KR20090007609A - Anti-viral agents that activate rnase l - Google Patents
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Abstract
Description
RNase L 즉, 인터페론 (IFN) 시스템에서 항바이러스 효소에 대한 임상전 연구는 이러한 효소가 암 치료제 및 항바이러스 제에 대한 중요한 표적임을 시사하였다 (Adah SA, Bayly SF, Cramer H, Silverman RH, Torrence PF. (Curr Med Chem. 2001 Aug;8(10):1189-212). 예를 들어, 유전성 전립선 암 1 (HPC1) 민감성 로커스가 RNase L에 대해 최근 맵핑되었다 (Carpten J, Nupponen N, Isaacs S, Sood R, Robbins C, Xu J, Faruque M, Moses T, Ewing C, Gillanders E, Hu P, Bujnovszky P, Makalwska I, Baffoe-Bonni A, Faith D, Smith J, Stepah D, Wiley K, Brownstein M, Gildea D, Kelly B, Jenkins R, Hostetter G, Matikainen M, Schleutker J, Klinger K, Conners T, Xiang Y, Wang Z, Demarzo A, Papdopoulos N, Kallioniemi O-P, Burk R, Meyers D, Gronberg H, Meltzer P, Silverman R, Bailey-Wilson J, Walsh P, Isaacs W, Trent J. Nature Genetics 2002, Jan 22). 또한, 웨스트 나일 바이러스를 포함하는 플라비바이러스에 대한 저항성을 부여하는 유전자는 RNase L 경로의 유전자에 대해 맵핑되었다 (OASlb) (Perelygin AA, Scherbik SV, Zhulin IB, Stockman BM, Li Y, Brinton MA. Proc 25 Natl Acad Sci USA. 2002 Jul 9;99(14):9322-7). 사실상, RNase L은 2',5'-뉴클레오티드간 결합 으로의 작은 비정상적인 올리고아데닐화물 ("2-5 A"로서 공지됨)에 의해 인터페론 항바이러스 반응 동안 활성화된다 (Kerr IM, Brown RE Proc Nall Acad Sci USA. 1978 Jan;75(l):256-60; Zhou A, Hassel BA, Silverman RH. Cell. 1993 Mar 12;72(5);753-65). 또한, RNase L이 IFN의 항-세포 증식 활성에 관여하는 것으로 이미 입증되었다 (Hassel BA, Zhou A, Sotomayor C, Maran A, Silverman RH. EMBO J. 1993 Aug; 12(8):3297-304). 2-5A는 RNase L을 통해 리보좀 RNA (rRNA) 및 메신저 RNA (mRNA)의 분해를 유도하여, 단백질 합성 수준을 저하시키고, 이러한 성향은 대동맥평활근 세포에 적용되는 경우, 혈관 성형술 후 재발협착증을 예방할 수 있다. 그러나, 2-5A는 1) 포스포디에스테라아제 및 포스파타아제의 작용으로 인해 혈청 및 세포에서 불안정하며; 2) 세포 막을 통과하지 않는 세포내 매개체라는 점에 있어서 치료제로서 바람직하지 않은 특정을 갖는다. 따라서, 임상용의 RNase L의 새로운 활성화제가 요구된다.Preclinical studies of antiviral enzymes in RNase L, the interferon (IFN) system, suggest that these enzymes are important targets for cancer and antiviral agents (Adah SA, Bayly SF, Cramer H, Silverman RH, Torrence PF. (Curr Med Chem. 2001 Aug; 8 (10): 1189-212) For example, hereditary prostate cancer 1 (HPC1) sensitive locus has recently been mapped to RNase L (Carpten J, Nupponen N, Isaacs S, Sood). R, Robbins C, Xu J, Faruque M, Moses T, Ewing C, Gillanders E, Hu P, Bujnovszky P, Makalwska I, Baffoe-Bonni A, Faith D, Smith J, Stepah D, Wiley K, Brownstein M, Gildea D, Kelly B, Jenkins R, Hostetter G, Matikainen M, Schleutker J, Klinger K, Conners T, Xiang Y, Wang Z, Demarzo A, Papdopoulos N, Kallioniemi OP, Burk R, Meyers D, Gronberg H, Meltzer P, Silverman R, Bailey-Wilson J, Walsh P, Isaacs W, Trent J. Nature Genetics 2002, Jan 22). in addition, resistance to flaviviruses including West Nile virus Gene which imparts was mapped to a gene in the RNase L paths (OASlb) (Perelygin AA, Scherbik SV, Zhulin IB, Stockman BM, Li Y, Brinton MA Proc 25 Natl Acad Sci USA 2002 Jul 9;.. 99 (14) In fact, RNase L is activated during the interferon antiviral response by small abnormal oligoadenylides (known as “2-5 A”) to 2 ′, 5′-nucleotide linkages (Kerr IM, Brown RE Proc Nall Acad Sci USA. 1978 Jan; 75 (l): 256-60; Zhou A, Hassel BA, Silverman RH. Cell. 1993 Mar 12; 72 (5); 753-65). In addition, RNase L has already been demonstrated to be involved in the anti-cell proliferative activity of IFN (Hassel BA, Zhou A, Sotomayor C, Maran A, Silverman RH. EMBO J. 1993 Aug; 12 (8): 3297-304) . 2-5A induces degradation of ribosomal RNA (rRNA) and messenger RNA (mRNA) via RNase L, which lowers the level of protein synthesis and, when applied to aortic smooth muscle cells, prevents restenosis after angioplasty. Can be. However, 2-5A is 1) unstable in serum and cells due to the action of phosphodiesterase and phosphatase; 2) It has certain undesirable characteristics as a therapeutic agent in that it is an intracellular mediator that does not cross cell membranes. Thus, there is a need for new activators of RNase L for clinical use.
발명의 요약Summary of the Invention
본 발명은 RNase L을 활성화시키는 많은 화합물의 발견에 기초한다 (실시예 3 참조) (이후, "밝혀진 RNase L 활성화제"). 이러한 RNase L 활성화제는 파라인플루엔자 바이러스 3 (Parainfluenza Virus 3; HPIV3), 피코르나바이러스 (Picornavirus) 및 엔세팔로마이오카르디티스 바이러스 (Encephalomyocarditis Virus ;EMCV)에 대한 항바이러스 활성을 포함하는 항바이러스 활성 (실시예 6 참조)을 갖는다. 밝혀진 RNase L 활성화제는 또한, 실험관내에서 연근 세포 증식을 억제하며 (실시예 7 참조), 따라서, 재발협착층 치료에 유용하다. 또한, 밝혀진 RNase L 활성화제는 놀랍게도 세포독성을 띠지 않는 것으로 밝혀졌다 (실시예 5). 이들 발견에 기초하여, 신규한 RNase L 활성화제, 이러한 RNase L 활성화제를 포함하는 약제 조성물 및 이들 RNase L 활성화제로의 치료 방법이 기술되어 있다.The present invention is based on the discovery of many compounds that activate RNase L (see Example 3) (hereinafter, “lightened RNase L activators”). These RNase L activators have antiviral activity, including antiviral activity against Paraflufluenza Virus 3 (HPIV3), Picornavirus and Encephalomaiocarditis Virus (EMCV). (See Example 6). The found RNase L activators also inhibit lotus root cell proliferation in vitro (see Example 7) and are therefore useful for treating the restenosis layer. In addition, the RNase L activators found were surprisingly found not to be cytotoxic (Example 5). Based on these findings, novel RNase L activators, pharmaceutical compositions comprising such RNase L activators, and methods of treatment with these RNase L activators are described.
밝혀진 RNase 활성화제, 이를 포함하는 약제 조성물 및 이를 이용한 치료 방법이 청구범위에 특정하게 기술되어 있다.The identified RNase activators, pharmaceutical compositions comprising them and methods of treatment using the same are specifically described in the claims.
도면의 간단한 설명Brief description of the drawings
도 1A-1F는 2-5A 또는 소분자 활성화제에 대한 RNase L 활성화의 용량-반응 및 반응속도 대 ~ M 농도 (도 1A-1C) 또는 시간 (분) (도 1D-1E)을 나타내는 그래프이다. 검정은 RNase L FRET 방법에 의한 것이며, 22℃에서 수행하였다. (A, D) ppp(A2'p5'A)2; (B, E) 화합물 1; 및 (C, F) 화합물 2.1A-1F are graphs showing dose-response and kinetics of RNase L activation versus ˜M concentration (FIGS. 1A-1C) or time (minutes) (FIGS. 1D-1E) for 2-5A or small molecule activators. The assay was by the RNase L FRET method and was performed at 22 ° C. (A, D) ppp (A2'p5'A) 2 ; (B, E)
도 2는 RNase L의 소분자 활성화제의 구조 (화합물 1-12) 및 RNA FRET 프로브에서 50% 분해에 요구되는 농도인 EC50을 나타낸다.Figure 2 shows the structure of the small molecule activator of RNase L (Compounds 1-12) and EC 50 , the concentration required for 50% degradation in RNA FRET probes.
도 3은 (A, B) 대안적인 리보누클레아제 검정 및 (C) 2-5A, 화합물 1 (C-1) 및 화합물 2 (C-2)에 대한 RNase L 이량체화 검정을 나타낸다. (A) 22℃에서 30분 동안 RNA 기질 GGACUUUUUUUCCCUUUUUUUCC[32P]pCp의 존재하에 25nM RNase L의 존재 또는 부재하에 25nM 트리머 2-5A (레인 1, 2), 25 ~M C-1 (레인 3, 4), 25 ~M C-2 (레인 5, 6). (B) 25nM 트리머 2-5A (레인 2, 3), 25 ~M C-1 (레인 4, 5), 25 ~M C-2 (레인 6, 7)을 22℃에서 30분 동안 25nM RNase L 및 RNA, C7U2C12-[32P]pCp의 존 재 또는 부재하에 인큐베이션하였다. 절단된 RNA를 20% 아크릴아미드/7M 우레아/TBE 시퀀싱 겔에서 분리하였다. (C) 디메틸 수베르이미데이트 (DMS)에 의한 RNase L의 공유 가교. DMS를 RNase L 및 트리머 2-5A (레인 2 내지 5), C-1 (레인 6 내지 9), 또는 C-2 (레인 10 내지 13)과 인큐베이션하였다. SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 후, 단백질을 니트로셀룰로오스로 전달시키고, RNase L에 대한 모노클로날 항체로 프로빙하였다.Figure 3 shows (A, B) alternative ribonuclease assays and RNase L dimerization assays for (C) 2-5A, Compound 1 (C-1) and Compound 2 (C-2). (A) 25 nM Trimmer 2-5A (
도 4A 및 4B는 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 바와 같이 화합물 1 및 2에 의한 RNase L과의 2-4A-바이오틴 결합의 치환을 나타내는 그래프이다. 바이오티닐화된 2-5A를 스트렙타비딘 바이오센서 칩 (Biacore)에서 부동화시켰다. 다양한 농도의 화합물 1 (A) 또는 화합물 2 (B)의 존재하에 RNase L (10nM)을 5분 동안 20㎕/분의 속도로 칩 위로 흐르게 하였다. 센소그램을 기록하고, 비아-이벨루에이션 (Bia-evaluationTM) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 각각의 경우의 Rmax를 증가되는 화합물 농도 ~M에 대하여 플롯팅하였다.4A and 4B are graphs showing the substitution of 2-4A-biotin bonds with RNase L by
도 5A-5C는 MTS 전환 검정에서 DU125 세포에 대한 화합물 1 및 2의 세포독성을 나타내는 그래프이다. 세포독성은 1일 (도 5A), 2일 (도 5B) 및 3일 (도 5C)에서 490나노미터에서의 흡광도 대 농도 ~M에 의해 측정하였다. 화합물 1의 결과는 청색으로 나타내었으며; 화합물 2에 대한 결과는 적색으로 나타내었다.5A-5C are graphs showing the cytotoxicity of
도 6A-6B는 MTS 전환 검정에서 Hela M 세포에 대한 화합물 1 및 2의 세포독성을 나타내는 그래프이다. 세포독성은 1일에 490나노미터에서의 흡광도 대 농도 ~M에 의해 측정하였다. 화합물 1에 대한 결과는 청색으로 나타내고; 화합물 2에 대한 결과는 적색으로 나타내었다. 도 6A는 RNase L을 발현하는 Hela M 세포에 대한 결과를 나타내며; 도 6B는 RNase L의 누클레아제-치사 변이체를 발현하는 Hela M 세포에 대한 결과를 나타낸다.6A-6B are graphs showing the cytotoxicity of
도 7은 화합물 2가 HPIV3/GFP의 복제를 억제한다는 것을 보여주는 도립 형광 현미경하의 사진을 나타낸다. RNase L이 결여된 Hela M 세포를 야생형 RNase L을 발현하거나 뉴클레아제-치사 변이체 (R667A) RNase L을 발현하는 공벡터 대조군 세포로서 사용하였다. 사진은 도립 형광 현미경을 이용하여 캡쳐링하였다.7 shows a photograph under an inverted fluorescence microscope showing that
도 8은 플라그 수 x 10-7으로 측정된 바와 같은, 엔세팔로마이오카르디티스 바이러스 (EMCV)에 대한 다양한 농도 ~M의 화합물 2의 항바이러스 효과를 나타내는 막대 그래프이다.FIG. 8 is a bar graph showing the antiviral effect of
도 9는 0, 25 및 50μM의 화합물 2와 성장한 MEF RL+/+ 세포의 성장을 나타내는 막대 그래프를 포함한다. 막대 그래프는 대조군과 비교하여 수득된 바이러스 플라그의 백분율을 나타낸다 (0μM 화합물 2, 100% = 2.5 x 104 PFU/mL). 화합물 2의 농도가 증가하면 플라그 검정에 의해 측정된 바와 같이 바이러스 수량이 저하되었다. 각각의 화합물 2 농도 바로 아래에 중간 적색으로 염색된 상응하는 아가 플레이트가 위치한다. 또한, 플레이트는, 플라그 검정에 의해 측정되는 바와 같이 바이러스 수량이 저하되면 화합물 2 농도가 증가함을 나타낸다.9 includes bar graphs showing the growth of MEF RL + / + cells grown with 0, 25, and 50 μΜ of
도 10은 화합물 2의 부재 또는 존재하에 성장한 MEF RL+/+, BSC 40 및 MEF RL-/- 세포에 대해 수득된 바이러스 플라그의 백분율을 나타내는 막대 그래프이다. 화합물 2는 MEF RL+/+ 및 BSC 40 세포에 대한 바이러스 역가를 억제하였다. RNase L 유전자가 결여된 세포는 화합물 2에 대해 내성을 갖는다. (PFU/mL의 비처리된 대조군 (0μM 화합물 2 첨가됨)은 100%로 계수됨: MEF RL+/+: 2.5 x 104; BSC 40: 2.5 x 104; 및 MEF RL-/-: 3.5 x 104).10 is a bar graph showing the percentage of virus plaques obtained for MEF RL + / + ,
도 11은 중간 적색으로 염색된 아가 플레이트에서 처리된 (50μM 화합물 2) 및 비처리된 (0μM 화합물 2 첨가됨) MEF RF+/+ 세포의 사진이다. 화합물 2의 존재는 바이러스 플라그 수를 저하시켰다.FIG. 11 is a photograph of MEF RF + / + cells treated (50 μM Compound 2) and untreated (0
도 12: MEF RL+/+ 및 MEF RL-/- 세포에 대한 플라그 검저에 의해 결정된 바와 같은 실질적 바이러스 플라그 계수를 갖는 표. MEF RL+/+ 세포에서 바이러스 수량은 화합물 2의 존재하에 감소하였다. 화합물 2는 MEF RL-/- 세포에서 바이러스 수량을 저하시키기 않았다. 바이러스 희석은 10배 바이러스 희석이 바이러스 플라그 계수의 10배 감소를 유도함을 나타낸다.12: Table with substantial viral plaque counts as determined by plaque probes for MEF RL + / + and MEF RL − / − cells. Virus yield in MEF RL + / + cells decreased in the presence of
"피검체"는 바람직하게는, 바이러스 감염, 암 또는 재발협착증 치료가 필요한 인간이나, 가축, 농장 동물 또는 실험용 동물일 수 있다.A "subject" is preferably a human, livestock, farm animal or laboratory animal in need of treatment for a viral infection, cancer or restenosis.
밝혀진 RNase L 활성화제로 치료될 수 있는 바이러스 감염은 이들의 게놈에 있어서 단일-가닥 RNA(들)을 갖는 바이러스를 포함한다. 예로서 오르토믹소바이러스 (orthomyxoviruses) (예를 들어, 인플루엔자 바이러스), 파라믹소바이러스 (paramyxoviruses) (예를 들어, 호흡기 세포융합 바이러스 & 인간 파라인플루엔자 바이러스-3), 랍도바이러스 (rhabdoviruses) (예를 들어, 라비에스 바이러스 (rabies virus)), 토가바이러스 (togaviruses) (예를 들어, 루벨라 바이러스 (rubella virus) 및 이스턴 이퀸 엔세팔리티스 바이러스 (eastern equine encephalitis virus)), 피코르나바이러스 (picornaviruses) (예를 들어, 폴리오바이러스 (poliovirus) & 콕스사키에바이러스 (Coxsackieviruses)), 플라비바이러스 (flaviviruses) (예를 들어, 웨스트 나일 바이러스 (West Nile virus), 덴귀 바이러스 (Dengue virus), 및 C형 간염 바이러스), 버냐바이러스 (bunyaviruses) (예를 들어, 라크로세 바이러스 (LaCrosse virus), 리프트 밸리 피버 바이러스 (Rift Valley fever virus) & 한타바이러스 (Hantavirus)), 레트로바이러스 (예를 들어, 감마레트로바이러스 XMRV 및 렌티바이러스 HIV-1 & -2), 필로바이러스 (filoviruses) (예를 들어, 에볼라바이러스, 헤모르하직 피버 바이러스 (hemorrhagic fever virus)) 또는 B형 간염 바이러스 (게놈 RNA 중개체를 갖는 DNA 바이러스)를 포함한다. Viral infections that can be treated with the identified RNase L activators include viruses with single-stranded RNA (s) in their genome. Examples include orthomyxoviruses (eg influenza viruses), paramyxoviruses (eg respiratory syncytial virus & human parainfluenza virus-3), rhabdoviruses (eg For example, rabies virus, togaviruses (e.g., rubella virus and eastern equine encephalitis virus), picornaviruses ) (Eg, poliovirus & Coxsackieviruses), flaviviruses (eg, West Nile virus, Dengue virus, and C) Hepatitis virus), bunyaviruses (eg, LaCrosse virus, Rift Valley fever virus & hanta) (Hantavirus), retroviruses (e.g. gammaretrovirus XMRV and lentivirus HIV-1 & -2), filoviruses (e.g. ebolavirus, hemorhagic fever virus )) Or hepatitis B virus (a DNA virus with a genomic RNA mediator).
밝혀진 RNase L 활성화제는 인간 파필로마바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스-1 및 -2, 사이토메갈로바이러스 및 인간 헤르페스바이러스-8을 포함하는 특정 DNA 바이러스로부터의 감염을 치료하는데 이용될 수 있다. 또한, 밝혀진 RNase L 활성화제는 또한, 바리올라 바이러스 (Variola virus) (스몰폭스 바이러스 (smallpox virus)), 몽키폭스 바이러스 (Monkeypox virus), 몰루스쿰 콘타기숨 바이러스 (Molluscum contagiosum virus), 엡스테인-바르 바이러스 (Epstein-Barr virus), 아데노바이러스, 바리셀라-조스터 바이러스 (varicella-zoster virus), 인간 헤르페스바이러스 6, 인간 헤르페스 바이러스 7, B19 파르보바이러스 (B19 parvovirus), 아데노-관련 바이러스 (adeno-associated virus), BK 바이러스, 및 JC 바이러스를 포함하는 특정 DNA 바이러스로부터의 감염을 치료하는데 이용될 수 있다.The RNase L activators found can be used to treat infections from certain DNA viruses, including human papillomavirus, herpes simplex virus-1 and -2, cytomegalovirus and human herpesvirus-8. In addition, the RNase L activators that have been found also include Variola virus (smallpox virus), Monkeypox virus, Molluscum contagiosum virus, Epstein Epstein-Barr virus, adenovirus, varicella-zoster virus,
2-5A로의 PC3 또는 DU145 세포의 트랜스펙션은 아폽토시스를 초래한다 (Xiang Y, Wang Z, Murakami J, Plummer S, Klein EA, Carpten JD, Trent JM, Isaacs WB, Casey G, Silverman RH. Cancer Res. 2003 Oct 15; 63(20):6795-801). 전이성 뇌 및 골, 전립선 암으로부터 유래된 세포주인 DU145 및 PC3은 각각 RNase L에 대한 야생형이다. 또한, 2-5A 트랜스펙션은 미토칸드리아 경로를 통해 인간 난소 암종 세포에서 카스페이즈-의존성 아폽토시스를 초래한다 (Rusch L, Zhou A, Silverman RH. Jlnterferon Cytokine Res. 2000 Dec;20(12):1091-100). 또한, 텔로머라아제 RNA에 대한 안티센스에 연결된 2-5A는 누드 마우스에서 DU145 종양에 대한 아폽토시스 및 항-종양 활성을 초래한다 (Kondo Y, Koga S, Komata T, Kondo S. Oncogene. 2000 Apr 27;19(18):2205-11). 상기에 기초하여, RNase L의 밝혀진 활성화제는 암을 치료하는데 이용될 수 있다.Transfection of PC3 or DU145 cells to 2-5A results in apoptosis (Xiang Y, Wang Z, Murakami J, Plummer S, Klein EA, Carpten JD, Trent JM, Isaacs WB, Casey G, Silverman RH. Cancer Res 2003
밝혀진 RNase L 활성화제로 치료될 수 있는 암의 예로는 비제한적으로, 인간 사르코마 및 암종 예를 들어, 피브로사르코마 (fibrosarcoma), 믹소사르코마 (myxosarcoma), 리포사르코마 (liposarcoma), 콘드로사르코마 (chondrosarcoma), 오스테오젠성 사르코마 (osteogenic sarcoma), 코르도마 (chordoma), 안지오사르코마 (angiosarcoma), 엔도텔리오사르코마 (endotheliosarcoma), 림판지오사르코마 (lymphangiosarcoma), 림판지오엔도텔리오사르코마 (lymphangioendotheliosarcoma), 시노비오마 (synovioma), 메소텔리오마 (mesothelioma), 윙 종양 (Ewing's tumor), 레이오마이오사르코마 (leiomyosarcoma), 랍도마이오사르코마 (rhabdomyosarcoma), 콜론 암종 (colon carcinoma), 췌장 암, 유방 암, 난소 암, 전립선 암, 편평세포암종, 기저세포 암종, 선암종, 한선암종, 피지선 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 수질성 암종, 기관지원성 암종, 신세포 암종, 간암, 담관암종, 융모상피암, 고환종, 배아암종, 윌름즈 종양, 자궁경부암, 고환종양, 폐암종, 소세포 폐 암종, 방광암종, 상피세포 암종, 신경아교종, 별아교세포종, 수아세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경초종, 희소돌기아교세포종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종 및 망막 모세포종을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 밝혀진 RNase L 활성화제는 전립선암, 난소암, 뇌암 또는 골암을 치료하는데 일반적으로 이용된다.Examples of cancers that can be treated with the disclosed RNase L activators include, but are not limited to, human sarcoma and carcinomas such as fibrosarcoma, myxosarcoma, liposarcoma, and chondroitin. Sarcoma, osteogenic sarcoma, chordoma, angiosarcoma, endotheliosarcoma, lymphangiosarcoma, lymphangiosarcoma, lymphangiosarcoma Lymphangioendotheliosarcoma, synovioma, mesothelioma, wing's tumor, leiomyosarcoma, rhabdomiosarcoma, colon hammoma carcinoma), pancreatic cancer, breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer, squamous cell carcinoma, basal cell carcinoma, adenocarcinoma, adenocarcinoma, sebaceous gland carcinoma, papillary carcinoma, papillary adenocarcinoma, cystic carcinoma, medulla carcinoma, Gi Supportive carcinoma, renal cell carcinoma, liver cancer, cholangiocarcinoma, choriocarcinoma, testicular carcinoma, germ carcinoma, Wilm's tumor, cervical cancer, testicular tumor, lung carcinoma, small cell lung carcinoma, bladder carcinoma, epithelial cell carcinoma, glioma Cell tumors, medulloblastomas, craniocytomas, epidermoid tumors, pineal carcinoma, hemangioblastoma, auditory neuroma, oligodendrocyte, meningioma, melanoma, neuroblastoma and retinoblastoma. The identified RNase L activators are commonly used to treat prostate cancer, ovarian cancer, brain cancer or bone cancer.
재발협착증은 PTCA 벌룬 카테터로 관상 처리 또는 말초 처리 (예를 들어, 경피적 관상동맥 성형술)된 혈관에서 발생할 수 있는 질환이다. 재발협착증은 처리 후 약 3 내지 6개월 동안 조직 상처가 진전된 것이며, 혈관의 협소화를 초래한다. 재발협착증은 과도한 연근 증식을 초래한다. 밝혀진 RNase L 활성화제는 연근 증식을 억제하기 때문에, 이들 화합물은 재발협착증의 억제, 치료 및/또는 예방에 이용될 수 있는 것으로 여겨진다.Restenosis is a disease that can occur in blood vessels that have been coronally or peripherally treated (eg, percutaneous coronary angioplasty) with a PTCA balloon catheter. Restenosis is the development of tissue wounds for about three to six months after treatment, resulting in narrowing of blood vessels. Restenosis causes excessive lotus root growth. Since the RNase L activators found inhibit lotus root proliferation, it is believed that these compounds can be used to inhibit, treat and / or prevent restenosis.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "알킬"은 포화된 직쇄 또는 분지쇄의 탄화수소를 의미한다. "할로알킬"은 하나 또는 그 초과의 할로겐으로 치환된 알킬이다. 용어 "할로겐"은 F, Cl, Br 또는 I를 의미한다. 바람직하게는, 할로알킬 또는 할로알콕시중의 할로겐은 F이다.The term "alkyl" as used herein refers to a saturated straight or branched chain hydrocarbon. "Haloalkyl" is alkyl substituted with one or more halogens. The term "halogen" means F, Cl, Br or I. Preferably, the halogen in haloalkyl or haloalkoxy is F.
단독으로 사용되거나 "아르알킬"에서와 같이 더 큰 부분의 일부로서 사용된 용어 "방향족 기"는 카르복실산 방향족 고리 및 헤테로아릴 고리를 포함한다. 용어 "방향족 기"는 용어 "아릴", "아릴 고리", "방향족 고리", "아릴 기" 및 "방향족 기"와 혼용되어 사용될 수 있다. "아르알킬"은 방향족 기로 치환된 알킬기이다. "펜알킬"은 페닐 기로 치환된 알킬 기이다.The term "aromatic group" used alone or as part of a larger moiety as in "aralkyl" includes carboxylic aromatic rings and heteroaryl rings. The term "aromatic group" can be used interchangeably with the terms "aryl", "aryl ring", "aromatic ring", "aryl group" and "aromatic group". "Aralkyl" is an alkyl group substituted with an aromatic group. "Penalkyl" is an alkyl group substituted with a phenyl group.
"모노시클릭 방향족 기"는 단지 하나의 고리를 갖는 방향족 기이다.A "monocyclic aromatic group" is an aromatic group having only one ring.
카르복실산 방향족 고리 기는 단지 탄소 고리 원자만 가지며, 페닐과 같은 모노시클릭 방향족 고리를 포함한다.Carboxylic acid aromatic ring groups have only carbon ring atoms and include monocyclic aromatic rings such as phenyl.
단독으로 사용되거나 "헤테로아르알킬" 또는 "헤테로아릴알콕시"에서와 같이 더 큰 부분의 일부로서 사용된 용어 "헤테로아릴", "헤테로방향족", "헤테로아릴 고리", "헤테로아릴 기" 및 "헤테로방향족 기"는 고리 원자로서 하나 또는 그 초과의 헤테로원자 예컨대, 질소, 황 또는 산소를 갖는 방향족 기를 나타낸다. 모노시클릭 헤테로아릴 기는 5 또는 6개의 구성원 및 1 또는 그 초과의 고리 헤테로원자 예컨대, 질소, 산소 및 황을 갖는다. 모노시클릭 헤테로아릴 기의 예로는 2-푸라닐, 3-푸라닐, N-이미다졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 5-이미다졸릴, 3-이속사졸릴, 4-이속사졸릴, 5-이속사졸릴, 2-옥사디아졸릴, 5-옥사디아졸릴, 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, 3-피라졸릴, 4-피라졸릴, 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-피리미디닐, 4-피리미디닐, 5-피리미디닐, 3-피리다지닐, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴, 2-트리아졸릴, 5-트리아졸릴, 테트라졸릴, 2-티에닐 및 3-티에닐을 포함한다.The terms “heteroaryl”, “heteroaromatic”, “heteroaryl ring”, “heteroaryl group” and “used alone or as part of a larger portion, such as in“ heteroaralkyl ”or“ heteroarylalkoxy ” Heteroaromatic group "refers to an aromatic group having one or more heteroatoms such as nitrogen, sulfur or oxygen as ring atoms. Monocyclic heteroaryl groups have 5 or 6 members and 1 or more ring heteroatoms such as nitrogen, oxygen and sulfur. Examples of monocyclic heteroaryl groups include 2-furanyl, 3-furanyl, N-imidazolyl, 2-imidazolyl, 4-imidazolyl, 5-imidazolyl, 3-isoxazolyl, 4 Isoxazolyl, 5-isoxazolyl, 2-oxadiazolyl, 5-oxazozolyl, 2-oxazolyl, 4-oxazolyl, 5-oxazolyl, 3-pyrazolyl, 4-pyrazolyl, 1- Pyrrolyl, 2-pyrrolyl, 3-pyrrolyl, 2-pyridyl, 3-pyridyl, 4-pyridyl, 2-pyrimidinyl, 4-pyrimidinyl, 5-pyrimidinyl, 3-pyrida Genyl, 2-thiazolyl, 4-thiazolyl, 5-thiazolyl, 2-triazolyl, 5-triazolyl, tetrazolyl, 2-thienyl and 3-thienyl.
방향족 기에서 "치환가능한 고리 탄소 원자"는 수소 원자에 결합된 고리 탄소 원자이다. 수소는 적합한 치환 기로 선택적으로 치환될 수 있다. 따라서, 용어 "치환가능한 고리 탄소 원자"는 두개의 고리가 융합되는 경우 공유되는 고리 탄소 원자를 포함하지 않는다. "치환가능한 고리 탄소 원자"는 구조가 이들이 이미 수소 이외의 부분에 부착되는 것으로 묘사된 경우 고리 탄소 원자를 포함하지 않는다.A "substitutable ring carbon atom" in an aromatic group is a ring carbon atom bonded to a hydrogen atom. Hydrogen may be optionally substituted with a suitable substituent. Thus, the term "substitutable ring carbon atom" does not include ring carbon atoms that are shared when two rings are fused. "Substitutable ring carbon atoms" do not include ring carbon atoms when the structures are already depicted as being attached to a moiety other than hydrogen.
아릴 (예를 들어, 페닐) 기의 치환가능한 고리 탄소 원자에 대한 적합한 치환기의 예로는 할로겐, R°, -OR°, -O(할로알킬), -SR°, 트리알킬실릴, 보로네이트, 알킬보로네이트, 디알킬보로네이트, -NO2, -CN, -N(R')2, -NR'C02R°, -NR'C(O)R°, -NR'NR'C(O)R°, -N(R')C(O)N(R')2, -NR'NR'C(O)N(R')2, -NR'NR'C02R°, -C(O)C(O)R°, -C(O)CH2C(O)R°, -C02R°, -C(0)R°, -C(O)N(R°)2, -OC(O)R°, -OC(O)N(R°)2, -S(0)2R°, -SO2N(R')2, -S(O)R°, -NR'SO2N(R')2, - NR'S02R°, -C(=S)N(R')2, -NR'-C(=NH)-N(R')2 및 -C(=NH)-N(R')2 또는 1,2-메틸렌 -디옥시 또는 1,2-에틸렌-디옥시로 치환될 수 있는 두개의 인접한 고리 탄소 원자를 포함한다.Examples of suitable substituents for the substitutable ring carbon atoms of the aryl (eg phenyl) group include halogen, R °, -OR °, -O (haloalkyl), -SR °, trialkylsilyl, boronate, alkyl Boronate, dialkylboronate, —NO 2, —CN, —N (R ′) 2 , -NR'C0 2 R °, -NR'C (O) R °, -NR'NR'C (O) R °, -N (R ') C (O) N (R') 2 , -NR 'NR'C (O) N (R ') 2 , -NR'NR'C0 2 R °, -C (O) C (O) R °, -C (O) CH 2 C (O) R °,- C0 2 R °, -C (0) R °, -C (O) N (R °) 2 , -OC (O) R °, -OC (O) N (R °) 2 , -S (0) 2 R °, -SO 2 N (R ') 2 , -S (O) R °, -NR'SO 2 N (R') 2 ,-NR'S0 2 R °, -C (= S) N ( R ') 2 , -NR'-C (= NH) -N (R') 2 and -C (= NH) -N (R ') 2 or 1,2-methylene-dioxy or 1,2-ethylene It includes two adjacent ring carbon atoms which may be substituted with deoxy.
각각의 R°는 독립적으로 수소 또는 알킬기이다.Each R ° is independently hydrogen or an alkyl group.
각각의 R'는 수소 또는 알킬 기이다.Each R 'is Hydrogen or an alkyl group.
아르알킬기가 특정 수의 탄소 원자를 갖는 것으로 특정화된 경우, 특정화되는 아르알킬의 알킬 부분에서 탄소 원자의 수인 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, C1-C2 아르알킬 기는 알킬 부분에서 1 또는 2개의 탄소 원자를 갖는다.When an aralkyl group is characterized as having a certain number of carbon atoms, it is to be understood that it is the number of carbon atoms in the alkyl portion of the aralkyl specified. For example, a C1-C2 aralkyl group has one or two carbon atoms in the alkyl moiety.
약제학적으로 허용되는 염은 아민 또는 기타 염기성 기를 함유하는 밝혀진 RNase L 활성화제의 산성 염을 포함하며, 화합물을 적합한 유기 또는 무기 산 예컨대, 염화수소, 브롬화수소, 아세트산, 과염소산 등을 반응시킴으로써 수득될 수 있다. 이러한 염의 다른 예로는 설페이트, 메탄술포네이트, 니트레이트, 말레이트, 아세테이트, 시트레이트, 푸마레이트, 타르트레이트 [예를 들어, (+)-타르트레이트, (-)-타르트레이트 또는 라세미체 혼합물을 포함하는 이의 혼합물], 숙시네이트, 벤조에이트 및 아미노산 예컨대, 글루탐산과의 염을 포함한다.Pharmaceutically acceptable salts include acidic salts of known RNase L activators containing amines or other basic groups, which can be obtained by reacting the compound with a suitable organic or inorganic acid such as hydrogen chloride, hydrogen bromide, acetic acid, perchloric acid, and the like. have. Other examples of such salts include sulfates, methanesulfonates, nitrates, malates, acetates, citrates, fumarates, tartrates [eg, (+)-tartrates, (-)-tartrates or racemate mixtures. Mixtures thereof, succinates, benzoates and salts with amino acids such as glutamic acid.
카르복실산 또는 다른 산성 작용기를 함유하는 밝혀진 RNase L 활성화제의 염은 적합한 염기와의 반응에 의해 제조될 수 있다. 이러한 약제학적으로 허용되는 염은 약제학적으로 허용되는 양이온을 제공하는 염기로 제조될 수 있으며, 이는 알칼리 금속 염 (특히, 나트륨 및 칼륨), 알칼리 토금속 염 (특히, 칼슘 및 마그네슘), 알루미늄 염 및 암모늄 염, 및 트리메틸아민, 트리에틸아민, 모르폴린, 피리딘, 피페리딘, 피콜린, 디시클로헥실아민, N,N'-디벤질에틸렌디아민, 2-히드록시에틸아민, 비스-(2-히드록시에틸)아민, 트리-(2-히드록시에틸)아민, 프로카인, 디벤질피페리딘, N-벤질-β-펜에틸아민, 데히드로아비에틸아민, N,N'-비스데히드로아비에틸아민, 글루카민, N-메틸글루카민, 콜리딘, 퀴닌, 퀴놀린 및 염기성 아미노산 예컨대, 리신 및 아르기닌과 같은 생리학적으로 허용되는 유기 염기로부터 제조된 염을 포함한다.Salts of the known RNase L activators containing carboxylic acids or other acidic functionalities can be prepared by reaction with a suitable base. Such pharmaceutically acceptable salts may be prepared with bases that provide pharmaceutically acceptable cations, which include alkali metal salts (particularly sodium and potassium), alkaline earth metal salts (particularly calcium and magnesium), aluminum salts and Ammonium salts and trimethylamine, triethylamine, morpholine, pyridine, piperidine, picoline, dicyclohexylamine, N, N'-dibenzylethylenediamine, 2-hydroxyethylamine, bis- (2- Hydroxyethyl) amine, tri- (2-hydroxyethyl) amine, procaine, dibenzylpiperidine, N-benzyl-β-phenethylamine, dehydroabiethylamine, N, N'-bisdehydro Salts prepared from physiologically acceptable organic bases such as abiethylamine, glucamine, N-methylglucamine, collidine, quinine, quinoline and basic amino acids such as lysine and arginine.
"치료" 또는 "치료하는"는 치료학적 및 예방학적 치료 둘 모두를 의미한다."Treatment" or "treating" means both therapeutic and prophylactic treatment.
"유효량"은 화합물이 치료가 필요한 피검체에 투여되는 경우 유익한 임상 결과 (예방학적 또는 치료학적)가 달성되는 밝혀진 RNase L 활성화제의 양이다. 바이러스 감염 치료에 있어서, "유익한 임상 결과"는 치료의 부재시와 비교하여 질환 (예를 들어, 열)과 관련된 증상 중증도의 감소, 질환 기간의 감소 및/또는 질환과 관련된 증상의 발생의 지연을 포함한다. 암 치료에서, 유익한 임상 결과는 치료 부재시와 비교하여 종양 질량의 저하, 종양 성장 속도의 저하, 전이의 저하, 암과 관련된 증상 중증도의 저하 및/또는 피검체의 수명 증가를 포함한다. 재발협착증에 있어서, "유익한 임상 결과"는 혈관 성형술이 시술된 혈관의 협착의 지연 또는 저하를 포함한다. 피검체에 투여되는 정확한 양의 밝혀진 RNase L 활성화제는 질환 또는 질병의 유형 및 중증도 및 피검체의 특징 예컨대, 일반적 건강 상태, 연령, 성별, 체중 및 약물에 대한 내성에 의존적일 것이다. 이는 또한 질환 또는 질병의 정도, 중증도 및 유형에 의존적일 것이다. 당업자는 이들 인자 및 다른 인자에 의존적인 적합한 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 밝혀진 RNase L 활성화제의 유효량은 전형적으로, 일일당 약 0.1mg/kg 체중 내지 일일당 약 1000mg/kg 체중, 바람직하게는, 일일당 1mg/kg 내지 일일당 100mg/kg 체중이다.An "effective amount" is the amount of RNase L activator found to be beneficial when the compound is administered to a subject in need of treatment (prophylactic or therapeutic). In the treatment of viral infections, "beneficial clinical outcome" includes a reduction in the severity of symptoms associated with the disease (eg, fever), a reduction in the duration of the disease and / or a delay in the onset of symptoms associated with the absence of treatment. do. In the treatment of cancer, beneficial clinical outcomes include lower tumor mass, lower tumor growth rate, lower metastasis, lower severity of symptoms associated with cancer and / or increased lifespan of the subject as compared to without treatment. In restenosis, "beneficial clinical outcome" includes the delay or slowing of narrowing of blood vessels in which angioplasty has been performed. The exact amount of RNase L activator found to be administered to a subject will depend on the type or severity of the disease or condition and the characteristics of the subject, such as general health, age, sex, weight and resistance to the drug. It will also depend on the extent or severity and type of disease or condition. Those skilled in the art will be able to determine suitable dosages that depend on these and other factors. The effective amount of RNase L activator found is typically about 0.1 mg / kg body weight per day to about 1000 mg / kg body weight per day, preferably 1 mg / kg per day to 100 mg / kg body weight per day.
밝혀진 RNase L 활성화제 및 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 및 수화물은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 약제 제조물중에 사용될 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체는 불활성 고체 충전제 또는 희석제 및 멸균 수용액 또는 유기 용액을 포함한다. 밝혀진 RNase L 활성화제는 본원에 기술된 범위의 목적하는 투여량을 제공하기에 충분한 양으로 이러한 약제 조성물중에 존재할 것이다. 본 발명의 화합물의 제형화 및 투여 기법은 문헌 [Remington: the Science and Practice of Pharmacy, 19 th edition, Mack Publishing Co., Easton, PA (1995)]에서 찾아볼 수 있다.The identified RNase L activators and their pharmaceutically acceptable salts, solvates and hydrates can be used in pharmaceutical preparations with pharmaceutically acceptable carriers or excipients. Suitable pharmaceutically acceptable carriers include inert solid fillers or diluents and sterile aqueous or organic solutions. The RNase L activators found will be present in such pharmaceutical compositions in amounts sufficient to provide the desired dosages in the ranges described herein. Formulations and administration techniques for the compounds of the invention are described in Remington: the Science and Practice of Pharmacy, 19 th edition, Mack Publishing Co., Easton, PA (1995).
경구 투여에 있어서, 밝혀진 RNase L 활성화제 또는 이의 염은 적합한 고체 또는 액체 담체 또는 희석제와 혼합되어 캡슐, 정제, 당의정, 분말, 시럽, 용액, 현탁액 등을 형성할 수 있다.For oral administration, the identified RNase L activators or salts thereof can be mixed with a suitable solid or liquid carrier or diluent to form capsules, tablets, dragees, powders, syrups, solutions, suspensions and the like.
정제, 당의정, 캡슐 등은 약 1 내지 약 99 중량%의 활성 성분 및 결합제 예컨대, 검 트래거캔트, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴; 부형제 예컨대, 디칼슘 포스페이트; 붕해제 예컨대, 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산; 윤활제 예컨대, 마그네슘 스테아레이트; 및 감미제 예컨대, 수크로오스 락토오스 또는 사카린을 함유한다. 투여 단위 형태가 캡슐인 경우, 이는 상기 유형의 물질 이외에 액체 담체 예컨대, 지방 오일을 함유할 수 있다.Tablets, dragees, capsules and the like may comprise from about 1 to about 99% by weight of active ingredient and binder such as gum tragacanth, acacia, corn starch or gelatin; Excipients such as dicalcium phosphate; Disintegrants such as corn starch, potato starch, alginic acid; Lubricants such as magnesium stearate; And sweetening agents such as sucrose lactose or saccharin. When the dosage unit form is a capsule, it may contain a liquid carrier such as fatty oil in addition to the above types of substances.
다양한 기타 물질이 코팅으로서 또는 투여 단위의 물리적 형태를 변형시키기 위해 존재할 수 있다. 예를 들어, 정제는 셀락, 당 또는 이 둘 모두로 코팅될 수 있다. 시럽 또는 엘릭시르는 활성 성분 이외에, 감미제로서 수크로오스, 방부제로서 메틸 및 프로필파라벤, 염료 및 체리 또는 오렌지 향과 같은 향미제를 함유할 수 있다.Various other materials may be present as coatings or to modify the physical form of the dosage unit. For example, tablets may be coated with shellac, sugar or both. Syrups or elixirs may contain, in addition to the active ingredient, sucrose as a sweetener, methyl and propylparabens as preservatives, dyes and flavoring agents such as cherry or orange flavors.
경구 투여를 위해서는, 밝혀진 RNase L 활성화제 또는 이의 염은 멸균 수성 또는 유기 매질과 혼합되어 주입가능한 용액 또는 현탁액을 형성할 수 있다. 예를 들어, 참깨 또는 땅콩 유중의 용액, 수성 프로필렌 글리콜 등 및 화합물의 수용성의 약제학적으로 허용되는 염의 수용액이 사용될 수 있다. 분산제는 또한, 오일중의 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 혼합물중에 제조될 수 있다. 저장 및 사용을 위한 일반적인 조건하에, 이들 제조물은 미생물 성장을 억제하기 위해 방부제를 함유한다.For oral administration, the identified RNase L activators or salts thereof can be mixed with sterile aqueous or organic media to form injectable solutions or suspensions. For example, an aqueous solution of a solution in sesame or peanut oil, aqueous propylene glycol, and the like and a water-soluble pharmaceutically acceptable salt of the compound can be used. Dispersions can also be prepared in glycerol, liquid polyethylene glycols, and mixtures thereof in oils. Under ordinary conditions for storage and use, these preparations contain a preservative to inhibit microbial growth.
이전에 기술된 제형 이외에, 밝혀진 RNase L 활성화제는 장기간 활성 제형 예컨대, 디폿 제조물로서 제형화될 수 있다. 이러한 장기간 활성 제형은 이식 또는 예를 들어, 근내 주입에 의해 피하내로 투여될 수 있다.In addition to the formulations described previously, the disclosed RNase L activators can be formulated as long-term active formulations such as dipot preparations. Such long acting formulations may be administered subcutaneously by implantation or, for example, intramuscular injection.
바람직하게는, 밝혀진 RNase L 활성화제 또는 이러한 화합물을 함유하는 약제 제형은 포유동물에 투여하기 위한 단위 투약 형태로 존재한다. 단위 투약 형태는 당해분야에 공지된 단위 투약 형태일 수 있으며, 예를 들어, 캡슐, IV 백, 정제 또는 바이알을 포함한다. 단위 투약 조성물중의 밝혀진 RNase L 활성화제의 양은 유효량이며, 관련된 특정 치료에 따라 변화될 수 있다. 환자의 연령 및 상태에 따라 투여량에 대한 일상적인 변화가 필요할 수 있음이 자명할 것이다. 투여량은 경구, 에어로졸, 직장, 피내, 피하내, 정맥내, 근내, 복강내 및 근내를 포함하는 다양한 경로일 수 있는 투여 경로에 의존적일 것이다.Preferably, the identified RNase L activators or pharmaceutical formulations containing such compounds are in unit dosage form for administration to a mammal. The unit dosage form can be a unit dosage form known in the art and includes, for example, capsules, IV bags, tablets or vials. The amount of RNase L activator found in the unit dosage composition is an effective amount and may vary depending on the particular treatment involved. It will be appreciated that routine changes in dosage may be necessary depending on the age and condition of the patient. The dosage will depend on the route of administration, which can be a variety of routes including oral, aerosol, rectal, intradermal, subcutaneous, intravenous, intramuscular, intraperitoneal and intramuscular.
합성 요법:Synthetic Therapy:
일반적 구조식 III의 화합물은 문헌 [Faull and Hull. "Some reactions of Ethyl 2-Anilino-4oxo-4,5-dihydrothiophen-3carboxylate." Perkin Transactions 1, 1981, 1078-1082]에 기술된 바와 같은 공정에 따라 합성될 것이다. 화학식 I의 Z2는 S (이소티오시아네이트) 또는 0 (이소시아네이트)이다. 치환된 벤즈알데히드와의 축합은 화학식 IV의 구조를 갖는 화합물을 생성시킬 것이다. 고리 A의 변형은 치환된 알데히드를 선택함으로써 달성된다. 고리 B의 변형은 반응식 3 및 4에 기술되어 있다:Compounds of general structure III are described by Faull and Hull. "Some reactions of Ethyl 2-Anilino-4oxo-4,5-dihydrothiophen-3carboxylate."
반응식 1:Scheme 1:
화합물 1의 합성은 하기 반응식에 따른다. 이소티오시아네이토벤젠 (V)은 폴 및 훌 (Faull and Hull) 조건하에 에틸 4-클로로-3-옥소부타노에이트 (VI)와 결합될 것이다. 2,3-디히드로티오펜 중간체 (VII)와 3-히드록시벤즈알데히드와의 축합은 화합물 1을 생성시킬 것이다.Synthesis of
반응식 2:Scheme 2:
고리 B에서 치환기의 변형은 반응식 1에 기술된 폴 및 훌 합성법 전에 달성될 것이다. 화합물 XII를 생성하기 위한 대표적인 합성법은 반응식 3에 도시되어 있다. 용이하게 입수가능한 (E)-메틸 3-(3-니트로페닐)아크릴레이트 (VIII)는 상응하는 아민 (IX)으로 촉매적으로 환원될 수 있다. DCC의 존재하에 아민과 이황화탄소의 결합을 통해 이소티오시아네이트 (X)의 제형화는 반응식 1의 I와 유사한 출발 반응물을 생성시켰다. 화합물 XII의 생성은 후속의 폴-훌 합성 공정에 따른다.Modification of the substituents on ring B will be accomplished before the pole and hu synthesis methods described in
반응식 3:Scheme 3:
포스포네이트 화합물 XVIII은 반응식 4에 도시된 바와 같이 제조될 것이다. 시중에서 입수가능한 3-아미노페놀 (XIII)은 NaOH 또는 Et3N을 갖는 디옥산/H2O (1:1)중의 디벤질피로카르보네이트와 표준 방법을 통해 보호될 것이다 (XIV 생성). 보호된 아미노페놀의 나트륨 히드라이드로의 탈보호 및 이전에 기술된 DMF중의 p-톨루엔셀포닐옥시메탄 포스포네이트와의 결합 (화합물 XV 생성)에 이어 수소화 이동에 의해 벤질옥시카르보닐 보호기를 제거한다 (화합물 XVI 생성). 티오펜 고리를 생성시키기 위한 유리 아민의 이소티오시아네이트로의 전환 및 에틸 4-클로로-3-옥소부타노에이트와의 축합은 화합물 XII의 합성과 유사하다. 티오펜 고리와 3-히드록시벤즈알데히드와의 결합 후, 디메틸 포스포네이트 에스테르 (XVII)의 선택적 탈보호를 수성 피리딘으로 달성하여 화합물 XVIII을 생성시켰다.Phosphonate compound XVIII will be prepared as shown in
반응식 4:Scheme 4:
본 발명은 하기 실시예에 예시되며, 이는 본 발명을 어떤 식으로든 제한하고자 하는 것은 아니다.The invention is illustrated in the following examples, which are not intended to limit the invention in any way.
실시예 1 - RNase L을 활성화시키는 제제를 확인하기 위한 검정법Example 1 Assay to Identify Agents Activating RNase L
검정은 형광공명 에너지 전이 (FRET)에 기초한다. 이러한 방법은 바쿨로바이러스 벡터로부터의 곤충 세포에서 생성되고 FPLC에 의해 정제된 재조합 인간 RNase L을 포함한다 (Thakur CS, Xu Z, Wang Z, Novince Z, Silverman RH. A convenient and sensitive fluorescence resonance energy transfer assay for RNase L and 2',5' oligoadenylates. Methods Mol Med 2005;116:103-13). 절단가능한 RNA 기질은 5'-말단에 형광체 (6-카르복시플루오로레세인, FAM) 및 3' 말단에서 켄처 (블랙 홀 켄쳐-1, BHQ1)를 갖는 36-누클레오티드 합성 올리고리보누클레오티드이다. RNA 서열은 파라믹소바이러스, 호흡 세포융합 바이러스 (RSV) 게놈 RNA로의 유전자 사이 영역으로부터 기인한다. RSV 서열은 절단을 위한 최적의 상황에서 RNase L (UU 또는 UA)에 대한 수개의 절단 부위를 함유하기 때문에 선택되었다. 검정의 유효성을 입증하기 위해, RNA 절단 반응은 RNase L, 절단성 FRET RNA 기질 및 2-5A를 함유하는 96-웰 블랙 미세적정 플레이트에서 수행하였다. EC50은 RNase L의 활성화제로서 확실한 트리머 2-5A [p3A(2'5'A)2]를 사용한 경우 일정하게 0.3nM으로 수득되었다 (50% 최대 활성화를 제공하는 활성화제의 농도) (도 1A). 데포스포릴화된 트리머인 A(2'p5'A)2는 RNase L을 활성화시킬 수 없었으며, 이는 종래 발견과 일치된다 (도 1A & D). [Dong B, Xu L, Zhou A, Hassel BA, Lee X, Torrence PF, Silverman RH. Intrinsic molecular activities of the interferon-induced 2-5A-dependent RNase. J Biol Chem 1994;269(19):14153-8]. 불활성의 데포스포릴화된 2-5A 분자는 "코어 2-5A"로서 언급된다. 신호 대 잡음비는 약 10:1이며, 검정은 매우 확고하였다. RNA를 함유하나 RNase L 또는 2-5A가 걸여된 반응에서는 시간에 따른 시그널 증가가 관찰되지 않았다.The assay is based on fluorescence resonance energy transfer (FRET). Such methods include recombinant human RNase L produced in insect cells from baculovirus vectors and purified by FPLC (Thakur CS, Xu Z, Wang Z, Novince Z, Silverman RH. A convenient and sensitive fluorescence resonance energy transfer assay for RNase L and 2 ', 5' oligoadenylates.Methods Mol Med 2005; 116: 103-13). Cleavable RNA substrates are 36-nucleotide synthetic oligoribonucleotides having a phosphor at the 5'-end (6-carboxyfluororesin, FAM) and a quencher at the 3 'end (black hole quencher-1, BHQ1). The RNA sequence is from the intergenic region into paramyxovirus, respiratory syncytial virus (RSV) genomic RNA. The RSV sequence was chosen because it contains several cleavage sites for RNase L (UU or UA) in the optimal situation for cleavage. To demonstrate the validity of the assay, RNA cleavage reactions were performed in 96-well black microtiter plates containing RNase L, cleavable FRET RNA substrates and 2-5A. EC 50 was consistently obtained at 0.3 nM when using reliable trimer 2-5A [p 3 A (2'5'A) 2 ] as RNase L activator (concentration of activator providing 50% maximum activation) (FIG. 1A). The dephosphorylated trimer A (2'p5'A) 2 was unable to activate RNase L, which is consistent with previous findings (FIGS. 1A & D). Dong B, Xu L, Zhou A, Hassel BA, Lee X, Torrence PF, Silverman RH. Intrinsic molecular activities of the interferon-induced 2-5A-dependent RNase. J Biol Chem 1994; 269 (19): 14153-8]. Inactive dephosphorylated 2-5A molecules are referred to as "cores 2-5A". The signal-to-noise ratio was about 10: 1, and the test was very robust. No signal increase over time was observed in reactions containing RNA but with RNase L or 2-5A.
실시예 2 - RNase L 억제제의 확인Example 2 Identification of RNase L Inhibitors
고처리량 스크리닝은 34,000 소분자량의 켐브릿지 다이버세트 (ChemBridge DIVERset)에서 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행하였다 (ChemBridge Co., San Diego). 배경에 비해 4배 이상의 시그널을 제공하는 화합물은 재-시험을 위한 잠재적인 파지티브로서 선택되었다.High throughput screening was performed as described in Example 1 on a 34,000 small molecular weight ChemBridge DIVERset (ChemBridge Co., San Diego). Compounds that provide signals four times more than background were selected as potential positives for re-testing.
7개의 "히트 (hit)"가 수득되었다 (도 2, 화합물 1 내지 7). 히트는 298 내지 470Da의 분자량을 가지며, 마이크로몰 범위에서 RNase L을 활성화시킬 수 있다 (22 내지 99~M의 EC50') (도 1 및 2). FRET 검정에서 RNA 절단의 동역학은 15분내에 pppA(2'p5'A)2에 의해 거의 최대 활성화를 나타내는 반면, 화합물 1 및 2는 최대 수준의 RNA 분해를 달성하는데 60분 내지 90분이 요구된다 (도 1D-F).Seven “hits” were obtained (FIG. 2, Compounds 1-7). The heat has a molecular weight of 298 to 470 Da, and can activate RNase L in the micromolar range (EC 50 ′ of 22 to 99 to M) (FIGS. 1 and 2). The kinetics of RNA cleavage in the FRET assay shows nearly maximal activation by pppA (2'p5'A) 2 within 15 minutes, while
이러한 활성화제에 대해 구조적으로 관련된 다른 화합물은 조사가능한 데이타베이스를 사용하여 캠브릿지 리파지토리 (ChemBridge repository)에서 확인하였다 (http://www.hit2lead.com). 화합물1에 구조적으로 관련된 두개의 화합물은 활성 (화합물 8-11) 또는 불활성 (화합물 12)이다 (도 2).Other structurally related compounds for these activators were identified in the ChemBridge repository using a searchable database (http://www.hit2lead.com). Two compounds structurally related to
실시예 3 - 화합물 1 및 2는 라벨링된 기질로의 리보누클레아제 검정에서 RNase L을 활성화시킨다Example 3
이들 화합물이 RNase L을 실제로 활성화시킬 수 있음을 입증하기 위해, 대안적으로 통상적인 리보누클레아제 검정을 두개의 상이한 32P-라벨링된 RNA 기질로 수행하였다 (도 3A&B). 이들 검정에서, 25μM의 화합물 1 (도 3A, 레인 3&4) 및 25μM 화합물 2 (도 3A, 레인 5&6)을 정제된 인간 RNase L과 합성 RNA 기질 GGACUUUUUUUCCCUUUUUUUCC-[32P]pCp (SEQ ID NO.: 1)의 존재하에 및 부재하에 인큐베이션하였다. 2-5A 또는 화합물 1 또는 2에 의해 활성화된 RNase L은 UU 디누클레오티드 서열의 3' 쪽에서 기질을 절단하였으며, 이는 FRET 검정 결과와 일치한다.To demonstrate that these compounds can actually activate RNase L, alternatively conventional ribonuclease assays were performed with two different 32 P-labeled RNA substrates (FIG. 3A & B). In these assays, 25 μM of Compound 1 (FIG. 3A,
서열 특이적 기질 C7U2C12 (도 3B) (SEQ ID NO.: 2)를 사용하여 유도 화합물 1 및 2에 의한 RNase L 활성화를 지지하였다. 화합물 1 (25μM) (레인 4 & 5), 및 화합물 2 (25μM) (레인 6 & 7)을 각각 방사선 라벨링된 RNA 기질과 RNase L의 존재 및 부재하에 인큐베이션하였다. 2-5A, 화합물 1 또는 화합물 2에 의해 활성화된 RNase L은 UU 디누클레오티드 서열의 3'-측에서 기질을 절단하였다. 활성화제의 부재하에, 생성물 밴드는 검출되지 않았다.Sequence specific substrate C 7 U 2 C 12 (FIG. 3B) (SEQ ID NO .: 2) was used to support RNase L activation by
RNase L 이량체화는 누클레아제 활성화에 필수적이다. RNase L의 이량체화를 모니터링하기 위해, 단백질 가교 검정을 수행하였다 (도 3C). RNase L의 올리고머 상태를 RNase L에 대한 모노클로날 항체로 프로빙되는 웨스턴 블롯으로 결정하였다. 모노머 RNase L은 2-5A, 화합물 1 또는 화합물 2의 존재하에 다이머로 전환되었다 (도 3C). 이들 데이타는 마이크로몰 수준의 화합물 1 & 2가 RNase L을 활성화시키고, 효소를 이량체화시킴을 보여준다.RNase L dimerization is essential for nuclease activation. To monitor dimerization of RNase L, a protein crosslinking assay was performed (FIG. 3C). The oligomeric state of RNase L was determined by Western blot probed with monoclonal antibodies against RNase L. Monomer RNase L was converted to dimers in the presence of 2-5A,
실시예 4 - 화합물 1 및 2는 2-5A 유사체 결합 도메인인 RNase L의 도메인과 상호작용한다.Example 4
바이아코어 모델 3000TM에 대한 표면 플라즈몬 공명 기법을 이용한 2-5A 경쟁 결합 검정을 이용하여 활성화제가 RNase L의 2-5A 결합 도메인과 상호작용하는 지를 결정하는데 이용되었다. 이들 검정에 사용된 2-5A 유사체 [2',3' 말단 리보오스를 통해 바이오틴에 연결된 p5'(A2'p)3A]는 일반적으로 이러한 수고를 위해 닥터. 에이취. 사와이 (Dr. H. Sawai; Gunma University, Japan)에 의해 제공되었다 (Gunma University, Japan). 스트렙타비딘 칩 (Biacore Inc.)은 2-5A-바이오틴으로 사전 코팅하였다. RNase L (10nM)와 다양한 농도의 화합물 1 또는 화합물 2의 혼합물 또는 RNase L 자체를 칩 위로 이동시켰다.A 2-5A competitive binding assay using surface plasmon resonance techniques for the Biacore model 3000 ™ was used to determine whether the activator interacts with the 2-5A binding domain of RNase L. The 2-5A analogs used in these assays [p5 '(A2'p) 3 A] linked to biotin via 2', 3 'terminal ribose are generally referred to the doctor. H. Provided by Dr. H. Sawai; Gunma University, Japan (Gunma University, Japan). Streptavidin chips (Biacore Inc.) were precoated with 2-5A-biotin. A mixture of RNase L (10 nM) and various concentrations of
센소그램을 기록하고, 평행시 최대 공명 유닛 (Rmax)을 바이아-이벨루에이션TM 소프트웨어를 사용하여 화합물 농도의 함수로서 플롯팅하였다 (도 4). 화합물 1 또는 2에 대한 공명 반응에서 용량 의존적 감소학 발생하였다. 데이타는 이들 화합물이 RNase L 결합에 있어서 2-5A와 경쟁함을 나타낸다. 데이타 분석은 화합물 1 및 2에 대한 결합 상수 (Kd)가 각각 18μM 및 12μM임을 나타내었다.Sensograms were recorded and the maximum resonance units (R max ) in parallel were plotted as a function of compound concentration using the Via-Elevation ™ software (FIG. 4). Dose dependent reduction occurred in the resonance response to
화합물 5 - 화합물 1 및 2는 테트라졸륨 전환 검정에 기초하여 세포독성을 띠지 않는다.
화합물 1 및 2의 세포독성을 MTS (테트라졸륨) 전환 검정 (Promega)으로 평가하였다. 3일 동안 50~M의 화합물 1의 처리는 DU145 및 HeLa 세포 각각에 있어서 세포 생존율을 대조군 (비처리된) 수준의 76.3% 및 98.2%로 저하시켰다. 화합물 2 (또한 3일 동안 50~M)로의 처리는 DU145 및 HeLa 세포 각각에 있어서 세포 생존율을 비처리된 세포의 백분율로서 95.2% 및 86.5%로 저하시켰다. DU145에 대한 결과는 도 5에 도시되어 있으며, Hela M 세포에 대한 결과는 도 6에 도시되어 있다. 이들 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 이들 화합물은 현저한 세포독성이 결여되어 있다.Cytotoxicity of
실시예 6 - 화합물 2는 파라인플루엔자 바이러스 3, 피코르나바이러스 및 엔세팔로마이오카르디티스 바이러스에 대해 항바이러스 활성을 나타낸다.Example 6
항바이러스 활성을 측정하기 위해, 세포를 재조합 인간 파라인플루엔자 바이러스 3 (HPIV3)으로 감염시키고, 녹색 형광 단백질 (GFP) cDNA를 (협력자 A. 배너지 (Banerjee)에 의해 제공된) P와 M 유전자 사이에 삽입하였다 (도 7). 사용된 세포주는 RNase L이 결여된 HeLa M 세포 또는 야생형 RNase L 또는 누클레아제-치사 변이체 (R667A) RNase L을 안정하게 발현하는 HeLa M 세포이다 (벡터 pcDNAneo에서 CMV 프로모터로부터). 세포를 혈청 비함유 배지 (DMEM)에서 1시간 동안 HPIV3/GFP로 0.1의 MOI에서 감염시켰다. 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 세척하고, 50~M 화합물의 존재 또는 부재하의 10% FBS를 갖는 완전 배지를 첨가하였다. 감염 후 24시간에, 세포를 불활성 형광 미세현미경하에서 시험하였다. 특징적 융합세포 (녹색)가 벡터를 단독으로 갖거나 변이체 (R667A) RNase L을 발현하는 처리된 및 비처리된 RNase L-결여 HeLa M 세포의 HPIV3/GFP 감염으로 관찰되었다. 반대로, 화합물 2는 바이러스 성장을 급격하게 억제시켰으며, 야생형 RNase L을 발현하는 세포에서 융합세포의 형성을 억제하였다. 형광 측정은 화합물 2가 야생형 RNase L 발현 세포에서 8배 까지 바이러스 성장을 저하시키는 반면, 다른 두 세포주에서는 바이러스 성장을 단지 1.2배 저하시키는 것으로 나타났다. 유사한 실험에서, 화합물 1은 또한 항바이러스 활성을 갖는다. 화합물 2의 항바이러스 활성은 엔세팔로마이오카르디티스 바이러스 (도 8 참조) 및 피코르나바이러스 (데이타 미도시됨)에 대해 수득되었다. 따라서, 낮은 독성을 갖는 이들 화합물은 일반적인 항바이러스 활성을 가지며, 후보 항바이러스 약물이다.To measure antiviral activity, cells are infected with recombinant human parainfluenza virus 3 (HPIV3) and green fluorescent protein (GFP) cDNA is provided between the P and M genes (provided by collaborator A. Bannerner). Inserted (FIG. 7). The cell line used is HeLa M cells lacking RNase L or HeLa M cells stably expressing wild type RNase L or nuclease-lethal variant (R667A) RNase L (from the CMV promoter in vector pcDNAneo). Cells were infected at 0.1 MOI with HPIV3 / GFP for 1 hour in serum free medium (DMEM). The medium was removed, cells were washed with PBS and complete medium with 10% FBS with or without 50-M compounds was added. 24 hours after infection, cells were tested under inert fluorescence microscopy. Characteristic fusion cells (green) were observed with HPIV3 / GFP infection of treated and untreated RNase L-deficient HeLa M cells with the vector alone or expressing variant (R667A) RNase L. In contrast,
실시예 7 - 밝혀진 RNase L의 활성화제는 연근 세포 증식을 억제한다.Example 7 Revealed RNase L Activators Inhibit Lotus Root Proliferation
클로날 세포주 A10 (DB1X 배아 쥐의 흉대동맥으로부터 유래되고, 연근 세포의 많은 특징적 성향을 가짐)의 증식을 기술된 바와 같이 측색기 셀타이터 96® AQueous (CellTiter 96® AQueous) 세포 증식 검정을 이용하여 측정하였다 (Promega). 이러한 방법에 테트라졸륨 화합물 [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨, MTS] 및 펜아진 메토설페이트 (PMS), 전자 결합 시제를 이용하였다. 세포를 96 웰 배양 플레이트에서 (3 x 104 세포/웰)로 시딩하고, 24시간 동안 상이한 농도의 화합물로 처리하였다. 셀타이터 96® AQueous 시약 (PBS중에 30% v/v 희석), 50 Φ1을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37E C에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 96-웰 플레이트 해독기로 490nm에서 흡광도 측정하였다 (Molecular Devices, model Spectra Max 340). 결과는 연근 세포 증식이 억제됨을 보여주며, 이는 이들 화합물이 재발협착증의 예방을 위한 새로운 부류의 치료제로서 작용할 수 있음을 나타낸다. 화합물 1을 시험하였다.Proliferation of the clonal cell line A10 (derived from the thoracic artery of DB1X embryonic rats and having many characteristic propensities of lotus root cells) using a colorimetric cell titer 96 ® AQ ueous (CellTiter 96 ® AQ ueous ) cell proliferation assay Measured by (Promega). Tetrazolium compounds in this method [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium, MTS] And penazine methosulfate (PMS), an electron binding reagent. Cells were seeded (3 × 10 4 cells / well) in 96 well culture plates and treated with different concentrations of compound for 24 hours. Celta data 96 ® AQ ueous reagent (30% v / v dilution in PBS), was added to each well 50 Φ1. Plates were incubated at 37E C for 2 hours and absorbance measured at 490 nm with 96-well plate reader (Molecular Devices, model Spectra Max 340). The results show that lotus root cell proliferation is inhibited, indicating that these compounds can act as a new class of therapeutics for the prevention of restenosis.
화합물 8 - 화합물 2는 폭스 바이러스 패밀리의 백시니아 바이러스 (균주: 웨스턴 리절브 (Western Reserve (WR)), DNA 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 나타낸다.Compound 8-
실험 프로토콜:Experiment protocol:
바이러스 균주: 웨스턴 리절브 (WR) Virus Strains : Western Reserve (WR)
세포: Cells :
불멸화된 마우스 배아 섬유아세포 (MEF)를 10% FBS 및 p/s가 보충된 RPMI에서 성장시켰다. 새끼 햄스터 신장 (BHK21) 세포 및 아프리카 그린 원숭이 신장 세포 (BSC40)를 10% 소태 혈청, p/s 및 1-glu가 보충된 둘베코 변형된 이글 배지에서 성장시켰다.Immortalized mouse embryo fibroblasts (MEF) were grown in RPMI supplemented with 10% FBS and p / s. Baby hamster kidney (BHK21) cells and African green monkey kidney cells (BSC40) were grown in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% fetal bovine serum, p / s and 1-glu.
역가: 플라그 검정을 위한 BHK21 (새끼 햄스터 신장 세포) Titer : BHK21 (Little Hamster Kidney Cells) for Plaque Assay
MOI: 감염을 위해 혈청 배지를 사용하지 않은 백신니아 바이러스 (웨스턴 리절브) 5 PFU (바이러스 스톡: 1 x 10 9 PFU/ml) MOI : Vaccania virus ( Western Reserve ) 5 PFU without serum medium for infection ( viral stock: 1 x 10 9 PFU / ml )
화합물: 삼중의 0, 25 및 50uM의 화합물 2 Compound :
감염: 24시간 감염 후 각 샘플로부터의 샘플을 수집하였다. Infection : Samples from each sample were collected after 24 h infection.
방법:Way:
MEF (RNase L)RL+/+, MEF (RNase L) RL-/- 및 BSC40 세포를 6웰 플레이트에서 플레이팅시키고, 80-85% 컨플루언트 세포를 혈청 비함유 배지를 사용하여 5PFU/ml에서 백신니아 바이러스 (WR)로 감염시켰다. 45분 후, 세포를 PBS로 세척하고, 세포에 화합물 2를 갖는 새로운 배지를 재공급하였다.Plate MEF (RNase L) RL + / + , MEF (RNase L) RL − / − and BSC40 cells in 6-well plates, and 80-85% confluent cells in 5 PFU / ml using serum free medium. Was infected with Vaccania virus (WR). After 45 minutes, cells were washed with PBS and the cells were reloaded with fresh medium with
24시간 감염 후, 배지를 제거하고, 세포를 PBS중에 스크랩핑하고, 2회 냉동 및 해동시킨 후, 바이러스 역가를 표시인자 세포주인 BHK21 세포에서 측정하였다.After 24 hours of infection, the medium was removed, the cells scraped in PBS, frozen and thawed twice, and viral titers measured in BHK21 cells, an indicator cell line.
플라그 검정:Plaque Black:
BHK21 세포를 12 웰 플레이트에서 플레이팅시키고, 세포의 완전 단일층을 혈청 비함유 배지를 이용하여 상이한 바이러스 희석물로 감염시켰다. 45분 감염 후, 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 2회 세척하고, 아가 배지 [2% 아가로스 + (2x MEM + 20% FBS)의 혼합]로 대체하고, 이틀 후, 아가 배지의 제 2 층을 플라그를 계수하기 위해 0.05% 중성 레드를 첨가하였다.BHK21 cells were plated in 12 well plates and complete monolayers of cells were infected with different virus dilutions using serum free medium. After 45 min infection, the medium was removed, cells were washed twice with PBS, replaced with agar medium [mix of 2% agarose + (2x MEM + 20% FBS)], and after two days, a second of agar medium The layer was added 0.05% neutral red to count plaques.
결과는 도 9, 10, 11 및 12에 도시되어 있으며, 도면의 간단한 설명에 기술되어 있다.The results are shown in FIGS. 9, 10, 11 and 12 and described in the brief description of the drawings.
본 발명은 바람직한 구체예를 기준으로 하여 특정하게 도시되고 기술되었지만, 다양한 형태 및 상세 내역의 변화가 첨부된 청구범위에 포함된 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않으면서 일어날 수 있음이 당업자에게는 자명할 것이다.While the invention has been particularly shown and described with reference to preferred embodiments, it will be apparent to those skilled in the art that changes in various forms and details may occur without departing from the scope of the invention as defined in the appended claims.
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