KR20080096834A - 분자 각인 폴리머의 개선된 제조법 - Google Patents

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Abstract

일 태양은 분자 각인 폴리머(MIP) 입자들의 개선된 제조법을 위한 방법에 관한 것으로서, 불용성 MIP 입자들을 포함하는 최초 조성물들은 특정한 표적 분자와 결합하는 그러한 MIP 입자들로 농축되어, 비결합 및 약하게 결합하는 분자들을 최종 조성물로부터 배출시킨다. 농축은 미립자 물질을 분리할 수 있는 크로마토그래피 방법들의 사용을 통하거나 응집반응의 수단에 의하여 통상적으로 수행된다. 다른 태양은 MIP 입자들의 질량 단위당 수많은 결합 부위들을 노출시키기 위하여 정제되지 않은 MIP 입자들의 확장된 미세화의 이용에 의한 개선된 불용성 MIPs의 제조법이다. 바람직한 실시예들에서, 상기 두 태양들은 조합된다. 생성된 개선된 MIPs는 진단, 분석 및 치료 목적들을 위하여, 그중에서도 위장관 내의 콜레스테롤, 담즙산들 및 담즙산염들과 같은 물질들과 결합할 수 있는 경구 투여 약물들로서 사용될 수 있다.
분자 각인 폴리머(MIP), 중합반응, 주형 분자, 표적 분자, 미세화

Description

분자 각인 폴리머의 개선된 제조법{IMPROVED PREPARATION OF MOLECULAR IMPRINTED POLYMERS}
본 발명은 분자 각인 폴리머들(MIPs)의 제조에 있어서 개선사항들에 관한 것으로서, 특히 본 발명은 분자 각인 폴리머들을 의약품 제조, 그 중에서도 소화관에서의 표적 분자들, 예컨대, 콜레스테롤, 담즙산 및 담즙산염들과 결합하는 의약품 제조에서의 포착제로서 사용할 수 있도록 MIPs의 결합능 및 특이도를 증가시키는 방법에 관한 것이다. 또한 MIPs의 제조의 이러한 개선사항은 상기 MIPs의 특성화의 수단으로 작용한다.
합성 폴리머들의 분자 각인은 분자 주형으로 작용하는 표적 분자가 존재시에 기능성 및 교차 결합 단량체들이 공중합되는 공정이다. 중합반응되기 전에, 기능성 단량체들은 비공유 상호작용들을 통하여 주형과 착물을 형성하거나 공유적으로 결합하여 주형의 가중합성 유도체(polymerizable derivative)를 형성한다. 중합반응 이후에, 단량체들의 작용기들은 고도로 교차 결합된 폴리머 구조에 의하여 제자리에 있게 된다. 이후 용매 추출 및/또는 화학적 절단법(chemical cleavage)에 의하여 주형을 제거하면 표적 분자와 크기 및 형태에서 상보적인 결합 부위들을 드러나게 한다. 이러한 방식으로, 아주 높은 특이도를 지닌 표적과 이제 재결합할 수 있 는 폴리머("분자 각인 폴리머" 또는 "MIP"라고 칭함)에 분자 메모리(molecular memory)가 도입된다.
원래, MIPs는 특히 키랄 분리(chiral separation)로 인하여 HPLC에서 정지상으로 사용되었다. 이후 이들의 사용은 박층 크로마토그래피, 모세관 전기영동법, 고체상 추출 및 면역 측정법 타입 결합 분석법들(immunoassay type binding assays)과 같은 다른 분석 기법들로 연장되었다. 결합 부위들은 종종 항체-항원 시스템들의 친화도 및 선택도에 접근하는 친화도 및 선택도를 가진다. 이러한 모방체들(mimics)은 센서 기술에 대하여 실제 항체들보다 몇 가지 뚜렷한 장점들을 보인다. 고도의 교차 결합 특성으로 인하여, MIPs는 본래 안정적이고 강하여, 산, 염기 또는 또는 금속 이온들이 존재하거나, 유기 용매들에서 또는 고온 고압에서와 같은 극한의 환경들에서의 응용을 용이하게 한다. 또한, MIPs는 생산 비용이 싸며, 상온에서 오랜 기간동안 건조 상태로 저장될 수 있다.
따라서, 원칙적으로 모든 MIPs는 하기의 방식으로 제조된다: 단량체들 및 표적(또는 주형) 분자들이 혼합되며, 자가 조립(self assembly)이 발생하며, 가교제(cross binder)가 첨가되어 중합반응이 개시될 수 있다. 중합반응 이후에 폴리머는 작은 부분들로 나누어지며 표적 분자가 추출된다. MIPs가 표적 분자들의 용액으로 녹아 들어가면 이들은 상기 MIPs와 재결합할 것이다(또한: Yu Cong; Leif Schweitz; and Ioana Warnmark-Surugiu 참조).
MIPs의 제조에서 일반적인 기술적 단계들은 도 1에 개략적으로 도시되어 있다.
MIPs 의 역사
MIP 제조의 최초 예들 중 하나는 염료의 선택적 인식을 위해 실리카 종류(물 유리)를 사용했던 1949 년(Dicky)까지 거슬러 올라간다. 이후 표적들/피분석물들과 특이적으로 결합하는 것이 가능한 네트워크들을 짜는 다른 종류의 자가-조직 체계들(self-organizing systems)이 기술되었다(Ramstroem et al ., Schweitz et al ., and Vlatakis et al .)
단량체들의 선택과 중합반응
1970 년대와 1980 년대에(Shea 1986, Shea 1990 및 Wulff 1987 참조) 지지체(scaffold)를 축조하는데 사용되는 폴리머들과 직접 주형/표적 분자를 공유적으로 결합하는 개념이 기술되었다. 당시에는 직접 결합을 하면 폴리머 전체에 걸쳐서 결합 부위들이 좀 더 균일하게 분포하게 된다는 주장을 하였다. 그러나, 동시에 이는 중합반응 이후에 주형을 제거하는 문제를 남겨 놓았다. 주형을 제거하기 위하여, 폴리머의 미세화 및 화학 결합의 분열 양쪽 모두가 필요하다.
중합반응이 일어나는 동안에 사용된 단량체들 중 하나에 주형을 속박하지 않으면서 MIPs를 제조하면 종종 양질의 MIPs를 생성하지만, 문헌상의 경험으로 본다면 그러한 결합 부위들 중 많은 것들이 분자의 덜 특이적인 부분들에서 주형/피분석물과 결합하는 경향이 있는 결합 부위들을 포함할 것이므로 생성된 MIPs의 원하는 특이도를 부여하지 않는다는 것이다. 이는 특히 분자들의 입체이성질체 형태들을 분리하는 것이 목적이라면 분석 목적을 위하여 사용되는 MIPs에 매우 중요한 반면에, 생성된 MIPs의 전체 결합능을 향상시키는 것이 주된 목적인 경우에는 덜 중 요한 것이다.
특정한 분석 상황들에서, 주형은 상이한 정체성이어야 함이 증명되었는데, 즉, 실제 주형을 사용하는 대신에 생성된 MIPs는 분석되는 표본을 오염시키지 않기 위하여 주형 "모방체들" 상에 축조된다는 것이다. 피분석물 및 MIP 사이에서 특이적인 결합을 확보할 수 있는 주형 모방체를 발견하는 것이 까다로운 일이라는 것은 분명하다.
MIPs를 제조하는 완전히 상이한 방법은 단량체, 가교제들 및 주형(또는 주형 모방체들)이 유탁액에서 미립자 형태로 유지되면서 생성된 MIP를 직접 입자로 남겨두면서 혼합물을 중합하는 것이다(Funke et al .). 이러한 공정으로 제조된 MIP의 입자 크기는 다른 것들 중에서, 단량체 농도 및 교반 속도(유탁액에서 액적(droplet) 크기를 결정한다)에 의존할 것이다. (입자 크기들을 1 ㎛ 이하로 얻기 위하여 용액을 100 rpm보다 초과하여 교반할 필요가 있다). 문헌에 따르면, 이러한 유형의 공정들이 지닌 단점들은 오랜 제조 시간과 낮은 수율이라는 것이다.
일반적으로, 종래 기술은 종종 결합능과 특이도 양쪽 모두가 절충되지 않는(따라서 원하는 것보다 더 낮음) 재생가능한 MIPs를 제조하는데 있어서의 어려운 점들을 기술한다. 지금까지, 종래 기술은 높은 결합능을 지닌 MIP 조성물들을 제조하는 신뢰할 만하고 개연성 있는 방법을 개시하지 않았다(Sellergren 1988).
유용한 입자 크기를 획득
MIPs를 제조하기 위하여 벌크(bulk) 형성 중합 공정이 이용되는 경우에, 높은 가교도(degree of cross binding)를 얻기 위해서는 주형 분자들의 추출이 이루 어질 수 있기 전에 폴리머를 아주 작은 입자 크기들로 미세화하는 것이 요구된다. 미세화를 위한 방법들은 시멘트 산업(㎜ 크기 입자들을 발생시킴)에서 전기 회로용 후막 페이스트(thick film paste) 제조(㎛ 입자 크기 입자들)를 위한 소형 볼 밀들에 이르기까지 매우 상이한 산업 분야들에 이용된다. 미세화 공정이 MIP 관능성(특이도 및 결합능)의 중요한 부분이라는 사실임에도, 실제 선택하는 방법은 대부분의 MIP 문헌에서 상세히 기술되어 있지않은 반면에, 구해진 벌크 폴리머는 MIPs로부터 주형을 추출하기 전에 분쇄되어 채로 쳐진다(정렬된 입자 크기로)라고만 언급되어 있다.
주형 제거
대부분의 문헌에서, 주형 분자들의 제거는 이 공정이 생성된 MIP의 관능성에 중요하다는 사실임에도 집중적으로 기술되어 있지않다. 흔히 상기 공정은 하나 이상의 특이적으로 명명된 용매들을 사용하는 비특이적 세척 절차로서 언급만 되어 있다. 특히 상기 MIP가 예컨대, 피분석물들의 예비 농축(pre-concentration)을 위한 도구로서 고체상 추출(SPE)에의 사용을 위하여 개발된다면, 주형의 잔존 용량들 조차도 MIPs의 이용가능성(usability)를 교란할 것이다. 주형 제거에 사용된 매트릭스로부터 MIP의 분류은 종종 여과법 또는 원심분리법에 의하여 수행된다.
MIPs 를 개선하기 위한 알려진 시도들
미국 특허 번호 제 4,111,863 호는 "광학적으로 활성인 화합물의 잔류물인 구성요소를 가지는 비팽윤성(non-swellable) 3차원 폴리머로서, 본 잔류물은 상기 폴리머로부터 화학적으로 제거할 수 있어 상기 폴리머의 물리적 구조에 광학적으로 활성인 화합물의 상기 잔류물의 크기와 형태에 해당하는 공극(void)을 남겨두고 상기 폴리머의 공극 내에 광학적으로 활성인 화합물의 상기 잔류물의 화학적 구조에 해당하는 작용기들의 특정한 입체 배열은.....""광학적으로 활성인 화합물"은 MIP가 이후에 의도적으로 결합할 수 있어야 하는 주형이다.
미국 특허 번호 제 5,110,833 호에서, "프린트 분자 주변의 단량체들의 배향성, 가교제들의 첨가, 폴리머로의 중합 및 상기 프린트 분자의 이후 제거를 포함하여, 상기 폴리머에 상기 프린트 분자에 해당하는 공동(cavity)를 발생시키는 합성 효소들 또는 합성 항체들을 생성하는 방법"이 주형 분자에 대한 MIP의 특이도를 증가시키는 것으로 청구되어 있다. 즉, 미국 특허 번호 제 5,110,833 호에 청구된 성능 개선사항은 중합반응이 발생하기 이전에 주형 분자 및 단량체 단위들 사이에서의 접촉의 최적화에 기반한 것이다.
미국 특허 번호 제 6,881,804 호에서, MIP 내의 다공성(porosity)의 도입은 주형과의 상호작용을 의도한 공극에의 접근을 증가시켜 MIP의 성능을 향상시키는 수단으로 기술되어 있다.
미국 특허 번호 제 6,638,498 호에서, 특이적으로 선택된 단량체들은 담즙산 특이적 MIPs의 발생을 위하여 청구된 것이며, 미국 특허 공개번호 제 2004/0157209 A1에서는 중합반응 전에 지지체 물질 상에 주형 분자를 고정시키는 것이 제안되어 있다. MIPs의 성능을 개선하기 위한 모든 제안들은 MIP의 제조 이전 또는 MIP의 제조 동안에 발생하는 모든 공정 단계들인 단량체들의 화학적 특성화 또는 MIPs의 축조를 다룬다.
미국 특허 번호 제 5,994,110 호는 주형 분자에 상보적인 구조를 포함하는 작은 폴리머들/올리고머들을 형성하기 위하여 제 위치에서(in situ) 생성되는 MIPs를 개시한다. 폴리머들 또는 올리고머들은 생체분자 주변에서 코팅 또는 이미지(image)를 형성하며, 상기 코팅 또는 이미지는 이로부터 제거되고, 예컨대, 약물과 같은 치료제 또는 예방제들로서 사용될 수 있는 개별 실체들(discrete entities)이 이로부터 유도된다. 이러한 유형의 생성 공정으로 인하여, 미국 특허 번호 제 5,994,110 호는 기존의 MIP 입자 제조법에서 미세화 단계를 이용하지 않는다. 미국 특허 번호 제 5,994,110 호는 비결합제들(non-binders)로부터 MIPs의 분리를 제안하지만, 상기 제안된 방법들은 모두 예컨대, 크로마토그래피를 통하지만 MIPs가 가용성 실체들인 경우에만 생성된 MIPs의 매우 작은 크기에 의존한다. 예컨대, 미국 특허 번호 제 5,994,110 호에 따른 치료적으로 활성인 MIPs는 1 내지 200 kDa 범위의 선단(lower end)에 해당하는 분자량들을 보인 MIPs이라는 것이 특이적으로 지적된다. 또한, 미국 특허 번호 제 5,994,110 호는 현탁된 불용성 MIPs를 한편으로는 "우수한 결합제들" 및 다른 한편으로는 "덜 효과적이거나 비결합제들"로 분리하는 임의의 수단을 개시하지는 않는다.
(발명의 목적)
충분히 높은 결합능을 가진 MIP 조성물들을 제공하기 위하여 가용성 수용체들 및 항체들에 대한 대체제로서 약학적 응용들에 그러한 조성물들이 사용되도록 MIPs를 제조하는 개선된 방법들을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 또한 기존 MIP 조성물들보다 더 개선된 성질들을 가진 MIP 조성물들을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
(발명의 개요)
MIPs의 제조에 기존의 기술을 개선하는 상술된 시도들이 있었음에도, 예컨대, 특정한 표적 분자를 신체로부터 제거하는 것이 치료법의 일부로서 적절한 치료 방법에서 항체들 및 가용성 수용체들에 대한 개연성 있는 대체제로서 임상적으로 사용될 수 있는 MIP 조성물들을 제조하는데 성공한 시도들은 현재까지 없다.
이는 개별적인 MIPs는 주어진 리간드에 대하여 매우 높은 친화도를 가질 수 있는, 예컨대, 미세화된/분쇄된 MIPs로 된 조성물이 리간드에 대하여 다양한 결합 친화도들을 보여서, 전체 결합능이 예컨대, 의약용으로 불충분하거나 부적합하거나 또는 좀 더 단순한 용어들로 부연 된다고 하더라도, 표적 리간드에 대한 알려진 MIP 조성물들의 결합능은 통상적으로 너무 낮아서 MIPs를 치료에 쓰는 가용성 수용체들 및 항체들에 대한 개연성 있는 대체제로서 불가능하게 한다는 사실에 본 발명자들은 원인으로 두고 있다.
본 발명자들은 또한 MIP 조성물의 전체 결합능에 미치는 MIP 입자 크기의 영향에 대한 연구는 거의 없다고 해도 된다는 사실에 중점을 두었다.
따라서 본 발명자들은 주형 또는 주형 유사체에 결합하는 능력에 따라 MIP 입자들을 분류하여, MIPs와 효과적으로 표적 결합하는 상향-농축(up-concentration)을 이루어 MIPs의 성능을 더 개선한다고 가르친다. 그러한 기능적 분류 또는 정제 공정에 의하여, 선택된 주형 또는 유사체에 적당한 결합능을 지닌 공극 또는 공동을 제공하는 MIP 입자들의 일부가 발생될 수 있으며, 따라서 MIP와 주형 사이의 평균 친화도를 개선시켜 MIP의 결합능을 개선하게 된다.
또한, 본 발명자들은 MIP 조성물들의 성능은 단순히 지금까지 이용된 미세화 단계들을 개선시켜 평균 크기가 더 작은 MIP 입자들을 발생시키면 개선될 수 있으며, 이로 인해 결합 부위들 및 부피 사이의 개선된 비율을 보인다는 것을 알게 되었다.
따라서, 제1 태양에서 본 발명은 표적 분자에 대하여 높은 결합능 및 특이도를 가지는 분자 각인 폴리머들(MIPs)을 포함하는 조성물을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은
a) 표적 분자와 결합하고, 표적 분자 또는 그 모방체를 주형 분자로서 사용하여 제조된 불용성 MIPs의 현탁액을 획득하는 단계,
b) 상기 현탁된 MIPs를 상기 주형 분자 또는 그 단편 또는 그 모방체가 포착제(capture agent)로서 사용되는 친화성 정제 절차를 거치게 하는 단계,
c) 상기 친화성 정제 절차에서 상기 포착제와 결합하는 상기 MIPs를 회수하면서 상기 포착제 및 회수된 생성물로부터 상기 포착제와 결합하지 않는 MIPs를 실질적으로 배출하는 단계, 및
d) 상기 조성물을 얻기 위하여 상기 회수된 MIPs 및 선택적으로는 담체, 운반체 또는 희석제와 조합하는 단계를 포함한다.
제2 태양에서, 본 발명은 표적 분자에 대하여 높은 결합능을 가지는 MIPs를 제조하는 방법을 제공하는 것으로서, 상기 방법은 상기 표적 분자 또는 그 모방체로 구성된 주형 분자들을 포함하는 정제되지 않은 MIP를 충분히 작은 MIP 입자 크기를 얻어서 주형 분자들을 제거할 수 있도록 미세화의 제1 단계를 거치는 단계, 실질적으로 모든 주형 분자들을 제거하고 선택적으로는 그렇게 얻어진 MIPs를 미세화의 제2 단계를 거치는 단계를 포함하며, 상기 미세화의 제1 및 선택적으로는 제2 단계가 평균 50 ㎛ 이하의 MIP 직경을 제공한다.
제3 태양에서, 본 발명은 하기 특성들 중 적어도 하나를 가지는 불용성 MIPs의 조성물을 제공한다:
1) 평균 MIP 직경은 20 ㎛ 미만이다;
2) 평균 표적 결합은 적어도 표적의 1 질량 단위 내지 MIP의 10 질량 단위들이다;
3) 조성물 내의 실질적으로 모든 MIPs는 동일한 표적 분자와 결합하고, 선택적으로 상기 조성물은 상기 표적 분자에 대한 모든 결합 부위들을 포함하는 것은 아니다.
제4 태양에서, 본 발명은 심혈관 질병, 고혈압, 죽경화증, 담석증, 담즙정체성 간 질환, 고콜레스테롤혈증, 비만, 및 기생충 또는 박테리아 및 곰팡이와 같은 미생물들로부터 유래한 감염들 또는 구강으로 유입된 독소들로부터 유래한 중독의 치료, 예방 또는 완화를 위한 의약품 제조에 본 발명의 조성물의 사용에 관한 것이다.
최종적으로, 제5 태양에서, 본 발명은 본 발명의 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 피검자에게 투여하는 단계를 포함하는 심혈관 질병, 고혈압, 죽경화증, 담석증, 담즙정체성 간 질환, 고콜레스테롤혈증, 비만, 및 기생충 또는 박테리아 및 곰팡이와 같은 미생물들로부터 유래한 감염들 또는 구강으로 유입된 독소들로부터 유래한 중독으로 구성된 군으로부터 선택된 질병을 치료, 완화시키거나 질병의 위험을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
도 1: 간단한 MIP 제조 절차의 개략도.
도 2: 여기에 기술된 발명의 공정들을 작동시키는 흐름도. 공정들은 필요하다면 수회에 걸쳐서 반복될 수 있다.
도 3, 부분 I:
확장된 베드 흡착(Expanded Bed Absorption)에 의한 정제 또는 분류.
베드 입자에 결합된 콜레스테롤 유사 분자와 같은 주형과 결합하는 MIPs는 머물러 있는 반면에 결합하지 않은 MIPs는 통과하여 폐기된다.
도 3, 부분 II:
관능성 정제된 MIPs.
베드 입자상에 주형 분자와 결합하는 MIPs는 이후 용리되어 배출될 수 있다. 용리된 MIPs는 결합 및 비결합 MIPs를 포함하는 정제되지 않은 MIPs 집합체보다는 더 높은 특이적인 결합능을 가질 것이다.
도 4: 오버레이(overlay) 도면에는 예 4의 MIP 입자들.
오버레이 도면은 가시 백색 광선(visible white light)과 자외선으로 각각 찍혀진 두 개의 도면들로 구성되어 있다. 백색 반점들은 백색광으로 조명된 입자들 을 나타내고 흑색 반점들은 자외선 조명된 녹색 형광 입자들을 나타낸다.
정의
하기에서, 본 발명의 범위를 정확히 이해하기 위하여 많은 용어들이 정의될 것이다.
"분자 각인 폴리머"(MIP)는 중합반응 전에 교차 결합 단량체들을 포함하는 단량체 매트릭스에 포함되는 하나 이상의 주형 분자들에 적어도 부분적으로 해당하는 공동들(또는 공극들)을 포함하는 폴리머이다. 중합반응 이후에 생성된 폴리머는 형태상으로 주형 분자에 해당하는 수많은 공동들을 포함한다. 통상적으로 MIP는 작은 입자들로 나누어져서, 주형의 제거를 용이하게 하고, 주형 분자와 유사하거나 동일한 표적 분자와의 상호작용을 위하여 일부 공동들을 열리게 한다. 본 명세서 및 청구항들에서, MIP라는 용어는 일반적으로 MIP의 미립자 형태를 지칭하며, "MIP" 및 "MIPs"라는 용어들은 MIP 입자 및 MIP 입자들이라는 표현들로 각각 혼용되어 사용된다는 것을 의미한다.
본 발명에 채용된 MIPs는 불용성 분자들/실체들이라는 것을 이해할 것이다. 이러한 MIPs는 그 불용성으로 인하여 이들이 위장관으로부터 신체로 들어오는 것(예컨대 순환으로)을 제한하거나 방지하기 때문에 위장관에서의 사용을 위한 의약품으로 특히 적합하다. 즉, 본 발명에 사용된 MIPs는 경구로 투여되는 경우에, 분변으로 배출되기 전까지 실질적으로 위장관에서 갇혀있을 것이다(confined).
"정제되지 않은(raw) MIP"는 임의의 미세화를 아직 거치지 않은 MIP이며, 따라서 MIP 구조 내의 공동들에 주형 분자들 또는 적어도 주형 분자들에서 유도된 파 편들을 여전히 포함한다.
"미세화"는 주형을 더 작은 분자들로 여전히 포함할 수 있는 MIPs를 격리시키는 공정을 나타낸다. 본 목적에 적합한 임의의 방법이 이용될 수 있다.
"표적 분자"는 본 문맥에서는 MIP와 결합하는 임의의 분자이다.
"주형 분자"는 주로 표적 분자와 동일하지만, 또한 그 모방체일 수 있다(즉, 표적 분자의 3D 구조 및 프로파일과 일치하는 동일한 3D 구조 및 프로파일을 적어도 부분적으로 가지는 분자 - 모방체는 예를 들어, 표적 분자의 단편으로 구성될 수 있다). 주형은 MIP 구조내의 공극들의 "발생자(generator)"로서 작용하여 이후에 이 공극들이 표적 분자와 결합할 수 있다.
"친화성 정제(affinity purification)"는 물질과 결합 파트너 사이의 특이적인 결합이 이용되는 물질의 정제를 위한 임의의 방법을 나타낸다. 많은 그러한 방법들은 물질을 붙들고 있는 고체 지지체(크로마토그래피 매트릭스와 같은)와 결합된 포착제를 이용한다. 업계에 알려진 통상적인 예들은 항체와 결합하는 항원들을 정제하는 크로마토그래피 비드들과 결합된 포착제들로서 항체들을 사용하는 친화성 정제이다. 본 발명에 따라서 적용되는 친화성 정제 방법들은 여기에 기술된 크기들을 가지는 현탁된 불용성 MIP 입자들을 포착할 수 있는 방법들이라는 것을 이해할 것이다. 따라서, 통상적인 친화성 정제 방법은 당업자에게 알려진 확장된 베드 흡착(EBA)일 수 있다.
"고체상"은 본 문맥에서는 공유성 또는 비공유성 결합에 의하여 포착제를 고정하는데 사용될 수 있는 임의의 물질이다. 따라서, 크로마토그래피 물질들의 제조 에서 기존에 사용되는 임의의 물질(플라스틱 폴리머, 설탕, 금속, 유리, 실리카, 고무 등)은 고체상으로 작용할 수 있다. 고체상 물질은 당해 물질에 포착제와 결합하게 하는 적당한 작용기들을 포함할 수 있다. 그러한 유도화된 물질들은 단백질들 및 다른 거대분자들의 크로마토그래피 정제 업계의 당업자에게 알려져 있다. 또한, 고체상은 MIPs와 같은 상대적으로 크며 불용성인 입자들(단백질들과 같은 단일 생체분자들과 비교하는 경우)의 포획을 가능하게 하는 임의의 물리적 형태를 가질 수 있다. 따라서, 고체상은 섬유(바람직하게는 중공된), 크로마토그래피 매트릭스(바람직하게는 EBA에 적합한 매트릭스), 비드들(바람직하게는 전자기 수단에 의하여 분리될 수 있는 것들) 형태이거나 임의의 다른 적당한 형태일 수 있다. 하기 참조.
본 발명에 따른 정제 태양의 실시예들
상술한 바와 같이, 본 발명은 제1 태양에서 표적 분자에 대하여 높은 결합능 및 특이도를 가지는 분자 각인 폴리머들(MIPs)을 포함하는 조성물을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은
a) 상기 표적 분자와 결합하고, 상기 표적 분자 또는 그 모방체를 주형 분자로서 사용하여 제조된 불용성 MIPs의 현탁액을 획득하는 단계,
b) 상기 현탁된 MIPs를 상기 주형 분자 또는 그 단편 또는 그 모방체가 포착제로서 사용되는 친화성 정제 절차를 거치는 단계,
c) 상기 친화성 정제 절차에서 상기 포착제와 결합하는 상기 MIPs를 회수하면서 상기 포착제 및 회수된 생성물로부터 상기 포착제와 결합하지 않는 MIPs를 실 질적으로 배출하는 단계, 및
d) 상기 조성물을 얻기 위하여 상기 회수된 MIPs 및 선택적으로는 담체, 운반체 또는 희석제(고체의 작은 크기 입자들을 포함하는 약학적 조성물들의 제조에 약학적으로 수용가능하며 당업자에게 알려진 담체들, 운반체 및 희석제들 중에서 통상적으로 선택되는 담체들, 운반체 및 희석제들과 같은)와 조합하는 단계를 포함한다.
즉, 본 태양은 표적 분자(또는 표적 분자의 적당한 단편과 같은 그 대용품)에 대하여 원하는 충분히 높은 친화도를 보이는 MIPs의 상향-농축에 의존하지만, 본 태양은 또한 정제하지 않은 원(original) MIP의 비결합 단편들은 그대로 MIP 조성물로부터 제거된다는 결과를 가지며, 이로 인하여 MIP 입자 조성물의 질량 단위당 결합능을 상당한 정도로 증가시킨다. 예 4 및 수반된 도 4를 참조. 본 발명자들은 업계에 알려진 방법들에 의하여 제조된 불용성 MIPs의 첨단 조성물들은 비결합 입자들의 큰 부분을 포함하며, 그러한 임의의 조성물의 질량 단위당 결합능은 비결합제들을 제거하여 극적으로 개선될 수 있다는 것을 최초로 실증한 사람들이라고 믿어진다. 따라서 불용성 MIPs의 임의의 제조법은 본 발명의 제 1 태양이 불용성 MIPs를 제조하는 임의의 알려진 방법, 특히 높은 결합능 및/또는 높은 특이도의 MIP 조성물들을 얻는 수단을 포함하는 그러한 알려진 방법들과 조합될 수 있도록 정제 단계 b)를 거칠 수 있어야 한다는 것을 이해할 것이다.
하기에서, MIP 조성물들에 대하여 설계된 정제 개요들의 다양한 실시예들이 상세히 다루어질 것이다.
제1 군의 정제 개요들의 포착제가 고체상(크로마토그래피 매트릭스와 같은)에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합된다 것을 포함한다 - 즉, 이러한 정제 개요들의 군은 통상적인 크로마토그래피 정제 방법들을 포함한다. 따라서, 크로마토그래피 및 유사한 방법들에 유용한 임의의 물질은 유용하지만, 바람직한 고체상들은 교차 결합된 탄수화물들, 합성 폴리머들, 금속 입자들 또는 그 조합들의 매트릭스들이다.
정제 개요들의 제2 및 동등하게 중요한 군은 포착제가 가용성 화학적 실체로 구성되거나 그 일부(예컨대, 응집반응(agglutination)에 의한 정제를 가능하게 하는, 하기 참조)인 정제 개요들이다. 이것의 바람직한 실시예들은 포착제가 가용성 화학적 실체당 다수의 포착제들을 노출시키기 위하여 덴드리머(dendrimer), 치환된 탄수화물 및 폴리비닐 알코올 및 폴리에틸렌글리콜과 같은 치환된 가용성 폴리머로부터 선택된 모이어티와 공유적으로 또는 비공유적으로 결합되어 있는 실시예들을 포함한다.
어떤 정제 개요들이 선택되는지의 여부에 관계없이, 본 발명의 제1 태양의 몇몇 실시예들은 주형 분자와 결합할 수 있는 단계 a)에서 정의된 MIPs의 결합 부위들의 일 부분만 결합하는 포착제를 가지는 실시예들을 포함한다. 더 간단히 말하자면, 이러한 실시예는 원하는 결합 특이도 또는 결합 친화도를 가진 MIPs만이 정제 공정에서 머물러 있는 반면에, 비특이적 또는 약한 결합 부위들을 가지는 그러한 MIPs는 정제에서 배출된다는 것이다.
정제 공정에서 비특이적 결합 부위들을 배출하는 일 방식은 친화성 정제에서 포착제의 사용을 포함하며, 상기 포착제는 주형 분자의 단편이다. 이러한 접근법을 선택하여, MIPs와 결합하기 위하여 다른 분자들과 경쟁할 수 있는 주형 분자의 부분들을 상기 포착제에서 생략하는 것이 가능하다. 이는 표적 분자가 적합하지 않은 표적들과 결합하게 될 MIPs를 생성할 수 있다고 추정하는 교차-반응 결합 부위들을 포함하는 경우들에서 특히 실용적이다. 그 예로서: 예를 들어, 황체 형성 호르몬과 결합하는 MIP 조성물을 제조하고자 한다면, 황체 형성 호르몬(LH), 여포 자극 호르몬(FSH), 갑상선 자극 호르몬(TSH) 및 인체 융모 성선 호르몬(hCG)의 α-서브단위들(α-subunits)이 동일하기 때문에, 주형에서 이 분자의 α-서브단위들을 배출하는 것이 적절할 것이다.
이러한 접근법에 대한 대안은 포착제의 일 부분의 MIPs에 실질적으로 노출을 피하기 위하여 가능하다면 고체 표면 또는 모이어티에 특이적인 배향성으로 결합되어 있는 주형 분자 또는 그 모방체 또는 그 단편을 포함하는 셋업(setup)을 이용하는 것이다 - 따라서, 상기 포착제를 선택된 관능성에서 그 고체 지지체 또는 모이어티와 결합시켜 상기 결합된 포착제의 배향성이 그 모든 결합 파트너들에 대하여 실질적으로 동일해 지는데, 이는 상기 포착제의 일부가 상기 MIPs과의 결합에 접근할 수 없을 것이며 따라서, 상기 포착제의 접근할 수 없는 부분과 결합할 수 있는 MIPs는 전체 정제 절차에서 가려내질 것이다. 따라서 그러한 정제 방법의 산물은 MIP 입자들의 조성물일 것이며, 상기 조성물 내의 실질적으로 모든 MIP 입자들은 특정한 표적과 결합하지만, 상기 표적의 적어도 하나의 결합 부위는 상기 조성물 내의 MIP 입자들에 의하여 결합되지 않는다.
또한, 상기 포착제 및 상기 MIPs 사이의 결합을 제한하려는 요구 또는 뚜렷한 장점 또는 필요성이 없는 경우에, 본 발명의 정제 방법은 포착제가 비특이적인 배향성으로 고체 표면 또는 모이어티(적용 가능하다면)에 결합된 주형 분자 또는 그 모방체 또는 그 단편을 포함하여 포착제의 실질적으로 모든 부분들이 MIPs에 노출되는 그러한 정제 방법이다.
포착제가 고체 지지체에 결합되어 있는 경우에는, 친화성 정제 절차는 포착제들을 고체 표면과 결합시키는 단계에 의존하는 임의의 유형의 적당한 정제 기술로부터 선택될 수 있다. 그러나, 정제 절차는 확장된 베드 흡착(EBA), 상자성 비드 분리(paramagnetic bead separation) 및 중공 섬유 정제로 구성된 군으로부터 선택된다.
확장된 베드 흡착(EBA)
칼럼 내에 팩 베드(packed bed)를 사용하는 기존의 크로마토그래피 방법들은 주로 입자들이 베드의 정적 공극(static void) 내에 비특이적으로 트랩되는 경향성으로 인하여 미립자 물질을 분리하는데 이용될 수 없다.
EBA에 적용되는 주 원리는 "고체상"이라고도 칭하는 크로마토그래피 매체를 유동화하는 것으로서, 설명한 바와 같이 입자들이 칼럼을 통과하도록 한다. EBA 기술을 이용하는 장점들은 대부분의 경우에 단백질 또는 펩티드인 가용성 물질을 정제하지 않은 물질로 칼럼에 적용하기 전에 여과법 및 원심분리법과 같은 예비-칼럼 제거 단계들 없이도 원료 피드 스탁(crude feed-stock) 또는 세포 배양액으로부터 가용성 물질을 정제하는 가능성에 대하여 기술되어 왔다(van Reis & Zapata; Lhihme et al.). 그 착상은 세포 파편 및 침전물들과 같은 불용성 또는 미립자 물질은 베드의 고체상에 표적 분자들을 결합시킴과 동시에 세척되어 진다는 것이다. 이러한 방식으로, 본 공정들에 드는 시간과 비용이 절감되어, EBA를 수많은 분자들의 정제를 위한 경제적으로 추천할 만한 귀중한 기술로 만들었다. 그러나, 베드가 확장된다면 베드의 정적 공극의 증가된 부피로 인하여 미립자 물질이 통과하게 되어 베드의 고체상과 적절히 접촉하게 되고 이후 필요하다면 결합하여 당해 미립자 물질과 베드의 고체상 사이의 친화도가 달성된다. 이런 경우에 EBA는 세포들 및 다른 미립자 물질의 선택에 사용될 수 있으며(Ujam et al.), 말초 혈액으로부터 단핵구들이 정제되지 않은 혈액 세포들과 혼합된 바이오틴화(biotinylated) 항-CD14 항체를 사용하여 분리되며 이후 베드 입자들에 스트렙타비딘이 공급되는 EBA 시스템을 적용하였다는 것이 또한 보여지다.
본 발명자들은 유사한 방식으로 MIP 기술에 의하여 제조된 그러한 입자들은 EBA 시스템의 고체상 또는 베드 입자들이 상기 MIP를 제조하는데 사용된 주형과 유사하거나 동일한 화학적 구조를 노출시킨다면, EBA에 의하여 분류되거나 정제될 수 있음을 결론 내렸다. MIP 입자들은 EBA 시스템의 유동 부분의 흐름과 함께 수송된다는 것이 중요할 수 있는 것과 같이, 베드 입자들이 상대적으로 불변인 확장된 부피에서 유지되는 동안, 유동화 공정에서 베드-결합된 MIPs로부터 결합되지 않은 MIPs를 분리하기 위하여 상대적으로 고밀도(> 2 g/㎖)인 베드 입자들은 아마도 뛰어날 것으로 판명될 것이다. 그러한 고밀도 비드들의 예는 Ujam et al.에 기술되어 있다. 비다공성이거나 제한된 기공도를 보이는 베드 입자들이 또한 바람직하다. Chase infra 참조. 콜레스테롤 또는 담즙산과 같은 주형은 바람직하게는 주형 분자의 구조 및 화학적 특성들을 최대한 노출시키는 배향(들)로 베드 입자들과 결합되며, 0.2 내지 50 ㎛ 범위의 바람직한 크기(하기 참조)를 지닌 제조된 MIPs는 유동화 베드에 적용되며, 적당한 반응 시간 이후에 바람직하게는 결합하지 않은 MIPs를 포함하는 유동상의 재순환을 이용하여 결합되지 않은 MIPs는 예컨대, 유속을 올리거나 단순히 깨끗한 세척 완충제를 EBA 시스템에 적용하여 세척되고 흐름을 폐기물로 이끌어 낸다. 결합된 MIPs는 가용성 주형을 적용하고, 열 및 이온 강도를 증가시키거나 물리적 응력을 베드에 가하여 베드 입자들로부터 방출될 수 있다. 전술한 바와 같이 비다공성이거나 제한된 기공도를 보이는 베드 입자들을 사용하는 것도 가능하다(Chase 참조).
베드를 확장하거나 베드를 통과하여 유동화하는 것에 대한 대안으로서, 베드는 기계적 교반, 회전 혼합(end-over-end mixing), 흔들기, 초음파 및 다른 대류/질량 수송 증가 방법들에 의하여 확장될 수 있다. 베드 입자들과 결합된 MIP 입자들의 분리는 이후 유동 통과상(flow-through phase)을 거쳐 베드의 적절한 유동화에 의하여 이루어질 수 있다. 또한, 결합된 MIPs 및 결합되지 않은 MIPs는 밀도, 크기, 형태, 광확적 성질의 차이들에 의하여, 원심분리법, 침강법, 여과법, 포착 또는 크기 및/또는 중량, 밀도, 형태, 색채, 광 방출, 광 산란, 확장 계수에 따라 분리하는 다른 수단에 의하여 분리될 수 있다.
따라서, 정제의 선행 기술에서 기술된 바와 같이, 입자들은 EBA에 의하여 분류되거나 정제될 수 있으며, 본 발명에 따라서 이는 EBA 시스템의 고체상 또는 베 드 입자들이 상기 MIP를 제조하는데 사용되는 주형과 유사한 화학적 구조를 노출시킨다면 MIP 기술에 의하여 제조된 입자들에 유리하게 적용될 수 있다.
자성 입자들과 결합하여 분리
Dynal(Invitrogen) 및 다른 회사들은 통상적으로 단백질, 펩티드 또는 DNA인 가용성 분자들의 정제를 주로 하기 위하여 상자성 비드들을 사용하는 기술들을 개발하였지만, 예컨대 상기 상자성 비드 상에 고정된 항체와 특이적으로 결합하여 세포들 및 세포소기관들의 분리도 제시되었다. 크기가 더 큰 M450 비드들(450 ㎛)은 세포들과 같은 미립자 물질의 분리에 추천된다. 포착 분자를 지니는 상자성 비드들을 거친 이후에, 주로 세포 상의 막 단백질에 대하여 특이적인 항체 및 예컨대, 세포 또는 다른 미립자 물질과 같은 표적은 적절한 시간 동안 접촉하며, 상기 항체를 통하여 세포와 이제 결합하는 상자성 입자들은 표본 용기에 자기장을 가하여 고정된다. 결합되지 않은 세포들은 상자성 비드들이 고정되어 있는 경우에 세척되어 나가고 자기장이 제거되는 경우에, 상자성 입자들이 방출될 것이다. 이러한 비드들은 예컨대, MIP 합성의 주형 분자와 같은 항체 또는 다른 포착 분자와 결합하는데 사용될 수 있는 토실(tosyl), 에폭시, 카복시 및 아민과 같은 다른 종류의 활성화를 지닌 비드들을 Dynal사로부터 상용 구입가능하다.
콜레스테로 또는 담즙산과 같은 주형들을 그러한 자성 입자 주형과 결합시켜, 반응성이 있는 MIPs는 상기 입자와 결합할 것이며, 특이적인 막 단백질을 지닌 세포들이 분리될 수 있는 것과 동일한 방식으로 자기장을 가하여 세기가 더 약한 주형 결합 또는 비결합 MIPs로부터 분리될 수 있다.
응집반응에 의한 분리
응집반응은 분자들 및 입자들 또는 세포들이 변화된 용해도 또는 현탁 성질을 지닌 네트워크들의 형성과 다가성 상호작용(multivalent interaction)을 성립한다면 발생하는 현상으로서, 예컨대, 네트워크들은 광학적 성질의 변화 또는 현미경으로 검출될 수 있는 결과를 가진다. 응집반응은 신속한 현장 검사(point of care test)들에서 진단 목적을 위하여 주로 이용된다. 예컨대, 적혈구들 사이에서 교차결합을 촉진하는 가용성 성분은 종종 이가(divalent) 또는 다가 항체들(Pla et al.), 렉틴 또는 이러한 응용에 특이적인 항원(Rogers et al .)이다.
예컨대, 콜레스테롤 또는 담즙산들이 공급되는 덴드리머 구조들과 같은 다수의 주형 또는 주형 유사체 분자들을 노출시키는 가용성 분자들은 예컨대, 기계적 교반, 회전 혼합, 흔들기, 초음파, 유동상 흐름 등에 의하여 유동화되거나 현탁액으로 있는 MIPs의 집합체에 적용될 수 있다. 주형 반응성 MIPs는 예컨대, 덴드리머 상에서 노출된 주형 분자들과 상호작용할 것이며, 바람직하게는 덴드리머 구조를 노출시키는 주형이 가교제로서 작용할 네트워크를 형성한다.
결합되지 않은 MIP 입자들은 밀도, 크기, 형태, 광학적 성질에서 뚜렷한 차이들로 인하여, 원심분리법, 침강법, 여과법, 유동세포 계수법, 포착 또는 크기 및/또는 중량, 밀도, 형태, 색채, 광 방출, 광 산란, 확장 계수에 따라 분리하는 다른 수단에 의하여 응집물 또는 네트워크에 포함된 MIP 입자들로부터 분리된다. 이후, 주형 반응성 MIP 입자들은 응집물 또는 네트워크에 열, 유기 용매, 흔들기와 같은 응력을 가하거나 가용성 주형을 과량으로 가하여 단일 입자들로서 추출된다.
MIPs 의 미세화와 관련한 실시예들
콜레스테롤 특이적인 MIP를 제조하기 위해 종래 기술로 시도한 이전의 시도에서, 결합능은 MIP 1 g당 17 ㎎ 콜레스테롤로 제한되었지만, 동일한 방식으로 제조된 비각인 MIP는 MIP 1 g당 13 ㎎ 콜레스테롤과 결합하였다(Sellergren 1998). 다른 시도에 의하여 MIP 1 g당 1 ㎎ 콜레스테롤 미만의 훨씬 낮은 결합능을 구하였다(Whitcombe 1995).
본 발명자들은 만족스러운 결합능들을 얻는데 이러한 선행 기술의 문제점들을 MIP 입자 조성물들에서 효과적인 결합제들을 농축하지 못한 결과로 보고 있다.
MIP 상에 주형 결합능에 대한 가장 간단한 모델은 순수한 면적 고려사항이다. MIP 입자 표면적의 함수로서 주형(예컨대, 콜레스테롤)이 차지하는 면적은 입자 크기 및 결합 효율(단일 주형들이 차지하는 MIP 표면적의 백분율)에 대한 요구 사항들(demands)을 측정하는 지침(guide)으로서 사용될 수 있다.
이론적 고려사항들:
결과들에 나타난 하기의 계산 예는 구형 폴리머 입자상의 주형 콜레스테롤을 이용한 것이다. 콜레스테롤은 16 Å(1.6 ㎚)의 분자 직경을 가지는 것으로 가정한다.
표적(콜레스테롤)이 차지하는 면적 A는 원으로 여겨질 수 있다. 그 면적은 하기와 같이 주어진다.
AT = πxrT 2 (rT는 표적의 분자 반경이다)
구(MIP 입자)의 면적은 하기와 같이 주어진다:
AMIP = πxdMIP 2 (dMIP는 MIP 구의 직경이다)
충분한 양의 콜레스테롤과 결합하는데 얼마나 많은 MIP(질량)가 필요한지를 평가하기 위하여, 사용된 폴리머의 밀도가 필요하다. 선택된 밀도는 또한 특정한 제한을 받을 것이다.
MIP의 결합능은 주어진 MIP의 질량(mMIP)에 의하여 결합될 수 있는 표적의 질량(mT)이다:
Figure 112008065491018-PCT00001
CA는 표적이 MIP 표면상에 차지하는 면적(covered area)을 나타낸다.
이는 하기와 같이 더 단축될 수 있다:
Figure 112008065491018-PCT00002
- 수학적 용어로 상기 식은 하기와 같은 직관적으로 예상되는 결과들을 제공한다:
● 표적 크기가 작을수록 더 큰 결합능을 제공한다
● MIP 입자가 작을수록 더 큰 결합능을 제공한다
● MIP 밀도가 작을수록 더 큰 결합능을 제공한다
개별 입자들 사이의 결합 속성들에 대한 MIP 입자 표면의 기술
통상적으로 50 mM인 첨가된 주형 분자들이 중합반응 전에 전체 부피에 걸쳐 서 균일하게 분포된다고 가정하면, 입자 크기의 함수로서 MIP 입자에서의 주형 분자들의 이론적 숫자가 계산될 수 있다. 주형 분자들의 숫자, 따라서 예컨대, 분말 입자인 주어진 부피에서의 가능한 결합 부위들의 숫자는 주어진 표준 편차를 사용한 정규 분포로 기술될 수 있다. 이론적으로, 이는 일 입자상의 두 개의 부위들 사이의 표준 편차는 하기와 같이 주어진다는 점에서 입자들의 편차에 영향을 주지 않을 것이다:
Figure 112008065491018-PCT00003
여기서 Δr은 두 개의 부위들 사이의 실제 거리이며,
Figure 112008065491018-PCT00004
는 두 개의 결합 부위들 사이의 주어진 중간 거리로서 입자 내의 주형 분자들의 분포에 의하여 결정된다. n은 각각의 입자상의 결합 부위들의 숫자를 나타낸다. Δr -
Figure 112008065491018-PCT00005
및 n 양쪽 모두는 입자 크기가 감소하면 감소하므로, sx는 입자의 미세화에 의하여 변하지 않는다. 입자당 평균 1 미만의 주형 분자가 있는 것과 같이 입자가 10-8 m 미만의 아주 작은 경우에만(표 1 참조), 입자들에서 큰 비유사성이 존재할 것이다. 실제적으로 이러한 비유사성은 추측하건대 "상향으로(upwards)""퍼져서" 10-8 m를 초과하는 입자들도 포함할 것이지만, 입자 크기가 증가하면 줄어들 것이며, 결합 부위들이 많은 더 큰 입자들의 경우에는 중요하지 않게 된다.
반면에, 주형 분자들의 배향성은 비유사성을 낳게 될 것이다. 주형 분자의 종방향이 입자상에서 수직으로 배향된다면, 수직 위치의 주형 분자가 그 자신의 종축 주위로 회전하다 하더라도, 다른 결합 부위들을 발생하지 않을 것이라고 가정한다는 점에서 원칙적으로 두 방향의 배향성만 가진다. 그러나, 주형 분자의 종방향이 입자 표면과 평행으로 배향된다면, 주형 분자가 그 자신의 종축 주위로 회전하는 경우에 무한히 많은 다른 결합 부위들을 발생할 수 있다. 즉, 이러한 상황에서 자유도의 숫자(주형 분자들이 차지할 수 있는 가능한 위치들)는 무한대이며, 종축 주위로 회전하는 결과로서 각각의 새로운 배향성은 원칙적으로 다른 모든 결합 부위들과 비유사한 결합 부위를 발생할 것이다. 전체적으로, 이는 주형 분자의 배향성은 무한한 수의 다른 결합 부위들을 발생한다는 것을 의미한다.
이러한 결합 부위들은 주형 분자에 결합하는 그 결합 상수 Kd에 의하여 특징될 수 있다. 몇몇 배향성들은 비록 서로 다르다 하더라도, 동일한 Kd를 지닌 결합 부위들을 분명히 발생할 것이지만, 하기로부터 명백해 지는 것과 같이 아주 다른 Kd의 결합 부위들도 있을 것이다.
결과 및 평가
표 1은 하기사항을 보여준다
● 0.9 ㎚ 두께의 구형 껍질에서 입자의 크기 함수로서 주형 분자들의 이론적 숫자 계산
● 발견될 것으로 예상될 수 있는 결합 부위들의 전체 숫자 계산
● 높은 친화성 결합 부위들의 예상 숫자 계산
말단의 두 칼럼들에서의 숫자들은 공개된 관찰들(Kempe and Mosbach 1991, Ramstroem et al 1994, 1996 I and 1996 II, Liu, Mosbach 1997 and 1998, Andersson et al 1995)에 근거하여 계산된 것이다. 구형 껍질의 두께는 예컨대, 콜레스테롤(Davidson and Hayes, 2002)과 같은 1.8 ㎚의 길이를 가지는 분자가 가지는 것으로 추측되는 동적 부피의 반경으로 선택된다. 통상적으로 MIPs는 MIPs 1 그램당 20 μmol 결합 부위들을 포함하지만(Kempe and Mosbach 1991, Ramstroem et al 1994 and 1996 I, Liu and Mosbach 1997 and 1998), 결합 상수들(Kd)에서의 편차는 10-3 내지 10-9 M에 이를 만큼 매우 큰 것으로서, 이는 상기 언급된 가정들과 일치하는 것이다; 높은 친화성 결합 부위들의 점유율(share)은 통상적으로 결합 부위들 전체 숫자의 1 % 미만을 차지한다(Ramstroem et al 1996 II, Andersson et al 1995). 예를 들어, 다른 코르티코스테로이드들(예컨대, 콜레스테롤과 구조적 유사성을 보이는 분자들)에 대한 MIPs를 기술한 Ramstroem et al 1996 II는 높은 친화성 결합 부위들(< 10-6 M)의 점유율은 각각 0.075 % 및 0.28 %이라는 것을 밝혔다. 표 1에 대한 계산에서, 높은 친화성 결합 부위들의 숫자는 0.5 %인 것으로 추정된다. 여기에 언급된 항목들에서, 입자 크기는 통상적으로 25 ㎛이다. 이 크기는 폴리머를 손으로 분쇄하는 막자 사발에서 처리하여 상대적으로 용이하게 구해진 것이다.
얇은 구형 껍질에서의 입자 크기 함수로의 결합 부위들의 숫자 기술
입자 직경(m) 50 nM 주형을 사용한 0.9 ㎚ 구형 껍질 내의 주형 분자들의 숫자 구형 껍질 내의 예상되는 결합 부위들의 숫자 구형 껍질 내의 예상되는 높은 친화성 결합 부위들의 숫자
1.0E-04 1.0E-05 5.0E-06 1.0E-06 5.0E-07 1.0E-07 1.0E-08 847,784,740 8,476,474 2,118,737 84,627 21,119 833 7 373,025,285 3,729,649 932,244 37,236 9,292 366 3 1,865,126 18,648 4,661 186 46 2 0
실제적으로, 10 ㎛ 입자를 사용하여 달성될 수 있는 결합 부위들의 최대 숫자는 3백70만 개인 것으로 나타났다(표 1). 10 ㎛ 입자가 1 ㎛ 입자들로 분말이 되면, 각각의 새로운 1 ㎛ 입자는 37,000 개의 결합 부위들을 가지게 될 것인데, 즉, 원 10 ㎛ 입자의 1 %에 해당한다. 원칙적으로, 10 ㎛ 입자로부터 결합 부위들은 100 개의 새로운 1 ㎛ 입자들 상에 그렇게 분포된다. 가능한 다른 결합 부위들에서 큰 숫자가 있는 것처럼, 새롭게 생성된 1 ㎛ 입자들에서는 편차들이 있기 나름인데, 이는 그들 각각이 10 ㎛ 입자상에 존재하였던 '비유사한' 결합 부위들 중 단지 1 %만 포함하기 때문이다. 높은 친화도인 결합 부위들의 일부만 즉, 전체 숫자의 0.5 %만 사용된다면 동일한 결과가 달성된다. 그러나, 이후 결합 부위들의 숫자가 더 작아짐에 따라, 결합 부위들이 거의 없는 결과(1 절에서 기술됨)는 아마도 개별 입자들 사이의 비유사성에 더 기여하게 될 것이다.
입자에서 '구멍(hole)'이 결합 부위로 정의되는 경우에 대한 제한은 이론의 여지가 있지만, 10-5 M를 초과하는 Kd를 지닌 결합 부위들은 치료적 응용을 위해 사용되는 적합성이 거의 없다. 미국 시장에서 의약품으로 승인된 단일클론성 항체들은 10-7 M 미만의 Kd 수치들을 가진다(Carter 2006).
입자들 내의 주형 분자들의 분포(수반된 표준 편차로 주어짐)는 또한 중합반응이 일어나는 동안의 혼합물의 온도, 점성도, 주형 분자의 크기, 용매 및 다른 단량체들과의 상호작용과 같은 매개변수들에 의존할 것이지만, 이러한 매개변수들은 위치와 배향성을 기술하려고 여기에 사용된 평가와 동일한 방식으로 보편적이지 않다. 우리 견해로는 이러한 공정 매개변수들을 사용하면 분말 입자들 사이의 비유사성들을 촉진하는데 적절할 것이다.
상술한 바와 같이, 자유도의 숫자는 개별 주형 분자의 위치를 배타적으로 의미한다; 주형 분자의 배향성과 연결된 자유도의 숫자는 아마도 높고 낮은 친화성 결합 부위들의 분포를 직접적으로 반영한다. 우리는 높은 특이도 및 결합능의 입자 조성물들을 생성하려고 하기 때문에, 분리에서 적당히 높은 엄격한 기준을 사용할 것이며, 이는 분류되고 선택되는 높은 친화성 결합 부위들이 될 것이다. 즉, 적절한 높은 친화성 결합 부위들의 숫자가 어느 정도의 크기에 이르는 경우, 또한 비유사성에 결정적으로 기여하는 이러한 매개변수(숫자)는 말하기 어렵지만, 적당히 추산하면 아마도 약 1 ㎛이다.
입자의 외부 표면상에서 즉시 필요로 하는 것보다 더 많은 결합 부위들을 노출 시키기를 원한다면, 유체가 충분히 넓은 채널들을 통해서 유속에 제한받지 않으면서 흐를 수 있도록 충분히 넓은 채널을 지닌 아주 단단한 입자들을 생성하는 방법들이 있다. 본 방법은 Poros TM 매트릭스들로 알려진 크로마토그래피 시스템들(예컨대, Applied Biosystem이 공급)에 이용되며, 입자들을 통하여 흐르는 유체의 흐름이 입자들을 둘러싸는 유체의 흐름과 동일하기 때문에, 이것이 분해능(resolution)에 영향을 주지않고 빠른 흐름을 흘려보내는 것이 가능하다. 크로마토그래피에 대한 좀 더 전통적인 매트릭스들에서(즉, HPLC는 아님) 상기 흐름은 개별 매트릭스 입자로의 확산 속도에 제한받는다.
콜레스테롤 또는 담즙산 결합 MIPs와 접촉을 증가시키기 위하여 장관의 연동운동을 이용하고자 한다면, 채널들이 있는 입자들이 장점일 수 있다. 겔이 사용된다면, 장액의 '교환"은 아마도 겔 속으로의 확산 속도에 제한될 것이다. 주로 포도당이 특이적인 부위와 결합하는 경우에 겔 개방에 의하여 작용하는 약물 방출 시스템들(예컨대, 인슐린 방출)의 목적을 위하여, MIPs 겔들이 생성되어 왔다. 이는 겔 구조를 지닌 MIPs를 생성하는 것도 실제적으로 가능하다는 것을 입증한다(Wizeman and Kofinas 2001, Seong et al 2002).
미세화 태양의 실제적인 실행
따라서, 상기에서 밝혀진 바와 같이, 본 발명의 제 2 태양은 표적 분자에 대하여 높은 결합능 및 특이도를 가지는 MIPs를 제조하는 방법을 포함하는 것으로서, 상기 방법은 상기 표적 분자 또는 그 모방체로 구성된 주형 분자들을 포함하는 정제되지 않은 MIP(즉, 주형의 실질적 추출 또는 MIP 구조의 미세화가 아직 실행되지 않은 중합된 교차 결합 MIP)를 충분히 작은 MIP 입자 크기를 얻어서 주형 분자들을 제거/추출할 수 있도록 미세화의 제1 단계를 거치는 단계, 실질적으로 모든 주형 분자들을 제거/추출하고 선택적으로는 그렇게 얻어진 MIPs를 미세화의 제2 단계를 거치는 단계를 포함하며, 상기 미세화의 제1 및 선택적으로는 제2 단계가 평균 25 ㎛ 정도의 MIP 직경을 제공한다. 따라서, 이러한 접근법을 이용하여 부피 및 노출된 결합 부위들 사이의 우수한 비율을 지닌 MIPs가 구해진다. 원하는 작은 MIP 입자 크기를 얻기 위하여, 주로 제 1 미세화 단계만을 이용해도 충분하며 (그리고 가장 간단한데), 이렇게 하면 주형 분자들이 제거될 수 있기 때문이지만, 주형 제거 단계에 의하여 분리되는 2 회의 미세화 단계들을 거치면 MIPs로부터 주형의 분리가 용이해지는 상황들을 상상할 수 있다.
미세화 단계(들)을 거친 이후에, MIP 평균 직경은 15 ㎛ 미만, 10 ㎛ 미만, 5 ㎛ 미만, 1 ㎛ 미만, 900 ㎚ 미만, 800 ㎚ 미만, 700 ㎚ 미만, 600 ㎚ 미만 및 심지어 500 ㎚, 400 ㎚, 300 ㎚ 및 200 ㎚ 미만과 같이 20 ㎛ 미만이 바람직하다.
적어도, 미세화를 거친 이후에 주어진 조성물 내에서의 MIPs는 직경이 50 ㎛를 초과하는(직경이 40, 30, 20, 10 또는 1 ㎛를 초과하는 것과 같이) 입자들을 실질적으로 포함하지 않는 것이 바람직하다.
미세화는 MIPs의 크기를 최소화하는 임의의 적당한 방법, 즉, 분쇄, 밀링, 폭발, 해머링(hammering), 볼 밀링, 동결 마쇄(cryo grinding) 및 충돌 파쇄(collision homogenization)뿐만 아니라 그러한 방법들의 임의의 조합과 같은 방법들에 의하여 이루어질 수 있다.
본 발명의 매우 중요한 일 실시예는 본 발명의 제1 및 제2 태양들의 조합, 즉, 본 발명에 따라서 작은 MIP 입자 크기로의 미세화를 포함하는 MIPs의 제1 제조 이후에 본 발명의 제1 태양을 토론하는 중에 상세히 설명된 친화성 정제 개요들과 같은 제1 및 제2 태양들의 조합을 포함한다는 것이 상기로부터 명백해 질 것이다.
대부분의 경우에, MIPs는 크로마토그래피 시스템들에서 분석 목적을 위하거나 센서들에서의 단백질 치환물들로 사용되어 왔다. 그러한 응용들에서 MIP 입자의 크기는 주로 25 내지 100 ㎛ 범위에 있다. 상술한 바와 같이, 이러한 MIP 크기들은 예컨대, 경구 사용과 같이 MIP 조성물로 목적하는 경우에, 너무 커서 원하는 결합능을 얻을 수 없으며, 또한 이러한 큰 MIPs는 기존의 세포 정제 방법들을 이용해서 선택/정제될 수 없다.
따라서 적당한 결합능을 얻기 위하여는 MIP 입자의 크기가 중요하다. 상기에 따르면, 주어진 MIP 질량의 결합능을 증가시키는 가장 간단한 방법은 부피 대 표면적 비율을 증가시키는 것, 즉, MIP 입자들을 더 작게 하고/하거나 "활성" 표면적(원하는 피분석물과 결합할 수 있는 MIP의 표면적)을 늘리는 것이다. 부피 대 표면적 비율은 직경과 반비례하여 증가한다, 즉 직경을 반으로 줄이면 부피 대 표면적 비율은 2 배가 된다. 이는 MIP의 질량 단위당 입자 직경을 25 ㎛에서 0.4 ㎛로 감소시키면 결합능에서 64 배의 증가를 얻을 수 있음을 의미한다.
입자 직경의 함수로서 부피 대 표면적 비율의 증가. 상기 증가는 25 ㎛의 입자 직경을 기준으로 한다(indexed).
입자 직경(㎛) 지수
25.0 12.5 6.3 3.1 1.6 0.8 0.4 0.2 1 2 4 8 16 32 64 128
직경이 0.5 ㎛ 범위에 있는 MIPs는 주형 결합된 베드 입자들을 사용하는 EBA 시스템에서의 기능적 선택/정제에 의한 결합능(표면적 결합 분율)에 대하여 더 최적화될 수 있음이 본 발명에 따라 고찰된다. 본 발명의 제1 태양의 상기 토론을 참조. 그러한 MIP 입자들은 EBA 시스템들에서의 표면 특징들에 의하여 분리되는 것으로 알려진 세포들과 동일한 크기 범위에 있다. 원하는 작은 입자 크기에 이르기 위하여, 상이한 크기 간격들(size intervals)에 적합하게 최적인 상이한 방법들로 인하여 한가지 초과의 방법들을 이용하여 분쇄/밀링하는 것이 필요하다. 하기 참조.
벌크 폴리머로부터 원하는 입자 크기를 구하기 위하여, 하나 이상의 분쇄 방법들을 이용하는 것이 종종 필요할 것이다. 모든 폴리머들을 ㎜ 크기에서 ㎛ 이하의 크기로 보편적으로 밀링할 수 있는 기술은 현재 존재하지 않는다.
폴리머와 융합될 수 있는 수팽윤성(water sweallable) 물질들을 삽입하여(intercalating) 크기를 줄이고 습식 및 동결 방법(예컨대, Cryo-GrindTM 기술)을 이용하면 폴리머를 아주 효과적으로 ~200 ㎛의 더 작은 입자들로 쪼갤 수 있다. 본 공정을 용이하게 하기 위하여, 폴리머에 섬유들(예컨대, 셀룰로오스, 아세트산 셀룰로오스)을 첨가하여 폴리머의 다공성 구조들을 만들어 낼 수 있다.
고농도의 주형을 사용하면 높은 결합능 및 용이하게 크기를 줄일 수 있는 구조적으로 약한 폴리머 양쪽 모두를 제공할 수 있는 작은 폴리머 구역들(polymer domains)을 발생시킬 수 있다.
입자들을 20 ㎛에서 40 내지 200 ㎚ 크기로 분쇄할 수 있는 하향식 공정인 나노-밀링(Nano-milling)/분쇄(예컨대, NETZSCH 비드 밀들)을 채용하면 ㎛ 이하의 입자들로 크기를 더 줄일 수 있다. (이러한 유형의 입자들은 종종 의약품들에 사용된다).
MIPs를 더 작은 입자 크기들로 쪼개기 위하여 공기 제트, 액체 제트 또는 유사한 것을 이용하여 MIPs를 가속시켜 크기를 줄이고 MIPs 및 담체(carrier)의 이러한 높은 속도 흐름이 충격력을 이용하여 고체 표적을 때리게 하면 MIPs의 크기를 줄이는 가능한 방법일 수도 있다.
최종적으로, 상기 예들에서 보여진 바와 같이, 예컨대, 간단한 막자 사발에서 MIPs의 물리적 분쇄의 사용은 수많은 MIPs에 효과적인 것으로 판명되었다.
본 발명에 속하는 다른 고려사항들
MIP를 위한 폴리머들의 선택
두 물질들 사이의 양호한 접착을 얻기 위하여, 습윤 장력은 낮아야 한다, 즉, 척력이 리간드가 폴리머 표면에 흡착하는데 거슬러 작용하지 않아야 한다. MIPs로 적합한 물질들을 선택하기 위하여, 적당한 폴리머에 대하여 단량체들이 선택되어야 하는 경우에 한센 용해도 매개변수들(HSP)(Hansen CM 참조)이 고려될 것이다.
콜레스테롤의 경우, 화합물에 대한 HSP가 결정되고, 폴리머의 표들을 연구하면 소수성이 큰 폴리머들이 콜레스테롤과 결합할 수 있는 MIPs를 제조하는데 양호한 선택이 될 것이라는 것을 알 수 있다. 콜레스테롤에 대한 HSP는 (δD, δP, δH, R) = (20.4; 2.8; 9.4; 12.6)이며, 콜레스테롤에 대한 HSP 구와 겹치는 MIP에 대한 폴리머들의 목록은 고밀도 폴리에틸렌(HDPE) > 폴리비닐 클로라이드(PVC) > 폴리아크릴로니트릴(PAN) > 폴리프로필렌(PP) > 테플론(PTFE) > 폴리비닐 아세테이트(PVAc) > 폴리스티렌(PS) > 폴리부틸메타크릴레이트(PBMA) > 폴리카보네이트(PC) > 폴리스티렌-폴리메타크릴산(PS/PMAA-코-폴리머(PS/PMAA-co-polymer)) > 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PETP) > 폴리우레탄(PUR) > 폴리스티렌아크릴로니트릴(SAN) > 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) > 예컨대, 나일론 66과 같은 폴리아미드 > 폴리비닐디플루리드(Polyvinyldiflurid: PVDF) > 폴리비닐알코올(PVA)이다. 이러한 폴리머들 모두가 가교제 및 주형과 함께 용이하게 중합되는 것은 아닐 것이지만, 그럼에도 상기 목록은 가장 적합한 폴리머를 제공할 단량체들 및 가교제들의 선택을 위한 간편한 출발점이다. 또한 주어진 표적 리간드에 대한 HSP와 대응시키기 위하여 공중합체들, 블럭-중합체들 및 코-블럭-중합체들(기타 등등)이 제조될 수 있다.
주형 추출
MIPs로부터 주형 제거는 다운사이징(downsizing) 공정 이후에 그리고 정제 단계 전에 이루어져야 한다. 다운사이징 공정 동안에 냉각이 필요하다면, 주형을 잘 용해시키는 용매들이 냉각제로서 탁월한 선택이 될 것이다.
주형 제거는 용매들 및 용매 혼합물들을 단독으로 또는 열, 증감된 이온 강도와 조합하여 사용하면 이루어질 수 있다. 흔히 이용되는 방법은 MIP가 반(semi) 연속적인 방식으로 새로 증류된 용매(또는 혼합물들이 사용된다면 공비혼합물들(azeotropes))로 세척되는 속시렛 추출법(soxhlet extraction method)이다. 그렇게 생성된(그리고 교차 결합된) MIP가 열적으로 안정하다면(그리고 주형 분자는 그렇지 않다면), 추출 전에 발열성의 절차가 이용되어 주형을 파괴하고 예컨대, 주형을 용해시키는데 흔히 사용되지 않는 용매들을 사용하여 제거를 더 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 제조 태양들의 전체적인 발견
본 발명자들은 높은 결합능을 지닌 MIP를 제조하기 위하여, MIP 제조, 미세화, 주형의 제거 및 사용가능한 MIPs의 선택을 조심스럽게 선별 조합하여 이용하되, 미세화 및 선택 기술들에 특히 중점을 두고 이용하여야 함을 알게 되었다.
따라서, 세포 및/또는 단백질 업계 현장에서 알려진 선택 및 정제 방법들을 이용한 MIP 제조 및 정제에 대한 기존의 방법들을 조합한다면, 우월한 결과들이 예상된다.
그 일 예는 하기와 같을 수 있다: MIP 기술로부터 "단량체들의 선택", 미세화, 추출 및 체질(sieving)이 EBA와 같은 기능적 정제와 조합될 수 있다. 확장된 베드의 관능화된 매트릭스/표면과 결합하는 능력에 따라서 MIP 입자들을 분류함으로써, "다운 스트림(down stream)" 선택 및 정제 단계들을 이용하여 기존의 "업 스트림(up stream)" MIP 생성이 수행된다.
상술한 조합된 공정들의 아주 간단한 조업을 도 2에서 볼 수 있다.
본 발명의 MIP 조성물들에 대한 유용한 표적 분자들(또는 주형 분자들)의 통상적인 예들은 인간 위장관과 같은 위장관에서 발견되는 것들이다. 특히 바람직한 표적 분자들은 병리(pathology)와 관련된 표적 분자들이다. 특히 바람직한 표적 분자들은 선택된 콜레스테롤 또는 담즙산 또는 담즙산염들 이며, 독성 물질들, 독소들(박테리아성, 바이러스성, 곰팡이 및 기생성 독소들 포함) 뿐만 아니라 박테리아, 바이러스, 곰팡이 및 기생충들과 같은 병원체들 상에 발견되는 항원들 및 수용체들도 본 발명에 따라서 제조되는 MIP 조성물들에 대한 흥미있는 표적들/주형들이다.
본 발명에 따른 조성물들 및 의약적 사용들
본 발명에 의하여 얻어진 적어도 몇몇 MIP 조성물들은 물질의 신규한 조성물들이라고 여겨진다. 따라서, 본 발명은 적어도 하나의 하기 특성들을 가진 MIPs의 조성물에 관한 것이기도 하다:
1) 평균 MIP 직경은 20 ㎛ 미만이다;
2) 평균 표적 결합은 적어도 표적 1 질량 단위 내지 MIP의 10 질량 단위들이다;
3) 상기 조성물에서 실질적으로 모든 MIPs는 동일한 표적 분자와 결합하지만, 상기 조성물은 상기 표적 분자에 대한 모든 결합 부위들을 포함하지는 않는다.
1, 2 또는 3의 이러한 특성들은 본 발명의 조성물에 의하여 충족되는 것이 바람직한데, 이는 상기 조성물은 특성 1 단독, 특성 1 및 특성 2 중 하나 또는 2, 특성 2 단독, 특성 2 및 3, 특성 3 단독 또는 특성 1, 2 및 3의 모든 특성들을 가질 수 있음을 의미하는 것이다.
평균 MIP 직경은 10 ㎛ 미만, 5 ㎛ 미만, 1 ㎛ 미만, 900 ㎚ 미만, 800 ㎚ 미만, 700 ㎚ 미만, 600 ㎚ 미만 및 심지어 500 ㎚, 400 ㎚, 300 ㎚ 및 200 ㎚ 미만과 같은 15 ㎛ 미만이다.
적어도, 본 발명의 주어진 조성물에서 MIPs는 직경이 50 ㎛을 초과하는(직경이 40, 30, 20, 10 또는 1 ㎛ 초과와 같은) 입자들을 실질적으로 포함하지 않는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 조성물들은 상술한 표적 분자들 중 임의의 것, 즉, 상기 언급된 "유용한 표적 분자들의 통상적인 예들"과 결합한다.
본 발명의 조성물들(및 본 발명의 방법들에 따라서 제조된 조성물들)은 의약품들로서 유용하며 항체 조성물들을 사용하는 것과 동일한 방식으로 사용될 수 있다. 그러나, 그 안정성으로 인하여, MIP 조성물들은 경구 투여용으로 적합하며, 항체들 및 수많은 가용성 단백 수용체들과는 달리, 소장 내의 단백질 분해에 대하여 안정하다. 또한, MIPs는 위장관 상피를 횡단할 수 없는 물질들로부터 제조될 수 있다는 사실로 인하여, 이들은 위장관에 머물러 있는 병리 관련 분자들/작용제들을 표적하는데 유용하다. 적당한 표적들은 콜레스테롤, 담즙산 및 담즙산염들뿐만 아니라, 위장관 내의 병원체들 상에 발견되는 다양한 독성 물질들 또는 항원들/리간드들도 가능성이 있다.
그러나, MIPs가 적당한, 생체적합성 및/또는 생체분해성 폴리머(예컨대, 폴리락타이드(PLA), 폴리글리콜라이드(PLG))로부터 제조된다면, 이들은 또한 비경구성 의약품들로서 채택될 수 있으며, 예컨대 항체들 및 가용성 수용체들의 투여와 비교할 경우에 약제들에 대항하여 원하지 않는 면역 반응을 일으키는 위험이 줄어든다. 그러한 실시예들에서, 항체 또는 가용성 수용체에 대한 적당한 표적인 실질적으로 모든 표적 분자는 본 발명의 MIP 조성물에 대한 표적일 수 있다.
따라서, 바람직한 일 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 조성물 또는 본 발명에 따라서 제조된 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 피검자에게 투여하는 단계를 포함하는, 심혈관 질병, 고혈압, 죽경화증, 심장, 담석증, 담즙정체성 간 질환, 고콜레스테롤혈증, 비만, 및 기생충, 바이러스 또는 예컨대, 박테리아 및 곰팡이와 같은 미생물들로부터 유래하는 감염들, 구강으로 유입된 독소들로부터 유래한 독성화(toxification)로 구성된 군으로부터 선택된 질병을 치료, 완화시키거나 질병의 위험을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 실시예는 심혈관 질병, 고혈압, 죽경화증, 담석증, 담즙정체성 간 질환, 고콜레스테롤혈증, 비만, 및 기생충, 바이러스 또는 박테리아 및 곰팡이와 같은 미생물들로부터 유래한 감염들 또는 구강으로 유입된 독소들로부터 유래한 독성화의 치료, 예방 또는 완화를 위한 의약품 제조에서 그러한 조성물들의 사용에 관한 것이기도 하다. 통상적으로, 경구 투여가 예상된다.
본 발명의 MIP 조성물 또는 본 발명에 따라서 제조되는 MIP 조성물의 예상되는 일일 투여량은 많아야 일당 40 g 이지만, MIP 조성물들의 높은 표적 결합능으로 인하여 최대 일당 30 g, 일당 20 g, 일당 10 g, 일당 5 g 및 일당 1 g과 같은 더 적은 양의 일일 투여량이 예상된다.
MIPs는 특히 경구용으로 제형되는 당업자에게 알려진 표준 방법들에 따라 제형될 수 있으며, MIPs는 분말, 유탁액, 캡슐화된 유탁액, 알약 및 정제 형태로, 그리고 식품의 성분으로서 투여될 수 있음을 예상하며, MIPs는 실질적으로 모든 음식 또는 식품에서 분산될 수 있다.
그러한 조성물들에 MIPs의 제형을 위하여, 여기에 참고로 포함된 Mark Gibson, CRC press, 2001을 전체적으로 참고한다.
물론, 본 발명에 따르고 본 발명에 따라서 제조된 MIP 조성물들은 MIPs가 종래 기술의 특이적인 결합 파트너들로서 제안되는 모든 유형의 응용들에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 MIP 조성물들의 의학적 사용들에 중점을 둔다고 하더라도, 이는 현재 개시된 MIP 조성물들을 그 자체로 알려진 분석 장치들 및 방법들에의 사용을 배제하지 않는다. 따라서, 본 발명은 그 범위 내에 표본 내의 표적 분자의 정성적 또는 정량적 측정을 위한 방법도 포함하며, 상기 방법은 조성물에서의 MIPs가 표적 분자와 특이적으로 결합하는, 본 발명의 조성물 또는 본 발명에 따라서 제조된 조성물과 상기 표본을 접촉시키는 단계 및 이후 상기 조성물과 결합하는 표적 분자의 정성적 또는 정량적 평가를 수행하는 단계를 포함한다. 이러한 맥락에서, MIPs의 일반적인 제조 및 사용에 관한 상기 언급된 개시물들이 모두 여기에 참고로 포함되어 있다.
하기 예들에 대한 서문
분자 각인 폴리머들을 제조하는 일반적인 방법
MIPs의 제조법은 적당한 용매 내에서 프린트 분자 및 교차 결합 단량체와 기능성 단량체를 혼합하는 일반적인 반응 방법을 따른다. 단량체의 선택은 프린트 분자와 배위하는 능력에 따라 이루어지며 당업자에게는 일상적인 일이다. 중합반응은 적당한 농도로 개시 인자을 첨가하여 개시되며 예컨대, 자외선(자외선 개시 인자들의 경우) 또는 열(열 분해성 개시 인자(heat cleavable initiators)의 경우)을 사용한 섭동(perturbation)이 뒤따른다.
중합반응 이후에, (종종) 딱딱하고 파삭파삭한 폴리머는 원하는 크기로 미세화되며, 프린트 분자들, 결합하지 않은 단량체들 및 가교제들 및 개시 인자 나머지들은 직접 세척 및/또는 주어진 시간 동안 용매를 환류시켜 추출에 의하여 제거된다.
예 1
주형으로서 플루오르세인(fluorescein)과 결합하는 MIP
100 ㎖ 플라스크에, 1.4 ㎖ 단량체 메타크릴산(MAA) , 9.5 ㎖ 에틸렌글리콜디메타크릴산(EGDMA), 50 ㎎ 플루오르세인 및 10 ㎖ 테트라하이드로퓨란(THF)이 열수중탕(약 40 ℃) 상에서 30 분 동안 혼합된다. 1,1-아조비스(사이클로헥산-카르보니트릴)(1,1-azobis(cyclohexane-carbonitrile): ACHCN) 2 g이 천천히 첨가된다. 용해시킨 이후에, 용액은 Ar(THF 포화됨)로 15 분 동안 퍼지 된다. 중합반응은 연속 자외선(365 ㎚, 9 W)에 의하여 48 시간 동안 개시된다. 그렇게 생성된 폴리머는 황색이 도는 파삭파삭한 것으로서, 막자 사발에서 10 ㎛ 및 25 ㎛ 사이의 입자 크기로 미세화된다. 분말은 THF에서 30 분 동안 환류되며 세척되어 에탄올/THF(75:25)에서 수회 여과된다. 백색 분말이 공기 중에서 건조된다.
예 2
주형으로서 콜산과 결합하는 MIP
100 ㎖ 플라스크에, 1.4 ㎖ 단량체 메타크릴산(MAA) , 9.5 ㎖ 에틸렌글리콜디메타크릴산(EGDMA), 2 g 콜산 및 12 ㎖ 테트라하이드로퓨란(THF)이 열수중탕 상에서 30 분 동안 혼합된다. 2,2'-아조비스이소부티로니트릴/2,2'-아조비스(2-메틸프로피오니트릴)(2,2'-azobisisobutyronitrile/2,2'-azobis(2-methylpropionitrile: AIBN) 0.2 g이 천천히 첨가된다. 용해시킨 이후에, 용액은 Ar로 15 분 동안 퍼지 된다. 중합반응은 얼음 중탕 상에서 연속 자외선(365 ㎚, 9 W)에 의하여 24 시간 동안 개시된다. 그렇게 생성된 폴리머는 황색이 도는 딱딱한 것으로서, 막자 사발에서 25 ㎛ 및 50 ㎛ 사이의 입자 크기로 미세화된다. 분말은 THF에서 30 분 동안 환류되며(1 회) 세척되어 에탄올/THF(75:25)에서 4 회 여과된다. 황색이 도는 백색의 분말이 공기 중에서 하룻밤 동안 건조된다.
예 3
주형으로서 콜산과 결합하는 MIP
100 ㎖ 플라스크에, 단량체 2-(디메틸아미노)-에틸메타크릴산(2-(dimethylamino)-ethylmethacrylic acid: DMA-EMAA) 2.8 ㎖, 9.5 ㎖ 에틸렌글리콜디메타크릴산(EGDMA), 2 g 콜산 및 12 ㎖ 테트라하이드로퓨란(THF)이 열수중탕 상에서 30 분 동안 혼합된다. 2,2'-아조비스이소부티로니트릴/2,2'-아조비스(2-메틸프로피오니트릴)(AIBN) 0.8 g이 천천히 첨가된다. 용해시킨 이후에, 용액은 Ar로 15 분 동안 퍼지 된다. 중합반응은 얼음 중탕 상에서 연속 자외선(365 ㎚, 9 W)에 의하여 24 시간 동안 개시된다. 그렇게 생성된 폴리머는 황색이 도는 파삭파삭한 것으로서, 막자 사발에서 10 ㎛ 및 25 ㎛ 사이의 입자 크기로 미세화된다. 분말은 THF에서 30 내지 60 분 동안 2 회 환류되며 세척되어 에탄올/THF(75:25)에서 3 회 여과된다. 백색 분말이 공기 중에서 하룻밤 동안 건조된다.
예 4
개별 MIP 입자들의 결합능
분말에서 MIP 입자들 사이의 결합능/특이도에서의 차이들을 평가하기 위하여, 결합 실험은 가장 간단한 형태로 수립되었다. 예 1의 MIPs는 플루오로세인에 대한 결합능의 여부에 대하여 시험 되었다.
플루오로세인에 대하여 MIP 1.9 ㎎이 380 ㎕ 에탄올(96 %)에 현탁되었으며, 플루오로세인 용액 5 ㎕(에탄올에서 0.05 ㎎/㎕)이 보충되어 5 분 동안 혼합되었다. 상기 현탁액은 원심분리되며 상청액이 제거되었다. 이후 입자들이 에탄올 300 ㎕으로 3 회 세척되었다. 세척된 입자들은 현미경 글래스 플레이트 상에 퍼지며, 결합능 분석은 백색광에서 입자들(모든 입자들) 및 자외선(365 ㎚)에 노출되는 경우에 녹색 형광을 보이는(MIP 입자들과 결합하는) 입자들을 육안으로 세어서 실시되었다. UV 광선의 사용으로 인하여, 녹색 형광을 관찰하기 위하여 방사 필터들은 필요하지 않았다.
도 4에 도시된 도면들은 백색광 및 자외선으로 찍은 2 개의 사진들을 겹친 도면이다. 백색 반점들은 백색광으로 조명된 입자들이며 흑색 반점들은 자외선 조명된 녹색 형광 입자들이다. 도 4에서 백색광으로 조명된 입자들(백색 반점들)은 자외선에 노출되는 경우에 보이는 녹색 형광 입자들(흑색 반점들)보다 많다는 것이 명확하다. 두 개의 다른 광원들 하에서의 보이는 입자들의 숫자가 다른 것은 MIP를 미세화하면 결합 MIP 입자들의 개체군 및 비결합 MIP 입자들의 개체군(=파편들)을 제공하게 된다는 것을 입증한다; 따라서 친화도 성질에 근거한 결합 MIP 입자들의 선택은 채용된 MIP 단위 중량당 사용된 주형과 결합하는 능력으로 측정되는 결합능을 효과적으로 증가시킬 것이다.
도시된 도면은 녹색 형광 입자들은 입자 크기에 관련되지 않은 녹색 형광의 상이도들(세기)를 보여준다는 우리의 관찰을 예시할 수 없다. 이러한 관찰은 상이한 결합 MIP 입자들 사이의 결합 능력에서의 차이들에 해당한다. 이러한 세기(형광) 차이는 MIP 입자들은 상이한 결합능을 가진다는 것을 다시 예시한다; 따라서 MIP의 결합능은 (본 예에서) 최고 형광 세기를 지닌 MIP 입자들을 선택하면 증가될 수 있다.
이것을 결론짓는다면, 본 예는 MIP 입자들의 조성물의 결합능은 비결합 입자들을 제거하여 증가될 수 있다는 것을 입증한다. 결합능은 높은 친화도 및/또는 표적 분자와 결합하는 다수의 노출된 결합 포켓들(binding pockets)을 가지는 MIP 입자들을 농축하여 더 개선될 수 있다.
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Claims (30)

  1. 표적 분자에 대하여 높은 결합능 및 특이도를 가지는 분자 각인 폴리머들(MIPs)을 포함하는 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
    a) 상기 표적 분자와 결합하고, 상기 표적 분자 또는 그 모방체를 주형 분자로서 사용하여 제조된 불용성 분자 각인 폴리머들(MIPs)의 현탁액을 획득하는 단계,
    b) 상기 현탁된 MIPs를 상기 주형 분자 또는 그 단편 또는 그 모방체가 포착제(capture agent)로서 사용되는 친화성 정제 절차를 거치게 하는 단계,
    c) 상기 친화성 정제 절차에서 상기 포착제와 결합하는 상기 MIPs를 회수하면서 상기 포착제 및 상기 회수된 생성물로부터 상기 포착제와 결합하지 않는 MIPs를 실질적으로 배출하는 단계, 및
    d) 상기 조성물을 얻기 위하여 상기 회수된 MIPs 및 선택적으로는 담체, 운반체 또는 희석제와 조합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물을 제조하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 포착제는 고체상과 공유적으로 또는 비공유적으로 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 고체상은 교차 결합된 탄수화물들, 합성 폴리머들 또는 그 조합들의 매트릭스들로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 포착제는 가용성 화학적 실체로 구성되거나 그 일부인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 포착제는, 가용성 화학적 실체당 다수의 포착제들을 노출시키기 위하여, 덴드리머(dendrimer), 치환된 탄수화물, 및 폴리비닐 알코올 및 폴리에틸렌글리콜과 같은 치환된 가용성 폴리머로부터 선택된 모이어티(moiety)에 공유적으로 또는 비공유적으로 연결되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5중 어느 한 항에 있어서,
    상기 포착제는 상기 주형 분자와 결합하는 단계 a)의 MIPs에서의 결합 부위들의 일부분에 결합하기만 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6중 어느 한 항에 있어서,
    상기 포착제는 상기 주형 분자의 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7중 어느 한 항에 있어서,
    상기 포착제는 상기 포착제의 일부분의 MIPs에 노출되는 것을 실질적으로 회피하기 위하여 가능하다면 특이적인 배향성으로 고체 표면 또는 모이어티에 결합된 주형 분자 또는 그 모방체 또는 그 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 포착제는 상기 포착제의 실질적으로 모든 부분들이 상기 MIPs에 노출되도록 가능하다면 비특이적인 배향성으로 고체 표면 또는 모이어티에 결합된 주형 분자 또는 그 모방체 또는 그 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 청구항 1 내지 청구항 9중 어느 한 항에 있어서,
    상기 친화성 정제 절차는 확장된 베드 흡착(EBA), 상자성 비드 분리, 중공 섬유 정제 및 응집반응(agglutination)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 표적 분자 또는 그 모방체로 구성된 주형 분자들을 포함하는 정제되지 않은 MIP를 충분히 작은 MIP 입자 크기를 얻어서 주형 분자들을 제거할 수 있도록 미세화의 제1 단계를 거치게 하는 단계, 실질적으로 모든 주형 분자들을 제거하고 선택적으로는 그렇게 얻어진 MIPs를 미세화의 제2 단계를 거치게 하는 단계를 포함하 며, 상기 미세화의 제1 및 선택적으로는 제2 단계가 50 ㎛ 이하의 MIP 평균 직경을 제공하는 것을 특징으로 하는 표적 분자에 대하여 높은 결합능을 가지는 MIPs를 제조하는 방법.
  12. 청구항 11에 있어서,
    미세화의 제1 단계만이 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 청구항 11 또는 12에 있어서,
    상기 미세화는 분쇄, 밀링, 폭발, 해머링(hammering), 볼 밀링, 동결 마쇄(cryo grinding), 또는 충돌 파쇄(collision homogenization)에 의하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 청구항 11 내지 13중 어느 한 항에 있어서,
    구해진 MIPs를 청구항 1 내지 10중 어느 한 항에 따른 방법을 거치게 하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 청구항 1 내지 청구항 14중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적 분자는 인간 위장관에서와 같이 위장관에서 발견되는 분자인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 청구항 15에 있어서,
    상기 표적 분자는 병리(pathology)와 관련된 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 청구항 1 내지 청구항 16중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적 분자는 콜레스테롤, 담즙산 및 담즙산염으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 1) 평균 MIP 직경은 20 ㎛ 미만이다;
    2) 평균 표적 결합은 적어도 표적의 1 질량 단위 내지 MIP의 10 질량 단위들이다;
    3) 조성물 내의 실질적으로 모든 MIPs는 동일한 표적 분자와 결합하고, 선택적으로 상기 조성물은 상기 표적 분자에 대한 모든 결합 부위들을 포함하는 것은 아니다;
    상기 특성들 중 적어도 하나를 가지는 것을 특징으로 하는 불용성 MIPs의 조성물.
  19. 청구항 18에 있어서,
    특성 1을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  20. 청구항 18 또는 19에 있어서,
    특성 2를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  21. 청구항 18 내지 20중 어느 한 항에 있어서,
    특성 3을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  22. 청구항 18 내지 21중 어느 한 항에 있어서,
    청구항 1 내지 17중 어느 한 항의 방법에 따라 제조되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  23. 청구항 18 내지 22중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물 내의 MIPs는 콜레스테롤, 담즙산 또는 담즙산염과 결합하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  24. 청구항 18 내지 23중 어느 한 항에 있어서,
    의약품으로서 사용을 위한 것을 특징으로 하는 조성물.
  25. 청구항 18 내지 23중 어느 한 항에 있어서,
    심혈관 질병, 고혈압, 죽경화증, 담석증, 담즙정체성 간 질환, 고콜레스테롤혈증, 비만, 및 기생충, 바이러스 또는 박테리아 및 곰팡이와 같은 미생물들로부터 유래한 감염들 또는 구강으로 유입된 독소들로부터 유래한 중독의 치료, 예방 또는 완화를 위한 의약품 제조에 쓰이는 것을 특징으로 하는 조성물의 사용.
  26. 청구항 25에 있어서,
    상기 의약품 제조는 경구 투여를 위한 것을 특징으로 하는 사용.
  27. 청구항 18 내지 23중 어느 한 항에 따른 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 피검자에게 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 심혈관 질병, 고혈압, 죽경화증, 담석증, 담즙정체성 간 질환, 고콜레스테롤혈증, 비만, 및 기생충, 바이러스 또는 박테리아 및 곰팡이와 같은 미생물들로부터 유래한 감염들 또는 구강으로 유입된 독소들로부터 유래한 중독으로 구성된 군으로부터 선택된 질병을 치료, 완화시키거나 질병의 위험을 감소시키는 방법.
  28. 청구항 27에 있어서,
    상기 유효량은 일당 최대 40 g 인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 청구항 27 또는 28에 있어서,
    상기 유효량은 경구 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 표본을 청구항 18 내지 24중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 청구항 1 내지 17중 어느 한 항에 따라서 제조된 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 조 성물 내의 MIPs는 특이적으로 표적 분자와 결합하고, 이후 상기 조성물과 결합하는 표적 분자의 정량적 또는 정성적 평가를 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 표본 내의 표적 분자의 정량적 또는 정성적 측정의 방법.
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