KR20090035808A

KR20090035808A - 백혈병 진단용 핵산

Info

Publication number: KR20090035808A
Application number: KR1020070100793A
Authority: KR
Inventors: 서상범; 김동욱; 김지영; 이규선
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단; 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2007-10-08
Filing date: 2007-10-08
Publication date: 2009-04-13
Also published as: KR100993531B1

Abstract

본 발명은 인간 RE-IIBP(response element-II binding protein) 유전자의 5'-UTR 염기서열 중에서 RE-IIBP 유전자에 특이적인, 서열번호 1의 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열로 이루어지는 핵산, 또는 이의 일부로서 서열번호 1의 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기 핵산을 포함하는 포유류의 백혈병 진단용 올리고뉴클레오티드 칩에 관한 것이며, 나아가 RE-IIBP의 발현 여부를 측정하는 것을 포함하는 백혈병 진단방법 및 메틸화된 히스톤에 대한 항체를 이용한 백혈병 진단방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 핵산, 올리고뉴클레오티드 칩 및 백혈병 진단방법은 B-세포 급성 림프아구성 백혈병, T-세포 급성 림프아구성 백혈병 및 급성 골수성 백혈병 등 다양한 백혈병의 진단에 유용하다.

RE-IIBP, 히스톤 메틸 전이효소, 백혈병

Description

백혈병 진단용 핵산{Nucleic Acids for Diagnosing Leukemia}

본 발명은 백혈병 진단에 유용한 핵산에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 백혈병 진단용으로 유용한 인간 RE-IIBP 유전자의 5'-UTR에 관한 것이다.

인간 인터루킨-5(IL-5) 유전자의 프로모터 부위는 전사조절인자가 특이적으로 결합하는 세 개의 REs(response elements)를 갖고 있으며, 그 중에서 RE-I은 -79 내지 -45 위치에, RE-II는 -123 내지 -92 위치에, RE-III는 -170 내지 -130 위치에 각각 존재한다(Stranick et al., Identification of Transciption Factor Binding Sites Important in the Regulation of the Human Interleukin-5 Gene, The Journal of Biological Chemistry, 272:16453-16465 (1997)).

인간 RE-IIBP(RE-II binding protein)는 MMSET(다발성 골수종 SET 도메인(Multiple Myeloman SET domain))으로도 알려져 있는 WHSC1(울프-허쉬호른 증후군 후보 1(Wolf-Hirschhorn syndrom candidate 1)) 유전자의 인트론 11에서부터 전사가 개시됨으로써 WHSC1의 C-말단과 동일한 아미노산 서열을 나타내는 단백질로 서, PHD(plant homeodomain)와 SET 도메인을 갖고 있으며, RE-II에 결합하여 IL-5의 전사를 억제한다(Garlisi et al., A Unique mRNA Initiated within a Middle Intron of WHSC1/MMSET Encodes a DNA Binding Protein That Suppresses Human IL-5 Transcription, American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, 24:90-98 (2001)). 인간 RE-IIBP 유전자의 염기서열 및 그에 의해 암호화되는 RE-IIBP의 아미노산 서열은 유전자은행 접속번호 제AF330040호(GenBank Accession No. AF330040)로 공개되어 있다.

한편, 백혈병의 진단은 일반적으로 골수 세포를 현미경으로 관찰하여 비정상적인 암세포의 형태와 염색 양상을 관찰하는 일차 과정을 통해 이루어지고 있으며, 진단에 도움이 되는 단백질 항체를 이용한 면역학적 방법도 병용되고는 있지만, 아직까지 병리학적 혹은 조직학적으로 백혈병을 진단할 수 있는 기준이 명확하지 않은 실정이다.

따라서 보다 쉽고 정확하게 백혈병 진단을 위하여 유의성이 높은 백혈병 진단 마커의 개발이 요구되고 있다.

본 발명의 목적은 다양한 백혈병을 진단할 수 있는 유의성이 높은 진단용 핵산을 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명은 상기 진단용 핵산을 포함하는 백혈병 진단용 올리고뉴클레 오티드 칩의 제공을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 백혈병의 종류를 불문하고 이를 진단할 수 있는 방법의 제공을 목적으로 한다.

본 발명은 서열번호 1의 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열로 이루어지거나, 또는 이의 일부로서 서열번호 1의 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산을 제공한다.

본 발명에 있어서 상기 핵산은 서열번호 1 또는 이에 상보적인 서열에 특이적으로 결합할 수 있다면 어떠한 길이의 것도 될 수 있으며, 예를 들면, 서열번호 1 또는 이에 상보적인 염기서열의 7개 내지 50개, 또는 적어도 17개 이상이거나 적어도 24개 이상의 염기서열로 이루어질 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 핵산은 서열번호 2 또는 3으로 기재된 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열로 이루어질 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 핵산은 포유류의 백혈병을 진단하기 위한 것이며, 이때 포유류는 인간이거나 인간을 제외한 포유류 동물이다. 또한 상기 백혈병은 바람직하게는 B-세포 급성 림프아구성 백혈병(B-cell acute lymphoblastic leukemia; B-ALL), T-세포 급성 림프아구성 백혈병(T-cell acute lymphoblastic leukemia; T-ALL), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia; AML), 급성 단핵구성 백혈병(acute monocytic leukemia) 및 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia; CML)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이고, 보다 바람직하게는 B-ALL, T-ALL 및 AML로 구성된 군으로부터 선택되는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 상기 핵산을 포함하는 포함하는 포유류의 백혈병 진단용 올리고뉴클레오티드 칩을 제공하며, 이때 포유류는 인간이거나 인간을 제외한 포유류 동물이다.

본 발명은 골수의 단핵세포에서 RE-IIBP의 발현 여부를 측정하는 것을 포함하는 포유류의 백혈병을 진단하는 방법을 제공하며, 이때 포유류는 인간이거나 인간을 제외한 포유류 동물이다. 골수의 단핵세포에서 RE-IIBP 유전자의 발현 여부를 측정하는 것은, 예를 들어, 상기 기재된 핵산을 프라이머 또는 탐침으로 이용함으로써 수행할 수 있다.

본 발명은 골수의 단핵세포에 히스톤 단백질의 메틸화 여부를 측정하는 것을 포함하는 포유류의 백혈병을 진단하는 방법을 제공하며, 이때 포유류는 인간이거나 인간을 제외한 포유류 동물이다.

본 발명에 따른 핵산, 백혈병 진단용 올리고뉴클레오티드 칩 및 백혈병 진단방법을 이용하면, 종류에 관계 없이 각종 백혈병의 발병 여부를 신속하고 간단하고 진단할 수 있다.

쥐의 RE-IIBP는 서열번호 4에 기재된 바와 같이 704개의 아미노산으로 이루어져 있으며, 도 1에서 보듯이, 유전자은행 접속번호 제AF330040호와 공개된 서열번호 5의 인간 RE-IIBP의 아미노산 서열과 거의 유사하다. 도 2에 도시한 바와 같이, 쥐의 RE-IIBP는 172번째 내지 214번째 아미노산 서열에서 PHD(plant homeo domain)를 갖고 있고, 217번째 내지 279번째 아미노산 서열에서 PWWP 도메인을 갖고 있다. 이 두개의 도메인은 각각 단백질 간의 결합이 가능하다고 알려진 도메인으로서, RE-IIBP가 다른 단백질과 결합할 수 있음을 시사한다. 또한 쥐의 RE-IIBP에서 402번째 내지 525번째 아미노산 서열에는 SET 도메인이 존재한다. SET 도메인은 갖고 있는 여러 단백질들이 히스톤 메틸 전이효소(histone methyl transferase) 활성을 나타내고는 것으로 알려져 있으나, SET 도메인을 둘러싼 앞뒤로 특징적인 구조를 가진 pre-SET 부분과 post-SET 부분이 동시에 요구되는 것으로 알려져 있다. 본 발명자들의 연구에 따르면, RE-IIBP는 히스톤 H3 단백질을 메틸화 시키는 활성을 갖고 있다(도 3).

최근의 연구에 의하면, 히스톤 메틸 전이효소는 전립선 암 발달시 안드로젠 수용체와 상호작용하여 전사조절에 관여하는 것으로 보고되었으며(Wang et al., Identification and characterization of a novel androgen receptor coregulator ARA267-alpha in prostate cancer cells, The Journal of Biological Chemistry, 276:40417-40423 (2001); Geetha et al., NSD1 is essential for early post-implantation development and has a catalytically active SET domain, The EMBO Journal, 22:3153-3163 (2003)), 또한 전립선 암 뿐만 아니라 MLL 유전자의 치환에 의해 급성 골수성 백혈병을 유발한다는 사실도 알려져 있다(Srinivasan et al., The synthetic peptide PFWT disrupts AF4-AF9 protein complexes and induces apoptosis in t(4;11) leukemia cells, Leukemia, 18:1364-1372 (2004)).

본 발명자들은 인간 RE-IIBP 유전자의 염기서열을 아형(isoform)인 WHSC1 유전자의 염기서열과 대비하여, 인간 RE-IIBP 유전자의 염기서열 중에서 서열번호 1로 기재된 -960번째 내지 -592번째 염기서열의 5'-UTR(untranslated region)이 인간 RE-IIBP 유전자에 특이적인 서열임을 밝혀내고(도 4), 이를 탐침으로 하여, 인체의 뇌, 심장, 근육, 소장, 비장, 흉선 등의 각 조직으로부터 얻은 mRNA 시료에 대해 노던 블롯팅을 수행한 결과, RE-IIBP가 흉선에서 특이적으로 발현하는 것을 알아냈다(도 5).

나아가 본 발명자들은 각종 백혈병 환자로부터 얻은 골수에서 단핵세포를 분리하여 이로부터 mRNA를 추출한 다음, 서열번호 1의 5'-UTR을 증폭시킬 수 있는 서열번호 2 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드를 각각 정방향 및 역방향 프라이머로 사용하여 RT-PCR을 수행한 결과, 도 6에서 보듯이, 놀랍게도 정상인의 샘플에서는 나타나지 않았으나 모든 백혈병 환자들의 샘플에서는 RE-IIBP가 발현하고 있는 것을 발견하였다. 아울러 상기 백혈병 환자들의 골수 단핵세포로부터 히스톤을 분리하여 항-판 메틸 라이신 항체 및 항-디메틸 히스톤 H3K27 항체와 배양한 결과, 도 7에서 보듯이, 모든 백혈병 환자의 히스톤 H3 단백질이 메틸화되어 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

이에, 본 발명은 RE-IIBP 유전자에 있어서 WHSC1과 상동성을 나타내지 않는 특이적 부분인 5'-UTR 중에서 서열번호 1의 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열로 이루어지는 핵산을 제공한다. 또한 본 발명은 서열번호 1의 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열의 일부로서 서열번호 1의 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산을 프라이머 또는 탐침으로서 제공하며, 또한 이러한 핵산을 포함하는 올리고뉴클레오티드 칩을 제공한다.

본 발명에 있어서 "프라이머"는 짧은 자유 3'-말단 수산화기(free 3'-hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로서, 상보적인 템플레이트와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명에 있어서 프라이머는, 서열번호 1 또는 이에 상보적인 염기서열에 특이적으로 결합할 수 있다면 어떠한 길이의 것도 될 수 있으며, 당업자라면 이용방법에 따라 특이적 서열을 가진 여러 길이의 단편을 자명하게 도출할 수 있을 것이다. 예를 들어, 본 발명에 있어서 프라이머는, 서열번호 1 또는 이에 상보적인 염기서열에 특이적인 7개 내지 50개의 염기서열을 가질 수 있으며, PCR에 이용하는 경우 바람직하게는 서열번호 1 또는 이에 상보적인 염기서열의 적어도 17개 이상, 보다 바람직하게는 적어도 24개 이상의 염기서열을 갖는다. 본 발명에 있어서 프라이머는 서열번호 2 또는 3으로 기재된 염기서열일 수 있다. 또한 본 발명에 있어서 프라이머는 DNA 합성의 개시 점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 한, 제한효소 부위와 같은 추가의 특징을 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서 "탐침"이란 짧은 자유 3'-말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로서, 혼성화 조건 하에서 상보적인 템플레이트와 특이적인 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있는 핵산 서열을 의미한다.

본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그날을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.

본 발명에 있어서 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상 진단은 백혈병의 발병 여부를 확인하는 것이다. 하나의 양태로서, 본 발명은 백혈병 의심 환자의 골수 시료에서 RE-IIBP 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 여부를 확인하는 단계를 포함하는 백혈병 진단방법에 관한 것이다. 또 다른 양태로서, 본 발명은 골수의 단핵세포에 히스톤 단백질의 메틸화 여부를 측정하는 것을 포함하는 백혈병 진단방법에 관한 것이다.

본 발명에 의해 진단 가능한 백혈병으로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, B-세포 급성 림프아구성 백혈병(B-cell acute lymphoblastic leukemia; B-ALL), T-세포 급성 림프아구성 백혈병(T-cell acute lymphoblastic leukemia; T-ALL), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia; AML), 급성 단핵구성 백혈병(acute monocytic leukemia) 및 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia; CML)이 있으며, 바람직하게는 B-ALL, T-ALL 및 AML이다.

본 발명에 있어서 "mRNA 발현 측정"이란 백혈병을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 백혈병 마커 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정을 말한다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(real-time RT-PCR), 노던 블랏팅(northern blotting), 올리고뉴클레오티드 칩 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 백혈병 진단방법은, 상기 검출 방법들 중 하나를 통하여 정상 대조군에서의 RE-IIBP mRNA의 발현량과 백혈병 의심 환자에서의 RE-IIBP mRNA의 발현량을 비교하고 mRNA의 유의한 발현 여부를 판단하여 백혈병 의심 환자의 실제 백혈병 발병 여부를 진단할 수 있다. mRNA 발현 측정은, 바람직하게는, 백혈병 진단 마커로 사용되는 핵산에 특이적인 프라이머를 이용하는 RT-PCR에 의하여 수행할 수 있다. 달리는, 상기 백혈병 진단 마커로 사용되는 핵산이 기판에 부착되어 있는 올리고뉴클레오티드 칩을 이용할 수 있다.

본 발명에 있어서 "단백질 발현 측정"은 백혈병을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서의 백혈병 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다.

단백질 발현 측정에 의한 본 발명의 백혈병 진단방법은 상기 백혈병 마커인 RE-IIBP 단백질 또는 메틸화된 히스톤 단백질을 항원으로 이용한 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)에 의해 수행될 수 있다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착 된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지를 하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다.

또한 단백질 발현 측정에 의한 본 발명의 백혈병 진단방법은 상기 백혈병 마커인 RE-IIBP 단백질 또는 메틸화된 히스톤 단백질에 대한 하나 이상의 항체를 이용하는 웨스턴 블롯팅에 의해 수행될 수 있다. 이를 위해 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동 하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀룰로오즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 그리고 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인함으로써 단백질의 발현 여부 및 발현양을 통해 백혈병 발병 여부를 알아낼 수 있다.

본 발명에 있어서 "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상 항체는 RE-IIBP 단백질 또는 메틸화된 히스톤 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체 등을 포함한다. 이와 같은 항체의 제조는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 수행될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 쥐 RE-IIBP 단백질의 구조

쥐(Mus musculus)의 cDNA 라이브러리(Clontech사)로부터 스크리닝한 쥐 RE-IIBP의 아미노산 서열을 분석한 결과 서열번호 4로 기재된 704개의 아미노산 서열로 이루어진 것을 확인하였다. 쥐 RE-IIBP 아미노산 서열을 서열번호 5의 인간 RE-IIBP 아미노산 서열과 대비한 결과는 도 1과 같았다. 또한 쥐 RE-IIBP에 대하여 단백질 도메인 분석을 수행한 결과, 도 2에 도시한 바와 같이, 172번째 내지 214번째 아미노산은 PHD 도메인, 217번째 내지 279번째 아미노산은 PWWP 도메인, 402번째 내지 525번째 아미노산은 SET 도메인인 것으로 밝혀졌다.

실시예 2: RE-IIBP의 히스톤 메틸 전이효소의 활성 확인

쥐 RE-IIBP 유전자의 암호화 부위를 PCR로 증폭시키기 위하여, 다음과 같이 정방향 프라이머(서열번호 6) 및 역방향 프라이머(서열번호 7)를 설계하였다. 이때 상기 프라이머에는 BamHI 및 NotI 제한효소 부위를 각각 삽입하였다.

정방향 프라이머: 5'-gcg gat ccg gag ggc atg gct gcc aaa aag gag-3'(서열번호 6)

역방향 프라이머: 5'-cgc gcg gcc gcg ggc ttt gcc atc tgt gac cct-3'(서열번호 7)

실시예 1에서 클로닝한 쥐 RE-IIBP 유전자를 주형으로 상기 프라이머를 사용하여, 94℃에서 1분, 67℃에서 1분 30초 및 72℃에서 1분을 1회로 하고 30회의 PCR 반응을 수행하였다. PCR로 증폭된 산물을 BamHI 및 NotI 제한효소로 37℃에서 두 시간동안 반응시킨 다음, 이를 T4 DNA 중합효소를 이용해 pcDNA 플라스미드(Invitrogen사)에 클로닝함으로써, 발현 플라스미드인 pcDNA-RE-IIBP를 제작하였다.

HeLa 세포주를 10% 우태아혈청(FBS, Gibco)과 페니실린-스트렙토마이신(50units/ml)을 함유한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)(Gibco사)에서 형질감염 이전에 24시간 동안 배양하였다. 상기 세포들을 항생제가 함유되지 않은 DMEM 배지로 세척하고, 리포펙타민(Lipofectamine, Invitrogen사)을 이용하여 발현 플라스미드인 pcDNA-RE-IIBP를 HeLa 세포 내로 형질감염(transient transfection) 시켰다. 형질감염을 완료한 세포들을 48시간 동안 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다.

상기 배양한 HeLa 세포주로부터 RE-IIBP 단백질을 정제한 다음, RE-IIBP 단 백질을 5X 히스톤 메틸 전이효소 완충액(50mM Tris-HCl, 20mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10mM 베타머캅토에탄올, 1.25M 수크로스)와 메틸기 제공자인 ¹⁴C-SAM(S-아데노실메티오닌), 기질로 사용되는 히스톤을 함께 섞은 후 30℃에서 3시간 동안 배양하였다. 그 다음 이를 p81 여과지로 여과한 후 10% TCA(trichloracetic acid) 완충액으로 15분간 세척하였고, 다시 95% 에탄올로 5분간 세척하였다. 여과지를 튜브로 옮긴 후 튜브에 신틸레이션 완충액(Ultima Gold F, PerkinElmer사)을 넣고서 신틸레이션 카운팅 기기로 히스톤 메틸 전이효소 활성을 측정했다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

실시예 3: 인간 RE-IIBP 유전자의 특이적 염기서열의 결정

인간 RE-IIBP 유전자의 염기서열을 유전자은행 접속번호 제AF330040호로 공개된 아형(isoform)인 WHSC1 유전자의 염기서열과 대비한 결과, 도 4에서 보듯이, 인간 RE-IIBP 유전자의 염기서열 중에서 서열번호 1로 기재된 -960번째 내지 -592번째 염기서열의 5'-UTR(untranslated region)이 인간 RE-IIBP 유전자에 특이적인 서열임을 밝혀내었다.

실시예 4: 인간 RE-IIBP 유전자의 특이적 발현조직의 확인

인간 RE-IIBP가 인체의 각 조직 중 어느 부위에서 특이적으로 발현하는지 알아보기 위해 노던 블랏팅(northern blotting)을 수행하였다.

구체적으로, 서열번호 1로 기재된 인간 RE-IIBP 유전자의 5'-UTR을 탐침으로 제조한 다음, 인체의 뇌, 심장, 간, 폐, 비장, 신장, 위장, 소장, 골격근, 흉선, 정소, 미임신의 자궁 및 태반으로부터 각각 추출한 mRNA 샘플이 존재하는 니트로셀룰로오즈 막(nitrocellulose membrane)을 SSC 혼성화 완충액(3M NaCl, 0.3M 소듐-시트레이트(pH 7.3))에서 58℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그리고 나서 상기 제조한 RE-IIBP의 5'-UTR 탐침을 상기 니트로셀룰로오즈 막이 들어 있는 완충액에 넣고서 다시 58℃에서 3시간 동안 혼성화 시켰다. 이후 TSS 완충액(0.2% PEG, 0.01% DMSO, 10mM MgCl₂)을 이용하여 10분 동안 세 번씩 세척하였다. 탐침이 붙은 막을 필름에 하루동안 노출시킨 후, 필름분석기기를 이용해 시그널을 확인하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 보듯이, 인간 RE-IIBP는 흉선세포에서만 특이적으로 발현하는 것임을 확인하였다.

실시예 5: RT-PCR을 이용한 백혈병의 진단

본인 또는 그 보호자의 동의 하에 T-ALL 백혈병 환자, B-ALL 백혈병 환자, AML 백혈병 환자와 정상인에서 골수 천자 및 생검으로 골수를 각각 얻은 다음, 전남대학교 병원의 내부 심의위원회의 허가를 거쳐 실험에 사용하였다.

피콜-소듐 메트리조에이트(Ficoll-sodium metrizoate)에 의한 농도 구배에 따른 밀도차를 이용하여 원심분리로 백혈병 환자의 골수로부터 골수 단핵세포를 분리한 다음, 다시 골수 단핵세포로부터 mRNA를 각각 추출하였다. 대조군으로서, 정 상인의 골수 단핵세포로부터 mRNA를 추출하였다. 그 다음, 5㎍의 mRNA 시료를 각각 취하여 20㎕ 반응부피에서 역전사시키고, 증류수를 첨가하여 100㎕로 희석하였다. 희석된 역전사 산물의 2㎕을 취하여 주형으로 이용하고, 서열번호 1의 인간 RE-IIBP 유전자의 5'-UTR 부분을 특이적으로 증폭할 수 있도록 서열번호 2 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 첨가한 다음, 반응액의 최종 부피를 25㎕로 하였다.

정방향 프라이머: 5'-gagtagcatt gtggttatat gtaa-3' (서열번호 2)

역방향 프라이머: 5'-aaaataattt tggtttgtaa agtt-3' (서열번호 3)

상기 반응액을 대상으로 94℃에서 30초, 55℃에서 1분 및 72℃에서 1분을 1회로 하여 25회의 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응 산물 중 8㎕를 취하여 0.5㎍/㎖의 에티듐 브로마이드 존재 하에 12% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 밴드를 관찰하였다. 그 결과를 도 6에 도시하였다.

도 6에서 보듯이, 정상인에서 추출한 골수 단핵세포의 mRNA에서는 RE-IIBP가 발현하지 않았으나, 3가지 종류의 백혈병에서는 모두 RE-IIBP가 특이적으로 발현하고 있음을 알 수 있었다.

실시예 6: 메틸화된 히스톤에 대한 항체를 이용한 백혈병의 진단

실시예 5와 마찬가지로 T-ALL 백혈병 환자, B-ALL 백혈병 환자, AML 백혈병 환자와 정상인으로부터 각각 골수 단핵세포를 얻은 다음, 이로부터 히스톤을 분리하였다. 이를 14% SDS-PAGE에 전기 영동을 한 뒤, 3% BSA(bovine serum albumin)가 섞인 TBST 완충액(10mM Tris-Cl(pH 8.0), 150mM NaCl, 0.05% Tween-20)으로 12시간 이상 블록킹을 하였다. 여기에 메틸화된 히스톤에 대한 항체로서 상업적으로 사용되고 있는 항-판 메틸 라이신 항체(Abcam사) 또는 항-디메틸 히스톤 H3K27 항체(Upstate사)를 각각 넣고서 2시간 동안 상온에서 배양한 후, TBST 완충액으로 5분간 3번씩 세척해 주었다. 그 결과를 도 7에 도시하였다.

도 7에서 보듯이, 백혈병의 종류에 따라 정도의 차이가 있긴 했으나, 정상인에서와는 달리 모든 백혈병 환자의 골수 단핵세포에서 히스톤 단백질의 메틸화가 일어난 것을 확인할 수 있었다.

도 1은 서열번호 4의 쥐 RE-IIBP 아미노산 서열(SET7)과 서열번호 5의 인간 RE-IIBP 아미노산 서열(R)을 대비한 것이다.

도 2는 서열번호 4로 기재된 쥐 RE-IIBP의 구조를 도메인을 중심으로 도시한 것이다.

도 3은 쥐 RE-IIBP를 대상으로 히스톤 메틸 전이효소의 활성을 측정한 결과를 나타내는 사진이다.

도 4는 인간 RE-IIBP 유전자의 5'-UTR 염기서열(RE)과 인간 WHSC1 유전자의 5'-UTR 염기서열(wh)과 대비한 것이다.

도 5는 인간 RE-IIBP 유전자의 5'-UTR 염기서열을 사용하여 인체의 각 조직에 대하여 노던 블랏팅을 수행한 사진이다.

도 6은 여러 백혈병 환자 및 정상인의 골수에서 채취한 mRNA 시료에 대해 서열번호 2 및 3의 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 수행한 사진이다.

도 7은 여러 백혈병 환자 및 정상인의 골수에서 채취한 단백질 시료에 대해, 메틸화된 히스톤 단백질에 대한 항체인 항-판 메틸 라이신 항체와 항-디메틸 히스톤 H3K27 항체로 웨스턴 블랏팅을 수행한 사진이다.

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation Seoul National University Industry Foundation <120> Nucleic Acids for Diagnosing Leukemia <130> FPD/200709-0041 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gagtagcatt gtggttatat gtaagacttt atgtttagag atttgtgcta aacttcttat 60 ggatgaaatg atatgtctgg gatttgcttc agaataatct ggcaggggga cgtggaacca 120 ggtatggata gagccacgct ggccccaggt tgatgttttt gggggccaag tagcgaggac 180 atggggttca ttgtacagtt tgtctgcttt tgtttatgtt cagatttttc catgatagaa 240 agttaagcca gaaggacaaa ggaattcaga agattcatct ttagaacttc acttatttga 300 ggggtaattt ttaagcagta aaaagatcaa gggtttatga tttgaaactt tacaaaccaa 360 aattatttt 369 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gagtagcatt gtggttatat gtaa 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 aaaataattt tggtttgtaa agtt 24 <210> 4 <211> 704 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Met Ala Ala Lys Lys Glu Tyr Val Cys Gln Leu Cys Glu Lys Thr Gly 1 5 10 15 Ser Leu Leu Leu Cys Glu Gly Pro Cys Cys Gly Ala Phe His Leu Ala 20 25 30 Cys Leu Gly Leu Ser Arg Arg Pro Glu Gly Arg Phe Thr Cys Thr Glu 35 40 45 Cys Ala Ser Gly Ile His Ser Cys Phe Val Cys Lys Glu Ser Lys Met 50 55 60 Glu Val Lys Arg Cys Val Val Asn Gln Cys Gly Lys Phe Tyr His Glu 65 70 75 80 Ala Cys Val Lys Lys Tyr Pro Leu Thr Val Phe Glu Ser Arg Gly Phe 85 90 95 Arg Cys Pro Leu His Ser Cys Met Ser Cys His Ala Ser Asn Pro Ser 100 105 110 Asn Pro Arg Pro Ser Lys Gly Lys Met Met Arg Cys Val Arg Cys Pro 115 120 125 Val Ala Tyr His Gly Gly Asp Ala Cys Leu Ala Ala Gly Cys Ser Val 130 135 140 Ile Ala Ser Asn Ser Ile Ile Cys Thr Gly His Phe Thr Ala Arg Lys 145 150 155 160 Gly Lys Arg His His Thr His Val Asn Val Ser Trp Cys Phe Val Cys 165 170 175 Ser Lys Gly Gly Ser Leu Leu Cys Cys Glu Ala Cys Pro Ala Ala Phe 180 185 190 His Pro Asp Cys Leu Asn Ile Glu Met Pro Asp Gly Ser Trp Phe Cys 195 200 205 Asn Asp Cys Arg Ala Gly Lys Lys Leu His Phe Gln Asp Ile Ile Trp 210 215 220 Val Lys Leu Gly Asn Tyr Arg Trp Trp Pro Ala Glu Val Cys His Pro 225 230 235 240 Lys Asn Val Pro Pro Asn Ile Gln Lys Met Lys His Glu Ile Gly Glu 245 250 255 Phe Pro Val Phe Phe Phe Gly Ser Lys Asp Tyr Tyr Trp Thr His Gln 260 265 270 Ala Arg Val Phe Pro Tyr Met Glu Gly Asp Arg Gly Ser Arg Tyr Gln 275 280 285 Gly Val Arg Gly Ile Gly Arg Val Phe Lys Asn Ala Leu Gln Glu Ala 290 295 300 Glu Ala Arg Phe Asn Glu Val Lys Leu Gln Arg Glu Ala Arg Glu Thr 305 310 315 320 Gln Glu Ser Glu Arg Lys Pro Pro Pro Tyr Lys His Ile Lys Val Asn 325 330 335 Lys Pro Tyr Gly Lys Val Gln Ile Tyr Thr Ala Asp Ile Ser Glu Ile 340 345 350 Pro Lys Cys Asn Cys Thr Pro Thr Asp Glu Asn Pro Cys Gly Ser Asp 355 360 365 Ser Glu Cys Leu Asn Arg Met Leu Met Phe Glu Cys His Pro Gln Val 370 375 380 Cys Pro Ala Gly Glu Tyr Cys Gln Asn Gln Cys Phe Thr Lys Arg Gln 385 390 395 400 Tyr Pro Glu Thr Lys Ile Ile Lys Thr Asp Gly Lys Gly Trp Gly Leu 405 410 415 Val Ala Lys Arg Asp Ile Arg Lys Gly Glu Phe Val Asn Glu Tyr Val 420 425 430 Gly Glu Leu Ile Asp Glu Glu Glu Cys Met Ala Arg Ile Lys Tyr Ala 435 440 445 His Glu Asn Asp Ile Thr His Phe Tyr Met Leu Thr Ile Asp Lys Asp 450 455 460 Arg Ile Ile Asp Ala Gly Pro Lys Gly Asn Tyr Ser Arg Phe Met Asn 465 470 475 480 His Ser Cys Gln Pro Asn Cys Glu Thr Leu Lys Trp Thr Val Asn Gly 485 490 495 Asp Thr Arg Val Gly Leu Phe Ala Val Cys Asp Ile Pro Ala Gly Thr 500 505 510 Glu Leu Thr Phe Asn Tyr Asn Leu Asp Cys Leu Gly Asn Glu Lys Thr 515 520 525 Val Cys Arg Cys Gly Ala Ser Asn Cys Ser Gly Phe Leu Gly Asp Arg 530 535 540 Pro Lys Thr Ser Ala Ser Leu Ser Ser Glu Glu Lys Gly Lys Lys Ala 545 550 555 560 Lys Lys Lys Thr Arg Arg Arg Arg Ala Lys Gly Glu Gly Lys Arg Gln 565 570 575 Ser Glu Asp Glu Cys Phe Arg Cys Gly Asp Gly Gly Gln Leu Val Leu 580 585 590 Cys Asp Arg Lys Phe Cys Thr Lys Ala Tyr His Leu Ser Cys Leu Gly 595 600 605 Leu Gly Lys Arg Pro Phe Gly Lys Trp Glu Cys Pro Trp His His Cys 610 615 620 Asp Val Cys Gly Lys Pro Ser Thr Ser Phe Cys His Leu Cys Pro Asn 625 630 635 640 Ser Phe Cys Lys Glu His Gln Asp Gly Thr Ala Phe Arg Ser Thr Gln 645 650 655 Asp Gly Gln Ser Tyr Cys Cys Glu His Asp Leu Arg Ala Asp Ser Ser 660 665 670 Ser Ser Thr Lys Thr Glu Lys Pro Phe Pro Glu Ser Leu Lys Ser Lys 675 680 685 Gly Lys Arg Lys Lys Arg Arg Cys Trp Arg Arg Val Thr Asp Gly Lys 690 695 700 <210> 5 <211> 584 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Met Arg Cys Val Arg Cys Pro Val Ala Tyr His Ser Gly Asp Ala 1 5 10 15 Cys Leu Ala Ala Gly Cys Ser Val Ile Ala Ser Asn Ser Ile Ile Cys 20 25 30 Thr Ala His Phe Thr Ala Arg Lys Gly Lys Arg His His Ala His Val 35 40 45 Asn Val Ser Trp Cys Phe Val Cys Ser Lys Gly Gly Ser Leu Leu Cys 50 55 60 Cys Glu Ser Cys Pro Ala Ala Phe His Pro Asp Cys Leu Asn Ile Glu 65 70 75 80 Met Pro Asp Gly Ser Trp Phe Cys Asn Asp Cys Arg Ala Gly Lys Lys 85 90 95 Leu His Phe Gln Asp Ile Ile Trp Val Lys Leu Gly Asn Tyr Arg Trp 100 105 110 Trp Pro Ala Glu Val Cys His Pro Lys Asn Val Pro Pro Asn Ile Gln 115 120 125 Lys Met Lys His Glu Ile Gly Glu Phe Pro Val Phe Phe Phe Gly Ser 130 135 140 Lys Asp Tyr Tyr Trp Thr His Gln Ala Arg Val Phe Pro Tyr Met Glu 145 150 155 160 Gly Asp Arg Gly Ser Arg Tyr Gln Gly Val Arg Gly Ile Gly Arg Val 165 170 175 Phe Lys Asn Ala Leu Gln Glu Ala Glu Ala Arg Phe Arg Glu Ile Lys 180 185 190 Leu Gln Arg Glu Ala Arg Glu Thr Gln Glu Ser Glu Arg Lys Pro Pro 195 200 205 Pro Tyr Lys His Ile Lys Val Asn Lys Pro Tyr Gly Lys Val Gln Ile 210 215 220 Tyr Thr Ala Asp Ile Ser Glu Ile Pro Lys Cys Asn Cys Lys Pro Thr 225 230 235 240 Asp Glu Asn Pro Cys Gly Phe Asp Ser Glu Cys Leu Asn Arg Met Leu 245 250 255 Met Phe Glu Cys His Pro Gln Val Cys Pro Ala Gly Glu Phe Cys Gln 260 265 270 Asn Gln Cys Phe Thr Lys Arg Gln Tyr Pro Glu Thr Lys Ile Ile Lys 275 280 285 Thr Asp Gly Lys Gly Trp Gly Leu Val Ala Lys Arg Asp Ile Arg Lys 290 295 300 Gly Glu Phe Val Asn Glu Tyr Val Gly Glu Leu Ile Asp Glu Glu Glu 305 310 315 320 Cys Met Ala Arg Ile Lys His Ala His Glu Asn Asp Ile Thr His Phe 325 330 335 Tyr Met Leu Thr Ile Asp Lys Asp Arg Ile Ile Asp Ala Gly Pro Lys 340 345 350 Gly Asn Tyr Ser Arg Phe Met Asn His Ser Cys Gln Pro Asn Cys Glu 355 360 365 Thr Leu Lys Trp Thr Val Asn Gly Asp Thr Arg Val Gly Leu Phe Ala 370 375 380 Val Cys Asp Ile Pro Ala Gly Thr Glu Leu Thr Phe Asn Tyr Asn Leu 385 390 395 400 Asp Cys Leu Gly Asn Glu Lys Thr Val Cys Arg Cys Gly Ala Ser Asn 405 410 415 Cys Ser Gly Phe Leu Gly Asp Arg Pro Lys Thr Ser Thr Thr Leu Ser 420 425 430 Ser Glu Glu Lys Gly Lys Lys Thr Lys Lys Lys Thr Arg Arg Arg Arg 435 440 445 Ala Lys Gly Glu Gly Lys Arg Gln Ser Glu Asp Glu Cys Phe Arg Cys 450 455 460 Gly Asp Gly Gly Gln Leu Val Leu Cys Asp Arg Lys Phe Cys Thr Lys 465 470 475 480 Ala Tyr His Leu Ser Cys Leu Gly Leu Gly Lys Arg Pro Phe Gly Lys 485 490 495 Trp Glu Cys Pro Trp His His Cys Asp Val Cys Gly Lys Pro Ser Thr 500 505 510 Ser Phe Cys His Leu Cys Pro Asn Ser Phe Cys Lys Glu His Gln Asp 515 520 525 Gly Thr Ala Phe Ser Cys Thr Pro Asp Gly Arg Ser Tyr Cys Cys Glu 530 535 540 His Asp Leu Gly Ala Ala Ser Val Arg Ser Thr Lys Thr Glu Lys Pro 545 550 555 560 Pro Pro Glu Pro Gly Lys Pro Lys Gly Lys Arg Arg Arg Arg Arg Gly 565 570 575 Trp Arg Arg Val Thr Glu Gly Lys 580 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 6 gcggatccgg agggcatggc tgccaaaaag gag 33 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 7 cgcgcggccg cgggctttgc catctgtgac cct 33

Claims

서열번호 1의 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열로 이루어지거나, 또는 이의 일부로서 서열번호 1의 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산.
제1항에 있어서,

상기 핵산이 서열번호 1의 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열의 7개 내지 50개의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 핵산.
제1항에 있어서,

상기 핵산이 서열번호 1의 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열의 적어도 24개 이상의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 핵산.
제3항에 있어서,

상기 핵산이 서열번호 2의 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 핵산.
제3항에 있어서,

상기 핵산이 서열번호 3의 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열로 이루어지는 것 을 특징으로 하는 핵산.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 핵산이 포유류의 백혈병을 진단하기 위한 것임을 특징으로 하는 핵산.
제6항에 있어서,

상기 포유류가 인간인 것을 특징으로 하는 핵산.
제7항에 있어서,

상기 백혈병이 B-세포 급성 림프구성 백혈병, T-세포 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 급성 단핵구성 백혈병 및 만성 골수성 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는, 포유류의 백혈병 진단용 올리고뉴클레오티드 칩.
골수의 단핵세포에서 RE-IIBP의 발현 여부를 측정하는 것을 포함하는, 인간을 제외한 포유류의 백혈병을 진단하는 방법.
제10항에 있어서,

제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 핵산을 프라이머 또는 탐침으로 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
골수의 단핵세포에서 히스톤 단백질의 메틸화 여부를 측정하는 것을 포함하는, 인간을 제외한 포유류의 백혈병을 진단하는 방법.