KR20080077347A - 병리 표지 및 치료 표적으로서의 ｐｄｇｆ 수용체에 대한자극성 자가항체들 - Google Patents

Abstract

본 발명은 자가면역 질환의 진단 및 예후에 적당한 PDGF 수용체에 대한 자가 항체의 생체 시료내의 존재를 생체외에서(in vitro) 검출하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 전신성 경화증 및 이와 관련된 질환의 진단용 키트에 관한 것이다. 본 발명은 자가면역 질환의 치료용 또는 이식편 대 숙주 질환(GVHR)의 치료용 약제의 제조에 사용되는 ROS 및/또는 Ras-ERK 1/2 저해제의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 유효량의 ROS 및/또는 Ras-ERK 1/2 저해제, 적당한 희석제(diluent), 및/또는 부형제(excipient), 및/또는 보조제(adjuvant)를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

병리 표지 및 치료 표적으로서의 ＰＤＧＦ 수용체에 대한 자극성 자가항체들 {STIMULATORY AUTO-ANTIBODIES TO THE PDGF RECEPTOR AS PATHOLOGY MARKER AND THERAPEUTIC TARGET}

본 발명은 자가면역 질환(autoimmune disease)의 진단(diagnosis) 및 예후(prognosis)에 적당한 PDGF 수용체에 대한 자가항체(auto-antibody)의 생체 시료(body sample)내의 존재를 생체외에서(in vitro) 검출하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 특히 전신성 경화증(systemic sclerosis) 및 이와 관련된 질환의 진단용 키트에 관한 것이다. 본 발명은 자가면역 질환의 치료용 또는 이식편 대 숙주 질환(Graft-Versus-Host Reaction, GVHR)의 치료용 약제의 제조에 사용되는 ROS 및/또는 Ras-ERK 1/2 저해제의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 유효량의 ROS 및/또는 Ras-ERK 1/2 저해제, 적당한 희석제(diluent), 및/또는 부형제(excipient), 및/또는 보조제(adjuvant)를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

자가면역 질환, 전신성 경화증 또는 경피증(sclerodermia)에 걸린 환자의 혈청은 인간 PDGF 수용체(PDGFR)에 대한 자극성 자가항체(stimulating auto-antibody)들을 함유한다. PDGFR은 PDGFRA NP008197 (SWProt P16234) 및 PDGFRB NPOO26000 (SWProt P09619)의 동종 또는 이종 이합체 분자이다. 이들 항체는 상기 질환들의 진단 도구로서 사용될 수 있다. 또한, 항-PDGFR 저해제를 이용한 치료는 상기 질환들의 치료적 접근을 나타낼 수 있었다.

현재, 상기 질환들은, 비록 희귀한 것일지라도(1/10,000), 치명적이며, 유용한 특정 치료법이 없는 실정이다. 진단은 본질적으로 임상적 증후군(clinical symptom)에 기초하지만, 적용가능한 특정 분석법이 없는 실정이다.

상기 자가항체들의 검출은 전신성 경화증보다 빈번한 하기 2가지 다른 질병들의 진단에 사용될 수 있다:

- 인구의 20%에 존재하며, 비록 일부가 전신성 경화증으로 발전할지라도 일반적으로 양성인 레이노 증후군(Raynaud phenomenon); 항체 시험에 의해 1차 레이노 증후군과 2차 레이노 증후군(전신성 경화증의 초기 신호)을 구별할 수 있다.

- 이식편 대 숙주 질환(GVHR). 이는 동종 기관의 이식, 주로 골수의 이식을 수반하는 매우 빈번한 합병증(complication)이다. 본 발명자들은 만성 이식편 대 숙주 질환 및 섬유증(fibrosis)이 있는 (지금까지 분석된) 모든 환자들(참고 문헌 15 참조)에 있어서의 전술한 항체들의 존재를 검출하였다.

전신성 경화증(경피증; SSc)은 피부 및 내장 기관(참고 문헌 1 참조)의 섬유증에 의해 특징지워지는 질환이다. 상기 질환의 주된 원인은 알려져 있지 않으며, 현재까지 상기 질환의 모든 양상들을 명확하게 구체적으로 설명할 수 있는 가설이 없는 실정이다.

경피증 표현형의 몇몇 특색은 잘 확립되어 있고, 상기 질환의 특징(hallmark)들을 나타낸다: 1. 내피 세포 손상 및 2. 과도한 세포외 기질 생성(참 고 문헌 2 참조). 세포성 경피증 표현형은 산화성 스트레스(oxidative stress), 및 섬유아세포에 의한 대량의 반응성 산소종(oxygen species, ROS)의 생성(참고 문헌 3-6 참조)에 의해 특징지워진다. ROS는 섬유아세포 증식(참고 문헌 7 참조) 및 콜라겐 유전자 발현(참고 문헌 7 참조)의 중요한 세포 변환기(cell transducer)이다. Ha-Ras 및 ERK 1-2에 의한 ROS의 대량 생산은 콜라겐 유전자 전사 및 정상 섬유아세포에서의 노화(참고 문헌 7 참조)를 유발시켰다.

혈소판-유도 성장 인자(platelet-derived growth factor, PDGF)는 ROS 및 Ras-ERK 1/2 신호화(signaling)를 유발시킬 수 있고(참고 문헌 9 참조); 경피증 환자로부터 유래한 IgG(SSc IgG)는 인간 섬유아세포와 반응하는 것으로 나타났다(참고 문헌 10 참조).

본 발명자들은 SSc 환자들의 혈청내의 Ha-Ras/ERK 1/2 및 ROS 자극성 분자들에 대해 연구하였다.

본 발명자들은 PDGF 수용체(PDGFR)에 대한 자극성 IgG 자가항체들이 PDGFR 활성화의 시동에 의해 Ha-Ras 및 ERK 1/2 신호화에 의한 ROS를 유발하고, 전신성 경화증의 분명한 특징들인 섬유아세포 활성화와 내피 세포 아팝토시스(apoptosis)의 원인이 된다는 증거를 제공한다.

따라서, 본 발명자들은 ERK 1/2 신호화에 의존적인 Ras 단백질의 새로운 수준의 조절을 밝혀냈다. 구체적으로, 본 발명자들은 PDGF 및 ROS가 1차 섬유아세포에서 Ha-Ras를 유발한다는 것을 밝혀냈다. 이는 ERK 1/2를 통해서 Ras 단백질 레벨로 ROS를 연결시키는 지금까지 알려지지 않은 새로운 경로를 밝혀낸 것이다. 본 발명자들은 전신성 경화증에 걸린 환자들로부터 유래한 세포들에 있어서의 생체내 회로(circuitry in vivo)의 주목할 만한 범례(remarkable example)를 밝혀내었다. 이러한 신호화 경로는 PDGF 수용체의 자극에 의해 개시되며, ROS-ERK 1/2 신호에 의해 유지된다. 전신성 경화증 세포들은 과도한 ROS(참고 문헌 12 참조)를 생성시키고, 활성 Ras-ERK 1/2를 유지시킨다. 이들 세포는 DNA 손상을 축적시키고, ROS 의존성 유전자들을 활성화시키며, 스트레스-유도 아팝토시스(stress-induced apoptosis)가 발생하는 경향이 있다. ROS, Ras 또는 ERK 1/2의 저해는 루프(loop)를 하향 조절(down-regulation)하고, 전신성 경화증 섬유아세포에 정상 표현형을 재저장한다. 이들 데이터는 Ras에 세포성 ROS의 중요한 센서(key sensor)을 알려 주고, 전신성 경화증의 진단 및 치료를 위한 분자 도구를 제시한다.

따라서, 본 발명의 제 1 목적은 PDGF 수용체에 대한 자가항체(auto-antibody)들의 생체 시료내의 존재를 생체외에서(in vitro) 검출하는 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공하는 것이다:

a) 자가항체들의 결합 및 리간드-자가항체들의 복합체(complex)의 형성을 허용하는 조건에서 상기 자가항체들에 특이적인 유효량의 리간드(ligand)와 생체 시료를 항온배양하는 단계; 및

b) 결합된 자가항체들, 또는 리간드-자가항체들의 복합체(존재하는 경우)를 검출하는 단계.

특이적인 리간드는 PDGF 수용체 또는 면역반응성 단편들 또는 이들의 유도체들인 것이 바람직하다.

상기 면역반응성 단편들은 PDGFRA 및/또는 PDGFRB의 세포외 영역에 속하는 것이 보다 바람직하고, 인간 PDGFRA NP008197 (SWProt P16234, 서열 번호 7) 및/또는 PDGFRB NPOO26000(SWProt P09619, 서열 번호 8)의 아미노산 서열의 NH 말단으로부터 처음 550개 아미노산에 포함되는 것이 가장 바람직하다.

SWProt P16234, 서열 번호 7

SWProt P09619, 서열 번호 8

본 발명의 방법은 자가면역 질환들, 특히 전신성 경화증의 진단 및 예후에 적합하다.

본 발명의 방법은 레이노 증후군과 전신성 경화증을 구별하는데 적합하다.

본 발명의 방법은 이식편 대 숙주 질환(GVHR)의 진단 및 예후에 적합하다.

본 발명의 제 2 목적은 전술한 본 발명의 방법을 위한 진단 키트(diagnostic kit)로서 하기 a) 및 b)를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트를 제공하는 것이다:

a) PDGF 수용체에 대한 자가항체들에 특이적인 리간드; 및

b) 결합된 자가항체들, 또는 리간드-자가항체들의 복합체의 검출 수단.

특이적인 리간드는 PDGF 수용체 또는 면역반응성 단편들 또는 이들의 유도체들인 것이 바람직하다. 상기 면역반응성 단편들은 PDGFRA 및/또는 PDGFRB의 세포외 영역에 속하는 것이 보다 바람직하고, 인간 PDGFRA NP008197 (SWProt P16234, 서열 번호 7) 및/또는 PDGFRB NPOO26000(SWProt P09619, 서열 번호 8)의 아미노산 서열의 NH 말단으로부터 처음 550개 아미노산에 포함되는 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 제 3 목적은 자가면역 질환의 치료용 또는 이식편 대 숙주 질환(Graft-Versus-Host Reaction, GVHR)의 치료용 약제의 제조에 사용되는 ROS 및/또는 Ras-ERK 1/2 저해제의 용도를 제공하는 것이다. 바람직하게는, 자가면역 질환은 전신성 경화증이다. ROS 및/또는 Ras-ERK 1/2 저해제는 PDGFR에 대한 항체들에 특이적인 리간드인 것이 바람직하다. 특이적인 리간드는 PDGF 수용체 또는 면역반응성 단편들 또는 이들의 유도체들인 것이 바람직하다. 상기 면역반응성 단편들은 PDGFRA 및/또는 PDGFRB의 세포외 영역에 속하는 것이 보다 바람직하고, 인간 PDGFRA NP008197 (SWProt P16234, 서열 번호 7) 및/또는 PDGFRB NPOO26000(SWProt P09619, 서열 번호 8)의 아미노산 서열의 NH 말단으로부터 처음 550개 아미노산에 포함되는 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 제 4 목적은 유효량의 ROS 및/또는 Ras-ERK 1/2 저해제, 적당한 희석제(diluent), 및/또는 부형제(excipient), 및/또는 보조제(adjuvant)를 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것이다. ROS 및/또는 Ras-ERK 1/2 저해제는 PDGFR에 대한 항체들에 특이적인 리간드인 것이 바람직하다. 특이적인 리간드는 PDGF 수용체 또는 면역반응성 단편들 또는 이들의 유도체들인 것이 바람직하다. 상기 면역반응성 단편들은 PDGFRA 및/또는 PDGFRB의 세포외 영역에 속하는 것이 보다 바람직하고, 인간 PDGFRA NP008197 (SWProt P16234, 서열 번호 7) 및/또는 PDGFRB NPOO26000(SWProt P09619, 서열 번호 8)의 아미노산 서열의 NH 말단으로부터 처음 550개 아미노산에 포함되는 것이 가장 바람직하다.

도 1: 경피증( scleroderma ) 환자들에 있어서의 PDGF 수용체에 대한 항체들

패널( panel ) A: 정상(N; n°20), 경피증(SSc; n°46), 1차 레이노 증후군(PRP; n°15), 전신성 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus)(SLE; n°15) 및 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis)(RA; n°15) IgG와 항온배양된 Fα 및 F-/- 세포들에 있어서의 반응성 산소종(ROS)의 레벨(level)을 나타낸 것이다. F 세포들은 PDGFR 티로신 키나제(AG 1296)의 선택적 저해제와 예비-항온배양(pre-incubation)하였다. 수평 막대(horizontal bar)는 평균값을 보여준다.

패널 B: Fα, Fαβ 및 F-/- 세포용해물(lysate)들은 SSc 환자들 및 정상 개체들로부터 유래한 정제된 IgG와 면역침전(immunoprecipitation)시키고, PDGFR α 및 β 서브유닛(subunit)(WB)들에 특이적인 항체들과 함께 발육시켰다. 오른쪽의 처음 2개 레인(lane)은 전체 단백질들의 면역블롯(immunoblot)들이다. SSc IgG만이 PDGFR α 및 β 서브유닛(subunit)(WB)들을 효율적으로 면역침전시켰다. 3번의 실험 중 하나의 실험으로부터 대표적인 실험 데이터를 나타내었다.

패널 C: 경피증 IgG는 PDGFR의 α 사슬을 발현시키는 Fα 세포들과 함께 항온배양하였다. 세포용해물을 원심분리 및 면역침전시켰다. 상청액을 αPDGFR의 세포외 영역과 혼합하고, 면역침전시켰다. F-/- 세포들에 대하여도 동일한 방법을 수행하였다. Fα 세포들에 의해 발현된 PDGFR은 SSc IgG로부터 유래한 항-PDGFR 항체 들을 역가측정(titration)하였다. 3번의 실험 중 하나의 실험으로부터 대표적인 실험 데이터를 나타내었다.

도 2: αβ PDGF 수용체에 대한 SSc 항체들은 정상 섬유아세포들에서 신호화 하는 Ha - Ras - ERK 1/2- ROS 를 자극한다.

패널 A: 정상(N; n°= 3) 및 SSc IgG(n°= 3)(15분 동안 200 ㎍/㎖)와 함께 항온배양되고, EGFR 또는 PDGFR(각각 AG 1478 및 AG 1296) 저해제들 및 FTI-277 및 PD98059와 예비-항온배양된 정상적인 인간 섬유아세포들에 있어서의 반응성 산소종의 레벨(평균 ± 1 표준편차)(DCF 형광 강도로서 평가됨)을 나타낸 것이다.

패널 B: 선택적 저해제들(2시간 동안 AG 1478 및 AG 1296 2μM)의 존재 또는 부재하에서 정상 및 SSc IgG(15분 동안 200 ㎍/㎖)와 항온배양된 정상적인 인간 섬유아세포들에 있어서의 Ha-Ras 단백질을 형광 현미경법 및 면역블롯팅(immunoblotting)법을 이용하여 측정하였다. AG 1478에 의한 Ha-Ras 밴드(band)상에서의 경미한 저해(slight inhibition)는 이 특정 실험에 사용되는 높은 농도에 의존적이었다(IC₅₀ EGF 수용체=3nM). 5번의 실험 중 하나의 실험으로부터 대표적인 실험 데이터를 나타내었다. 40배 확대.

패널 C: 2명의 SSc 환자들, 1명의 SLE 환자 및 2명의 정상 개체들로부터 유래한 정제된 IgG와 세포용해물들을 면역침전시키고, PDGFR 및 EGFR(WB)에 대하여 특이적인 항체들과 함께 발육시켰다. 왼쪽의 처음 2개 레인(lane)은 정상(N) 또는 경피증(SSc) 섬유아세포들로부터 추출되고 PDGFR 및 EGFR에 대한 항체들과 프로 빙(probing)된 전체 단백질들의 면역블롯(immunoblot)들이다. 3번의 실험 중 하나의 실험으로부터 대표적인 실험 데이터를 나타내었다.

패널 D: 정상적인 인간 섬유아세포들을 SSc IgG(15분 동안 200 ㎍/㎖), PDGF(15분 동안 15 ng/㎖)로 자극하거나 또는 0.2% FCS(우태아 혈청)에서 성장시켰다. 세포용해물들을 PDGFR(서브유닛 β)에 대한 다클론 항체(polyclonal antibody)와 함께 항온침전시키고, 면역블롯(immunoblot)들을 인산화된 티로신(phosphorylated tyrosine)에 대해 특이적인 항체와 함께 발육시켰다.

도 3: 항- PDGFR 항체들의 생물학적 효과들

패널 A: AG 1296(24시간 동안 2μM)의 존재 또는 부재하에서, PDGF(24시간 동안 15ng/㎖), 정상 인간 IgG(NIgG; 24시간 동안 200 ㎍/㎖) 및 경피증 IgG(SSc IgG; 24시간 동안 200 ㎍/㎖)으로 자극된 정상적인 인간 섬유아세포들에 있어서의 α-SMA 단백질 유도를 나타낸 것이다. 보여진 실험은 3개의 독립된 실험들에서 얻은 전형적인 블롯(blot)을 나타낸 것이다. 농도계 분석(densitometric analysis)은 아래 부분(lower part)에 나타나 있다. 데이터는 3개의 독립된 실험의 평균값±표준편차(SEM)을 의미한다.

패널 B: 타입(Type) I은 AG 1296(24시간 동안 2μM)의 존재 또는 부재하에서, 48시간 동안 0.2% FCS, PDGF(24시간 동안 15ng/㎖), 정상 인간 IgG(NIgG; 24시간 동안 200 ㎍/㎖) 및 경피증 IgG(SSc IgG; 24시간 동안 200 ㎍/㎖)와 항온배양된 후의 정상적인 인간 섬유아세포들에 의한 콜라겐 유전자 발현을 나타낸 것이다. 노던 블롯 분석(Nothern blot analysis)을 이용하여 α1(I) 및 α2(I) 콜라겐 mRNA를 검출하였다. 3번의 실험 중 하나의 실험으로부터 대표적인 실험 데이터를 나타내었다.

패널 C: 제대 정맥(umbilical vein) 내피 세포들을 PDGF(밤새도록 15 ng/㎖), 및 정상 개체들(N), 전신성 홍반성 낭창(SLE) 환자들 및 경피증(SSc) 환자들로부터 유래한 IgG(밤새도록 200 ㎍/㎖)와 항온배양하였다. SSc는 또한 AG 1296(밤새도록 2μM)의 존재하에서 항온배양하였다. 이어서, 아넥신(annexin) V-Cys 3 염색된 세포들의 FACS(형광 활성 세포 분리) 분석에 의해 아팝토시스(apoptosis)를 검출하였다. 다이어그램(diagram)은 아넥신 V-Cys 3 양성 세포들의 백분율을 나타낸다.

도 4: 1차 섬유아세포들에서의 PDGF 에 의한 Ras 단백질들의 유도

건강한 공여자들(2-5 계대(passage))로부터 유래한 1차 섬유아세포들을 0.2% FCS에서 48시간 동안 항온배양한 후, 지정된 시간 동안 PDGF 15 ng/㎖로 자극시켰다.

패널 A: 전체 단백질들을 추출하고, pan-Ras 항체들과 면역침전시키고, Ha-Ras 및 Ki-Ras에 대해 특이적인 항체들로 면역블롯팅(immunoblotting)하였다. 면역블롯(immunoblot)은 각각 2회씩 수행된 3개의 독립된 실험들 중 하나를 대표적으로 나타낸 것이다. 종좌표(ordinate) 상의 DU는 PDGF 세트로 처리되지 않은 Ha Ras의 밴드를 1로 표준화한 임의 농도 단위(arbitray densitometric unit)를 보여준다.

패널 B: 0.2% FCS에서 48시간 동안 예비-항온배양된 섬유아세포들을 PDGF(15 ng/㎖)로 15분 동안 자극하고 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다. Ha- Ras 및 Ki-Ras에 특이적인 항체들로 간접 면역형광법에 의해 세포들을 염색하였다. 5번의 실험 중 하나의 실험으로부터 대표적인 실험 데이터를 나타내었다. Neg는 비면역(non-immune) 혈청들로 면역형광된 것을 보여준다. 40배 확대.

패널 C: 패널 B에 지시된 바와 같이 처리된 세포들의 Ha-Ras 항체들로 FACS 분석한 결과를 나타낸 것이다. 값들은 각각 2회 수행된 3개의 독립된 실험들의 평균 ± 1 표준편차(SD)이다. Ha-Ras에 대한 단일클론 항체(F235)와 다클론 항체(SC520)를 이용하였는데 모두 동일한 결과를 나타내었다(실시예의 재료 및 방법 참조).

패널 D: 사이클로헥시미드(6시간 동안 10 ㎍/㎖)의 존재 또는 부재하에서 PDGF(15 ng/㎖)로 자극된 정상 섬유아세포들에 있어서의 Ha-Ras 발현을 나타낸 것이다. 3번의 실험 중 하나의 실험으로부터 대표적인 실험 데이터를 나타내었다.

패널 E: 60분 동안 15 ng의 PDGF로 자극된 세포들로부터 추출된 RNA의 반정량적인 RT-PCR(실시간 중합효소 연쇄 반응) 결과를 나타낸 것이다. 이 반응들은 실시예의 재료 및 방법에 기술되어 있는 바와 같이 수행하였다. 3개의 반응(20 사이클) 중 하나의 반응으로부터 대표적인 실험 데이터를 나타내었다. 이러한 조건하에서, 특정 밴드들의 강도는 cDNA의 농도에 선형적으로 의존한다. 긴 형태의 Ki(Ki long)와 짧은 형태의 Ki(Ki short)는 3' UTR 길이에 있어서 차이가 있는 2개의 주된 Ki4B mRNA들을 의미한다.

도 5: ROS 는 1차 섬유아세포들에 있어서의 Ha - Ras 를 유도한다.

패널 A: PDGF에 의한 ROS 유도의 시간 경과(time course)를 나타낸 것이다. 건강한 공여자들(2-5 계대(passage))로부터 유래한 1차 섬유아세포들을 0.2% FCS에서 48시간 동안 항온배양한 후, 지정된 시간 동안 PDGF로 자극시켰다. PDGF(15 ng/㎖)의 존재 또는 부재하에서 DCF 형광법에 의해 정상 섬유아세포들내의 ROS를 측정하였다. 값들은 각각 2회 수행된 5개의 독립된 실험들의 평균 ± 1 표준편차(SD)이다.

패널 B: ROS 저해는 PDGF에 의한 Ha-Ras의 유도를 억제한다. 1차 섬유아세포들을 NAC(N-아세틸 시스테인)(5시간 동안 20 mM) 및 DPI(디페닐 요오도늄)(1시간 동안 20 μM)로 처리하고, 도 1의 패널 A에서와 마찬가지로 Ha- 및 Ki-Ras 레벨을 분석하였다. 3번의 실험 중 하나의 실험으로부터 대표적인 실험 데이터를 나타내었다.

패널 C: 0.2% FCS에서 48시간 동안 예비-항온배양된 섬유아세포들을 NAC(20 mM)로 미리 처리하고 PDGF(15 ng/㎖)로 15분 동안 자극하고 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다. Ha-Ras 및 Ki-Ras에 특이적인 항체들로 간접 면역형광법에 의해 세포들을 염색하였다. 5번의 실험 중 하나의 실험으로부터 대표적인 실험 데이터를 나타내었다.

패널 D: ERK 1/2에 의해 Ha-Ras의 PDGF 유도를 매개하였다. 0.2% FCS에서 48시간 동안 항온배양된 섬유아세포들을 PDGF(15 ng/㎖)로 처리하기 전에 MEK 저해제 PD98059(40 μM)로 2시간 동안 처리하였다. 도 1의 패널 A에서와 마찬가지로 pan-Ras 항체들을 이용한 면역침전과 면역블롯에 의해 Ha-Ras 레벨을 측정하였다. 또한, 추출물들을 항-PDGF R 베타-서브유닛 및 pan-Ras 항체들로 블롯팅하였다.

패널 E: ROS는 ERK 1/2의 PDGF 유도를 매개한다. 0.2% FCS에서 48시간 동안 항온배양되고 NAC(5시간 동안 20 mM) 및 DPI(1시간 동안 20 μM)로 미리 처리된 섬유아세포들을 PDGF(30분 동안 15 ng/㎖)로 처리하고, 전술하바와 마찬가지로 P-ERK 1/2 레벨을 분석하였다. 3번의 실험 중 하나의 실험으로부터 대표적인 실험 데이터를 나타내었다.

도 6: ERK 1/2는 Ras 단백질에 대한 ROS 의 영향을 매개한다.

Ras의 ROS 유도는 MEK1 저해제들에 의해 억제된다.

패널 A: PD98059(2시간 동안 40 μM)의 존재 또는 부재하에서 0.2% FCS에서 48시간 동안 항온배양된 후 H₂O₂(15분 동안 1 μM)로 처리된 항-Ha-Ras 항체를 갖는 1차 섬유아세포들의 형광 현미경 관찰 결과를 나타낸 것이다. 3번의 실험 중 하나의 실험으로부터 대표적인 실험 데이터를 나타내었다. 40배 확대.

패널 B: 0.2% FCS에서 48시간 동안 항온배양된 세포들을 H₂O₂(15분 동안 1 mM)로 처리하기 전에 MEK 저해제들, PD98059(40 μM) 및 U0126(50 μM)로 각각 2시간 및 15분 동안 처리하였다. 전체 ERK(ERK 1/2)와 이의 인산화된 형태(P ERK 1/2)에 대한 항체를 이용하여 면역블롯 분석을 수행하였다. 단일클론 항-pan-Ras 항체와 사전에 면역침전된 세포용해물상의 Ha-Ras 및 Ki-Ras에 대해 특이적인 항체들과 함께 면역블롯들을 발육시켰다. 비면역 혈청(*)을 대조군(control)로서 사용하였다. 3번의 실험 중 하나의 실험으로부터 대표적인 실험 데이터를 나타내었다. Ha-Ras 레벨의 농도 분석(densitometric analysis)은 패널의 아래 부분에 나타내었다. 3번의 실험에 대한 결과를 표준화하고, 평균 ± 1 표준편차(SD)로서의 임의 단위로 나타내었다.

패널 C: 대조군, 또는 MEK 우성 음성 변이체를 운반하는 발현 벡터 pBASE-MKK-S217A(C. Marshall, CRC, ICR, UK)로 1차 섬유아세포들을 일시적으로 감염시켰다. 전술한 바와 같이 Ha-Ras 및 P ERK 1/2 레벨을 측정하였다. 3번의 실험에 대한 결과를 표준화하고, 평균 ± 1 표준편차(SD)로서의 임의 단위로 나타내었다.

패널 D: 제니스테인(genistein)(1시간 동안 1 ㎍/㎖)의 존재 또는 부재하에서 PDGF(15분 동안 15 ng/㎖) 및 H₂O₂(15분 동안 1 mM)로 1차 섬유아세포들을 처리하였다. 값들은 각각 2회 수행한 3개의 독립된 실험들의 평균 ± 1 표준편차(SD)이다.

패널 E: 모넨신(MON)(30분 동안 0.1 mM) 또는 MG132(30분 동안 0.04 mM)로 예비 처리된 1차 섬유아세포들을 PDGF(15분 동안 15 ng/㎖) 및 H₂O₂(15분 동안 1 mM)로 처리하였다. 값들은 각각 2회 수행한 3개의 독립된 실험들의 평균 ± 1 표준편차(SD)이다.

도 7: 경피증 섬유아세포들에 있어서의 ROS - Ras 신호화의 증폭

경피증 병변으로부터 유래한 1차 섬유아세포들에 있어서의 ROS. MEK1 및 파네실 전이효소 저해제(farnesyl transferase inhibitor)들에 의한 ROS의 환원.

패널 A: ROS 검정 이전에, PD98059(2시간 동안 40 μM)로 항온배양하기 전에(0.2% FCS에서 48시간 동안 항온배양), PD98059(2시간 동안 40 μM)로 항온배양 한 후(0.2% FCS에서 48시간 동안 항온배양한 후에 PD98059(2시간 동안 40 μM)로 항온배양) 또는 파네실 단백질 전이효소 저해제, FTI-277(2시간 동안 20 μM)로 항온배양한 후에 3개의 정상(25) 섬유아세포 세포주 및 3개의 SSc(검정) 섬유아세포 세포주에서의 DCF 형광 강도(임의 단위)로서 평가된 반응성 산소종의 레벨을 나타낸 것이다. 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase)-저해가능한 사이토크롬(cytochrome) C 환원 분석에 의해 측정한 O₂ ^-와 호모바닐산(homovanilic acid) 환원 분석에 의해 측정한 H₂O₂를 나타내었다. 데이터는 각각 2회 수행한 3번의 독립적인 실험들의 평균 ± 1 표준편차(SD)이다.

경피증 세포들에 있어서의 증가된 Ha-Ras 레벨 및 활성.

패널 B:

좌측 패널: 3개의 정상(N) 섬유아세포 세포주와 3개의 SSc 섬유아세포 세포주를 이용하여 실험한 데이터를 나타낸 것이다. 면역블롯(immunoblot)들은 단일클론 항-pan-Ras 항체로 면역침전된 세포용해물상의 Ha-Ras 및 Ki-Ras에 대해 특이적인 항체들과 함께 발육시켰다. 히스토그램(histogram)은 동일한 시료에 대한 3번의 독립적인 실험으로부터 얻은 Ha/Ki 비율을 나타낸 것이다. 비면역 혈청은 대조군(*)으로 사용하였다.

우측 패널: 0.2% FCS에서 48시간 동안 항온배양된 정상 섬유아세포들 및 경피증 섬유아세포들의 형광 현미경 분석 결과를 나타낸 것이다. 항 Ha-Ras 및 Ki-Ras 항체들로 간접 면역형광법에 의해 세포들을 염색하였다. 3번의 실험 중 하나의 실험으로부터 대표적인 실험 데이터를 나타내었다. 40배 확대.

패널 C: 패널의 위 부분은 항-pan-Ras 항체들로 프로빙(probing)된 정상(N) 섬유아세포들 및 SSc 섬유아세포들로부터 유래한 전체 세포용해물 및 GST-RBD 결합 Ras 단백질들을 나타낸 것이다. 3번의 실험 중 하나의 실험으로부터 대표적인 실험 데이터를 나타내었다. SSc 섬유아세포들은 또한 음성 Ha-Ras 변이체 RasN17로 감염시켰다. 패널의 아래 부분은 3번의 독립된 실험에 있어서의 밴드들의 농도 분석(평균 ± 1 표준편차(SD))를 나타낸 것이다. 일부의 세포들만이 외인성 전이우성(transdominant) 음성 Ras를 발현시키기 때문에, Ras 저해는 완전하지 못하였다.

패널 D: 정상 섬유아세포들 및 경피증 섬유아세포들로부터 추출한 전체 단백질들(50 ㎍)의 면역블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 3개의 정상(N) 섬유아세포 세포주들 및 3개의 경피증(SSc) 섬유아세포 세포주들은 수확하기 전에 혈청의 부재하에서 배양(0.2% FCS에서 48시간 동안 항온배양)하거나 또는 혈청의 존재하에서 배양(0.2% FCS에서 48시간 항온배양한 후 10% FCS에서 15분 동안 항온배양)하였다. 인산화된 형태의 ERK 1/2. AKT 및 JNK는 인-특이적(phospho-specific) 항체들을 이용한 면역블롯팅에 의해 검출하였다. 3번의 실험 중 하나의 실험으로부터 대표적인 실험 데이터를 나타내었다.

도 8: 경피증 섬유아세포들의 가속화된 노화( senescence )

패널 A: 경피증 섬유아세포들에 있어서의 DNA 손상 조절점(DNA damage checkpoint)의 활성화를 나타낸 것이다. 또한, 인산화된 히스톤(phosphorylated histone) H2AX 또는 p21WAF를 인식하는 특이적인 항체들을 이용한 면역블롯을 나타 낸 것이다. 3번의 실험 중 하나의 실험으로부터 대표적인 실험 데이터를 나타내었다. ERK 1/2에 대한 다클론 항체는 적재된 단백질의 양을 표준화하는데 사용하였다.

패널 B: 경피증 섬유아세포들에 있어서의 염색체 손상을 나타낸 것이다. 경피증 병변들로부터 유래한 1차 섬유아세포들의 3개의 세포주의 핵형 분석 (karyotype analysis)을 나타낸 것이다. 이들 세포주를 2 계대(passage) 동안 배양하고, FTI-277(10 ㎍/㎖)로 48시간 동안 처리하였다. 3개의 정상적인 1차 섬유아세포들을 비롯하여 각 세포주들에는 적어도 50개 이상의 중기(metaphase)가 관찰되었다. 정상 세포주들에 있어서의 변경된 중기들의 빈도는 FTI(48시간 동안 10 ㎍/㎖)의 존재 또는 부재하에서 대략 4%±2%이었다(데이터는 나타나 있지 않음). 발견된 이상(異常, aberration)은 세포들의 생체외 성장으로부터 유래한 인공산물(artefact)가 아니었는데, 이는 제 1 계대에서는 세포들이 존재하지 않았기 때문이다. 일부 변형(alteration)들은 배양에 있어서의 초기 계대로부터 분석 시간까지 경과된 시간에 의존하여 보다 빈번하게 일어났다. 우측 패널은 SSc 세포들에서 발견된 대표적인 염색체 변형들을 나타낸다.

패널 C: 경피증 세포들에 있어서의 산화성 스트레스-유도 아팝토시스(oxidative stress-induced apoptosis)를 나타낸다. MEK 저해제 PD 98059(40 μM)의 존재 또는 부재하에서 H₂O₂의 농도를 증가시키면서 H₂O₂로 2시간 동안 정상(N) 및 SSc 섬유아세포들을 자극시켰다. 이어서, 아넥신 V-C 염색된 세포들의 FACS 분 석에 의해 아팝토시스를 검출하였다. 다이어그램은 아넥신 V 양성 세포들의 백분율을 나타낸다. 데이터는 3번의 독립된 실험의 평균 ± 1 표준편차(SD)이다.

패널 D: 경피증 세포들에 있어서의 ROS-유도가능한 유전자들의 활성화를 나타낸 것이다. 또한, SSc 세포들에 있어서의 ROS에 의한 콜라겐 프로모터(promotor)의 활성화를 나타낸 것이다. 정상(N) 또는 경피증(SSc) 세포들은 인간 카탈라제 유전자를 발현시키는 벡터(pCat, 10)와 함께 또는 인간 카탈라제 유전자를 발현시키는 벡터(pCat, 10)없이 루시페라제 유전자(Col1A2)의 발현을 유도하는 알파2(I) 콜라겐 프로모터로 감염시키거나 속이 빈 벡터(empty vector)(pGL3)로 감염시켰다. 반딧불 루시페라제(firefly luciferase)에 대한 레닐라 루시페라제(renilla ruciferase)의 비율은 공감염(co-transfection) 실험들을 표준화하는데 사용하였다. 데이터는 평균 ± 1 표준편차(SD) (n=3)으로서 표현되었다.

패널 E: SSc 섬유아세포들을 PD 98059(24시간 동안 40 μM) 및 FTI-277(24시간 동안 20 μM)과 항온배양하거나 또는 인간 카탈라제 유전자를 운반하는 발현 벡터로 감염시킨 후의 알파1(I) 및 알파2(I) 콜라겐 mRNA를 나타낸 것이다. 또한, H₂O₂로 24시간 동안 자극된 정상 세포들에 있어서의 콜라겐 mRNA들을 나타낸 것이다. 3번의 실험 중 하나의 실험으로부터 대표적인 실험 데이터를 나타내었다.

도 9: Ras 와 ROS 를 연결시키는 회로( circuitry )

PDGF에 의해 개시되고, NADPH 산화효소에 의한 ROS 생산을 유발하는 회로를 설명하는 모식도(schmatic diagram)를 나타낸 것이다. ROS는 Ha-Ras를 유도하는 ERK 1/2를 활성화시킨다. 일단 유발되기만 하면 회로는 PDGF 신호화에 비의존적으로 된다. 이 루프(loop)는 경피증 세포들내에서 증폭된다.

하기 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이므로, 본 발명의 범주가 하기 실시예에 국한되는 것으로 해석되어서는 아니된다.

환자, 재료 및 방법

시약

둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium), FCS(우태아 혈청), L-글루타민 및 pen-strept-anfotB 용액을 Gibco사(이태리 밀란 소재)로부터 구입하였다. 재조합 혈소판-유도 성장 인자 BB(PDGF-BB)를 Peprotech사(미국 뉴저지주 록키 힐 소재)로부터 구입하였고; FTI-277, 파네실 단백질 전이효소 저해제 H-Ampamb-Phe-Met-OH, 및 PD 98059를 Calbiochem사(미국 캘리포니아주 샌디애고 소재)로부터 구입하였다. 제니스테인을 ICN Biomedicals사(미국 오하이오주 오로라 소재)로부터 구입하였다. 항 Ha-Ras(F235 또는 SC520), 항 Ki-Ras(F234), 항 pan-Ras(F132) 및 항 Rac1 항체들을 Santa Cruz사(미국 캘리포니아주 소재)로부터 구입하였다. 항 phospho-p44/42 MapKinase, 항 phospho-SAPK/JNK 및 항 Akt를 Cell Signaling Technology사(미국 매사츄세츠주 베버리 소재)로부터 구입하였다. 항 H2AX 및 항 p21WAF 항체들을 Upstate Biotechnology사(미국 버지니아주 샬로츠빌 소재)로부터 구입하였고; 디페닐 요오도늄(DPI)를 Alexis Biomedicals사(스위스 란 센 소재)로부터 구입하였고, N-아세틸-L-시스테인(NAC) 및 시클로헥시미드를 Sigma사(미국 미주리주 세인트루이스 소재)로부터 구입하였다. U0126을 Promega사(미국 위스콘신주 매디슨 소재)로부터 구입하였고, 2',7'-디클로로플루오레신 디아세테이트(DCFH-DA)를 Molecular Probes사(미국 오리건주 유진 소재)로부터 구입하였다. 하기 플라스미드(plasmid)들을 사용하였다: 우성 음성 Ha-RasN17, 인간 Ha-Ras의 V12 양성 변이체 및 인간 Ki-Ras의 V12 양성 변이체 (참고 문헌 7 참조), 우성 음성 Rac 변이체(Rac1N17), 우성 양성 Rac 변이체(Rac1V12) (참고 문헌 13 참조), 우성 음성 MEK 변이체 pBabe-MKK-S217A(랫트 유전자 은행 z30163). 콜라겐 α1(I)(Hf677 클론) 및 콜라겐 α2(I)(Hf32 클론)에 대한 cDNA는 Dr. Ch M. Lapiere(벨기에 리게대학교의 Laboratorie de Biologie des Tissues Conjonctifs)로부터 공여받았다.

환자

경피증을 앓고 있으며 평균 연령이 58세(35세∼77세)인 46명의 코카사스 인종 환자(남자 8명, 여자 38명)를 대상으로 연구하였다. ACR 예비 기준(참고 문헌 11 참조)에 따라 진단을 행하고, LeRoy 등의 분류 방식(참고 문헌 12 참조)에 따라 환자들을 전신성(diffuse) SSc와 국부성(limited) SSc의 2가지 아종(subset)로 분류하였다. 또한, 전신성 SSc 아종에 속하는 환자들은 초기 질환(early disease)(질환 기간 2년 이하)의 환자와 만기 질환(late disease)(질환 기간 2년 초과)의 환자로 나누었다. 환자들은 연구 시점 이전에 6주 동안 치료를 받지 않았다. 연구 대상 개체들의 인구통계학적(demographic) 및 임상적 특징들은 하기 표 1에 제시되어 있 다.

환자 및 대조군의 인구통계학적 특징

그룹	N°	M/F	아종(subset)		평균 연령 (범위)	레이노 증후군의 평균 기간 (범위)	질병의 평균 기간 (범위)
			ISSc	dSSc
SSc	46	8/38	24	22	58세 (35세-77세)	14세 (2세-50세)	7세 (<1세-48세)
PRP	15	2/13			42세 (22세-70세)	6세 (2세-25세)	6세 (2세-25세)
LES	14	1/13			36세 (26세-50세)		7세 (1세-23세)
AR	15	2/13			65세 (22세-91세)		11세 (1세-28세)

레이노 증후군은 경피증의 발전에 따라 해가 거듭할수록 진전되기 때문에, 1차 레이노 증후군(PRP)이 있는 15명의 환자를 연구 대상에 포함시켰다(표 1 참조). 후술하는 참고 문헌(13)에 보고된 기준에 따라 PRP의 진단을 행하였다. 또한, 나이, 성별 및 인종에 따라 적절히 선발된 20명의 건강한 지원자들을 평가하고, 이들을 대조군으로 하였다. 대조군 그룹은 성별 및 나이에 따라 적절히 선발된, 전신성 홍반성 낭창을 앓고 있는 15명의 환자들과 류마티스성 관절염을 앓고 있는 15명의 환자들을 포함하였는데, 상기 환자들의 전신성 홍반성 낭창과 류마티스성 관절염은 확립된 표준(참고 문헌 14 및 15 참조)에 따라 진단되었다.

충분한 설명에 의한 동의(informed consent) 후, 21℃에서 30분 동안 순화(acclimatization) 후에 환자들 및 대조군들로부터 혈액 시료를 채취하고, 응혈(clot) 형성 후에 냉동 원심분리기(refrigerated centrifuge)에서 원심분리하였다. 상청액을 수집하고, 분석시까지(통상적으로는 4주 이내) -30℃에서 저장하였다.

세포주

마우스 배아 섬유아세포는 PDGFR 서브유닛(F-/- 세포들)의 α 및 β 사슬들을 발현시키지 않는 PDGF 수용체 녹아웃(knock-out) 배아로부터 얻었으며, PDGFR α 및 β 서브유닛(Fα; Fβ: Fαβ)으로 감염된 F-/- 세포들은 관련 참고 문헌(16)에 기술되어 있다.

1차 섬유아세포 배양

인간 피부 섬유아세포는 정상적인 지원자들의 상박(forearm), 및 참고 문헌(14)에 기재되어 있는 바와 같은 전신성 경화증의 진단을 위한 미국 류마티스 협회의 예비 기준을 통과한 환자들의 피부에서 채취한 펀치 생검(punch biopsies)으로부터 수득하였다. 제 4 계대 내지 제 6 계대의 섬유아세포들은 모든 실험에 사용하였다.

IgG 의 정제

정상적인 개체, 경피증 환자, 전신성 홍반성 낭창 환자 및 류마티스성 관절염 환자의 혈청으로부터 단백질 A/G-세파로스 칼럼(미국 일리노이주 록포드 소재 Pierce사의 제품) 상에서의 친화 크로마토그래피(affinity chromatography)에 의해 IgG 분획(fraction)들을 정제하였다. 단백질 농도는 분광광도법 (spectrophotometry)에 의해 평가하였다. 모든 제제들은 리물루 아메보사이트 검정 (Limulus amoebocyte assay)에 의한 측정시 엔도톡신(endotoxin)이 없었다.

항- PDGFR 자가항체들에 대한 생물검정( bio - assay )

환자들 및 대조군의 혈청 시료는 PDGFR α 및/또는 β 서브유닛들로 감염되고 생체외에서 면역정제된(immunopurified) IgG에 노출된 마우스 배아 섬유아세포에 의한 ROS의 생성에 기초한 기능적 생물검정(functional bioassay)에 있어서 자가항체들을 활성화하는 PDGFR의 존재에 대하여 시험되었다. 대조군 세포들은 PDGFR이 결여된 F-/- 세포들이었다. 간단히 말해서, 1.8㎠의 웰(well) 내의 30,000개의 세포들의 밀도로 세포들을 이중으로(in duplicate) 도말하고, 0.2% 우태아 혈청에서 37℃에서 24시간 동안 항온배양하였다. 이어서, ROS 생성 측정 전에, 세포들을 인산염 완충 식염수로 세척하고, 37℃에서 15분 동안 예정된 양의 대조군 또는 환자 IgG로 항온배양하였다.

37℃에서 15분 동안 세포들에 2',7'-디클로로플루오레신 디아세테이트(DCFH-DA 10 μM, 분자 프로브, 네덜란드의 PoortGebouw사의 제품)를 적재한 후에, 부착성(adherent) 섬유아세포들에 의해 생성되는 세포내 ROS의 형광정량 측정을 평가하였다.

DCF 형광 강도는 CytoFluor 평판 판독기(핀란드 발락 소재 PerkinElmer사의 제품)(여기 파장: 485nm; 방사 파장: 530nm)(참고 문헌 8 참조)에 의해 측정하였다. 10개의 선명한 지점(distinct point)으로부터 각 단일 웰에서 10회 측정하고, 값들을 평균하였다. 각 IgG 샘플에 대하여 2회 측정하고, 평균을 기록하였다. 결과는 시험 대상 IgG의 DCF 형광 광도에서 IgG없이 배양된 세포들에 의해 수득된 음성 대조군의 DCF 형광 강도를 빼서 계산된 DCF 형광 강도로서 표현하였다. 플레이트내(intra-plate) 및 플레이트간(inter-plate)의 변이 계수는 3% 미만이었다. 시료는 SI가 정상 그룹의 평균 + 3 표준편차를 초과하는 경우에는 양성으로 기록하였다.

선별된 실험에서, Ras 파네실화(FTI-277; 2시간 동안 20 μM)를 차단하기 위하여 PDGF 수용체 티로신 키나제 저해제(AG 1296; 2시간 동안 2 μM), 상피 성장 인자(EGF) 수용체 티로신 키나제 저해제(AG 1478; 2시간 동안 2 μM), ERK 1/2 신호화의 화학적 저해제(PD 98059; 2시간 동안 40 μM), 및 파네실 단백질 전이효소 저해제의 첨가 후에 ROS 생성을 평가하였다. AG 1296, AG 1478, PD 98059 및 FTI-277은 Calbiochem사(미국 캘리포니아주 샌디애고 소재)로부터 구입하였다.

세포 용해( cell lysis ) 및 면역블롯팅( immunoblotting )

0.3 ㎖의 냉(冷) RIPA 완충액(1×PBS, 1% Nonidet P-40, 0.5% 소듐 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 2mM 소듐 오르토바나데이트, 2㎍/㎖ 아프로티닌, 1mM PMSF)을 이용하여 세포 배양판에서 세포 용해하고, 참고 문헌(8)에 기재되어 있는 바와 같이 면역블롯팅을 진행하였다.

면역침전 검정

200㎍의 IgG로 배양된 세포로부터 PDGF 수용체를 면역침전시켰다. 면역복합체(immunocomplex)들을 분리하고, 전기영동하고, 항 PDGFR α 및 β 서브유닛 항체(Santa Cruz)들로 면역블롯팅하고, 화학발광(chemiluminescence)(스웨덴 Amersham사의 제품 이용)에 의해 노출시켰다.

Ras 단백질들은 제조업체에서 추천하는 방법에 따라 다클론 항 pan-Ras 항체(미국 캘리포니아주 산타 크루즈 소재 Santa Cruz Biotechnology사)로 배양된 섬유아세포들로부터 면역침전시켰다. 면역복합체들을 분리하고, 전기영동하고, 항 Ha-Ras 항체들로 면역블롯팅하고, 화학발광(chemiluminescence)(스웨덴 Amersham사의 제품 이용)에 의해 노출시켰다.

면역블롯팅

0.3 ㎖의 냉(冷) RIPA 완충액(1×PBS, 1% Nonidet P-40, 0.5% 소듐 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 2mM 소듐 오르토바나데이트, 2㎍/㎖ 아프로티닌, 1mM PMSF)을 이용하여 세포 배양판에서 세포 용해하고, 참고 문헌(14)에 기재되어 있는 바와 같이 면역블롯팅을 진행하였다.

재조합 PDGF 수용체를 이용한 자가항체의 흡수

4℃에서 2시간 동안 경피증 IgG(200 ㎍/㎖)를 Fα 세포들에 의해 발현된 재조합 PDGFR과 항온배양하였다. 이어서, 이 혼합물을 원심분리하고(4℃에서 15분 동안 14,000g), 상청액을 항원 공급원으로서의 PDGFR α 서브유닛(독일 비바덴 소재 R&D Systems사) 세포외 영역과 면역침전시키고, PDGFR 밴드가 제거되었는지 여부를 시험하였다. F-/- 세포들을 대조군 세포들로 사용하였다. 항 PDGFR α 및 β 서브유닛 항체(Santa Cruz)들로 면역블롯을 공격하고, 화학발광(chemiluminescence)(스웨덴 Amersham사의 제품 이용)에 의해 노출시켰다.

면역형광

Lab-Tek 챔버 유리 슬라이드(미국 일리노이주 소재 Nalge-Nunc사) 상에서 배양되고 자극 또는 저해제 첨가 전에 48시간 동안 굶은 섬유아세포들을 4% 파라-포름알데히드에 의해 고정시키고, 0.1% 트리톤-X에 의해 투과시키고, Ha-Ras에 대한 단일클론 항체들로 염색한 후, 테트라메틸로다민-이소티오시아네이트(TRITC) 결합된 2차 항체(Molecular Probes, NL)로 염색하였다. 슬라이드에 Vectarshield(H-100; 벡터, 미국 캘리포니아주 버링검 소재)를 적재하고, 아르곤 및 헬륨/네온 레이저가 장착된 BioRad(영국 Hemel Hempstead사) 마이크로라디안 공초점 레이저-주사 현미경을 이용하여 검사하였다. Laser Sharp Processing BioRad 소프트웨어(버젼 3.2)를 이용하여, 획득된 상(이미지)들을 분석하였다. 상이한 슬라이들로부터 유래한 모든 상들은 이중 맹검 방식으로 획득하였다.

RNA 분리 및 노던 블롯 ( Nothern blot ) 분석

Rneasy Mini 키트(독일 힐든 소재 Qiagen사)를 이용하여 전체 세포성 RNA를 추출하였다. 이어서, 참고 문헌(7)에 기재된 방법에 따른 노던 블롯 분석에 10 마이크로그램의 전체 RNA를 사용하였다.

아팝토시스 분석

탯줄(umbilical cord)로부터 내피 세포들을 분리한다. PDGFR 및 EGFR 티로신 키나제 활성 저해제의 존재 또는 부재하에서 12시간 동안 SSc IgG(200 ㎍/㎖), 정상 IgG(200 ㎍/㎖) 및 PDGF(15 ng/㎖)로 세포들을 자극하였다.

정상 및 경피증 섬유아세포들 80-90% 융합(confluence)될 때까지 성장시키고, 2시간 동안 상이한 농도의 H₂O₂로 처리하였다. 필요한 경우, 30분 동안 PD 98059(40 μmol/L)와 예비항온하였다.

자극을 제거한지 6시간 후에 아넥신 V-Cy3(미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재 Clontech사)를 이용한 FACS 분석에 의해 아팝토시스를 검출하였다.

통계적 분석

데이터는 평균 ± 1 표준편차로서 표현하였다. 스튜던트(Student's) 쌍(paird) 및 독립(unpaired) t-검정을 이용하여 평균값을 비교하였다. 0.05 미만의 P 값은 유의적인 것으로 간주되었다. 모든 값은 양쪽 검증(2-tailed)된 것이다.

항 Ha - Ras 항체를 이용한 유동 세포계측 분석( flow cytometric analysis )

60 mm 배양 접시에서 반융합(semiconfluency)될 때까지 세포들을 성장시켰다. 트립신 분리(trypsin detachment) 후에, 1㎖의 인산염 완충 식염수(PBS) 중에 5×10⁵개의 세포들을 현탁시키고, 실온에서 1% 포름알데히드를 이용하여 밤새도록 고정시켰다. 그 후, 4℃에서 40분 동안 0.1% 트리톤X100으로 세포를 투과시키고, 2% FBS, 0.01% NaN₃ 및 0.1% 트리톤X100을 함유하는 2㎖의 PBS(완충액 A)로 4회 세척하고, 단일클론 및 다클론 항 Ha-Ras 항체들(미국 캘리포니아주 산타크루즈 소재 Santa Cruz Biotechnology사)의 1:50 희석물과 4℃에서 45분 동안 항온배양하였다. 이어서, 동일한 완충액으로 세포들을 2회 세척하고, Cy2-결합 항-마우스 IgG 항체들(이탈리아 밀라노 소재 Amersham Pharmacia Biotech사)의 1:50 희석물과 4℃에서 45분 동안 항온배양하였다. 오직 Cy2-결합 항-마우스 IgG 항체들과 대조군 항체를 항온배양하였다. 완충액 A로 2회 세척한 후, 세포들을 PBS 중에 재현탁시키고, FACScan(독일 하이델베르크 소재 BD사) 및 WinMDI 소프트웨어를 이용하여 유동 세포계측 분석을 수행하였다.

ROS 측정

DCF 형광 레벨(참고 문헌 15 참조)을 평가하기 전에, 37℃에서 15분 동안 세포에 DCFH-DA(10 μM)을 적재한 후, 섬유아세포에 의해 생성된 세포내 ROS의 형광정량 측정을 행하였다. 수퍼옥사이드 디스뮤타제-억제가능한 사이토크롬 c 환원(참고 문헌 12 참조)을 이용하여, 수퍼옥사이드 음이온 방출을 평가하였다. Valletta 및 Berton의 방법(1987)(참고 문헌 16 참조)의 개량법을 이용하여, 섬유아세포로부터 중복 배지(overlying medium)으로의 H₂O₂의 방출을 평가하였다. 참고 문헌 12 및 17에 기재되어 있는 바와 같이, 살아있는 감염된 세포들에 있어서의 산화적 활성 이미징(oxidative activity imaging)을 평가하였다.

Ras 활성 분석

빙냉(ice cold) PBS 중에서 세포들을 세척하고, 플레이트당 0.5 ㎖의 세포용해 완충액(20 mM 헤페스(Hepes), pH 7.4, 1% NP40, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 10% 글리세롤, 1 mM EDTA, 1 mM Na 바나데이트, 10 mg/㎖ 류펩틴(leupeptin) 및 10 mg/㎖ 아프로티닌(aprotinin))으로 세포용해시켰다. 원심분리(4℃에서 13,000 rpm)에 의해 세포용해물들을 세정하고, 세포용해 완충액을 이용하여 1 mg/㎖로 희석시켰다.

1 mM의 IPTG를 이용하여 1-2 시간 동안 형질전화된 에스체리치아 콜라이(Escherichia coli)에서의 GST-RBD 발현을 유도하고, 글루타티온-세파로스 비드(bead)들상에서 융합 단백질을 정제하였다. 20 mM 헤페스(Hepes), pH 7.4, 120 mM NaCl, 10% 글리세롤, 0.5% NP40, 2 mM EDTA, 1 mM Na 바나데이트, 10 mg/㎖ 류펩틴(leupeptin) 및 10 mg/㎖ 아프로티닌(aprotinin)를 함유하는 용액 중에서 상기 비드들을 세척하였다. 친화 침전(affinity precipitation)의 경우, 록킹(rocking)하면서 4℃에서 60분 동안 글루타티온-세파로스(30 ml의 패킹된 비드들)에 미리 결합된 GST-RBD와 세포용해물들을 항온배양하였다. SDS-PAGE 시료 완충액으로 결합된 단백질들을 용출시키고, 12% 아크릴아미드 겔들 상에서 분해시키고, 웨스턴 블롯팅하였다. 항 Ras, 클론 Ras 10(Upstate Biotechnology사)으로 블롯들을 프로빙하였다.

감염( transfection )

감염 실험의 경우, 배양 배지 내의 100mm의 접시에 융합 섬유아세포(confluent fibroblast)들을 도말하였다. 24시간 후, 배지를 버리고, 신선한 배양 배지로 대체하고, 세포들을 감염시켰다. 리포좀 방법(독일 힐덴 소재 Qiagen사의 Effectene)을 이용하여 감염 실험을 이중으로 수행하였다.

선별된 실험에서, 전술한 방법에 따라, 인간 타입 I 콜라겐 α2 사슬 유전자(COL1A2)(참고 문헌 20 참조)의 프로모터를 클로닝함으로써 수득된 재조합 플라스미드 pGbC1A2-P를 인간 카탈라제 유전자를 운반하는 PS3CAT(볼티모어 존스 홉키스의 Dr. Irani가 제공한 것임) 또는 대조군 벡터와 공감염시켰다. TD-20/20 발광측정기(luminometer)(Turner Design)으로 시료의 루시페라제 활성을 측정하고, 레닐라 대(對) 반딧불 루시페라지의 비(比)를 이용하여 공감염 실험을 표준화하였다.

Ha - Ras 및 Ki - Ras mRNA 의 RT - PCR

참고 문헌 18에 기술되어 있는 바와 같이, 전체 RNA 및 cDNA 합성을 수행하였다. Ha-Ras, Ki-Ras 및 액틴 유전자에 특이적인 프라이머의 존재하에 MgCl₂를 함유하지 않는 완충액에서 Ampli Taq Gold(PE Applied Biosystems) 1 유닛(unit)으로 2㎕의 cDNA 산물(전체 RNA 2.5㎍으로부터 유래함)을 증폭시켰다(하기 참조). 역전사 반응으로부터 산출된 dNTP들의 양은 추가의 증폭을 위해 충분하다. 유전자 증폭 PCR 시스템(Gene Amp PCR system) 9600에서 반응들을 수행하였다. 95℃에서 10분, 65℃에서 45초 및 72℃에서 1분의 첫번째 사이클(cycle) 이후에 95℃에서 45초, 65℃에서 45초, 그리고 72℃에서 1분의 사이클이 30번 수반된다.

분석된 cDNA들이 증폭 프로토콜의 말기에 플래토(plateau)에 이르지 않게 하고(즉, 분석된 cDNA들이 증폭의 대수기(exponential phase)에 있도록 하고), 각각의 반응에 사용되는 2 세트의 프라이머들이 서로 경쟁하지 않도록 하는 조건을 선택하였다. 각 세트의 반응들은 항상 비(非)시료 음성 대조군(no-sample negative control)을 포함하였다. 본 발명자들은 통상적으로 c-DNA 대신에 RNA를 함유하는 음성 대조군을 사용하여 게놈 DNA 오염을 방지하였다. 하기 프라이머들을 사용하였다:

Ki-Ras 긴 왼쪽 프라이머: ACATCTCTTTGCTGCCCAAT(서열 번호 1)

Ki-Ras 긴 오른쪽 프라이머: GAGCGAGACTCTGACACCAA(서열 번호 2)

Ki-Ras 짧은 왼쪽 프라이머: TCGACACAGCAGGTCAAGAG(서열 번호 3)

Ki-Ras 짧은 오른쪽 프라이머: AGGCATCATCAACACCCTGT(서열 번호 4)

Ha-Ras 왼쪽 프라이머: CCAGCTGATCCAGAACCATT(서열 번호 5)

Ha-Ras 오른쪽 프라이머: AGGTCTCGATGTAGGGGATG(서열 번호 6).

세포유전학적 분석

FTI-277(20 μM)과 24시간 항온배양하기 전후에 섬유아세포에 대한 세포유전학적 연구를 수행하였다. 35mm 페트리(Petri) 접시에 배치된 커버 글라스 상에서 섬유아세포들을 배양하였다. 2㎖의 Chang Medium

B의 첨가 후, 37℃의 5% CO₂ 항온배양기에서 48시간 동안 항온배양하고, 90분 동안 콜세미드(Colcemid) 용액(0.1 ㎍/㎖)을 첨가한 후에 배양액을 수확하였다. 커버 글라스를 고정시키고, 표준 방법에 따라 Q-밴딩을 하였다. 형광 현미경 Zeiss Axioplan 2를 사용하여 평가를 수행하였다. MacKtype 5.4 소프트웨어가 장착된 개인용 컴퓨터에 연결된 전하결합소자 카메라(이태리의 Powergene Olympus사)를 사용하여 이미지를 포획하였다. 인간 세포유전학적 명명법에 대한 국제 시스템(ISCN)의 기준에 따라 염색체 동정 및 핵형(karyotype) 지정을 하였다.

염색질( chromatin ) 추출 및 H2AX 인산화

0.2 ㎖의 완충액(120 mM NaCl, 40 mM 헤페스(Hepes), 5 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 0.5 mM EDTA, 0.6% 트리톤X100, 2 mM 소듐 오르토바나데이트, 2 ㎍/㎖ 아프토티닌, 1 mM PMSF)를 이용하여 세포 배양판에서 세포용해를 수행하고, 4℃에서 15분 동안 14000×g에서 원심분리하고, Bio-Rad 단백질 분석법(참고 문헌 12 참조)을 이용하여 단백질 함량을 측정하였다. 80-100 U의 Dnase를 함유하는 40㎕의 완충액에 펠렛을 재현탁시키고, 얼음 위에서 15분 동안 항온배양하였다. 추출물을 변성시키고, 12% SDS-PAGE에 용해시켰다. 전술한 바와 같이 특이 항체들을 이용한 면역블롯팅을 수행하였다.

통계적 분석

데이터는 평균 ± 1 표준편차(SD)로서 표현하였다. 스튜던트(Student's) 쌍(paird) 및 독립(unpaired) t-검정을 이용하여 평균값을 비교하였다. 0.05 미만의 P 값은 유의적인 것으로 간주되었다. 모든 값은 양쪽 검증(2-tailed)된 것이다.

결과

경피증 환자들로부터 유래한 면역글로불린들은 ROS 를 유도하고, PDGF 수용체와 반응한다.

생체외에서 SSc 섬유아세포들은 자발적으로 ROS를 방출하고(참고 문헌 7 참조), SSc 환자들로부터 유래한 IgG는 정상적인 인간 섬유아세포들을 결합시킨다(참고 문헌 10 참조). PDGF는 ROS의 축적을 유도하기 때문에(참고 문헌 9 참조), 본 발명자들은 PDGFR을 표적하는 아고니스트 혈청 항체(agonistic serum antibody)들이 SSc 환자들에 존재할 수 있는지 여부에 대하여 조사하였다. 이 가설을 시험하기 위하여, 본 발명자들은 전신성 경화증 환자들로부터 유래한 전체 IgG를 정제하고, 다음과 같은 것들을 측정함으로써 상기 아고니스트 혈청 항체(agonistic serum antibody)들의 생물학적 활성을 측정하였다: 1. ROS 레벨; 2. PDGFR의 티로신 인산화; 3. 특정 PDGFR 저해제의 존재 또는 부재하에서의 ERK 1/2 활성. 본 발명자들은 대조표준으로서의, α 및 β PDGFR 서브유닛들의 미반응 복제물을 운반하는 마우스 배아 세포주를 표적 세포로 사용하였다. 재조합 α 및 β PDGFR 서브유닛들(Fα, Fβ 및 Fαβ)을 발현시키는 동일한 세포주를 각종 IgG 분획들로 공격하였다. 세포들을 굶기고, 정제된 IgG로 처리하여 ROS를 측정하기 이전에 퍼옥사이드-감작성 형광발색단(peroxide-sensitive fluorophore) DCF와 항온배양하였다.

SSc IgG는 Fα, Fβ 및 Fαβ에서의 ROS 생성을 용량 의존적 방식으로 자극하였다. ROS는 IgG 첨가 후 15분에 최대 레벨로 신속하게 증가하였고, 40-120분에 기준선(baseline)으로 복귀되었다. 정상 IgG와 SSc IgG의 구별은 약 200 ㎍/㎖의 IgG와 Fα 세포들을 이용할 때 가장 잘 되었다. 특별한 언급이 없는 한 이러한 조건은 모든 후속 실험들에 적용되었다.

그 후, 본 발명자들은 연관성이 없는 46명의 경피증 환자들의 그룹에서의 자극성 IgG의 유포(prevalence)를 시험하였다. 도 1A는 SSc IgG(20000개의 세포당 15분 동안 200 ㎍/㎖; 168.8±59)에 의해 유도된 ROS 레벨이 정상 IgG(1.4±2.9), PRP IgG(5.1±7), SLE IgG(4.8±9) 및 RA IgG(2.7±7)와 항온배양한 후에 생성되는 ROS보다 유의적으로 높다(P<0.0001)는 것을 나타낸다. 정상 값의 상한으로서 95%를 사용하여, 정상 개체가 아닌 모든 경피증 환자들에서 ROS 레벨을 자극하는 항체들을 발견하였다(도 1A). 전신성 홍반성 낭창(SLE)이 있는 환자들 및 류마티스성 관절염(RA)이 있는 환자들 뿐만 아니라 1차 레이노 증후군(PRP)이 있는 환자들에서는 항체들이 검출되지 않았다. SSc IgG의 ROS-유도 활성은 PDGFR에 의해 매개된다. 이는 다음과 같은 것들에 의해 나타난다: 1. SSc IgG와 항온배양된 Fα 세포들내에 유도된 ROS는 PDGFR 티로신 키나제 저해제 AG 1296(2시간 동안 2 μM)과 세포들의 예비-항온배양에 의해 저해되었다(도 1A); 2. SSc IgG는 F-/- 세포들내에서 ROS를 자극하지 않았다(도 1A); 3. 정상 개체로부터 유래한 IgG가 아닌 SSc IgG는 PDGFR 발현 세포들로부터 유래한 PDGFR α 및 β 서브유닛들을 면역침전시켰다(도 1B); 4. 경피증 IgG로부터 유래한 PDGFR-상호작용 항체들은 Fα 세포들과의 예비 흡착(pre-absorption)에 의해 완전히 제거되었다(도 1C). 반대로, F-/- 세포들과의 예비 흡착은 PDGFR-상호작용 항체들을 제거할 수 없었다(도 1C). 더욱이, Fα 세포들과의 흡착(absorption) 후의 상청액은 ROS 생성을 자극하지 않았다(데이터는 나와 있지 않음).

경피증 환자들로부터 유래한 IgG 는 정상 섬유아세포들에 있어서의 Ras - ERK 1/2-ROS 케스케이트(cascade)를 유발한다.

SSc 환자들로부터 유래한 IgG에 의해 유발된 신호화 캐스케이드(signaling cascade)를 차단하기 위하여, 본 발명자들은 다음과 같은 특정 저해제의 존재하에서 SSc IgG(3명의 환자 vs. 3명의 정상 대조군)의 ROS-생성 활성을 분석하였다: 1. EGFR 신호화 저해제(AG 1478, 2시간 동안 2 μM); 2. 세포질막에의 Ras의 부착에 필요한 파네실 전이효소 저해제, FTI-277(2시간 동안 20 μM); 3. MEK 저해제, 업스트림 ERK 1/2에 위치한 키나제, PD 98059(2시간 동안 40 μM). 이들 저해제들은 정상 섬유아세포들에서 SSc IgG에 의한 ROS 유도를 방지하였다(도 2A). 반대로, 이들 저해제들은 경피증 병변들로부터 유래한 섬유아세포들에 있어서의 ROS 레벨을 유의적으로 감소시켰다(참고 문헌 8 참조). PDGFR을 통해 SSc IgG에 의해 유발된 특정 신호화 캐스케이드에 대한 통찰을 얻기 위하여, 본 발명자들은 SSc 세포들, 또는 SSc IgG로 공격된 정상 세포들에 있어서의 Ras의 생물학적 활성을 분석하였다. 본 발명자들은 PDGF와 SSc IgG 모두 1차 세포들에서 Ras 단백질 레벨을 유도한다는 것을 밝혀내었다. 이러한 효과는 ERK 1/2 의존적이며, 1차 세포들에 특이적인 것이다. 도 2B는 SSc 환자들로부터 유래한 IgG가 Ha-Ras를 유도하고, 특정 항체들을 이용한 면역형광과 면역블롯에 의해 나타난 바와 같이, 이러한 유도가 PDGFR 저해제에 의해 방지된다는 것을 보여준다.

보다 정확하게 SSc IgG의 표적을 측정하기 위하여, 본 발명자들은 2명의 SSc 환자들, 1명의 SLE 환자 및 2명의 정상 개체들로부터 유래한 IgG를 동일한 단백질 농도(200 ㎍/㎖)에서 면역침전시켰다. PAGE 상에서 면역침전물들을 분리하고, 보나 피데(bona fide) PDGFR α 및 β 서브유닛들 및 항-EGFR 항체들을 이용하여 면역블롯팅하였다.

도 2C는 SSc 환자들로부터 분리된 IgG만이 PDGFR α 및 β 서브유닛들을 효과적으로 면역침전시켰다는 것을 보여준다. SSc 환자들의 혈청으로부터 분리된 IgG는 직접 면역블롯에 의해 PDGFR의 재조합 α 및 β 서브유닛들을 인식하지 못하였는데, 이는 이들 항체가 천연(미반응) 수용체에서만 존재하는 배좌(conformation)들을 인식한다는 것을 보여준다(데이터는 나타나 있지 않음).

또한, 항체-수용체 상호작용의 자극 성질을 측정하기 위하여, 본 발명자들은 농도를 증가시키면서 1명의 SSc 환자들로부터 유래한 IgG를 15분 동안 공격하고, PDGFR의 티로신 인산화를 시험하였다. SSc 환자로부터 유래한 IgG는 용량 의존적 방식으로 PDGFR의 티로신 인산화를 유도하였다(도 2D). 본 발명자들은 몇몇 SSc 환자들(약 4명)로부터 유래한 IgG가 PDGF에 비하여 지속적이지만 강도가 덜한 PDGFR의 티로신 인산화를 유도한다는 것을 밝혀내었다(데이터는 나타나 있지 않음).

SSc 환자들로부터 유래한 항- PDGFR 아고니스트 항체의 생물학적 효과

SSc IgG에 의해 유도된 생물학적 효과들을 측정하기 위하여, 본 발명자들은 전신성 경화증 환자들에 있어서의 섬유아세포들을 특징지우는 하기 2개의 유전자들의 발현을 분석하였다: SSc IgG에 노출된 정상적인 인간 섬유아세포들내의 α-평활근 액틴(α-SMA) 및 타입 I 콜라겐. α-평활근 액틴(α-SMA)은 섬유아세포로부터 발육하며 평활근 세포들의 특성과 섬유아세포들의 특성을 보유하는 간엽 세포(mesenchymal cell)들, 근섬유아세포(myofibroblast)들의 식별 표지(distinctive mark)이다. 인간 섬유아세포들은 α-SMA의 검출을 위한 면역조직화학적 분석 및 면역블롯팅 이전에 AG 1296(24시간 동안 2 nM)의 존재 또는 부재하에 PDGF(24시간 동안 15 ng/㎖), 정상 인간 IgG(NIgG; 24시간 동안 200 ㎍/㎖) 및 경피증 IgG(SSc IgG; 24시간 동안 200 ㎍/㎖)로 인간 섬유아세포들을 자극하였다. 정상 IgG가 아닌 SSc IgG에 의해 α-평활근 액틴(α-SMA)을 자극하였다(도 3A). 타입 I 및 타입 II 콜라겐 mRNA는 정상 IgG가 아닌 SSc IgG에 의해 강하게 유도되었다(도 3B).

마지막으로, 본 발명자들은 SSc 세포들이 스트레스를 받고 SSc IgG(밤새도록 200 ㎍/㎖)의 영향을 받는 때에 SSc IgG 유도된 아팝토시스에 대한 내피 세포들의 감작성을 시험하였는데, SSc 세포들은 대조군 세포들에 비하여 아팝토시스가 일어나기 쉬운 경향이 있었다. 세포들을 PDGFR 저해제들과 항온배양함으로써 아팝토시스를 방지하였다. 동일한 조건하에서, PDGF는 아팝토시스를 유도할 수 없다는 것을 참고하라(도 3C).

토의

전신성 경화증에 있어서의 PDGF 수용체에 대한 자극성 항체들

본 연구는 경피증(SSc)이 있는 환자들의 혈청내의 PDGFR 자극성 항체들의 존재를 입증한다. 이와 같은 결론은 하기 5가지 독립된 실험 증거들에 의해 뒷받침된다: 1. SSc 환자들로부터 유래한 정제된 면역글로불리 분획들은 PDGF-/- 세포들이 아닌 PDGFR+ 세포들내의 ROS 레벨을 유도하였다; 2. SSc 환자들로부터 유래한 면역글로불린 분획들은 PDGFR(α 및 β 사슬들)을 천연 배열(configuration) 상태로 인식 및 면역침전시켰다; 3. PDGF-/- 세포들이 아닌 PDGFR-발현 세포들에의 예비 흡착에 의해 SSc IgG의 PDGFR-결합 및 ROS-생성 활성들을 제거하였다; 4. SSc 환자들로부터 유래한 면역글로불린 분획들은 정상 섬유아세포들에 있어서의 근섬유아세포 전환 및 콜라겐 타입 I 및 ROS 생성을 유도하였다; 5. 본 발명자들은 정상 대조군들(20명)에서가 아닌, 지금까지 분석된 모든 전신성 경화증 환자들(46명)에서 이들 항체를 발견하였다. PDGFR 저해제(들)에 의해 SSc 면역글로불린들의 ROS-유도 활성을 저해하였다. 이들 항체는 1차 레이노 증후군, 전신성 홍반성 낭창 및 류마티스성 관절염 환자들에서 검출되지 않았다. 그러나, 본 발명자들은 동종 골수 이식 후에 이식편 대 숙주 질환(GVHD)에 경피증-유사 피부 병변들을 제공하는 환자들에서 선택적으로 전술한 특징들을 갖는 항체들을 발견하였다. 이에 기초하여, 이들 항체의 존재는 질병 특이적이고, 전신성 경화증 환자들을 표시한다.

항체들, 활성 PDGFR 및 ROS

전신성 경화증의 개시는 혈액 중의 전술한 항체들의 축적에 의해 유발될 수 있다. 본 발명자들은 PDGF 및 전술한 항체들에 의해 개시되는 캐스케이드(cascade)를 확인하였고, 성장 인자들 및 ROS에 의한 Ras 단백질들의 신규 조절을 발견하였다. 정상적인 1차 세포들에 있어서, Ras 단백질 레벨은 연속적인 분해(퇴화)에 의해 낮게 유지된다. PDGF는 ERK 1/2를 자극하고, 궁극적으로 프로테아솜(proteasome)에 의한 Ras 분해(퇴화)를 방지하는 ROS를 일시적으로 유도한다. ROS는 ERK 1/2에 의해 이들 신호를 저해한다. ROS 레벨의 증가에 의해 PDGF는 Ras 단백질을 안정화시킨다(참고 문헌 8 참조).

PDGF와 SSc 환자들로부터 유래한 항체들은 모두 ROS를 유도하고, Ras를 안정화시킨다(도 2B). 그러나, 이들은 수용체 활성화의 기전(kinetics)의 측면에서 중요한 차이를 나타낸다. 항체들은 그 효과가 PDGF에 비하여 지속적이기 때문에 오랫동안 작용하는 PDGFR 자극제이다. SSc IgG에 의해 유도된 ROS는 60-120분 지속되는 반면에, PDGF-유도 ROS는 15-30분에 기준선으로 회복된다. 지속적인 ROS 축적은 정상 대조군들보다 높은 Ras-ERK 1/2-ROS를 유지시키고, 세포외에서 낮은 혈청에서 SSc 세포들내의 보다 높은 ROS 레벨을 설명할 수 있다. SSc IgG에 의해 유도된 상대 티로신 인산화는 비록 PDGF보다 낮을지라도 보다 오랫동안 지속되었다(60분 vs. 15분)(도 2D 참조, 데이터는 나타나 있지 않음).

PDGF 수용체에 대한 항체들은 막에서 보다 오랫동안 잔류할 수 있고, PDGF에 비하여 지속적이지만 덜 강한 자극을 일으킨다.

초기 및 후기 전신성 경화증 표현형들

본 발명자들은 정상 세포들에 있어서의 SSc IgG의 단기 및 장기 생물학적 효과들을 분석하였다. 표현형들은 생체내에서 전신성 경화증의 특징들을 근접하게 복제한다. SSc IgG에 의해 유도된 높은 ROS 레벨은 섬유아세포들 및 내피 세포들이 혈청 및 기타 성장 인자들에 대하여 보다 반응성이 되도록 하는데, 이는 높은 레벨의 Ha-Ras 단백질 및 활성 ERK 1/2에 기인한다. 콜라겐 유전자들 및 액틴(α-SMA)의 전사 활성화는 근섬유아세포들 및 섬유증의 출현을 초래한다. 반면에, 내피 세포들은 ROS에 의해 스트레스를 받을 때 아팝토시스가 일어나기 쉬운 경향이 있다. 그러나, 본 발명자들은 질환의 장기(長期) 결과를 설명할 수 있는 ROS 및 SSc IgG에 노출된 세포들에 있어서의 표현형을 밝혀내었다. SSc 환자들로부터 유래한 섬유아세포들은 신속한 퇴화를 겪으며, DNA 및 염색체 이상을 축적시킨다(참고 문헌 8 참조). 이는 만성 병변들에 있어서의 세포들의 손상을 설명할 수 있다.

본 발명의 데이터는 경피증 표현형의 체계적인 설명을 제공한다. 자가항체들에 의해 인식된 PDGFR 상의 에피토프는 보다 감작성이 있고 덜 수고로운 진단 시험에 적합할 수 있으며, 표적 특이적 치료를 발전시키는데 적합할 수 있고, PDGFR 상의 상이한 에피토프들이 자가항체들에 의해 관여되는 경우의 경피증 환자들의 임상적 차이를 설명하는데 적합할 수 있다.

당업자는 에피토프들의 동정이 당업계에 공지된 다수의 방법들(예컨대, 파지 디스플레이 라이브러리)에 의해 수행될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 내피 세포 손상이 경피증의 임상 병력(clinical history)에서의 초기 사건이기 때문에, 자가면역은 혈관 내피 세포들의 지연된 손상의 결과로서 노출된 에피토프들에 의해 유도될 수 있다. 이 경우, 비록 병리학적으로 혈관 및 섬유 특징들의 지속에 적합지라도, 항-PDGFR 자가항체들은 1차적이고 분명한 사건을 수반한다. 자가항체는 1차 사건이라고 간주될 수 있다. 이 문제에 대한 대답은 발전하는 명확한 경피증을 종결시키는 레이노 증후군 환자들의 종단 연구(longitudinal study)로부터 나올 가능성이 있다. 아뭏든, 1차 레이노 증후군 환자에 있어서의 자가항체의 부재는 혈관경련성 질환의 발병기전에 역할을 하지 못하고, 자가항체의 검출은 경피증 환자들로부터 1차 레이노 증후군 환자들을 구별하는데 이용될 수 있다.

경피증과 연관된 가장 빈번한 자가항체들은 각각 20-30%와 9-20%에서 발견되는 항-동원체 및 항-토포이소메라제 I 항체들을 포함한다(참고 문헌 28 참조). 상기 자가항체들이 특이한 임상 증상에 대하여 위험 상태에서 환자들의 그룹을 동정하기 위한 진단 및 예후에 도움이 될 수 있을지라도, 상기 자가항체들이 발병기전에 실제 역할을 하는지 여부에 대하여는 논란의 여지가 있다.

다수의 자가면역 질환들 중에서 기관-특이적 자가면역 질환인 그레이브병(Grave's disease)만이 (TSH) 수용체에 대한 자극성 자가항체에 의해 특징지워진다. 본 발명자들은 결합 조직(connective tissue) 질병에 있어서의 유사한 조사결과(similar finding)를 처음으로 보고한다. 또한, 본 발명의 데이터는 경피증 피부에 있어서의 유전자 발현 분석(참고 문헌 30 참조)에 따라 체액성 면역 및 Th2-의존성 면역 반응을 경피증의 발병기전의 핵심이라는 것을 보여준다(참고 문헌 29 참조).

결론적으로, 본 발명자들은 경피증 환자들에 있어서의 PDGF 수용체에 대한 항체들을 동정하고 아고니스트 활성을 부여하였다. 이들 항체는 내피 세포 손상 및 증가된 콜라겐 유전자 발현을 야기하는 Ha-Ras-ERK 1/2-ROS를 포함하는 세포내 루프(intracellular loop)를 유발시킨다. 최근, 본 발명자들은 항-PDGFR ROS 자극 항체들을 정제하고, 정제된 클론(clone)들로서의 생물학적 활성을 시험하는데 성공하였다. 이는 전신성 경화증의 원인이 되는 역할을 강하게 긍정하는 것이다. 본 명세서에 나타난 데이터로부터 알 수 있는 하나의 중요한 암시는 전신성 경화증의 진단 및 표적 치료가 가능한 도구의 확인이다.

PDGF 및 반응성 산소종(ROS)는 ERK 1/2에 의한 1차 인간 섬유아세포에 있어서의 Ras 단백질 레벨을 조절한다.

결과

PDGF 에 의한 Ras 단백질 레벨의 유도

무활동의(quiescent) 1차 인간 섬유아세포들에 있어서, Ha-Ras 단백질은 거의 검출불가능하다. Ki-Ras 및 Ha-Ras 단백질의 레벨을 정확하게 측정하기 위하여, 본 발명자들은 0.1% SDS(RIPA 완충액)에 가용화된 전체 세포 단백질들을 pan-Ras 항체와 면역침전시켰다. 겔 전기영동에 의해 면역침전물들을 분리하고, 특이 Ras 이종형(isoform) 항체들을 블롯팅하였다. 15분 동안 PDGF로 세포들을 자극하는 것은 성장 인자의 존재에도 불구하고 자극후 120분에 초기 레벨로 감소되는 Ha-Ras 단백질을 유도하는데 충분하다. 또한, Ki-Ras 단백질 레벨은 PDGF에 의해 자극되었지만, 상이한 기전(kinetics)으로 덜 효율적으로 자극되었다. Ki-Ras는 빈약하게 유도되었고, 천천히 감쇠되었다(PDGF 자극후 3시간). 또한, Ha-Ras 유도는 형광 현미경법(도 4B) 또는 항-Ha-Ras 단일클론 또는 다클론 특이 항체들을 이용한 FACS 분석(도 4C)에 의해 가시화된다.

번역 저해제 시클로헥시미드로 세포들을 처리하는 것은 PDGF에 의한 Ha-Ras 유도를 방지하지 못하였다(도 4D). 또한, PDGF 처리는 Ki-Ras 및 Ha-Ras의 mRNA 레벨을 변화시키지 못하였다(도 4E). PDGF에 의해 유도된 Ha-Ras가 지질이 풍부한 막 분획들에 결합하며 면역침전 방법에 의해 효율적으로 추출되지 못한다는 것을 부정하기 위하여, 본 발명자들은 세포들을 50 mM 시클로덱스트린으로 처리하여 면역침전 이전에 콜레스테롤을 고갈시켰다. 시클로덱스트린으로 처리하는 것은 Ha-Ras의 PDGF 유도를 방지하지 못하였다(도 4 보충 물질).

종합적으로, 이들 데이터는 Ha-Ras 및 Ki-Ras 단백질들이 1차 섬유아세포들에서 PDGF에 의해 번역후에 조절된다는 것을 보여준다. 본 발명자들은 몇몇 실험들로부터 PDGF에 의해 유도된 Ha-Ras 단백질의 반감기가 대략 40분이라고 평가하였다(도 4A, 데이터는 나타나 있지 않음).

ROS 및 ERK 1/2의 PDGF 자극

PDGF는 NADPH 산화효소(참고 문헌 3a 및 19a 참조)를 자극함으로써 ROS 생성을 활성화시킨다(도 5A). PDGF 자극 후의 ROS 생성의 기전은 Ha-Ras 유도의 기전을 반복하였다(도 4 및 도 5A). ROS가 PDGF에 의한 Ha-Ras 유도에 관련되어 있는지 여부를 측정하기 위하여, 본 발명자들은 비특이적 ROS 스캐빈저(scavenger)(N-아세틸-시스테인, NAC) 또는 NADPH 산화효소 저해제(DPI)로 세포들을 처리하고, PDGF의 존재 또는 부재하에서의 Ha-Ras 레벨을 측정하였다. 도 5B는 NAC 및 DPI가 PDGF 유도 Ha-Ras 레벨을 유의적으로 저해하였다는 것을 보여준다. 이는 항 Ha-Ras 항체들을 이용한 면역형광에 의해서도 나타난다(도 5C). 정상 세포들에 있어서의 PDGF에 의한 Ha-Ras 유도의 기전은 ERK 1/2 활성화 프로필(데이터는 나타나 있지 않음)을 반복하는데, 이는 MEK-ERK 1/2와 Ha-Ras 유도 사이의 관계를 시사한다. 이러한 프로세스에 대한 통찰을 얻기 위하여, 본 발명자들은 업스트림 ERK 1/2 MAPK에 위치한 키나제인 MEK(MAPKK)를 저해하는, ERK 1/2 신호화의 화학적 저해제(PD 98059)로 예비 처리된 세포들에 있어서의 Ha-Ras를 측정하였다. PD 98059로 세포를 처리하는 것은 PDGF에 의한 Ha-Ras 유도를 저해하였다(도 5D). 항-Ras 항체들과 면역침전된 동일한 추출물들에서, 본 발명자들은 PDGF 수용체를 측정하였다. 도 2D는 PDGF 처리가 ERK 1/2 활성화(도 5D)에 비의존적으로 수용체를 하향 조절한다는 것을 보여준다. PDGF에 의한 ERK 1/2 활성화가 ROS 고갈에도 민감한지 여부를 측정하기 위하여, 본 발명자들은 일반적인 ROS 스캐빈저(NAC) 또는 NADPH 산화효소 저해제(DPI)의 존재하에 PDGF로 세포들을 처리하였다. 도 5E는 PDGF에 의해 활성화된 ERK 1/2가 NAC 및 DPI에 민감하였다는 것을 보여주는데, 이는 ROS 고갈이 PDGF에 의한 ERK 1/2 활성화를 방해하였다는 것을 보여준다. 시간 경과(time course) 실험들은 ROS가 ERK 1/2의 초기 활성화(PDGF 자극후 5분)에 불필요하다는 것을 보여준다. 그러나, 본 발명자들은 PDGF 자극 후 15-20분에 MEK-ERK 1/2를 증폭시켰다(도 5E).

ROS 는 Ha - Ras 레벨을 유도한다.

위에 제시된 데이터는 PDGF가 1차 섬유아세포에서 ROS 및 ERK 1/2에 의해 Ha-Ras 단백질 레벨을 유도한다는 것을 보여준다. PDGF와 ROS 사이의 메카니즘과 관계를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 ERK 1/2 신호화의 화학적 및 생물학적 저해제들의 존재하에 H₂O₂로 세포들을 자극시켰다. 본 발명자들은 다음과 같은 것들을 이용하였다: 1. MEK(MAPKK)를 저해하는 PD 98059 및 U 0126(각각 2시간과 15분 항온배양); 및 2. 세포성 MEK를 저해하는 우성 음성 MEK 변이체(재료 및 방법 참조). 도 6A, 6B 및 6C에 나타난 결과들은 H₂O₂에 의한 Ha-Ras의 유도가 MEK 저해에 의해 방지된다는 것을 입증한다. H₂O₂가 다운스트림 PDGF라는 것을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 PDGF 또는 H₂O₂의 존재하에서 티로신 키나제 저해제인 제니스테인으로 세포들을 처리하였다. 도 6D에 나타나 있는 데이터는 H₂O₂가 제니스테인의 존재하에서 Ha-Ras의 강력한 유도물질(inducer)이라는 것을 보여준다. 예상된 바와 같이, 약물은 PDGF에 의한 Ha-Ras의 유도를 저해하였다. 그러나, 제니스테인의 존재하에서의 보다 오랜 항온배양 기간(90분)은 H₂O₂에 의해 유도된 Ha-Ras 및 ERK 1/2를 억제하였는데, 이는 H₂O₂의 장기(長期) 효과가 활성 PDGF 수용체를 필요로 하였다는 것을 보여준다(데이터는 나타나 있지 않음). 종합적으로, 도 5 및 도 6에 설명되어 있는 데이터는 PDGF가 ERK 1/2 및 ROS에 의해 Ha-Ras 단백질을 유도하였다는 것을 보여준다. ROS는 수용체의 활성화에 비의존적으로 Ha-Ras를 유도하였기 때문에, ROS는 다운스트림 PDGF 수용체이다. 그러나, ROS에 의해 유도된 Ha-Ras 단백질은 활성 PDGF 수용체의 부재하에서는 일시적으로 존재한다(데이터는 나타나 있지 않음).

ERK 1/2의 하향조절(도 5D, 도 5E 및 도 6)은 Ha-Ras 레벨을 감소시켰다. 연속 활성(constitutive active) Ha-Ras 또는 우성 양성 MEK 단백질을 발현시킴으로써 ERK 1/2를 높게 유지하는 경우, ROS 생산은 높아지고, 내인성 Ha-Ras는 감쇠되지 않았다(데이터는 나타나 있지 않음). 이러한 프로세스는 Ha-Ras에 특이적이었는데, 이는 Ki-Ras 레벨이 1차 섬유아세포들에서 ERK 1/2 저해에 의해서만 약간 영향을 받기 때문이었다. 보다 중요하게는, Ha-Ras 안정화는 1차 세포들에 특이적이었는데, 이는 안정화된 세포들(예컨대, 3T3 섬유아세포들, CHO, PC12 및 COS7)은 ERK 1/2 저해에 둔감한 안정하고 높은 레벨의 Ha-Ras를 함유하기 때문이었다(데이터는 나타나 있지 않음).

위에 나타나 있는 데이터는 PDGF-ROS-ERK 1/2에 의해 유도된 Ha-Ras 안정화의 원인이 되는 메카니즘을 분명하게 설명하지 못한다. 본 발명자들은 광범위하게 사용되는 프로테아솜 저해제인 MG132, 및 엔도솜 산성화의 저해를 통해 수용체 재순환을 억제하는 것으로 알려진 독소인 모넨신(monensin)으로 세포들을 처리하였다. 도 6E는 MG132가 Ha-Ras를 유도하였고, 그 효과는 PDGF 또는 H₂O₂와 함께 투여되는 경우에도 증가되지 않았다는 것을 보여준다. 반대로, 모넨신은 단독으로 또는 PDGF 또는 H₂O₂와 함께 Ha-Ras 레벨에 영향을 미치지 않았다.

경피증 섬유아세포들에 있어서의 생체내에서의 ROS - Ras 신호화의 증폭

Ras에 ROS를 연결시키는 신호화 경로가 생체내에서 적절한지 여부를 측정하기 위하여, 본 발명자들은 전신성 경화증을 앓는 환자들로부터 유래한 섬유아세포들을 이용하였다. 이들 세포들은 높은 레벨의 ROS를 생성시키고(참고 문헌 12 참조), 자극성 항-PDGF 수용체 항체들의 혈청내의 존재에 의한 PDGF 산호화의 생체내 연속 자극을 받는다. 도 7A는 상기 환자들로부터 유래한 3개의 섬유아세포 세포주들이 높은 ROS, 수퍼옥사이드 및 H₂O₂ 레벨을 함유한다는 것을 보여준다. ROS는 파네실 전이효소, MEK 및 Ras 저해제들(Ras 저해제는 나타나 있지 않음)에 의해 강력하게 저해된다(도 7A). 또한, 이들 세포들은 정상 대조군 세포들에 비하여 보다 높은 레벨의 Ha-Ras 단백질을 함유하였다(도 7B). 또한, Ras 활성은 정상 대조군 세포들에 비하여 상대적으로 증가되었다(도 7C). 본 발명자들은 최근에 전신성 경화증에 걸린 46명의 환자들에 대한 분석을 완료하였는데, 모든 경우에 Ha/Ki 비율이 2보다 높았다. 다운스트림 Ras 작동인자(effector)(AKT 및 ERK 1/2)의 분석은 ERK 1/2만이 선택적으로 활성화된다는 것을 보여준다(도 7D). ROS, Ras 및 ERK 1/2 활성화는 연관되어 있는데, 이는 MEK 저해제들, ROS 스캐빈저들 또는 파네실 전이효소 저해제들이 Ras P-ERK 1/2 및 ROS 레벨을 감소시킬 수 있기 때문이다(도 7A). ROS, Ha-Ras 및 활성 ERK 1/2는 낮은 혈청에서 배양된 세포들에서 천천히 감쇠되며, 1-2일에 기준선까지 회복된다(데이터는 나타나 있지 않음).

생체내에서의 Ha - Ras 안정화의 생물학적 효과: 높은 ROS , 높은 ERK , DNA 손상, 콜라겐 합성, 노화

본 발명자들은 ROS-Ras 증폭이 전술한 세포주들의 표현형에 영향을 미치고 있는지 의문이 들었다. 본 발명자들은 다음과 같은 것들을 측정하였다: DNA 손상 조절점(DNA damage checkpoint)의 활성화, 또는 직접적인 염색체 변형; 2. 스트레스-유도 아팝토시스; 3. ROS에 의한 콜라겐 유전자들의 전사의 활성화. 도 8은 경피증 세포들이 다음과 같은 것들을 함유하였다는 것을 보여준다: 1. 히스톤 H2AX의 인산화에 의해 검정된 활성화된 ATM; 2. p21 WAF의 축적(도 8A); 및 3. 손상된 염색체들(도 8B). 염색체 이상은 배양액에서의 팽창(expansion) 이전에 생체내에 존재하였고, 배양액에서 연속적으로 생성되었다. 이러한 변형(alteration)들은 ROS에 의해 증폭되었고, 상기 세포들의 음성 선택(negative selection)을 초래하였다(데이터는 나타나 있지 않음). 이는 변형된 중기(metaphase)의 수가 배양 첫째날 및 둘째날 동안 파네실 전이효소 저해제들 또는 ROS 스캐빈저들과 세포들을 항온배양함으로써 유의적으로 감소되었던 이유를 설명한다(도 8B). 이들 세포들은 MEK 저해제 PD 98059를 이용한 예비 처리에 의해 저해된 산화적 스트레스-유도 아팝토시스에 극도로 민감하였다(도 8C). 마지막으로, ROS에 매우 민감하였던 콜라겐 유전자들의 전사는 매우 자극되었다(도 8D 및 도 8E). 모든 이러한 특징들은 MEK 또는 파네실 전이효소 저해제들 또는 ROS 스캐빈저들로 세포들을 처리함으로써 저해되었다(도 8B, 8C, 8D 및 8E). 현재까지, 본 발명자들은 전신성 경화증 환자들로부터 유래한 대략 15개의 독립된 섬유아세포 세포주들에서 이들 데이터를 반복하였다(데이터는 나타나 있지 않음).

보충적인 접근법으로서, 본 발명자들은 경피증 세포들에 존재하는 대략적으로 동일한 비율(3:1)의 Ha-Ras 또는 Ki-Ras로 정상 섬유아세포들을 감염시켰다. 본 발명자들은 ROS 생성이 Ha-Ras 발현에 의해 유의적으로 자극되었다는 것을 밝혀냈다. 본 발명자들은 Ki-Ras에 대한 상대 비율 5:1로 Ha-Ras를 발현시킴으로써, 도 8에 나타나 있는 모든 특징들(콜라겐 유도, DNA 손상, H₂O₂ 유도 아팝토시스)을 반복하였다(도 5 보충 재료들 및 참고 자료 15).

이들 데이터는 생체내에서 ROS-Ras 증폭과 경피증 섬유아세포들의 복합체 표현형(complex phenotype)의 관계를 입증한다. 또한, 본 발명자들은 지금까지 치유불가능한 질병들의 진단 및 표적 치료를 가능하게 하는 도구를 제공한다.

토의

본 발명의 데이터는 이전에 알려져 있지 않던 새로운 수준의 Ras 단백질 조절을 나타낸다. 불멸의 주화 세포주(established and immortal cell line)들에 있어서, Ras는 GTP-GDP 결합 활성에 의해서만 조절되었다. Ha-Ras 또는 Ki-Ras의 광범위한 발현이 발육중에 또는 성체(adult organism)에서 관용(toleration)되지 않기 때문에, 1차 세포들에서 단백질들의 레벨은 낮게 유지되었다(참고 문헌 20a 참조). 1차 섬유아세포들에 있어서, Ras 단백질들은 프로테아솜 분해(변성)에 의해 낮게 유지되었다(도 6E).

성장 인자들 및 ROS에 의한 Ras 유도는 1차 섬유아세포들에 특이한 것은 아니지만, 인간 말초혈액 림프구, 1차 뉴론 및 1차 마우스 아스토로사이트(astrocyte)에 존재한다. 이들 세포들에 있어서, H₂O₂는 Ha-Ras와 Ki-Ras를 모두 자극한다.

1차 섬유아세포들에 있어서, Ras 단백질의 축적은 PDGF 및 ERK 1/2에 의해 유발된다(도 4 및 도 5). PDGF에 의해 유도된 ROS는 ERK 1/2를 활성 상태로 유지시킨다(도 5). Ras의 ROS 유도는 PDGF 자극에 비의존적이고, ROS에 의해 유지될 수 있다.(도 6). 그러나, PDGF 자극의 부재하에서, H₂O₂는 보다 오랜 기간(2시간) 동안 높은 Ha-Ras 레벨을 유지시킬 수 없다.

PDGF 및 ROS에 의한 Ha-Ras 유도에 관한 메커니즘의 경우, 도 6E에 나타나 있는 데이터는 Ha-Ras 단백질이 26S 프로테아솜에 의해 분해(변성)된다는 것과 ERK 1/2가 Ha-Ras를 분해(변성)로부터 보호한다는 것을 보여준다. 마찬가지로, c-myc는 프로테오솜에 의해 분해(변성)되고(참고 문헌 21a 참조), MEKK1에 의한 스트레스에 의해 안정화된다(참고 문헌 22a 참조). ROS와 Ha-Ras 단백질 레벨간의 관계를 설명하는 모식도는 도 9에 나타나 있다. 본 발명자들은 ROS가 Ras 단백질 레벨을 증가시키고, PDGF 신호화를 증폭한다는 것을 제안한다. Ras 단백질 레벨의 조절은 아팝토시스 또는 DNA 손상 및 산화적 스트레스를 야기시킬 수 있는 성장 인자들에 의한 과도한 자극으로부터 1차 세포들을 보호한다.

생체내에서의 ROS - Ras 신호화의 증폭

본 발명자들이 섬유아세포들에 의한 콜라겐의 과도한 생성으로 인한 피부 및 내부 기관들의 광범위한 섬유증(extensive fibrosis)에 의해 특징지워지는 자가면역 질환인 전신성 경화증이 있는 환자들의 병변으로부터 분리된 세포들에서 전술한 경로를 발견하였기 때문에, 전술한 경로는 생체내에 관련된 것이다(참고 문헌 23a). 전신성 경화증 환자들로부터 유래한 섬유아세포들은 높은 Ha-Ras 및 ROS 레벨과 ERK 1/2의 연속 활성화를 포함한다. 이러한 특징들은 본 발명자들이 전술한, H₂O₂로 자극된 정상 섬유아세포들에 있어서의 신호화 경로의 특징들이다. 전신성 경화증 환자들은 PDGF 수용체에 대한 자극 항체들을 합성한다. 이들 항체들은 섬유아세포들과 단핵세포(monocyte)들을 자극하여, ERK 1/2를 유발하고 Ha-Ras를 유도하는 높은 ROS(참고 문헌 14a 참조)를 생성시킨다(Svegliati 등의 문헌 참조). 이 루프(loop)의 구성 성분들(ERK 1/2, Ras, ROS) 중 하나의 저해는 시스템을 하향조절하고, Ras-ROS 활성화(예컨대, 전신성 경화증 세포들의 표현형을 특징지우는 세포들의 가속화된 노화)의 생물학적 효과를 방지한다(참고 문헌 23a 및 24a 참조). 이들 세포들은 다음과 같은 특징들이 있다: 1. 아팝토시스가 일어나기 쉬운 경향이 있다; 2. DNA가 심하게 손상된다; 3. ROS에 의해 유도된 유전자들의 전사는 활발하게 유도된다. 이러한 구조(framework)에 있어서, 섬유증은 세포들 손상(아팝토시스)와 콜라겐 침착의 결과이다(참고 문헌 23a 및 24a). 처음에 PDGF 수용체 자극에 의해 유발된 루프는 상대적으로 자율적으로 되는데, 이는 Ras-ERK 1/2에 의한 NADPH 산화효소의 활성화에 의해 생성된 ROS에 의해 유지되기 때문이다(참고 문헌 24). 이는 ROS, ERK 1/2 또는 Ras의 저해가 경피증을 정상 섬유아세포로 전환시킨다는 것을 설명한다. 그러나, PDGF 신호화는 장기(長期) ROS 생성에 필요한데, 이는 4-12시간 동안의 PDGF 수용체의 저해가 Ras-ROS-ERK 1/2-콜라겐 레벨을 감소시키기 때문이다(데이터는 나타나 있지 않음).

생리학적 자극의 존재하에서, Ras 단백질 레벨의 조절은 과도하거나 부적절한 자극으로부터 1차 세포들을 보호한다. Ras에의 ROS의 결합(coupling)은 산화환원 신호화(redox signaling)의 감지기(sensor) 및 조절기(controller)로서의 Ras 단백질들의 주요 역할을 두드러지게 한다. 1차 세포들에 있어서의 상이한 대사회전(turnover) 및 Ha-Ras와 Ki-Ras 사이의 ROS 레벨에 대한 상이한 효과는 상이한 세포들에 대한 2가지 이종 신호들의 활성화는 생성된 ROS의 타입 및 레벨을 구분한다는 것을 시사한다. Ras-ERK 1/2의 연속적 또는 돌연변이적 활성화는 이러한 유형의 조절의 손상을 야기시킨다. 이는 Ras2val19 또는 Ras2 야생형 Ras를 발현시키는 사카로마이세스 세레비시아(S. cerevisiae)의 수명(life-span)에 대해서 반대 표현형(opposite phenotype)을 설명한다(참고 문헌 11a). 1차 세포들에 있어서, 노화, 성장 또는 분화는 이 회로(circuitry)의 완전성(integrity)에 의존적인 것같다.

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Asn Glu Lys Val Val Gln Leu Asn Ser Ser Phe Ser Leu Arg 35 40 45 Cys Phe Gly Glu Ser Glu Val Ser Trp Gln Tyr Pro Met Ser Glu Glu 50 55 60 Glu Ser Ser Asp Val Glu Ile Arg Asn Glu Glu Asn Asn Ser Gly Leu 65 70 75 80 Phe Val Thr Val Leu Glu Val Ser Ser Ala Ser Ala Ala His Thr Gly 85 90 95 Leu Tyr Thr Cys Tyr Tyr Asn His Thr Gln Thr Glu Glu Asn Glu Leu 100 105 110 Glu Gly Arg His Ile Tyr Ile Tyr Val Pro Asp Pro Asp Val Ala Phe 115 120 125 Val Pro Leu Gly Met Thr Asp Tyr Leu Val Ile Val Glu Asp Asp Asp 130 135 140 Ser Ala Ile Ile Pro Cys Arg Thr Thr Asp Pro Glu Thr Pro Val Thr 145 150 155 160 Leu His Asn Ser Glu Gly Val Val Pro Ala Ser Tyr Asp Ser Arg Gln 165 170 175 Gly Phe Asn Gly Thr Phe Thr Val Gly Pro Tyr Ile Cys Glu Ala Thr 180 185 190 Val Lys Gly Lys Lys Phe Gln Thr Ile Pro Phe Asn Val Tyr Ala Leu 195 200 205 Lys Ala Thr Ser Glu Leu Asp Leu Glu Met Glu Ala Leu Lys Thr Val 210 215 220 Tyr Lys Ser Gly Glu Thr Ile Val Val Thr Cys Ala Val Phe Asn Asn 225 230 235 240 Glu Val Val Asp Leu Gln Trp Thr Tyr Pro Gly Glu Val Lys Gly Lys 245 250 255 Gly Ile Thr Met Leu Glu Glu Ile Lys Val Pro Ser Ile Lys Leu Val 260 265 270 Tyr Thr Leu Thr Val Pro Glu Ala Thr Val Lys Asp Ser Gly Asp Tyr 275 280 285 Glu Cys Ala Ala Arg Gln Ala Thr Arg Glu Val Lys Glu Met Lys Lys 290 295 300 Val Thr Ile Ser Val His Glu Lys Gly Phe Ile Glu Ile Lys Pro Thr 305 310 315 320 Phe Ser Gln Leu Glu Ala Val Asn Leu His Glu Val Lys His Phe Val 325 330 335 Val Glu Val Arg Ala Tyr Pro Pro Pro Arg Ile Ser Trp Leu Lys Asn 340 345 350 Asn Leu Thr Leu Ile Glu Asn Leu Thr Glu Ile Thr Thr Asp Val Glu 355 360 365 Lys Ile Gln Glu Ile Arg Tyr Arg Ser Lys Leu Lys Leu Ile Arg Ala 370 375 380 Lys Glu Glu Asp Ser Gly His Tyr Thr Ile Val Ala Gln Asn Glu Asp 385 390 395 400 Ala Val Lys Ser Tyr Thr Phe Glu Leu Leu Thr Gln Val Pro Ser Ser 405 410 415 Ile Leu Asp Leu Val Asp Asp His His Gly Ser Thr Gly Gly Gln Thr 420 425 430 Val Arg Cys Thr Ala Glu Gly Thr Pro Leu Pro Asp Ile Glu Trp Met 435 440 445 Ile Cys Lys Asp Ile Lys Lys Cys Asn Asn Glu Thr Ser Trp Thr Ile 450 455 460 Leu Ala Asn Asn Val Ser Asn Ile Ile Thr Glu Ile His Ser Arg Asp 465 470 475 480 Arg Ser Thr Val Glu Gly Arg Val Thr Phe Ala Lys Val Glu Glu Thr 485 490 495 Ile Ala Val Arg Cys Leu Ala Lys Asn Leu Leu Gly Ala Glu Asn Arg 500 505 510 Glu Leu Lys Leu Val Ala Pro Thr Leu Arg Ser Glu Leu Thr Val Ala 515 520 525 Ala Ala Val Leu Val Leu Leu Val Ile Val Ile Ile Ser Leu Ile Val 530 535 540 Leu Val Val Ile Trp Lys Gln Lys Pro Arg Tyr Glu Ile Arg Trp Arg 545 550 555 560 Val Ile Glu Ser Ile Ser Pro Asp Gly His Glu Tyr Ile Tyr Val Asp 565 570 575 Pro Met Gln Leu Pro Tyr Asp Ser Arg Trp Glu Phe Pro Arg Asp Gly 580 585 590 Leu Val Leu Gly Arg Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Lys Val Val 595 600 605 Glu Gly Thr Ala Tyr Gly Leu Ser Arg Ser Gln Pro Val Met Lys Val 610 615 620 Ala Val Lys Met Leu Lys Pro Thr Ala Arg Ser Ser Glu Lys Gln Ala 625 630 635 640 Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Met Thr His Leu Gly Pro His Leu Asn 645 650 655 Ile Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Lys Ser Gly Pro Ile Tyr Ile 660 665 670 Ile Thr Glu Tyr Cys Phe Tyr Gly Asp Leu Val Asn Tyr Leu His Lys 675 680 685 Asn Arg Asp Ser Phe Leu Ser His His Pro Glu Lys Pro Lys Lys Glu 690 695 700 Leu Asp Ile Phe Gly Leu Asn Pro Ala Asp Glu Ser Thr Arg Ser Tyr 705 710 715 720 Val Ile Leu Ser Phe Glu Asn Asn Gly Asp Tyr Met Asp Met Lys Gln 725 730 735 Ala Asp Thr Thr Gln Tyr Val Pro Met Leu Glu Arg Lys Glu Val Ser 740 745 750 Lys Tyr Ser Asp Ile Gln Arg Ser Leu Tyr Asp Arg Pro Ala Ser Tyr 755 760 765 Lys Lys Lys Ser Met Leu Asp Ser Glu Val Lys Asn Leu Leu Ser Asp 770 775 780 Asp Asn Ser Glu Gly Leu Thr Leu Leu Asp Leu Leu Ser Phe Thr Tyr 785 790 795 800 Gln Val Ala Arg Gly Met Glu Phe Leu Ala Ser Lys Asn Cys Val His 805 810 815 Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Leu Ala Gln Gly Lys Ile Val 820 825 830 Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Met His Asp Ser Asn 835 840 845 Tyr Val Ser Lys Gly Ser Thr Phe Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro 850 855 860 Glu Ser Ile Phe Asp Asn Leu Tyr Thr Thr Leu Ser Asp Val Trp Ser 865 870 875 880 Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Gly Thr Pro Tyr 885 890 895 Pro Gly Met Met Val Asp Ser Thr Phe Tyr Asn Lys Ile Lys Ser Gly 900 905 910 Tyr Arg Met Ala Lys Pro Asp His Ala Thr Ser Glu Val Tyr Glu Ile 915 920 925 Met Val Lys Cys Trp Asn Ser Glu Pro Glu Lys Arg Pro Ser Phe Tyr 930 935 940 His Leu Ser Glu Ile Val Glu Asn Leu Leu Pro Gly Gln Tyr Lys Lys 945 950 955 960 Ser Tyr Glu Lys Ile His Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp His Pro Ala 965 970 975 Val Ala Arg Met Arg Val Asp Ser Asp Asn Ala Tyr Ile Gly Val Thr 980 985 990 Tyr Lys Asn Glu Glu Asp Lys Leu Lys Asp Trp Glu Gly Gly Leu Asp 995 1000 1005 Glu Gln Arg Leu Ser Ala Asp Ser Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Pro Asp 1010 1015 1020 Ile Asp Pro Val Pro Glu Glu Glu Asp Leu Gly Lys Arg Asn Arg His 1025 1030 1035 1040 Ser Ser Gln Thr Ser Glu Glu Ser Ala Ile Glu Thr Gly Ser Ser Ser 1045 1050 1055 Ser Thr Phe Ile Lys Arg Glu Asp Glu Thr Ile Glu Asp Ile Asp Met 1060 1065 1070 Met Asp Asp Ile Gly Ile Asp Ser Ser Asp Leu Val Glu Asp Ser Phe 1075 1080 1085 Leu <210> 8 <211> 1106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Arg Leu Pro Gly Ala Met Pro Ala Leu Ala Leu Lys Gly Glu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ser Leu Leu Leu Leu Leu Glu Pro Gln Ile Ser Gln Gly 20 25 30 Leu Val Val Thr Pro Pro Gly Pro Glu Leu Val Leu Asn Val Ser Ser 35 40 45 Thr Phe Val Leu Thr Cys Ser Gly Ser Ala Pro Val Val Trp Glu Arg 50 55 60 Met Ser Gln Glu Pro Pro Gln Glu Met Ala Lys Ala Gln Asp Gly Thr 65 70 75 80 Phe Ser Ser Val Leu Thr Leu Thr Asn Leu Thr Gly Leu Asp Thr Gly 85 90 95 Glu Tyr Phe Cys Thr His Asn Asp Ser Arg Gly Leu Glu Thr Asp Glu 100 105 110 Arg Lys Arg Leu Tyr Ile Phe Val Pro Asp Pro Thr Val Gly Phe Leu 115 120 125 Pro Asn Asp Ala Glu Glu Leu Phe Ile Phe Leu Thr Glu Ile Thr Glu 130 135 140 Ile Thr Ile Pro Cys Arg Val Thr Asp Pro Gln Leu Val Val Thr Leu 145 150 155 160 His Glu Lys Lys Gly Asp Val Ala Leu Pro Val Pro Tyr Asp His Gln 165 170 175 Arg Gly Phe Ser Gly Ile Phe Glu Asp Arg Ser Tyr Ile Cys Lys Thr 180 185 190 Thr Ile Gly Asp Arg Glu Val Asp Ser Asp Ala Tyr Tyr Val Tyr Arg 195 200 205 Leu Gln Val Ser Ser Ile Asn Val Ser Val Asn Ala Val Gln Thr Val 210 215 220 Val Arg Gln Gly Glu Asn Ile Thr Leu Met Cys Ile Val Ile Gly Asn 225 230 235 240 Glu Val Val Asn Phe Glu Trp Thr Tyr Pro Arg Lys Glu Ser Gly Arg 245 250 255 Leu Val Glu Pro Val Thr Asp Phe Leu Leu Asp Met Pro Tyr His Ile 260 265 270 Arg Ser Ile Leu His Ile Pro Ser Ala Glu Leu Glu Asp Ser Gly Thr 275 280 285 Tyr Thr Cys Asn Val Thr Glu Ser Val Asn Asp His Gln Asp Glu Lys 290 295 300 Ala Ile Asn Ile Thr Val Val Glu Ser Gly Tyr Val Arg Leu Leu Gly 305 310 315 320 Glu Val Gly Thr Leu Gln Phe Ala Glu Leu His Arg Ser Arg Thr Leu 325 330 335 Gln Val Val Phe Glu Ala Tyr Pro Pro Pro Thr Val Leu Trp Phe Lys 340 345 350 Asp Asn Arg Thr Leu Gly Asp Ser Ser Ala Gly Glu Ile Ala Leu Ser 355 360 365 Thr Arg Asn Val Ser Glu Thr Arg Tyr Val Ser Glu Leu Thr Leu Val 370 375 380 Arg Val Lys Val Ala Glu Ala Gly His Tyr Thr Met Arg Ala Phe His 385 390 395 400 Glu Asp Ala Glu Val Gln Leu Ser Phe Gln Leu Gln Ile Asn Val Pro 405 410 415 Val Arg Val Leu Glu Leu Ser Glu Ser His Pro Asp Ser Gly Glu Gln 420 425 430 Thr Val Arg Cys Arg Gly Arg Gly Met Pro Gln Pro Asn Ile Ile Trp 435 440 445 Ser Ala Cys Arg Asp Leu Lys Arg Cys Pro Arg Glu Leu Pro Pro Thr 450 455 460 Leu Leu Gly Asn Ser Ser Glu Glu Glu Ser Gln Leu Glu Thr Asn Val 465 470 475 480 Thr Tyr Trp Glu Glu Glu Gln Glu Phe Glu Val Val Ser Thr Leu Arg 485 490 495 Leu Gln His Val Asp Arg Pro Leu Ser Val Arg Cys Thr Leu Arg Asn 500 505 510 Ala Val Gly Gln Asp Thr Gln Glu Val Ile Val Val Pro His Ser Leu 515 520 525 Pro Phe Lys Val Val Val Ile Ser Ala Ile Leu Ala Leu Val Val Leu 530 535 540 Thr Ile Ile Ser Leu Ile Ile Leu Ile Met Leu Trp Gln Lys Lys Pro 545 550 555 560 Arg Tyr Glu Ile Arg Trp Lys Val Ile Glu Ser Val Ser Ser Asp Gly 565 570 575 His Glu Tyr Ile Tyr Val Asp Pro Met Gln Leu Pro Tyr Asp Ser Thr 580 585 590 Trp Glu Leu Pro Arg Asp Gln Leu Val Leu Gly Arg Thr Leu Gly Ser 595 600 605 Gly Ala Phe Gly Gln Val Val Glu Ala Thr Ala His Gly Leu Ser His 610 615 620 Ser Gln Ala Thr Met Lys Val Ala Val Lys Met Leu Lys Ser Thr Ala 625 630 635 640 Arg Ser Ser Glu Lys Gln Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Met Ser 645 650 655 His Leu Gly Pro His Leu Asn Val Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr 660 665 670 Lys Gly Gly Pro Ile Tyr Ile Ile Thr Glu Tyr Cys Arg Tyr Gly Asp 675 680 685 Leu Val Asp Tyr Leu His Arg Asn Lys His Thr Phe Leu Gln His His 690 695 700 Ser Asp Lys Arg Arg Pro Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ser Asn Ala Leu 705 710 715 720 Pro Val Gly Leu Pro Leu Pro Ser His Val Ser Leu Thr Gly Glu Ser 725 730 735 Asp Gly Gly Tyr Met Asp Met Ser Lys Asp Glu Ser Val Asp Tyr Val 740 745 750 Pro Met Leu Asp Met Lys Gly Asp Val Lys Tyr Ala Asp Ile Glu Ser 755 760 765 Ser Asn Tyr Met Ala Pro Tyr Asp Asn Tyr Val Pro Ser Ala Pro Glu 770 775 780 Arg Thr Cys Arg Ala Thr Leu Ile Asn Glu Ser Pro Val Leu Ser Tyr 785 790 795 800 Met Asp Leu Val Gly Phe Ser Tyr Gln Val Ala Asn Gly Met Glu Phe 805 810 815 Leu Ala Ser Lys Asn Cys Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val 820 825 830 Leu Ile Cys Glu Gly Lys Leu Val Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala 835 840 845 Arg Asp Ile Met Arg Asp Ser Asn Tyr Ile Ser Lys Gly Ser Thr Phe 850 855 860 Leu Pro Leu Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe Asn Ser Leu Tyr 865 870 875 880 Thr Thr Leu Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile 885 890 895 Phe Thr Leu Gly Gly Thr Pro Tyr Pro Glu Leu Pro Met Asn Glu Gln 900 905 910 Phe Tyr Asn Ala Ile Lys Arg Gly Tyr Arg Met Ala Gln Pro Ala His 915 920 925 Ala Ser Asp Glu Ile Tyr Glu Ile Met Gln Lys Cys Trp Glu Glu Lys 930 935 940 Phe Glu Ile Arg Pro Pro Phe Ser Gln Leu Val Leu Leu Leu Glu Arg 945 950 955 960 Leu Leu Gly Glu Gly Tyr Lys Lys Lys Tyr Gln Gln Val Asp Glu Glu 965 970 975 Phe Leu Arg Ser Asp His Pro Ala Ile Leu Arg Ser Gln Ala Arg Leu 980 985 990 Pro Gly Phe His Gly Leu Arg Ser Pro Leu Asp Thr Ser Ser Val Leu 995 1000 1005 Tyr Thr Ala Val Gln Pro Asn Glu Gly Asp Asn Asp Tyr Ile Ile Pro 1010 1015 1020 Leu Pro Asp Pro Lys Pro Glu Val Ala Asp Glu Gly Pro Leu Glu Gly 1025 1030 1035 1040 Ser Pro Ser Leu Ala Ser Ser Thr Leu Asn Glu Val Asn Thr Ser Ser 1045 1050 1055 Thr Ile Ser Cys Asp Ser Pro Leu Glu Pro Gln Asp Glu Pro Glu Pro 1060 1065 1070 Glu Pro Gln Leu Glu Leu Gln Val Glu Pro Glu Pro Glu Leu Glu Gln 1075 1080 1085 Leu Pro Asp Ser Gly Cys Pro Ala Pro Arg Ala Glu Ala Glu Asp Ser 1090 1095 1100 Phe Leu 1105

Claims (23)

1. PDGF 수용체에 대한 자가항체(auto-antibody)들의 생체 시료내의 존재를 생체외에서(in vitro) 검출하는 방법으로서,

   a) 자가항체들의 결합 및 리간드-자가항체들의 복합체(complex)의 형성을 허용하는 조건에서 상기 자가항체들에 특이적인 유효량의 리간드(ligand)와 생체 시료를 항온배양하는 단계; 및

   b) 결합된 자가항체들, 또는 리간드-자가항체들의 복합체(존재하는 경우)를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서,

   특이적인 리간드는 PDGF 수용체 또는 면역반응성 단편들 또는 이들의 유도체들인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 2 항에 있어서,

   면역반응성 단편들은 PDGFRA 및/또는 PDGFRB의 세포외 영역(extracellular region)에 속하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 3 항에 있어서,

   PDGFRA 및/또는 PDGFRB의 세포외 영역에 속하는 면역반응성 단편들은 인간 PDGFRA NP008197(SWProt P16234, 서열 번호 7) 및/또는 PDGFRB NPOO26000(SWProt P09619, 서열 번호 8)의 아미노산 서열의 NH 말단으로부터 처음 550개 아미노산에 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 하나의 항에 있어서,

   자가면역 질환들의 진단(diagnosis) 및 예후(prognosis)에 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 5 항에 있어서,

   자가면역 질환은 전신성 경화증(systemic sclerosis)인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 5 항에 있어서,

   레이노 증후군(Raynaud phenomenon)과 전신성 증후군을 구별하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 하나에 있어서,

   이식편 대 숙주 질환(Graft-Versus-Host-Reaction)(GVHR)의 진단에 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 하나의 항의 방법에 사용하기 위한 진단 키트(diagnostic kit)로서,

   a) PDGF 수용체에 대한 자가항체들에 특이적인 리간드; 및

   b) 결합된 자가항체들, 또는 리간드-자가항체들의 복합체의 검출 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
10. 제 9 항에 있어서,

    특이적인 리간드는 PDGF 수용체 또는 면역반응성 단편들 또는 이들의 유도체들인 것을 특징으로 하는 진단 키트.
11. 제 10 항에 있어서,

    면역반응성 단편들은 PDGFRA 및/또는 PDGFRB의 세포외 영역에 속하는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
12. 제 11 항에 있어서,

    PDGFRA 및/또는 PDGFRB의 세포외 영역에 속하는 면역반응성 단편들은 인간 PDGFRA NP008197(SWProt P16234, 서열 번호 7) 및/또는 인간 PDGFRB NPOO26000(SWProt P09619, 서열 번호 8)의 아미노산 서열의 NH 말단으로부터 처음 550개 아미노산에 포함되는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
13. 자가면역 질환의 치료용 또는 이식편 대 숙주 질환(Graft-Versus-Host Reaction, GVHR)의 치료용 약제의 제조에 사용되는 ROS 및/또는 Ras-ERK 1/2 저해제의 용도.
14. 제 13 항에 있어서,

    자가면역 질환은 전신성 경화증(systemic sclerosis)인 것을 특징으로 하는 용도.
15. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서,

    ROS 및/또는 Ras-ERK 1/2 저해제는 PDGFR에 대한 항체들에 특이적인 리간드인 것을 특징으로 하는 용도.
16. 제 15 항에 있어서,

    특이적인 리간드는 PDGF 수용체 또는 면역반응성 단편들 또는 이들의 유도체들인 것을 특징으로 하는 용도.
17. 제 16 항에 있어서,

    면역반응성 단편들은 PDGFRA 및/또는 PDGFRB의 세포외 영역에 속하는 것을 특징으로 하는 용도.
18. 제 17 항에 있어서,

    PDGFRA 및/또는 PDGFRB의 세포외 영역에 속하는 면역반응성 단편들은 인간 PDGFRA NP008197(SWProt P16234, 서열 번호 7) 및/또는 PDGFRB NPOO26000(SWProt P09619, 서열 번호 8)의 아미노산 서열의 NH 말단으로부터 처음 550개 아미노산에 포함되는 것을 특징으로 하는 용도.
19. 유효량의 ROS 및/또는 Ras-ERK 1/2 저해제, 및 적당한 희석제(diluent), 및/또는 부형제(excipient), 및/또는 보조제(adjuvant)를 포함하는 약학 조성물.
20. 제 19 항에 있어서,

    ROS 및/또는 Ras-ERK 1/2 저해제는 PDGFR에 대한 항체에 특이적인 리간드인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
21. 제 20 항에 있어서,

    특이적인 리간드는 PDGF 수용체 또는 면역반응성 단편들 또는 이들의 유도체들인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
22. 제 20 항에 있어서,

    면역반응성 단편들은 PDGFRA 및/또는 PDGFRB의 세포외 영역에 속하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
23. 제 21 항에 있어서,

    PDGFRA 및/또는 PDGFRB의 세포외 영역에 속하는 면역반응성 단편들은 인간 PDGFRA NP008197(SWProt P16234, 서열 번호 7) 및/또는 인간 PDGFRB NPOO26000(SWProt P09619, 서열 번호 8)의 아미노산 서열의 NH 말단으로부터 처음 550개 아미노산에 포함되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

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