KR20090042344A

KR20090042344A - 단편화된 핵산 및 ｎ―프라이머를 이용한 핵산의 합성방법

Info

Publication number: KR20090042344A
Application number: KR1020070108046A
Authority: KR
Inventors: 문제선; 허철구; 황인규; 좌남수
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2007-10-26
Filing date: 2007-10-26
Publication date: 2009-04-30
Also published as: KR100991724B1; WO2009054564A1

Abstract

본 발명은 RNA의 단편화 및 이를 주형으로 하여 N-프라이머를 이용한 핵산의 합성 방법 및 cDNA 라이브러리의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 cDNA 라이브러리, 및 N-프라이머를 포함하는 핵산 합성용 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, mRNA의 모든 부위에 동일한 상보성을 가지고 있을 가능성이 있는 N-프라이머와 인위적 방법에 의하여 무작위로 단편화된 mRNA를 포함한 여러 가지 종류의 핵산을 이용하여 모든 부위에서 cDNA 또는 상보적인 핵산의 가닥을 합성하기 때문에 중복을 회피하고 mRNA로부터 유래된 모든 cDNA 또는 상보적인 핵산 염기서열을 확보할 수 있다.

RNA 단편화, N-프라이머, 핵산 합성, cDNA 라이브러리

Description

단편화된 핵산 및 Ｎ―프라이머를 이용한 핵산의 합성 방법{Method for the synthesis of nucleic acid by using fragmented nucleic acids and N-primer}

본 발명은 RNA의 단편화 및 N-프라이머를 이용한 핵산의 합성 방법 및 cDNA 라이브러리의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 cDNA 라이브러리, 및 N-프라이머를 포함하는 핵산 합성용 키트에 관한 것이다.

DNA 합성은 유전공학 분야의 연구에서 다양한 목적으로 사용된다. 올리고뉴클레오티드와 같은 단쇄 DNA의 합성을 제외한 대부분의 DNA의 합성은 DNA 중합효소를 사용하는 효소적 방법에 의해 수행된다.

전체 RNA 또는 mRNA로부터 cDNA를 합성하기 위해서 대상 RNA에 대해 상보적인 염기서열을 가진 특이 프라이머 또는 poly-T 서열을 가진 프라이머를 활용하여 왔다. 시료내의 대상 RNA의 서열이 알려져 있거나 poly-A 테일(tail)을 가진 mRNA가 대상이 될 경우 cDNA의 합성이 가능하다. 그러나 이러한 경우를 제외한 서열이 알려져 있지 않은 대상 RNA나 외래 RNA(예; 바이러스 유래의 RNA 등)는 cDNA로 전환할 수가 없다.

이러한 제한 요소를 극복하기 위하여 Marcelo Bento Soares 등 [Marcelo Bento Soares 등, (1996) Genome Research. 6(9); 791-806]은 "Normalization and Subtraction"의 개념을 도입하여 라이브러리에 많은 복제 수를 가진 RNA를 제거하여 상대적으로 작은 복제 수를 가진 RNA로부터 유래된 유전정보를 획득할 확률을 높이고 있다. 그러나 이 방식 역시 발현되는 유전자의 정보를 획득하는데 있어서 동일한 문제점을 가지고 있다.

이러한 한계점을 극복하기 위하여 Andrew J. G. Simpson 등 [Andrew J. G. Simpson 등, (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(7); 3491-3496]은 전장 RNA와 무작위로 선택된 프라이머를 이용하여 한 가닥의 cDNA를 합성하고 PCR을 이용하여 두 번째 가닥의 cDNA를 합성하여 라이브러리를 제작하였다. 이러한 방식을 도입하여 발현되는 유전자의 양 말단보다 중간 지점의 유전정보를 많이 획득하는데 성공하였다. 그러나 이 방식 또한 무작위적으로 유전자의 전체 부위에 동일한 수준의 유전정보를 획득하는데 있어서 완전한 무작위적인 염기서열을 가진 프라이머가 아니며 PCR에 의한 편중 현상을 회피하지 못하였다. 또한, PCR에 의하여 두 번째 가닥의 합성 방법을 채택함으로써 라이브러리가 가진 인서트의 크기가 매우 짧아 발현 유전체 (expression sequence tag; EST) 정보를 획득하는데 있어서 비효율적이며, 이들의 크기를 적절하게 조절할 수 있는 방안이 마련되지 않아 현재 널리 활용될 수 없다.

인간 게놈 프로젝트 성과로 인해 현재 인간의 게놈 정보는 거의 확보되어 있지만, 유전자는 약 20,000-30,000개로 추정될 뿐 정확한 수는 밝혀지지 않았다. 더군다나 발현되는 유전자의 유전 정보는 약 800만개 이상의 EST가 완료되었음에도 발현되는 유전자의 정보를 상당 부분 확인하지 못한 실정이다. 본 발명에 고안된 방법은 모든 생물체의 유전정보를 매우 효율적으로 거의 완벽하게 획득할 수 있으며, 인간의 경우 그 경제적인 가치는 매우 클 것이다.

본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 기존에 널리 활용되는 라이브러리 제작 방식에 새로운 개념을 도입하여 유전 정보를 획득함에 있어서 중복을 회피하여 효율성을 극대화하고, 서로 다른 유전 정보를 가진 생물체 또는 진핵 생물이 공통적으로 가지는 mRNA의 공통 서열을 활용하지 않고도 효율적인 다중 진단을 가능하게 하기 위함이다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 RNA의 단편화 및 N-프라이머를 이용한 핵산의 합성 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 RNA의 단편화 및 N-프라이머를 이용한 cDNA 라이브러리의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 cDNA 라이브러리를 제공한다.

또한, 본 발명은 N-프라이머를 포함하는 핵산 합성용 키트를 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 N-프라이머 및 단편화된 핵산을 이용하여 핵산을 합성할 경우, N-프라이머의 특성상 mRNA의 말단에서부터 cDNA를 합성하는 것이 아니라 mRNA의 모든 부위에 동일한 상보성을 가지고 무작위적으로 모든 부위에서 cDNA를 합성하기 때문에, 중복을 회피하고 mRNA의 모든 염기서열의 확보가 가능하여 발현 유전체를 확보하는데 있어서 나타나는 중복성을 극복할 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

RNA를 단편화시키는 단계;

상기 단편화된 RNA를 주형으로 하고, N-프라이머를 상기 주형에 어닐링시켜 제1가닥 (first strand) cDNA를 합성하는 단계; 및

상기 합성된 제1가닥 cDNA에 DNA 중합효소를 첨가하여 제2가닥 (second strand) cDNA를 합성하는 단계를 포함하는, 핵산의 합성 방법을 제공한다.

본 발명에서 제안된 cDNA 합성 방법은 N-프라이머를 이용하여 단편화된 RNA를 가지고 cDNA를 합성하여 발현되는 모든 유전정보를 유전자의 양 말단 및 중간의 어느 지점이라도 동일한 확률로 그 정보를 획득될 수 있도록 설계된 것이다. N-프라이머는 기존의 프라이머와 달리 모든 가능한 조합의 염기서열을 가지고 있기 때문에 시료 내에 존재하는 모든 서열에 상보적일 것으로 추측되며, 이러한 특징으로 인해 시료 내 존재하는 어떠한 염기서열을 가진 RNA라도 cDNA로 전환될 것으로 생각된다. 따라서 poly-A 테일을 가지지 않은 조각난 mRNA, rRNA, 바이러스 또는 원핵생물의 RNA, DNA 등의 모든 생물체의 모든 종류의 RNA 및 DNA로부터 핵산을 합성할 수 있다. 진핵세포의 발현 유전자의 정보를 획득하는 방법으로 조직발현 유전자[Expressed Sequence Tag(EST)]의 중복을 획기적으로 회피할 수 있는 방법이다. 이는 중복 회피뿐만 아니라 하나의 mRNA를 여러 조각으로 분리시켜 핵산을 합성하기 때문에 증폭의 효과도 나타낼 수 있다. 따라서 N-프라이머를 이용한 핵산의 합성 방법은 다음과 같은 경우에 매우 유용하다.

첫째, 생물체의 유전체 정보를 획득하기 위하여 대상 생물체의 전체 게놈 서 열을 확보하는 방법이 있으나 유전자로서 실제 기능을 가진 부위를 확인하기 곤란하거나 게놈의 크기 등의 제한 요소가 있을 경우에는 세포내에서 발현되는 유전자의 서열을 확인하는 방법이 있다. 그러나 이 방법의 문제점은 single-pass sequencing 때문에 동일한 유전자에서 발현된 동일한 지역 (주로 5'-말단 또는 3'-말단)의 서열이 중복되어 실제 필요한 mRNA 상의 전체 염기서열의 확보가 매우 비효율적이고 발현되는 유전자의 많은 부분을 밝히는데 한계가 있다는 점이다. RNA를 작은 단편으로 절단한 다음, N-프라이머를 이용하여 핵산을 합성할 경우 N-프라이머의 특성상 mRNA의 말단에서부터 cDNA를 합성하는 것이 아니라 mRNA의 모든 부위에 동일한 상보성을 가지고 무작위로 모든 부위에서 cDNA를 합성하기 때문에 중복을 회피하고 mRNA의 모든 염기서열의 확보가 가능하다. 실제 N-프라이머를 이용하여 mRNA를 cDNA로 전환하면 합성된 cDNA는 poly-T 서열을 가진 프라이머를 이용하여 합성된 cDNA처럼 대부분이 전장 mRNA에서 합성된 것처럼 나타나기 때문에 이러한 단점을 보완하기 위해 순수 분리된 mRNA를 물리적 또는 화학적인 방법으로 절단한 후 N-프라이머를 이용하여 cDNA를 합성하면 된다. 또한 mRNA의 크기가 크면 클수록 N-프라이머의 효과가 극대화되기 때문에 조직 특이적인 유전자의 동정 및 유전자의 완전한 기능을 위해 요구되거나, 조직 특이적인 alternative splicing form의 확보, 질병과 관련된 유전자의 동정 및 병 특이적인 alternative splicing form을 확보하는데 필수적일 것으로 사료된다.

둘째, 병원균의 진단을 위해서 N-프라이머의 효과는 여러 가지 측면에서 고찰해 볼 수 있다. 여러 종류의 대상 병원체를 진단하기 위한 칩을 사용하기 위하여 시료에 존재하는 모든 핵산을 형광물질 등으로 표지하여 칩에 처리한다. 이 경우 시료에 존재하는 병원체가 동정되지 않아 특이적인 핵산의 염기서열이 알려지지 않으면 칩을 사용할 수 없다. 그러나 이러한 경우에도 N-프라이머를 이용하면 모든 핵산을 형광물질로 표지 가능하기 때문에 진단 대상의 수가 아무리 많은 칩이라도 사용이 가능하다. 이 경우 전체 RNA 또는 mRNA를 물리적 또는 화학적인 방법으로 절단하지 않아도 N-프라이머의 무작위적인 특징으로 인해 여러 종류의 병원균을 동시에 진단할 수 있다. 특히, 올리고뉴클레오타이드 DNA 칩의 경우 진단 대상으로부터 추출된 핵산의 양이나 질이 좋지 못할 경우에 RNA를 물리적 또는 화학적인 방법으로 절단한 후 사용하면 증폭의 효과를 나타내기 때문에 좀 더 나은 결과를 얻을 수 있다. 또한, dT 프라이머 또는 역방향(reverse) 프라이머의 경우 mRNA의 3＇방향에서만 핵산 합성이 가능하지만, N-프라이머의 경우에 양 방향 모두에서 핵산의 합성이 이루어지기 때문에 시료내에 존재하는 네거티브 가닥으로부터 핵산이 합성될 수 있어서 역시 진단 대상의 증폭 효과가 있다.

셋째, 시료에 포함된 특정 무엇을 확인하기 위하여 PCR 등의 도구를 이용하여 실험을 하였을 경우 그 무엇이 확인되지 않았을 경우 이 시료는 쓸모가 없어지게 된다. 그러나 N-프라이머를 이용하여 핵산을 합성할 경우 이 시료를 보관하여 두었다가 추후에 그 무엇이 밝혀지면 이 시료를 재사용하여 시험할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 병과 같은 증상이 고추에 나타나 고추에 감염하는 모든 바이러스를 대상으로 진단하였으나 어떠한 바이러스도 검출되지 않았을 경우 특이적인 역방향 프라이머 또는 올리고 dT 프라이머로 핵산이 합성된 고추 시료는 버려지지만 N-프 라이머로 핵산을 합성한 시료는 보관하여 추후에 새로운 바이러스가 고추를 감염한다는 사실이 알려지면 이 시료를 다시 사용하여 새로운 바이러스에 감염되었는지 확인해 볼 수 있다. 이러한 점은 N-프라이머의 장점으로 활용될 수 있다.

본 발명의 핵산 합성 방법은 RNA를 단편화시키는 단계를 포함한다. 상기 RNA는 mRNA, 폴리-A 테일을 갖지 않는 rRNA, 또는 바이러스 또는 원핵생물의 RNA일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 실제 N-프라이머를 이용하여 mRNA를 cDNA로 전환하면 합성된 cDNA는 poly-T 서열을 가진 프라이머를 이용하여 합성된 cDNA처럼 대부분이 전장 mRNA에서 합성된 것처럼 나타나기 때문에 이러한 단점을 보완하기 위해 순수 분리된 mRNA를 물리적 또는 화학적인 방법으로 절단한 후 N-프라이머를 이용하여 cDNA를 합성하는 것이다. 상기 RNA의 단편화는 초음파 분해 (sonication)를 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않고 RNA를 단편화시키는 임의의 물리적 또는 화학적 방법을 사용할 수도 있다. 초음파 분해를 통해 단편화된 RNA의 크기는 0.5~1.5kb인 것이 바람직하다. 단편화된 RNA의 크기가 상기 범위를 벗어나면 현재 기술로 single-pass 시퀀싱에 의해 해독 가능한 크기에 비해 효율적인 시퀀싱 결과를 얻을 수 없어 동일한 정보를 획득하기 위하여 불필요하게 많은 수의 클론이 시퀀싱되어야 할 뿐만 아니라 시퀀싱 결과를 assembly 하는데 있어서 많은 문제를 야기할 수 있으며, 1.5kb보다 크면 양쪽 말단의 시퀀싱을 통해 한 번에 해독할 수가 없기 때문이다.

본 발명의 방법에서 주형으로서 사용되는 핵산인 RNA는 핵산을 포함할 수 있는 어느 샘플로부터 분리하거나 제조할 수 있다. 핵산을 포함할 수 있는 샘플의 예 는, 제한하는 것은 아니지만, 전체 혈액, 혈청, 백혈구층(buffy coat), 소변, 대변, 뇌척수액, 정액, 침, 조직(예: 종양 조직 또는 림프절) 및 세포 배양액 (예: 포유류 세포 배양액 또는 박테리아 세포 배양액)과 같이 유기체로부터의 샘플, 비로이드(viroid), 바이러스, 박테리아, 진균, 효모, 식물 및 동물과 같이 핵산을 포함하는 샘플, 바이러스 또는 박테리아와 같은 미생물로 오염되거나 감염된 것으로 예측되는 샘플(예; 식품 또는 생물학적 제제), 및 토양 및 폐수와 같이 유기체를 포함할 수 있는 샘플을 포함한다. 핵산은 이에 제한되지 않고, 예를 들면, 세제를 사용하는 세포 용해, 초음파 처리, 글래스 비드 또는 프렌치 프레스(French press)를 사용하는 진탕/교반을 사용하여 상기 언급된 물질로부터 제조할 수 있다.

본 발명의 핵산 합성 방법은 또한 상기 단편화된 RNA를 주형으로 하고, N-프라이머를 상기 주형에 어닐링시켜 제1가닥 (first strand) cDNA를 합성하는 단계를 포함한다. 제1가닥 cDNA를 합성하는 방법은 당 업계에 통상적으로 이용되는 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, 역전사효소, RNase 블록 리보뉴클레아제 저해제 등을 이용하여 제1가닥 cDNA를 합성할 수 있다. 역전사 효소의 예는 다양한 소스로부터 기원한 역전사 효소, 예를 들면, 조류 골수아세포증바이러스-유래 역전사 효소(avian myeloblastosis virus-derived virus reverse transcriptase(AMV RTase)), 마우스 백혈병 바이러스-유래된 역전사 효소(murine leukemia virus-derived virus reverse transcriptase(MMLV RTase) 및 라우스-관련 바이러스 2 역전사효소 (Rous-associated virus 2 reverse transcriptase(RAV-2 RTase)를 포함한다.

그러나 프라이머는 특정 N-프라이머를 이용하는 것이다. N-프라이머는 각각의 뉴클레오티드 위치에 G, A, T 및 C가 모두 위치할 수 있는 프라이머로서, 예를 들면, 30개 뉴클레오티드의 N-프라이머라면 예상할 수 있는 프라이머의 조합의 수는 4³⁰개이다. 상기 N-프라이머의 길이는 5~50개 뉴클레오티드인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 25~30개 뉴클레오티드이다. N-프라이머의 길이가 상기 범위를 벗어나면 원하는 크기의 핵산 합성의 효율이 저하될 가능성이 있기 때문이다.

본 발명의 핵산 합성 방법은 또한 상기 합성된 제1가닥 cDNA에 DNA 중합효소를 첨가하여 제2가닥 (second strand) cDNA를 합성하는 단계를 포함한다. 제2가닥 cDNA를 합성하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, RNase H, DNA 중합효소 I 등을 이용하여 제2가닥 cDNA를 합성할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 DNA 중합효소는 주형으로서 DNA 가닥을 사용하여 새롭게 DNA 가닥을 합성하는 효소를 언급한다. DNA 중합효소는 제한하는 것은 아니지만, Pol I-형 DNA 중합효소(예: 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) DNA 중합효소 I, 클레나우 단편 및 Taq DNA 중합효소), α-형 DNA 중합효소 (예: 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus(Stratagene))로부터의 DNA 중합효소, VENT DNA 중합효소 (New England Biolabs), KOD DNA 중합효소 (Toyabo) 및 DEEP VENT DNA 중합효소 (New England Biolabs)) 및 비-α-, 비-Pol I-형 DNA 중합효소 (예: WO 97/24444에 기재되어 있는 DNA 중합효소)를 포함한다. 가닥 치환 활성을 갖는 DNA 중합효소는 바실러스 칼도테넥스 (Bacillus caldotenax) 및 바실러스 스테아로써모 필루스(Bacillus stearothermophilus)와 같은 바실러스 속의 고온성 세균으로부터의 DNA 중합효소 및 그들의 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결핍된 이들 DNA 중합효소의 변이체를 포함한다. 또한, 가닥 치환형의 DNA 중합효소는 가닥 치환 활성은 갖고 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성은 갖지 않는 DNA 중합효소, 예로서 클레나우 단편를 포함한다. 또한, DNA 중합효소는 제한되지 않고, 예를 들면, 치환 활성을 갖는 DNA 중합효소 및 치환 활성을 갖지 않는 DNA 중합효소의 혼합물과 같은 다수의 DNA 중합효소의 혼합물일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 "가닥 치환 활성"은 가닥을 치환할 수 있는 활성, 즉, DNA 가닥을 치환하여 주형 가닥에 어닐링된 상보적인 가닥을 분리시키면서 주형으로 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 DNA를 복제할 수 있는 활성을 언급한다. 또한, 본 명세서에서 가닥 치환으로부터 수득한 주형으로서 뉴클레오타이드 서열로부터 분리된 DNA 가닥을 "치환된 가닥"으로서 언급한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

RNA를 단편화시키는 단계;

상기 합성된 제1가닥 cDNA에 DNA 중합효소를 첨가하여 제2가닥 (second strand) cDNA를 합성하는 단계를 포함하는, cDNA 라이브러리의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에서, 상기 RNA의 단편화는 초음파 분해 (sonication)를 통해 수행될 수 있으며, 상기 단편화된 RNA의 크기는 0.5~1.5kb인 것이 바람직하다. 또 한, 상기 N-프라이머의 길이는 5~50개 뉴클레오티드인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 25~30개 뉴클레오티드이다. N-프라이머의 길이가 상기 범위를 벗어나면 원하는 크기의 핵산 합성의 효율이 저하될 가능성이 때문이다. RNA의 단편화, N-프라이머, DNA 중합효소 등에 관한 자세한 내용은 전술한 바와 같다.

cDNA 라이브러리를 제조하기 위한 방법은 상기 본 발명의 특징적인 단계 이외에도 예를 들면, 이에 제한되지 않고, cDNA 말단 정리 (termini blunting), 제한효소 (예를 들면, EcoRI) 어댑터(adaptor) 연결과 말단 인산화, 제한효소 처리 (예를 들면, XhoI 효소 처리), 겔 용출을 통한 cDNA 분리, cDNA 인서트-벡터 연결, 패키징 반응 및 매스 익시전 (mass excision) 등의 일반적인 단계를 포함할 수 있다. 상기 일반적인 단계는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 cDNA 라이브러리의 제조 방법에 의해 제조된 cDNA 라이브러리를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 N-프라이머 및 핵산 합성에 필요한 기타 시약을 포함하는 핵산 합성용 키트를 제공한다. 상기 N-프라이머의 길이는 5~50개 뉴클레오티드인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 25~30개 뉴클레오티드이다. N-프라이머의 길이가 상기 범위를 벗어나면 원하는 크기의 핵산 합성의 효율이 저하될 가능성이 있기 때문이다. 핵산 합성에 필요한 기타 시약은 예를 들면, 이에 제한되지 않고, 역전사효소, DNA 중합효소, RNase H 등일 수 있다. 또한, 상기 키트는 안내서를 포함할 수 있다. "안내서"는 키트 사용법, 예를 들면, 핵산 합성 반응용 시약 용액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하 는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

하기에 구체적으로 기재되지 않은 실험 방법은 당업계에 공지된 일반적인 분자생물학적 방법에 따라 수행할 수 있다.

실시예 1: N-프라이머를 이용한 cDNA 라이브러리 제작

N-프라이머 cDNA 라이브러리는 Stratagene ZAP-cDNA Gigapack Ⅲ Gold Cloning Kit (cat.#200450)을 사용하여 그 프로토콜을 기준으로 실험하였다. 샘플은 클론텍(Clontech) 제품의 사람 간, 뇌(human liver and brain) mRNA를 이용하여 cDNA 라이브러리를 제작하였다.

1. mRNA 초음파 분해(sonication)

mRNA 5㎍을 총 부피 400㎕로 맞추고 sonics & materials.inc.의 초음파 분해기를 사용하여 6초간 초음파 분해(sonication) 하였다. 분해된 mRNA에 100% 에탄올 800㎕와 3M 소듐아세테이트(sodium acetate) 40㎕를 첨가하여 앞뒤로 뒤집어 용액 을 잘 섞어서 -20℃에서 1시간 동안 침전시켰다. 침전된 샘플을 4℃, 13000rpm에서 30분간 원심분리하고 용기 바닥에 침전된 mRNA만 남기고 상등액을 제거하였다. 침전물에 1.2ml의 70% 에탄올을 첨가하여 불순물들을 세척한 후, 4℃, 13000rpm에서 10분간 원심분리하고 상등액을 제거하여 잘 말린 mRNA에 DEPC 처리된 멸균수를 넣어 용해시켰다. 도 1은 인간 간 및 뇌에서 분리한 mRNA를 초음파 분해한 후, 아가로즈 겔 전기영동한 사진이다. 초음파 분해하여 제조된 최종 mRNA 20㎕ 중 0.4㎕ (총 100ng)를 1% 아가로즈 겔에 로딩한 것이다. 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 0.5-1.5kb 크기 범위의 RNA가 대부분인 것을 관찰할 수 있다.

2. 첫 번째 가닥 (First-strand) cDNA 합성

10x 첫 번째 가닥 버퍼(first-strand buffer) 5㎕, 첫 번째 가닥 메틸뉴클레오타이드 혼합물 (first-strand methylnucleotide mixture) 3㎕, XhoⅠ-N25 프라이머 (5'-GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAAGCTTCTCGAGN₍₂₅₎-3' 프라이머; 서열번호 1) 9㎍, RNase 블록 리보뉴클레아제 저해제 (block ribonuclease inhibitor - 40U/㎕) 1㎕를 초음파 분해 처리된 mRNA에 첨가하여 부드럽게 섞어 37℃에서 10분 동안 반응시켰다. 반응된 샘플에 strata script RTase (50U/㎕) 2.25㎕를 첨가하여 다시 37℃, 10분 동안 반응시키고 그 후 42℃에서 50분간 cDNA를 합성하였다.

3. 두 번째 가닥 (Second-strand) cDNA 합성

첫 번째 가닥이 합성된 cDNA와 두 번째 가닥 합성에 사용할 반응물들을 모두 16℃ 이하로 온도를 낮추기 위하여 얼음에 5분간 정치시켰다. 그리고 10x second-strand buffer 20㎕, second-strand dNTP 혼합물 8㎕, 멸균수 107.5㎕와 첫 번째 가닥 cDNA 샘플 45㎕를 섞어 주고 RNase H(1.5U/㎕), DNA 중합효소Ⅰ(polymeraseⅠ)(9U/㎕)을 더 혼합하여 부드럽게 섞어준 후 16℃에서 2시간 30분 동안 반응시켰다. 반응된 샘플을 꺼낼 때 즉시 얼음에 넣어 온도가 올라가 헤드핀 구조가 생성되지 않게 주의한다. 도 2는 인간 간 및 뇌에서 분리한 mRNA를 초음파 분해한 후, 합성한 제1가닥 cDNA 및 제2가닥 cDNA의 아가로즈 겔 전기영동 사진이다. 합성된 제1가닥 cDNA 및 제2가닥 cDNA의 각각 10%를 1% 아가로즈 겔에 로딩한 것이다. 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 적당한 크기의 cDNA가 합성되었다는 것을 알 수 있다.

4. cDNA 말단 정리 (cDNA termini blunting)

합성된 cDNA 샘플 200㎕에 blunting dNTP mix 23㎕, cloned pfu DNA 중합효소 (2.5U/㎕) 2㎕를 넣고 즉시 볼텍스(vortex)를 이용하여 섞어준 후, 72℃에서 정확히 30분 동안 반응시켰다. 그 후, 페놀-클로로포름 (1:1, pH7-8) 200㎕를 첨가하여 볼텍싱(vortexing)하여 잘 섞어 최대 속도로 2분간 원심분리하였다. 상층액을 새로운 튜브로 옮기고 클로로포름을 동량 첨가해서 볼텍싱(vortexing)하여 최대 속도로 2분간 원심분리하였다. 다시 상층액을 새로운 튜브에 옮겨 100% 에탄올 400㎕, 3M 소듐아세테이트(sodium acetate) 20㎕ 첨가하여 잘 섞어준 후 -20℃에 밤새 정치시켰다. 정치시켰던 샘플을 15000rpm, 4℃에서 60분 동안 원심분리하고 상층을 제거하여 80% 에탄올 500㎕를 첨가하였다. 이때 바닥에 침전된 cDNA가 보이는데, 섞지 않고 상온에서 2분간 원심분리한 후, 에탄올을 제거하고 10분 동안 건조하여 EcoRⅠ어댑터(adapter)를 9㎕ 첨가해서 4℃에서 2시간 용해시켰다.

5. EcoRⅠ 어댑터(adapter) 연결과 말단 인산화(phosphorylating)

준비된 샘플에 10x 라이게이즈 버퍼 (ligase buffer) 1㎕, 10mM rATP 1㎕, T4 DNA 라이게이즈 (ligase)(4U/㎕) 1㎕를 섞어 4℃에 2일 동안 라이게이션(ligation) 시켰다. 2일 후 70℃에서 30분 동안 불활성화 반응을 진행하고 상온에 5분간 정치시킨 후, 10x 라이게이즈 버퍼(ligase buffer) 1㎕, 10mM rATP 2㎕, T4 폴리뉴클레오타이드 카이네이즈(polynucleotide kinase)(5U/㎕) 2㎕, 멸균수 5㎕를 첨가하여 37℃에서 30분 동안 어댑터를 연결시켰다. 그리고 70℃에 30분 동안 불활성화 반응을 거쳐 상온에 5분 동안 정치시킨 후 이후 과정을 진행하였다.

6. XhoⅠ 효소 처리

인산화된 cDNA 가닥을 XhoⅠ제한효소로 자르기 위해, XhoⅠ 버퍼 추가물(buffer supplement) 28㎕, XhoⅠ(40U/㎕) 3㎕, 인산화된 cDNA 샘플 22㎕를 섞어 37℃에서 1시간 30분 동안 반응시켰다. 그 후 10x STE 버퍼 5㎕, 100% 에탄올 125㎕를 넣고 -20℃에 밤새 정치시켰다. 다음날 14000rpm, 4℃에서 한시간 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고 건조시킨 후 1x STE 버퍼(buffer) 14㎕를 넣어 건조된 cDNA를 용해시켰다.

7. 겔 용출 (gel elution)을 이용한 cDNA 분리 추출

0.7% 아가로즈 젤(agarose gel)에 샘플을 로딩(loading)하여 25V로 70분 동안 러닝(running)한 후, 500bp~1.5kb 길이의 cDNA만 잘라 QIAquick gel extraction kit(Qiagen, cat.28706)를 이용하여 추출하였다. 추출한 cDNA에 100% 에탄올 80㎕, 3M 소듐아세테이트(sodium acetate) 4㎕ 첨가하여 잘 섞어준 후 -20℃에 1시간 동안 정치시켰다. 정치시켰던 샘플을 15000rpm, 4℃에서 60분 동안 원심분리하고 상층을 제거하여 70% 에탄올 200㎕를 넣어주고 상온에서 2분간 원심분리한 후, 남아있는 에탄올을 모두 제거하고 건조하여 멸균수 4.5㎕에 용해하였다. 도 3은 합성한 제1가닥 cDNA 및 제2가닥 cDNA를 XhoI 제한효소로 처리한 후, cDNA 인서트를 용출하기 위해 0.7% 아가로즈 겔 전기영동한 사진이다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 적당한 크기의 cDNA가 합성되었다는 것을 알 수 있다.

8. cDNA 인서트-벡터 연결(insert-vector ligating)

준비된 샘플 3.5㎕, Uni-ZAP XR 벡터(1㎍/㎕) 1㎕, 10x 라이게이즈 버퍼(ligase buffer) 0.5㎕, 10mM rATP(pH7.5) 0.5㎕, T4 DNA 라이게이즈(ligase)(4U/㎕) 0.5㎕를 섞어 4℃에서 2일 동안 라이게이션(ligation) 시켰다.

9. 패키징 반응(packaging reaction)

-80℃에 보관된 패키징 익스트랙트(packaging extract)를 얼음 위에 꺼내어 막 녹기 시작할 때 준비된 샘플 중 4㎕를 즉시 첨가하였다. 첨가할 때 공기방울이 들어가지 않게 조심히 팁(tip)으로 살살 돌려 섞어 준 후, 재빨리 2-3초간 원심기에 돌려주고 22℃에 2시간 정치시켰다. 그리고 SM 버퍼(buffer) 500㎕와 클로로포름 20㎕를 첨가하여 부드럽게 섞어주고 간단하게 원심분리하여 찌꺼기를 침전시켜 상층액만 새로운 튜브에 이동하여 4℃에 보관하였다. 패키징된 샘플과 10mM MgSO₄로 OD₆₀₀를 0.5로 맞춘 엑스엘원-블루 엠알에프' 셀(XL1-Blue MRF' cell)을 섞어 37℃에서 15분간 반응시켰다. 그리고 X-gal과 IPTG가 첨가된 NZY 탑 아가(top agar) 배지에 섞어 NZY 아가(agar) 배지 위에 부어 12시간동안 37℃에서 키운 후 역가(titer)를 확인하였다.

10. 매스 익시전(mass excision)

패키징(packaging)한 샘플, 엑스엘원-블루 엠알에프' 셀(XL1-Blue MRF' cell)과 ExAssist 헬퍼 파아지(helper phage)를 섞어 37℃에서 15분 동안 반응시키고 엘비 브로스 배지(LB broth with supplements) 20ml을 섞어 37℃에서 3시간 200rpm으로 흔들어 배양하였다. 그 후 65℃에서 20분 동안 열을 가해 세포(cell)를 라이시스(lysis)시키고 1000g로 10분 동안 원심분리하여 찌꺼기를 제거한 상등액을 새로운 튜브로 옮겼다. 상등액을 SOLR 셀(cell)과 섞어 37℃에서 15분간 반응하고 X-gal과 IPTG가 포함된 LB-암피실린(ampicillin) 플레이트(plate)에 필요한 양을 도말하여 37℃에서 밤새 키웠다. 하얀 콜로니(white colony)만 키워 RBC hiyield miniprep kit을 이용하여 DNA를 추출하였다.

실시예 2: 본 발명의 핵산 합성 방법과 기존 방법의 비교

본 발명의 방법 (이하, kribb 방법이라 함)에 의해 합성된 핵산에 의해 제작된 라이브러리에서 임의로 선택된 클론의 염기서열과 기존 방법 [Andrew J. G. Simpson 등, (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(7): 3491-3496; 이하, pnas 방법이라 함]에 의해 합성된 핵산의 크기 및 전장 RNA에 대비한 상대적인 위치 분포를 비교하였다. 5'과 3'은 National Center for Biotechnology Information (NCBI)에 공개된 정보 가운데 임의로 추출된 EST의 시퀀싱 결과를 추출하여 비교 분석에 사용하였다. pnas 방법은 전장 RNA와 무작위로 선택된 프라이머를 이용하여 한 가닥의 cDNA를 합성하고 PCR을 이용하여 두 번째 가닥의 cDNA를 합성하여 라이브러리를 제작하였다. 자세한 절차는 Andrew J. G. Simpson 등에 기재된 방법을 참고한다.

도 4 및 5는 라이브러리에서 무작위적으로 선택된 클론들을 시퀀싱하여 획득된 결과를 전장 (full-length) cDNA 서열과 비교하여, 각각의 클론의 전장 cDNA 서열과의 상대적인 위치를 표시하고 있다. 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, NCBI에 공개된 정보 가운데 5' 및 3' 방향에서 시퀀싱한 결과, pnas 방법에 의하여 나타난 결과도 마찬가지로 무작위적으로 추출하여 본 발명의 결과와 비교하였다. 5' 부위에서 시퀀싱한 결과를 보면 대부분이 전장 cDNA 서열의 앞쪽 20%에 분포하며, 3' 부위에서 시퀀싱한 결과를 보면 대부분이 전장 cDNA 서열의 뒤쪽 20%에 분포한다는 것을 알 수 있다. 그러나, kribb 방법 및 pnas 방법은 전장 cDNA 서열에 거의 균일하게 분포한다는 것을 알 수 있다. 즉, kribb 방법 및 pnas 방법 양자는 합성된 핵산이 전장 cDNA 서열의 거의 전부를 포함한다는 것을 알 수 있다. 따라서 기존에 널리 활용되는 라이브러리 제작 방식은 발현 유전체 정보를 생산하면 할수록 비효율적인 중복된 정보만이 반복적으로 나타나게 된다. 이러한 문제를 극복하기 위하여 전장 cDNA를 확보하여 시퀀싱하는 방향으로 연구가 진행되고 있지만, 궁극적으로는 조직 특이성 및 질병관련 alternative splicing form에 대한 정보는 획득할 수 없다. 그러나 kribb 방법은 비효율적인 중복된 정보의 생산을 방지함은 물론 조직 특이성 및 질병관련 alternative splicing form에 대한 정보를 용이하게 획득할 수 있다.

도 6은 kribb 방법 및 pnas 방법에 따라 제작된 라이브러리에서 임의로 선택된 클론의 인서트의 염기서열을 single-pass 시퀀싱에 의해 결정한 결과 나타난 인서트의 크기를 비교한 것이다. 도 6에서 x축은 서열 결정된 핵산의 길이를 나타내며, y축은 해당 크기의 서열을 가진 클론의 수이다. 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, pnas 방법에 의해 합성된 핵산은 서열 결정된 핵산의 길이가 대부분 400bp 이하인 반면, kribb 방법에 의해 합성된 핵산은 서열 결정된 핵산의 길이가 대부분 600~800bp라는 것을 알 수 있다. 즉, pnas 방법에 의해 합성된 핵산은 추정하건데 PCR이 가지는 한계로 인해 그 길이가 대부분 비효율적으로 작고 랜덤 프라이머에 의해 cDNA가 합성되기 때문에 특정한 서열을 가진 mRNA는 cDNA로 전환되지 않을 가 능성이 높으며 인서트의 크기가 지나치게 작아서 EST의 assembly를 하는데 있어서 많은 문제점을 야기할 수 있을 뿐만 아니라 시퀀싱을 할 경우 많은 비용이 투입되어야하는 비효율성을 극복하기 불가능한 반면, kribb 방법에 의해 합성된 핵산을 가지고 라이브러리를 제작할 경우 인서트의 크기를 상황에 따라 가장 효율적인 크기로 조절 가능할 뿐만 아니라 pnas 방법과 달리 발현되는 모든 유전자의 서열이 다르더라도 N-프라이머에 의해 모든 mRNA가 cDNA로 전환된다. 따라서 기존의 라이브러리 제작 방식에서 나타나는 모든 문제점을 완전하게 해결할 수 있다.

도 1은 인간 간 및 뇌에서 분리한 mRNA를 초음파 분해한 후, 아가로즈 겔 전기영동한 사진이다.

도 2는 인간 간 및 뇌에서 분리한 mRNA를 초음파 분해한 후, 합성한 제1가닥 cDNA 및 제2가닥 cDNA의 아가로즈 겔 전기영동 사진이다.

도 3은 합성한 제1가닥 cDNA 및 제2가닥 cDNA를 Xho I 제한효소로 처리한 후, 0.5~1.5kb 크기의 cDNA 인서트를 용출하고 나서 0.7% 아가로즈 겔 전기영동으로 확인된 사진이다.

도 4는 선택되어 시퀀싱된 클론들이 가지는 인서트가 전장 (full-length) cDNA 서열을 기준으로 상대적으로 어느 부위에 위치하는지를 라이브러리 제작 방식에 따라 나타난 결과를 보여주는 그림이다.

도 5는 도 4의 그림을 연속적으로 나타낸 것이다.

도 6은 kribb 방법 및 pnas 방법에 따라 합성된 핵산의 서열 결정의 결과를 비교한 것으로, pnas 방법의 경우는 인서트의 크기가 대부분 0.5kb 미만으로 나타났으며, kribb 방법은 인서트의 크기가 대부분 0.5kb 이상으로 나타남을 보여주는 그림이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Method for the synthesis of nucleic acid by using fragmented nucleic acids and N-primer <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N25 primer <400> 1 gagagagaga gagagagaga agcttctcga gnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnn 56

Claims

RNA를 단편화시키는 단계;

상기 단편화된 RNA를 주형으로 하고, N-프라이머를 상기 주형에 어닐링시켜 제1가닥 (first strand) cDNA를 합성하는 단계; 및

상기 합성된 제1가닥 cDNA에 DNA 중합효소를 첨가하여 제2가닥 (second strand) cDNA를 합성하는 단계를 포함하는, 핵산의 합성 방법.
제1항에 있어서, 상기 RNA의 단편화는 초음파 분해 (sonication)를 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 단편화된 RNA의 크기는 0.5~1.5kb인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 N-프라이머의 길이는 5~50개 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 RNA는 mRNA, 폴리-A 테일을 갖지 않는 rRNA, 또는 바이러스 또는 원핵생물의 RNA인 것을 특징으로 하는 방법.
RNA를 단편화시키는 단계;

상기 단편화된 RNA를 주형으로 하고, N-프라이머를 상기 주형에 어닐링시켜 제1가닥 (first strand) cDNA를 합성하는 단계; 및

상기 합성된 제1가닥 cDNA에 DNA 중합효소를 첨가하여 제2가닥 (second strand) cDNA를 합성하는 단계를 포함하는, cDNA 라이브러리의 제조 방법.
제6항에 있어서, 상기 RNA의 단편화는 초음파 분해 (sonication)를 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 단편화된 RNA의 크기는 0.5~1.5kb인 것을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 N-프라이머의 길이는 5~50개 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법.
제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된 cDNA 라이브러리.
N-프라이머 및 핵산 합성에 필요한 기타 시약을 포함하는 핵산 합성용 키트.
제11항에 있어서, 상기 N-프라이머의 길이는 5~50개 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 키트.