KR20090012379A - 스트렙토마이세스 스모카르복시두스 씨 12가 생산하는섭티리신 유사 단백질 분해효소 저해제 및 그의 제조방법 - Google Patents

스트렙토마이세스 스모카르복시두스 씨 12가 생산하는섭티리신 유사 단백질 분해효소 저해제 및 그의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20090012379A
KR20090012379A KR1020070076132A KR20070076132A KR20090012379A KR 20090012379 A KR20090012379 A KR 20090012379A KR 1020070076132 A KR1020070076132 A KR 1020070076132A KR 20070076132 A KR20070076132 A KR 20070076132A KR 20090012379 A KR20090012379 A KR 20090012379A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
protease inhibitor
streptomyces
thermocarboxydus
streptomyces thermocarboxydus
subtilisin
Prior art date
Application number
KR1020070076132A
Other languages
English (en)
Other versions
KR100904632B1 (ko
Inventor
공재열
최영준
강성일
최경림
Original Assignee
경상대학교산학협력단
주식회사바이오라인즈
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 경상대학교산학협력단, 주식회사바이오라인즈 filed Critical 경상대학교산학협력단
Priority to KR1020070076132A priority Critical patent/KR100904632B1/ko
Publication of KR20090012379A publication Critical patent/KR20090012379A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100904632B1 publication Critical patent/KR100904632B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 해양에서 분리한 균주 스트렙토마이세스 스모카르복시두스 C12 (Streptomyces thermocarboxydus C12, KACC 91318P)에 의한 섭티리신(Subtilisin)-유사 단백질 분해효소 저해제 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 이를 더욱 상세하게 설명하면, 스트렙토마이세스 스모카르복시두스 C12 (Streptomyces thermocarboxydus C12 : 수탁번호 KACC 91318P)균주로서, 배양액을 25℃에서 4일 동안 진탕 배양하여 균체 및 포자를 제거하기 위해 여과지로 여과하고, 여과된 여과액은 원심분리하여, 분리한 상층액은 암모늄 설페이트(Ammonium sulfate) 침전시켜, 회수한 침전물은 50 mM Tris-HCl 완충용액 (pH 7.5, 완충용액 A)으로 투석하고, DEAE Sepharose CL-6B anion column (26/30, Pharmacia, Sweden)에 0.1～1.0 M의 NaCl이 첨가된 완충용액 A로 저해물질을 용출시키고, 용출된 용출액은 분획별로 단백질량과 저해활성을 측정하여 활성이 높은 분획을 모아 Ultrafiltration YM-10 membrane (M.w 10 kDa)으로 한외여과하여 농축된 농축액을 0.1 M의 NaCl이 포함된 완충용액 A로 평형화된 Superdex 200 column (16/60, Pharmacia, Sweden)에서 용출시켜, 용출된 용출액은 탈 이온수에 투석한 후, 한외여과(YM-10 membrane)하여 농축하고, 농축액은 분석용 Superdex 75 column(10/30, FPLC)으로 확인하여 섭티리신(Subtilisin)-유사 단백질 분해효소 저해제가 얻어짐을 특징으로 하며, 33.1 kDa의 분자량을 가지며, 세포독성 및 간세포 손상이 없어 상업적 저해제 즉, 단백질 분해효소 저해제를 이용한 조성물은, 건강식품소재, 기능성 식품소재, 기능성 화장 품 소재, 의학적 약품 소재로 이용 가능한 스트렙토마이세스 스모카르복시두스 씨12 (Streptomyces thermocarboxydus C12 : 수탁번호 KACC 91318P)에 의한 단백질 분해효소 저해제 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
방선균, 단백질 분해효소 저해제, Streptomyces thermocarboxydus C12, 건강식품소재, 기능성 식품소재, 기능성 화장품 소재, 의학적 약품 소재

Description

스트렙토마이세스 스모카르복시두스 씨 12가 생산하는 섭티리신 유사 단백질 분해효소 저해제 및 그의 제조방법 {Production and Application of subtilisin-like proteinase inhibitor by Streptomyces thermocarboxydus C12 }
본 발명은 해양에서 신규의 스트렙토마이세스 스모카르복시두스 C12(Streptomyces thermocarboxydus C12 : 수탁번호 KACC 91318P, 농업생명공학연구소, 기탁일자 2007년 6월 1일)가 생산하는 섭티리신(Subtilisin) -유사 단백질 분해효소의 최적 생산 방법과 단백질 분해효소의 응용에 관한 것으로, 단백질 분해효소 저해제를 가장 많이 생산하는 배양조건과 정제 조건을 찾아서 대량 생산을 위한 방법을 확립하고, 특성을 파악하여 일반 식품, 기능성 식품 및 의약품의 원료로 활용하고자 하는 방법에 관한 것이다.
단백질 분해효소 저해물질은 약리학, 식품, 농업에 활용 가능할 뿐 아니라 단백질 구조의 연구와 반응기작에 대해서 연구할 수 있다(Bode and Huber, 1992; Terashita 등, 1980). 특히 특이적이고 선택적인 단백질 분해효소 저해제는 소염작용, 항종양작용, 변이유발저지, 복수저류저지, 발암 및 암 전이 저지, 폐기종, 관절염, 체장염, 혈전증, 고혈압, AIDS 같은 인체 질병발병과정에 관여하는 단백질 분해효소들을 불활성화할 수 있다(Demuth, 1990). 그리고 세포, 조직, 체액 중에서 단백질 분해효소의 식별, 친화성 크로마토그래피의 활성기, 물질 정제시에 일어나는 효소적 분해방지용으로 이용될 수 있다. 한편 단백질 분해효소 저해제는 식품공정상 불필요한 단백질 분해효소의 활성을 억제시킨다(Garcia-Carreno, 1996).
미생물 유래의 단백질 분해효소 저해물질에 관한 연구는 Hoyen과 Skulberg(1962)가 Clostridium botulinum (type A, B 및 E)에서 트립신에 대한 저해물질을 발견한 이래 활발하게 이루어졌다. 곰팡이류의 단백질 분해효소 저해물질 생성균주는 주로 Penicillum cyclopium에 대하여 많이 연구되었으며, 산성 단백질 분해효소에 대한 저해물질로 malic acid가 중합한 고분자의 poly-L-malic acid를 생성한다(Shimada and Matsushima, 1969). Actinomyces에서 트립신, plasmin을 저해하는 leupeptin이 발견되었고(Aoyagi 등, 1969), Streptomyces mauvecolor에서 트립신, 파파인, 카셉신 A와 B를 저해하는 antipain이 발견되었다(Umezawa 등, 1972). Murao 등(1972)은 Streptomyces 속에서 Streptomyces subtilisin 저해제를 분리하였다.
그러나 상술한 단백질 분해효소들은 대부분이 저분자량 저해제로서 주로 효소의 분류에 사용하여 응용의 범위가 한정되어 있고, 소금 농도에 영향을 받는 문제점을 가지고 있다. 본 발명에서 제시한 스트렙토마이세스 스모카르복시두스 C12 (Streptomyces thermocarboxydus C12, KACC 91318P)은 단백질성 단백질 분해 저해물질을 생성하며, 비교적 간단한 정제 과정인 암모늄 설페이트(ammonium sulfate) 침전에 의해 22.5배까지 정제도가 증가하여 저비용으로 부분 정제할 수 있을 뿐 아니라 해양에서 분리하였기 때문에 식품에 첨가하는 정도의 소금 농도에서도 저해율이 감소하지 않으며, 세포독성과 간독성이 검출되지 않아 식품을 포함하여 포괄적인 응용이 가능하다.
이에 본 발명은 생산과 정제가 쉽고, 포괄적인 응용 범위를 가진 단백질 분해효소 저해물질을 분리함으로서 기능성 제품의 소재로 활용하기 위해 본 발명을 완성하기에 이르렀으며, 본 발명의 목적은 1) 해양미생물에서 유래하는 강력한 단백질 분해효소 저해제 물질의 생산, 2) 열안정성과 NaCl에 대하여 내성이 있는 단백질 분해효소 저해물질의 생산, 3) 간편하고 단순한 정제 방법 적용을 통한 저렴한 저해물질의 생산, 4) 일반식품, 기능성 식품 및 의약품 활용을 위한 소재를 제공하는 데 있다.
본원 발명인 스트렙토마이세스 스모카르복시두스 C12 (Streptomyces thermocarboxydus C12, KACC 91318P)가 생산하는 섭티리신(Subtilisin)-유사 단백질 분해효소 저해제 및 그의 제조방법에 따르면, 스트렙토마이세스 스모카르복시두스 C12 (Streptomyces thermocarboxydus C12, KACC 91318P)에서 단리한 섭티리신(Subtilisin)-유사 단백질 분해효소 저해제 단백질 분해효소에 대하여 강력한 저해효과를 가질 뿐 아니라, 간편법에 의한 정제방법으로도 순도가 높은 부분 정제물을 얻을 수 있어서 정제 단가를 획기적으로 낮출 수 있기 때문에 산업적인 응용의 범위를 확대할 수 있다. 그리고 세포에 대한 안전성이 확인됨에 따라 다양한 기능성 식품, 기능성 화장품 및 의약품의 소재로 활용 가능하다.
본원 발명은 해양에서 신규의 스트렙토마이세스 스모카르복시두스 C12 (Streptomyces thermocarboxydus C12 : 수탁번호 KACC 91318P, 농업생명공학연구소, 기탁일자 2007년 6월 1일)가 생산하는 섭티리신(Subtilisin)-유사 단백질 분해효소의 최적 생산 방법과 단백질 분해효소의 응용에 관한 것으로, 생산과 정제가 쉽고, 포괄적인 응용 범위를 가진 단백질 분해효소 저해물질을 분리함으로서 기능성 제품의 소재로 활용하기 위해 본 발명을 완성하기에 이르렀으며,
이하 실시 예를 통하여 본 발명의 실시를 위한 구체적인 내용을 설명하고자 한다. 각각의 실시 예는 반복 실시하여 그 결과의 재현성을 확인하였다.
[실시 예 1 ] Streptomyces thermocarboxydus C12의 분리 정제 방법
본 발명에 사용되는 시약으로, 효소들은 Subtilisin (Fluka, Switzerland), Trypsin, α-chymotrypsin, Amino peptidase, Collagenase (Sigma, USA)와 Proteinase K (Promega, USA)를 사용하였고, 기질로서 사용된 gelatine은 (Yakuri, JAPAN)를 사용하였다. 효소반응에 사용된 발색시약은 ninhydirn (Lancaster, England)을 사용하였다. 그 외 사용된 모든 시약은 특급 혹은 분석용 시약을 사용하였다.
균주의 분리 및 배양을 위한 배지조성으로는 증류수 1L당 NaCl 23.0 g, KCl 0.7 g, MgCl26H2O 10.6 g, CaCl2 1.1 g, NaSO4 3.9 g, NaHCO3 0.2 g, (NH4)2SO4 1.0 g, K2HPO4 0.01 g, Tris-HCl 6.05 g, pH 7.8의 인공해수에 첨가된 Bennet's 배지(Glucose 10 g, Peptone 1 g, Yeast extract 1 g, Beef extract 1 g, pH 7.5)를 기본배지로 사용하였다. 평판배지에서 얻어진 각종 분리균주를 액체배지 20 ml를 함유한 전배양에 접종하여 25℃, 3일 동안 shaking incubator하였다. 그 후 본배양 액체배지 50 ml를 전배양액 1% (v/v)를 접종하여 25℃, shaking incubator 에서 180 rpm으로 4일 동안 진탕배양하였다.
남해 해안으로부터 뻘 또는 해수에서 탐색된 해양 미생물을 단백질 분해효소 저해제 분리시료로 방선균 및 해양미생물 선택배지를 이용하여 27℃, 4～6주 동안 정치배양 시켜 방선균을 분리한 후, Bennet's 배지에서 단백질 분해효소 저해제의 우수 한 균주를 1차 선별하였다(도 1). 1차 선별된 균주를 액체배양하여 paper disk를 이용하여 serine 계열인 proteinase K 와 subtilisin에 대해 inhibitor 활성이 가장 높게 나타난 strain C12를 최종적으로 선별하였다(도 2). 최종선별된 strain C12는 운동성이 없고, 그람양성에 포자를 형성하고 있었다. 도 3과 같이 전자현미경으로 관찰한 결과 긴 원통모양의 형태를 보였으며, 표면은 smooth type이다.
또한, 일반적으로 해양세균은 2~3%의 염에서 성장하는 것으로 알려져 있지만, 균주 C12의 경우 NaCl 9%의 고농도, 50℃까지 성장 가능한 것으로 확인되었다.
따라서, Streptomyces thermocarboxydus로 확인되었으며, 이 균주를 C12로 명명하였고, 이 균주를 스트렙토마이세스 스모카르복시두스 C12 (Streptomyces thermocarboxydus C12 : 수탁번호 KACC 91318P, 농업생명공학연구소, 기탁일자 2007년 6월 1일)로 명명하였으며, 균주 C12는 전자현미경에 의해 관찰한 결과, 긴 원주모양의 간균형태이고, 포자의 색은 배지조건에 따라 흰색에서 회색의 빛깔을 가졌고, 운동성이 없으며, 그람 양성 포자를 형성하고 표면은 smooth type의 그람양성인 방선균이며, 기질 균사체의 분열 경우 전자현미경에서 음성으로 나타났으며, 카타라제(Catalase) 양성반응, 전분, 젤라틴 및 카제인에 대하여 분해를 확인하였다. 이 균주 C12균주의 형태 및 생리적 특성을 표 1, 2에 요약하였다.
Figure 112007055217416-PAT00001
Figure 112007055217416-PAT00002
[실시 예 2] 섭티리신(Subtilisin)-유사 단백질 분해효소 저해제 생산을 위한 최적 배양 조건
섭티리신(Subtilisin)-유사 단백질 분해효소 저해제의 생산량 및 저활성을 증가시키는 최적의 배양 조건은 온도 40, 배양초기 pH 8.0, 1.6% 갈락토스(galactose), 0.5% 프로테오스 펩톤(proteose peptone), 1% NaCl, 1 mM LiCl 이었으며, 60 시간 배양 후 최대활성을 나타내었다.
[실시 예 3] 섭티리신(Subtilisin)-유사 단백질 분해효소 저해제의 분리, 정제
스트렙토마이세스 스모카르복시두스 C12 (Streptomyces thermocarboxydus C12 : 수탁번호 KACC 91318P, 농업생명공학연구소, 기탁일자 2007년 6월 1일) 균주에서 생산되는 저해물질을 정제단계는 다음과 같이 행하였으며, 전체 모식도는 도 4.에 나타내었다.
우선, 배양액을 25℃에서 4일 동안 진탕 배양하여 균체 및 포자를 제거하기 위해 Whatman No 1. 여과지로 여과하였으며, 여과액은 16,000 rpm, 20 분 동안 원심분리하여 분리한 상층액은 암모늄 설페이트(Ammonium sulfate) (0.1～40%) 범위까지 침전시켜 16,000 rpm, 20 분간 원심분리하여 침전물을 회수하였다. 회수한 침전물은 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5)(buffer A)로 투석율을 높이기 위해 3회 반복해서 24 시간 동안 투석하였다. 투석액은 0.20 ㎛로 여과한 후, DEAE Sepharose CL-6B anion column (26/30, Pharmacia, Sweden)에 NaCl (0.1～1.0 M)이 첨가된 buffer A로 step gradient를 주어 저해물질을 용출시켰다. 용출액은 fraction별로 단백질량과 저해활성을 측정하였다. 그 중, 활성이 높은 분획을 모아 Ultrafiltration YM-10 membrane (M.w 10 kDa)으로 한외여과하여 농축하였다. 농축액은 0.1 M NaCl이 포함된 buffer A로 평형화된 Superdex 200 column (16/60, Pharmacia, Sweden)에사 같은 완충액으로 용출시켰다. 용출액은 탈 이온수에 투석한 후, 한외여과(YM-10 membrane)하여 농축하였다. 농축액은 분석용 Superdex 75 column (10/30, FPLC)으로 확인하여 섭티리신(Subtilisin)-유사 단백질 분해효소 저해제를 얻었다. 정제된 저해물질은 -20℃에서 보관하였다. 효소활성 1 unit는 37℃에서 1 분당 유리되는 1 ㎛ol의 아미노산 수로 나타내었으며, 표준적정곡선으로 leucine을 사용하였다. 효소 저해활성 1 unit는 효소활성 1 unit를 감소시키는 것으로 정의하였다.
상기의 분리정제 과정에서, 정제단계는 암모늄 설페이트(Ammonium sulfate) 포화침전, DEAE Sepharose CL-6B, Superdex 200 칼럼 크로마토그래피로 정제한 최종 제품의 비활성은 35,620.6 U/mg-protein, 수율은 20.7%, 정제도는 119.9배로 정제하였다. 정제 후, SDS-PAGE에서 33,1 kDa mono subunit로 확인되었다.
그리고, 암모늄 설페이트(Ammonium sulfate) 침전에 의해 22.5배 정제되었으며, 수율은 72.0%였고, 70℃에서 30분 동안 열처리 후, 60%의 잔존 저해활성을 보였고, pH 6~10의 범위에서 80% 이상의 저해활성이 유지되었다.
상기와 같이, 특히 저해물질은 0.1~40% 암모늄 설페이트(ammonium sulfate) 포화 침전에서 22.5배 정제되어 제조 단가가 싸기 때문에 산업용 효소로 활용 가치가 매우 높다. 정제 단계에 따른 비활성, 수율 및 정제도를 하기의 표 3에 정리하였다.
[실시 예 4] Streptomyces thermocarboxydus C12의 식품에 응용
Streptomyces thermocarboxydus C12에서 생산된 섭티리신(Subtilisin)-유사 단백질 분해효소 저해제의 아미노산 조성분석의 경우, Pro, Gly, Asp의 함량이 높았으며, Met, Ile, His, Lys의 함량이 낮은 것으로 조사되었으며, 섭티리신(Subtilisin)-유사 단백질 분해효소 저해제를 식품에 적용 가능한지 조사하기 위해 저해제로 사용되는 돼지 혈청 단백질(pork plasma protein)과 난백단백질(egg white)을 상대비교한 결과, 단백질 농도 0.54 mg/mL와 6 ug/mL의 농도에서 subtilisin은 100% 저해하였으며, Proteinase K는 각각 100%와 35% 저해하였다. 이 결과는 돼지 혈청 단백질과 난백 단백질 P-39에 비하여 각각 1,648.3배와 571.6배까지 저해효과가 우수하므로 식품 저해제로써 사용가능할 것으로 판단된다. 이와 같은 저해활성의 결과를 표 4에 정리하였다.
Figure 112007055217416-PAT00004
[실시 예 5] 안전성 시험
섭티리신(Subtilisin)-유사 단백질 분해효소 저해제의 안전성을 시험하기 위하여, 먼저, 세포 독성을 평가하는 MTT 분석 결과는 건조 분말 200 mg까지는 세포 독성을 보이지 않았으며(도 1), 간세포 손상을 측정하는 THA 분석결과는, 약 50% 수준까지 간세포를 손상시킨 후, silimarine을 표준군으로 간세포에 대한 독성을 측정한 결과 200 ug/mL의 농도까지 간세포에 대하여 독성을 보이지 않았다(도 2).
따라서, 상기의 섭티리신(Subtilisin)-유사 단백질 분해효소 저해제는 식품 저해제로써 사용가능할 것으로 판단된다.
상기의 실시예에 의한 본 발명은 강력한 단백질 분해효소를 생성하는 새로운 균주를 발견하였으며, 단백질 분해효소 저해물질의 대량생산을 위한 최적 조건을 제시하고, 정제 공정을 제시하였다. 저해물질의 특성을 구명하고, 안전성을 검토하여 응용의 범위를 확대하였다. 얻어진 저해물질은 식품, 화장품 및 의약품의 원료 및 소재로 활용하기 위해 고정화, 분말, 과립의 형태로 가공할 수 있는 장점을 가지고 있다.
본 발명에 따른 단백질 분해효소 저해제는 식품공정상에서 불필요한 단백분해효소의 활성 억제 및 저해를 통해 여러 식품(예, 연제품 등)의 물성을 개선할 수 있을 뿐 아니라 소염작용, 항종양작용, 변이유발저지, 복수저류저지, 발암 및 암 전이 저지, 폐기종, 관절염, 췌장염, 혈전증, 고혈압의 질병발병과정에 관여하는 단백질 분해효소의 불활성화를 통해 기능성 식품, 기능성 화장품, 의약품의 원료로도 적용 가능하다.
도 1은 해양 방사선균에 의한 효소저해물질의 플래이트 분석
도 2는 Streptomyces thermocarboxydus C12에 의한 세린 프로테아제 저해의 플래이트 분석
도 3은 Streptomyces thermocarboxydus C12의 전자현미경 사진
도 4는 Streptomyces thermocarboxydus C12 균주에서 생산되는 저해물질의 정제 흐름도
도 5는 Streptomyces thermocarboxydus C12 균주에서 생산되는 단백질 분해효소 저해제의 MTT 분석에 의한 세포독성 결과도
도 6은 Streptomyces thermocarboxydus C12 균주에서 생산되는 단백질 분해효소 저해제의 간 세포에 대한 독성 실험의 결과도

Claims (8)

  1. 해양에서 분리한 섭티리신(Subtilisin) -유사 단백질 분해효소 저해제 생산균주로서 스트렙토마이세스 스모카르복시두스 C12 (Streptomyces thermocarboxydus C12 : 수탁번호 KACC 91318P).
  2. 스트렙토마이세스 스모카르복시두스 C12 (Streptomyces thermocarboxydus C12 : 수탁번호 KACC 91318P) 균주에서 생산되는 저해물질의 정제단계에 있어서,배양액을 25℃에서 4일 동안 진탕 배양하여 균체 및 포자를 제거하기 위해 여과지로 여과하는 제1과정과:,
    상기의 여과된 여과액은 16,000 rpm, 20 분 동안 원심분리하여, 분리한 상층액은 암모늄 설페이트(Ammonium sulfate) 침전시켜, 16,000 rpm, 20 분간 원심분리하여 침전물을 회수하는 제 2과정과:,
    제 2과정 후, 회수한 침전물은 50 mM Tris-HCl 완충용액 (pH 7.5, 완충용액 A)로 투석율을 높이기 위해 3회 반복해서 24 시간 동안 투석하고, 투석액은 0.20 ㎛로 여과한 후, DEAE Sepharose CL-6B anion column (26/30, Pharmacia, Sweden)에 0.1～1.0 M의 NaCl이 첨가된 완충용액 A로 저해물질을 용출시키는 제 3과정과:,
    제 3과정 후, 용출된 용출액은 분획별로 단백질량과 저해활성을 측정하여 활성이 높은 분획을 모아 Ultrafiltration YM-10 membrane (M.w 10 kDa)으로 한외여과하여 농축하는 제 4과정과:,
    제 4과정에서 농축된 농축액을 0.1 M의 NaCl이 포함된 완충용액 A로 평형화된 Superdex 200 column (16/60, Pharmacia, Sweden)에서 용출시키는 제 5과정과:,
    제 5과정에서 용출된 용출액은 탈 이온수에 투석한 후, 한외여과(YM-10 membrane)하여 농축하고, 농축액은 분석용 Superdex 75 column(10/30, FPLC)으로 확인하여 섭티리신(Subtilisin)-유사 단백질 분해효소 저해제가 얻어짐을 특징으로 하는 스트렙토마이세스 스모카르복시두스 씨12 (Streptomyces thermocarboxydus C12 : 수탁번호 KACC 91318P)에 의한 단백질 분해효소 저해제 제조방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 제 2과정의 침전물을 회수하는 과정에서, 0.1~40% 암모늄 설페이트(ammonium sulfate) 포화 침전에서에 의해 정제되며, pH 6~10 에서 저해활성을 가지게 됨을 특징으로 하는 스트렙토마이세스 스모카르복시두스 씨12 (Streptomyces thermocarboxydus C12 : 수탁번호 KACC 91318P)에 의한 단백질 분해효소 저해제 제조방법.
  4. 제 2항의 방법에 의하여 분리 정제된 단백질 분해효소 저해제로서 33.1 kDa의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 스트렙토마이세스 스모카르복시두스 씨12 (Streptomyces thermocarboxydus C12 : 수탁번호 KACC 91318P)에 의한 단백질 분해효소 저해제.
  5. 제 4항에 있어서, 단백질 분해효소 저해제를 이용한 조성물은, 건강식품소재 로 이용 가능한 것을 특징으로 하는 스트렙토마이세스 스모카르복시두스 씨12 (Streptomyces thermocarboxydus C12)에 의한 단백질 분해효소 저해제.
  6. 제 4항에 있어서, 단백질 분해효소 저해제를 이용한 조성물은, 기능성 식품소재로 이용 가능한 것을 특징으로 하는 스트렙토마이세스 스모카르복시두스 씨12 (Streptomyces thermocarboxydus C12)에 의한 단백질 분해효소 저해제.
  7. 제 4항에 있어서, 단백질 분해효소 저해제를 이용한 조성물은, 기능성 화장품 소재로 이용 가능한 것을 특징으로 하는 스트렙토마이세스 스모카르복시두스 씨12 (Streptomyces thermocarboxydus C12)에 의한 단백질 분해효소 저해제.
  8. 제 4항에 있어서, 단백질 분해효소 저해제를 이용한 조성물은, 의학적 약품 소재로 이용 가능한 것을 특징으로 하는 스트렙토마이세스 스모카르복시두스 씨12 (Streptomyces thermocarboxydus C12)에 의한 단백질 분해효소 저해제.
KR1020070076132A 2007-07-30 2007-07-30 스트렙토마이세스 스모카르복시두스 씨 12가 생산하는섭티리신 유사 단백질 분해효소 저해제 및 그의 제조방법 KR100904632B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020070076132A KR100904632B1 (ko) 2007-07-30 2007-07-30 스트렙토마이세스 스모카르복시두스 씨 12가 생산하는섭티리신 유사 단백질 분해효소 저해제 및 그의 제조방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020070076132A KR100904632B1 (ko) 2007-07-30 2007-07-30 스트렙토마이세스 스모카르복시두스 씨 12가 생산하는섭티리신 유사 단백질 분해효소 저해제 및 그의 제조방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20090012379A true KR20090012379A (ko) 2009-02-04
KR100904632B1 KR100904632B1 (ko) 2009-06-29

Family

ID=40683149

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020070076132A KR100904632B1 (ko) 2007-07-30 2007-07-30 스트렙토마이세스 스모카르복시두스 씨 12가 생산하는섭티리신 유사 단백질 분해효소 저해제 및 그의 제조방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100904632B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103484396A (zh) * 2013-08-15 2014-01-01 北京农学院 一种嗜热一氧化碳链霉菌新菌株及其应用

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103484396A (zh) * 2013-08-15 2014-01-01 北京农学院 一种嗜热一氧化碳链霉菌新菌株及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
KR100904632B1 (ko) 2009-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
El-Bessoumy et al. Production, isolation, and purification of L-asparaginase from Pseudomonas aeruginosa 50071 using solid-state fermentation
Sharma et al. Production, purification and crystallization of an alkaline protease from Aspergillus tamarii [EF661565. 1]
Aly et al. Production of the antitumor L-glutaminase enzyme from thermotolerant Streptomyces sp. D214, under submerged fermentation conditions.
JP5392942B2 (ja) 新規なアルカリアルギン酸リアーゼとその利用
JPH05219942A (ja) 細菌クロストリジウム・ヒストリチカムの変異株、その製造法及びその用途
US5192677A (en) Alkali and heat stable protease from thermomonospora fusca
JP2957246B2 (ja) 微生物起源カルボキシペプチダーゼｂ様酵素
Velmurugan et al. A novel low temperature chitinase from the marine fungus Plectosphaerella sp. strain MF-1
KR100904632B1 (ko) 스트렙토마이세스 스모카르복시두스 씨 12가 생산하는섭티리신 유사 단백질 분해효소 저해제 및 그의 제조방법
Fıtrıanı et al. Isolation, screening, partial purification and characterization of protease from halophilic bacteria isolated from Indonesian fermented food
EP1535999B1 (en) Milk-coagulating enzyme originating in bacterium and process for producing cheese using the same
Mahesh et al. Optimization for the production of extracellular alkaline phosphatase from Proteus mirabilis
Fernandez et al. Screening and characterization of protease producing marine actinobacteria Streptomyces pactum RA71 isolated from Pulicat Lake, Chennai, Tamil Nadu, India
KR101123966B1 (ko) 스트렙토마이세스 그리세우스 변이주 및 이를 이용한 트립신 함량이 높은 프로네이즈 생산방법
KR0180103B1 (ko) 바실러스 서브틸리스 속 균주 유래의 혈전용해효소
Femi-Ola et al. Production and Characterization of Protease from Serratia marcescens
RU2584601C1 (ru) Способ выделения протеолитического фермента террилитина
SU1622397A1 (ru) Способ получени бактериального лектина, специфичного к сиаловым кислотам
KR19990011607A (ko) 고활성 단백질 분해효소 생산을 위한 아스퍼질러스 오리재 변이주의 제조방법
RU2077577C1 (ru) Штамм бактерии delcya marina - продуцент щелочной фосфатазы и способ получения щелочной фосфатазы
JP2000279126A (ja) 蛋白質加水分解物の製造方法
Abd EI-Aziz et al. Optimization of microbial elastase production
M I Optimization of fibrinase productivity from Actinomycetes
KR20110106748A (ko) 슈도모나스 플루오레센스 제이케이-412 균주가 생산하는 신규의 폴리시알산 분해 효소, 이의 제조 방법 및 이용
JPS6156997B2 (ko)

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
N231 Notification of change of applicant
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20120612

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130417

Year of fee payment: 5

LAPS Lapse due to unpaid annual fee