KR20080065657A - 황반 변성 관련 유전자 - Google Patents

황반 변성 관련 유전자 Download PDF

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KR20080065657A
KR20080065657A KR1020087011352A KR20087011352A KR20080065657A KR 20080065657 A KR20080065657 A KR 20080065657A KR 1020087011352 A KR1020087011352 A KR 1020087011352A KR 20087011352 A KR20087011352 A KR 20087011352A KR 20080065657 A KR20080065657 A KR 20080065657A
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macular degeneration
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mutation
loc387715
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조세핀 호
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예일 유니버시티
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Abstract

본 발명은 노화성 황반 변성과 관련있는 유전자 변이, 예컨대 LCO389915, SYNPR 또는 PDGFC 유전자 변이의 동정과, 노화성 황반 변성 발병 위험이 있는 개체를 식별하거나 또는 식별을 돕는 방법에 관한 것이다.

Description

황반 변성 관련 유전자{GENES ASSOCIATED WITH MACULAR DEGENERATION}
연구비지원
본 발명은 미국 국립보건원에 의해 주어진 지원번호 HG000060 및 EY015771로 미국 정부 지원을 받아 수행하였다. 본 발명에 대해 미국 정부는 일정 권리를 갖는다.
본 출원과 관련된 상호 참고문헌
이건 출원은 2005년 10월 11일자 미국 가출원번호 제 60/726,061호에 대하여 우선권을 주장한다. 상기 가출원의 내용은 원용에 의해 그 전문이 본 명세서에 포함된다.
선진국에서 노화성 황반 변성(Age-related macular degeneration, AMD)은 노화성 실명의 주원인이다. 본 질병은 수명이 길어지고 노인인구가 증가됨에 따라 증가하고 있다(D. S. Friedman et al., Arch Ophthalmol 122, 564 (2004)). 본 질환은 망막 중심 부위(황반)의 진행성 파괴로 인해 중추계 시각 손실을 특징으로 하는 만성 질환이다(J. Tuo, C. M. Bojanowski, C. C. Chan, Prog Retin Eye Res 23, 229 (2004)). AMD의 주요 특징 중 하나는 망막 색소 상피(RPE) 및 맥락막 사이 망막 후면의 황반에 또는 그 주변에 집중되는 드루젠(drusen)이라고 불리는 세포외 침착물이 형성되는 것이다. AMD 발병 위험도는 유전적 변이의 복잡한 상호 작용에 의해 결정되지만, 대부분은 아직 규명되지 않았다. AMD의 유전적 결정에 대한 추가적인 정보는 당해 분야에 매우 유익할 것이다.
발명의 개요
본 발명의 방법은 AMD 소인과 관련된 인간 유전자 변이 동정에 관한 것이다. 이러한 변이 및 변이가 발생된 유전자 변이체는 AMD 발생 위험성이 있는 개체의 식별 또는 식별을 도울 뿐만 아니라, AMD 진단 또는 진단을 돕는데 유용하다. 또한, 본 발명은 AMD 발생 위험성이 있는 개체의 식별 또는 그 식별을 돕는 방법, AMD의 진단 또는 진단을 돕는 방법, 상기 방법에 유용한 폴리뉴클레오티드(예컨대, 프로브, 프라이머), 프로브 또는 프라이머를 포함하는 진단 키트, AMD 위험성이 있거나 앓고 있는 개체를 치료하는 방법, 및 AMD 위험성이 있거나 앓고 있는 개체를 치료하는데 유용한 조성물에 관한 것이다.
출원인들은 AMD를 앓고 있는 개체와 AMD에 걸리지 않은 개체로부터 게놈-와이드 SNP 유전자형 확인 데이타를 분석하여, LOC387715 및 상호작용할 것으로 보이는 다른 유전자 좌에서의 단일 연관성(single association)을 검색하였다. AMD 발생 위험성에 작용하는 것으로 알려진 변이가 유전자 LOC387715에서 발견되었다. 본원에 언급된 바와 같이, 출원인들은 LOC387115와 AMD 간의 연관성을 검증하였다. 또한, 출원인들은 공지된 AMD 관련 피크에 모두 위치된, 유전자 LOC387715, 시냅토포린(synaptoporin: SYNPR), 및 혈소판 유래 성장 인자 C(PDGFC) 변이들의 상호작용이 AMD 감수성에 기여한다는 증거를 제공한다. 이러한 상호작용은 본 출원인이 이전에 확인한 상보 인자 H(complement factor H: CFH)와의 조합과 더불어, AMD에 대한 높은 유전적 위험을 나타내는 것으로 보인다.
일 예로, 본 발명은 인간에서의 AMD 발병과 관련있는 LOC387715 유전자, 인간에서의 AMD 발병과 관련있는 SYNPR 유전자 및 인간에서의 AMD 발병과 관련있는 PDGFC 유전자를 검출하거나 그 검출을 돕는데 유용한 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 표현 "인간에서의 AMD 발병과 관련있는" 및 "AMD 발병과 관련있는"은 본원에서 상호 호환적으로 사용된다. 구체적인 예로, 본 발명은 인간에서의 AMD와 관련있는 각 유전자의 변이를 검출하거나 그 검출을 돕는데 유용한 폴리펩티드에 관한 것이다. 다른 예로, 본 발명은 AMD 발병 위험을 개체에서 확인하거나 확인을 돕는데 유용한 방법 및 조성물을 제공한다. 다른 예로, 본 발명의 방법 및 조성물은 AMD를 앓고 있거나 또는 AMD 발병 위험이 있는 개체의 치료에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 과제는 LOC387715 변이 유전자, SYNPR 변이 유전자 또는 PDGFC 변이 유전자를 단독으로 또는 조합으로 개체로부터 유래된 샘플에서 검출하기 위한 진단 키트를 제공하는 것이다. 이러한 키트는 AMD 발병과 관련있는 CFH 유전자 변이를 검출하는데에도 이용할 수 있다. 이러한 키트는 AMD 발병 위험이 있는 개체를 식별하거나 식별을 돕는데 유용할 뿐만 아니라 개체에서 AMD를 진단하거나 진단을 돕는데 유용하다.
구체적인 예로, 본 발명은 LOC387715 변이 유전자를 검출하기 위한 분리된 폴리뉴클레오티드; SYNPR 변이 유전자를 검출하기 위한 분리된 폴리뉴클레오티드; 및 PDGFC 변이 유전자를 검출하기 위한 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 분리된 폴리뉴클레오티드는 인간에서 AMD와 상호 관련있는 LOC387715 유전자에서의 변이; 인간에서 AMD와 상호 관련있는 SYNPR 유전자에서의 변이; 또는 인간에서 AMD 발병과 상호 관련있는 PDGFC 유전자에서의 변이를 특이적으로 검출하는 핵산 분자를 포함한다. 분리된 폴리뉴클레오티드는 개체의 샘플에서 인간의 AMD와 상호 관련있는 LOC387715 변이 유전자, SYNPR 변이 유전자 또는 PDGFC 유전자 변이를 검출하는데 유용하다.
본원에 언급된 연구는 AMD 감수성에 대한 각각의 염색체 상에 있는 3개의 유전자 좌간의 유전자 상호작용을 보이는 강력한 증거를 제공한다. 시냅토포린(SYNPR) 변이체(들) 및 혈소판 유래 성장 인자(PDGFC) 변이체(들)과 조합된 LOC387715 기능 변이체(들). 반대로, CFH 변이체는 개체의 AMD 발병 유전적 위험도에 독립적으로 기여한다. 예상된 PAR은 AMD의 유전자 기여가 기존에 추산된 수준(0.46 - 0.71) 만큼 높은 수준(0.55 - 0.71)에 이르렀으며(16), 이는 보고된 유전자 네트워크(들)가 예컨대 유럽 혈통의 집단에서 상당한 비중의 AMD 유전자 위험도를 포착한다는 가설을 뒷받침한다. 다른 집단에서 AMD 감수성에 대한 이러한 유전자 네트워크(들)의 기여는 본원에 언급된 방법을 이용하여 검증 또는 결정할 수 있다.
발명의 상세한 설명
개요
본원에 언급된 바와 같이, 출원인들은 다른 유전자와 독립적으로, 그리고 협력하여, 노화 관련 안 질환 연구(AREDS)로 개체의 유전자형을 확인하여 수득한 게놈-와이드 조합 데이타(genome-wide association data)에서 LOC387715 유전자 좌를 100,000개 이상의 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)에 대해 조사하였다(AREDS Research Group, Ophthamology 107, 2224 (2000)). 또한, 본원에 개시된 바와 같이, 상기한 조사 결과, 3개의 유전자(LOC387715, 시냅토포린(SYNPR) 및 혈소판 유래 성장 인자 C (PDGFC))와 AMD 발병과의 연관성을 입증하였고, AMD 감수성에서의 이들의 상호작용 기능을 입증하였다. 3종의 유전자의 변이를 각각 vLOC387715, vSYNPR 및 vPDGFC로 본 발명에 나타낸다. 출원인이 이전에 입증한 CFH(complement factor H) 조합과 더불어, 이들 상호작용은 AMD에 대한 현저한 유전적 위험성을 추정하는 것으로 보인다. AMD 발병과 관련있는 3종의 유전자 변이 조사, 및 AMD 발병과 관련있는 CFH 변이 유전자와 3종의 유전자 변이의 조합적인 조사는, AMD 발병 위험성이 있는 개체를 식별하거나 식별을 돕는데 유용할 뿐만 아니라 개체(예, 인간)에서 AMD를 진단하거나 진단을 돕는데 유용하다.
인간의 AMD와 관련있는(조합된) 것으로 입증된 LOC387715 유전자 변이, SYNPR 유전자 변이 및 PDGFC 유전자 변이는, AMD 소인이 있는 개체의 조기 진단 및 치료에 유용하다. LOC387715 유전자, SYNPR 유전자 및 PDGFC 유전자의 유전적 구성을 개체(인간)에서 결정하는 것은 AMD를 조기에 또는 어떠한 AMD 증상을 개체가 보이기도 전에 치료하는데 유용하다. 또한, LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 유전자형에 대한 진단 테스트는 AMD 발병 위험성이 있는 것으로 입증된 개체와 같은 개체에서 실시 가능하며, 이들의 양태를 AMD 발병에 기여하는 환경적인 위험(예, 흡연)을 감소시키도록 변이시켜, 그 결과 AMD 발병 위험성을 낮추거나, AMD 중증도를 경감시키거나/시키고, AMD 개시를 지연시킬 수 있다.
일 예로, 본 발명은 인간에서 AMD 발병, AMD 소인(발병 가능성 증가)과 관련있는 VLOC387715 유전자(들), vSYNPR 유전자(들) 및 vPDGFC 유전자(들)의 동정에 관한 것이다. 이러한 변이는 AMD 발병 위험성이 있는 개체를 식별하거나 식별을 돕는데 유용할 뿐만 아니라 AMD를 진단하거나 진단을 돕는데 유용하다. 또한, 본 발명은 AMD 발병 위험성이 있는 개체를 식별하거나 식별을 돕는 방법, 인간에서 AMD 발병 소인이 되는 그러한 변이를 검출하는 방법 및 조성물, AMD를 진단하는 방법 또는 진단을 돕는 방법, 방법에 이용가능한 폴리뉴클레오티드(예, 프로브, 프라이머), 프로브 또는 프라이머를 포함하는 본 발명의 방법에 유용한 진단 키트, AMD를 앓고 있는 또는 앓을 위험이 있는 개체를 치료하는 방법 및 AMD를 앓을 위험이 있거나 앓고 있는 개체를 치료하는데 유용한 조성물에 관한 것이다. 본원에서 상호작용하는 것으로 입증된 3종의 유전자 변이는 단독으로(다른 인자(들)의 조사 없이, 예컨대 AMD 발병과 관련있는 CFH 변이 유전자의 조사 없이), 또는 AMD와 관련있는 CFH 변이 유전자의 조사 또는 임상 조사와의 조합과 같은 추가적인 인자(들)의 조사와 조합하여, 본 발명의 방법으로 조사할 수 있다.
LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 유전자는 cDNA 또는 유전자 게놈 형태일 수 있으며, 상류 및 하류 조절 서열을 포함할 수 있다. 예컨대, 호모사피엔스 유전자 LOC387715 엔트리, http://www.ncbi.nlm.nih.gov; 시냅토포린(rat protein P22831 EMBL 및 SYNPR synaptorin Gene ID 66030 Entrez Gene at http://rat.embl.de: SYNPRJVIOUSE Q8BGN8 at http://us.expasy.org; human protein Q8TBG9 - Synaptoporin EMBL and SYNPR synaptoporin [Homosapiens] at http://harvester.embl.de); PDGFC(Genbank accession AF336376; Utela et al. Circulation 2001; 103:2242-2247)을 참조하며, 이들은 어떠한 방식으로도 한정되는 것으로 의도되진 않는다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 프로브 및 프라이머는 3종의 유전자들(LOC387715, SNYPR 또는 PDGFC) 중 어느 하나의 임의의 연속된 부분 또는 3종의 유전자 변이체들(vLOC387715, vSNYPR 또는 vPDGFC) 중 어느 하나의 임의의 연속된 부분과 혼성화할 수 있다. LOC387715, SYNPR5 및 PDGFC 유전자는 유전자가 전장 mRNA의 길이에 대응하도록 양 말단에 약 1-2 kb 길이로 5' 및 3' 말단 모두에서 코딩 서열에 인접하게 위치된 서열을 더 포함할 수 있다. 코딩 부위의 5'에 위치되어 있으며 mRNA에 존재하는 서열은 5' 비번역 서열이라고 한다. 코딩 부위의 3' 또는 하류에 위치되어 있으며 mRNA에 존재하는 서열은 3' 비번역 서열이라고 한다.
또한, 본 발명의 과제는 분리된 vLOC387715 폴리펩티드; 분리된 vSYNPR 폴리펩티드; 및 분리된 vPDGFC 폴리펩티드와, 본 발명의 방법에서의 이들의 용도, 예컨대 AMD 발병 위험이 있는 개체를 식별하거나 또는 식별을 돕는 방법, 인간에서 AMD 발병 소인이 되는 그러한 변이를 검출하는 방법 및 피셔 및 공동연구자들(8)에 의해 개시된 LOC387715 유전자에서 코딩 변화에 의해 코딩된 Ala69Ser 변화와 같은 인간 폴리펩티드 서열 및 비-인간(예, 랫, 마우스) 폴리펩티드 서열 등의 AMD vLOC387715 폴리펩티드를 진단하는 방법 및 그 진단을 돕는 방법에서의 이들의 용도에 관한 것이다. 이와 유사하게, vSYNPR 폴리펩티드 및 vPDGFC 폴리펩티드는 인간의 서열 및 비-인간성 서열을 포함한다. LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 폴리펩티드는 전장 코딩 서열이나 또는 코딩 서열 중 임의 부분에 의해 코딩될 수 있으며, vLOC387715, vSYNPR 및 vPDGFC 폴리펩티드는 코딩된 폴리펩티드가 원하는 활성 또는 기능적 특성(예, 효소 활성, 리간드 결합성, 신호 전달)을 가지는 한, 전장 코딩 서열이나 또는 코딩 서열중 임의 부분에 의해 코딩될 수 있다.
LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 폴리뉴클레오티드 프로브 및 프라이머
특정 예에서, 본 발명은 AMD 발병과 관련있는 LOC387715 유전자의 변이, AMD 발병과 관련있는 SYNPR 유전자의 변이 또는 AMD 발병과 관련있는 PDGFC 유전자의 변이, 또는 이들의 조합을 특이적으로 검출하는 분리된 및/또는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 프로브는 그러한 LOC387715 유전자, SYNPR 유전자, 또는 PDGFC 유전자의 변이(대상 변이라고 함)와, 측면 서열(flanking sequence)에 특이적인 양상으로 혼성화하며, 따라서 전형적으로 변이 및 측면 영역의 서열과 완전히 또는 부분적으로 상보적인 서열을 가진다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 프로브는 변이가 프로브의 중심 부분 또는 프로브의 말단 부위와 같이 프로브의 다른 부분과 정렬되도록 대상 변이를 포함하는 유전자의 단편 또는 DNA와 혼성화할 수 있다. 일 예로, 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드 프로브는 엄격 조건하에서 인간에서 AMD 발병과 관련있는 LOC387715 변이 유전자, AMD 발병과 관련있는 SYNPR 변이 유전자 또는 AMD 발병과 관련있는 PDGFC 변이 유전자, 또는 그것의 일부분 또는 대립유전자 변이를 포함하는 핵산 분자와 혼성화한다. 다른 예로, 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드 프로브는 엄격 조건하에서 LOC387715 유전자의 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드, SYNPR 유전자의 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드, PDGFC 유전자의 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드, AMD와 상호 관련있는 LOC387715 변이 유전자, AMD와 상호 관련있는 SYNPR 변이 유전자 또는 AMD와 상호 관련있는 PDGFC 변이 유전자를 포함하는 핵산 분자, 또는 이들의 대립유전자 변이체와 혼성화하며, 상기 핵산 분자는 인간에서 AMD 발병과 관련있는 변이를 포함한다.
특정 예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 프로브는 대립유전자-특이적인 프로브이다. 다형성(polymorphism)을 분석하기 위한 대립유전자-특이적인 프로브 설계 및 이용은 예컨대 Saiki et al., Nature 324:163-166(1986); Dattagupta, EP 235726; 및 Saiki WO 89/11548에 개시되어 있다. 2종의 개체로부터 유래된 각 절편에는 상이한 다형성 형태 또는 변이부위가 존재하기 때문에, 대립유전자-특이적 프로브는 한 개체로부터 유래된 표적 DNA 절편에 혼성화하도록 고안될 수 있으나, 다른 개체로부터 유래된 대응되는 절편에는 혼성화하지 않는다. 혼성화 조건은 충분히 엄격하여, 대립유전자 간 혼성화 강도에 유의한 차이가 있어야 한다. 일부 예에서, 프로브는 대립유전자 중 하나에만 혼성화한다.
개체의 AMD의 원인이 되는 LOC387715 유전자, SYNPR 유전자 및 PDGFC 유전자에서 다양한 변이 또는 이러한 변이의 임의 조합은 본 명세서에 기재된 방법 및 폴리뉴클레오티드에 의해 검출할 수 있다. 예를 들어, 인간의 AMD와 관련된, 코딩 영역, 엑손, 엑손-인트론 경계, 신호 펩티드, 5'-비번역 영역, 프로모터 영역, 인핸서(enhancer) 서열, 3'-비번역 영역 또는 인트론의 임의의 뉴클레오티드 다형성을 검출할 수 있다. 이들 다형성은 다음 변화를 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다: LOC387715 유전자, SYNPR 유전자 및/또는 PDGFC 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 아미노산 서열 변경, 대체 스플라이싱 생성물의 생성, 잘린(truncated) 생성물의 형성, 미성숙 정지 코돈의 도입, 잠재(cryptic) 엑손의 도입, 정도 또는 발현을 다소 변경, 유전자 발현의 조직 특이성 변경, LOC387715, SYNPR 또는 PDGFC에 의해 코딩된 단백질의 3차 구조의 변화 유도, LOC387715, SYNPR 또는 PDGFC에 의해 발현되는 단백질의 결합 친화성 또는 특이성의 변화 유도, 또는 LOC387715, SYNPR 또는 PDGFC에 의해 코딩되는 단백질 기능의 변경. 특정 예에서, LOC387715 변이 유전자는 LOC387715 단백질의 69번 위치를 알라닌 이외의 다른 아미노산(예, 세린)을 코딩한다. 변이부위가 코딩 영역에 있는 변이 유전자와 같이 기타 변이 유전자(예, AMD와 관련없는 LOC387715 유전자의 해당 위치, AMD와 관련없는 SYNPR 유전자의 해당 위치, AMD와 관련없는 PDGFC 유전자의 해당 위치에 존재하는 아미노산 이외의 다른 아미노산을 코딩하는 변이)는, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물을 사용하여 검출할 수 있다. 또한, 변이부위가 비코딩 영역에 있는 변이 유전자를 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 의해 검출할 수 있다.
변이 폴리뉴클레오티드가 AMD 발병과 관련있는 LOC387715, SYNPR 또는 PDGFC변이 유전자를 특이적으로 검출하는 능력을 보유하는 한, 대상 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오티드의 변이인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로 이해된다. 변이 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 부가 또는 결손에 의해 차이가 생기는 서열을 포함한다.
특정 예에서, 분리된 폴리뉴클레오티드는 엄격 조건에서, 인간 AMD 발병과 관련있는 LOC387715 유전자의 변이에, 인간 AMD 발병과 관련있는 SYNPR 유전자의 변이에, 또는 인간 AMD 발병과 관련있는 PDGFC 유전자의 변이에, 혼성화하는 프로브이다. 용어 "프로브"는 목적한 다른 핵산에 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 정제된 제한효소 분해 산물 형태로서 자연적으로 발생할 수 있거나, 또는 합성, 재조합 또는 핵산 증폭에 의해 생산될 수 있다(예컨대, PCR 증폭).
핵산 분자를 사용한 혼성화 시험의 수행 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 당업자는 혼성화 조건에 익숙하다. 이러한 혼성화 조건은 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(2001); 및 Current Protocol in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons(1992)와 같은 당 분야의 일반 교재에 언급되어 있다. 엄격 조건에서, 인간 AMD 발병과 관련있는 LOC387715 유전자의 변이에, 인간 AMD 발병과 관련있는 SYNPR 유전자의 변이에, 또는 인간 AMD 발병과 관련있는 PDGFC 유전자의 변이에, 또는 변이 LOC387715 유전자, 변이 SYNPR 유전자, 변이 PDGFC 유전자의 영역에, 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드가 본 발명의 방법에서 특히 유용하다. 엄격 조건에서, 인간 AMD 발병과 관련있는 LOC387715 유전자의 변이부위에, 인간 AMD 발병과 관련있는 SYNPR 유전자의 변이부위에, 또는 인간 AMD 발병과 관련있는 PDGFC 유전자의 변이부위에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드는 상기 대상 변이부위를 포함하지 않은 해당 LOC387715 유전자, SYNPR 유전자, PDGFC 유전자에는 혼성화하지 않는다.
핵산 혼성화는 당해 분야의 당업자에 의해 용이하게 평가될 수 있는, 염 농도, 온도, 유기 용매, 기제 성분, 상보 가닥의 길이, 및 혼성화 핵산 간에 미스매치된 뉴클레오티드 염기의 갯수와 같은 조건에 의해 영향받는다. 엄격한 온도 조건은 일반적으로 3O℃ 초과 온도를 포함하며, 또는 37℃ 또는 45℃를 초과할 수 있다. 엄격 조건은 온도에 따라 더욱 엄격해진다. 예를 들어, 45℃ 초과 온도는 높은 엄격 조건이다. 엄격한 염 조건은 통상 1000 mM 미만이며, 또는 500 mM 또는 200 mM 미만일 수 있다. 예를 들어, 당업자는 45℃, 6.Ox 염화나트륨/구연산나트륨(SSC)에서 혼성화한 다음 약 50℃에서 2.Ox SSC에서 세척할 수 있다. 예를 들어, 세척 단계에서 염 농도는 50 ℃에서 약 2.Ox SSC의 낮은 엄격 조건 내지 50 ℃에서 약 0.2x SSC의 높은 엄격 조건으로 선택될 수 있다. 또한, 세척 단계에서 온도는 실온, 약 22 ℃의 낮은 엄격 조건에서 약 65 ℃의 높은 엄격 조건으로 증가될 수 있다. 온도와 염 모두 변경될 수 있으며, 또는 온도 또는 염 농도를 일정하게 유지하면서 다른 변수를 바꿀 수 있다. 엄격 조건에서 인간 AMD 발병과 관련있는 변이 LOC387715 유전자, 인간 AMD 발병과 관련있는 변이 SYNPR 유전자, 또는 인간 AMD 발병과 관련있는 변이 PDGFC 유전자에, 또는 변이 LOC387715 유전자, 변이 SYNPR 유전자나 변이 PDGFC 유전자의 영역에 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드가 본 발명의 방법에 특히 유용하다. 그러나, DNA 혼성화를 촉진시키기 위해, 적절한 엄격 조건을 변화시킬 수 있는 것으로 이해된다. 특정 예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 높은 엄격 조건에서, 인간 AMD 발병과 관련있는 변이 LOC387715 유전자, 인간 AMD 발병과 관련있는 변이 SYNPR 유전자, 또는 인간 AMD 발병과 관련있는 변이 PDGFC 유전자에, 또는 변이 LOC387715 유전자, 변이 SYNPR 유전자나 변이 PDGFC 유전자의 일부 영역에 혼성화한다. 엄격 조건에서, LOC387715 변이 유전자, SYNPR 변이 유전자 또는 PDGFC 변이 유전자에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드는, 대상 변이부위를 포함하지 않는 해당 LOC387715, SYNPR 또는 PDGFC 유전자에는 혼성화하지 않는다. 일 예에서, 본 발명은 실온에서 6.Ox SSC의 저엄격 조건에서 혼성화한 다음 실온의 2.Ox SSC로 세척하는 핵산을 제공한다. 그러나, 이러한 파라미터의 조합이 임의의 단일 파라미터의 측정보다 훨씬 중요하다. 예컨대, Wetmur and Davidson, 1968를 참조한다. 또한, 프로브 서열은 삼중 이상의 DNA 복합체를 생성하는 특정 조건하에서, 이중 DNA에 특이적으로 혼성화할 수 있다. 이러한 프로브 및 적절한 혼성화 조건은 당해 분야에 공지되어 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머는, 효소(예컨대, ELISA, 및 효소-기재 조직화학적 분석법), 형광, 방사성, 화학적, 및 발광 시스템을 비제한적으로 포함하는 다양한 검출 시스템으로 검출가능하도록 표지될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머는, 표지(예컨대, 형광 표지) 부근에 위치할 때 표지로부터의 신호가 거의 없거나 전혀 없도록 하는 억제 모이어티(quencher moiety)를 추가로 포함할 수 있다. 표지의 검출은 직, 간접적 수단을 통해 수행될 수 있다(예컨대, 바이오틴/아비딘 또는 바이오틴/스트렙트아비딘 연결). 본 발명은 임의의 특정 검출 시스템 또는 표지로 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
다른 예에서, 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드는 엄격 조건에서, 인간 AMD 발병과 관련있는 LOC387715 유전자, SYNPR 유전자 또는 PDEFC 유전자의 변이부위의 인접, 상류 또는 하류부위에 혼성화하는 프라이머이다. 분리된 폴리뉴클레오티드는 엄격 조건에서, 인간 AMD 발병과 관련있는 변이 LOC387715 유전자, 변이 SYNPR 유전자 또는 변이 PDEFC 유전자 전체 또는 부분을 포함하는 핵산 분자에 혼성화할 수 있다. 또한, 분리된 폴리뉴클레오티드 프라이머는 엄격 조건에서, 인간 AMD 발병과 관련있는 변이 LOC387715 유전자, 변이 SYNPR 유전자 또는 변이 PDEFC 유전자의 적어도 50개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자에 혼성화할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 프라이머는 코딩된 단백질의 아미노산 69개를 코딩하는 LOC387715 유전자 영역의 인접, 상류 또는 하류부위에 혼성화할 수 있다.
본 명세서에 사용된, 용어 "프라이머"는, 핵산 가닥에 상보적인 프라이머 신장 생성물의 합성이 이루어지는 조건하에(예를 들어, 뉴클레오티드, DNA 중합효소와 같은 유도제, 및 적절한 온도, pH, 및 전해질 농도에서), 핵산 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 또한, 2개의 비연결된 핵산의 접합(ligation)이 일어나는 조건에 놓일 때(예를 들어, 인접 핵산, DNA 라이게이즈와 같은 접합 유도제, 및 적절한 온도, pH, 및 전해질 농도에서), 프라이머는 인접 핵산에 접합될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 프라이머는 정제된 제한효소 절단산물 형태로 자연적으로 발생할 수 있거나 합성에 의해 생산될 수 있다. 최대 증폭 효율을 위해, 프라이머는 바람직하게는 단일 가닥이지만, 대안적으로 이중 가닥일 수 있다. 프라이머가 이중 가닥일 경우, 프라이머는 사용 전에 우선 그 가닥이 분리되도록 처리된다. 바람직하게는, 프라이머는 올리고데옥시리보뉴클레오티드이다. 프라이머의 실제 길이는 온도, 프라이머의 소스 및 사용 방법을 포함하는 다수 인자에 따라 달라질 수 있다. 특정 예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 프라이머는 적어도 10개의 뉴클레오티드 길이이고, 인간 AMD 발병과 관련있는 LOC387715, SYNPR 또는 PDGFC 유전자 변이가 있는 쪽이나 다른 한 쪽에 혼성화한다. 뉴클레오티드가 일정한 특이성으로 표적 변이 LOC387715, SYNPR 또는 PDGFC 유전자에 혼성화할 수 있는 한, 상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 추가 또는 결손과 같은 변형을 포함할 수 있다.
일 예에서, 본 발명은 AMD 발병과 관련있는 LOC387715 유전자에서의 변이, AMD 발병과 관련있는 SYNPR 유전자에서의 변이 또는 AMD 발병과 관련있는 PDGFC 유전자에서의 변이를 특이적으로 검출하는 한 쌍의 프라이머를 제공한다. 이 경우, 제1 프라이머는 변이부위의 상류부위에 혼성화하고, 제2 프라이머는 변이부위의 하류부위에 혼성화한다. 예컨대, 프라이머 중 하나는 AMD 발병과 LOC387715 유전자의 변이부위, AMD 발병과 관련있는 SYNPR 유전자의 변이부위 또는 AMD 발병과 관련있는 PDGFC 유전자의 변이부위를 포함하는 DNA 영역의 한 가닥에 혼성화하고, 다른 프라이머는 AMD 발병과 관련있는 LOC387715 유전자의 변이부위, AMD 발병과 관련있는 SYNPR 유전자의 변이부위 또는 AMD 발병과 관련있는 PDGFC 유전자의 변이부위를 포함하는 DNA 영역의 상보적인 가닥에 혼성화한다. 본 명세서에 사용된, 용어 "DNA 영역(region)"은 아염색체(sub-chromosomal) 길이의 DNA를 의미한다.
다른 예에서, 본 발명은 AMD 발병과 관련있는 LOC387715 유전자의 변이부위, AMD 발병과 관련있는 SYNPR 유전자의 변이부위 또는 AMD 발병과 관련있는 PDGFC 유전자의 변이부위와 중복되는 표적 DNA 위치에 혼성화하는 대립유전자-특이적 프라이머를 제공한다. 본 발명의 대립유전자-특이적 프라이머는 프라이머가 완벽한 상보성을 나타내는 대립유전자형의 증폭을 촉매한다. 상기 프라이머는 예를 들어, 원위에서 혼성화하는 제2 프라이머와 함께 사용할 수 있다. 따라서, 2개의 프라이머로부터 증폭이 진행되어, AMD 발병과 관련있는 LOC387715 변이 유전자, AMD 발병과 관련있는 SYNPR 변이 유전자 또는 AMD 발병과 관련있는 PDGFC 변이 유전자의 존재를 나타내는 생성물을 검출가능하다.
검출 방법
특정 예에서, 본 발명은 노화성 황반 변성의 발병과 관련있는 LOC387715, SYNPR 또는 PDGFC 유전자 변이를 검출하는데 유용한 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 폴리뉴클레오티드는, 엄격한 혼성화 조건에서, 노화성 황반변성의 발병과 관련있는 LOC387715 유전자의 변이부위, SYNPR 유전자의 변이부위 또는 PDGFC 유전자의 변이부위를 포함하는 DNA 영역에 혼성화할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 AMD 발병과 관련있는 LOC387715, SYNPR 또는 PDGFC 유전자의 변이를 검출할 수 있는 모든 분석법에 사용될 수 있다. 이러한 분석법은 예를 들어, DNA 서열분석, 혼성화, 접합 또는 프라이머 신장법을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에서 상기 방법을 임의로 조합하여 사용할 수 있다.
일 예에서, AMD 발병과 관련있는 LOC387715, SYNPR 또는 PDGFC 유전자의 변이 또는 이들 조합의 존재는 DNA 서열분석에 의해 검출 및/또는 측정된다. 다이데옥시 체인 종결 기술 및 겔-전기영동과 같은 표준 방법, 또는 파이로서열분석(pyrosequencing)(Biotage AB, Uppsala, Sweden)과 같은 기타 방법에 의해, DNA 서열 분석을 실시할 수 있다. 예를 들어, 다이데옥시 체인 종결 기술에 의한 DNA 서열분석은 비표지된 프라이머 및 표지된 (예컨대, 형광 또는 방사성) 종결자를 사용하여 수행할 수 있다. 또한, 표지된 프라이머 및 비표지된 종결자를 사용하여 서열분석을 수행할 수 있다. AMD 발병과 관련있는 LOC387715 유전자의 변이, AMD 발병과 관련있는 SYNPR 유전자의 변이 또는 AMD 발병과 관련있는 PDGFC 유전자의 변이나, 또는 이러한 변이 조합이 존재하는 지를 확인하기 위해서, AMD 발병과 관련있는 변이를 포함하지 않는 DNA 또는 야생형 DNA의 핵산 서열과 비교할 수 있다.
다른 예에서, AMD 발병과 관련있는 LOC387715 유전자의 변이, AMD 발병과 관련있는 SYNPR 유전자의 변이 또는 AMD 발병과 관련있는 PDGFC 유전자의 변이, 또는 이들 조합의 존재는, 혼성화에 의해 검출 및/또는 결정한다. 일 예에서, 폴리뉴클레오티드 프로브는, AMD 발병과 관련있는 LOC387715 유전자, SYNPR 유전자 또는 PDGFC 유전자의 변이부위 및 측면 뉴클레오티드에 혼성화하지만, AMD와 관련있는 변이를 포함하지 않는 LCO389915, SYNPR 또는 PDGFC 유전자에는 혼성화하지 않는다. 혼성화 검출을 용이하게 하기 위하여, 폴리뉴클레오티드 프로브는 형광, 방사성, 또는 화학적으로 표지된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 노던 블롯팅, 서던 블롯팅, 형광 인시츄 혼성화법(FISH), 또는 DNA 어레이나 마이크로어레이와 같은 고형판 위에 고정된 폴리뉴클레오티드에 혼성화시키는 방법과 같은, 당해 분야에서 공지된 표준 방법을 사용하여, 혼성화를 수행 및 검출할 수 있다. 본 명세서에 사용된, 용어 "DNA 어레이(array)," 및 "마이크로어레이(microarray)"는 혼성화 가능한 어레이 요소가 정렬되어 있는 장치를 의미한다. 어레이 요소가 정렬되어, 바람직하게는 적어도 하나 이상의 상이한 어레이 요소가 기판 표면 위에 고정된다. 각 어레이 요소로부터 유래되는 혼성화 신호는 개별적으로 구별가능하다.
다른 예에서, AMD 발병과 관련있는 LOC387715 유전자의 변이 존재는 혼성화에 의해 검출 및/또는 결정된다.
다른 예에서, AMD 발병과 관련있는 SYNPR 유전자의 변이 존재는 혼성화에 의해 검출 및/또는 결정된다.
다른 예에서, AMD 발병과 관련있는 PDGFC 유전자의 변이 존재는 혼성화에 의해 검출 및/또는 결정된다.
특정 예에서, 폴리뉴클레오티드 프로브는 FISH에 의한 게놈 DNA 혼성화에 사용된다. FISH는 예를 들어, 유전자 DNA의 결손을 검출하기 위해, 중기 세포에서 사용될 수 있다. 게놈 DNA를 변성시켜, DNA 이중 나선 구조 내 상보적 가닥을 분리시킨다. 다음으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 프로브를 변성 유전체 DNA에 첨가한다. AMD 발병과 관련있는 LOC387715 유전자의 변이, AMD 발병과 관련있는 SYNPR 유전자의 변이 또는 AMD 발병과 관련있는 PDGFC 유전자의 변이가 존재한다면, 상기 프로브는 게놈 DNA에 혼성화할 것이다. 이 후, 프로브 신호(예컨대, 형광)는 신호의 존재 또는 부재에 대해 형광 현미경을 통해 검출할 수 있다. 즉, 신호의 부재는 AMD 발병과 관련있는 각 유전자의 변이가 없음을 의미한다. 다른 특이적 예에서, 표지된 폴리뉴클레오티드 프로브를 DNA 어레이 상에 고정된 폴리뉴클레오티드에 적용한다. 혼성화는 예를 들어, 세척 후 DNA 어레이 상에 남아 있는 표지된 프로브의 강도를 측정하여 검출할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한 Taqman 분석(Applied Biosystems, Foster City, CA)과 같은 시판되는 분석방법으로 이용할 수 있다.
다른 예에서, AMD 발병과 관련있는 LOC387715 유전자의 변이, AMD 발병과 관련있는 SYNPR 유전자의 변이 또는 AMD 발병과 관련있는 PDGFC 유전자의 변이 존재는 DNA 중합효소를 이용한 프라이머 신장에 의해 검출 및/또는 결정된다. 일 예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 프라이머는 변이부위에 바로 인접하여 혼성화한다. 변이부위를 검출하기 위하여, 표지된 다이데옥시뉴클레오티드 종결자를 이용한 단일 염기 서열분석 반응을 사용할 수 있다. 변이가 있으면 표지된 종결자가 혼입되지만, 변이가 없으면 종결자는 혼입되지 않는다. 다른 예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 프라이머는 AMD 발병과 관련있는 LOC387715 유전자의 변이, AMD 발병과 관련있는 SYNPR 유전자의 변이 또는 AMD 발병과 관련있는 PDGFC 유전자의 변이부위에 혼성화한다. 프라이머, 또는 그의 일부는 AMD 발병과 관련있는 변이를 포함하지 않는 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 유전자와는 혼성화하지 않는다. 변이가 있으면 프라이머 신장이 이루어지지만, 변이가 없으면 프라이머 신장은 이루어지지 않은다. 프라이머 및/또는 뉴클레오티드는 형광, 방사성, 또는 화학적 프로브를 추가로 포함할 수 있다. 겔 전기영동법, 질량 분광법, 또는 형광, 방사성, 또는 화학적 표지를 검출하는 기타 방법 등의 신장 생성물의 강도 측정에 의해, 프라이머 신장으로 표지된 프라이머를 검출할 수 있다.
다른 예에서, AMD 발병과 관련있는 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 유전자의 변이 존재는 접합(ligation)에 의해 검출 및/또는 결정된다. 일 예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 프라이머는 AMD 발병과 관련있는 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 유전자의 변이부위에 혼성화한다. 프라이머, 또는 그 일부분은 변이를 포함하지 않는 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 유전자에는 혼성화하지 않을 것이다. 제1 프라이머의 바로 인접한 LOC387715, SYNPR, 또는 PDGFC 유전자 영역에 혼성화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 또한 제공한다. 1개 또는 2개의 폴리뉴클레오티드 프라이머는 형광, 방사성, 또는 화학적으로 표지할 수 있다. AMD 발병과 관련있는 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 유전자의 변이가 존재한다면, DNA 라이게이즈 존재하에서 2개의 폴리뉴클레오티드 프라이머의 접합이 이루어질 것이다. 접합은 겔 전기영동법, 질량 분광분석법, 또는 형광, 방사성, 또는 화학적 표지 강도의 측정에 의해 검출할 수 있다.
다른 예에서, AMD 발병과 관련있는 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 유전자의 변이 존재는 단일-염기 연장(SBE)에 의해, 검출 및/또는 결정된다. 예를 들어, 첨가된 염기의 표지물 및 프라이머의 표지물 간의 형광 공명 에너지 전이(FRET)와 커플링된 형광-표지된 프라이머를 사용할 수 있다. 통상, Chen et al., (PNAS 94:10756-61(1997), 원용에 의해 본 명세서에 포함됨)에 기재된 방법에서는, 5' 말단에 5-카복시플루오레세인(FAM)이 표지된 유전자 좌(locus)-특이적인 폴리뉴클레오티드 프라이머를 사용하였다. 상기 표지된 프라이머는, 3' 말단에 원하는 다형 부위가 바로 인접하도록 설계된다. 상기 표지된 프라이머는 유전자 좌에 혼성화하여, 염료-종결자 서열분석 방법에서 데옥시리보뉴클레오티드가 존재하지 않는 것을 제외하고는 염료-종결자 서열분석 방법으로 형광 표지된 다이데옥시리보뉴클레오티드(ddNTP)를 이용하여 표지된 프라이머의 단일-염기 신장을 수행한다. 표지된 프라이머의 파장에서 여기에 따른 첨가된 ddNTP의 형광 증가를 통하여, 첨가된 뉴클레오티드의 실체를 유추한다.
AMD 발병과 관련있는 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 유전자의 변이를 검출하는 방법은, 변이부위를 포함하는 DNA 영역의 증폭을 포함할 수 있다. 임의의 증폭 방법이 사용될 수 있다. 일 특정 예에서, 변이부위를 포함하는 DNA 영역은 중합효소 연쇄반응(PCR)으로 증폭할 수 있다. PCR은 Mullis(예컨대, 미국 특허 4,683,195, 4,683,202, 및 4,965,188 참조, 원용에 의해 본 명세서에 포함됨)에 최초로 개시된 방법인데, 클로닝 또는 정제 없이 게놈 DNA 혼합물 중에서 DNA 영역의 농도를 증가시키는 방법이다. 또한, RT-PCR, 정량 PCR, 실시간 PCR, 신속 증폭 다형성 DNA(Rapid Amplified Polymorphic DNA) 분석, cDNA 말단의 신속 증폭(RACE), 또는 롤링 서클 증폭(rolling circle amplification)을 포함한 다른 PCR 방법도 핵산 증폭에 사용할수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 프라이머는 DNA가 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 유전자를 포함하는 DNA 혼합물(또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 프라이머로 증폭될 수 있는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열)과 혼합한다. 상기 혼합물은 또한 열 순환 반응에 필요한 필수 증폭 시약(예컨대, 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 완충액 등)을 포함한다. 표준 PCR 방법에 따라, 상기 혼합물에 대해 일련의 변성, 프라이머 어닐링, 및 중합효소 연장 단계를 수행하여, LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 유전자의 변이부위를 포함하는 DNA 영역을 증폭시킨다. 증폭된 DNA 영역의 길이는 각 프라이머의 상대적인 위치에 의해 결정되므로, 상기 길이는 조절가능한 파라미터이다. 예를 들어, 변이부위에 인접한 프라이머 말단이 1 내지 10,000 염기쌍(예컨대, 10 염기쌍(bp) 50 bp, 200 bp, 500 bp, 1,000 bp, 2,500 bp, 5,000 bp, 또는 10,000 bp) 떨어져 있는 상태로, 프라이머의 혼성화가 일어날 수 있다.
당해 분야에서 공지된 표준 장치를 DNA 증폭 및 증폭된 DNA의 검출에 사용한다. 예를 들어, 핵산 증폭을 수행하기 위한 다양한 기기들이 개발되었으며, 특히 PCR, 예컨대 Johnson et al, 미국 특허 5,038,852(컴퓨터-조절 열 순환기); Wittwer et al, Nucleic Acids Research, 17: 4353-4357(1989)(모세관 PCR); Hallsby, 미국 특허 5,187,084(대기-기초 온도 조절); Garner et al, Biotechniques, 14: 112-115(1993)(864-웰 플레이트에서 고속 PCR); Wilding et al, 국제 출원 PCT/US93/04039(PCR 마이크로-머신 구조); Schnipelsky et al, 유럽 특허 출원 90301061.9(공개 번호 0381501 A2)(일회용, 단일 사용 PCR 장치) 등이 개시되어 있다. 특정 예에서, 본 명세서에 기재된 발명은 실시간 PCR 또는 Taqman 분석과 같은 당해 분야에서 공지된 다른 방법을 이용한다.
특정 예에서, Orita et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 86, 2766- 2770(1989)에 기재된 바와 같이, 단일 가닥 PCR 산물의 전기영동 이동 변화에 의해 염기의 차이를 확인하는 단일-가닥 배열(conformation) 다형성 분석에 의해, 인간 AMD 발병과 관련있는 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 변이 유전자를 검출할 수 있다. 전술한 바와 같이, 증폭된 PCR 산물을 제조하고, 가열하거나 변성시켜 단일 가닥의 증폭 산물을 만들 수 있다. 단일-가닥 핵산은 재접힘되거나 서열에 부분적으로 의존하는 이차 구조를 형성할 수 있다. 단일-가닥 증폭 산물의 전기영동 이동 차이는 표적 서열의 대립유전자 간 염기-서열과 관계가 있을 수 있다.
일 예에서, 증폭된 DNA는 DNA 서열분석과 같은 본 명세서에 기재된 검출 방법들 중 한가지 방법과 조합하여 분석한다. 대안적으로, 증폭된 DNA는 표지된 프로브의 혼성화, DNA 어레이 또는 마이크로어레이에 혼성화, 아비딘화된 프라이머의 병합 및 이후의 아미딘-효소 접합체 검출, 또는 dCTP 또는 dATP와 같은 32P-표지된 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트를 증폭된 절편에 혼입함으로써, 분석할 수 있다. 특정 예에서, 전기영동 또는 크로마토그래피에 의해 증폭된 DNA 길이를 측정함으로써, 증폭된 DNA를 분석한다. 예를 들어, 증폭된 DNA은 겔 전기영동으로 분석한다. 겔 전기영동 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Current Protocol in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992을 참조하다. 증폭된 DNA는 예를 들어, 형광 또는 방사성 수단, 또는 DNA에 삽입되는 기타 염료 또는 마커에 의해 가시화할 수 있다. 또한, DNA는 겔 전기영동 후, 니트로셀룰로스 막과 같은 고체 기판에 이동시켜 서던 블롯팅을 수행할 수 있다. 일 예로, DNA를 에티듐 브로마이드로 염색한 후, 자외선을 조사하여 가시화한다.
LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 폴리펩티드를 코딩하는 치료 핵산
특정 예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 기능적 변이를 포함하는, LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 폴리펩티드를 코딩하는, 분리된 및/또는 재조합 핵산을 제공한다. 대상 핵산은 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있다. 이러한 핵산은 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 이들 핵산은, 예컨대 LOC387715, SYNPR 또는 피비 폴리펩티드 제조 방법으로 또는 직접적인 치료제(예, 유전자요법)로 사용할 수 있다.
LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 폴리펩티드를 코딩하는 대상 핵산은(예, 데이타 베이스를 통해) 공개적으로 이용가능한 서열 및 본원에 원용된 서열의 변이체인 핵산을 포함하는 것으로 더욱 이해된다. 변이 뉴클레오티드 서열은 대립유전자의 변이와 같은, 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 부가 또는 결손에 의해 차이가 있는 서열을 포함하며, 그 결과, 공개적으로 이용가능한 코딩 서열 또는 본원에 원용된 코딩 서열의 뉴클레오티드 서열과 상이한 코딩 서열을 포함할 것이다.
특정 예에서, 본 발명은 공개적으로 이용가능한 핵산 서열 또는 본원에 원용된 핵산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한, 분리된 또는 재조합 핵산 서열을 제공한다. 다른 예로, 본 발명의 핵산 서열은 분리, 재조합 및/또는 이종의 뉴클레오티드 서열과 융합될 수 있으며, 또는 DNA 라이브러리 형태일 수 있다.
다른 예에서, 본 발명의 핵산은 또한 엄격 조건하에서 공개적으로 이용가능한 뉴클레오티드 서열 또는 본원에 원용된 핵산 서열, 또는 그의 단편에 혼성화하는 핵산을 포함한다. 전술한 바와 같이, DNA 혼성화를 촉매하는 적절한 엄격 조건을 변경시킬 수 있음을, 당업자들에게는 자명할 것이다. 예를 들어, 당업자는 약 45℃에서 6.Ox 염화나트륨/구연산나트륨(SSC)에서 혼성화한 다음 50℃에서 2.Ox SSC로 세척하는 과정을 수행할 수 있다. 예를 들어, 세척 단계에서 염 농도는 50 ℃, 약 2.Ox SSC의 낮은 엄격 조건에서 50 ℃, 약 0.2x SSC의 높은 엄격 조건으로부터 선택할 수 있다. 또한, 세척 단계의 온도는 실온(약 22 ℃)의 낮은 엄격 조건에서 약 65 ℃의 높은 엄격 조건으로 높아질 수 있다. 온도와 염 모두 변경할 수 있으며, 또는 다른 변수를 변화시키면서 온도 또는 염 농도는 일정하게 유지시킬 수 있다. 일 예에서, 본 발명은 실온에서 6 x SSC의 낮은 엄격 조건에서 혼성화하며 실온에서 2 x SSC로 세척되는 핵산을 제공한다.
유전자 코드의 축중성(degeneracy)으로 인해 본원에 개시된 핵산과 상이한 분리된 핵산도 본 발명의 범위에 포함된다. 예를 들어, 다수의 아미노산은 하나 이상의 삼중자(triplet)에 의해 지정된다. 동일한 아미노산 또는 동의체(synonym)(예를 들어, CAU 및 CAC는 히스티딘을 동일하게 코팅함)를 명시하는 코돈은 단백질의 아미노산 서열에 영향을 미치지 않는 "침묵(silent)" 변이를 만들 수 있다. 그러나, 대상 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 DNA 서열 다형성이 포유류 세포에 존재할 것으로 기대된다. 자연적인 대립유전자의 변이로 인해, 특정 단백질을 코딩하는 핵산의 하나 이상의 뉴클레오티드(최대 약 3-5% 뉴클레오티드)에서의 변이는 해당 종의 개체들 간에 존재할 수 있는 것으로, 당업자는 이해할 것이다. 임의의 모든 상기 뉴클레오티드 변이 및 그로부터 만들어지는 아미노산 다형성은 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 핵산 및 폴리펩티드는 표준적인 재조합 방법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 핵산은 발현 구조체에서 하나 이상의 조절성 뉴클레오티드 서열에 작동가능하도록 연결될 수 있다. 조절성 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 발현에 이용되는 숙주 세포에 적합할 것이다. 다양한 숙주 세포에 대하여, 다수 형태의 적절한 발현 벡터 및 조절 서열이 당해 분야에 공지되어 있다. 통상적으로, 하나 이상의 조절성 뉴클레오티드 서열은 프로모터 서열, 리더 또는 신호 서열, 리보좀 결합 부위, 전사 개시 및 종결 서열, 번역 개시 및 종결 서열, 및 인핸서 또는 활성자 서열을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. 당해 분야에 공지된 상시발현성 또는 유도성 프로모터를 본 발명에서 고려할 수 있다. 프로모터는 자연적으로 만들어진 프로모터, 또는 하나 이상의 프로모터 성분들이 조합된 하이브리드 프로모터이다. 발현 구조체는 플라스미드와 같이 에피좀으로 세포에 존재하거나, 염색체에 삽입될 수 있다. 발현 벡터는 또한 선별 마커 유전자를 포함하여, 형질전환된 숙주 세포를 선별할 수 있다. 선별 마커 유전자는 당해 분야에 공지되어 있으며, 사용된 숙주 세포에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 특정 예에서, 상기 핵산은 LOC387715 폴리펩티드, SYNPR 폴리펩티드 또는 PDGFC 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 하나 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 발현 벡터로 제공된다. 조절 서열은 당해 분야에서 공지된 것으로, LOC387715 폴리펩티드, SYNPR 폴리펩티드 또는 PDGFC 폴리펩티드의 발현을 인가하도록 선택된다. 용어 조절 서열은 프로모터, 인핸서, 종결 서열, 바람직한 리보좀 결합 부위 서열, 바람직한 mRNA 리더 서열, 바람직한 단백질 프로세싱 서열, 단백질 분비를 위한 바람직한 신호 서열, 및 기타 발현 조절 요소를 포함한다. 조절 서열의 예는 Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA(1990)에 기재되어 있다. 예를 들어, 작동가능하게 연결되었을 때 DNA 서열의 발현을 조절하는 매우 다양한 발현 조절 서열을 벡터에 사용하여, LOC387715, SYNPR 또는 PDGFC를 코딩하는 DNA 서열을 발현시킬 수 있다. 그렇게 사용가능한 발현 조절 서열은 예를 들어, 초기 및 후기 SV40 프로모터, tet 프로모터, 아데노바이러스 또는 사이토메가로바이러스 즉시 초기 프로모터, RSV 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T7 RNA 중합효소에 의해 발현이 인가되는 T7 프로모터, 람다파지의 주 작동자 및 프로모터 영역, fd 외피 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 해당효소의 프로모터, 산 인산화효소의 프로모터, 예컨대, Pho5, 효모 α-교배 인자의 프로모터, 바큘로바이러스(baculovirus) 시스템의 다면체(polyhedron) 프로모터, 및 원핵 또는 진핵 세포 또는 그 바이러스의 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려진 다른 서열, 및 그의 다양한 조합을 포함한다. 발현 벡터의 모양은 형질전환될 숙주 세포의 선택 및/또는 발현하고자 원하는 단백질 종류 등의 인자에 따라 달라질 수 있는 것으로 이해된다. 더욱이, 벡터의 카피 수, 카피 수를 조절하는 능력, 및 항생제 마커와 같이 벡터에 의해 코딩되는 임의의 다른 단백질의 발현도 고려하여야 한다.
본 발명의 재조합 핵산은 클로닝된 유전자, 또는 그의 일부분을 원핵 세포나 진핵 세포(효모, 조류, 곤충 또는 포유류), 또는 이들 세포 모두에서 발현시키기에 적절한 벡터에 연결함으로써 생산할 수 있다. 재조합 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC를 생산하기 위한 발현 비히클은 플라스미드 및 다른 벡터를 포함한다. 예를 들어, E. coli와 같은 원핵세포 발현에 적절한 벡터로는 pBR322-유래 플라스미드, pEMBL-유래 플라스미드, pEX-유래 플라스미드, pBTac-유래 플라스미드 및 pUC-유래 플라스미드 등의 플라스미드 종류를 포함한다.
일부 포유류 발현 벡터는 박테리아 벡터의 증식을 용이하게 하기 위한 원핵 서열, 및 진핵 세포에서 발현되는 하나 이상의 진핵 전사 단위를 모두 포함한다. pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo 및 pHyg 유래 벡터가 진핵 세포의 형질감염(transfection)에 적합한 포유류 발현 벡터의 예이다. 원핵 및 진핵 세포에서 복제 및 약물 저항성 선택을 용이하게 하기 위해, 상기 벡터들 중 일부는 pBR322와 같이, 박테리아 플라스미드 서열로 변형된다. 대안적으로, 진핵 세포에서 단백질의 일시적 발현을 위해, 소 유두종 바이러스(BPV-I), 또는 엡스테인-바(Epstein-Barr) 바이러스(pHEBo, pREP-유래 및 p205)와 같은 바이러스 유도체를 사용할 수 있다. 기타 바이러스(레트로바이러스 포함) 발현 시스템은 하기 유전자 치료 전달 시스템에 대한 내용에서 찾아볼 수 있다. 플라스미드 제조 및 숙주 유기체의 형질전환에 사용되는 다양한 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 원핵 및 진핵 세포 모두에 적합한 다른 발현 시스템 뿐만 아니라, 일반적인 재조합 공정은 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(2001)을 참조한다. 일부 예로, 바큘로바이러스 발현 시스템을 사용하여 재조합 폴리펩티드를 발현시키는 것이 바람직하다. 이러한 바큘로바이러스 발현 시스템의 예는 pVL-유래 벡터(예. pVL1392, pVL1393 및 pVL941), pAcUW-유래 벡터(예, pAcUWl), 및 pBlueBac-유래 벡터(예, β-gal 함유성 pBlueBac III)를 포함한다.
일 예에서, Pcmv-Script 벡터(Stratagene, La Jolla, Calif.), pcDNA4 벡터(Invitrogen, Carlsbad, Calif.) 및 pCI-neo 벡터(Promega, Madison, Wise)와 같은 벡터가 CHO 세포에서 폴리펩티드(예, LOC387715 폴리펩티드, SYNPR 폴리펩티드 또는 PDGFC 폴리펩티드)를 생산하기 위해 고안될 수 있다. 다른 예로, 벡터는 원핵 숙주 세포(예컨대, E. coli 및 B. subtilis) 및 예를 들어, 효모 세포, 곤충 세포, 골수종 세포, 3T3 섬유모세포, 원숭이 신장 또는 COS 세포, 밍크-폐 상피 세포, 인간 포피(foreskin) 섬유모세포, 인간 교모세포종 세포, 및 기형암 세포와 같은 진핵 숙주 세포에서 폴리펩티드(예, LOC387715 폴리펩티드, SYNPR 폴리펩티드 또는 PDGFC 폴리펩티드)를 생산하기 위하여 고안된다. 대안적으로, 유전자는 토끼 세망세포 융해물 시스템과 같은 무세포성 시스템에서 발현시킬 수 있다. 대상 유전자 구조체를 사용하여, 배양물 중에 증식된 세포에서 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 폴리펩티드를 발현, 예컨대 융합 단백질 또는 변이 단백질 등의 정제용 단백질을 생산할 수 있다.
본 발명은 또한 하나 이상의 상기 LOC387715 폴리펩티드, SYNPR 폴리펩티드 또는 PDGFC 폴리펩티드의 코딩 서열을 포함하는, 재조합 유전자로 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다. 상기 숙주 세포는 임의의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 LOC387715 폴리펩티드, SYNPR 폴리펩티드 또는 PDGFC 폴리펩티드는 E. coli와 같은 박테리아 세포; 곤충 세포(예컨대, 바큘로바이러스 발현 시스템을 이용함), 효모, 또는 포유류 세포에서 발현될 수 있다. 기타 적절한 숙주 세포가 당해 분야에 공지되어 있다.
따라서, 본 발명은 또한 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 폴리펩티드의 제조 방법에 관한 것이다. 예를 들어, LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 폴리펩티드를 코딩하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 적절한 조건에서 배양하여, LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다. LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 폴리펩티드는 분비되어, LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 폴리펩티드가 함유된 포함하는 세포 및 배지의 혼합물로부터 분리할 수 있다. 대안적으로, 폴리펩티드는 세포질에, 또는 막 분획물, 수확한 세포, 세포 융해물 및 분리된 단백질 중에 존재할 수 있다. 세포 배양물은 숙주 세포, 배지 및 기타 부산물을 포함한다. 세포 배양에 적절한 배지는 당해 분야에 공지되어 있다. 이온-교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 초여과, 전기영동 및 폴리펩티드의 특정 에피토프에 대한 특이적인 항체를 이용한 면역친화성 정제를 포함하는 당해 분야에 공지된 단백질 정제 기술을 사용하여, 폴리펩티드를 세포 배양 배지, 숙주 세포, 또는 그 둘로부터 분리할 수 있다. 특정 예에서, LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 폴리펩티드는 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 폴리펩티드 정제를 용이하게 하는 도메인을 포함하는 융합 단백질이다.
다른 예에서, 재조합 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 폴리펩티드의 목적 부분의 N-말단에 폴리-(His)/엔테로키나제 절단부위(cleavage site) 서열과 같은 정제 리더 서열을 코딩하는 융합 유전자는, Ni2 + 금속 수지를 사용한 친화성 크로마토그래피에 의해 발현된 융합 단백질을 정제할 수 있다. 그 후, 정제 리더 서열은 엔테로키나제 처리로 제거하여, 정제된 폴리펩티드를 제공한다(예컨대, Hochuli et al., (1987) J. Chromatography 411:177; 및 Janknecht et al., PNAS USA 88:8972 참조).
융합 유전자 제조 기술은 공지되어 있다. 필수적으로, 상이한 폴리펩티드 서열을 코딩하기 위한 다양한 DNA 단편의 접합은 기존의 방법에 따라, 연결을 위한 블런트-말단(blunt-ended) 또는 스테거-말단(stagger-ended), 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 절단, 코헤시브(cohesive) 말단의 적절한 채움, 바람직하지 못한 연결을 방지하기 위한 알칼리성 포스파타제 처리 및 효소에 의한 접합을 이용하여 수행한다. 다른 예에서, 융합 유전자는 자동 DNA 합성기 등의 공지 기술에 의해 합성할 수 있다. 대안적으로, 이후에 어닐링되어 키메라 유전자 서열을 만들 수 있는 2가지 연속 유전자 단편간에 상보적인 돌출부(overhang)를 만드는 앵커(anchor) 프라이머를 이용하여, 유전자 단편의 PCR 증폭을 수행할 수 있다(예를 들어, Current Protocol in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992 참조).
안티센스 폴리뉴클레오티드
특정 예에서, 본 발명은 변이 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 유전자의 발현을 억제하는 안티센스 기전을 통해 작용하는, 안티센스 서열 함유 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 안티센스 기술은 유전자 발현 조절을 위해 광범위하게 사용되고 있다(Buskirk et al., Chem Biol 11, 1157-63(2004); and Weiss et al., Cell Mol Life Sci 55, 334-58(1999)). 본 명세서에서, "안티센스" 기술은, 예컨대, 입체 방해(steric hinderance)에 의한 바와 같은 전사 및/또는 번역 억제, 스플라이싱 변경, 또는 전사체에 절단 도입 또는 그외 효소적 불활성화 도입에 의해, 상기 표적 단백질의 발현을 억제하기 위해 하나 이상의 표적 단백질을 코딩하는 대상 표적 핵산(mRNA 및/또는 게놈 DNA)과 세포 조건하에서 특이적으로 혼성화(예컨대, 결합)하는 분자 또는 그 유도체의 투여 또는 정위치에서(in situ)의 제조를 의미한다. 상기 결합은 통상적인 염기쌍 상동성에 의해 이루어지거나, 또는 예를 들어, DNA 이중 가닥에 결합하는 경우에는 이중나선의 주 그로브(major groove)에서의 특이적인 상호작용을 통해 결합이 이루어진다.
본 발명의 안티센스 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 세포 내에서 전사될 때, 표적 핵산의 적어도 특정 부분에 상보적인 핵산 서열을 생산하는 발현 플라스미드의 구성 성분으로서 전달할 수 있다. 또한, 안티센스 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 표적 세포의 외부에서 생성될 수 있으며, 표적 세포 내로 도입되면 표적 핵산에 혼성화하여 발현을 억제시킨다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 엑소뉴클레아제 및/또는 엔도뉴클레아제와 같은 내인성 핵산분해효소에 저항성을 갖도록 변형되어, 따라서 생체내에서 안정하다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드로 사용하기 위한 핵산의 예는 DNA의 포스포르아미데이트, 포스포티오에이트 및 메틸포스포네이트 유사체이다(또한, 미국 특허 5,176,996; 5,264,564; 및 5,256,775 참조). 안티센스 기술에 유용한 폴리뉴클레오티드를 구축하는 일반적인 접근법이 예를 들어, van der krol et al. (1988) Biotechniques 6:958-976; 및 Stein et al. (1988) Cancer Res 48:2659-2668에서 고찰되었다.
안티센스 접근법은 변이 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 유전자를 코딩하는 표적 핵산에 상보적인 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 RNA 중 하나)의 설계를 포함한다. 안티센스 폴리뉴클레오티드는 mRNA 전사체에 결합하여, 대상 단백질의 번역을 막을 수 있다. 바람직하기는 하지만, 절대적 상보성이 요구되는 것은 아니다. 이중-가닥 안티센스 폴리뉴클레오티드의 경우, 이중 가닥 DNA 중 단일 가닥을 테스트하거나, 삼중 가닥 형성을 분석할 수 있다. 혼성화 능력은 상보성 정도 및 안티센스 서열의 길이 모두에 의존적이다. 일반적으로, 혼성화하는 핵산의 길이가 길수록, 표적 핵산과의 미스매치 염기가 많을수록, 안정한 이중나선(경우에 따라서, 삼중나선)을 포함하게 형성할 수 있다. 당업자는 표준 방법에 따라 허용가능한 미스매치 정도를 조사하여, 혼성화된 혼합물의 융점을 결정할 수 있다.
표적 mRNA의 5' 말단, 예컨대 최대 5' 비번역 서열에 상보적이며 AUG 개시 코돈을 포함하는 안티센스 폴리뉴클레오티드는, mRNA의 번역 억제에 가장 효과적으로 작용하여야 한다. 그러나, 최근에 mRNA의 3' 비번역 서열에 상보적인 서열도 mRNA의 번역 억제에 효과적인 것으로 나타났다(Wagner, R. 1994. Nature 372:333). 따라서, 변이 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 유전자의 5' 또는 3' 비번역되는, 비-코딩 영역에 상보적인 안티센스 폴리뉴클레오티드를, 변이 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC mRNA의 번역을 억제하기 위한 안티센스 접근법에 사용할 수 있다. mRNA의 5' 비번역 영역에 상보적인 안티센스 폴리뉴클레오티드는 AUG 개시 코돈의 상보체를 포함하여야 한다. mRNA 코딩 영역에 상보적인 안티센스 폴리뉴클레오티드는 낮은 저효율의 번역 억제제이지만, 본 발명에 사용할 수 있다. mRNA의 5', 3', 또는 코딩 영역에 혼성화 여부를 불문하고, 안티센스 폴리뉴클레오티드는 그 길이가 적어도 6개의 뉴클레오티드 길이여야 하며, 바람직하게는 약 100개 미만, 보다 바람직하게는 약 50, 25, 17 또는 10개 미만의 뉴클레오티드 길이여야 한다.
표적 서열의 선택과는 무관하게, 변이 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 유전자의 발현을 억제하는 안티센스 폴리뉴클레오티드의 능력을 정량하기 위해, 우선 시험관내 시험을 수행하는 것이 바람직하다. 상기 시험에서, 안티센스 폴리뉴클레오티드의 안티센스 유전자 억제 및 비특이적인 생물학적 활성을 구분하는 대조군을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 시험에서, 표적 RNA 또는 단백질 농도를 내부의 대조 RNA 또는 단백질의 농도와 비교하는 것이 바람직하다. 게다가, 안티센스 폴리뉴클레오티드를 사용하여 수득한 결과를 대조군 안티센스 폴리뉴클레오티드를 사용하여 수득한 결과와 비교한다. 대조군 안티센스 폴리뉴클레오티드가 시험군 안티센스 폴리뉴클레오티드와 길이가 거의 동일하고, 대조군 안티센스 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 표적 서열에 대한 특이적인 혼성화를 억제하는데 필요한 수준 이하로 대상 안티센스 서열과 다른 것이 바람직하다.
안티센스 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 단일가닥 또는 이중가닥의 DNA 또는 RNA, 그의 키메라 혼합물, 그 유도체 또는 수정된 버전일 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 분자의 안정성, 혼성화 등을 개선하기 위해, 염기 모이어티, 당 모이어티 또는 인산 골격이 변형될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 펩티드(예컨대, 숙주 세포 수용체를 표적하기 위한); 세포막(예컨대, Letsinger et al., 1989, Proc Natl Acad Sci . USA 86:6553-6556; Lemaitre et al., 1987, Proc Natl Acad Sci . USA 84:648-652; 1988. 12. 15일자로 공개된 PCT 공개 W088/09810 참조) 또는 혈뇌장벽(예컨대, 1988. 4. 25일자로 공개된 PCT 공개 W089/10134 참조)을 통한 전달을 용이하게 하는 제제; 혼성화-촉발성 절단제(예컨대, Krol et al., 1988, Biotechniques 6:958-976 참조); 또는 삽입제(intercalating agent)(예컨대, Zon, Pharm . Res . 5:539-549(1988))와 같은 기타 부수적 그룹도 포함할 수 있다. 이를 위해, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 예컨대, 펩티드, 혼성화 촉발성 가교제, 전달 제제, 혼성화-촉발성 절단제 등과 같은 다른 분자와 접합될 수 있다.
안티센스 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 다음의 모이어티를 비제한적으로 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 변형된 염기 모이어티를 포함할 수 있다: 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-아이오도우라실, 하이포잔틴, 잔틴, 4-아세틸사이토신, 5-(카복시히드록시트리에틸) 우라실, 5- 카복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 베타-D-갈락토실퀘오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸사이토신, 5-메틸사이토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실; 베타-D-만노실퀘오신, 5-메톡시카복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산(v), 위부톡소신(wybutoxosine), 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오사이토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 우라실-5-옥시아세트산(v), 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카복시프로필) 우라실, (acp3)w 및 2,6-디아미노퓨린.
또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 비제한적으로 아라비노스, 2-플루오로아라비노스, 자일룰로스(xylulose) 및 헥소스를 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 변형된 당 모이어티를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 중성의 펩티드-유사 골격을 포함할 수 있다. 이러한 분자를 펩티드 핵산(PNA)-올리고머라고 하며, 예컨대, Perry-O'Keefe et al. (1996) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93:14670 및 Eglom et al. (1993) Nature 365:566에 기재되어 있다. PNA 올리고머의 한가지 장점은 DNA 골격의 중성 특징으로 인해, 매질의 이온결합력으로부터 실질적으로 독립적으로 상보적인 DNA에 대하여 결합할 수 있는 능력이다. 또 다른 예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 포스페이트 골격은 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미도티오에이트, 포스포르아미데이트, 포스포르디아미데이트, 메틸포스포네이트, 알킬 포스포트리에스테르 및 포름아세탈 또는 그 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형된 포스페이트 골격을 포함한다.
다른 예로, 안티센스 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 아노머형 올리고뉴클레오티드이다. 아노머형 올리고뉴클레오티드는 통상적인-단위와는 반대로, 가닥이 서로 평행하게 정렬하는 형태로, 상보적 RNA와 특이적인 이중-가닥 하이브리드를 형성한다(Gautier et al., 1987, Nucl . Acids Res . 15:6625- 6641). 상기 올리고뉴클레오티드는 2'-O-메틸리보뉴클레오티드(Inoue et al., 1987, Nucl . Acids Res . 15:6131-6148), 또는 키메라 RNA-DNA 유사체(Inoue et al., 1987, FEBS Lett . 215:327-330)이다.
안티센스 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 당해 분야에서 공지된 표준 방법, 예컨대, 자동 DNA 합성기(예. Biosearch, Applied Biosystems 등에서 상업적으로 구입가능함)를 사용하여, 합성할 수 있다. 예를 들어, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 Stein et al. Nucl . Acids Res . 16:3209 (1988)의 방법에 의해 합성할 수 있으며, 메틸포스포네이트 올리고뉴클레오티드는 조절된 공극 유리 고분자 지지체를 사용하여 제조할 수 있다(Sarin et al., Proc. Natl . Acad . Sci . USA 85:7448-7451 (1988)).
mRNA 서열의 코딩 영역에 상보적인 안티센스 서열을 사용될 수 있다. 대안적으로, 전사된 비번역 영역에 상보적인 안티센스 서열와 개시 메티오닌을 포함하는 영역에 상보적인 안티센스 서열도 사용할 수 있다.
안티센스 폴리뉴클레오티드는 생체내에서 표적 유전자를 발현하는 세포에 전달할 수 있다. 세포에 핵산을 전달하기 위한 다수의 방법들이 개발되어 있으며, 예컨대, 핵산을 조직 부위에 직접 주입하거나, 또는 원하는 세포를 표적화 하도록 고안된 변형 핵산(예컨대, 표적 세포 표면에 발현된 항원나 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 펩티드에 연결된 안티센스 폴리뉴클레오티드)을 전신 투여할 수 있다.
그러나, 특정 예에서, 변이 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 유전자 또는 mRNA의 활성을 약화시키는데 충분한 수준으로 안티센스 폴리뉴클레오티드의 세포내 농도를 형성하는 것은 어려울 수 있다. 따라서, 다른 접근법은 안티센스 폴리뉴클레오티드가 강력한 pol III 또는 pol II 프로모터의 통제하에 위치된 재조합 DNA 구조체를 이용한다. 환자에서 표적 세포를 형질감염시키기 위한 이러한 구조체를 사용하게 되면, 변이 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 유전자 또는 mRNA와 상보적 염기쌍을 형성하게 될 충분한 양의 안티센스 폴리뉴클레오티드가 전사되며, 따라서, LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 단백질 활성을 약화시킬 수 있다. 예를 들어, 벡터는 세포에 의해 포획되고 변이 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 유전자 또는 mRNA를 표적으로 하는 안티센스 폴리뉴클레오티드의 전사를 지시하도록, 생체내에 도입될 수 있다. 그러한 벡터는 전사되어 원하는 안티센스 폴리뉴클레오티드를 생산할 수 있는 한, 에피솜 형태로 잔류하거나, 염색체에 삽입될 수 있다. 상기 벡터는 당해 분야에서 일반적인 재조합 DNA 기술 방법에 의해 구축할 수 있다. 벡터는 포유류 세포에서 복제 및 발현에 사용되는 플라스미드, 바이러스 또는 당해 분야에 공지된 그외의 것일 수 있다. 프로모터는 안티센스 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 서열과 작동가능하게 연결될 수 있다. 안티센스 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 서열은 포유류, 바람직하게는 인간 세포에서 작용하는 당해 분야에서 공지된 임의의 프로모터에 의해 발현될 수 있다. 상기 프로모터는 유도성이거나 상시발현성일 수 있다. 상기 프로모터는 SV40 초기 프로모터 영역(Bernoist and Chambon, Nature 290:304-310 (1981)), 라우스 육종 바이러스의 3' 장 말단 반복부에 포함된 프로모터(Yamamoto et al., Cell 22:787-797 (1980)), 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터(Wagner et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 78: 1441-1445 (1981)), 메탈로티오닌 유전자의 조절 서열(Brinster et al, Nature 296:3942 (1982)) 등을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. 조직 부위에 직접 도입될 수 있는 재조합 DNA 구조를 제조하기 위해, 임의 형태의 플라스미드, 코스미드(cosmid), YAC 또는 바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 또한, 원하는 조직에 선택적으로 감염하는 바이러스성 벡터를 사용할 수 있으며, 이 경우 벡터는 다른 경로(예컨대, 전신으로)로 투여할 수 있다.
RNAi 구조체- siRNA 및 miRNA
간섭 RNA(RNAi)는 이중-가닥(ds) RNA-의존성 유전자 특이적인 전사후 침묵(silencing)을 의미하는 현상이다. 본 발명은 변이 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 유전자의 발현을 약화시키기 위해 RNAi 또는 miRNA 기전을 통해 작용하는 RNAi 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 변이 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 유전자의 발현을 약화 또는 억제하는 miRNA 또는 siRNA 서열을 포함할 수 있다. 일 예에서, miRNA 또는 siRNA 서열은 약 19개의 뉴클레오티드 내지 약 75개의 뉴클레오티드 길이이거나, 바람직하게는, 약 25개 염기쌍 내지 약 35개 염기쌍 길이이다. 특정 예에서, 폴리뉴클레오티드는 RNAse 효소에 의해 프로세싱될 수 있는 헤어핀 루프 또는 스템-루프(stem-loop)이다(예컨대, Drosha and Dicer).
RNAi 구조체는, 세포의 생리 조건하에서 변이 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 유전자에 대한 mRNA 전사체의 적어도 일부분의 뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이중-가닥 RNA는 단지 RNAi를 매개할 만큼의 능력을 가진다는 점에서 천연 RNA와 충분히 유사할 필요가 있다. 표적 서열 및 RNAi 구조체 서열 간의 허용되는 미스매치 뉴클레오티드 수는 5 bp에서 1 bp 이상이거나, 또는 10 bp에서 1 bp 이상, 또는 20 bp에서 1 bp 이상, 또는 50 bp에서 1 bp 이상이다. RNAi 구조체는 변이 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 유전자를 특이적으로 표적으로 할 수 있는 것이 가장 중요하다. siRNA 이중가닥의 센터에서의 미스매치가 가장 중요하며, 필연적으로 표적 RNA의 분해를 없앨 수 있다. 대조적으로, 표적 RNA에 상보적인 siRNA 가닥의 3' 말단의 뉴클레오티드는 특이적 표적 인식에 유의하게 기여하진 않는다.
당해 분야에서 공지된 서열 비교 및 정렬 알고리즘(Gribskov and Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991 및 상기 문헌에 인용된 참조문헌)과, 예를 들어, 디폴트 파라미터를 이용한 BESTFIT 소프트웨어 프로그램에서의 실행하는 Smith-Waterman 알고리즘에 의한 뉴클레오티드 서열 간의 차이성% 계산에 의해(예컨대, University of Wisconsin Genetic Computing Group), 서열 동일성(identity)을 최적화할 수 있다. 억제성 RNA와 표적 유전자의 일 부분간의 서열 동일성이 90% 이상이거나, 100%인 것이 바람직하다. 또한, RNA의 이중나선 영역은 표적 유전자 전사체의 일부분과 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열로서, 기능적으로 정의될 수 있다(예컨대, 400 mM NaCl, 4OmM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA, 12-16 시간 동안 50℃ 또는 70℃에서 혼성화 및 세척).
다양한 방법으로 RNAi 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제조할 수 있다. 예를 들어, RNAi 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 화학적 합성 방법 또는 재조합 핵산 기술에 의해 제조할 수 있다. 처리된 세포의 내인성 RNA 중합효소가 생체내 전사를 매개할 수 있거나, 클로닝한 RNA 중합효소를 시험관내 전사에 사용할 수 있다. 야생형 또는 안티센스 폴리뉴클레오티드, 또는 RNAi 기전에 의해 표적 유전자의 활성을 조절하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 포스페이트-당 골격 또는 뉴클레오사이드 중 어느 하나의 변형을 포함하여, 예컨대, 세포 핵산분해효소에 대한 감수성을 감소, 생체이용성을 개선, 제형 특성을 개선 및/또는 기타 약동학적 특성을 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 적어도 하나의 질소 또는 황 헤테로원자를 포함하도록 천연 RNA의 포스포디에스테르 결합을 변형할 수 있다. RNA 구조의 변형은, dsRNA에 대한 일반적인 반응을 피하면서, 특이적으로 유전자를 억제하도록 맞춰질 수 있다. 유사하게, 아데노신 디아미나제의 활성을 차단하도록 염기를 변형시킬 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 효소적으로 또는 부분/전체 유기 합성에 의해 생산할 수 있으며, 임의의 변형된 리보뉴클레오티드를 시험관내 효소적 또는 유기 합성에 의해 도입할 수 있다.
RNA 분자를 화학적으로 변형시키는 방법을 RNAi 구조체를 변형하는데 적용할 수 있다(예를 들어, Heidenreich et al. (1997) Nucleic Acids Res, 25:776- 780; Wilson et al. (1994) J Mol Recog 7:89-98; Chen et al. (1995) Nucleic Acids Res 23:2661-2668; Hirschbein et al. (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 7:55-61 참조). 예시적으로, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 포스포디티오에이트, 키메라 메틸포스포네이트-포스포디에스테르, 펩티드 핵산, 5-프로피닐-피리미딘 함유 올리고머 또는 당 변이체(예컨대, 2'-치환된 리보뉴클레오사이드, α-배위)를 이용하여 RNAi 구조체를 변형시킬 수 있다.
1개의 자기-상보적 RNA 가닥 또는 2개의 상보적 RNA 가닥에 의해, 이중-가닥 구조를 만들 수 있다. RNA 이중가닥 형성은 세포 내부 또는 외부에서 개시될 수 있다. RNA는 세포당 적어도 한개 이상의 카피수로 전달가능한 양으로 도입할 수 있다. 보다 낮은 양의 이중-가닥 물질을 구체적인 적용에 이용할 수 있지만, 보다 높은 양(예컨대, 세포당 적어도 5, 10, 100, 500 또는 1000개의 카피)의 이중-가닥 물질이 더욱 효과적인 억제를 달성할 수 있다. RNA의 이중가닥 영역에 대응되는 뉴클레오티드 서열은 유전자 억제에 표적이 된다는 점에서, 억제는 서열-특이적이다.
특정 예에서, 대상 RNAi 구조체는 "siRNA"이다. 이 핵산의 길이는 약 19-35개의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 21-23개 뉴클레오티드이며, 예컨대, 더 긴 이중-가닥 RNA의 핵산분해효소 "다이싱(dicing)"에 의해 만들어진 단편 길이에 상응한다. siRNA는 핵산분해효소 복합체를 소집하여, 특이적인 서열과의 쌍을 지어 복합체를 표적 mRNA로 인도하는 것으로 이해된다. 그 결과, 표적 mRNA는 단백질 복합체 중의 핵산분해효소에 의해 분해되거나, 번역이 억제된다. 특정 예에서, 21-23개의 뉴클레오티드 siRNA 분자는 3' 히드록시기를 포함한다.
다른 예에서, 대상 RNAi 구조체는 "miRNA"이다. 마이크로 RNA(miRNA)는 상동 mRNA와의 상호작용을 통해 유전자 발현의 전사후 조절을 지시하는 소형 비코딩 RNA이다. miRNA는 단백질 코딩 유전자로부터 표적 mRNA의 상보적 영역에 결합하여, 유전자 발현을 조절한다. miRNA는 siRNA와 유사하다. miRNA는 큰 이중-가닥 전구체 분자로부터 핵융해(nucleolytic) 절단에 의해 처리된다. 상기 전구체 분자는 종종 약 70개 뉴클레오티드 길이의 헤어핀 구조이며, 헤어핀 구조에서 25개 이상의 뉴클레오티드가 염기쌍을 이룬다. RNAse Ⅲ-유사 효소인 드로샤(Drosha) 및 다이서(Dicer)(상기 효소는 siRNA 처리에서도 사용됨)는 miRNA 전구체를 절단하여 miRNA를 만든한다. 처리된 miRNA는 단일-가닥으로, RISC 또는 miRNP라는 단백질 복합체에 병합된다. 이 RNA-단백질 복합체는 상보 mRNA를 표적으로 한다. miRNA는 표적 mRNA의 번역을 억제하거나, 직접 절단한다(Brennecke et al., Genome Biology 4:228 (2003); Kim et al., Mol. Cells 19:1-15 (2005).
특정 예에서, miRNA 및 siRNA 구조는 예를 들어, 다이서 및 드로샤 효소 존재하에서 보다 긴 이중-가닥 RNA를 처리함으로써, 만들 수 있다. 다이서 및 드로샤는 dsRNA를 특이적으로 절단하는 RNAse Ⅲ-유사 핵산분해효소이다. 다이서는 헬리케이즈(helicase) 도메인 및 이중 RNAse Ⅲ 모티프(motif)를 포함하는 고유한 구조를 가지고 있다. 다이서는 또한 하등 진핵세포의 RNAi와 유전적으로 연결되어 있는 RDE1/QDE2/ARGONAUTE 패밀리와 상동한 부위를 포함한다. 실제, 다이서의 활성 또는 과발현은, 많은 경우에, 배양물 또는 전체 유기체에서 포유류(비난모세포성) 세포 또는 배양된 진핵 세포와 같은 다른 비수용 세포에서 RNA 간섭이 가능하도록 충분할 수 있다. 다이서 뿐만 아니라 그외 RNAi 효소를 이용한 방법 및 조성물이 미국 특허 출원공개 2004/0086884에 기재되어 있다.
일 예에서, 초파리(Drosophila)의 시험관내 시스템을 사용한다. 상기 예에서, RNAi 서열 또는 RNAi 전구체를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 초파리 배아세포 유래의 가용성 추출물과 조합하여, 조합물을 만든다. 조합물은 dsRNA가 약 21 내지 약 23개 뉴클레오티드의 RNA 분자로 처리되는 조건에서 유지시킨다.
miRNA 및 siRNA 분자는 당해 분야에서 공지된 다수의 기술에 의해 정제할 수 있다. 예를 들어, 겔 전기영동을 이용하여 그러한 분자를 정제할 수 있다. 대안적으로, 비-변성 컬럼 크로마토그래피와 같은 비-변성 방법을 이용하여 siRNA 및 miRNA 분자를 정제할 수 있다. 또한, 크로마토그래피(예컨대, 크기 배제 크로마토그래피), 글리세롤 농도구배 원심분리, 항체를 이용한 친화성 정제를 사용하여, siRNA 및 miRNA를 정제할 수 있다.
특정 예에서, 작용기 도메인의 siRNA 서열의 적어도 하나의 가닥은 약 1 내지 약 6개 뉴클레오티드 또는 2 내지 4개 뉴클레오티드 길이의 3' 돌출부(overhang)를 가진다. 다른 예에서, 3' 돌출부는 1-3개 뉴클레오티드 길이이다. 특정 예에서, 한 가닥은 3' 돌출부를 가지고, 다른 가닥이 블런트-말단(blunt-ended)이거나 돌출부를 가진다. 돌출부의 길이는 각 가닥마다 동일하거나 상이할 수 있다. siRNA 서열의 안정성을 보다 개선시키기 위해, 3' 돌출부를 분해에 대해 안정화시킬 수 있다. 일 예에서, RNA는 아데노신 또는 구아노신 뉴클레오티드와 같은 퓨린 뉴클레오티드를 포함시킴으로써 안정화시킬 수 있다. 대안적으로, 피리미딘 뉴클레오티드의 변형 유사체에 의한 치환, 예컨대, 우리딘 뉴클레오티드 3' 돌출부의 2'-데옥시티이니딘에 의한 치환이 허용되며, RNAi 효능에는 영향을 미치지 않는다. 2' 히드록시기의 부재는 조직 배양 배지내에서 돌출부의 핵산분해효소 저항성을 크게 향상시키며, 생체내에서 유리할 수 있다.
특정 예에서, RNAi 서열 또는 RNAi 전구체를 포함하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 헤어핀 구조 형태이다(이하, 헤어핀 RNA라고 함). 헤어핀 RNA는 외래에서 합성되거나, 생체내 RNA 중합효소 Ⅲ 프로모터로부터 전사에 의해 형성될 수 있다. 포유류 세포에서 유전자 침묵(silencing)을 위해 상기 헤어핀 RNA를 제조하고 이용하는 예는 예를 들어, Paddison et al., Genes Dev, 2002, 16:948-58; McCaffrey et al., Nature, 2002, 418:38-9; McManus et al., RNA 2002, 8:842-50; Yu et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99:6047- 52에 기재되어 있다. 바람직하게는, 상기 헤어핀 RNA는 원하는 유전자의 연속적이고 안정된 억제를 보장하도록 세포나 동물에서 조작된다. miRNA 및 siRNA는 세포에서 헤어핀 RNA를 처리함으로써 제조할 수 있는 것으로 당해 분야에 공지되어 있다.
또 다른 예에서, 플라스미드를 사용하여, 전사 산물로서, 이중-가닥 RNA를 전달한다. 코딩 서열이 전사된 후, 상보적인 RNA 전사체는 염기쌍을 이루어 이중-가닥 RNA를 형성한다.
항체
본 발명은 또한 항체에 관한 것이다. 일 예에서, 변이 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 폴리펩티드와 특이적으로 반응하는 항체를 사용하여, 변이 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 폴리펩티드의 존재를 검출하거나, 변이 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 폴리펩티드의 활성을 억제할 수 있다. 예를 들어, 변이 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 펩티드로부터 유래된 면역원을 사용하여, 항-단백질/항-펩티드 혈청 또는 모노클로날 항체를 표준 프로토콜로 제조할 수 있다(예를 들어, Antibodies: A Laboratory Manual ed. by Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988) 참조). 마우스, 햄스터 또는 토끼와 같은 포유류를 변이 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 펩티드의 면역원 형태, 항체 반응을 이끌어낼 수 있는 항원 단편, 또는 융합 단백질로 면역화시킬 수 있다. 특정 예에서, 접종된 마우스는 내인성 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC를 발현하지 않아, 항-자가 항체로서 제거될 항체의 분리를 용이하게 할 수 있다. 단백질 또는 펩티드에 면역원성을 부여하는 기술은 캐리어에 접합시키거나 또는 기타 당해 분야에서 공지된 기술을 포함한다. 변이 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 펩티드의 면역원성 부분은 보강제의 존재하에 투여할 수 있다. 혈장 또는 혈청에서 항체 역가를 측정함으로써, 면역화 진행을 모니터링할 수 있다. 표준 ELISA 또는 그외 면역분석법을 항원으로서 면역원을 사용하여, 항체 농도를 측정할 수 있다.
변이 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 폴리펩티드의 항원 조제물을 이용하여 동물을 면역화한 다음, 혈청을 수득하여, 필요에 따라 혈청으로부터 폴리클로날 항체를 분리할 수 있다. 모노클로날 항체를 제조하기 위해, 항체-생산 세포(림프구)를 면역화된 동물로부터 수득하고 이를 표준 체세포 융합 과정에 의해 골수종 세포와 같은 불멸화 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 수득할 수 있다. 그러한 기술은 당해 분야에서 공지되어 있으며, 예를 들어, 인간 모노클로날 항체를 생산하기 위한, 하이브리도마 기술(Kohler and Milstein, (1975) Nature, 256: 495-497에 의해 최초 개발), 인간 B 세포 하이브리도마 기술(Kozbar et al., (1983) Immunology Today, 4: 72) 및 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96)을 포함한다. 변이 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 폴리펩티드와 특이적으로 반응하는 항체 및 상기 하이브리도마 세포를 포함하는 배양물로부터 분리된 모노클로날 항체를 생산하기 위해, 상기 하이브리도마 세포는 면역화학적으로 스크리닝할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "항체"는 변이 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 폴리펩티드와 특이적으로 반응하는 그의 단편도 포함하는 것으로 의도된다. 항체는 통상의 기술을 사용하여 단편화할 수 있으며, 상기 단편은 상기 항체 전체에서 기재된 것과 동일한 방법을 사용하여 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, F(ab)2 단편은 항체를 펩신 처리하여 만들 수 있다. 만들어진 F(ab)2 단편은 이황화 결합을 환원 처리하여 Fab 단편을 만들 수 있다. 또한 본 발명의 항체는 항체의 적어도 하나의 CDR 영역에 의해 부여된 변이 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 폴리펩티드에 대한 친화성을 가지는 이중특이성, 단쇄, 및 키메라 및 인간화(humanized) 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 바람직한 예로, 항체는 그 항체에 부착되어 검출될 수 있는 표지물을 더 포함한다(예컨대, 표지물은 방사성동위원소, 형광 화합물, 효소, 또는 효소 보조인자일 수 있음).
특정 예에서, 본 발명의 항체는 모노클로날 항체이고, 특정 예에서, 본 발명은 변이 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 신규 항체의 제조를 가능하게 하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 변이 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 신규 항체의 제조 방법은, 검출가능한 면역 반응을 자극하기에 유효한 양의 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물을 마우스에 투여하는 단계, 상기 마우스로부터 항체-생산 세포를 수득하는 단계(예컨대, 비장으로부터 세포를 수득), 상기 항체-생산 세포를 골수종 세포와 융합시켜 항체-생산 하이브리도마를 수득하는 단계 및 항체-생산 하이브리도마를 시험하여 변이 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 확인하는 단계를 포함한다. 일단 하이브리도마가 수득되면, 하이브리도마를 세포 배양으로 선택적으로는 하이브리도마-유래 세포가 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 생산하는 배양 조건에서, 증식시킬 수 있다. 모노클로날 항체는 세포 배양물로부터 정제할 수 있다.
항체와 관련하여 사용되는 용어 "특이적으로 반응하는"은 당해 분야에서 일반적으로 이해되는 바와 같이, 항체가 대상 항원(예컨대, 변이 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 폴리펩티드)과 관심대상이 아닌 다른 항원에 대하여 충분히 선택적인 것을 의미하며, 여기서 항체는 최소한 특정 형태의 생물학적 시료 중에서 대상 항원의 존재를 검출하는데 유용하다. 치료학적 적용과 같이 항체를 이용하는 특정 방법에서, 고도의 결합 특이성이 바람직할 수 있다. 모노클로날 항체는 일반적으로(폴리클로날 항체에 비하여) 원하는 항원과 교차-반응하는 폴리펩티드를 효과적으로 구별하는 경향이 강하다. 항체:항원 상호작용의 특이성에 영향을 미치는 한가지 특성은 항원에 대한 항체의 친화성이다. 바람직한 특이성은 다양한 친화성 범위일 수 있지만, 일반적으로 바람직한 항체는 약 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 또는 그 이하의 친화도(해리상수)를 가질 수 있다.
스크리닝 분석법
본 발명은 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 폴리펩티드의 작용제 또는 길항제인 화합물(제제)을 확인하기 위한 LOC387715 폴리펩티드, SYNPR 폴리펩티드 또는 PDGFC 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다. 본 스크리닝을 통해 확인되는 화합물은 안(eye) 세포(예컨대, 상피 및 내피 세포) 뿐 아니라 기타 조직(예컨대, 근육 및/또는 신경)에서 시험하여, 생체내 또는 시험관내 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 활성을 조절하는 화합물의 능력을 분석할 수 있다. 어떤 면에서, 본 스크리닝 분석을 통해 확인된 화합물은 드루젠 침착물의 제형을 조절한다. 임의로, 이 화합물을 동물 모델에서 추가로 테스트하여, 생체내 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 활성을 조절하는 화합물의 능력을 분석할 수 있다.
LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 폴리펩티드를 표적으로 하는 치료제를 스크리닝하기 위한 다수의 접근법이 있다. 특정 예에서, LOC387715 폴리펩티드, SYNPR 폴리펩티드 또는 PDGFC 폴리펩티드의 활성에 영향을 미치는 제제를 확인하기 위해, 화합물의 고성능 스크리닝법(high-throughput screening)을 수행할 수 있다. 다양한 분석 포멧을 사용될 수 있으며, 본 명세서에 기재되지 않은 검색방법도 당해 분야의 당업자에 의해 포함될 수 있다. 본 명세서에 기재된, 본 발명의 시험 화합물(제제)은 화학적 방법의 임의의 조합에 의해 만들 수 있다. 대안적으로, 대상 화합물은 생체내 또는 시험관내에서 합성된 천연적으로 만들어지는 생물 분자일 수 있다. LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 활성의 조절자로 작용하는 능력을 시험할 화합물(제제)은 예를 들어, 박테리아, 효모, 식물 또는 다른 유기체 (예컨대, 천연물)에서 생산하거나, 화학적(예컨대, 펩티드모방체를 포함하는 소형 분자), 또는 재조합에 의해 생산할 수 있다. 본 발명에서 고려하는 시험 화합물은 비-펩티드성 유기 분자, 펩티드, 폴리펩티드, 펩티드모방체, 당, 호르몬, 및 핵산 분자를 포함한다.
본 발명의 시험 화합물은 단독의 분리된 단위로 제공되거나, 조합 화학에 의해 제조된 것과 같은 보다 복잡한 라이브러리 형태로 제공될 수 있다. 이 라이브러리는 예를 들어, 알콜, 알킬 할라이드, 아민, 아미드, 에스테르, 알데히드, 에테르 및 다른 유기 화합물 클래스를 포함할 수 있다. 시험 화합물은 특히 초기 스크리닝 단계에서, 분리된 형태나 혼합물로 시험 시스템에 존재할 수 있다. 선택적으로, 화합물은 다른 화합물과 유도체화될 수 있으며, 화합물의 분리를 용이하게 하는 유도체기를 가질 수 있다. 유도체기는 바이오틴, 플루오레세인 디곡시게닌(digoxygenin), 녹색 형광 단백질, 동위원소, 폴리히스티딘, 자기 비드, 글루타티온 S 트랜스퍼라제(GST), 광활성 가교제 또는 그 임의 조합을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.
약제학적 조성물
본 명세서에 기재된 및 AMD를 앓고 있는 개체의 치료 방법 및 조성물은 AMD 발생의 위험성이 진단되거나 예상되는 개체의 예방을 위해 사용할 수 있다. 이 경우, 본 조성물은 AMD 또는 관련 증상의 개시를 지연시키거나, 서행시키거나 또는 예방하는데 충분한 양 및 투여량으로 투여된다. 대안적으로, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 AMD를 앓고 있는 개체 치료에 사용할 수 있다. 이 경우, 본 조성물은 전체적으로 또는 부분적으로, 증상 진행을 지연 또는 늦추는데 충분한 용량 및 투여량으로, 또는 상태를 질병의 제거 시점으로 역전시키기에 충분한 용량 및 투여량으로 투여된다. AMD 발생의 위험성이 진단되거나 예상되는 개체의 치료용 조성물의 유효량은 개체를 치료하거나 질병 그 자체를 치료하는데 충분한 용량 또는 투여량으로 이해된다.
특정 예에서, 본 발명의 화합물(예컨대, LOC387715 폴리펩티드, SYNPR 폴리펩티드 또는 PDGFC 폴리펩티드를 코딩하는 분리되거나 재조합적으로 생산된 핵산 분자, 또는 분리되거나 재조합적으로 생성된 LOC387715 폴리펩티드, SYNPR 폴리펩티드 또는 PDGFC 폴리펩티드)은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화된다. 예를 들어, LOC387715 폴리펩티드, SYNPR 폴리펩티드 또는 PDGFC 폴리펩티드 또는 LOC387715 폴리펩티드, SYNPR 폴리펩티드 또는 PDGFC 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 단독으로 또는 약제학적 제형의 성분(치료용 조성물)으로서 투여될 수 있다. 상기 화합물은 인간 의약품으로 사용하기 위한 통상의 방법에 따라 투여하기 위해 제형화될 수 있다.
특정 예에서, 본 발명의 치료 방법은 조성물을 국소(topically), 전신 또는 국부(locally)로 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 치료 조성물은 주사(예컨대, 정맥내, 피하, 또는 근육내), 흡입(inhalation) 또는 통기(insufflation)(입이나 코를 통한) 또는 경구, 협측(buccal), 설하, 경피, 경비, 또는 비경구 등의 투여용으로 제형화될 수 있다. 본 명세서에 기재된 조성물은 임플란트 또는 장치의 일부분으로 제형화될 수 있다. 투여 시, 본 발명에 사용되는 치료 조성물은 발열원 없는 생리학적으로 허용되는 형태이다. 또한, 본 조성물은 안구세포와 같은 표적세포가 존재하는 부위에 전달하기 위한 점성 형태로 주입되거나 캡슐화될 수 있다. 기술 및 제형은 일반적으로 Remington's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, PA에 기재되어 있다. LOC387715 폴리펩티드, SYNPR 폴리펩티드 또는 PDGFC 폴리펩티드 또는 LOC387715 폴리펩티드, SYNPR 폴리펩티드 또는 PDGFC 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 이외에, 치료적으로 유용한 제제가 전술된 임의의 조성물에 포함될 수 있다. 또한, 치료적으로 유용한 제제는 대안적으로 또는 부가적으로, 본 발명의 방법에 따라 LOC387715 폴리펩티드, SYNPR 폴리펩티드 또는 PDGFC 폴리펩티드 또는 LOC387715 폴리펩티드, SYNPR 폴리펩티드 또는 PDGFC 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자와 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
특정 예에서, 본 발명의 조성물은 각 제형이 활성 성분으로서 제제의 예정된 양을 포함하는 예컨대, 캡슐제, 카세제(cachet), 환제, 정제, 로젠지(향미 기제, 통상적으로 슈크로스 및 아카시아 또는 트라가칸트 사용), 산제, 과립제, 또는 수성 또는 비수성 액체 형내의 용액이나 현탁제, 수중유 또는 유중수 유제, 또는 엘릭실제 또는 시럽제, 또는 향정(pastille)(젤라틴 및 글리세린, 또는 슈크로스 및 아카시아와 같은 불활성 기제를 사용) 및/또는 구강 세척제 등의 제형으로, 경구 투여될 수 있다. 또한, 상기 제제는 덩어리(bolus), 연질(electuary) 또는 반죽(paste) 형태로 투여될 수 있다.
경구용 고형 제형에서 (캡슐제, 정제, 환제, 당의정, 산제, 과립제 등), 본 발명의 하나 이상의 치료 화합물은 구연산나트륨 또는 인산 디칼슘, 및/또는 다음과 같은 임의의 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 혼합될 수 있다: (1) 전분, 락토스, 슈크로스, 글루코스, 만니톨 및/또는 실릭산과 같은 충전제 또는 증량제; (2) 예를 들어, 카복시메틸셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐 피롤리돈, 슈크로스, 및/또는 아카시아와 같은 결합제; (3) 글리세롤과 같은 보습제; (4) 한천-한천, 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 규산염, 및 탄산나트륨과 같은 붕해제; (5) 파라핀과 같은 용액 완염제(retarding agent); (6) 4급 암모늄 화합물과 같은 흡수 촉진제; (7) 예를 들어, 세틸 알콜 및 글리세롤 모노스테아레이트와 같은 습윤제; (8) 카올린 및 벤토나이트 점토와 같은 흡착제; (9) 탈크, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 라우릴 설페이트, 및 그 혼합물과 같은 활택제, 및 (10) 착색제. 캡슐제, 정제 및 환제의 경우, 약제학적 조성물은 또한 완충제를 포함할 수 있다. 유사한 타입의 고체 조성물을, 락토스 또는 유당뿐 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 부형제를 이용하여 연질 및 경질 젤라틴 캡슐제내 충전제로 이용할 수 있다.
경구용 액제는 약제학적으로 허용되는 유제, 미세유제, 용액, 현탁제, 시럽제 및 엘릭실제를 포함한다. 활성 성분 이외에, 액체 투약 형태는 물 또는 다른 용매; 에틸 알콜, 이소프로필 알콜, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 오일 (특히, 면실유, 땅콩, 옥수수, 검, 올리브, 캐스터 오일 및 참기름), 글리세롤, 테트라히드로푸릴 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 및 그의 혼합물과 같은 가용화제 및 유화제와 같은 당해 분야에서 통상 사용되는 불활성 희석제를 포함할 수 있다. 불활성 희석제 이외에, 경구용 조성물은 또한 습윤제, 유화제 및 현탁제, 감미제, 향미제, 착색제, 향료, 및 보존제와 같은 보강제를 포함할 수 있다.
활성 화합물 이외에 현탁제는 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨, 및 소르비탄 에스테르, 미세결정 셀룰로스, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 한천-한천 및 트라가칸트, 및 그 혼합물과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.
국소 또는 경피 투여용 제형은 산제, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패치제, 및 흡입제를 포함한다. 활성 화합물은 멸균 조건에서 약제학적으로 허용가능한 담체, 및 필요할 수 있는 임의의 보존제, 완충제, 또는 분사제와 혼합될 수 있다. 연고, 페이스트, 크림, 및 겔제는 본 발명의 대상 화합물과 함께 (예컨대, LOC387715 폴리펩티드, SYNPR 폴리펩티드 또는 PDGFC 폴리펩티드를 코딩하는 분리되거나 재조합적으로 생산된 핵산 분자, 또는 분리되거나 재조합적으로 생성된 LOC387715 폴리펩티드, SYNPR 폴리펩티드 또는 PDGFC 폴리펩티드), 동물 및 식물성 지방, 오일, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 탈크 및 산화아연, 또는 그 혼합물과 같은 부형제를 포함할 수 있다.
산제 및 스프레이제는 대상 화합물과 함께, 락토스, 탈크, 규산, 수산화알루미늄, 칼슘 실리케이트, 및 폴리아미드 산제, 또는 이들 성분의 혼합물과 같은 부형제를 포함할 수 있다. 스프레이제는 클로로플루오로 탄화수소와 같은 통상의 분사제, 및 부탄 및 프로판과 같은 휘발성 비치환 탄화수소를 추가로 포함할 수 있다.
투여 계획은 예를 들어, 본 발명의 대상 화합물의 활성을 변화시키는 다양한 인자, AMD의 중증도 또는 단계, 투여 경로, 및 연령, 체중 및 키와 같은 개체에 특별한 특성을 고려하여, 개체마다 결정되는 것으로 이해된다. 당업자는 또한 개체를 치료하는데 필요한 투여량을 정할 수 있다. 일 예에서, 투여량은 개체 체중 kg 당 약 1.0 ng/kg 내지 약 100 mg/kg일 수 있다. 조성물에 따라, 투여량은 연속적으로 또는 주기적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 1회 이상 분리 투여될 수 있다. 특정 조성물의 수회 투약 간격은 당업자에 의해 과도한 시험 없이 결정될 수 있다. 예를 들어, 화합물은 매시간, 매일, 매주, 매달, 매년(예컨대, 시간-방출 형태) 또는 1회 전달될 수 있다.
특정 예에서, 비경구 투여에 적절한 약제학적 조성물은, 항산화제, 완충액, 정균제, 제형을 의도된 수용자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질, 또는 현탁제 또는 비후제를 포함할 수 있는, 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 멸균 등장성 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 유제, 또는 사용 직전에 멸균 주사 용액 또는 분산액으로 재구성되는 멸균 산제와 함께, LOC387715 폴리펩티드, SYNPR 폴리펩티드 또는 PDGFC 폴리펩티드 또는 LOC387715 폴리펩티드, SYNPR 폴리펩티드 또는 PDGFC 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 이용될 수 있는 적절한 수성 및 비수성 담체는 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 그의 적절한 혼합물, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 및 에틸 올리에이트와 같은 주사용 유기 에스테르를 포함한다. 적절한 유동성은 예를 들어, 렉시틴과 같은 코팅 물질의 사용, 분산제의 경우 필수 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보강제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 포함시켜 미생물 작용을 확실히 방지할 수 있다. 또한, 당, 염화나트륨과 같은 등장제를 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수 지연제를 포함시켜, 주사용 약제학적 형태의 흡수 연장을 유도할 수 있다.
특정 예에서, 본 발명은 또한 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 폴리펩티드의 생체내 생산을 위한 유전자 치료법을 제공한다. 상기 치료법은, 정상적인 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 작용이 결여된 세포 또는 조직에 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 폴리뉴클레오티드 서열을 도입하여 치료적 효과를 달성할 수 있다. 키메라 바이러스와 같은 재조합 발현 벡터, 또는 콜로이드성 분산 시스템을 이용하여, LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 폴리뉴클레오티드 서열을 전달할 수 있다. 표적화된 리포좀도 또한 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 폴리뉴클레오티드 서열의 치료적 전달을 위해 사용할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 유전자 치료법에 사용될 수 있는 다양한 바이러스성 벡터는 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 우두(vaccinia), 또는 레트로바이러스와 같은 RNA 바이러스를 포함한다. 레트로바이러스 벡터는 쥐 또는 조류 레트로바이러스의 유도체일 수 있다. 하나의 외래 유전자를 삽입할 수 있는 레트로바이러스 벡터의 예는 몰로니종 쥐 백혈병 바이러스(MoMuLV), 하비 쥐 육종 바이러스(HaMuSV), 쥐 유방암 바이러스(MuMTV), 및 라우스 육종 바이러스(RSV)가 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 다수의 추가 레트로바이러스 벡터에 다수 유전자를 삽입할 수 있다. 이들 벡터는 모두 형질전이된 세포를 확인 및 만들 수 있도록 선별 마커 유전자를 수송 또는 병합할 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 예를 들어, 당, 당지질, 또는 단백질 부착에 의해, 표적-특이적으로 제조될 수 있다. 바람직한 표적화는 항체를 이용하여 달성된다. 특이적인 폴리뉴클레오티드 서열이 레트로바이러스성 유전자에 삽입되거나, 바이러스성 외피(envelope)에 부착되어, LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 폴리뉴클레오티드를 포함하는 레트로바이러스 벡터의 표적 특이적 전달을 가능하게 하는 것으로, 당해 분야의 당업자는 이해할 것이다. 바람직한 일 예에서, 벡터는 안구 세포 또는 조직을 표적으로 한다.
대안적으로, 통상적인 인산칼슘 형질전이에 의해 조직 배양 세포에 레트로바이러스의 구조 유전자인 gag, pol 및 env를 코딩하는 플라스미드를 직접 형질감염시킬 수 있다. 그 후, 상기 세포는 대상 유전자를 포함하는 벡터 플라스미드로 형질감염된다. 제조된 세포는 배양 배지로 레트로바이러스 벡터를 방출한다.
LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 폴리뉴클레오티드의 다른 표적화 전달 시스템은 콜로이드성 분산 시스템이다. 콜로이드성 분산 시스템은 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미세구, 비드, 및 수중유 유제를 포함하는 지질-기초 분산계, 마이셀, 혼성 마이셀, 및 리포좀을 포함한다. 본 발명의 바람직한 콜로이드 시스템은 리포좀이다. 리포좀은 시험관내 및 생체내 전달 운반체로 유용한 인공 막 운반체이다. RNA, DNA 및 완전한 비리온은 수성 내부로 캡슐화되어 생물학적 활성 형태로 세포에 전달될 수 있다(예컨대, Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981 참조). 리포좀 운반체를 이용한 효과적인 유전자 전달 방법이 당 분야에 공지되어 있으며, 예컨대, Mannino, et al., Biotechniques, 6:682, 1988을 참조한다. 리포좀 조성물은 통상 인지질과 일반적으로 스테로이드, 특히 콜레스테롤과의 조합물이다. 그외 인지질 또는 지질도 사용할 수 있다. 리포좀의 생리적 특성은 pH, 이온 세기, 및 이가 양이온의 존재에 의해 결정된다.
리포좀 제조에 유용한 지질의 예는 포스페티딜글리세롤, 포스페티딜콜린, 포스페티딜세린, 포스페티딜에탄올아민, 스핀고리피드, 세레브로사이드 및 강글리오사이드와 같은 포스페티딜 화합물을 포함한다. 인지질의 예는 에그 포스페티딜콜린, 디팔미토일포스페티딜콜린, 및 디스테아로일포스페티딜콜린을 포함한다. 또한 예를 들어, 기관-특이적, 세포-특이적, 및 소기관-특이적 리포좀의 표적화가 가능하며, 당해 분야에 공지되어 있다.
당해 분야의 당업자는 개체를 치료하는데 필요한 양을 결정할 수 있다. 투여 계획은 예를 들어, 본 발명의 대상 화합물의 활성을 변화시키는 다양한 인자, AMD의 중증도 또는 상태, 투여 경로, 및 연령, 체중 및 키와 같은 개체에 특별한 특성을 고려하여, 개체마다 결정되는 것으로 이해된다. 당업자는 또한 개체를 치료하는데 필요한 투여량을 정할 수 있다. 일 예에서, 투여량은 개체 체중의 약 1.0 ng/kg 내지 약 100 mg/kg일 수 있다. 조성물에 따라, 투여량은 연속적으로 또는 주기적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 1회 이상으로 분리 투여될 수 있다. 특정 조성물의 수회 투약 간격은 당업자에 의해 과도한 시험 없이 결정될 수 있다. 예를 들어, 화합물은 매시간, 매일, 매주, 매달, 매년(예컨대, 시간-방출 형태) 또는 1회 전달될 수 있다. 본 명세서에 사용된, 용어 개체 또는 개인은 AMD에 이환될 수 있는 임의의 동물을 의미한다. 개체는 인간, 영장류, 말, 조류, 소, 돼지, 개, 고양이, 마우스, 래트, 기니아 피그, 흰족제비, 및 토끼를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에 기재된 방법에 사용된 시료는, DNA 또는 RNA를 얻기에 충분한 눈, 귀, 코, 이, 혀, 표피, 상피, 혈액, 누액, 타액, 점액, 요도관, 뇨, 근육, 연골, 피부, 또는 기타 다른 조직 또는 체액을 포함할 수 있다.
시료는 충분히 처리하여, 시료 중에 존재하는 DNA 또는 RNA를 본 명세서에 기재된 방법으로 시험하는데 이용가능하도록 만들어져야 한다. 예를 들어, 시료 유래 DNA가 증폭 또는 다른 폴리뉴클레오티드와의 혼성화에 이용가능하도록, 시료가 처리될 수 있다. 처리된 시료는 이용가능한 DNA 또는 RNA가 다른 세포성 물질로부터 정제되지 않은 조 세포 용혈물일 수 있다. 대안적으로, 천연 재료에 존재하는 하나 이상의 오염물로부터 이용가능한 DNA 또는 RNA를 분리하기 위해, 시료를 처리할 수 있다. DNA 또는 RNA를 본 명세서에 기재된 방법으로 시험하는데 이용가능하도록 만드는 당해 분야에 공지된 임의의 수단에 의해, 시료가 처리될 수 있다. 시료의 처리 방법은 세포를 용해하거나 및/또는 세포 및 세포 용혈물을 정제하는 기계적, 화학적, 또는 분자적 수단을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. 처리 방법은 예를 들어, 이온-교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 초여과, 전기영동, 및 폴리펩티드의 특정 에피토프에 특이적인 항체를 이용한 면역친화성 정제 방법을 포함할 수 있다.
키트
또한, 본 발명은, 키트 예컨대, 치료 목적의 키트 또는 개체 유래 시료에서 변이 LOC387715, SYNPR 및 PDGFC 유전자 검출용 키트를 제공한다. 일 예에서, 키트는 엄격 조건하에서 인간 AMD 발병과 관련있는 LOC387715, SYNPR 또는 PDGFC 유전자 변이부위에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 프로브가 미리 결정된 양으로 존재하는 하나 이상의 용기 수단을 포함한다. 다른 예에서, 키트는 엄격 조건하에서 인간 AMD 발병과 관련있는 LOC387715, SYNPR 또는 PDGFC 유전자 변이부위의 한 쪽에 인접하게 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 프라이머가 미리 결정된 양으로 존재하는 하나 이상의 용기 수단을 포함한다. 추가적 예에서, 엄격 조건하에서 인간 AMD 발병과 관련있는 LOC387715, SYNPR 또는 PDGFC 유전자 변이부위의 다른 한 쪽에 혼성화하는 제2 폴리뉴클레오티드 프라이머가 미리 결정된 양으로 제공된다. 키트는 LOC387715의 변이부위와 혼성화하는 하나 이상의 프로브나 프라이머; SYNPR에 혼성화하는 하나 이상의 프로브나 프라이머; 및 PDGFC에 혼성화하는 하나 이상의 프로브나 프라이머와 같이, 하나 이상의 프로브 또는 프라이머를 포함할 수 있다. 키트는 부가적으로 AMD와 관련있는 CFH의 변이부위에 혼성화하는 하나 이상의 프로브나 프라이머 및/또는 대상 변이부위를 포함하지 않는 대응되는 유전자(예, 대조 유전자 또는 기준 유전자) 하나 이상에 혼성화하는 하나 이상의 프로브 또는 프라이머를 포함할 수 있다. 키트는 샘플에서 LOC387715, SYNPR 또는 PDGFC 검출시 치료 또는 진단 키트의 사용에 대한 라벨 및/또는 설명서를 더 포함한다. 또한, 키트는 비제한적으로 아이스, 드라이 아이스, 스티로폼, 기포제, 플라스틱, 셀로판, 수축 포장, 버블 랩, 종이, 보드지, 땅콩 전분, 꼬인 끈, 금속 클립, 금속 캔, 드라이에라이트(drierite), 유리 및 고무와 같은 포장 물질(예를 들어 www.papermart.com.로부터 입수가능한 제품 참조)을 포함할 수도 있다.
본 방법의 실시는 별도로 지시되어 있지 않은 한, 당해 분야에 속하는 세포 생물학, 세포 배양학, 분자 생물학, 형질전환 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학에 관한 통상의 기술을 사용할 것이다. 상기 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예로, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (2001); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. U.S. Patent No: 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N. Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemmical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV(D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1986)을 참조할 수 있다.
AMD 사례 96건과 AMD가 아닌 대조군 사례 50건으로부터 취한 게놈-와이드 SNP 유전자형 데이타를 분석하여, LOC387715에서의 단독 관련성과 관련있어 보이는 다른 유전자 좌를 확인하였다.
하기 방법과 재료는 본원의 연구에 이용하였다.
일배체형(Haplotype) 분석. 10q26에서의 일배체형을 확인하기 위해, 출원인은 디폴트 파라미터의 SNPHAP 버전 1.3을 사용하였다. 일배체형 추론은 오류가 있어, 출원인은 PHASE version 2.1.1을 이용하여 동일한 영역에 대한 일배체형을 확인하였다. 2가지 프로그램은 일배체형을 추정하기 위해 상이한 접근 방법을 이용 하며, 따라서 아마 다른 오류에 빠질 수 있다. 2가지 프로그램으로 ARREDS 데이타로 동일한 결과가 나타났으며, 이는 일배체형 평가가 정확함을 시사한다.
상호작용에 대한 테스트. 100,000개 이상의 SNP가 포함된 대규모의 데이타로부터 상호작용에 대한 분석을 2 단계로 적절하게 수행할 수 있다: 통계적으로 유의한 조인트 효과가 있는 마커 선별 및 선별 마커를 모델링하여 효과 정도를 정량화하는 다계(10). 1단계 과정을 수행한 다음, 통상적인(로지스틱) 회귀 분석을 2 단계에서 수행할 수 있다.
단순한 2 유전자 좌의 연관성 테스트는 사례와 대조군 간에 9 2 유전자 좌의 유전자형 빈도를 비교하는 것을 포함한다. 유의성 있는 차이는 강세(epistasis) 또는 주 유전자 좌 효과(major locus effect)를 의미할 수 있다. 특히 상호작용에 초점을 맞추기 위해, 출원인은 먼저 2-유전자 좌 유전자형을 2 또는 3개의 클래스로 그룹화하였고(각각 1, 2 또는 1, 2, 3으로 번호를 매김), 사례와 대조군 사이에 클래스 빈도 차이를 조사하였다(표 1). Cockerham의 partitioning of epistatic variance (11)을 반영한 4가지 상이한 분류 체계(타입 I-IV)를 이용하였다. 각 체계에서, A 및 a는 유전자 좌 1의 대립유전자(후술한 바와 같이 항상 출원인 데이타에서 LOC387715 일배체형을 기준으로 함)이고, B 및 b는 유전자 좌 2의 대립유전자(항상 출원인 데이타에서 SNP)이다. 클래스는 표 1에 규정되어 있다.
테스트할 각 유전자 좌 쌍에서, 타입 I, II, III 및 IV 상호작용에 대해 4번의 독립적인 테스트를 수행하였다. 각 테스트에서, 각각의 2-유전자좌 유전자형은 표 1에 나타낸 하나의 표에 2 또는 3 카테고리로 기록하였다. 다음으로 유전자형 클래스 카운트를 사례 및 대조군간에 비교하였다. 통계적 유의성은 2(타입 I-III) 또는 1(타입 I) 자유도로 Pearson χ2 테스트를 이용하여 평가하였다. 다중 테스트는 116204 SNPs * 4 = 464816 총 테스트에 대해 Bonferroni correction을 이용하여 보정하였다.
발현 분석. 인간의 망막, 태반, 신장 및 간 시료를 NDRI(National Disease Research Interchange)로부터 수득하였다. 천연 인간 RPE와 배양한 인간 RPE는 각각 Dr. Bret Hughes 및 Dr. Piyoush Kothary로부터 제공받았다.
총 RNA를 TRIZOL(Invitrogen)을 이용하여 분리하였다. 올리고-dT로 프라이밍한 다음 역전사하여(www.invitrogen.com), 총 RNA 2.5 mg으로부터 제1 가닥 cDNA를 만들었다. 총 RNA 조제물에 존재되는 게놈 DNA로부터 증폭되는 것을 방지하기 위해,인트론을 메우는(spanning) 프라이머를 Primer3 소프트웨어(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)를 이용하여 제작하였다. PCR 반응은 표준 조건으로 설정하였다. 예상되는 산물의 크기는 PDFGC는 300 bp, SYNPR는 250 bp이고 LOC387715는 375 bp이다. 사용한 프라이머는 다음과 같다:
PDGFC-F 5'-GCTGCACACCTCGTAACTTCT-S' (서열번호 1)
PDGFC-R 5'-GATGCGGCTATCCTCCTGT-S' (서열번호 2)
SYNPR-F 5'-AAACACTTCTGTGGTCTTTGGA-S' (서열번호 3)
SYNPR-R 5'-AGTGGGGCCAGTAGGCTGT-S' (서열번호 4)
LOC387715-F 5'-TCCCAGCTGCTAAAATCCAC-S' (서열번호 5)
LOC387715-R 5'-GCTGCACAGAGCAGAAGATG-B' (서열번호 6)
조직 준비. 정상적인 공여 안구를 PBS(phosphate buffer saline) 중의 4% 파라포름알데하이드(EM Grade, Polysciences, Warrington, PA)에 6시간동안 고정하고, 동결-보호한 다음, 최적의 커팅 온도 화합물(OCT; Miles Laboratory, Elkhart, IN)로 포매하였다. 동결된 망막 조직을 저온유지장치(Leica microsystem, Bannockburn, IL)에서 8 내지 10 ㎛으로 자르고, 슬라이드(Superfrost/Plus; Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) 위에 두었다. 모든 인간 안구는 공여자에게 설명하여 동의를 받아 수득하였으며, 인간 눈에 대한 연구는 헬싱키 및 IRB(institutional review board) 선언에 따라 수행하였다.
면역형광 검경. 망막 섹션을 30분간 IC 완충액(0.2% Tween-20, 0.1% 소ㄷ듐 아지드를 포함하는 PBS)에 희석한 5% 정상 염소 혈청(Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)으로 블록킹하고, 염색 완충액(IC 완충액 + 1% 정상 염소 혈청)에 1: 50으로 희석한 토끼 항-랫 시냄토포린 항혈청(SYSY, Gottingen, Germany)과 함께 실온에서 1시간동안 인큐베이션하였다. 섹션은 IC 완충액으로 3회 헹구고, 핵 염료인 4'1 6'-다이아미노-2-페닐인돌(DAPI; 1 μg/mL) 및 Alexa-488 염소 항-토끼 항체(Molecular Probes, Eugene, OR)의 염료 완충액 중의 1:250 희석액과 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. IC 완충액으로 반복하여 헹군 다음, 섹션을 마운팅 매질(Gel Mount; Biomeda, Foster City, CA)로 덮고 커버슬라이드를 덮었다. 대조군의 경우, 동일 농도의 항-시냅토포린 항체를 시냅토포린 대조군 펩티드(SYSY, Gottingen, Germany)와 함께 1시간 동안 미리 인큐베이션하였다. 다음으로, 상기에 설명한 바와 같이 미리 처리한 항체를 이용하여 조직 섹션을 염색하였다. 표본은 레이커 스캐닝 공초점 현미경(model SP2; Leica Microsystems, Exton, PA)에서 분석하였다. 면역표지된 섹션과 음성 대조군 섹션은 동일한 스캐닝 조건하에서 영상을 촬영하였다. 영상은 포토샵(Adobe Systems, San Jose, CA)으로 처리하였다.
결과
부분적으로는, 공개된 2가지 보고서에 비해 사례 그룹에서 위험 대립유전자의 보다 낮은 빈도로 인해, SNP rs10490924 그 자체는 AREDS 데이타세트에서 겨우 통계적으로 유의하였다(대립유전자 및 유전자형의 명목상의 p-값은 0.04임; 표 2). 이러한 빈도 차이는 이들 연구에서 AMD에 대한 상이한 정의로 인한 것임에 틀림없다. 본원의 연구에서, 크기가 125 ㎛ 보다 큰 드루센(drusen)을 가지는 것이 개체를 사례로 판단하는데 필수적인 것으로 하였지만(1), 다른 실험들에서는 색소 변화, 신생혈관형성 또는 지도형 위축(geographic atrophy)을 AMD 진단에 충분한 것으로 보았다(8, 9). 이들 관찰 결과와 출원인의 데이타에 대한 추가적인 분석은, 질병 위험성에 함께 영향을 위치는 SNP rs10490924와 협력하여 작용하는 다른 변이체의 존재를 나타내었다. 이를 더욱 조사하기 위해, rs10490924 주변 SNP 4개 세트를 한정하여, FGT(four-gamete test)를 이용하여 측면 마커와의 선조 재조합(ancestral recombination)의 증거를 확인하였다. 상기 4개의 SNP는 약 500개의 뉴클레오티드를 포괄한다. 시료의 모든 염색체에서, 16가지의 가능한 일배체형들 중 4가지가 확인되었다. 2가지의 일배체형은 "위험" 일배체형(N2 및 N3)이고, 다 른 2가지는 "부-위험" 일배체형(N1 및 N4; 표 3)이다. 2가지 위험 일배체형은 SNP rs2736911 및 rs10490924에 의해 테깅된다. "위험" 및 "무-위험" 일배체형 빈도 차이는 사례군 : 대조군에서 통계적으로 유의하였다(표 2).
각 개체에 대한 확인된 일배체형을 이용하여 새로운 "SNP"를 규명하였다. 이 SNP에서, 대립유전자 "A"는 일배체형 N1 또는 N4를 의미하며, 대립유전자 "B"는 일배체형 N2 또는 N3을 의미한다. 이 "SNP"에서 개체의 유전자형은 상기 개체에서 2개의 염색체의 일배체형을 기초로 배정하였다. 이원식 상호작용 테스트를 수행하여, 사례군과 대조군에서의 상기 "SNP"(본원에서는 10q26Hap라 함) 및 다른 모든 SNP 간의 차별적인 상호작용을 게놈-와이드 연구로 조사하였다. 엄격한 Bonferroni 역치 p < 0.05/(4 x 105)를 이용하여, 출원인은 2가지 유의한 결과(Pearson χ2 테스트; 표 4에서 불확실한 표)를 얻었으며, 나중에 다른 집단 코호트에서 재현되었다(하기 참조). AMD와 관련있는 것으로 기존에 확인된 CH 지원자들에서는 2가지 SNP간의 유의하 상호작용은 확인되지 않았다. Y402H의 경우, 최상의 상호작용은 비보정 P-값이 0.093이었다. rs380390의 경우, 최상의 상호작용은 비보정 P-값이 0.11이었다. 이는, Bonferroni 역치에서 유의한 상호작용은 참일 수 있으며 추가적인 조사가 필요하다.
이러한 상호작용 중 한가지는 염색체 3pl4.2 상의 SNP rs10510899와 10q26Hap 상의 SNP rs10510899 간의 상호작용이며, 두번째는 염색체 4q32.1 및 10q26Hap 상의 SNP rs997955 간의 상호작용이다. SNP rs10510899와 rs997955는 각 각 시냅토포린(SYNPR)과 혈소판 유래 성장인자(PDGFC)의 인트론내에 있다. 독자적으로, 이들 SNP들은 지금까지 연구들에서 AMD와 단일-유전자 좌 연관성은 보이지 않았다. 특히, 이들 2가지 SNP는 최근 AMD 연관 연구의 메타-분석(2)에서 확인된 상위에 랭크된 6가지 영역들중 2가지 영역내에 위치되어 있다. 상호작용에 대한 본 연구에서 가설에 한정되지 않은 방식으로 전체 게놈을 스캐닝하였지만, Bonferroni 역치에서 유의한 겨우 2가지 SNP만이 이전의 연관 연구를 토대로 AMD에 연류된 것으로 가설한 영역에 위치되어 있었다. 실험에서, 이들 4가지 유전자(CFH, LOC387715, SYNPR 및 PDGFC)는 주된 연관 피크(major linkage peak)들 중 4개에 속하였고, 이들간의 상호작용이 암시되었다(12).
본원에 게시된 데이타로 전반적인 AMD 위험도를 추정하였다. 주어진 개체에서, CFH의 402 위치가 히스티딘인 대립유전자 수와 10q26에서 위험 일배체형의 수를 합하였다. 만약 위험한 개체가 2 이상의 합을 가진 개체로 정의되었다면, 사례군은 82%가 위험한 것으로 분류되지만 대조군은 48%가 위험한 것으로 분류될 수 있다. 대신, 위험도는 4개의 개별 유전자 좌에서 5개의 SNP들의 유전자형을 토대로 정의되었다. 총체적인 유전적 위험도는 3가지 독립적인 위험 요인들의 합이다: CFH, SYNPR에서 10q26Hap와 rs10510899의 상호작용 및 PDGFC에서 10q26Hap와 rs997955의 상호작용. 각 위험 요인에 대한 가능성 있는 3가지 유전자형 또는 유전자형 클래스를 0(최저 위험도) 내지 2(최고 위험도)의 등급으로 점수를 매겼다. 이 점수의 합이 총체적인 위험도 값이다. 총체적인 위험도 값이 3 이상인 개체는 "위험"한 것으로 감주하였고, 2 이하인 개체는 "무-위험"으로 간주하였다(표 2). 이러한 분류를 통해, 사례군의 81%는 위험한 상태였지만 대조군은 36%에 불과하였다. 이러한 유전자 네트워크 효과에 대한 집단 기여 위험도(population attributable risk, PAR)은 71%로 추산되었다(표 2).
이러한 상호작용은 대게 데이타로부터 유래된 것이므로, 지원자의 데이타가 유전자 상호작용에 대한 통계 모델에 과적합(over-fitting )하여 위양성 가능성이 있다. 이것이 우연인지 또는 실제 연관성인지를 분석하기 위한 최선의 방법은, 사례군과 대조군 개체의 독립적인 이차 코호트로 유전자형이 확인 SNP를 재현하는 것이다. DNA는 부모와 미시간 대학에 수집된 대조군으로부터 구하였다(6). 초기 AREDS 코호트에서, 모든 개체들은 집단 계층화로 인한 위양성일 가능성을 축소시키기 위해 유럽인 후손이었다. 이러한 사례군 및 대조군의 독립적인 그룹들에서, SNP rs10490924가 AMD 위험도와 강력하고 유의하게 관련있었다(표 2). 사례군에서 단일 SNP에 대해서 관찰된 위험 대립유전자 빈도는 AREDS 샘플에서 관찰된 결과와는 다르지만 이전의 두가지 연구들의 결과와는 유사하였다. 이러한 차이는, 미시간 사례 코호트가 대형 드루센(직경이 >125 ㎛임)이 없는 지도형 위축 및/또는 신생혈관형성을 보이는 개체를 포함하기 때문이거나, 2가지 연구에서 환자의 유전적 배경에서의 미묘한 차이 때문이거나, 및/또는 미시간 샘플은 가족 사례가 많기 때문에, 생길 수 있다.
AREDS 코호트(표 2; 표 4에서 불확실 표)에서 확인된 2가지 상호작용이 있는 것처럼, 10q26에서 2가지 클래스의 일배체형은 AMD와 유의하게 관련있는 것으로 추가적인 분석으로 확인되었다. 일부 경우들에서, 동일한 위험 인자에 대한 교차 비(odds ratio)는 2가지 코호트에서 매우 달랐다. 이는 아마도 AREDS 코호트의 샘플 크기가 작기 때문이며, 상기 코호트에 대한 큰 신뢰 구간으로 나타난다. 이들 위험 요인들에 대한 교차비를 정확하게 산출하기 위해서는 큰 코호트를 이용한 추가적인 연구가 필요할 것이다. 그러나, 보고된 상호작용들 모두 비교적 작은 AREDS 코호트에서 통계적으로 유의성이 있으며, 미시간 코호트에서 독립적으로 재현되어, 출원인들은 이것이 생물학적으로 중요한 상호작용인 것으로 결론내렸다. 동일한 위험 정의(3개 이상의 위험 인자)를 이용하여, 사례군의 63%가 위험하고 대조군은 32%가 위험한 것으로 관찰하였다(표 2). 미시간 샘플의 경우, PAR 추산값은 55%였다. AREDS 연구에서의 극단적인 유전자형은 2종의 샘플들간의 PAR 불일치성을 설명해줄 수도 있다.
게놈에서 공통적인 SNP가 겨우 10,000,000만개가 유전자형이 확인되었음을 감안하면, SYNPR 및 PDGFC에서 2가지 SNP는 아마도 "테그(tag)" SNP일 것이며, 기능적 돌연변이는 게놈에서 근처에 위치한 다른 변이이다. 기능적 돌연변이를 발견하기 위해, 유타내 중앙 및 북유럽 가계 개체 세트에 대한 국제 HapMap 프로젝트(13)의 유전자형 데이타를 조사하였다. SNP rs10510899는 연관 불평형(linkage disequilibrium (LD, 짝간(pairwise) D' 값으로 측정)이었고 SNP가 미치는 범위는 약 50 kb이다. 이 영역은 주로 SYNPR의 인트론 서열과 미확인된 변이가 있는 하나의 코팅 엑손으로 이루어져 있다. 유전자형을 확인한 100,000 세트 중에서 단지 2개의 SNP만 이 영역에 해당되었다. 이들중 어느 것도 각각 AMD와 관련있진 않았지만, 이들은 10q26 일배체형과의 상호작용에 연관성을 보였다. rs10510899와의 상 호작용에 대한 증거는 단지 우리의 엄격한 Bonferroni 역치를 초과한다. 미시간 샘플에서, rs10510899 근처 3종의 추가적인 SNP를 유전자형을 확인하여, 이들도 10q26 일배체형과 상호작용하는지를 살펴보았다. 오로지 rs6796563 하나만 rs10510899 보다 조금 강한 상호작용을 보였다. 이 SNP는 rs10510899와 동일한 인트론ㄴ내에 있으며, rs10510899(D'=0.37 r2=0.05)와 약한 연관 불평형 상태에 있다.
대조적으로, SNP rs997955는 약 225 kb를 감당하는 매우 많은 수의 SNP와 LD 상태이다. 이 영역은 PDGFC의 인트론 서열, PDGFC의 수개의 엑손 서열 및 PDGFC 유전자의 하류 영역을 포함하지만, 그외 공지된 전사되는 임의 서열과는 중첩되지 않는다. 유전자형을 확인한 100,000개 중에서 25개가 이 영역에서 맵핑되었다. 어느 것도 AMD와 독립적으로 관련있진 않았지만, 2개는 10q26 일배체형과 상호작용을 보였다. 이들 중, 엄격한 역치를 초과하는 상호작용에 대한 증거는 rs997955 뿐이었다. 미시간 샘플에서, rs997955 근처의 추가적인 4개의 SNP에서 유전자형을 확인하였다. 이들중 어느 것도 rs997955 보다 강한 상호작용을 보이진 않았다. 따라서, AMD와 관련있는 기능적 SNP는 SYNPR 및 PDGFC 유전자에 있는 것으로 보인다.
상호작용하는 3종의 유전자(LOC387715, SYNPR 및 PDGFC)가 영향을 받은 타겟 조직(들)에서 발현되는 지를 보기 위해, 인간 눈 색소 상피(RPE), 망막 및 그외 조직의 총 RNA를 RT-PCR 분석에 이용하였다. SYNPR 전사체는 천연 인간 RPE에서 낮은 수준으로 검출되었고 망막과 태반에서는 강하게 발현되었다. PDGFC는 천연 인 간 RPE와 배양한 RPE 두 곳 뿐만 아니라 망막, 태반 및 간에서도 높은 수준으로 발현되었다. LOC387715는 망막과 배양한 RPE에서만 약하게 발현되었다. 시냅토포린에 대한 상업적으로 시판되는 항체를 이용한 눈 조직에서의 단백질 발현 조사를 또한 수행하였다. 내부 망상층은 시냅토포린 항체에 대해 가장 강하게 표지되는 것으로 나타났으며, 외부 망상층도 표지되긴 하였지만 신호가 약하였다. 이러한 결과는 이전에 보고된 토끼 망막에서의 시냅토포린의 국지성(4)과 일치된다. 프리시냅스 말단(presynaptic terminal)인 수평 세포에서의 시냅토포린의 분포는 아마 시냅스 소포(synaptic vesicle) 분비에 관여하는 것으로 보인다. 이들 세포는 이극성 뉴런의 길항제성 센터-주변 반응(antagonistic center-surround response)에 기여하는 저해 정보를 제공하며, 이러한 정보의 효과 변이는 비정상적인 수준의 광수용기 시냅스 활성을 이끌어, 결국 세포 손상을 유도한다. PDGFC는 혈관 정지(vascular quiescence) 및 눈과 다른 조직의 생장에 밀접하게 관련된 분자인, 기질 메탈로프로테네이즈 및 이의 조직 저해자를 통제하는 조절 케스케이드의 일부분이다(15). LOC387715와 2종의 아마도 무관한 유전자 - SYNPR 및 PDGFC -와의 상호작용은 망막 또는 RPE에서의 공통적인 조절 기능을 시사한다. 예비 결과는, 정상적인 망막의 내부 핵 층과 신경절 세포에서의 PDGFC의 분포를 나타내며(데이타 미기재), SYNPR나 PDGFC는 CFH 양성 드루센에서는 검출되지 않는 것으로 나타났다.
본 발명에 대한 전반적인 이해를 제공하기 위해, AMD 발병 위험이 있는 개체를 식별하거나 식별을 도울 뿐만 아니라 AMD 진단 또는 진단을 돕기 위한 조성물 및 방법을 포함한 특정한 예시적인 구현예를 기재한다. 그러나, 당업자라면 본원 에 기재된 조성물 및 방법은 지정된 적용에 적합하도록 개조 및 변형될 수 있으며, 그러한 기타 부가 및 변형이 본 발명의 범위내에 포함됨을 이해할 것이다.
표 1: 4가지 강세(epistasis) 클래스의 규정
타입 I - 상가(additive) x 상가 상호작용 A/A A/a a/a B/B 3 2 1 B/b 2 2 2 b/b 1 2 3 타입 II - 상가 x 우성(dominant) 상호작용 A/A A/a a/a B/B 3 1 3 B/b 2 2 2 b/b 1 3 1 타입 III - 우성 x 상가 상호작용 A/A A/a a/a B/B 3 2 1 B/b 1 2 3 b/b 3 2 1 타입 IV - 우성 x 우성 상호작용 A/A A/a a/a B/B 1 2 1 B/b 2 1 2 b/b 1 2 1
표 2: 연관성 증거 및 교차비(OR). OR를 계산하기 위한 위험 인자는 χ2 테스트로부터 2개의 클래스 조합일 수 있음을 유념하라. 집단 A는 AREDS 샘플이고, M은 미시간 샘플이다.
Figure 112008033628464-PCT00001
표 3: re10490924 주변 일배체형. 일배체형이 관찰된 이들 292에 대한 χ2 통계치는 12.5이다. 자유도는 3일 때 이는 p 값 0.006으로 해석된다.
Figure 112008033628464-PCT00002
표 4: 10q26Hap; rs10510899; 및 rs997955로 관찰한 유전자형 갯수. 갯수는 9쌍의 가능성 있는 유전자형 각각에 대해 나타낸다.
Figure 112008033628464-PCT00003
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Claims (50)

  1. 인간에서 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 변이 유전자를 개체 샘플에서 검출하기 위한 분리된 폴리뉴클레오티드로서,
    (a) 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 LOC387715 유전자의 변이를 특이적으로 검출하는 핵산 분자;
    (b) 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 SYNPR 유전자의 변이를 특이적으로 검출하는 핵산 분자; 및
    (c) 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 PDGFC 유전자의 변이를 특이적으로 검출하는 핵산 분자
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 분자를 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 (a) 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 LOC387715 유전자의 변이, (b) 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 SYNPR 유전자의 변이 및 (c) 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 PDGFC 유전자의 변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 변이에 엄격 조건하에서 혼성화하는 프로브인 분리된 폴리뉴클레오티드.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 변이는 LOC387715 단백질의 69번 위치에 알라닌 이외 의 다른 아미노산을 코딩하는 것인 분리된 폴리뉴클레오티드.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 변이는 LOC387715 단백질의 69번 위치에 세린을 코딩하는 것인 분리된 폴리뉴클레오티드.
  5. 제 2항에 있어서, 상기 프로브는 DNA 프로브인 분리된 폴리뉴클레오티드.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 프로브는 약 8 내지 약 500개의 뉴클레오티드 길이인 분리된 폴리뉴클레오티드.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 프로브는 약 10 내지 약 250개의 뉴클레오티드 길이인 분리된 폴리뉴클레오티드.
  8. 제 5항에 있어서, 상기 프로브는 하나 또는 그 이상의 비천연 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드인 분리된 폴리뉴클레오티드.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 비천연 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드는 방사성으로 표지된 뉴클레오티드, 형광물질로 표지된 뉴클레오티드 또는 화학적으로 표지된 뉴클레오티드인 분리된 폴리뉴클레오티드.
  10. 엄격 조건하에서 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 유전자의 변이부위에 인접하여 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 프라이머로서,
    상기 변이부위는
    (a) 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 LOC387715 유전자의 변이부위;
    (b) 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 SYNPR 유전자의 변이부위; 및
    (c) 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 PDGFC 유전자의 변이부위
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리뉴클레오티드 프라이머.
  11. 제 10항에 있어서, 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 유전자의 변이부위에 바로 인접하여 혼성화하며,
    상기 변이부위는
    (a) 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 LOC387715 유전자의 변이부위;
    (b) 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 SYNPR 유전자의 변이부위; 및
    (c) 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 PDGFC 유전자의 변이부위
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리뉴클레오티드 프라이머.
  12. 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 유전자의 변이부위를 특이적으로 검출하는 한 쌍의 폴리뉴클레오티드 프라이머로서,
    상기 변이부위는
    (a) 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 LOC387715 유전자의 변이부위;
    (b) 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 SYNPR 유전자의 변이부위; 및
    (c) 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 PDGFC 유전자의 변이부위
    로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    제1 폴리뉴클레오티드 프라이머는 상기 변이부위의 한 쪽에 혼성화하며, 제2 폴리뉴클레오티드 프라이머는 상기 변이부위의 다른 한 쪽에 혼성화하는 것인 한 쌍의 폴리뉴클레오티드 프라이머.
  13. 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 유전자의 변이부위를 포함하는 DNA 영역에 혼성화하는 한 쌍의 폴리뉴클레오티드 프라이머로서,
    상기 변이부위는
    (a) 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 LOC387715 유전자의 변이부위;
    (b) 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 SYNPR 유전자의 변이부위; 및
    (c) 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 PDGFC 유전자의 변이부위
    로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    상기 제1 폴리뉴클레오티드 프라이머들은 상기 변이부위 근처의 혼성화된 프라이머의 말단들이 약 20 내지 약 10,000개의 뉴클레오티드 길이 간격으로 떨어져 있도록 상기 영역에 혼성화하는 것인 한 쌍의 폴리뉴클레오티드 프라이머.
  14. 제 12항에 있어서, 상기 변이부위는 LOC387715 단백질의 69번 위치에 알라닌 이외의 다른 아미노산을 코딩하는 것인 한쌍의 폴리뉴클레오티드 프라이머.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 변이부위는 LOC387715 단백질의 69번 위치에 세린을 코딩하는 것인 한쌍의 폴리뉴클레오티드 프라이머.
  16. 제 12항에 있어서, 상기 프라이머는 DNA 프라이머인 한쌍의 폴리뉴클레오티드 프라이머.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 각 프라이머는 약 8 내지 약 500개의 뉴클레오티드 길이인 한쌍의 폴리뉴클레오티드 프라이머.
  18. 제 16항에 있어서, 상기 각 프라이머는 약 10 내지 약 250개의 뉴클레오티드 길이인 한쌍의 폴리뉴클레오티드 프라이머.
  19. 제 16항에 있어서, 상기 프라이머는 하나 또는 그 이상의 비천연 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 것인 한쌍의 폴리뉴클레오티드 프라이머.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 비천연 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드는 방사성으로 표지된 뉴클레오티드 또는 형광물질로 표지된 뉴클레오티드인 한 쌍의 폴리뉴클레오티드 프라이머.
  21. 개체로부터 수득한 샘플에서, 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 LOC387715 유전자의 변이, 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 SYNPR 유전자의 변이 및 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 PDGFC 유전자의 변이를 검출하는 방법으로서,
    (a) 샘플을, (1) 엄격 조건하에서 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 LOC387715 유전자의 변이부위에 혼성화하지만 변이가 없는 LOC387715 유전자에는 혼성화하지 않는 폴리뉴클레오티드 프로브; (2) 엄격 조건하에서 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 SYNPR 유전자의 변이부위에 혼성화하지만 변이가 없는 SYNPR 유전자에는 혼성화하지 않는 폴리뉴클레오티드 프로브; 및 (3) 엄격 조건하에서 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 PDGFC 유전자의 변이부위에 혼성화하지만 변이가 없는 PDGFC 유전자에는 혼성화하지 않는 폴리뉴클레오티드 프로브와 혼합하는 단계; 및
    (b) 혼성화 발생 여부를 결정하여, 상기 (1), (2) 및 (3)의 폴리뉴클레오티드 프로브의 혼성화 발생은 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 LOC387715 유전자의 변이, 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 SYNPR 유전자의 변이 및 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 PDGFC 유전자의 변이가 샘플에 존재함을 나타내는 단계
    를 포함하는 검출 방법.
  22. 개체로부터 수득한 샘플에서, 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 LOC387715 유전자의 변이, 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 SYNPR 유전자의 변이 및 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 PDGFC 유전자의 변이를 검출하는 방법으로서,
    (a) 샘플을, (1) 엄격 조건하에서 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 LOC387715 유전자의 변이부위에 혼성화하지만 변이가 없는 LOC387715 유전자에는 혼성화하지 않는 폴리뉴클레오티드 프로브; (2) 엄격 조건하에서 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 SYNPR 유전자의 변이부위에 혼성화하지만 변이가 없는 SYNPR 유전자에는 혼성화하지 않는 폴리뉴클레오티드 프로브; (3) 엄격 조건하에서 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 PDGFC 유전자의 변이부위에 혼성화하지만 변이가 없는 PDGFC 유전자에는 혼성화하지 않는 폴리뉴클레오티드 프로브와 혼합하는 단계;
    (b) 단계 (a)에서 제조한 혼합물을 엄격한 혼성화 조건하에 두는 단계; 및
    (c) 상기 혼합물에서 이루어진 혼성화를 대조군에서의 혼성화와 비교하는 단계로, 상기 대조군은 (a)와 동일한 샘플 타입으로 (a)의 샘플과 동일하게 처리되며, 상기 폴리펩티드 프로브는 엄격 조건하에서 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 LOC387715 유전자의 변이부위에 결합하지 않는 폴리펩티드 프로브, 인간 의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 SYNPR 유전자의 변이부위에 결합하지 않는 폴리펩티드 프로브 및 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 PDGFC 유전자의 변이부위에 결합하지 않는 폴리펩티드 프로브이고,
    혼합물에서 상기 3종의 폴리펩티드 프로브의 혼성화는 이루어지지만 대조군에서는 혼성화가 이루어지지 않은 것은 노화성 황반 변성과 관련있는 변이 유전자가 샘플에 존재하는 것을 나타내는 것인 혼성화의 비교 단계
    를 포함하는 검출 방법.
  23. 제 22항에 있어서, 혼성화 정도는 단계 (c)에서 측정하는 검출 방법.
  24. 개체로부터 수득한 샘플에서, 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 LOC387715 유전자의 변이, 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 SYNPR 유전자의 변이 및 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 PDGFC 유전자의 변이를 검출하는 방법으로서,
    (a) 샘플의 1차 일부를, (1) 엄격 조건하에서 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 LOC387715 유전자의 변이부위에 혼성화하지만 변이가 없는 LOC387715 유전자에는 혼성화하지 않는 폴리뉴클레오티드 프로브; (2) 엄격 조건하에서 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 SYNPR 유전자의 변이부위에 혼성화하지만 변이가 없는 SYNPR 유전자에는 혼성화하지 않는 폴리뉴클레오티드 프로브; (3) 엄격 조건하에서 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 PDGFC 유전자의 변이부위에 혼성화하지만 변이가 없는 PDGFC 유전자에는 혼성화하지 않는 폴리뉴클레오티드 프로브와 혼합하는 단계;
    (b) 샘플의 2차 일부를 대조군의 혼성화와 혼합하는 단계로, 상기 대조군은 (a)와 동일한 샘플 타입으로 (a)의 샘플과 동일하게 처리되며, 폴리펩티드 프로브는 엄격 조건하에서 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 LOC387715 유전자의 변이부위에 결합하지 않는 폴리펩티드 프로브, 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 SYNPR 유전자의 변이부위에 결합하지 않는 폴리펩티드 프로브 및 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 PDGFC 유전자의 변이부위에 결합하지 않는 폴리펩티드 프로브이고,
    혼합물에서 상기 3종의 폴리펩티드 프로브의 혼성화는 이루어지지만 대조군에서는 혼성화가 이루어지지 않은 것은 노화성 황반 변성과 관련있는 유전자 변이가 샘플에 존재함을 나타내는 것인 샘플의 2차 일부를 대조군의 혼성화와 혼합하는 단계; 및
    (c) 혼성화 발생 여부를 결정하는 단계로,
    상기 1차 일부 중에서 상기 3종의 폴리펩티드는 혼성화되지만 상기 2차 일부 중에서는 혼성화가 이루어지지 않은 것은 노화성 황반 변성과 관련있는 유전자 변이가 샘플에 존재함을 나타내는 것인 혼성화 발생 여부의 결정 단계
    를 포함하는 검출 방법.
  25. 제 21항에 있어서, 상기 변이는 LOC387715 단백질의 69번 위치에 알라닌 이 외의 다른 아미노산을 코딩하는 것인 검출 방법.
  26. 제 25항에 있어서, 상기 변이는 LOC387715 단백질의 69번 위치에 세린을 코딩하는 것인 검출 방법.
  27. 제 21항에 있어서, 상기 샘플은 눈, 귀, 코, 이, 혀, 표피, 상피, 혈액, 누액, 타액, 점액, 요도관, 뇨, 근육, 연골, 피부, 또는 기타 다른 조직 또는 체액인 검출 방법.
  28. 제 21항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 프로브는 DNA 프로브인 검출 방법.
  29. 제 21항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 프로브는 약 8 내지 약 500개의 뉴클레오티드 길이인 검출 방법.
  30. 개체로부터 수득한 샘플에서, 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 LOC387715 유전자의 변이, 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 SYNPR 유전자의 변이 및 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 PDGFC 유전자의 변이를 검출하는 방법으로서,
    (a) 샘플을 3쌍의 폴리뉴클레오티드 프라이머와 혼합하는 단계로,
    (1) 첫번째 쌍에서 제1 폴리뉴클레오티드 프라이머는 LOC387715 유전자 산물의 변이를 코딩하는 DNA의 한 쪽에 혼성화하고 제2 폴리뉴클레오티드 프라이머는 상기 변이를 코딩하는 DNA의 다른 한 쪽에 혼성화하며, (2) 두번째 쌍에서 제1 폴리뉴클레오티드 프라이머는 SYNPR 유전자 산물의 변이를 코딩하는 DNA의 한 쪽에 혼성화하고 제2 폴리뉴클레오티드 프라이머는 상기 변이를 코딩하는 DNA의 다른 한 쪽에 혼성화하며, (3) 세번째 쌍에서 제1 폴리뉴클레오티드 프라이머는 PDGFC 유전자 산물의 변이를 코딩하는 DNA의 한 쪽에 혼성화하고 제2 폴리뉴클레오티드 프라이머는 상기 변이를 코딩하는 DNA의 다른 한 쪽에 혼성화하는 것인단계;
    (b) 샘플에서 DNA를 증폭시켜 증폭된 DNA를 제조하는 단계;
    (c) 증폭된 DNA의 염기서열을 분석하는 단계; 및
    (d) 상기 DNA에서 (1) LOC387715 유전자 산물의 변이를 코딩하는 변이; (2) SYNPR 유전자 산물의 변이를 코딩하는 변이; 및 (3) PDGFC 유전자 산물의 변이를 코딩하는 변이의 존재를 검출되는 단계로,
    상기 3종의 변이의 존재는 LOC387715 변이 유전자, SYNPR 변이 유전자 및 PDGFC 변이 유전자가 샘플에서 검출됨을 나타내는 것인 단계
    를 포함하는 검출 방법.
  31. 노화성 황반 변성 발병 위험성이 있는 개체를 식별하거나 식별을 돕는 방법으로서,
    인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 변이 유전자의 존재에 대해 개체 로부터 수득한 샘플을 검정하는 단계를 포함하며,
    상기 변이 유전자는 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 LOC387715 변이 유전자, 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 SYNPR 변이 유전자 및 (c) 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 PDGFC 변이 유전자이며,
    상기 변이 유전자의 존재는 개체가 노화성 황반 변성으로 진행될 위험이 있음을 나타내는 것인 방법.
  32. 노화성 황반 변성 발병 위험성이 있는 개체를 식별하거나 식별을 돕는 방법으로서,
    (a) 개체로부터 수득한 샘플을, (1) 엄격 조건하에서 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 LOC387715 유전자의 변이부위에 혼성화하지만 변이가 없는 LOC387715 유전자에는 혼성화하지 않는 폴리뉴클레오티드 프로브; (2) 엄격 조건하에서 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 SYNPR 유전자의 변이부위에 혼성화하지만 변이가 없는 SYNPR 유전자에는 혼성화하지 않는 폴리뉴클레오티드 프로브; (3) 엄격 조건하에서 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 PDGFC 유전자의 변이부위에 혼성화하지만 변이가 없는 PDGFC 유전자에는 혼성화하지 않는 폴리뉴클레오티드 프로브와 혼합하는 단계; 및
    (b) 혼성화 발생 여부를 결정하는 단계로서,
    상기 (a)의 (1), (2) 및 (3)의 폴리뉴클레오티드 프로브의 혼성화 발생은 개체가 노화성 황반 변성으로 진행될 위험이 있음을 나타내는 것인 혼성화 발생 여부 의 결정 단계를 포함하는 방법.
  33. 개체의 샘플에서 노화성 황반 변성과 관련있는 유전자 변이를 검출하기 위한 진단 키트로서,
    (a) (1) 엄격 조건하에서 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 LOC387715 유전자의 변이부위에 혼성화는 폴리뉴클레오티드 프로브; (2) 엄격 조건하에서 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 SYNPR 유전자의 변이부위에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 프로브; 및 (3) 엄격 조건하에서 인간의 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 PDGFC 유전자의 변이부위에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 프로브가 있는 하나 이상의 용기 수단; 및
    (b) 샘플에서 변이 유전자 검출에 진단 키트를 사용하기 위한 라벨 및/또는 설명서
    를 포함하는 키트.
  34. 노화성 황반 변성을 앓고 있는 개체를 치료하기 위한 조성물로서,
    (a) 유효량의, (1) 분리되거나 재조합으로 제조된 야생형 LOC387715 폴리펩티드 또는 그 단편; (2) 분리되거나 재조합으로 제조된 야생형 SYNPR 폴리펩티드 또는 그 단편; 및 (3) 분리되거나 재조합으로 제조된 야생형 PDGFC 폴리펩티드 또는 그 단편; 및
    (b) 약제학적으로 허용되는 담체
    를 포함하는 조성물.
  35. 개체에게 제 34항에 따른 조성물을 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 노화성 황반 변성을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법.
  36. 노화성 황반 변성을 앓고 있는 개체를 치료하기 위한 조성물로서,
    (a) 유효량의, (1) LOC387715 폴리펩티드를 코딩하는 분리되거나 재조합으로 제조된 핵산 분자 또는 그 단편; (2) SYNPR 폴리펩티드를 코딩하는 분리되거나 재조합으로 제조된 핵산 분자 또는 그 단편; 및 (3) PDGFC 폴리펩티드를 코딩하는 분리되거나 재조합으로 제조된 핵산 분자 또는 그 단편; 및
    (b) 약제학적으로 허용되는 담체
    를 포함하는 조성물.
  37. 개체에게 제 36항에 따른 조성물을 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 노화성 황반 변성을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법.
  38. 개체 유래의 시료에서, 인간의 노화성 황반 변성의 발병과 관련있는 변이 폴리펩티드를 검출하는 방법으로서,
    상기 변이 폴리펩티드는 LOC387715 변이 폴리펩티드, SYNPR 변이 폴리펩티드 및 PDGFC 변이 폴리펩티드이고,
    (a) 샘플을, 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 LOC387715 변이 폴리펩티드에 결합하는 항체, 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 SYNPR 변이 폴리펩티드에 결합하는 항체 및 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 PDGFC 변이 폴리펩티드에 결합하는 항체와 혼합하는 단계; 및
    (b) 상기 3가지 항체의 결합 여부를 결정하는 단계를 포함하되,
    상기 3가지 항체의 결합은 노화성 황반 변성의 발병과 관련있는 변이 폴리펩티드가 샘플에 존재함을 나타내는 것인 방법.
  39. 노화성 황반 변성을 앓고 있는 개체의 치료 조성물로서,
    (a) 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 LOC387715 변이 유전자 또는 변이 mRNA에 혼성화하는 안티센스 서열을 포함하는 핵산 분자;
    (b) 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 SYNPR 변이 유전자 또는 변이 mRNA에 혼성화하는 안티센스 서열을 포함하는 핵산 분자;
    (c) 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 PDGFC 변이 유전자 또는 변이 mRNA에 혼성화하는 안티센스 서열을 포함하는 핵산 분자; 및
    (d) 약제학적으로 허용되는 담체
    를 포함하는 조성물.
  40. 제 39항에 있어서, 변이 유전자에의 안티센스 서열의 혼성화는 상기 변이 유전자로부터 전사되는 RNA의 양을 감소시키는 것인 조성물.
  41. 제 39항에 있어서, 변이 mRNA에의 안티센스 서열의 혼성화는 상기 변이 mRNA로부터 번역되는 단백질의 양을 감소시키거나/시키며 변이 mRNA의 스플라이싱(splicing)을 변형시키는 것인 조성물.
  42. 개체에 제 39항에 따른 조성물을 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 노화성 황반 변성을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법.
  43. 노화성 황반 변성을 앓고 있는 개체의 치료 조성물로서,
    (a) 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 LOC387715 변이 유전자 또는 변이 mRNA에 혼성화하는, siRNA, miRNA 또는 이들의 전구체를 포함하는 핵산 분자;
    (b) 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 SYNPR 변이 유전자 또는 변이 mRNA에 혼성화하는, siRNA, miRNA 또는 이들의 전구체를 포함하는 핵산 분자;
    (c) 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 PDGFC 변이 유전자 또는 변이 mRNA에 혼성화하는, siRNA, miRNA 또는 이들의 전구체를 포함하는 핵산 분자; 및
    (d) 약제학적으로 허용되는 담체
    를 포함하는 조성물.
  44. 제 43항에 있어서, 변이 유전자에의 siRNA 또는 miRNA 서열의 혼성화는 상기 변이 유전자로부터 전사되는 RNA의 양을 감소시키는 것인 조성물.
  45. 제 43항에 있어서, 변이 mRNA에의 siRNA 또는 miRNA 서열의 혼성화는 상기 변이 mRNA로부터 번역되는 단백질의 양을 감소시키거나/시키며 변이 mRNA의 스플라이싱(splicing)을 변형시키는 것인 조성물.
  46. 개체에 제 43항에 따른 조성물을 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 노화성 황반 변성을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법.
  47. 제 31항에 있어서, 샘플을 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 CFH 변이 유전자의 존재에 대해 검정하는 단계를 더 포함하는 방법.
  48. 제 32항에 있어서, 샘플을 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 CFH 변이 유전자의 존재에 대해 검정하는 단계를 더 포함하는 방법.
  49. 제 33항에 있어서, 엄격 조건하에서 노화성 황반 변성 발병과 관련있는 CFH 변이 유전자에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 프로브를 더 포함하는 진단 키트.
  50. 제 34항에 있어서, 분리되거나 재조합으로 제조된 야생형 CFH 폴리펩티드 또는 그의 단편을 유효량으로 더 포함하는 조성물.
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