KR20090050725A - 트리코델마 롱기브라키아툼 hk 119 (kfcc11400p) 균주를 함유하는 항 미생물 제제 - Google Patents

트리코델마 롱기브라키아툼 hk 119 (kfcc11400p) 균주를 함유하는 항 미생물 제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 트리코델마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) HK 119 (KFCC 11400P) 균주를 함유하는 식물에 질병을 일으키는 미생물에 대한 항 미생물 제제에 관한 것으로, 식물(특히, 상추)에 질병(특히, 균핵병)을 일으키는 미생물(특히, 진균류)에 대해 우수한 방제능을 발휘한다.
곰팡이, 미생물 제제, 상추, 생물 농약, 진균, 트리코델마 롱기브라키아툼

Description

트리코델마 롱기브라키아툼 HK 119 (KFCC 11400P) 균주를 함유하는 항 미생물 제제{Anti-mirobial agent containing Trichoderma longibrachiatum HK 119 (KFCC 11400P)}
본 발명은 식물에 질병을 일으키는 미생물에 대한 생물학적 항 미생물 제제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 트리코델마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) HK 119 (KFCC 11400P) 균주를 함유하는 식물에 질병을 일으키는 미생물에 대한 항 미생물 제제에 관한 것이다.
농업에서 화학적 방제의 오·남용으로 토양 오염 등의 환경적인 문제가 발생하고, 화학제가 인체에 해롭다는 문제가 대두되면서 효과적이고 환경 친화적인 생물학적 방제에 대한 관심이 더욱 고조되고 있다.
특히, 환경 보호와 생태계 보전에 관한 그린 라운드 협약이 국제적 관심의 대상이 되면서, 과다한 화학제 농약의 사용이 심각한 문제로 대두되고 있고, 이를 대체하는 무공해 농약의 개발이 국제적으로 관심을 끌고 있다.
이와 같은 관심이 고조되면서, 농업 생산의 안정성 향상, 환경 보전, 농업 생산물의 부가가치 증진 등의 양적·질적 생산성을 향상시키기 위하여 저공해 천연 생물농약을 개발하려는 연구들이 많이 이루어지고 있다.
기존 농약에 의한 환경오염 문제를 극복하기 위한 천연의 생물농약은 병원균을 효과적으로 억제하는 길항 미생물을 선발하고 이로부터 생물 활성물질을 분리하는 것에 초점을 맞춰 진행되어 오고 있다.
한편, 상추는 셀러드용 채소로서 재배 역사가 오래되어 기원전 550년경부터 재배되기 시작하였다고 알려져 있다. 우리나라에서는 오래전부터 중국으로부터 줄기상추가 도입되어 재배되었으며, 1890년경에 잎상추가 일본으로부터 들어와서 널리 재배되었다. 상추는 품종이 많이 분화되어 있는데, 국내에서는 축면포기잎상추(적축면, 청축면)와 치마잎 상추(적치마, 청치마)가 많이 재배되고 있으며, 그 외에 결구상추가 일부 재배되고 있는 실정이다.
상추는 재배 일수를 보면 봄 재배 작형이 약 20일, 가을 재배 작형이 30일, 겨울 재배 작형이 35∼40일 정도 소요되고, 작형 구분없이 15∼20일 간격으로 계속하여 파종하면 연속 연중 재배가 가능하다.
상추에 관련되는 질병으로는 균핵병, 잿빛곰팡이병, 잎마름병 등이 대표적인데, 이 중 균핵병이 가장 많이 발생되고 있다.
이에 상추의 균핵병을 방제할 수 있는 미생물 농약의 개발이 적극 요구된다 할 것이나, 종래에 그에 관한 기술의 개발은 미미하였다.
이에 본 발명은 식물(특히, 상추)에 질병(특히, 균핵병)을 일으키는 미생물(특히, 진균류)에 대한 새로운 항 미생물 제제를 개발하여 제공하는데 그 목적이 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 트리코델마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) HK 119(KFCC 11400P) 균주를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 식물에 질병을 일으키는 미생물에 대한 항 미생물 제제를 제공한다.
이때, 바람직하게 상기 식물은 상추일 수 있고, 더욱 바람직하게 식물에 발생하는 질병은 균핵병일 수 있다.
한편, 본 발명에 있어 식물에 질병을 일으키는 미생물은 대표적으로 진균류이다.
이하, 본 발명의 내용에 대해 더욱 상세히 설명하고자 한다.
본 발명에서는 트리코델마(Trichoderma) 속 균주를 토양에서 분리하고자 하였다. 토양으로부터 다양한 트리코델마(Trichoderma) 속 균주가 분리되었는데, 퇴비와 토양에서 총 89개의 트리코델마(Trichoderma) 속 균주가 분리되었으며, 노지 토양에서는 9개, 하우스에서는 16개, 퇴비에서는 64개의 균주가 분리되었다.
이를 콜로니 형태별로 분류하고, 고체배양 방법과 대치배양 방법을 이용하여 중복기생성이 우수한 트리코델마(Trichoderma)를 분리하였다. 분리한 균주를 곰팡이의 분자생물학적 동정법으로 널리 이용되는 18S rDNA 염기서열을 통해 분석하고, NCBI의 유전자정보를 이용하여 트리코델마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum)으로 동정하였다.
이와 같이 동정된 균주를 트리코델마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) HK 119로 명명한 후, 한국미생물보존센터에 2007년 10월 31일자로 기탁하고, 기탁번호 KFCC 11400P를 부여받았다.
이 균주를 이용하여 포장 시험을 하였는데, 그 결과 트리코델마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) HK 119(KFCC 11400P)의 포장에서 방제가는 73.5%로 조사되어, 생물적 방제제로서의 기능성이 확인되었다.
한편, 본 발명의 트리코델마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) HK 119(KFCC 11400P)를 함유하는 항 미생물 제제의 제형은 생물농약으로서의 제형화에 관한 당업계의 공지 사실에 따라 다양하게 제형화될 수 있으며, 일 예로서 톱밥을 베이스로 하여 제형화될 수 있다.
상기에서 살펴본 바와 같이 본 발명의 트리코델마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) HK 119(KFCC 11400P)는 식물(특히, 상추)에 질 병(특히, 상추 균핵병)을 일으키는 미생물(특히, 진균류)에 대해 우수한 방제능을 발휘한다.
이하, 본 발명의 내용에 대해 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
실시예 1: 트리코델마 롱기브라키아툼 ( Trichoderma longibrachiatum ) HK 119(KFCC 11400P)의 분리 및 동정
(1) 트리코델마(Trichoderma) 속 균주의 분리
트리코델마(Trichoderma) 속 균주를 분리하기 위해 충북 청원군 지역의 노지 토양, 비닐하우스, 퇴비장에서 토양을 채취하였다. 토양은 지표면 15cm 부위를 걷어내고 채치하였고, 채취한 시료를 폴리에틸렌 백(polyethylene bag)에 담아 실험에 사용하였다(도 1).
채취한 각각의 토양 시료 1,0g을 0.9% NaCl 용액에서 10-6까지 희석하고 각 10-4, 10-5, 10-6 의 희석액을 WA(Water agar)와 PDA(Potato dextrose agar)에 100㎕를 도말한 다음, 20℃의 배양기에서 보관하면서 트리코델마(Trichoderma) 속 균주로 예상되는 균주를 선발하여 순수 분리하였다. 모든 실험은 3 반복으로 수행하였 다.
도 2의 붉은색 화살표에서 보는 바와 같이 WA와 PDA 두 배지에서 다양한 트리코델마(Trichoderma) 속 균주가 분리되었다. 퇴비와 토양에서 총 89개의 트리코델마(Trichoderma) 속 균주가 분리되었으며, 노지 토양에서는 9개, 하우스에서는 16개, 퇴비에서는 64개의 균주가 분리되었다.
(2) 콜로니 형태별 분류 및 균주 보관
토양에서 분리한 트리코델마(Trichoderma) 속 균주를 콜로니 형태에 따라 분류하고, 대표 균주를 선발하여 포자를 수확한 다음 15% 글리세롤 용액에 담아 -70℃에 보관하면서 실험에 사용하였다.
트리코델마(Trichoderma) 종류는 분리원에 따라 다소 차이가 있었다. 콜로니 타입별로 구분하였을 때 가장자리가 불규칙하고 초기에 흰색의 균사를 형성하며 생육이 저조한 타입을 'A type', 가장자리가 불규칙하고 초기 생육이 빠르며 흰색균사를 형성하는 타입을 'B type', 가장자리가 규칙적이고 초기생육이 빠르며 흰색균사를 형성하는 타입을 'C type'으로 구분하였다(도 3).
타입별 균주 가운데 대표 균주를 선발하여 -70℃에 보관하고, 필요할 때 꺼내 실험에 사용하였다.
A type B type C type
노지 토양 2 4 3
하우스 토양 1 8 7
퇴비장 15 10 39
(3) 병원균 분리
상추 균핵병이 발생한 포장에서 균핵을 수집(도 4)하고, 70% 에탄올과 4% 차염소산나트륨에서 각각 30초간 표면 소독한 다음, 멸균수로 2회 세척 후 30분간 무균상에서 건조하여 PDA에 치상하였다. 그 후, 25℃ 인큐베이터에 보관하면서 균핵으로부터 자라나온 균사 끝을 떼 내어 순수 분리한 다음, 사면배지에 접종하여 4℃ 냉장보관하면서 하기의 실험에 사용하였다.
(4) 트리코델마(Trichoderma) 속 균주의 중복기생성 확인 및 우수 균주 선발
토양과 퇴비로부터 분리한 트리코델마(Trichoderma) 속 균주와 상추재배 포장으로부터 분리한 균핵병균을 PDA가 분주된 슬라이드 글라스에 동시 접종하고 20℃ 항온기에 보관하면서 트리코델마(Trichoderma) 속 균주들의 중복기생성을 확인하였다. 이와 동시에 PDA가 분주된 플레이트에도 동시 접종하여 중복기생성 여부를 파악하였으며, 실험에 사용한 트리코델마(Trichoderma) 속 균주 가운데 중복기생성이 가장 우수한 균주를 선발하고자 하였다.
고체배양 방법과 대치배양 방법을 이용하여 균주 타입별 중복기생성을 확인한 결과(도 5, 도 6), 'C type' 균주가 가장 우수한 중복기생성을 나타내었다. 중복기생성은 일반 광학현미경 하에서 타입별 경계부위를 관찰하면서 트리코델마(Trichoderma)가 상추 균핵병균의 균사를 감고 있는 정도를 확인하여 심한 정도에 따라 +~+++++로 구분하였다.
구분 Type
A B C
중복기생 정도 ++ +++ +++++
-Type별 10 반복을 평균한 표시임
(5) 트리코델마(Trichoderma) 동정
중복기생성이 우수한 'C type'의 트리코델마(Trichoderma)를 선발하고, 동정하였다. 선발 균주는 곰팡이의 분자생물학적 동정법으로 널리 이용되는 18S rDNA 염기서열을 통해 분석하고, NCBI의 유전자정보를 이용하여 동정하였다. 그 결과, 'C type'의 균주는 트리코델마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum)으로 동정되었으며, 아직까지 국내에 중복기생성에 대한 연구가 거의 없는 균주로 확인되었다.
이상의 결과로부터 선발된 'C type'균주를 트리코델마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) HK 119로 명명한 후, 한국미생물보존센터에 2007년 10월 31일자로 기탁하고, 기탁번호 KFCC 11400P를 부여받았다.
실험예 1: 트리코델마 롱기브라키아툼 ( Trichoderma longibrachiatum ) HK 119(KFCC 11400P)의 필드 적용
중복기생성이 가장 우수한 트리코델마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) HK 119(KFCC 11400P) 균주를 대량으로 생산하기 위해 톱밥 배지를 이용하여 배양하였다.
실험에 사용한 톱밥은 팽이를 배양하고 난 것으로서, 톱밥 내 이화학 성분으로 질소 0.49%, 인산 0.74%, 가리 0.36%를 함유하고 있었으며, 주요 구성물로는 쌀겨와 활엽수 톱밥이었다.
톱밥 배지의 수분조건을 30%로 조절하고 멸균한 다음 선발한 트리코델마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) 균주를 접종하여, 20℃에서 5일간 배양 후 포장실험에 사용하였다.
톱밥 배지에서 배양된 트리코델마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) HK 119(KFCC 11400P) 균주를 상추재배 예정지 3.3m2당 0.5kg 살포
하였다.
이때, 상추 재배에 필요한 비료는 농가 관행을 따랐다.
처리구는 하우스 1동을 1처리구로 하였으며, 정식 1개월 후 이병주를 조사하여 방제가를 계산하였다.
포장 시험 결과, 표 3에서 보는 바와 같이 트리코델마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) HK 119(KFCC 11400P) 균주의 포장에서 방제가는 73.5%로 조사되어, 생물적 방제제로서의 기능성이 확인되었다.
구분 이병주 수 이병주율(%) 방제가(%)
처리구 112 10.7 73.5%
무처리구 429 40.35 -
도 1은 퇴비장과 토양에서의 시료를 채취하는 모습을 보여주는 사진도이다.
도 2는 퇴비와 토양시료로부터 분리한 트리코델마(Trichoderma)의 사진도로서, 화살표는 트리코델마(Trichoderma)의 콜로니를 가리킨다.
도 3은 분리된 트리코델마(Trichoderma)의 콜로니를 'A type', 'B type', 'C type'의 형태별로 분류한 사진도이다.
도 4는 상추 균핵병과 분리한 병원균을 보여주는 사진도로서, 좌측은 상추 균핵병의 사진이고, 우측은 균핵으로부터 순수 분리한 병원균의 사진이다.
도 5는 고체배양 방법과 대치배양에 의해 중복기생성을 확인한 사진도이다.
도 6은 상추균핵병균에 대한 'C type', 트리코델마(Trichoderma) 속 균주의 중복기생을 보여주는 사진도로서, 화살표는 중복기생을 가리킨다.
도 7은 트리코델마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) HK 119(KFCC 11400P) 처리에 의한 상추 균핵병 방제를 보여주는 사진도로서, A는 트리코델마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) HK 119(KFCC 11400P) 처리구이고, B는 무처리구이다.

Claims (4)

  1. 트리코델마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) HK 119(KFCC 11400P) 균주를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 식물에 질병을 일으키는 미생물에 대한 항 미생물 제제
  2. 제1항에 있어서,
    상기 식물은,
    상추인 것을 특징으로 하는 항 미생물제제
  3. 제2항에 있어서,
    상기 질병은,
    균핵병인 것을 특징으로 하는 항 미생물제제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 미생물은,
    진균류인 것을 특징으로 하는 항 미생물제제
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