KR20090029833A - 면역치료용 크립틱 ｈｌａ－ｂ７ 에피토프의 동정, 최적화 및 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 펩티드 면역치료 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 항원에 있는 HLA-B*0702-제한 크립틱 에피토프를 확인하는 방법에 관한 것이며, 그 면역원성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 HLA-B*0702 표현형을 갖는 환자를 효과적으로 치료하는 방법 및 물질을 제공한다.
면역치료 HLA-B*0702-제한 크립틱 에피토프, 면역원성(immunogenicity)
Description
본 발명은 단백질 면역치료(immunotheraphy) 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 HLA- B*0702 표현형을 갖는 환자를 효과적으로 치료하기 위한 신규한 방법 및 물질을 제공한다.
면역치료는 암치료의 맥락에서 현재 매우 관심있는 주제인 치료적 접근 방법이다. 그 원리는 종양 세포의 제거에 주요 역할을 하는 사이토톡신 T 림포사이트(CTLs)에 의해 인지되는 종양 항원(tumor antigen)의 T cell 에피토프를 생산하는 펩티드와의 면역반응에 기초하고 있다.
CTLs는 전체 단백질 항원을 인식하지 않고, 일반적으로 세포 표면에 발현되는 클래스 I 주요조직적합 복합체 (MHC I) 분자로 표시되는 8 내지 11 아미노산을 포함하는 펩티드의 단편을 인식하는 것으로 기억될 것이다. 이러한 펩티드들의 발 현은 다음의 3단계와 관련된 항원 프로세싱의 결과이다.
- 프로테아좀(proteaseome)이라 불리는 멀티 효소 복합체에 의한 항원의 세포질 분해(cytosolic degradation).
- TAP 트랜스포터에 의한 소포체(ER)에서의 이러한 분해로부터 유도되는 펩티드의 트랜스로케이션(translocation).
- 이들 펩티드와 MHC I 분자의 결합 및 펩티드/MHC I 복합체의 외부로의 운반(exportation).
펩티드/MHC I 복합체는 펩티드가 유도되는 항원을 발현하는 타겟 세포를 공격할 수 있는 이러한 CTL의 자극 및 증대를 유도하는 CTL의 특이적 T cell 수용체(TCR)와 상호작용을 한다.
항원 프로세싱 동안, 펩티드 선택이 일어나며, 이는 계층적인 펩티드 발현을 가져온다. MHC I 분자에 의해 선호되어 발현되는 펩티드는 면역우세로 불리는 반면, 약하게 발현되는 펩티드는 크립틱(암호의)한 것으로 불린다. 면역우세한 펩티드는 MHC I에 대해 높은 친화력을 나타내고, 면역원성인 반면, 크립틱 펩티드는 MHC I에 대해 낮은 친화력을 나타내고, 비면역원성이다.
면역 우세한 펩티드는 예비임상 및 임상 연구에서 사라지는 결과로, 종양 백신(tumor vaccines)에 의해 널리 타겟이 되어왔다(Bowne et al., 1999; Colella et al., 2000; Gross et al., 2004; Hawkins et al., 2000; Naftzger et al., 1996; Overwijk et al., 1998; Vierboom et al., 1997; Weber et al., 1998).
종양 항원(tumor antigen)에 의해 과발현되고, 일반 세포 및 조직에 의해서는 낮은 수준으로 발현되는 자기 단백질(self proteins)이다. 면역체계는 자아 내성 과정(self tolerance process)에 때문에 이러한 자기의 항원과 반응할 수 없다. 자기-내성(self-tolerance)은 주로 면역 우세 펩티드와 관련이 있어서((Cibotti et al., 1992; Gross et al., 2004; Hernandez et al., 2000; Theobald et al., 1997), 종양 면역을 유도하는 이러한 펩티드의 불능(incapacity)을 설명한다.
크립틱 펩티드는 자기 내성 과정과 거의 관련이 없으며(Anderton et al., 2002; Boisgerault et al., 2000; Cibotti et al., 1992; Friedman et al., 2004; Gross et al., 2004; Moudgil et al., 1999; Overwijk et al., 2003; Sinha et al., 2004), 따라서, 면역원성을 제공하는 효율적인 종양 면역이 강화되도록 유도할 수 있다(Disis et al., 2002; Dyall et al., 1998; Engelhorn et al., 2006; Gross et al., 2004; Grossmann et al., 2001; Lally et al., 2001; Moudgil and Sercarz, 1994a; Moudgil and Sercarz, 1994b; Palomba et al., 2005).
MHC I와의 낮은 친화성으로 인해, 비면역원성인 크립틱 펩티드의 면역원성을 강화시키는 일반적인 전략은 아미노산 치환을 통한 MHC I 분자에 대한 친화성을 증가시키는 것으로 이루어진다. MHC I 분자에 대한 친화성은 주로 "일차 앵커 잔기(anchor residue)"라 불리는 매우 한정된 위치(1차 앵커 잔기)의 잔기의 존재에 의존한다. 이들 잔기는 MHC I 대립유전자 특이적이다. 1차 앵커 잔기의 존재는 종종 필요함에도 불구하고, 높은 MHC I 분자 친화성을 보증하는데는 불충분하다. 1차 앵커 잔기 밖에 위치한 잔기(2차 앵커 잔기)가 MHC I에 대한 펩티드의 친화성에 우호적 또는 비우호적인 영향을 미칠 수 있다(Parker et al., 1994; Rammensee H et al., 1999). 이러한 2차 앵커 잔기의 존재는 1차 앵커 모티브를 갖는 펩티드 내에서, 결합 친화력(binding affinity)의 다양성의 존재를 설명할 수 있다.
MHC I 분자와의 친화성을 강화하기 위한 아미노산 치환은 그런 최적화된 펩티드의 항원성을 보존하여야 한다. 최적화된 펩티드에 의해 생성된 CTL은 대응하는 자연의 펩티드와 교차반응(cross-react)하여야 한다.
수많은 연구팀은 HLA-A*0201의 친화성을 증가시킴으로써, 이미 항원성있는 펩티드의 항원성을 더욱 증가시켜왔다.(Bakker et al., 1997; Parkhurst et al., 1996; Sarobe et al., 1998; Valmori et al., 1998). 발명가들은 이미 HLA-B*0201-제한 크립틱 에피토프의 친화성 및 항원성을 강화시키는 일반적인 전략을 서술하였다(Scardino et al., 2002; Tourdot et al., 2000).
HLA-B*0702는 자주 발현되는 분자이다(군집의 25%). 따라서, HLA-B*0702-제한 종양 크립틱 펩티드의 동정 및 최적화는 HLA-B*0702 발현 환자에 대한 효율적인 암 백신을 개발하기 위해 필수적이다.
HLA-B*0702에 의해 발현되는 종양 펩티드는 현재까지 거의 기술되지 않았다. CEA (CEA632) (Lu et al. 2000) 및 TERT (TERT1123) (Cortez-Gonzales et al. 2006)항원으로부터 유래한 2가지 펩티드만 확인되어왔다; 이들 펩티드들은 HLA-B*0702에 의한 강한 결합 친화력(binding affinity)을 나타내었으며, HLA-B*0702 트랜스제닉 마우스 및 휴먼 세포의 in vitro 테스트에서 모두 면역성을 나타내었다. 이러한 실험결과는 이들 펩티드들이 면역우세의 펩티들임을 보여준다.
MAGE-A1(MAGE-A1289) (Luiten et al., 2000) 및 RU2 (신장 세포의 암에 의해 발현되는 새로운 항원)(Van den Eynde et al. 1999)로 부터 유래한 2가지 추가적인 펩티드들은 암환자로부터 분리된 HLA-B*0702 CTL의 타겟으로 밝혀져왔다. 이들 펩티드들의 HLA-B*0702 친화력에 대한 정보가 없음에도 불구하고, 암환자에서 진행된 CTL이 항상 면역우세 펩티드인 것으로 밝혀졌기 때문에, 우리는 그들은 면역우세로 간주할 수 있다.
이하 실험 부분에서 기술되는 바와 같이, 발명가들은 HLA-B*0702 -제한 크립틱 펩티드의 친화성 및 면역원성을 강화시키는 일반적인 전략을 발견해왔다.
첫번째 관점에서, 본 발명은 HLA-B*0702 -제한 크립틱 에피토프의 면역원성을 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 에피토프의 N-말단 잔기를 알라닌(A)으로 대체하거나 상기 에피토프의 C-말단 잔기를 류신(L)으로 대체하는 단계를 포함한다.
이하에서, 용어 "HLA-B*0702 -제한 크립틱 에피토프"는 HLA-B*0702에 대한 낮은 친화력을 나타내고, 비항원성이며, X1PX3X4X5X6X7X8X9X10X11 (SEQ ID NO: 58)서열을 가지며, 여기서 P는 프롤린, X3는 R (arginine) 또는 K (lysine) 또는 H (histidine) 또는 M (methionine)이며, X1 및 X4 내지 X7 는 독립적은 어떤 아미노산이고, X8 내지 X10 는 독립적인 어떤 아미노산 또는 어떤 아미노산도 아니며, C-말단 아미노산 X11는 N-말단 아미노산 X1이 A(알라닌)이면, X11는 L(leucine)나 A나 I(isoleucine)나 V (valine)나 M도 아니어야 하며, X1이 A가 아닌 다른 아미노산이라면, X11는 L 또는 A 또는 I 또는 V 또는 M라는 가정하에서 어떤 아미노산인 것을 특징으로 하는 8개 내지 11개의 아미노산, 바람직하게는 9 또는 10개의 아미노산을 갖는 펩티드를 가리키는데 사용된다.
본 맥락에서, 용어 "펩티드"는 아미노산 잔기가 펩티드 결합(-CO-NH-)에 의해 결합되는 분자들 뿐만 아니라, 펩티드 결합이 변형되어 특히 단백질 가수분해(proteolysis)에 더 내성이 있게 되며, 그 변형에 의해 면역원성이 손상되지 않는 합성 유사 펩티드 또는 펩티도미메틱스(peptidomimetics)를 가리킨다.
본 맥락에서, 아미노산 잔기는 한 글자의 코드로 표시된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대체하는(substituting)"은 상기 크립틱 에피토프의 아미노산 서열이 적절한 아미노산을 포함하고 있지 않은 경우, 언급한 대체에 의해 상기 HLA-B*0702 -제한 크립틱 에피토프의 서열로부터 유도된 서열을 갖는 펩티드를 얻는 것으로 이해되며, 상기 펩티드를 얻는데 사용된 기술적 방법이 무엇이든 상관없다. 예를 들어, 펩티드는 인공적인 펩티드 합성 또는 재조합 발현에 의해 제조될 수 있다.
HLA-B*0702를 위한 펩티드의 친화도는 당업계에 알려진 방식, 가령, Rohrlich et al., 2003에 기술된 분석방법(assay)의해 결정될 수 있다. 결과는 대조 펩티드에 대한 상대 친화도(RA)로 표시된다. 이 방법을 따라, RA가 10 초과인 경우, 펩티드는 HLA-B*0702에 대해 낮은 친화도를 갖는 것으로 본다. RA가 10 초과인 펩티드는 따라서, 크립틱 펩티드(에피토프)로 간주된다.
본원에 사용된 바에 따라, 용어 "비 면역원성(non immunogenic)"은 HLA-B*0702 발현하는 개체(HLA-B*0702 트랜스제닉 동물 포함)에 투여된 경우, HLA-B*0702-제한 CTL 면역 반응을 개시할 수 없는 펩티드를 말한다.
다른 실시예에서, 두번째 및 세번째 아미노산 잔기가 PR 또는 PK 또는 PH 또는 PM이며, 마지막 잔기가 L 또는 A 또는 I 또는 V 또는 M인 HLA-B*0702-제한 크립틱 에피토프의 면역원성이 그 첫번째 아미노산을 A(알라닌)으로 대체함으로써 증가될 수 있다. 실제로, N-말단 아미노산 X1가 A 이외의 아미노산이고, X3가 R 또는 K 또는 H 또는 M 이고, C-말단 아미노산 X11가 L 또는 A 또는 I 또는 V 또는 M이고, X4 내지 X7 가 독립적인 어떤 아미노산이고, X8 내지 X10 가 독립적인 어떤 아미노산 또는 어떤 아미노산도 아닌 선택된 HLA-B*0702-제한 크립틱 에피토프의 서열이 X1PX3X4X5X6X7X8X9 X10X11 (SEQ ID NO: 59)인 경우, X1을 A로 대체하는 것이 그 면역원성을 증가시키는데 충분하다.
또 다른 실시예에서, 첫번째 3개의 아미노산 잔기가 APX3(여기서 X3 는 R 또는 K 또는 H 또는 M 임)인 HLA-B*0702-제한 크립틱 에피토프의 면역원성은 그 마지막 아미노산을 L로 치환함으로써(또는 추가된 류신을 갖게 된 후 상기 에피토프의 아미노산 서열이 11 아미노산보다 길지 않다면, C-말단에 류신을 추가함으로써) 증가될 수 있다. 실제로, 선택된 HLA-B*0702-제한 크립틱 에피토프의 서열이 APX3X4X5X6X7X8X9X10X11 (SEQ ID NO: 60)이고, 여기서 X3는 R 또는 K 또는 H 또는 M 이고, X4 내지 X7는 독립적인 어떤 아미노산이고, X8 내지 X10가 독립적으로 어떤 아미노산이거나, 어떤 아미노산도 아니며, C-말단 아미노산 X11가 L 또는 A 또는 I 또는V 또는 M 가 아닌 아미노산인 경우, X11를 L로 대체하는 것은 그 면역원성을 증가시키기에 충분하다.
이하에서, 표현 "최적화된 펩티드(optimized peptide)"는 APX3X4X5X6X7X8X9X10X11 (SEQ ID No: 61)의 일반적인 서열을 가지며, 여기서 X3 는 R 또는 K 또는 H 또는 M이며, X4 내지 X7 는 독립적으로 어떤 아미노산이며, X8 내지 X10 는 독립적으로 어떤 아미노산이거나 어떤 아미노산도 아니며, C-말단 아미노산 X11 는 L 또는 A 또는 I 또는 V 또는 M 이고, 상기 방법에 의해 HLA-B*0702-제한 크립틱 에피토프로부터 유래한 면역원성 펩티드를 의미한다.
발명가들은 수많은 HLA-B*0702-제한 크립틱 에피토프를 밝혀왔으며, 그들 중 일부는 하기의 표 1에 개시되었다. 따라서, 본 발명의 다른 관점은 표 1에 개시된 SEQ ID NOs: 1 내지 4의 펩티드들 가운데서 선택된 크립틱 HLA-B*0702-제한 에피토프이다.
본 발명에 따라 얻어진 면역원성 HLA-B*0702-제한 에피토프의 실시예들은 그 N-말단 아미노산을 A(알라닌)으로 대체함으로써, 크립틱 HLA-B*0702-제한 에피토프 SEQ ID NOs 1, 3, 4, 로부터 유도된 것들 및 C-말단 아미노산을 L(류신)로 대체함으로써, 크립틱 HLA-B*0702-제한 에피토프 SEQ ID NOs 2로부터 유도된 것들이다.
따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 SEQ ID NOs: 1 내지 4의 크립틱 펩티드들로부터 유도된 최적화된 펩티드들에 관한 것이다. 최적화된 펩티드들의 바람직한 실시예들은 APRSPLAPL (SEQ ID NO: 6), APKANKEIL (SEQ ID NO: 7), APKHSDCLA (SEQ ID NO: 8) 및 APRRLVQLL (SEQ ID NO: 5)이다.
본 발명은 또한, 상술한 2, 3 또는 그 이상의 HLA-B*0702-제한 크립틱 에피토프 또는 2, 3 또는 그 이상의 면역원성 HLA-B*0702-제한 크립틱 에피토프를 포함하는 키메릭 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명에 따른 키메릭 폴리펩티드에서, 에피토프들은 서로 다를수 있거나, 동일한 에피토프가 여러 번(2, 3 또는 그 이상) 반복될 수 있다. 당업자는 그러한 폴리펩티드를 제조하기 위해 알려진 기술을 사용할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 화학적 합성 또는 유전자 공학의 기술을 사용함으로써, 얻어질 수 있다.
본 발명의 다른 목적은 상술한 바에 따른 크립틱 HLA-B*0702-제한 에피토프 또는 면역원성 에피토프 또는 키메릭 폴리펩티드를 발현하도록 고안된 분리된 핵산 분자이다. 본원에서 펩티드를 "발현하도록 고안되는(designed to cause the expression of)" 것은 핵산이 적절한 셀에 도입되도록 하는 경우, 상기 펩티드가 그 서열이 선택된(및 적절한 경우, 상술한 바와 같이 최적화된) 전체 항원으로부터 분리되도록 발현되는 것을 의미한다. 상기 에피토프 또는 키메릭 폴리펩티드의 코딩 영역은 적절한 프로모터의 조절하에 폴리뉴클레오티드에서 전형적으로 적합할 것이다. 박테리아의 프로모터는 in vitro 또는 특별한 경우 in vivo(생체내)에서 폴리펩티드를 제조할 수 있는 박테리아에서의 발현에 선호될 것이다. 본 발명에 따른 펩티드 또는 폴리펩티드를 직접적으로 in vivo에서 생산하는데 사용될 수 있는 박테리아의 예는 활성화된 식균작용(phagocytosis)에 의한 전문적인 항원-제시 세포로 들어가는 조건적 세포내 박테리아(facultative intracellular bacterium)인 Listeria monocytogenes 이다(Paterson and Maciag, 2005). 택일적으로, 본 발명에 따른 핵산은 적절한 벡터를 사용하여 직접적으로 투여될 수 있다. 이런 경우, 조직-특이적이며, 강한 구조적(constitutive) 또는 내생성(endogeneous) 프로모터가 펩티드 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 적절한 벡터 시스템은 네이키드(naked) DNA 플라스미드, 전달을 강화시키는 리포좀 조성물 및 일시적 발현(transient expression)을 일으키는 바이러스 벡터를 포함한다. 그 예시로 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스 벡터(vaccinia virus vector), 특히 비-복제 형태의 헤르페스 패밀리의 벡터를 들 수 있다.
본 발명의 다른 실시예는 유효한 원칙으로서 상술한 HLA-B*0702-제한 크립틱 에피토프 또는 상술한 바에 따라 유도된 면역학적 에피토프 폴리펩티드 또는 본 발명에 따른 키메릭 폴리펩티드 또는 이들 중 어떤 하나를 코팅하는 핵산 및/또는 상기 핵산을 운반하는 벡터 중 적어도 어느 하나를 포함하는 약학적 조성물이다.
특히, HLA-B*0702-제한 크립틱 에피토프 또는 그로부터 유도된 면역학적 에피토프 폴리펩티드 또는 그러한 여러 개의 면역원성 또는 크립틱 에피토프를 운반하는 키메릭 폴리펩티드 또는 이들 중 어느 하나를 코딩하는 핵산은 벡터에 포함되거나 포함되지 않은 채로, 예방 또는 치유를 위한 면역치료를 위해, 특히, 항바이러스 또는 항암 면역치료를 위한 조성물의 제조에 사용될 수 있다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 백신이다. 후자의 경우, 본 발명의 조성물은 면역 반응을 강화하기 위한 애주번트와 결합될 수 있다. 전통적인 애주번트는 Incomplete Freund's Adjuvant와 같은 오일 에멀전 및 명반(alum)과 같은 점착성 표면을 포함한다. 특히 TLR을 통해 수지상 세포(박테리아의 DNA 또는 단백질로부터 유도된 박테리아 세포막과 같은)를 보충하고 활성화하거나, 세포독성(cytotoxic) T cell를 제거하는 것을 돕는 애주번트는 특히 유용하다. 그렇지 않으면 면역 반응을 강화하거나 세포자살(apoptosis) 또는 암세포의 제거를 촉진하는 다른 요소가 또한 조성물에 포함될 수 있다.
본 발명의 면역원성 조성물의 복합 용량 및/또는 다른 조합은 분리되거나 함께 배분되기 위해 포장될 수 있다. 이하 상술하는 부분의 키트와 같이 각 조성물 또는 조성물 세트는 면역반응 및 또는 암치료를 유도하는 조성물 또는 그 조합의 용도에 관한 설명서(판촉물 또는 포장 삽입물의 형태로)와 함께 첨부될 수 있다.
이전 특허 출원(PCT/EP2006/005325)에서, 출원인은 크립틱 에피토프에 대한 T cell 반응의 개시 및 유지를 가능하게 하는 백신 프로토콜을 기술하였다. PCT/EP2006/005325에 보고된 결과는 동종의 최적화된 펩티드로 백신화한 후에, 크립틱 에피토프에 대응한 본래 펩티드의 투여가 상기 최적화된 펩티드에 의해 개시된 면역반응을 유지할 수 있음을 증명한다.
본 발명에 따라, HLA-B*0702-제한 크립틱 에피토프는 따라서 그 동종의 최적화된 펩티드에 의해 개시된 CTL 면역 반응을 유지하기 위한 의약 조성물의 제조에 사용될 수 있다. HLA-B*0702-제한 크립틱 에피토프로부터 유도된 최적화된 HLA-B*0702-제한 크립틱 에피토프 서열을 갖는 면역원성 펩티드가 상기 HLA-B*0702-제한 크립틱 에피토프에 대한 CTL 면역 반응을 개시하기 위한 의약 조성물을 제조하는데도 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 발암 또는 바이러스 항원에 대해 환자에게 백신접종하기 위한 방법을 포함하며, 상기 방법은 상기 항원의 본래 HLA-B*0702-제한 크립틱 에피토프와 동종인 최적화된 펩티드로 백신접종하는 제 1단계 및 상기 본래 펩티드로 백신접종하는 제 2단계를 포함한다.
본 발명은 또한 HLA-B*0702-제한 크립틱 에피토프의 서열을 갖는 1차 펩티드 및 그 동종의 HLA-B*0702-제한 면역원성 에피토프에 대한 2차 펩티드를 분리된 제형으로 포함하는 키트의 부분에 관한 것이다. 본 발명에 따른 키트의 일부가 될 수 있는 펩티드의 실시예는 SEQ ID NOs: 1 내지 4의 펩티드이며, 이는 1차 펩티드, 상술한 바와 같이 면역원성을 증가시키는 방법에 의해 상기 1차 펩티드로부터 유도된 2차 펩티드를 구성할 수 있다.
본 발명에 따른 다른 키트의 부분은 적어도 키메릭 폴리펩티드를 포함한다. 그러한 키트의 여러 변형체가 고려된다: 첫번째 실시예에서, 상기 키트는 분리된 제형으로, 2, 3 또는 그 이상의 HLA-B*0702-제한 크립틱 에피토프를 포함하는 1차 키메릭 폴리펩티드 및 그 동종 HLA-B*0702-제한 면역원성 키메릭 폴리펩티드에 대응하는 2차 키메릭 폴리펩티드(이는 1차 키메릭 폴리펩티드에 포함된 크립틱 에피토프와 동종인 최적화된 HLA-B*0702-제한 면역원성 에피토프를 포함함을 의미한다)를 포함한다. 두번째 실시예에서, 상기 키트는 2, 3 또는 그 이상의 HLA-B*0702-제한 크립틱 에피토프를 포함하는 1차 키메릭 폴리펩티드 및 하나 또는 여럿의 분리된 제형으로, 상기 1차 키멜릭 폴리펩티드에 포함된 크립틱 에피토프와 동종인 최적화된 HLA-B*0702-제한 크립틱 에피토프에 대응하는 펩티드들을 포함한다. 세번째 실시예에서, 상기 키트는 구별되는 HLA-B*0702-제한 크립틱 에피토프에 대응하는 2, 3 또는 그 이상의 펩티드를 포함하며, 상기 펩티드들은 하나의 제형으로 혼합되거나, 여러 제형으로 분리되며, 분리된 제제로 키메릭 폴리펩티드는 상기 크립틱 펩티드와 동종인 최적화된 HLA-B*0702-제한 면역원성 에피토프를 포함한다.
본 발명에 따른 키트의 이하의 설명에서, (본래 또는 최적화된)펩티드들에 대해서만 언급될 것이며, 키메릭 폴리펩티드(본래의 크립틱 에피토프 또는 최적화된 에피토프를 포함하는)가 단일-에피토프 펩티드들 대신에 키트에 첨부될 수 있을 것임이 이해될 것이다.
본 발명의 특정 실시예에서, 상기 키트는 백신 키트로서, 상기 1차(본래) 및 2차(동종의 최적화된)펩티드들은 분리된 백신 용량이다. 바람직한 실시예에서, 백신 키트는 최적화된 2 또는 3 용량 및 본래 펩티드의 3, 4 5, 6 용량을 포함한다. 본 발명에 따른 특정 백신 키트는 6 투여의 1차 백신 서열에 적합하며, 최적화된 펩티드 2 또는 3 용량 및 본래 펩티드의 4 또는 3 용량을 포함한다. 만성 질병의 경우, 일반적인 기억에 의해 이 1차-백신접종(primo-vaccination) 후에 얻어진 면역 수준을 유지하는 것이 바람직하다. 이는 예를 들어, 매 1.5 내지 6 개월에 수행된 투여에 의해 수행될 수 있다. 따라서, 순수 펩티드의 적어도 2 용량 및 40 내지 50 용량에 이르는 상보적인 키트도 본 발명의 일부가 될 수 있다. 택일적으로, 백신 키트는 최적화된 펩티드의 2 내지 3 용량 및 본래 펩티드의 3 내지 40 또는 50 용량까지 포함할 수 있다. 물론, 상기 키트에 존재하는 본래 및 최적화된 펩티드들은 상술한 바와 같다.
각 용량은 0.5 내지 10mg의 펩티드를 포함하며, 바람직하게는 1 내지 5 mg 또는 1 내지 20 mg의 폴리펩티드를 포함한다. 바람직한 실시예에서, 각 용량은 피하주사용으로 제조된다. 예를 들어, 각 용량은 애주번트로 사용되는 몬타나이드(Montanide)로 유화된 수용액의 에멀전 0.3 내지 1.5 ml으로 제조된다. 당업자는 몬타나이드(Montanide)(뿐만 아니라)를 대체하는 어떠한 다른 애주번트(들)를 선택할 수도 있다. 또한, 상기 용량은 투여되는 액체 용액의 즉석 제조용 동결건조된(lyophilized) 펩티드의 형태로 될 수 있다. 상기 키트의 다른 가능한 구성요소는 투여 전에 펩티드 조성물에 추가되는 하나 이상의 애주번트이며, 상기 키트의 사용 방법을 기술하는 통지(notice)이다.
본 발명은 다음의 도면 및 실시예에 의해 설명된다.
도 1: HLA-B*0702 제한된 펩티드의 면역원성. CTL은 표시된 바에 따라 펩티드로 로딩된 RMA-B7 타겟에 대해 테스트되었다.
도 2: 최적화된 HLA-B*0702 크립틱 폴리펩티드의 면역원성. CTL은 표시된 바에 따라 펩티드로 로딩된 RMA-B7 타겟에 대해 테스트되었다.
도 3: HLA-B*0702 트랜스제닉 마우스에서 최적화된 Her2/neu1069L9(A) 및 Her2/neu1069(B) 펩티드의 In vivo 면역원성. CTL은 표시된 바에 따라 펩티드로 로딩된 RMA-B7 타겟에 대해 테스트되었다. 유도된 CTL 모집단은 3배(1), 10배(2), 30배(3), 100배(4) 희석되었다.
도 4: (A) HLA-B*0702 트랜스제닉 마우스에서 TERT 4 면역원성. CTL은 감소된 용량의 TERT4 펩티드로 로딩된 RMA-B7 타겟에 대해 테스트되었다. (B) TERT 4 특정 뮤린 CTL에 의한 내생성 TERT의 인식. CTL은 표시된 바에 따라, HLA-B*0702 및 TERT로 감염된 COS 세포에 대해 테스트되었다. (C) TERT 4 특정 휴먼 CTL의 유도. CTL은 표시된 바에 따라(왼쪽 그래프), 작동자(Effector)/타겟(Target) 비율을 사용하여, TERT4 (■) 또는 무관한 (●) 펩티드로 로딩된 T2-B7 타켓에 대해 테스트되었으며, HLA-B*0702 양성 TERT 양성 SK-MES-1 (■), HBL-100 (●) 및 HLA-B*0702 음성 TERT 양성 SW-480 (□), HSS (○) 휴먼 종양 세포 라인(오른쪽 그래프)에 대해 테스트되었다.
도 5: TERT 444 특이적 뮤린 CTL에 의한 내생성 TERT의 인식. (A) CTL은 표시된 바에 따라, TERT444 또는 TERT444A1 펩티드의 감소된 용량으로 로딩된 RMA-B7 타겟에 대해 테스트되었다. (B) CTL은 표시된 바에 따라, HLA-B*0702 및/또는 TERT로 감염된 COS 세포에 대해 테스트되었다.
도 6: 특이적 인간 CTL의 유도. CTL은 표시된 바에 따라, 펩티드로 로딩된 T2-B7에 대해 테스트되었다. CTL 최대 활성은 PMA/이오노마이신(ionomycine) 처리에 의해 얻어진다.
실시예들은 다름의 물질 및 방법을 사용하여 수행되었다.
트랜스제닉 마이스. HLA-B7 H-2 클래스-I 녹아웃 마이스는 이전에 기술되었다(Rohrlich et al., 2003).
세포 . HLA-B*0702 감염된 뮤린 RMA-B7 및 인간 T2-B7 세포는 이전에 기술되었다(Rohrlich et al., 2003). COS-7 및 WEHI-164 클론 13 셀은 F. Jotereau (INSERM 463, Nantes, France)에 의해 제공되었다. HLA-B*0702 양성 SK-MES-1 (폐암), HBL-100 (유방암), 및 HLA-B*0702 음성 SW-480 (결장암) 및 HSS (골수종) 셀라인이 인간 CTL 세포의 타겟으로 사용되었다. 모든 셀 라인은 FCS 10% 보충된 RPMI1640 배양 배지에서 성장하였다.
펩티드 및 플라스미드 . 펩티드들은 Epytop (Nimes, France)에 의해 합성되었다. HLA-B*0702 플라스미드는 Dr. Lemonnier (Institut Pasteur, Paris, France) (Rohrlich et al., 2003)에 의해 제공되었으며, TERT 플라스미드는 Dr. Weinberg (MIT, Boston, MA) (Meyerson et al, 1997)에 의해 제공되었다.
HLA-B*0702에 대한 펩티드 상대 친화도 측정 . 사용된 프로토콜은 이전에 기술되어 왔다(Rohrlich et al., 2003). 간단히 말해, T2-B7 세포는 37℃에서 16 시간 동안 100 μM 에서 0.1 μM 까지의 농도 범위의 펩티드로 배양된 후 HLA-B*0702 표면 발현을 정량화하기 위해 ME-1 모노클로날 항체(mAb)로 염색되었다. 각각의 펩티드 농도에 대해, HLA-B*0702 특이적 염색은 대조 펩티드 CMV265-274(R10V; RPHERNGFTV, SEQ ID NO: 9) 100 μM로 얻어진 염색의 퍼센트로 계산되었다. 상대 친화도(RA)는 다음과 같이 결정되었다: RA = (20 %의 HLA-B*0702-발현을 유도하는 각 펩티드의 농도 / 20% 의 HLA-B*0702 발현을 유도하는 대조 펩티드의 농도).
HLA-B*0702 T트랜스제닉 마우스에서의 in vivo에서의 CTL의 유도 . 쥐에게 150 μg의 I-Ab 제한 HBVcore128 T 헬퍼 에피토프(TPPAYRPPNAPIL, SEQ ID NO: 10)의 존재하에, Incomplete Freund's 애주번트(IFA)에서 유화된 100 μg의 펩티드로 피하 주사하였다. 11일 후에, 5x107 비장세포(spleen cells)가 in vitro 에서 펩티드(10 μM)로 유도되었다. 배양 6일째, 대부분의 반응 군이 특정 세포 독성(cytotoxicity)에 대해 테스트되었다.
COS-7 감염 세포에서의 펩티드 프로세싱 분석. 2.2x104 유인원 COS-7 세포 가 각각의 조건에 대해 세배로 DMEM+10% FCS에서 플랫-바닥의 96-웰 플레이트에서 도포되었다. 18시간 후, 세포는 DEAE 덱스트란으로 각각의 DNA 플라스미드 100ng으로 트랜스펙션되었다. 4시간 후, PBS+10% DMSO가 2분 동안 추가되었다. 감염된 COS 세포는 DMEM+10% FCS에서 40 시간 동안 배양된 후 TNFa 분비 분석(secretion assay)에서 뮤린 CTL을 자극하는데 사용되었다.
TNFa 분비 분석 . 4일째의 트랜스펙션된 COS-7 세포는 50μl의 RPMI+10% FCS 에서 현탁되었고, 자극 세포로 사용되었다. 5x104 뮤린 T 세포는 그 후 50 μl의 RPMI 10% FCS에 추가되었고 6시간동안 배양되었다. 각각의 조건은 3배로 테스트되었다. 50 μl의 상등액이 TNFa를 측정하기 위해 수집되었다. 표준 희석은 104 내지 0 pg/ml 범위의 TNFa 의 최종 용량으로 50 μl에서 제조되었다. 상등액 및 표준 희 석 모두에서, 3x104 TNFa 민감성 WEHI-164c13 세포가 50 μl로 추가되었다. 이들은 37℃에서 16시간 동안 배양되었다. 세포 증식의 저해가 MTT 색도 측정 방법에 의해 측정되었다(Espevik and Nissen-Meyer, 1986).
인간 PBMC로부터의 CTL의 생성 . PBMC는 건강한 HLA-B*0702 지원자의 백혈구 분리과정에 의해 수집되었다. 수지상 세포(DC)가 완전 배지에서(10%의 열 비활성화된 인간 AB 체액, 2 μM의 L-글루타민 및 항생제로 보충된 RPMI-1640) 500 IU/ml GM-CSF 및 500IU/ml IL-4 (R&D Systems, Minneapolis, MN)의 존재하에, 7일 동안 배양된 점착성 세포(adherent cells)(2x106 cells/ml)로부터 생성되었다. 7일째에, DC는 2시간동안 10 μM 펩티드로 펄스되었으며; 100 ng/ml에서 성숙제(maturation agent) Poly I:C (Sigma, Oakville, Canada) 및 2 μM/ml에서 항-CD40 mAb (clone G28-5, ATCC, Manassas, VA)가 배양액에 추가되었고, DC는 37℃에서 밤새 또는 48시간까지 배양되었다. 성숙한 DC는 그 후 방사 조사되었다(3500 radd). CD8+ 세포는 제조사의 설명에 따라, CD8 MicroBeads (Miltenyi Biotec, Auburn, CA)로 양성 선택(positive selection)에 의해 정화되었다. 2x105 CD8+ 세포 + 6x104 CD8- 세포는 둥근 바닥의 96 웰 플레이트의 1000 IU/ml IL-6 및 5 IU/ml IL-12 (R&D Systems, Minneapolis, MN)로 보충된 완전 배양 배지에서 2x104 펩티드 펄스된 DC로 자극되었다. 17일째부터, 배양은 20 IU/ml IL-2 (Proleukin, Chiron Corp., Emeryville, CA) 및 10 ng/ml IL-7 (R&D Systems, Minneapolis, MN) 존재하에서, 매주 펩티드-로딩된 DC로 재자극되었다. 세번째, in vitro 재자극 후에, 벌크 세포 배양은 세포독성 (TERT4) 또는 IFNg 세포내 염색 (TERT444A1) 에 대해 테스트되었다.
세포독성 분석 . 타겟은 100μCi의 Cr51 로 60분 동안 라벨되고, 96-웰 V자-바닥의 플레이트에 도포되었으며(100 μL의 RPMI 1640 배지에서 3x103 세포/웰), 필요한 경우, 37℃에서 2시간 동안 펩티드(1μL)로 펄스되었다. 이후 작동자(effector)가 웰에 추가되고, 37℃에서 4시간동안 배양되었다. 특이적 세포용해(lysis)의 퍼센트가 다음과 같이 결정되었다: % 세포용해(Lysis) = (실험적 배출 - 자연적 배출) / (최대 배출 - 자연적 배출) x 100.
IFNγ 세포내 염색. T cells (105)이 μg/ml 브레펠딘-A(Brefeldin-A) (Sigma, Oakville, Canada)존재 하에, 자극 펩티드로 로딩된 2x 105 T2 cells 로 배양되었다. 6시간 후, 세척하여, PBS에서 r-피코에리쓰린-결합된 항-CD8 항체(Caltag Laboratories, Burlingame, CA, USA)로 4℃에서 25분 동안 염색되었으며, 다시 세척하고, 4% PFA로 고정하였다. 상기 세포는 이 후, PBS, 0.5% BSA, 0.2% 사포닌(Sigma, Oakville, Canada)으로 투과되었고, FACSCalibur® flow cytometer로 분석되기 전, 알로피코시아닌(allophycocyanin)-결합된 항-IFNγ mAb (PharMingen, Mississauga, Canada)로 25분 동안 4℃에서 라벨링되었다.
실시예 1: 펩티드의 친화도
Hsp70 (Hsp70115, Hsp70137, Hsp70397), TERT (TERT4 및 TERT444) 및 MAGE-A (MAGE-A121.1, MAGE-A121.2 및 MAGE-A121.4) 항원에 속하는 HLA-B*0702 특이적 앵커 모티브를 가진 8개의 펩티드 즉, P2 및 바람직하게는 C-말단 위치의 L/V(Sidney et al., 1996)는 HLA-B*0702 분자의 결합 여부에 대해 테스트되었다. TERT4만 높은 친화도로 HLA-B*0702에 결합하였고, 나머지 7개의 펩티드는 약하게 결합되거나 결합되지 않았다(표 II). 이는 앵커 모티브의 존재가 HLA-B*0702에 대한 높은 결합력을 보증하기에 충분하지 않음을 입증한다. 낮은 친화도를 고려했을 때, 펩티드 Hsp70115, Hsp70137, Hsp70397, TERT444, MAGE-A121.1, MAGE-A121.2, MAGE-A121.4는 크립틱 펩티드로 간주된다.
| 펩티드 | 서열 | RA | 서열 번호 | |
| 1 | Hsp70 115 | YPEEISSMVL | >10 | 11 |
| Hsp70 115A1 | Apeeissmvl | >10 | 12 | |
| 2 | Hsp70 137 (10) | YPVTNAVITV | >10 | 13 |
| 3 | Hsp70 397 | APLSLGLET | >10 | 14 |
| 4 | TERT4 | APRCRAVRSL | 0.74 | 15 |
| 5 | TERT444 | DPRRLVQLL | >10 | 1 |
| TERT 444A1 | APRRLVQLL | 1.4 | 5 | |
| 6 | MAGE-A121.1 | EPVTKAEML | >10 | 16 |
| MAGE-121.1 A1 | APVTKAEML | >10 | 17 | |
| 7 | MAGE-A121.2 | EPFTKAEML | >10 | 18 |
| 8 | MAGE-A121.4 | EPITKAEIL | >10 | 19 |
표 II: 펩티드의 HLA-B*0702 친화도
실시예 2: 선택된 펩티드의 면역원성
낮은 친화도의 Hsp137, Hsp115, Hsp397, TERT444 및 높은 친화도의 TERT4 펩티드가 HLA-B*0702 트랜스제닉 마우스에서 CTL 면역 반응을 유도하는 능력에 대해 테스 트되었다. 높은 친화도의 TERT4만 면역원성이 있었으며, 이는 펩티드의 면역원성이 HLA의 친화도와 깊은 관련이 있음을 확인해준다(도 1).
실시예 3:
낮은 친화도의 펩티드의 친화도의 강화
모든 이러한 크립틱 펩티드가 1차 앵커 모티브를 가지기 때문에, 그 친화도의 강화는 그들이 면역원성이기 위해서는 필수조건이 된다. 친화적이지 않은 2차 앵커 모티브를 확인하고 그를 친화적 모티브로 대체하는 것이 필요하다. 이러한 대체는 그러나, TCR(위치 4 내지 위치 8)과 상호작용하는 펩티드 세그먼트의 대응을 유지해야 한다. 따라서, 흥미로운 것은 2차 앵커 위치 1 및 3 : 지방족(aliphatic) 아미노산이 위치 1에서 친화적인 모티브라는 것이다(Sidney, Southwood et al., 1996). 그러나, 위치 1에서 Y(티로신)을 가지는 펩티드 Hsp70115 및 Hsp70137는 결합하지 않는다. 더욱이, 위치 1의 아미노산을 또한 이 위치에 친화적인 A(알라닌)으로 대체하는 것(Parker et al, 1994)은 TERT444의 친화도를 강화시키며, Hsp70115 및 MAGE-A121.1 펩티드의 친화도를 강화시키지는 않는다(표 II). 이는 위치 1 및 앵커 위치 2 및 9/10 에서의 친화적 아미노산의 존재가 모든 펩티드의 높은 결합 친화도를 그 자체로 보증할 수 없음을 나타낸다. 다시 말해, 양이온 펩티드(R/H/K)가 위치 3에서 친화적임이 기술되었으며(Sidney et al., 1996) 26개의 동정된 종양 중 10개 및 HIV 유도된 면역원성 펩티드는 위치 3에서 R/K/H를 가진다(표 III).
| 항원 | 서열 | 서열 번호 | 참조 |
| NY-ESO-1 | APRGVRMAV | 20 | Slager et al, 2004 |
| ICE | SPRWWPTCL | 21 | Ronsin et al., 1999 |
| RAGE-1 | SPSSNRIRNT | 22 | Gaugler et al., 1996 |
| RU2AS | LPRWPPPQL | 23 | Van Den Eynde et al., 1999 |
| RBAF500 | RPHVPESAF | 24 | Lennerz et al., 2005 |
| SSX2 융합 단백질 | QPRYGYDQIM | 25 | Worley et al, 2001 |
| HIVp17 | RPGGKKRYKL | 26 | HIV Molecular Immunology Database (Operated by Los Alamos National Security, LLC, for the U.S. Department of Energy's National Nuclear Security Administration) http://hivweb.lanl.gov/content/immunology/tables/ctl_summary.html |
| HIVp24 | SPRTLNAWV | 27 | |
| HIVp24 | HPVHAGPIA | 28 | |
| HIVp24 | PPIPVGEIY | 29 | |
| HIVp24 | GPGHKARVL | 30 | |
| HIV-RT | SPIETVPVKL | 31 | |
| HIV-RT | GPKVKQWPLT | 32 | |
| HIV-RT | SPAIFQSSM | 33 | |
| HIV-RT | IPLTEEAEL | 34 | |
| HIV-RT | QPDKSESELV | 35 | |
| HIV-Vif | HPRISSEVHI | 36 | |
| HIV-Vif | KPPLPSVKKL | 37 | |
| HIV-Vif | FPRTWLHGL | 38 | |
| HIVgp160 | KPCVKLTPLC | 39 | |
| HIVgp160 | KVVSTQLLL | 40 | |
| HIVgp160 | RPWNNTRKSI | 41 | |
| HIVgp160 | IPRRIRQGL | 42 | |
| HIVnef | FPVTPQVPL | 43 | |
| HIVnef | TPQVPLRPM | 44 |
표 Ⅲ: 종양 및 HIV 유도 HLA-B*0702 제한 에피토프
이러한 모든 관찰에 따라, APX3X4X5X6X7X8X9X10X11 (SEQ ID NO: 61) 의 서열을 갖는 펩티드는 HLA-B*0702에 대해 높은 친화도를 가져야 한다. 이는 표 Ⅳ에 나타난 결과에 의해 확인된다. 상기 인용된 서열을 갖는 모든 18개의 펩티드들은 높은 친화도를 가지며 및/또는 HLA-B*0702 트랜스제닉 마우스에서 면역원성이다.
| 서열 | 서열번호 | RA | 면역원성 |
| APRRLVQLL | 5 | + | + |
| APRSPLAPL | 6 | ++ | + |
| APKANKEIL | 7 | ND | + |
| APKHSDCLA | 8 | ND | + |
| APRCRAVRSL | 15 | + | + |
| APRMHCAVDL | 45 | ++ | + |
| APRVSIRLPL | 46 | ++ | ND |
| APREYVNAL | 47 | + | + |
| APRGVPQIEL | 48 | ND | + |
| APRALVETL | 49 | + | + |
| APRMPEAAL | 50 | ND | + |
| APRRRLGCEL | 51 | + | + |
| APRPWTPCL | 52 | + | + |
| APRASSPLL | 53 | ND | + |
| APRQLGREL | 54 | ND | + |
| ApReissmvl | 55 | + | + |
| APRSLGLEL | 56 | ++ | + |
| APRTKAEML | 57 | + | + |
표 Ⅳ: APX3X4X5X6X7X8X9X10X11 HLA-B*0702 제한-펩티드의 친화도 및 면역원성.
- = RA>10, + = 1<RA<10, ++ = RA<1, 면역원성은 실시예 2에서 상술한 바에 따라 테스트되었다. + : 특정 면역반응이 적어도 하나의 HLA-B*0702 트랜스제닉 마우스에서 일어났음을 의미함. ND : 측정되지 않음.
실시예 4: 강화된 친화도를 갖는 펩티드의 in vivo 면역원성 및 본래 대응물(counterpart)의 인식
HLA-B7 트랜스제닉 마우스는 선택된 펩티드로 백신접종되었으며, 11일 후, 그 비장 세포는 in vitro에서 펩티드로 자극되었다.
이러한 맥락에서, Hsp70115, Hsp70397 및 TERT444는 따라서,위치 1(그 아미노산이 A로 대체) 및/또는 위치 3(그 아미노산이 R로 대체)에서 변형되었다. Hsp70397 펩티드에 대해, C-말단 위치(T를 L로 대체)에서 추가적인 수정이 도입되었다. 수정된 펩티드 즉, Hsp70115A1R3 (SEQ ID NO: 55), Hsp70397R3L9 (SEQ ID NO: 56), TERT444A1 (SEQ ID NO: 5) 는 HLA-B*0702에 대해 강한 친화도를 나타내었으며(표 Ⅳ), 대부분의 백신 접종된 쥐에서 면역반응을 유도하였다(도 2). 그러나, TERT444A1 를 제외한 모든 펩티드에 대해, 생성된 CTL은 대응하는 본래의 펩티드가 아닌 최적화된 펩티드를 인식하였다(도 2). 이는 위치 3의 아미노산을 R로 대체한 것이 TCR과 접촉하는 펩티드 세그먼트의 대응(confrontation)을 변화시킬 수 있으며, TCR의 상호 인식을 보장할 수 있음을 강하게 시사한다.
a) APX3X4X5X6X7X8X9X10X11로 테스트된 모든 펩티드가 면역원성이며 (표 IV 및 도 1, 2) 및 b) 위치 3의 아미노산을 R로 대체하는 것은 본래 펩티드의 상호-인식을 방해할 수 있기 때문에, 발명자들은 위치 2 및 3에 각각 P 및 R을 가지는 본래 펩티드를 선택하였으며, 이들은 마지막 아미노산이 친화적인 경우(L, A, I, V 또는 M), 위치 1의 아미노산을 A로 대체하였다. 친화도 및 CTL의 HLA-B*0702 제한 펩티드의 인식에 있어서 위치 3의 중요성이 크다는 점을 고려해 볼 때, 발명자들은 서열 X1PX3 (여기서, X1 는 모든 아미노산이고, X3 는 K, R, H 또는 M 임; 이들 아미노산은 위치 3에서 친화적인 잔기로 기술되어 왔음) 및 C-말단에 친화적 아미노산((A/I/L/V)를 가진 펩티드를 선택하였다. 이 서열을 가지며, HLA-B*0702에 대해 낮은 친화도를 가지는 펩티드들은 첫번재 잔기를 A로 대체하는 것으로 변형되었다. 이는 TERT444, Her-2/neu760 및 Her-2/neu246의 경우이다. 발명자들은 또한 서열 APX3 (여기서, X3는 K, R, H 또한 M)를 가지며, C-말단 위치에 비 친화적 잔기(즉, L, A, I, V 또는 M이외의 아미노산)를 가지는 펩티드들을 선택하였다. 이러한 서열을 가진, HLA-B*0702에 대해 낮은 친화도를 갖는 펩티드들은 C-말단 위치의 잔기를 L로 대체함으로써 변형되었다. 이는 Her-2/neu1069의 경우이다. 이러한 모든 변형된 펩티드들은 HLA-B*0702에 대해 강한 친화도를 가졌다.
실시예 5: 최적화된 펩티드의 면역원성 및 본래 대응물(counterpart)
본래의 Her2/neu246, Her2/neu760, Her2/neu1069 및 TERT444 펩티드는 면역원성이 아닌 반면, 최적화된 펩티드들은 HLA-B*0702 트랜스제닉 마우스에서 면역원성이었다. 더욱이, 이런 모든 최적화된 펩티드들에 의해 유도된 CTL은 대응하는 본래의 펩티드와 상호-반응할 수 있었다(도 3 및 표 Ⅴ).
| 펩티드 | 서열 | 서열번호 | 면역원성 | 대응하는 본래 펩티드 상호 인식 |
| TERT444 | DPRRLVQLL | 1 | - | |
| TERT444A1 | APRRLVQLL | 5 | + | + |
| Her2/neu760 | SPKANKEIL | 3 | - | |
| Her2/neu760A1 | APKANKEIL | 7 | + | + |
| Her2/neu246 | GPKHSDCLA | 4 | - | |
| Her2/neu246A1 | APKHSDCLA | 8 | + | + |
| Her2/neu1069 | APRSPLAPS | 2 | - | |
| Her2/neu1069L9 | APRSPLAPL | 6 | + | + |
표 5: 본래의 최적화된 HLA-B*0702 제한 펩티드의 면역원성. 면역원성이 + 또는 본래 펩티드 상호 인식은 상기 펩티드가 적어도 하나의 HLA-B*0702 트랜스제 닉 마우스에서 특정 반응을 유도하며 대응하는 본래 펩티드를 인식할 수 있음을 의미한다.
결론적으로, 발명자는 HLA-B*0702 제한 크립틱 펩티드의 면역원성(및 친화도)를 최적화하는 방법을 기술했다. 이는 a) 서열 X1PX3 (여기서 X1은 A를 제외한 아미노산이고, X3는 R 또는 K 또는 H 또는 M임), C-말단 위치의 친화적 아미노산(즉, L 또는 A 또는 I 또는 V 또는 M 임) 및 HLA-B*0702에 대해 낮은 친화도를 갖는 모든 펩티드에서 위치 1의 잔기를 A로 대체하거나, b) 서열 APX3 (X3는 상술한 바와 같음), C-말단 위치에서 비친화적인 잔기(즉, L 또는 A 또는 I 또는 V 또는 M 이외의 아미노산) 및 HLA-B*0702에 대해 낮은 친화도를 갖는 모든 펩티드에서 C-말단 위치의 잔기를 L로 대체하는 것으로 이루어진다.
실시예 6: TERT
4
면역우세의 펩티드는 TERT 특이적 CTL를 유도한다
HLA-B7 트랜스제닉 마우스는 이후 TERT4 (SEQ ID NO: 15)로 면역화되고, 11일 후, 이들의 비장세포(spleen cells)는 in vitro에서 펩티드로 자극되었다. 생성된 TERT4 펩티드의 감소되는 농도로 로딩된 RMA-B7 타겟을 죽였다(도 4A). TERT4 로딩된 타겟의 최대 세포용해의 절반은 1.5nM로 얻어졌다(도 4A). CTL은 이후 HLA-B*0702 및 외생성(endogenous) TERT를 발현하는 COS-7 세포를 인식하는 능력에 대해 테스트되었다. 도 4B에 나타난 결과는 CTL이 HLA-B*0702나 TERT 중 하나로 감염 된 COS-7 세포가 아닌 HLA-B*0702 및 TERT 둘 다로 감염된 COS-7 세포를 인식하였음을 보여주며, 이는 TERT4 우세 펩티드가 내생성(endogenous) TERT로부터 자연스럽게 프로세싱된 HLA-B*0702 제한 에피토프임을 증명한다.
더욱이, 건강한 도너로부터의 CD8은 TERT4 펩티드로 로딩된 자가 조직의 수지상 세포(dendric cells)로 in vitro에서 자극되었다. 4번의 자극 후에, CTL은 T2-B7로 로딩된 TERT4 에 대한 세포독성을 테스트하였다. 3개의 도너가 테스트되었고, CTL은 그 중 2개에서 유도되었다. 대응하는 도너로부터의 결과는 도 4C에 도시하였다. CTL은 관계없는 Nef 펩티드를 표시하는 T2-B7 세포가 아니라, TERT4를 표시하는 T2-B7 타겟을 죽였다(왼쪽 그래프). 흥미롭게도, CTL은 HLA-B*0702 제한 표시 및 TERT4 에피토프의 내생성 프로세싱을 확인하는 HLA-B*0702-TERT+ SW-480 및 HSS 인간 종양 세포라인이 아니라, HLA-B*0702 TERT+ SK-MES-1 및 HBL-100를 죽였다(오른쪽 그래프).
실시예 7: TERT
444A1
펩티드에 의해 유도된 CTL은 내생성 TERT를 인식한다
TERT444A1 (SEQ ID NO: 5)는 내생성 TERT을 인식할 수 있는 CTL을 유도할 수 있으며, 건강한 도너에서 CTL을 유도할 수 있는 능력에 대해 테스트되었다(실시예6). HLA-B*0702 트랜스제닉 마우스는 그 후 TERT444A1로 면역화되었으며, 11일 후에, 이들의 비장세포(spleen cells)가 본래의 TERT444 펩티드(SEQ ID NO: 1)로 in vitro 자극되었다. 생성된 CTL은 TERT444A1 및 TERT444 펩티드의 감소되는 농도로 로딩된 RMA-B7 타겟을 죽였다. TERT444 로딩된 및 TERT444A1 로딩된 타겟의 최대 세포 용해의 절반이 각각 5.5nM 및 1nM로 얻어졌다(도 5A). CTL은 HLA-B*0702 및 내생성 TERT을 발현하는 COS-7 세포를 인식하는 능력에 대해 테스트되었다. 도 5B에 나타난 결과는 CTL이 HLA-B*0702 나 TERT 중 하나로 감염된 COS-7 세포가 아닌 HLA-B*0702 및 TERT 둘 다로 감염된 COS-7 세포를 인식하였음을 보여주며, 이는 TERT444 가 내생성 TERT로 프로세싱된 HLA-B*0702 제한 크립틱 에피토프임을 증명한다.
실시예 8: TERT
444A1
는 건강한 도너로부터의 CTL을 자극한다
건강한 도너로부터의 CD8 세포는 TERT444A1 펩티드로 로딩된 자가 조직의 수지상 세포(dendric cells)로 in vitro에서 자극되었다. 4번의 자극 후에, 증식세포는 4개의 풀로 나뉘어졌다. 각각의 풀은 최적화된 TERT444A1 또는 본래의 TERT444로 로딩된 T2-B7 세포로 자극된 후의 세포내 IFNg 생산에 대해 테스트되었다. D5609 대응 도너로부터의 결과는 도 6에 도시하였다. CTL를 생산하는 IFNg는 TERT444나 TERT444A1 로딩된 T2B7로 자극된 후 풀 2 및 4에서 탐지되었다(도 6).
REFERENCES
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SEQUENCE LISTING
<110> VAXON BIOTECH
KOSMATOPOULOS, Kostantinos (Kostas)
GRAFF-DUBOIS, Stephanie
MENEZ-JAMET, Jeanne
<120> IDENTIFICATION, OPTIMIZATION AND USE OF CRYPTIC HLA-B7 EPITOPES
FOR IMMUNOTHERAPY
<130> VMA/bv-F1788/3PCT
<150> PCT/IB2006/002937
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<160> 61
<170> PatentIn version 3.3
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<400> 57
Ala Pro Arg Thr Lys Ala Glu Met Leu
1 5
<210> 58
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> HLA-B*0702-restricted cryptic eptiope
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa is any naturally occurring amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa is Arg or Lys or His or Met
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(7)
<223> Xaa are independently any naturally occurring amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(10)
<223> Xaa are independently any naturally occurring amino acid or none
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> Xaa is any naturally occurring amino acid with the proviso that
if Xaa (1)..(1) is Ala then Xaa (11)..(11) is neither Leu nor Ala
nor Ile nor Val and nor Met; and if Xaa (1)..(1) is not Ala then
Xaa (11)..(11) is Leu or Ala or Ile or Val or Met
<400> 58
Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10
<210> 59
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> HLA-B*0702-restricted cryptic epitope
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa is any naturally occurring amino acid other than Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa is Arg or Lys or His or Met
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(7)
<223> Xaa are independently any naturally occurring amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(10)
<223> Xaa are independently any naturally occurring amino acid or none
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> Xaa is Leu or Ala or Ile or Val or Met
<400> 59
Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10
<210> 60
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> HLA-B*0702-restricted cryptic epitope
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa is Arg or Lys or His or Met
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(7)
<223> Xaa are independently any naturally occurring amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(10)
<223> Xaa are independently any naturally occurring amino acid or none
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> Xaa is any naturally occurring amino acid other than Leu or Ala
or Ile or Val or Met
<400> 60
Ala Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10
<210> 61
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Immunogenic HLA-B*0702 restricted epitope
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa is Arg or Lys or His or Met
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(7)
<223> Xaa are independently any naturally occurring amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(10)
<223> Xaa are independently any naturally occurring amino acid or none
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> Xaa is Leu or Ala or Ile or Val or Met
<400> 61
Ala Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10
Claims (27)
- 상기 에피토프의 N-말단 잔기를 알라닌으로 대체하거나, 상기 에피토프의 C-말단을 류신으로 대체하는 단계를 포함하는 HLA-B*0702-제한 크립틱 에피토프의 면역원성(immunogenicity) 증가 방법.
- 상기 크립틱 에피토프의 3개의 첫째 잔기들이 APR 또는 APK 또는 APH 또는 APM 인 것을 특징으로 하며, 상기 에피토프의 C-말단을 류신으로 대체하는 단계를 포함하는 HLA-B*0702-제한 크립틱 에피토프의 면역원성(immunogenicity) 증가 방법.
- 상기 크립틱 에피토프의 두번째, 세번째 잔기가 PR 또는 PK 또는 PH 또는 PM 이며, C-말단 위치의 아미노산이 L 또는 A 또는 I 또는 V 또는 M 인 것을 특징으로 하며, 상기 에피토프의 N-말단 잔기를 알라닌으로 대체하는 단계를 포함하는 HLA-B*0702-제한된 크립틱 에피토프의 면역원성(immunogenicity) 증가 방법.
- APRSPLAPS (SEQ ID NO: 2), SPKANKEIL (SEQ ID NO: 3), GPKHSDCLA (SEQ ID NO: 4), DPRRLVQLL (SEQ ID NO: 1)로 이루어진 군에서 선택된 크립틱 HLA-B*0702-제한 에피토프.
- C-말단 아미노산을 류신으로 대체함으로써, 크립틱 HLA-B*0702-제한 에피토프 APRSPLAPS (SEQ ID NO: 2)로부터 유래한 면역원성 HLA-B*0702-제한 에피토프.
- N-말단 아미노산을 알라닌으로 대체함으로써, SPKANKEIL(SEQ ID NO: 3), GPKHSDCLA (SEQ ID NO: 4), DPRRLVQLL (SEQ ID NO: 1)로 이루어진 군에서 선택된 크립틱 HLA-B*0702-제한 에피토프로부터 유래한 면역원성 HLA-B*0702-제한 에피토프.
- APRSPLAPL (SED ID NO:6), APKANKEIL (SED ID NO:7), APKHSDCLA (SED ID NO:8), APRRLVQLL (SED ID NO:5) 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 청구항 5 또는 청구항 6에 따른 면역원성 HLA-B*0702-제한 에피토프.
- 청구항 4에 따른 2 또는 3 이상의 HLA-B*0702-제한 크립틱 에피토프를 포함하는 키메릭 폴리펩티드.
- 청구항 5 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 따른 2 또는 3 이상의 면역원성 HLA-B*0702-제한 에피토프를 포함하는 키메릭 폴리펩티드.
- 청구항 4에 따른 크립틱 HLA-B*0702-제한 에피토프, 청구항 5 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 따른 면역원성 에피토프 또는 청구항 8 또는 청구항 9의 키메릭 폴리펩티드를 발현하도록 고안된 핵산 분자.
- 유효성분(active principle)으로서, 적어도 청구항 4에 따른 HLA-B*0702-제한 크립틱 에피토프 또는 청구항 5 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 따른 면역원성 에피토프 또는 청구항 8 또는 청구항 9의 키메릭 폴리펩티드 또는 청구항 10에 따른 핵산을 포함하는 약학적 조성물.
- 백신인 것을 특징으로 하는 청구항 11에 따른 약학적 조성물.
- 분리된 제형으로서, 2 또는 3 이상의 HLA-B*0702-제한 크립틱 에피토프 서열을 갖는 1차 펩티드 및 그 동종의 HLA-B*0702-제한 면역원성 에피토프에 대응하는 2차 펩티드를 포함하는 키트의 일부분.
- 상기 1차 펩티드는 청구항 4에 따른 크립틱 에피토프이며, 상기 2차 펩티드는 청구항 5 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 따른 면역원성 펩티드인 것을 특징으로 하는 청구항 13에 따른 키트.
- 2, 3 또는 그 이상의 HLA-B*0702-제한 크립틱 에피토프를 포함하는 1차 키메릭 펩티드 및 1차 키메릭 폴리펩티드에 포함된 HLA-B*0702-제한 크립틱 에피토프를 포함하는 2차 키메릭 폴리펩티드를 분리된 제형(formulation)으로 포함하는 키트의 일부분.
- 상기 1차 키메릭 폴리펩티드는 청구항 8에 따른 키메릭 폴리펩티드이며, 상기 2차 펩티드는 청구항 9에 따른 키메릭 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 청구항 15에 따른 키트.
- 백신 키트로서, 상기 1차 및 2차 펩티드 또는 키메릭 폴리펩티드는 분리된 백신 용량인 것을 특징으로 하는 청구항 13 내지 16 중 어느 한 항에 따른 키트.
- 2차 펩티드 또는 키메릭 폴리펩티드의 2 또는 3 용량 및 1차 펩티드 또는 키메릭 폴리펩티드의 3, 4, 5, 6 또는 50까지의 용량을 포함하는 청구항 17에 따른 백신 키트.
- 각각의 용량이 1 내지 5 mg의 펩티드 또는 1 내지 20 mg의 키메릭 폴리펩티드를 포함하는 청구항 12에 따른 백신 또는 청구항 17 또는 청구항 18에 따른 백신 키트.
- 백신 용량이 피하주사용으로 조제된 청구항 12 내지 청구항 19 중 어느 한 항에 따른 백신 또는 청구항 16 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 따른 백신 키트.
- 예방 또는 치료를 위한 면역치료용 조성물의 제조를 위한 청구항 4에 따른 HLA-B*0702-제한 크립틱 에피토프 또는 청구항 5 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 따른 면역원성 에피토프 폴리펩티드 또는 청구항 8 또는 청구항 9에 따른 키메릭 폴리펩티드 또는 청구항 11에 따른 핵산의 용도.
- 항바이러스 또는 항암 면역치료를 위한 청구항 21의 용도.
- 백신의 조제를 위한 청구항 21 또는 청구항 22의 용도.
- 동종의 최적화된 펩티드에 의해 개시되는 CTL 면역 반응을 유지하기 위한 의약 조성물을 제조하기 위한 HLA-B*0702-제한 크립틱 에피토프의 서열을 갖는 펩티드의 용도.
- 동종의 최적화된 키메릭 폴리펩티드 또는 상기 크립틱 에피토프와 동종의 최적화된 펩티드에 의해 개시되는 CTL 면역 반응을 유지하기 위한 의약 조성물의 제 조를 위한 2, 3 또는 그 이상의 HLA-B*0702-제한 크립틱 에피토프를 포함하는 키메릭 폴리펩티드의 용도.
- 상기 HLA-B*0702-제한 크립틱 에피토프에 대한 CTL 면역 반응을 개시하기 위한 의약 조성물 제조를 위한 HLA-B*0702-제한 크립틱 에피토프로부터 유도된 최적화된 HLA-B*0702-제한 에피토프 서열을 갖는 면역원성 펩티드의 용도.
- 상기 HLA-B*0702-제한 크립틱 에피토프에 대한 CTL 면역 반응을 개시하기 위한 의약 조성물 제조를 위한 HLA-B*0702-제한 크립틱 에피토프로부터 유도된 2, 3 또는 그 이상의 최적화된 HLA-B*0702-제한 에피토프를 포함하는 키메릭 폴리펩티드의 용도.
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