KR20080077346A

KR20080077346A - 혈액 단백질의 삼출을 감소시키는 조성물

Info

Publication number: KR20080077346A
Application number: KR1020080078548A
Authority: KR
Inventors: 최성현
Original assignee: 주식회사 케이티앤지; 최성현
Priority date: 2008-08-11
Filing date: 2008-08-11
Publication date: 2008-08-22

Abstract

본 발명은 혈액 단백질의 삼출을 감소시키는 조성물에 관한 발명으로 더욱 상세하게는 혈액 단백질들(serum-proteins)의 피부 및 점막 삼출 현상을 감소시켜 폐질환 등의 증상들을 개선하는 발명이다.

이중 포화 인지질, 혈액 단백질, 삼출

Description

혈액 단백질의 삼출을 감소시키는 조성물{Composition for reducing the exudation of serum proteins}

아토피성 질환들에 대한 학문적인 이해와 증상의 완화 및 치료를 목적으로, 많은 연구들이 면역학과 세포학의 발달과 맞물려 생체의 면역조절 기작들이나 세포신호전달 기작들을 이해하고 이를 이용하는 방법들로 진행되어지고 있다. 반면에 일부 과학자들에 의해 꾸준히 현대문명발달에 의한 변화 즉, 식생활의 변화나 오염물질의 노출들에 원인을 두고 연구를 해왔다.

이들 다양한 분야의 아토피성 질환 연구들에서 공통적으로 발견할 수 있는 사실은 아토피 질환의 발생을 면역학적인 원인으로 해석하든, 서구화된 음식으로 인한 원인으로 해석되거나 화학 물질에 노출된 원인으로 해석되든 간에 아토피성 질환들의 피부나 점막에서 혈액 단백질들이 스며 나온다는 사실이다. 하지만, 아토피성 질환들이 발생함으로 인하여 혈액 단백질들이 피부나 점막으로 새어 나오는 지, 아니면 혈액단백질이 새어 나옴으로써 아토피 질환들이 발생하는지 확실하게 결론을 내릴 수 있는 연구는 아직까지 이루어지지 않고 있다.

표피 또는 점막의 혈액단백질들의 삼출(exudation)은 대부분 알부민(serum-albumin)을 기준 단백질(marker)로 관찰되어져 왔다. 피부질환에서 알부민의 삼출 정도는 질환의 심한 정도와 상관관계가 있다고 알려져 있다. 혈액 단백질들의 피부삼출이 심한 경우에는 혈액의 저알부민증(hypoalbuminemia)을 유발한다(Worm et al., 1981. Br. J. Dermatol. 104: 389-396와 Worm and Rossing, 1980. J. Invest. Dermatol. 75: 302-305). 알러지성 천식(allergic asthma)과 비염을 갖고 있던 환자의 경우, 장내벽에서 심각한 상태의 알부민 손실이 유발되는 림프관확장증 (intestinal lymphangiectasia)의 증상도 보였다(Esenberh, 1976. Ann. Allergy, 36: 342-350). 어린아이에 있어서 아토피성 피부질환으로 인한 알부민 손실은 성장의 저해도 유발하며(Abrahamov, 1986. Eur. J. Pediatr. 145: 223-226) 또한 저알부민증과 함께 빈뇨(oiguria)와 말단의 청색증(cyanosis)도 동반을 한다(Capulong et al. 1996. Pediatr. Allergy Immunol. 7: 100-102). 아토피성 습진(atopic eczema)의 경우와 접촉성 피부염의 경우에도, 환부에서의 알부민의 유출 정도는 증상의 심각성과 상관되어있다고 보고가 되어있다(David et al., 1990. Br. J. Dermatol. 122: 485-489와 Wijsbek et al., 1991. Int. J. Microcirc. Clin. Exp. 10: 193-204).

천식(asthma)과 만성폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease) 증상들도 환자들의 가래(sputum)에서 알부민을 포함한 혈액단백질의 유출이 보고되 었고(Schoonbrood et al. 1994. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 150:1519-1527와 Anderson & Persson 1988. Agents Actions Suppl. 23: 239-260), 만성 기침(chronic cough)의 경우에는 호산구증다증(eosinophilia)의 증상이 없이도 알부민의 삼출이 생긴다고 보고되었다(Pizzichini et al., 1999. Can. Respir. J. 6:323-330).

화학물질에 의한 혈액단백질의 삼출은, 메틸 살리실레이트(methyl salicylate), 페놀(phenol), 크로톤 오일(croton oil), 벤잘코니움(benzalkonium)등의 물질들과(Patrick et al. 1985. Toxicol. Appl. Pharmacol. 81: 476-490) 톨루엔(toluene), m-크실렌(m-xylene), 싸이클로헥산(cyclohexane) 등에 의해 유발된다(Iyadomi et al., 1998. Ind. Health 36:40-51). 2,4-다이나이트로플로로벤젠(2,4-dinitrofluorobenzne)은 피부자극을 연구하기 위한 동물모델에 사용되며 이 물질 역시 혈액 단백질의 삼출을 일으킨다(Nakamura et al., 2001. Toxical. Pathol. 29:200-207). 모든 유기용매성 물질들이 혈액단백질의 삼출을 유발하지 않으며, 삼출의 정도 역시 화학물질에 따라 다르다고 보고되었다. 혈액단백질의 삼출은 방향족 고리(aromatic ring) 화학물질에 의해 쉽게 유발되어지고, 아세톤과 같은 유기용제는 혈액단백질의 삼출에 거의 영향을 주지 않는다.

서구화된 식생활에 인하여 아토피성 질환들이 발생의 원인이라고 보는 연구들(Weiland et al., 1999. Lancet 353:2040-2041와 von Mutis et al., 1998. Lancet 351:862-866와 Dunder et al., 2001. Allergy 56:425-428)은 사람들이 섭취하는 지질성분 및 함량의 변화에 주목하고 있다. 이 연구들은 1970년대에 들어서면 서 과도하게 섭취하는 식물성오일의 주성분인 불포화지방산과 트란스오일(trans-oil)로 인하여 인간대사의 불균형이 유발되고 이는 아토피성 질환의 증가로 연결된다는 것이다.

사람을 포함한 포유동물의 폐는 다른 장기나 기관과는 달리 월등히 높은 이중포화지방산을 갖는 인지질들이 많으며, 특히 폐의 표면에 존재하는 계면활성체(surfactant)는 다이팔미토일포스파티딜콜린(dipalmitoylphosphatidylcholine, DPPC)의 함량이 매우 높다. 이 성분은 폐에서 표면장력을 낮춰주는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 폐의 표면에서 계면활성체에 의한 표면장력의 감소는, 숨을 들이킬 때 호흡을 편하게 해줄 수 있을 뿐만 아니라 숨을 끝까지 내쉬었을 때 폐포의 벽이 서로 붙거나 그 구조가 망가지는(collapse) 것을 방지해 준다. 폐에 존재하는 계면활성체의 지질성분은 약 90%가 인지질(이 성분들 중 약 70%는 이중포화인지질)이고 약 10%가 중성지방(중성지방의 대부분은 콜레스테롤)으로 되어 있다(Reviews: Jon Goerke 1998. Biochem. Biophy. Acta. 1408:79-89와 Veldhuizen et al., 1998. Biochim. Biophys. Acta. 90-108).

위에서 언급한 사실에 더 고려해야 할 과학적 결과들은 폐의 계면활성체의 지질들이 합성되어지는 거시적인 경로이다. 사람의 폐에 존재하는 콜레스테롤은 대부분은 혈액으로부터 공급을 받는다는 사실이다. 폐에서 합성되는 콜레스테롤은 단지 1% 정도이고 나머지는 혈액으로부터 공급을 받아야 한다는 것이다(Hass and Longmore, 1979. Biochim. Biophys. Acta 573:166-174). 폐의 계면활성체의 대부분을 구성하는 인지질의 경우, 타입II 표피세포(epithelial cell Type II) 에서 합성 되고 분비가 되어지지만, 인지질을 구성하는 지방산의 대부분은 혈액의 VLDL(very low density lipoprotein)으로부터 공급을 받는 것으로 알려져 있다(Rama et al., 1997. J. Clin. Invest. 99: 2020-2029).

SP-A(Surfactant Protein A)는 폐의 계면활성체에 존재하는 주 단백질로 지난 30여년간 연구되어온 단백질이다. SP-A는 폐포(alveoli)에 존재하는 타입 II 표피세포에서 합성되어져 분비될 뿐만 아니라 소장표면, 귀의 유스타키오관(Eustachian tube), 눈물 등에서도 발견된다. 분자랑은 약 700KDa(gel- filtration 분석에 의한 크기) 정도로 32KDa의 동일한 단위체 18개가 모여서 하나의 기능을 갖는 완성된 단백질을 형성한다. 이 단백질의 생물학적 기능은 여러 가지가 있다고 알려져 있지만, 크게 두 가지의 범주로 분류할 수 있다. 첫번째로 SP-A는 호흡 중에 폐로 들어오게 되는 박테리아나 바이러스, 그 외 집진드기나 꽃가루 등에 결합하여 폐를 보호하는 면역학적인 기능이고, 두 번째로 폐의 계면활성체의 항상성(homeostasis)을 유지하는데 관여한다는 것이다(Tino and Wright 1998. Biochim. Biophys. Acta. 1408: 241-263와 Haagsman, Biochim. Biophys. Acta. 1408: 264-277와 Crouch & Wright, 2001. Annu. Rev. Physiol. 63:521-524와 Haagsman and Diemel, 2001 Compar. Biochem. Physiol. 129: 191-108).

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 혈액 단백질의 삼출과 관련된 질환을 치료 예방 및/또는 완화시키는 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 유효성분으로 이중 포화 인지질을 포함하는 혈액 단백질 삼출 관련 질환 치료 또는 완화용 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 이중 포화 인지질은 동물로부터 추출된 것이 바람직하고, 소 또는 돼지로부터 추출된 것이 더욱 바람직하며, 이들의 폐 세척액 또는 폐 조직의 파쇄물로부터 추출된 것이 가장 바람직하다.

또한 본 발명의 상기 이중 포화 인지질은 다이팔미토일포스파티딜콜린 및/또는 다이팔미토일포스파티딜이노시톨인 것이 바람직하다.

또한 본 발명의 조성물은 칼슘과 카르복실기를 포함하는 유기산을 더욱 포함하는 것이 바람직하며 상기 카르복실기를 포함하는 유기산은 대사 가능한 유기산 즉 예를 들어 젖산, 숙신산, 푸마르산 또는 구연산을 포함하나 이에 한정되지 아니하는 유기산인 것이 가장 바람직하다. 또 본 발명의 조성물은 필요에 의하여 첨가제, 예를 들어 글리세롤을 더욱 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물에서, 상기 이중 포화 인지질은 0.1mg/ml ~ 60mg/ml의 농도로 존재하는 것이 바람직하다. 0.1mg/ml 미만의 농도에서는 치료 또는 완화 효과 가 미약하고 60mg/ml 이상에서는 에멀젼 형성이 곤란하여 사용하기 곤란하므로 상기 농도 범위가 가장 바람직하였다.

본 발명의 상기 혈액 단백질 삼출 관련 질환은 아토피성 비염, 천식, 또는 만성 폐쇄성 폐질환인 것을 포함하나 이에 한정되지 아니한다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명은 식물추출오일에 많이 존재하는 불포화지방산과 트란스오일의 과도한 섭취로 인한 혈관-외피 장막(endothelial-epithelial barrier)의 기능저하로 인하여, 피부나 점막에서 혈액 단백질이 삼출되는 현상을 아토피성 질환들의 공통의 모델로 이용하였다. 쥐의 폐에 식물추출오일을 투여하여 인위적으로 혈액 단백질의 삼출을 유발하였고, 생체에서 완전히 대사되어지는 안전한 생체성분들을 이용하여 혈액단백질의 삼출을 줄이거나 억제시킬 수 있다는 것을 알아내었다. 그리고 아토피 질환을 갖는 환자들의 환부(피부)에서도 효과적으로 작용한다는 것을 알아내었다.

본 발명은 건강한 동물의 폐 세척액 또는 폐 파쇄액에서 SP-A 단백질이 2가양이온에 의한 뭉침 현상을 일으킬 때, 동물 폐에 존재하는 이상적인 인지질 성분들과 함께 독특한 침전층을 형성한다는 것을 알아내었다. 이 침전층으로부터 사람에게 면역반응을 유발할 수 있는 계면활성 단백질들(특히, 유기용매 용해성 단백질인 SP-B와 SP-C)과 소수성 펩타이드들, 그리고 콜레스테롤과 불포화인지질들을 제거한 후에 건강한 생체가 갖는 이상적인 조합의 이중포화인지질분획을 온전하게 얻어내는 방법을 포함하고 있다.

게다가 SP-A 단백질은 2가 양이온이 존재하지 않을 때 비특이적 소수성 성질(non-specific hydrophobic interaction)이 강해진다는 발견에 기초하여, 이중포화인지질분획을 성분으로 하는 조성물을 아토피성 질환의 피부나 점막에 혈액단백질의 삼출을 저해하기 위하여 적용할 때, 일정농도의 칼슘이온이 요구되어질 뿐만 아니라 동시에 이중포화인지질들이 특정 농도의 칼슘이온에 의해 뭉치지 않게 하기 위한 방법으로 세포 내에서 대사되어질 수 있는 카복실기(carboxyl group)를 갖는 물질, 즉 시트르산(citrate 또는 citric acid)을 조성물에 추가하는 것 역시 중요한 요소이다.

상기의 구성에서 알 수 있는 바와 같이 본 발명의 이중 포화 인지질을 포함하는 조성물은 혈액 단백질의 삼출로 유발되는 아토피성 질환 등의 치료 또는 완화에 유효한 효과가 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단 본 발명의 실시예는 본 발명을 설명하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위는 하기 실시예에 한정되지 아니한다.

실시예 1: 돼지의 폐세척액으로부터 이중포화인지질분획 추출방법

(1) 폐세척액 얻는 방법.

건강한 돼지에서 적출한 폐를 5mM의 염화칼슘(CaCl₂)을 함유하는 식염수를 기관으로 투여하여 내부를 세척하였다. 세척은 상온에서 압력펌프를 이용하여 한쪽 폐에 약 0.6 리터의 용액을 투입했다가 흘러나오는 세척액을 받아내었다. 폐 한쪽 당 15 리터씩 세척을 한다. 모아진 폐세척액(bronchial alveolar lavage)은 즉시 물-얼음 수조(ice-water bath)로 옮겨 냉각을 시켰다.

(2) 폐세척액으로부터 SP-A의 뭉침현상을 이용한 계면활성체의 침전물을 얻는 방법

칼슘이온(5mM)을 함유하고 있는 상기 폐세척액을 1시간동안 얼음-물 수조에 방치하면, SP-A 단백질은 계면활성체의 지질(lipid)들과 함께 뭉침현상을 보였다. 이 용액을 저가속(low- acceleration) 기능을 갖는 원심분리기(한일, 대한민국)로 원심분리하였다. 4,500g의 원심분리힘으로 4℃에서 35분간 원심분리를 하였다. 원심분리 후 침전물은 독특한 3개의 층(layer)을 갖는다. 소량의 바닥층은 세포들과 변성된 단백질들이고, 가장 많은 양의 중간층과 소량의 맨 위층은 계면활성체(surfactant)와 계면활성체 단백질들(surfactant proteins)의 복합성분들이다. 침전물의 중간층과 맨 윗층을 따로 모아 이중포화인지질분획의 추출에 이용하였다.

(3) 1차 유기용매 추출

위에서 얻어진 계면활성 단백질들과 계면활성체 지질의 복합체 부피의 두배의 증류수를 가하여 혼탁시켰다. 클로로포름과 메탄올의 2:1(부피비) 혼합용매를 시료에 같은 부피를 가한 후 30분 동안 30℃에서 흔들어 주었다. 시료를 1,000g의 원심분리힘으로 15분간 원심분리 후, 유기용매층을 추출하였다.

(4) 실리카 컬럼 크로마토그래피를 이용한 이중포화인지질 분획의 추출.

1차 유기용매 추출 시료를 증발기(evaporator)를 이용하여 용매를 증발시킨 후, 클로로포름으로 다시 녹였다. 이 시료를 실리카(머크사 제품, Merck, 230-400 mesh)로 채워진, 1:5(지름: 높이 비율) 컬럼에 적용(loading)시켰다. 시료로부터 콜레스테롤과 유기용매에 녹아있는 계면활성 단백질들을 제거하고, 이중포화인지질을 얻기 위하여 디자인된 용매들은 다음의 순서로 사용되었다. 실리카 컬럼을 순수 클로로포름으로 세척 후, 순수 클로로포름-순수 아세톤-순수 클로로포름-클로로포름:메탄올(9:1 부피비) 혼합용매 -클로로포름:메탄올(4:1 부피비)혼합용매-클로로포름:메탄올:물(8:6:1 부피비)혼합용매의 순서로 사용하였다. 유기용매 용해성 계면활성단백질들 및 소수성 펩타이들은 순수 아세톤-순수 클로로포름 용매로 용출되며, 이 발명에서 필요로 하는 성분인 이중포화인지질 분획은 맨 마지막 용매로 용출이 되었다. 얻어진 분획들의 각 인지질 성분들은 기준지질들(standard lipids, 씨그마 회사에서 구입)을 이용하여 2D-TLC(2차원-얇은막 크로마토그래피)를 이용하여 확인하였다(도 1). 추출된 이중포화인지질분획의 주성분은 다이팔미토일포스파티딜콜린과 다이팔미토일포스파티딜이노시톨(dipalmitoylphosphatidylcholine과 dipalmitoylphosphatidylinositol)이었다.

(5) 추출된 이중포화인지질분획의 후처리.

컬럼에서 추출된 최종시료는 3겹(layer)의 왓트만 1번 종이필터(Whatman Filterpaper No.1)를 통과시킨 후, 증발기(evaporator)를 이용하여 용매를 제거하였다. 용매가 제거된 시료에 순수 ethanol을 첨가 후, PVDF(polyvinylidene fluoride, 2μm pore-size, 밀리포어 제품)필터를 이용하여 걸렀다. 에탄올은 증발기를 이용하여 다시 증발을 시켰다. 에탄올 세척작업을 2회에 거쳐 수행하였다. 미 량으로 잔존하는 에탄올은 동결건조기(freeze-drier)를 이용하여 제거를 하였다. 얻어진 이중포화인지질분획의 분말형태는 질소로 충전된 밀폐보관용기에 넣어 -70℃에 보관을 하였다.

실시예 2: 소의 폐세척액으로부터 이중포화인지질분획 추출방법

사용된 동물이 돼지에서 소로 변경된 것을 제외하곤 실시예 1에 기재된 (1)～(5)의 과정을 통하여 소의 폐세척액으로부터 이중포화인지질분획을 얻었다.

실시예 3: 건강한 돼지의 폐조직 파쇄물로부터 이중포화인지질분획을 얻는 방법

(1) 동물 폐조직의 1차 파쇄

건강한 돼지에서 적출한 폐에서 조직 150g을 떼어 약 2㎝×2㎝ 정도의 크기로 썬다. 썰어진 폐조각들에 3mM의 2가양이온(염화칼슘)을 함유하는 냉각된 식염수 700ml를 첨가한 후, 금속날이 있는 믹서(metal-blade blander)로 파쇄(homogenization)를 한다. 파쇄는 20초씩 6회를 저속회전속도로 하며, 온도가 상승하는 것을 막기 위하여 얼음-물 수조를 이용하여 틈틈이 냉각을 시켰다. 초기 파쇄는 완전파쇄를 하지 않고 폐 조직들이 콩알 크기 정도로 잘려지도록 하였다.

(2) 1차 파쇄액으로부터 계면활성체지질의 손실없이 혈액을 제거하는 방법.

위의 1차 파쇄액을 얼음-물 수조에서 1시간 동안 방치하여, 넓은 표면적을 갖는 파쇄조직으로부터 혈액이 쉽게 빠져나오게 하며, 동시에 계면활성체 성분들은 2가양이온(칼슘이온, 3mM)에 의해 뭉침 현상을 일으킬 수 있도록 하였다. 1시간 방 치한 파쇄액은 저가속(low-acceleration) 기능의 원심분리기를 이용하여 4,500g의 원심분리힘으로 4℃에서 40분간 원심분리를 하였다. 원심분리 후, 침전층과 부유물(완전히 파쇄되지 않은 일부 폐조직은 공기를 포함하므로 침전되지 않고 부유를 한다)을 제외한 혈액을 함유한 용액은 제거를 하였다.

(3) 폐조직의 2차 파쇄 및 계면활성체의 침전 방법.

혈액이 제거된 1차 폐조직 파쇄물에 5mM의 2가양이온(칼슘이온)농도를 함유한 500ml의 75mM의 염화나트륨 용액(생리적 식염수의 1/2 농도)을 가한 후, 금속날이 있는 믹서(blander)로 조직을 곱게 파쇄하였다. 이 과정은 폐의 타입 II 표피세포의 안쪽에 존재하는 계면활성체들의 보관소(reservoir)역할을 하는 멀티 라멜라(multi lamellar) 구조물들을 용이하게 얻어내기 위하여 저장용액(hypotonic solution)을 사용하였다. 파쇄과정에서 온도가 상승하지 않도록 고속회전 파쇄를 40초씩 6-8회를 하며 얼음-물 수조를 이용하여 틈틈이 냉각을 시켰다. 2차 파쇄를 거친 시료는 4℃에서 1시간 동안 방치하여, SP-A에 의한 계면활성체의 뭉침 현상이 일어나도록 하였다. 저가속 기능의 원심분리기를 이용하여 4℃에서 4,500g의 원심분리 힘으로 40분간 원심분리를 하였다. 원심분리 후, 시료는 색깔과 질감이 확연히 다른 두 침전층을 형성하게 된다. 침전층 중에 상층을 따로 얻어내어 이중포화인지질을 추출하기 위한 유기용매추출 과정을 거치었다. 남겨진 소량의 하층에 다시 5mM 칼슘이온을 함유한 식염수를 가하여 다시 혼탁시킨 후, 같은 방법으로 원심분리를 하면, 일부 섞여있던 계면활성체지질들이 다시 분리된 층을 이루었다. 이 상층의 침전층을 이전에 얻은 시료와 합하여 유기용매추출 과정을 거쳤다.

(4) 이중포화인지질분획을 얻는 방법

상기 실시예 1에서 서술한 (3), (4), (5)의 방법과 동일한 방법을 이용하여 폐조직 파쇄물로부터 이중포화인지질분획을 얻었다.

실시예 4: 건강한 소의 폐조직 파쇄물로부터 이중포화인지질분획을 얻는 방법

사용된 동물이 돼지에서 소로 변경된 것을 제외하곤 실시예 3에 기재된 것과 동일한 과정을 통하여 소의 폐조직 파쇄물로부터 이중포화인지질분획을 얻었다.

실험예 1: 동물 실험

1-1. 동물의 폐에서 혈액단백질의 삼출유발

옥수수 오일(corn oil, 시그마 시약회사로부터 구입)과 식염수는 고온고압멸균기(autoclave)를 이용하여 각각을 따로 멸균을 하였다. 500㎕(마이크로리터)의 옥수수오일과 1,500㎕의 식염수를 섞은 후, 매우 세게 흔들어(vortex) 균질한 혼탁액으로 만들었다. 이 혼탁액을 다 자란 실험용 흰쥐(Sprague-Dawley rat)의 폐에 혈액단백질의 삼출을 유발하기 위하여 기관지내 투여(intratracheal administration)를 하였다. 가증상(placebo effect)의 대조군 쥐들은 멸균된 식염수만 기관지내 투여를 하였다. 실험군 쥐들은 2주 뒤에 케타민(Ketamine, 유한양행제품) 마취제를 이용하여 수면마취 후, 이산화탄소를 이용하여 안락사 시켰다. 실험동물이 죽자마자 폐를 즉시 적출하였고, 전체 50ml의 식염수(3mM의 염화캄슘을 함유)로 폐를 세척(lavage)하여 폐세척액을 동물개체별로 모았다.

1-2. 혈액단백질 삼출의 저해효과실험 및 사용된 조성물의 구성

위에서 언급한 방법으로 혈액단백질 삼출을 동물에게 유발시킨 후, 1주 뒤에 실시예 1 내지 4로부터 얻은 이중포화인지질분획을 함유하는 조성물을 기관지내 투여하였다. 실험동물들로부터 폐의 적출 및 폐 세척은 조성물을 투여시킨 시점으로부터 1주일 후에 하였다.

사용된 조성물은 30mg/ml의 이중포화인지질분획, 1.5mM의 염화칼슘, 7.5mM의 시트레이트(citrate trisodium salt), 125mM 염화나트륨의 농도가 되도록 증류수에 혼합하였고 용액의 pH는 6.0으로 하였다. 동물에게 투여 전에 세게 흔들어 균질한 혼탁액으로 만들어 사용을 하였다.

1-3. 혈액단백질의 삼출유발 및 삼출저해의 분석

(1) 각각의 실험동물군에서 분석시료의 준비

각 실험 동물군에서 얻어진 폐 세척액들은 저 가속 기능의 원심분리기를 이용하여, 4,500g의 원심분리힘으로 4℃에서 30분간 원심분리를 하였다. 얻어진 침전물에서 2가양이온(칼슘이온)의 존재 하에 SP-A에 의해 뭉쳐진 계면활성체의 층만을 따로 모았다. 모아진 침전물의 약 3배 부피의 식염수(3mM 염화칼슘 함유)를 가하여 다시 혼탁시켰다. 이 혼탁액은 동일한 원심분리힘으로 원심분리를 하여 침전을 시켰다. 이와 같은 침전물의 세척과정을 두 번 더 반복하여 침전물을 세척하였다. 최종 침전물의 혼탁액들을 1ml 소형 원심분리 튜브에 나누어, 침전물의 부피가 200㎕씩 되도록 분할을 하였다.

위에서 설명한 세척된 계면활성체 침전물 200㎕에 10mM의 이디티에이(EDTA, ethylenediamineteteraacetic acid)를 함유하는 10ml의 트리스 완충용액(Tris buffered saline, pH 7.4, 10mM Tris-HCl, 140mM NaCl)을 가하여 혼탁시켰다. 이 용액에 양쪽성 세제(detergent)인 쳅스(CHAPS, 암레스코제품 Amresco, USA)를 첨가하여 혼탁액을 용해시켰다(solubilization). 쳅스기준(stock)용액은 10%(약 162mM 농도)를 사용하였고, 최종 사용된 CHAPS 사용농도는 65mM이었다.

(2) 분석

위의 과정으로 준비된 각각의 시료들(2ml)로부터 1ml를 취하여 Sephacry S-400HR(1.5㎝×20㎝, Amersham Bioscience제품) 수지(resin)로 채워진 크로마토그래피 컬럼에 적용하여 단백질의 용출형태(elution pattern)를 분석하였다. 크로마토그래피 작업은 그래디프랙(GradiFrac, Pharmacia제품)을 이용하였다. 이 때 사용되어진 완충용액은 5mM의 EDTA, 1mM의 CHAPS와 140mM의 NaCl을 함유하는 10mM의 Tris 완충용액(pH 7.4)을 사용하였다. 컬럼에서 용출된 단백질들의 자외선 흡광 그라프(UV absorption graph)로부터, 분자량 700kDa 부위의 SP-A 함유하는 단백질 피크(peak)와, 분자량 70kDa 부위의 알부민을 함유하는 단백질 피크의 크기(양)를 비교함으로써 혈액단백질의 삼출정도와 삼출의 저해정도를 각각 측정을 하였다(도 2 참조).

1-4. 동물실험 결과

혈액 단백질 삼출을 유발한 실험쥐들에서 얻은 시료들, 조성물의 투여로 삼출억제를 시킨 실험쥐들의 시료들, 식염수만 투여한 실험쥐들로부터 얻은 시료들, 그리고 아무런 처리도 하지 않은 정상 쥐들로부터 얻은 단백질 용출 패턴 그래프로부터, 분자량 700KDa 부위의 단백질 피크(peak)와 분자량 70KDa 부위의 단백질 피 크의 비율, 즉 두 피크의 크기(양)의 비율을 다음의 표 1에 정리하였다.

	700KDa 부위의 단백질 피크(peak)/ 분자량 70KDa 부위 단백질 피크 비
혈액단백질 삼출유발 대조군	0.8
	1.1
	1.4
실시예 1 또는 실시예 2의 조성물 투여	2.0
실시예 1 또는 실시예 2의 조성물 투여	2.3
실시예 3 또는 실시예 4의 조성물 투여	1.9
	1.9
	2.1
	2.3
식염수만 투여한 대조군	4.4
	5.7
비실험 대조군(어떠한 처리도 하지 않은 쥐)	4.2
	4.3
	4.8

상기 표 1 및 얻어진 결과들로부터, 건강한 동물의 폐에서 추출한 이중포화인지질분획을 주성분으로 하는 조성물은 혈액단백질 삼출을 줄여주는 것으로 확인하였다. 단 1회 기관지내 투여로 알부민을 함유하는 피크의 크기가 혈액단백질 삼출 유발쥐들에 비하여 약 50% 감소하였다. 이 감소된 양은 정해 놓은 기준(criterion)으로부터 얻어진 수치이고 실제 감소량은 이보다 훨씬 더 크다. 그 이유는 정상 쥐들로부터 폐세척을 얻으면 평균적으로 2-3ml(침전물 부피/마리)가 얻어지는 것이 일반적이나, 혈액단백질 삼출 유발 쥐들로부터는 개체마다 큰 변이가 있지만, 정상 쥐의 3배~5배 정도 많은 침전물이 얻어진다. 그러나 본 발명의 조성물에 의한 혈액단백질 삼출억제를 시킨 쥐들로부터는 정상 쥐들의 침전물 양과 거의 같거나 많아야 약 2배 부피의 침전물이 얻어진다. 즉 본 발명의 조성물은 혈액단백질 삼출 유발 쥐들에 비하여 그 침전물의 절대적인 양이 확연히 감소되는 것을 보인다. 그러나 이러한 침전물의 양의 절대적 차이는 실험온도, 폐조직의 유연성, 실험자의 손기술 등에 의해 달라질 수 있으므로 그것을 수치화하지는 않았다. 즉, 도 2 및 표 1에서 제시된 혈액단백질의 감소는 전체적인 단백질의 양을 보여주는 것이 아니라 SP-A를 함유하는 피크와 알부민을 함유하는 피크의 상대적인 비교 값만을 제시하고 있다. 만일 본 발명의 조성물에 의하여 감소된 알부민을 함유하는 피크의 총량(도 2의 (2)의 B 참조)을 고려한다면 그 감소 정도는 매우 현저한 효과가 있는 것을 알 수 있다.

생체가 폐표면에 갖고 있는 가장 이상적인 이중포화인지질조성은 폐세척액에서 온전하게 추출한 이중포화인지질분획이 가장 효과가 뛰어나야 하지만, 얻어진 실험 결과를 볼 때 혈액을 제거한 폐조직 파쇄물에서 얻은 이중포화인지질분획 역시 같은 비율의 혈액단백질의 삼출저해를 보였다.

실험예 2: 아토피성 피부질환의 지원자들 실험

2-1. 피부에 사용한 조성물과 적용방법

(1) 조성물

동물 폐를 파쇄 후, 2가 양이온(칼슘이온)에 의한 계면활성체의 뭉침현상을 이용한 추출방법에 의해 얻어낸 이중포화인지질분획(이 성분들은 추출과정에서 0.2㎛ 포어-크기의 피브이디에프 PVDF(polyvinylidenefluoride filter, 0.2μm pore-size, 밀리포어제품) 필터로 걸러진 후, 동결건조된 상태)에 증류수를 가한 후, 고온고압멸균을 하였다. 염화칼슘 용액, 시트레이트(citrate trisodium salt)용액 및 글리세롤(glycerol) 역시 각각 따로 가압멸균을 하였다. 멸균된 성분들을 무균상태에서 증류수에 혼합하여, 15mg/ml의 이중포화인지질, 1.5mM의 칼슘이온, 7.5mM의 시트레이트(citrate trisodium salt), 10%(부피/부피 비) 글리세롤의 농도가 되도록 하였다. pH는 6.0으로 하였다. 글리세롤은 이중포화인지질들이 피부에 바르는 동안 문지르는 물리적인 힘에 의해 이중포화인지질들이 쉽게 퍼질 수 있도록, 용액에 점도를 주기 위하여 전체 농도 10%가 되도록 첨가하였다. 혼합성분들을 세게 흔들어(vortex) 균질한 혼탁액으로 만들어 적용을 하였다.

(2) 적용방법

피부적용은 약 2㎝×2㎝의 환부표면에 한 방울(약 30㎕)을 떨어뜨려 용액이 완전히 스밀 때까지 문지르도록 하였다. 하루 2번 이상 피부 도포를 권장하였다. 이 조성물을 사용하는 동안 고리구조(aromatic ring)의 화합물을 가질 수 있는 향이 강한 화장품이나 비누의 사용을 자제하도록 권장하였다.

2-2. 지원자 실험 결과(육안관찰)

아토피성 피부질환을 갖고 있는 8명(5세~40세, 평균나이 33세, 남4명, 여4명)의 지원자들로부터 15부위를 테스트를 하였다. 조성물의 피부적용기간은 2주~4주였다. 테스트 지원자 전원에서 환부와 환부 주변의 경계가 구별되지 않을 정도로 아토피성 피부증상의 개선을 보였다.

아토피성 피부질환으로 인한 피부진물(exudate)이 건조되어 형성되는 비늘형태(skin crust)들은 적용 후 2일부터 피부표면에 재형성이 안 되는 것을 확인하였다. 아토피성 홍반을 갖고 있는 지원자의 경우 1주 경과 후, 환부와 환부주변의 색의 차이가 구별가지 않게 증상이 없어졌다. 피부괴저(skin ulcer)를 동반한 경우는 3.5주 후(약 25일 경과 후), 상처가 완전히 재생된 것을 확인하였다(도 3 참조).

도 1은 이중 포화 인지질을 TLC로 확인한 사진이다. 도 1에서 * 표시 부분이 이중 포화 인지질 분획부분을 나타낸다.

도 2는 쥐의 폐에 혈액단백질의 삼출 유발 후, 조성물에 의한 억제 후, 정상상태의 단백질 패턴 분석결과 예를 나타낸다. 도 2에서 (1)은 쥐의 폐에 혈액단백질을 유발한 결과 (2)는 혈액단백질 삼출유발 쥐에 조성물을 투여한 결과 (3)은 대조군 쥐의 상태. A는 SP-A (~700KDa)단백질을 함유하는 피크(peak). B는 혈액알부민(~70KDa)을 함유하는 피크를 나타내며, 두 피크의 크기를 비교하여 삼출억제 효과를 관찰하였다.

도 3은 조성물의 아토피 피부질환 적용(2주~4주) 후 결과들의 예를 나타낸다. 사진의 왼쪽은 조성물 적용 전. 사진의 오른쪽은 조성물 적용 후. 적용기간은 2-4이었고, 가장 위쪽 사진은 아토피성 습진 환자, 위에서 두번째 손등 사진은 궤양을 포함하는 아토피성 피부염 환자, 위에서 세번째 사진은 아토피성 홍반의 사진이고, 맨 아래쪽 사진은 아토피성 피부염 환자 사진이다.

Claims

유효성분으로 이중 포화 인지질을 포함하는 폐질환 치료 또는 완화용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 이중 포화 인지질은 동물로부터 추출된 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 이중 포화 인지질은 소 또는 돼지로부터 추출된 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2항 또는 제 3항에 있어서, 상기 이중 포화 인지질은 폐 세척액 또는 폐 조직의 파쇄물로부터 추출된 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항 내지 제3항 중 임의의 한 항에 있어서, 상기 이중 포화 인지질은 다이팔미토일포스파티딜콜린 및/또는 다이팔미토일포스파티딜이노시톨인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 칼슘과 카르복실기 함유 유기산을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 조성물은 글리세롤을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 이중 포화 인지질은 0.1mg/ml~60mg/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 폐질환은 아토피성 비염, 천식, 또는 만성 폐쇄성 폐질환인 것을 특징으로 하는 조성물.