함으로써, G 형 간염 바이러스 양을 측정하는 것을 특징으로 하는, 경쟁 PCR법에 의한 G 형 간염 바이러스를 정량하는 방법이 개시되어 있다. 여기에서, 상기 내부 표준은, 증폭 영역의 일부분을 흠결시킨 cDNA를 삽입시킨 프라스미드인 것이 개시되어 있다.
이러한 종래 기술에 의하더라도, 보다 간단하고 신속하게 표적 핵산을 경쟁적 증폭방법을 이용하여 검출할 수 있는 방법이 여전히 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 경쟁적 증폭반응을 이용하여 시료 중의 표적 핵산 서열의 양을 측정하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은, 시료 중의 표적 핵산 서열의 양을 측정하는 방법으로서, (a) 상기 시료 및 내부 표준 핵산을 주형으로 하고, 상기 시료 중의 표적 핵산 및 상기 내부 표준 핵산에 공통적인 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여, 상기 표적 핵산과 상기 내부 표준 핵산을 경쟁적으로 증폭시키는 단계로서, 상기 내부 표준 핵산은 상기 표적 핵산 서열과 길이가 동일하고, 검출가능한 프로브가 결합하는 부위를 제외하고는 상기 표적 핵산과 서열이 실질적으로 동일한 것으로 사용되는 농도가 알려져 있는 것이고, 상기 증폭반응은 상기 검출가능한 프로브의 존재하에서 수행되고, 상기 검출가능한 프로브는 상기 표적 핵산에 특이적인 표적 프로브 및 상기 내부 표준 핵산에 특이적인 내부 표준 프로브를 포함하는 것인 단계; (b) 상기 표적 프로브 및 내부 표준 프로브로부터 발생하는 신호를 검출하는 단계; (c) 상기 표적 프로브로부터 발생하는 표적 신호 대 상기 내부 표준 프로브로부터 발생하는 표준 신호의 비를 결정하는 단계; 및 (d) 상기 표적 신호가 상기 표준 신호에 비하여 큰 경우, 상기 표적 핵산 서열이 상기 증폭반응에 사용된 상기 내부 표준 핵산의 농도보다 높은 것으로 결정하고, 상기 표적 신호가 상기 표준 신호의 크기와 동일한 경우, 상기 표적 핵산 서열이 상기 증폭반응에 사용된 상기 내부 표준 핵산의 농도와 동일한 것으로 결정하고, 상기 표적 신호가 상기 표준 신호에 비하여 작은 경우, 상기 표적 핵산 서열이 상기 증폭반응에 사용된 상기 내부 표준 핵산의 농도보다 작은 것으로 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은, (a) 시료 및 내부 표준 핵산을 주형으로 하고, 상기 시료 중의 표적 핵산 및 상기 내부 표준 핵산에 공통적인 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여, 상기 표적 핵산과 상기 내부 표준 핵산을 경쟁적으로 증폭시키는 단계로서, 상기 내부 표준 핵산은 상기 표적 핵산 서열과 길이가 동일하고, 검출가능한 프로브가 결합하는 부위를 제외하고는 상기 표적 핵산과 서열이 실질적으로 동일한 것으로 사용되는 농도가 알려져 있는 것이고, 상기 증폭반응은 상기 검출가능한 프로브의 존재하에서 수행되고, 상기 검출가능한 프로브는 상기 표적 핵산에 특이적인 표적 프로브 및 상기 내부 표준 핵산에 특이적인 내부 표준 프로브를 포함하는 것인 단계를 포함한다.
상기 증폭반응은, 중합효소증폭반응(PCR)일 수 있다. PCR이란 당업계에 널리 알려져 있는 것으로, 주형, 포워드 프라이머, 리버스 프라이머, 폴리머라제, dNTP를 포함하는 반응용액을 변성, 어닐링, 중합에 해당하는 온도로 반복하여 순환시킴으로써, 표적 핵산을 증폭하는 증폭방법을 의미한다.
상기 시료는 표적 핵산을 포함하는 것이면 어떠한 것이나 될 수 있다. 예를 들면, 혈액, 뇨, 조직 및 생검 시료 등 생물학적 시료일 수 있다. 상기 핵산에는 DNA, RNA 및 그 유사체가 포함될 수 있다. 상기 "표적 서열"이란 프라이머 또는 프 로브가 혼성화되는 대상이 되는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
"암플리콘 (amplicaon)"이란 표적 서열 내에서 증폭되고 말단이 두 개의 프라이머 결합 부위에 의하여 정의되는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다.
(a) 단계에서, 상기 내부 표준 핵산은 상기 표적 핵산 서열과 길이가 동일하고, 검출가능한 프로브가 결합하는 부위를 제외하고는 상기 표적 핵산과 서열이 실질적으로 동일한 것으로 사용되는 농도가 알려져 있는 것이다. 즉, 상기 내부 표준 핵산은 표적 핵산과 프라이머 결합 부위의 서열이 동일하고 그 길이가 동일하므로, 증폭되는 표적 및 내부 표준 "암플리콘"의 길이도 또한 동일하다. 따라서, 증폭과정에서 길이의 차이에 의한 속도론적 변이 (kinetic variation)로 인하여 증폭산물의 양이 변화하는 것은 최소화된다. 또한, 상기 내부 표준 핵산은, 표준 프로브가 결합하는 부분 또는 그 상보적인 부분을 제외하고는 상기 표적 핵산과 실질적으로 서열이 동일하다. 여기에서, "실질적으로 동일 (substantially indentical)"이라는 용어는 서열이 완전 동일한 것뿐만 아니라, 서열이 다르더라도 암플리콘의 증폭 효율에 거의 영향을 미치지는 않는 정도로 서열이 다른 것을 포함한다.
상기 표적 프로브와 표준 프로브는 상기 프라이머 결합 부위에 인접하거나 떨어진 위치에서 상기 표적 핵산 또는 표준 핵산에 결합할 수 있다.
상기 표적 프로브와 상기 내부 표준 프로브는 각각 표적 핵산 및 내부 표준 핵산에 대하여 서로 대응되는 위치에 결합하는 것일 수 있다.
"검출가능한 프로브"란 표적 핵산의 서열과 상보적 염기쌍 결합에 의하여 이중가닥 구조, 또는 더 고차 구조, 예를 들면, 3중 나선을 형성하고 검출가능한 신 호를 방출할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 검출가능한 프로브는 형광 염료로 표지되어 있을 수 있다.
상기 검출가능한 프로브는 리포터 염료와 흡광흡수자 (quencher)를 포함하는 자가-흡수 형광 프로브인 것일 수 있다. "자가-흡수 형광 프로브 (self-quenching fluorescence probe: SQP)"는 형광 리포터 염료와 에너지 전이 (FRET)에 의하여 반응하는 흡광흡수자 (quencher)로 구성되는 한 쌍의 표지로 표지되어 있다.
본 명세서에 있어서, "표지 (label)"란 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 5'-트리포스페이트에 결합할 수 있고 (i) 검출가능한 신호를 제공하고 (ii) 제1 또는 제2 표지, 예, FRET에 의하여 제공된 검출가능한 신호를 변경하기 위하여 제2 표지와 반응하고, (iii) 혼성화를 안정화하고, 예, 이중가닥을 형성하는 기능 중에서 하나 이상을 기능을 하는 임의의 모이어티를 의미한다.
"흡수 (quenching)"이란 기작에 상관없이 제2 모이어티 (흡광흡수자 (quencher))에 의하여 야기된 제1 모이어티 (리포터 염료)의 형광 감소를 의미한다. "자가 흡수 (self quenching)"이란 분자내, 에너지 전이 효과, 예를 들면 FRET (fluorescence resonance energy transfer)를 의미하는 것으로, 형광 리포터 염료와 흡광흡수자는 플루오로포어로부터 흡광흡수자로 에너지 전이가 일어나도록 하는 구조로 프로브 상에 연결되어 형광 염료에 의한 형광의 감소를 초래한다. 상기 자가 흡수 효과는 프로브가 상보체에 혼성화하거나 5' 뉴클레아제 작용에 의하여 형광 리포터 염료의 절단이 일어나 형광 리포터 염료와 흡광흡수자가 분리되는 것에 의하여 감소하거나 소실될 수 있다.
(a) 단계에서, 상기 중합반응에 사용되는 중합효소는 증폭하는 동안 상기 자가-흡수 형광 프로브로부터 리포터 염료를 잘라 상기 흡광흡수자로부터 상기 리포터 염료를 분리하는 것일 수 있다. 상기 중합효소는 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 열 안정성 중합효소인 것일 수 있다.
상기 리포터 염료는 플루오레세인 (fluorescein)과 같은, 잔텐 염료 (xanthene dye)일 수 있다. 상기 리포터 염료는 통상 상기 흡광흡수자로부터 12 nt 이상 분리되어 있다. 상기 리포터 염료는 SQP의 5' 말단 또는 3' 말단에 결합하고, 흡광흡수자는 SQP의 반대편 말단에 결합할 수 있다. 예를 들면, SQP는 형광 리포터 염료가 5' 뉴클레오티드에, 흡광흡수자가 3' 뉴클레오티드에 표지된 것일 수 있다. 상기 흡광흡수자는 상기 리포터 염료의 파장에 따른 분할을 위하여 비형광 물질이거나, 또는 형광물질일 수 있다. 이러한 리포터 염료-흡광흡수자 쌍을 포함하는 프로브는, 일반적으로 TaqManTM이라고도 하며, 5' 뉴클레아제 활성을 필요로 한다. 상기 프로브는 증폭 중에 잘려져 존재하는 이중가닥 DNA의 양에 비례하여 형광 신호를 방출한다 (미국특허 제5,538,848호, 제5,804,375호, 제6,358,679호 참조).
프로브 표지에 사용될 수 있는 형광 염료에는 플루오레세인(fluorescein), 로다민 (rhodamine) (예를 들면, 미국특허 제5,366,960호, 제5,936,087호, 제6,051,719호), 시아닌 (cyanines) (미국특허 제6,080,868호, WO 97/45539), 금속 포르피린 복합체 (WO 88/04777)가 포함될 수 있다. 플루오레세인 염료의 예에는, 6-카르복실플루오레세인 (6-FAM) 1, 2',4',1,4,-테트라클로로플루오레세인 (TET) 2 및 2',4',5',7',1,4-헥사클로로플루오레세인 (HEX) 3 (미국특허 제5,654,442호), 2',7'-디메톡시-4',5'-디클로로-6-카르복시로다민 (JOE) 4, 2'-클로로-5'-플루오로-7',8'-융합된 페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인 5 (미국특허 제 5,188,934호 및 제5,885,778호), 2'-클로로-7'-페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인 6 (미국특허 제6,008,379호)이 포함된다 (하기 식1-6 참조). 플루오레세인과 로다민 염료는 1,4-디클로로 치환기를 가질 수 있다 (하기 식 5-6에 나타낸 바와 같은 아래쪽 링). 또한, 상기 리포터 염료는 Cy3 또는 Cy5인 것일 수 있다.
Figure 112007083499712-PAT00001
Figure 112007083499712-PAT00002
Figure 112007083499712-PAT00003
Figure 112007083499712-PAT00004
Figure 112007083499712-PAT00005
Figure 112007083499712-PAT00006
식 중 X는 프로브와 연결되는 부분이다.
프로브 표지에 사용되는 다른 표지는 형광 흡광흡수자 모이어티이다. 흡광흡수자에는, (i) 테트라메틸-6-카르복시로다민 (TAMRA) 7, 테트라프로파노-6-카르복시로다민 (ROX) 8로 구성된 군으로부터 선택되는 로다민 형광 염료, 및 (ii) 디아조 화합물, 예를 들면 9-11, 및 (iii) 11, 안트라퀴논, 말라카이트 그린, 니트로티아졸 및 니트로이미다졸화합물 등을 포함한 시아닌 염료가 포함될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
Figure 112007083499712-PAT00007
Figure 112007083499712-PAT00008
Figure 112007083499712-PAT00009
Figure 112007083499712-PAT00010
Figure 112007083499712-PAT00011
식 중 X는 프로브와 연결되는 부분이다.
상기 표적 프로브의 리포터 염료는 상기 표준 프로브의 리포터 염료와 형광 파장이 구분되는 것일 수 있다.
증폭과정에서, 상기 리포터 염료는 중합효소의 5' 뉴클레아제 활성에 의하여 상기 SQP로부터 잘려 나와 더 이상 흡광흡수자에 의하여 흡수되지 않고, 형광을 발하게 된다. 그 결과 형광의 증가는 증폭산물의 카피의 증가와 직접적으로 비례하여 증가한다. 상기 증폭 산물은 종말점 분석 또는 리얼 타임 분석을 통하여 측정되고 정량화될 수 있다.
본 명세서에 있어서, "종말점 분석 (end point analysis)"이란 데이터 수집이 반응이 완료된 후에만 이루어지는 것을 말한다. PCR의 종말점 분석은 열순환과 증폭이 완료된 경우 형광 염료 측정을 하는 것을 의미한다. "리얼 타임 분석 (real time analysis)"란 PCR 동안 주기적으로 모니터링하는 것을 의미한다. ABI 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, Calif.)와 같은 특정 시스템은 미리 설정된 지점 또는 유저 정의된 지점에서 각 열 순환 동안 모니터 링을 수행한다.
본 명세서에 있어서, 상기 SQP는 길이가 10 내지 40nt인 것이 바람직하나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에 있어서, 상기 표적 핵산 및/또는 내부 표준 핵산의 길이는 특별히 한정되지 않으나, 30 내지 110nt, 바람직하게는. 50 내지 70nt인 것이다. 또한, 상기 프라이머는 길이가 10 내지 40nt인 것일 수 있으나, 여기에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 있어서, (a) 단계에서 상기 증폭반응은 프라이머의 제한 조건하에서 수행되는 것일 수 있다.
본 명세서에 있어서, "프라이머의 제한 조건"이란 프라이머의 농도가 일반적으로 사용되는 프라이머 농도의 1/2이하, 바람직하게는 1/5이하, 더 바람직하게는 1/10 이하, 더욱 바람직하게는 1/20 이하인 것일 수 있다. PCR에 있어서, 프라이머의 제한 조건은 주형의 농도 및 사이클 수에 따라 달라질 수 있다. 바람직하게는, 프라이머의 제한 조건은 프라이머의 농도가 바람직하게는 0.1μM 내지 5μM, 더욱 바람직하게는 0.1μM 내지 2μM, 가장 바람직하게는 0.1μM 내지 1μM 인 것일 수 있다. 프라이머의 제한 조건하에서, 증폭반응 예를 들면, PCR을 수행하는 경우, 표적 핵산과 내부 표준 핵산의 농도에 따른 증폭 산물의 비율이 더 크게 된다.
본 발명의 방법은, (b) 상기 표적 프로브 및 내부 표준 프로브로부터 발생하는 신호를 검출하는 단계를 포함한다. 상기 신호의 검출은 사용되는 신호의 종류에 따라 당업계에 알려진 임의의 신호 검출 수단이 사용될 수 있다. 예를 들면, 형광 신호인 경우, 형광 검출기가 사용될 수 있다. 상기 표적 프로브와 내부 표준 프로브는 서로 다른 파장의 형광 신호를 발생하는 것이 바람직하며, 이 신호를 검출함으로써, 초기에 포함된 표적 핵산 및 내부 표준 핵산의 양을 추정할 수 있다.
본 발명의 방법은, (c) 상기 표적 프로브로부터 발생하는 표적 신호 대 상기 내부 표준 프로브로부터 발생하는 표준 신호의 비를 결정하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 방법은, (d) 상기 표적 신호가 상기 표준 신호에 비하여 큰 경우, 상기 표적 핵산 서열이 상기 증폭반응에 사용된 상기 내부 표준 핵산의 농도보다 높은 것으로 결정하고, 상기 표적 신호가 상기 표준 신호의 크기와 동일한 경우, 상기 표적 핵산 서열이 상기 증폭반응에 사용된 상기 내부 표준 핵산의 농도와 동일한 것으로 결정하고, 상기 표적 신호가 상기 표준 신호에 비하여 작은 경우, 상기 표적 핵산 서열이 상기 증폭반응에 사용된 상기 내부 표준 핵산의 농도보다 작은 것으로 결정하는 단계를 포함한다.
상기 표적 신호가 상기 표준 신호에 비하여 크거나, 동일하거나 또는 작다는 의미는, 상기 표적 신호와 표적 신호가 동일한 표지로부터 발생하는 경우에는, 그 절대 값을 기준으로 하고, 그 표지가 양자 수율 (quantum yield)이 서로 다른 것이면, 이 양자 수율을 반영하여 얻어지는 신호를 의미한다. 즉, 얻어지는 신호를 단위 양자 수율로 나누어 얻어지는 신호의 비를 의미한다.
이렇게 함으로써, 증폭반응의 초기에 농도를 아는 내부 표준 핵산의 농도에 비하여, 표적 핵산의 농도가 더 높은지 낮은지를 정량할 수 있는 것입니다. 반응의 초기에 도입하는 내부 표준 핵산의 농도는 바람직하게는, 법률적 규정이나 판단의 기준이 되는 농도로 포함되는 것일 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 시료 중의 표적 핵산의 존재 여부를 간단하게 검출할 수 있다. 또한, 반응에 사용되는 반응용기 수가 줄어들고, 반드시 리얼 타임으로 형광량을 측정하지 않아도 되기 때문에, 광학 측정 기구가 단순화될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 프라이머 농도가 경쟁적 PCR 에 미치는 영향
본 실시예에서는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 표적 핵산과, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 내부 표준 핵산의 농도 비를 달리하고, 서열번호 3 (포워드 프라이머) 및 서열번호 4 (리버스 프라이머)의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여, PCR을 수행하였다. 본 실시예에서 사용된 표적 핵산, 내부 표준 핵산, 프라이머, 및 프로브는 바이오니아 (Bioneer,한국)로부터 의뢰하여 합성하였다.
구체적으로, 표적핵산과 내부 표준 핵산의 농도 비를 10: 1 (106 :105 copy /㎕)로 하고, 각 프라이머의 농도를 각각 1μM, 1/3 μM, 1/9 μM 및 1/27μM로 하였다. 반응용액은, 상기 농도의 표적 핵산, 내부 표준 핵산, 서열번호 3 (포워드 프라이머) 및 서열번호 4 (리버스 프라이머)의 올리고뉴클레오티드 프라이머와 함께 서열번호 5의 표적 프로브 5μM와 서열번호 6의 표준 프로브 5μM, dNTP 250μM, Taq 폴리머라제 0.1 유니트를 포함하고 총 부피 1㎕로 하였다. 상기 표적 프로브는 5' 말단에 Cy3가 표지되어 있고, 3'말단에는 EHQ2 (black hole quencher) 흡광흡수자가 표지되어 있다. 상기 표준 프로브는 5' 말단에 Cy5가 표지되어 있고, 3'말단에는 EHQ2 (black hole quencher) 흡광흡수자가 표지되어 있다.
PCR은 초기 변성 94℃에서 30초, 변성 94℃에서 10초 및, 어닐링 및 중합 60℃에서 30초를 30회 반복하였다. PCR 반응이 완료된 후, 증폭 산물 중의 Cy3 및 Cy5로부터 발생하는 형광 값 즉, 파장 532nm (Cy3), 및 635nm (Cy5)에서의 흡광도를 측정하였다.
도 1은, 표적핵산과 내부 표준 핵산을 도식적으로 나타낸 도면이다. 도 1에 나타낸 바와 같은, 표적 핵산과 내부 표준 핵산은 프로브 결합 부위를 제외하고는 동일한 서열을 가진다. 따라서, 동일한 포워드 및 리버스 프라이머가 표적 핵산과 내부 표준 핵산 중 어느 하나에 결합할 수 있다. 프로브는 표적 프로브와 표준 프로브가 각 Cy3와 Cy5로 5' 말단이 변형되어 있어 증폭된 표적 핵산과 표준 핵산을 형광에 의하여 구분할 수 있다. 상기 표적 핵산은 람다 DNA의 전체 게놈의 1849번 내지 1929번 뉴클레오티드의 서열에 해당하는 것이다.
도 2는 동일한 농도의 비를 갖는 주형에 대하여 프라이머의 농도를 달리하여 경쟁적 PCR한 결과를 나타내는 도면이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 프라이머의 농도가 낮을수록 농도가 높은 주형이 상대적으로 더 많이 증폭되었다. 따라서, 프라 이머의 제한 조건하에서 PCR 하는 경우, 주형 중 어느 주형이 더 많이 포함되어 있는지를, PCR 결과로부터 더 잘 추측할 수 있다. 도 2에서 가로 축은 프라이머의 농도이며 세로 축은 증폭된 표적 핵산으로부터 발생하는 형광/증폭된 표준 핵산으로부터 발생하는 형광의 비율이다. 도 2에서 각 실험 결과는 2반복 실험한 결과를 나타낸다.
대조군으로서, 표적핵산과 내부 표준 핵산의 농도를 1:1로 한 경우, PCR 종료 시의 형광량은 1.04:1로 거의 유사하였다. 이는 주형 핵산의 농도 비를 1:1를 기준으로 많은 쪽이 더 잘 증폭된다는 것을 의미한다.
실시예 2: 프라이머 농도 제한 조건하에서 주형의 농도가 경쟁적 PCR 에 미치는 영향
본 실시예에서는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 표적 핵산과, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 내부 표준 핵산의 농도 비를 달리하고, 서열번호 3 (포워드 프라이머) 및 서열번호 4 (리버스 프라이머)의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여, PCR을 수행하였다.
본 실시예에서, 표적핵산과 내부 표준 핵산의 농도 비는 각각 10:1, 5:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:5, 1:10 (이때 1에 해당하는 주형의 농도는 105 copy/㎕에 해당함)으로 하고, 프라이머의 농도를 각각 1/9 μM로 한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 PCR 및 형광측정 조건에서 측정하였다.
도 3은 프라이머 농도 제한 조건에서 주형 농도의 비를 달리하여 경쟁적 PCR 한 결과를 나타내는 도면이다. 도 3에서 왼쪽 세로축은 Cy5/Cy3 (내부 표준 핵산/표적 핵산), 오른쪽 세로축은 Cy3/Cy5 (표적 핵산/내부 표준 핵산) 값이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 표적 핵산과 내부 표준 핵산의 비율이 1인 경우를 기준으로, 1 보다 큰 경우, 표적 핵산이 더 많이 증폭되었으며, 1 보다 작은 경우에는 내부 표준 핵산이 더 많이 증폭되었다.
따라서, 프라이머 농도 제한 조건에서 경쟁적으로 PCR을 통하여, 농도를 알고 있는 내부 표준 핵산을 사용함으로써, 시료 중에 표적 핵산이 그 보다 많은 양으로 존재하는지, 적은 양으로 존재하는지 여부를 정성적으로 분석할 수 있다.
본 발명의 방법에 의하면, 시료 중의 표적 핵산의 농도를 정성적으로 분석할 수 있다. 예를 들면, 두 개의 병원균 Chlamydia Trachomatis (이하 CT)와 Neisseria gonorrhoeae (이하 NG)를 검출하는 경우에 있어서, CT 시료와 내부 표준 핵산를 포함하는 반응, NG 시료와 내부 표준 핵산을 포함하는 반응 및 어느 것도 포함하지 않는 음성 대조군의 3종류의 PCR 반응을 통하여 일정한 농도의 병원균이 존재하는지 여부를 검출할 수 있다. 이 경우 PCR 증폭은 본 발명의 실시예에 따라 진행한 것으로 한다. 법률적으로 허용되는 혈액 중의 CT와 NG의 농도를 103 cell/ml로 가정하면, 사용되는 내부 표준 핵산의 농도를 103 cell/ml에 대응하는 농도로 한다. PCR 결과 얻어진 표적 핵산 형광 값 Cy3/표준 핵산 형광값 Cy5의 값이 다음과 같은 경우, 다음과 같은 판별을 할 수 있다.
표 1.
번호 판별 PCR 결과
1 CT/NG가 기준 농도보다 매우 높게 (예, 105 cell/ml) 혈액 중에 존재하는 경우 진한 빨간색
2 CT/NG가 기준 농도보다 약간 높게 (예, 103-104 cell/ml) 혈액 중에 존재하는 경우 빨간색
3 CT/NG가 기준 농도(103 cell/ml)로 존재하는 경우 보라색
4 CT/NG가 기준 농도보다 약간 낮게 (예, 103-102 cell/ml) 혈액 중에 존재하는 경우 파란색
5 CT/NG가 기준 농도보다 매우 낮게 (예, 10-0 cell/ml) 혈액 중에 존재하는 경우 진한 파란색
6 DNA 정제 오류 무색
7 시약 및 준비 단계의 오류 음성대조군 발색
위와 같이, 본 발명의 방법에 따르면, 단지 3개의 반응을 통하여 병원균의 존재 여부를 간단하게 검출할 수 있다. 또한, 반응에 사용되는 반응용기 수가 줄어들고, 리어 타임으로 형광량을 측정하지 않아도 됨으로, 광학 측정 기구가 단순화될 수 있다.
도 1은, 표적핵산과 내부 표준 핵산을 도식적으로 나타낸 도면이다.
도 2는 동일한 농도의 비를 갖는 주형에 대하여 프라이머의 농도를 달리하여 경쟁적 PCR한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 프라이머 농도 제한 조건에서 주형 농도의 비를 달리하여 경쟁적 PCR한 결과를 나타내는 도면이다.
<110> Samsung Electronics Co., Ltd. <120> Method of detecting a target nucleic acid by using a competitive amplification <130> PN075821 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 81 <212> DNA <213> Lambda virus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(81) <223> target nucleic acid <400> 1 agcggaaaga gcattattca gcgcccgttc ctgaccgtgt ggcttacctg accgccggta 60 tcgactccca gctggaccgc t 81 <210> 2 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> internal standard nucleic acid <400> 2 agcggaaaga gcattattca gcgcccgaca gaacccgcag aacaacaacc cccgccggta 60 tcgactccca gctggaccgc t 81 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 3 agcggaaaga gcattattca g 21 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 4 agcggtccag ctgggagt 18 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A target probe: 5' hydroxyl group is modified with Cy3 and 3' hydroxyl group is modified with EHQ2 <400> 5 ttcctgaccg tgtggcttac ctga 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A standard probe : 5' hydroxyl group is modified with Cy3 and 3' hydroxyl group is modified with EHQ2 <400> 6 acagaacccg cagaacaaca accc 24

Claims (10)

  1. 시료 중의 표적 핵산 서열의 양을 측정하는 방법으로서,
    (a) 상기 시료 및 내부 표준 핵산을 주형으로 하고, 상기 시료 중의 표적 핵산 및 상기 내부 표준 핵산에 공통적인 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여, 상기 표적 핵산과 상기 내부 표준 핵산을 경쟁적으로 증폭시키는 단계로서, 상기 내부 표준 핵산은 상기 표적 핵산 서열과 길이가 동일하고, 검출가능한 프로브가 결합하는 부위를 제외하고는 상기 표적 핵산과 서열이 실질적으로 동일한 것으로 사용되는 농도가 알려져 있는 것이고, 상기 증폭반응은 상기 검출가능한 프로브의 존재하에서 수행되고, 상기 검출가능한 프로브는 상기 표적 핵산에 특이적인 표적 프로브 및 상기 내부 표준 핵산에 특이적인 내부 표준 프로브를 포함하는 것인 단계;
    (b) 상기 표적 프로브 및 내부 표준 프로브로부터 발생하는 신호를 검출하는단계;
    (c) 상기 표적 프로브로부터 발생하는 표적 신호 대 상기 내부 표준 프로브로부터 발생하는 표준 신호의 비를 결정하는 단계; 및
    (d) 상기 표적 신호가 상기 표준 신호에 비하여 큰 경우, 상기 표적 핵산 서열이 상기 증폭반응에 사용된 상기 내부 표준 핵산의 농도보다 높은 것으로 결정하고, 상기 표적 신호가 상기 표준 신호의 크기와 동일한 경우, 상기 표적 핵산 서열이 상기 증폭반응에 사용된 상기 내부 표준 핵산의 농도와 동일한 것으로 결정하고, 상기 표적 신호가 상기 표준 신호에 비하여 작은 경우, 상기 표적 핵산 서열이 상기 증폭반응에 사용된 상기 내부 표준 핵산의 농도보다 작은 것으로 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 증폭반응은 중합효소증폭반응(PCR)인 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, (a) 단계에서 상기 증폭반응은 프라이머의 제한 조건하에서 수행되는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 프라이머의 제한 조건이란 프라이머의 농도가 0.1μM 내지 1μM 인 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 표적 프로브와 상기 내부 표준 프로브는 각각 표적 핵산 및 내부 표준 핵산에 대하여 서로 대응되는 위치에 결합하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 검출가능한 프로브는 리포터 염료와 흡광흡수자 (quencher)를 포함하는 자가-흡수 형광 프로브인 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 중합반응에 사용되는 중합효소는 증폭하는 동안 상기 자가-흡수 형광 프로브로부터 리포터 염료를 잘라 상기 흡광흡수자로부터 상기 리포터 염료를 분리하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 중합효소는 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 열 안정성 중합효소인 것인 방법.
  9. 제6항에 있어서, (b) 단계에서 상기 표적 프로브의 리포터 염료는 상기 표준 프로브의 리포터 염료와 형광 파장이 구분되는 것인 방법.
  10. 제6항에 있어서, 상기 리포터 염료는 Cy3 또는 Cy5인 것인 방법.
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