KR20080059595A - 어댑터 올리고뉴클레오티드를 사용하는 ｔｌｒ-매개 면역반응의 조절 - Google Patents

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마리온 우르크
외르크 폴머
아서 엠. 크리그
오이겐 울만
베른하르트 오. 놀
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콜리 파마슈티칼 게엠베하
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Abstract

본 발명은 TLR7, TLR8 및 TLR9 리간드와 같은 TLR 리간드의 프로필을 변경시키는 특정 올리고뉴클레오티드의 능력에 관한 것이다.
TLR 리간드, 프로필, 어댑터 올리고뉴클레오티드, 면역 반응, 조절

Description

어댑터 올리고뉴클레오티드를 사용하는 ＴＬＲ-매개 면역 반응의 조절 {MODULATION OF TLR-MEDIATED IMMUNE RESPONSES USING ADAPTOR OLIGONUCLEOTIDES}
관련 출원
본원은 그 전체 내용을 본원에 참고로 포함시킨, 2005년 9월 27일 출원된 미국 특허 가출원 60/720,981 (명칭: "MODULATION OF TLR-MEDIATED IMMUNE RESPONSES USING ADAPTOR OLIGONUCLEOTIDES")을 기초로 한 35 USC §119 하의 우선권을 주장한다.
본 발명은 특정 핵산을 사용한 TLR-매개 면역 반응의 조절에 관한 것이다.
세균 DNA 내의 특정 모티프에 대한 반응은 자연 면역의 중요한 기능이다. 세균 DNA는 오랫동안 포유동물 B 림프구 (B 세포)에 대해 분열촉진성인 것으로 알려졌지만, 포유동물 DNA는 일반적으로 그렇지 않다. 상기 면역 인식이 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는 모티프 상에 중심이 있는 특이적 DNA 서열에 대해 지정된다는 발견은 분자 면역학 연구에 새로운 길을 제시하였다 (Krieg AM et al. (1995) Nature 374:546-9). 소위 CpG DNA의 면역자극 효과는 특정한 바람직한 플랭킹 (flanking) 서열, CpG 모티프의 맥락에서 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는 합성 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN)을 사용하여 재현될 수 있다. CpG-함유 ODN (CpG-ODN)은 면역계의 다양한 종류의 세포에 대해 일차 B 세포를 세포자멸로부터 보호하고, 세포 주기 도입의 촉진, 및 면역 반응을 Th1형 면역 반응, 예를 들어, 인터루킨 6 (IL-6), 인터루킨 12 (IL-12), 감마 인터페론 (IFN-γ)의 유도, 항원-특이적 세포용해성 T 림프구 (CTL)의 활성화, 및 마우스에서 IgG2a의 유도로 편향되게 하는 것을 포함하여 많은 효과를 발휘하는 것으로 보고되었다.
최근에 CpG DNA의 면역조절 효과가 Toll-유사 수용체 9 (TLR9)에 의한 신호전달을 포함하는 것으로 보고되었다. CpG DNA는 서열-비특이적 경로를 통해 세포 내로 내재화되고 엔도좀 구획으로 들어가, 여기에서 TLR9와 서열-특이적 방식으로 상호작용하는 것으로 생각된다. TLR9 신호전달 경로는 특히 NF-κB를 포함하는 많은 면역 기능 관련 유전자의 유도를 일으킨다.
TLR은 병원체 내에 존재하는 특이적 분자 구조 (병원체-연관 분자 패턴 또는 PAMP)를 인식하는 큰 수용체 패밀리이고, 또한 패턴 인식 수용체 (PRR)로 불린다. PRR을 발현하는 면역 세포는 PAMP의 인식 시에 활성화되고, 최적 적응 면역 반응의 발생을 촉발한다. 10개의 상이한 TLR 하위형 (TLR1 내지 TLR1O)으로 이루어지는 PRR이 설명되었다. 상기 TLR은 이중가닥 RNA (TLR3), 지질다당체 (LPS) (TLR4), 세균 플라겔린 (TLR5), 작은 항바이러스 화합물 (TLR7 및 TLR8), 및 세균 DNA 또는 CpG ODN (TLR9)의 인식에 관여하는 것으로 설명되었다 (문헌 [Uhlmann et al. (2003) Curr Opin Drug Discov Devel 6:204-17] 참조) 또한, TLR7 및 TLR8과 상호작용하고 그를 통해 신호전달하는 것으로 생각되는 RNA 분자가 확인되었다 (국제 특허 출원 PCT/US03/10406 참조). 상기 면역자극성 RNA 분자는 적어도 하나의 구 아닌 및 적어도 하나의 우라실을 포함하는 염기 서열을 갖는 것으로 생각된다. 면역자극성 G,U-풍부 RNA는 TLR9에 대해 설명된 바와 같은 CpG 모티프를 요구하지 않는다. 자연에서 발견된 RNA 분자의 상응하는 클래스가 리보좀 RNA (rRNA), 전달 RNA (fRNA), 메신저 RNA (mRNA) 및 바이러스 RNA (vRNA) 내에 존재하는 것으로 생각된다.
면역자극성 CpG DNA의 발견 이후, 면역억제 효과를 갖는 짧은 DNA 서열을 설명하는 많은 보고가 제시되었다. 폴리-G 서열이 면역억제성인 것은 오랫동안 알려져 왔다. PCT 특허 출원 공개 WO 00/14217에서는 억제 모티프 N1N2GN3G (여기서, N1, N2, 및 N3 중 적어도 임의의 2개는 G (구아노신)임)을 함유하는 ODN을 설명한다. 크리그 (Krieg)와 동료들은 자극성 ODN에 의해 유도된 세포자멸 보호 및 세포-주기 도입을 차단시키는, 3 또는 4개의 연속 G를 갖는 일군의 억제성 15-mer ODN을 설명하였다 (Lenert P et al. (2001) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 11:247-56; Stunz LL et al. (2002) Eur J Immunol 32:1212-22; Lenert P et al. (2003) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 13:143-50). 상기 ODN의 면역억제 효과는 CpG-ODN에 특이적이고 세포성 흡수에 대한 단순 경쟁 외의 기전을 포함하는 것으로 보고되었다 (Stunz LL et al. (2002) Eur J Immunol 32:1212-22). 독립적으로, 클린만 (Klinman)과 동료들은 단일 면역억제성 ODN을 보고하였다 (Zeuner RA et al. (2002) Arthritis Rheum 46:2219-24; Yamada H et al. (2002) J Immunol 169:5590-4).
<발명의 개요>
본 발명은 일부 반응을 억제하거나, 다른 반응을 강화시키거나, 또는 이들의 일부 조합을 포함하는 TLR-매개 면역 반응을 조절하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명은 부분적으로 특정 올리고뉴클레오티드가 TLR 리간드의 TLR 신호전달 프로필을 명백하게 변화시킬 수 있다는 발견을 전제로 한다. 따라서, 상기 "어댑터 (adaptor)" 올리고뉴클레오티드는 한 실시태양에 따라 TLR7 리간드를 TLR8 리간드로, 다른 실시태양에 따라 TLR7/8 리간드를 TLR8 리간드로 본질적으로 전환시킬 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 TLR8-매개 면역 반응의 자극을 필요로 하는 대상에게 TLR7/8 리간드 및 어댑터 올리고뉴클레오티드를, TLR8-매개 면역 반응을 자극하기 위해 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함하는, TLR8-매개 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 TLR7-매개 면역 반응을 경험하는 대상에게 어댑터 올리고뉴클레오티드를, TLR7-매개 면역 반응을 TLR8-매개 면역 반응으로 재지정하기 위해 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함하는, TLR7-매개 면역 반응을 TLR8-매개 면역 반응으로 재지정하기 위한 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 TLR7/8 리간드 및 어댑터 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공한다.
한 실시태양에서, TLR7/8 리간드는 TLR7 리간드, 예를 들어 TLR7 특이적 리간드이다. TLR7 리간드는 구아노신 유사체, 예를 들어 비제한적으로 C8-치환 구아 노신일 수 있다. TLR7 리간드는 3M-001일 수 있다. TLR7 리간드는 아데노신계 화합물, 예를 들어 비제한적으로 6-아미노-9-벤질-2-(3-히드록시-프로폭시)-9H-퓨린-8-올, 또는 6-아미노-9-벤질-2-부톡시-9H-퓨린-8-올일 수 있다. TLR7 리간드는 7-데아자-구아노신일 수 있다.
C8-치환 구아노신의 예는 7-알릴-7,8-디히드로-8-옥소-구아노신 (록소리빈), 7-티아-8-옥소구아노신 (이뮤노신, 이사토리빈, ANA245, 7-티아-8-옥소-7,8-디히드로구아노신, 5-아미노-3-(β-D-리보푸라노실)-3H,6H-티아졸[4,5-d]피리미딘-2,7-디온), 8-머캅토구아노신, 8-브로모구아노신, 8-메틸구아노신, 8-옥소-7,8-디히드로구아노신, C8-아릴아미노-2'-데옥시구아노신, C8-프로피닐-구아노신, C8- 및 N7-치환 구아닌 리보뉴클레오시드, 7-메틸-8-옥소구아노신, 8-아미노구아노신, 8-히드록시-2'-데옥시구아노신, 7-데아자-8-치환 구아노신, 및 8-히드록시구아노신을 포함한다. 일부 실시태양에서, C8-치환 구아노신은 록소리빈, 이뮤노신, 또는 7-데아자 구아노신이다.
다른 실시태양에서, TLR7/8 리간드는 TLR8 특이적 리간드를 포함하는 TLR8 리간드이다. TLR8 리간드는 3M-002일 수 있다. 리간드가 TLR8 리간드인 실시태양에서, TLR8-매개 면역 반응은 어댑터 올리고뉴클레오티드의 부재 하에 달성된 면역 반응의 수준보다 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 15배, 20배 이상 향상될 수 있다.
다른 실시태양에서, TLR7/8 리간드는 TLR7 리간드 및 TLR8 리간드이다. 상기 TLR7/8 리간드의 예는 이미다조퀴놀린이다. 이미다조퀴놀린의 예는 이미다조퀴 놀린 아민, 이미다조피리딘 아민, 6,7-융합 시클로알킬이미다조피리딘 아민, 1,2 가교된 (bridged) 이미다조퀴놀린 아민, R-848 (S-28463 또는 레시퀴모드), 4-아미노-2-에톡시메틸-α,α-디메틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-에탄올, 1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 (R-837 또는 이미퀴모드), 또는 S-27609를 포함한다. 일부 중요한 실시태양에서, 이미다조퀴놀린은 R848이다.
TLR7/8 리간드는 3M-003일 수 있다. 리간드가 TLR7 및 TLR8 리간드인 실시태양에서, TLR8-매개 면역 반응은 어댑터 올리고뉴클레오티드의 부재 하에 달성된 TLR8-매개 면역 반응의 수준보다 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 15배, 20배 이상 향상될 수 있다.
한 실시태양에서, 어댑터 올리고뉴클레오티드는 식 5' X - N5 - X 3' 또는 식 5' X - N4 3'를 포함하고, 여기서, X는 임의의 뉴클레오티드일 수 있고, 존재하거나 부재할 수 있고, N4 및 N5는 N4 또는 N5 내의 모든 N이 동일하도록 4 또는 5개의 인접 T (티미딘), U (우라실) 또는 A (아데닌)을 나타낸다. 실시태양에 따라, 올리고뉴클레오티드는 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 중요한 실시태양에서, 이는 뉴클레오티드간 포스포로티오에이트 연결 (완전히 포스포로티오에이트화된 주쇄 (backbone)를 포함하는 것까지)을 하나 이상 포함한다.
관련 실시태양에서, 어댑터 올리고뉴클레오티드는 식 5' Xa - TTTTT - Xb 3' 를 포함하고, 여기서, Xa 및 Xb는 독립적으로 임의의 뉴클레오티드일 수 있고 존재하거나 부재할 수 있다. Xa 및 Xb는 하나 이상의 뉴클레오티드일 수 있다 (예를 들어, 1-100개 뉴클레오티드). 한 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 6, 7개 이상의 인접 T를 포함한다. 한 중요한 실시태양에서, 어댑터 올리고뉴클레오티드는 임의로 17개 뉴클레오티드 길이의 티미딘 (dT) 단일중합체이다.
다른 실시태양에서, 어댑터 올리고뉴클레오티드는 식 5' Xa - UUUUU - Xb 3'를 포함하고, 여기서, Xa 및 Xb는 독립적으로 임의의 뉴클레오티드일 수 있고 존재하거나 부재할 수 있다. Xa 및 Xb는 하나 이상의 뉴클레오티드일 수 있다 (예를 들어, 1-100개 뉴클레오티드), 한 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 6 또는 7개 이상의 인접 U를 포함할 수 있다. 중요한 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 임의로 17개 뉴클레오티드 길이의 우라실 (dU) 단일중합체이다.
또다른 실시태양에서, 어댑터 올리고뉴클레오티드는 식 5' Xa - AAAAA - Xb 3'를 포함하고, 여기서, Xa 및 Xb는 독립적으로 임의의 뉴클레오티드일 수 있고 존재하거나 부재할 수 있다. Xa 및 Xb는 하나 이상의 뉴클레오티드일 수 있다 (예를 들어, 1-100개 뉴클레오티드), 한 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 6 또는 7개 이상의 인접 A를 포함할 수 있다. 중요한 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 임의로 17개 뉴클레오티드 길이의 아데닌 (dA) 단일중합체이다.
또다른 실시태양에서, 어댑터 올리고뉴클레오티드는 식 5' Cn - Tm - Cp 3'이고, 여기서, n은 0-100의 정수이고, p는 0-100의 정수이고, m 은 0-100의 정수이다. 한 실시태양에서, n 및 p의 합은 전체 올리고뉴클레오티드의 C 함량이 50％, 50％ 미만, 45％ 미만, 40％ 미만, 35％ 미만, 30％ 미만, 25％ 미만, 20％ 미만, 15％ 미만, 10％ 미만 또는 5％ 미만이도록 m 값과 동일하거나 그 미만이다. 일부 실시태양에서, 상기 인용된 백분율이 만족된다면 n은 3-7이고, m은 2-10이고, p는 4-8이다. 예로는 5' C3T10C4 3'(서열 1) 및 5' C4T8C5 3' (서열 2)를 포함한다.
어댑터 올리고뉴클레오티드는 CpG 모티프를 포함할 수 있거나, 상기 모티프가 결핍될 수 있다. 모티프는 비메틸화된 CpG 모티프일 수 있다.
한 실시태양에서, TLR7/8 리간드 및 어댑터 올리고뉴클레오티드는 대상에게 별개로 투여된다. 상기 및 다른 실시태양에서, 리간드 및 올리고뉴클레오티드는 서로 실질적으로 동시에 투여될 수 있다. 또다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드 및 TLR7/8 리간드는 서로에 대해 컨쥬게이트(conjugate)된다. 한 실시태양에서, 어댑터 올리고뉴클레오티드는 TLR7/8 리간드에 공유 부착된다.
한 실시태양에서 어댑터 올리고뉴클레오티드는 DNA인 반면, 다른 실시태양에서 RNA이다. 한 실시태양에서, 어댑터 올리고뉴클레오티드는 단독으로 사용될 때 면역자극성이 아니다. 한 실시태양에서, 어댑터 올리고뉴클레오티드는 단독으로 TLR7- 또는 TLR8-매개 면역 반응을 자극하지 않는다.
한 실시태양에서, 조성물은 항원을 추가로 포함하고/하거나, 방법은 항원을 대상에게 투여하는 것을 포함한다.
한 실시태양에서, 대상은 감염된 상태이다. 다른 실시태양에서, 대상은 암에 걸린 상태이다. 또다른 실시태양에서, 대상은 알레르기 또는 천식에 걸린 상태이다.
조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 제약 제제일 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 대상을 면역화하기 위한 의약의 제조를 위한 상기 설명된 바와 같은 TLR 리간드 및 어댑터 올리고뉴클레오티드 조합물의 용도를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 백신을 제조하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 설명된 바와 같은 TLR 리간드 및 어댑터 올리고뉴클레오티드 조합물을 항원 및 임의로 제약상 허용되는 담체와 밀접하게 연합되도록 배치하는 단계를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 대상에서 감염을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한, 상기 설명된 바와 같은 TLR 리간드 및 어댑터 올리고뉴클레오티드 조합물의 용도를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 상기 설명된 바와 같은 TLR 리간드 및 어댑터 올리고뉴클레오티드 조합물, 및 항미생물제 또는 의약을 포함하는, 감염 치료에 유용한 조성물을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 대상에서 암을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한, 상기 설명된 바와 같은 TLR 리간드 및 어댑터 올리고뉴클레오티드 조합물의 용도를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 상기 설명된 바와 같은 TLR 리간드 및 어댑터 올리고뉴클레오티드 조합물, 및 항암제를 포함하는, 암 치료에 유용한 조성물을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 대상에서 알레르기 질환을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한, 상기 설명된 바와 같은 TLR 리간드 및 어댑터 올리고뉴클레오티드 조합물의 용도를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 상기 설명된 바와 같은 TLR 리간드 및 어댑터 올리고뉴클레오티드 조합물, 및 알레르기 의약을 포함하는, 알레르기 질환의 치료에 유용한 조성물을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 대상에서 천식을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한, 상기 설명된 바와 같은 TLR 리간드 및 어댑터 올리고뉴클레오티드 조합물의 용도를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 상기 설명된 바와 같은 TLR 리간드 및 어댑터 올리고뉴클레오티드 조합물, 및 천식 의약을 포함하는, 천식의 치료에 유용한 조성물을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 TLR7/8 리간드 및 어댑터 올리고뉴클레오티드를 확인하기 위한 스크리닝 방법을 제공한다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 TLR8 발현 세포를 어댑터 올리고뉴클레오티드의 존재 및 부재 하에 시험 리간드와 접촉시키고, 어댑터 올리고뉴클레오티드의 존재 및 부재 하에서의 시험 리간드에 대한 반응으로 TLR8 발현 세포의 자극을 측정하는 것을 포함하는, TLR8 리간드를 확인하기 위한 방법을 제공한다. TLR8 리간드는 어댑터 올리고뉴클레오티드의 존재 하에 증가된 자극에 의해 확인된다. 증가된 자극은 바람직하게는 어댑터 올리고뉴클레오티드의 부재 하에서의 0이 아닌 자극 수준을 넘는 증가이다.
다른 측면에서, 본 발명은 TLR7 발현 세포 및 TLR8 발현 세포를 어댑터 올리고뉴클레오티드의 존재 및 부재 하에 시험 리간드와 접촉시키고, 어댑터 올리고뉴클레오티드의 존재 및 부재 하에서의 시험 리간드에 대한 반응으로 TLR7 발현 세포 및 TLR8 발현 세포의 자극을 측정하는 것을 포함하는, TLR7 리간드를 확인하기 위한 방법을 제공한다. TLR7 리간드는 어댑터 올리고뉴클레오티드의 존재 하에 TLR7 발현 세포의 감소된 자극 및 TLR8 발현 세포의 증가된 자극에 의해 확인된다. 상기 측면에서, 증가된 자극은 바람직하게는 어댑터 올리고뉴클레오티드의 부재 하에서의 0의 자극 수준을 넘는 증가이다.
다른 측면에서, 본 발명은 TLR8 발현 세포를 시험 어댑터 올리고뉴클레오티드의 존재 및 부재 하에 공지의 TLR7 리간드와 접촉시키고, 시험 어댑터 올리고뉴클레오티드의 존재 하에서의 TLR7 리간드에 대한 반응으로 TLR8 발현 세포의 자극을 측정하는 것을 포함하는, 어댑터 올리고뉴클레오티드를 확인하기 위한 방법을 제공한다. 자극의 수준을 시험 올리고뉴클레오티드의 부재 하의 수준, 및/또는 TLR7 리간드의 부재 및 시험 올리고뉴클레오티드의 존재 하의 수준, 및/또는 TLR7 리간드 및 공지의 어댑터 올리고뉴클레오티드의 존재 하의 수준과 비교할 수 있다. 한 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드 자체가 TLR8-매개 면역 반응을 매개하지 않 는다면 (상기 언급된 대조 분석에 의해 결정된 바와 같은), 어댑터 올리고뉴클레오티드는 그의 부재에 비해 그의 존재 하에서의 TLR8 발현 세포의 증가된 자극에 의해 확인된다.
TLR7 및 TLR8 리간드 및 어댑터 올리고뉴클레오티드는 상기한 측면 및 실시태양에서 언급되는 임의의 것일 수 있다. TLR7- 또는 TLR8 발현 세포는 자연적으로 TLR7 또는 TLR8을 발현하는 세포일 수 있거나, TLR7 또는 TLR8을 발현하도록 (예를 들어, 이소에서 (ectopically)) 조작된 세포일 수 있다. 자극은 TLR7 또는 TLR8을 통한 신호전달, 및 증가된 유전자 발현 (예를 들어, TLR7 또는 TLR8의 하류에 위치하는 표적의 프로모터 요소에 컨쥬게이트된 리포터 구성체를 사용하여 가시화됨), 성장 인자 (사이토킨) 발현, 생산 또는 분비의 증가 등을 포함하지만 그로 제한되지 않는 그의 하류 효과에 의해 측정할 수 있다.
본 발명의 상기 및 다른 측면 및 실시태양은 본원에서 더 상세히 설명될 것이다.
도 1A-1B는 ODN에 의한 인간 TLR8 및 TLR7에 대한 R-848-매개 활성의 선택적인 향상 및 억제를 보여준다. 도 1A는 ODN 6056 (서열 3) 및 1982 (서열 4)에 의한 인간 TLR7에 대한 R-848 활성의 억제를 보여준다 (서열에 대해서는 표 1 및 2 참고). TLR7 및 NF-κB 루시퍼라제 리포터 구성체를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포를 표시된 양의 올리고(dT)17 단일중합체 ODN 6056, 또는 이종중합체 ODN 1982 의 존재 또는 부재 하에 2 μM의 R-848과 함께 인큐베이션하였다. R-848 단독의 활성을 100％로 설정하였다. 모든 데이타 점을 삼중으로 분석하였고, 평균 (±SD)를 표시한다. 도시된 결과는 2회 이상의 독립 실험 중 하나이다. 도 1B는 올리고(dT)17 ODN에 의한 인간 TLR8에 대한 R-848 활성의 서열-선택적인 향상을 보여준다. hTLR8 및 NF-κB-루시퍼라제 리포터 구성체를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포를 0.1, 1 및 5 μM의 올리고(dT)17 단일중합체 ODN 6056, 또는 이종중합체 ODN 1982의 부재 또는 존재 하에 증가량의 R-848과 함께 인큐베이션하였다. NF-κB 활성화의 자극은 배지 배경을 참조로 계산하였다. 모든 데이타 점은 삼중으로 분석하였고, 평균 (±SD)를 표시한다. 도시된 결과는 4회의 독립 실험 중 하나이다.
도 2A-C는 올리고(dT)17 ODN과 조합될 때 TLR7 리간드, 록소리빈 및 7-데아자-구아노신의 변경된 표적 특이성을 도시한 것이다. 도 2A에서, hTLR7, hTLR8 또는 hTLR9를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포를 증가량의 록소리빈과 함께 인큐베이션하였다. NF-κB 활성화는 16시간 후에 루시퍼라제 활성을 분석함으로써 측정하고, 배지 배경을 능가하는 자극 배수로서 표시하였다. 도 2B에서, hTLR8을 발현하는 HEK293 세포를 표시된 농도의 단일중합체 ODN 6056 또는 이종중합체 ODN 1982의 부재 또는 존재 하에 증가량의 록소리빈과 함께 인큐베이션하였다. NF-κB 활성화는 배지 배경을 능가하는 유도 배수로서 제시된다. 도 2C에서, 증가량의 7-데아자-구아노신 (좌측 패널) 및 이노신 (우측 패널)을 5 μM ODN 6056의 부재 (채워진 원) 또는 존재 (빈 원) 하에 hTLR8 발현 HEK293 세포 상에서 분석하고, 배지 배 경을 능가하는 NF-κB 자극을 계산하였다. 모든 데이타 점을 삼중으로 분석하였다. 3회 실험 중 하나의 데이타를 도시한다.
도 3A-3B는 HEK293 세포에서 ODN 6056이 TLR7-매개 NF-κB 활성화를 억제하는 것을 도시한 것이다. hTLR7 및 NF-κB-루시퍼라제 리포터 구성체를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포를 표시된 농도의 ODN 6056의 존재 또는 부재 하에 16시간 동안 2.5 mM 록소리빈 (도 3A) 또는 2 μM R-848 (도 3B)와 함께 인큐베이션하였다. NF-κB-활성화의 자극은 배지 배경을 참조로 하여 계산하였다. 모든 데이타 점은 삼중으로 분석하였고, 평균 (±SD)를 표시한다. 도시된 결과는 2회의 독립 실험 중 하나의 것이다.
도 4A-4D는 특이적 ODN에 의한 록소리빈-유도된 사이토킨 생산의 재지정을 도시한 것이다. 인간 PBMC를 증가량의 ODN 6056 및 ODN 1982의 부재 하에 또는 별개로 존재 하에 1 mM 록소리빈과 함께 인큐베이션하였다. 24시간 후 상등액을 수집하고, IFN-α (도 4A), IL-12p40 (도 4B), IFN-γ (도 4C) 및 TNF-α (도 4D)의 양을 ELISA에 의해 측정하였다. 값은 3명의 공여자의 평균 (±SEM)을 나타낸다. 데이타는 4회의 실험 중 하나의 대표적인 실험의 것이다.
도 5A-5F는 록소리빈 및 올리고(dT)17 ODN과 동시배양될 때 IL-12p40 및 TNF-α를 생산하기 위한 인간 단핵구의 자극을 도시한 것이다. 인간 PBMC를 표시된 양의 록소리빈 및 ODN과 함께 인큐베이션하였다. 항-IL-12p40/p70 (도 5A) 및 항-TNF-α (도 5B) 항체를 사용하여 세포내 염색을 수행하였다. 세포를 항-CD14 및 항-CD19 항체를 사용하여 동시에 염색하였다. 세포를 CD14-양성 세포에 대해 게이팅 (gating)하고, IL-12p40/p70-양성 세포 또는 TNF-α-양성 세포의 비율을 계산하였다. 결과는 3명의 공여자의 평균 (±SEM)을 보여준다. 도 5C-5F는 대표적인 유동 세포 측정 도트 블로트 (dot blot)를 나타낸다. 2회의 독립 실험 중 하나를 도시한다.
도 6A-6L은 록소리빈 및 올리고(dT)17 ODN 6056과 동시배양 시에 IFN-γ를 생산하기 위한 인간 NK 세포의 자극을 도시한 것이다. 인간 PBMC를 표시된 양의 록소리빈 및 ODN과 함께 인큐베이션하였다. 항-IFN-γ 항체를 사용하여 세포내 염색을 수행하였다. 항-CD56 및 항-CD3 항체를 사용하여 세포를 염색하였다. 세포를 CD56-양성/CD3 음성 세포 (NK 세포)에 대해 게이팅하였다. IFN-γ-양성 세포의 비율을 계산하였고, 유동 세포 측정 도트 블로트 내에 나타낸다. 5명 중 2명의 대표적인 공여자를 도시한다.
도 7A 및 7B는 단리된 세포 집단으로부터 사이토킨 생산에 대한 록소리빈과 ODN의 동시 인큐베이션의 영향을 도시한 것이다. 도 7A에서, CD 14 mAb를 사용하여 인간 PBMC로부터 단핵구를 단리하고 (96％ 순도), ODN의 존재 또는 부재 하에 표시된 양의 록소리빈과 함께 인큐베이션하였다. 상등액 내의 IL-12p40의 양을 ELISA에 의해 결정하였다. 데이타는 2명의 개별 공여자 (회색 및 흑색 막대)에 대한 결과를 표시한다. 3회의 유사한 실험 중 하나를 도시한다. 도 7B에서, PDC를 BDCA-4 mAb를 사용하여 2명의 공여자의 인간 PBMC (회색 및 흑색 막대)로부터 풍부 화시키고 (85％ 순도), 록소리빈 및 ODN의 표시된 조합물과 함께 24시간 동안 인큐베이션하였다. 상등액 내에서 IFN-α를 ELISA에 의해 검출하였다. 3회의 유사한 실험 중 하나로부터의 데이타를 도시한다.
도 8A는 표시된 양의 ODN의 존재 하에 16시간 동안 50 μM R-848과 함께 인큐베이션한 hTLR8-LUC-293 세포에 대한 효과를 도시한 것이다. 루시퍼라제 활성을 측정함으로써 NF-κB 자극을 측정하였다. 50 μM R-848 단독에 의해 유도된 NF-κB 활성을 100％로 설정하였다. 도 8B는 1 μM의 표시된 ODN의 존재 하에 16시간 동안 증가하는 농도의 R-848과 함께 인큐베이션한 hTLR8-LUC-293 세포를 도시한 것이다. 루시퍼라제 활성을 분석함으로써 NF-κB 자극을 측정하였다.
도 9A 및 9B는 TLR7 특이적 리간드 6-아미노-9-벤질-2-부톡시-9H-퓨린-8-올 및 ODN 6056의 조합물을 사용한 TLR7 및 TLR8 신호전달을 도시한 것이다. 도 9A는 TLR7 신호전달에 대한 조합물의 효과를 도시한 것이다. 도 9B는 TLR8 신호전달에 대한 조합물의 효과를 도시한 것이다.
도 10은 2개의 상이한 RNA의 TLR8 신호전달에 대한 효과를 도시한 것이다. 폴리(rU)18 (서열 5)은 TLR7/8 리간드의 부재 하에 TLR8을 자극한다. 혼합된 RNA 올리고 (서열 16)는 TLR8을 단독으로 자극하지 않는다.
도 11은 TLR7/8 리간드의 존재 하에 R-848 TLR8 신호전달에 대한 2개의 RNA의 효과를 도시한 것이다.
도 12는 TLR7 리간드 (록소리빈, 이뮤노신), TLR7 및 TLR8 리간드인 리간드 (R-848), 및 TLR7/8 리간드가 아닌 화합물 (리바비린)에 대한 ODN 6056의 TLR8-매개 효과를 도시한 것이다.
도 13A-D는 이뮤노신 (A), 올리고뉴클레오티드에 3' 말단에서 또는 내재적으로 (B) 또는 5' 말단에서 (C) 컨쥬게이트될 수 있는 2개의 이뮤노신 변이체/단량체 (B 및 C), 및 6-아미노-9-벤질-2-부톡시-9H-퓨린-8-올 (D)의 구조를 도시한 것이다.
도 14는 링커를 포함하는 이뮤노신-올리고뉴클레오티드 컨쥬게이트의 구조를 도시한 것이다.
도 15A-C는 R-848 (A), CL-029 (B) 및 이뮤노신 (C)의 구조, 및 링커 및/또는 올리고뉴클레오티드가 부착될 수 있는 지점을 도시한 것이다.
본 발명은 부분적으로 특정 올리고뉴클레오티드가 TLR-매개 면역 반응을 조절할 수 있다는 발견에 관한 것이다. 본원에서 사용될 때, TLR-매개 면역 반응을 조절하는 것은 하나 이상의 TLR의 신호전달을 조정하는 능력을 나타낸다. 예를 들어, 본 발명에 따르면, 특정 올리고뉴클레오티드의 존재 하에 리간드가 상이한 TLR을 통해 신호를 전달하도록 특정 TLR 리간드의 TLR 프로필을 변화시키는 것이 가능하다. 다른 예로서, 특정 올리고뉴클레오티드의 존재 하에, 하나 초과의 TLR을 통해 신호를 전달하는 것으로 공지된 TLR 리간드는 단지 하나의 TLR을 통한 신호전달을 나타내고, 많은 경우에 상기 신호전달은 향상된다. 또다른 예에서, 특정 올리고뉴클레오티드의 존재 하에, TLR 신호전달의 효능 및 효력은 유의하게 증가된다. 따라서, 본 발명에 의해 TLR7, TLR8, 및 TLR9 중 임의의 하나 또는 그의 임의의 조합에 의한 신호전달을 선택적으로 억제하고/하거나 향상시킬 수 있다.
본 발명은 부분적으로 이미다조퀴놀린 유도체 레시퀴모드 (R-848) (이는 단독으로 TLR7 및 TLR8을 모두 활성화시킨다)을 올리고(dT)17 단일중합체 올리고뉴클레오티드 (ODN 6056)와 동시 인큐베이션하면 TLR8 발현 HEK 293 세포에 대한 R-848의 활성을 유의하게 증가시키는 반면, TLR7-매개 신호전달은 폐지되었다는 발견을 전제로 한다. 유사하게, 구아노신 유사체 록소리빈 (이는 단독으로 TLR7을 활성화시킨다) 및 올리고(dT)17 ODN 6056의 조합물은 TLR8-매개 신호전달을 서열-선택적 방식으로 유도하였고, TLR7-매개 신호전달을 폐지하였다.
인간 면역 세포에서 록소리빈에 의해 유도된 사이토킨 프로필도 또한 올리고(dT)17과 동시 인큐베이션에 의해 변경되었다. IL-12, TNF-α 또는 IFN-γ는 고도로 분비되지만, IFN-α 생산은 폐기되었다. 임의의 특정 기전에 얽매이기를 의도하지 않지만, 유도된 사이토킨에서 관찰된 변경은 활성화되는 세포 종류가 록소리빈 단독에 의한 형질세포양 (plasmacytoid) DC로부터 그의 ODN과의 조합물에 의한 단핵구로의 이동에 의한 것으로 가정되고, 이는 단핵구가 기능적 TLR7을 발현하지 않는다는 것을 나타낸다.
따라서, 본 발명은 다양한 범위의 면역 반응을 조정하기 위해 유용하다. 특정 실시태양에서, 본 발명은 임의로 TLR8 신호전달 (및 연관된 TLR8-매개 면역 반응)을 유도하면서 TLR7 신호전달 (및 연관된 TLR7-매개 면역 반응)을 억제하는데 있어서 유용하다. 다른 특정 실시태양에서, 본 발명은 TLR8 신호전달 (및 연관된 TLR8-매개 면역 반응)의 유도 (향상 포함)를 제공한다. 어댑터 올리고뉴클레오티드의 특성에 따라, 동시에 TLR9 신호전달 (및 연관된 TLR9-매개 면역 반응)을 유도하는 것이 추가로 가능하다. 예를 들어, CpG 모티프를 포함하는 어댑터 올리고뉴클레오티드 및 TLR7 리간드, 예를 들어 록소리빈의 조합물은 TLR8 및 TLR9 신호전달 (및 그들의 연관된 면역 반응)을 유도할 것이다.
본 발명은 또한 임의로 TLR9-매개 면역 반응의 부재 또는 존재 하에, TLR7-매개 면역 반응의 억제 및/또는 TLR8-매개 면역 반응의 유도 (향상 포함)가 유익한 다양한 병태를 치료하기 위해 유용하다.
TLR7-매개 면역 반응의 억제가 유익한 상태는 루푸스 및 류마티스 관절염, 특히 DNA 바이러스에 의한 감염과 연관된 것을 포함하지만 이로 제한되지 않는 자가면역 상태를 포함한다. TLR8-매개 면역 반응의 동시 유도와 함께 TLR7-매개 면역 반응의 억제는 T 조절성 세포에 의해 억제되는 T 세포 반응을 향상시키는 것이 바람직한 경우에 사용될 수 있다. 상기 상태는 일부 암 형태뿐만 아니라 HCV, HBV 및 HIV 감염을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 조합된 TLR7 억제 및 TLR8 유도는 또한 자가면역 질환을 치료하는데 있어서 또는 면역 반응을 유도하지만 TLR7 연관 독성을 피하는 것이 요망되는 경우에 유익할 수 있다. TLR7-매개 면역 반응의 조절과 독립적으로 TLR8-매개 면역 반응의 유도 (향상 포함)는 특히 백신 또는 비-백신 환경에서 암 및 감염의 치료에서 유용하다.
본 발명은 또한 사이토킨 생산에서 이동이 유익할 상태의 치료에서, 또는 대상이 특정 사이토킨 (예를 들어, 때때로 바이러스 감염의 치료에서 발견되는 바와 같은 IFN-α)의 효과에 대해 무반응이거나 무반응으로 되는 경우에 유용하다.
TLR
Toll-유사 수용체 (TLR)는 포유동물에서 선천 면역에 중요한 역할을 하는 고도로 보존된 폴리펩티드의 패밀리이다. 현재, TLR1 - TLR10으로 지정된 10개의 패밀리 구성원이 확인되었다. 각종 TLR의 세포질 도메인은 Toll-인터루킨 1 (IL-1) 수용체 (TIR) 도메인에 의해 특성화된다 (Medzhitov R et al. (1998) Mol Cell 2:253-8). TLR에 의한 미생물 침입의 인식은 드로소필라 (Drosophila) 및 포유동물에서 진화상 보존된 신호전달 케스케이드의 활성화를 촉발시킨다. TIR 도메인-함유 어댑터 단백질 MyD88은 많은 TLR과 연합되고 IL-1 수용체-연관 키나제 (IRAK) 및 종양 괴사 인자 (TNF) 수용체-연관 인자 6 (TRAF6)을 TLR에 동원시키는 것으로 보고되었다. MyD88-의존 신호전달 경로는 면역 활성화 및 염증성 사이토킨의 생산에서 중요한 단계인 NF-κB 전사 인자 및 c-Jun NH2 말단 키나제 (Jnk) 미토겐-활성화된 단백질 키나제 (MAPK)의 활성화를 일으키는 것으로 생각된다 (문헌 [Aderem A et al. (2000) Nature 406:782-87] 참조).
TLR은 다양한 조직 내에서 및 다양한 종류의 면역 세포 상에서 차별적으로 발현되는 것으로 생각된다. 예를 들어, 인간 TLR7은 태반, 폐, 비장, 림프절, 편도에서 및 형질세포양 전구체 수지상 세포 (pDC) 상에서 발현되는 것으로 보고되었다 (Chuang T-H et al. (2000) Eur Cytokine Netw 11:372-8); Kadowaki N et al. (2001) J Exp Med 194:863-9). 인간 TLR8은 폐, 말초혈 백혈구 (PBL), 태반, 비장, 림프절에서, 및 단핵구 상에서 발현되는 것으로 보고되었다 (Kadowaki N et al. (2001) J Exp Med 194:863-9; Chuang T-H et al. (2000) Eur Cytokine Netw 11:372-8). 인간 TLR9는 비장, 림프절, 골수, PBL에서 및 pDC 및 B 세포 상에서 발현되는 것으로 보고되었다 (Kadowaki N et al. (2001) J Exp Med 194:863-9; Bauer S et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:9237-42; Chuang T-H et al. (2000) Eur Cytokine Netw 11:372-8).
인간 및 쥐 TLR7의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 알려져 있다 (예를 들어 그 전체 내용이 본원에 참고로 포함된 GenBank 기탁 번호 AF240467, AF245702, NM_016562, AF334942, NM_133211; 및 AAF60188, AAF78035, NP_057646, AAL73191 및 AAL73192 참고). 인간 TLR7은 1049개 아미노산 길이인 것으로 보고되어 있다. 쥐 TLR7은 1050개 아미노산 길이인 것으로 보고되어 있다. TLR7 폴리펩티드는 류신-풍부 반복 영역을 갖는 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 및 TIR 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함한다.
인간 및 쥐 TLR8의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 알려져 있다 (예를 들어 그 전체 내용이 본원에 참고로 포함된 GenBank 기탁 번호 AF246971, AF245703, NM_016610, XM_045706, AY035890, NM_133212; 및 AAF64061, AAF78036, NP_057694, XP_045706, AAK62677 및 NP_573475 참고). 인간 TLR8은 하나는 1041개 아미노산 길이이고 다른 하나는 1059개 아미노산 길이인 적어도 2개의 이소형 (isoform)으로 존재하는 것으로 보고되어 있다. 쥐 TLR8은 1032개 아미노산 길이이다. TLR8 폴리펩티드는 류신-풍부 반복 영역을 갖는 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 및 TIR 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함한다.
인간 및 쥐 TLR9의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 알려져 있다 (예를 들어 그 전체 내용이 본원에 참고로 포함된 GenBank 기탁 번호 NM_017442, AF259262, AB045180, AF245704, AB045181, AF348140, AF314224, NM_031178; 및 NP_059138, AAF72189, BAB19259, AAF78037, BAB19260, AAK29625, AAK28488, 및 NP_112455 참고). 인간 TLR9은 하나는 1032개 아미노산 길이이고 다른 하나는 1055개 아미노산 길이인 적어도 2개의 이소형으로 존재하는 것으로 보고되어 있다. 쥐 TLR9는 1032개 아미노산 길이이다. TLR9 폴리펩티드는 류신-풍부 반복 영역을 갖는 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 및 TIR 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함한다.
TLR -매개 면역 반응
본원에서 사용될 때, 용어 "TLR 신호전달"은 TLR을 통한 신호전달과 연관된 세포내 신호전달의 임의의 측면을 나타낸다. 본원에서 사용될 때, 용어 "TLR-매개 면역 반응"은 TLR 신호전달과 연관된 (예를 들어, 그의 결과인) 면역 반응을 나타낸다.
TLR7-매개 면역 반응은 TLR7 신호전달과 연관된 반응이다. TLR7-매개 면역 반응은 일반적으로 IFN-α 및 IFN-유도가능 사이토킨, 예를 들어 IP-10 및 I-TAC의 유도를 특징으로 한다. TLR7-매개 면역 반응에서 유도된 사이토킨 IL-1α/β, IL-6, IL-8, MIP-1α/β 및 MIP-3α/β의 수준은 TLR8-매개 면역 반응에서 유도된 것보다 작다.
TLR8-매개 면역 반응은 TLR8 신호전달과 연관된 반응이다. 상기 반응은 전-염증 사이토킨, 예를 들어 IFN-γ, IL-12p40/70, TNF-α, IL-1α/β, IL-6, IL-8, MIP-1α/β 및 MIP-3α/β의 유도를 특징으로 한다.
TLR9-매개 면역 반응은 TLR9 신호전달과 연관된 반응이다. 상기 반응은 적어도 TLR8-매개 면역 반응을 통해 달성된 것보다 더 작은 수준이기는 하지만 IFN-γ 및 IL-12의 생산 및/또는 분비를 특징으로 한다.
TLR7/8 리간드
본원에서 사용될 때, "TLR7/8 리간드"는 총칭하여 TLR7 및/또는 TLR8 신호전달을 증가시킬 수 있는 임의의 물질 (즉, TLR7 및/또는 TLR8의 작용제)를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 어댑터 올리고뉴클레오티드의 부재 하에 사용될 때, 일부 TLR7/8 리간드는 TLR7 신호전달만을 유도하고 (예를 들어, TLR7 특이적 리간드), 일부는 TLR8 신호전달만을 유도하고 (예를 들어, TLR8 특이적 리간드), 다른 것은 TLR7 및 TLR8 신호전달을 모두 유도한다. 본 발명에 따라, 상기 리간드가 어댑터 올리고뉴클레오티드와 조합으로 사용될 때, 상기 리간드의 TLR 신호전달 프로필이 변경되는 것으로 밝혀졌다. 일부 경우에, TLR7 신호전달은 억제되고 TLR8 신호전달은 유도된다. 다른 경우에, TLR8 신호전달은 유도 (즉, 배경 수준으로부터 증가) 또는 향상 (즉, 비-배경 수준으로부터 증가)되고, 또 다른 실시태양에서, TLR8 및 TLR9 신호전달 모두가 유도 또는 향상된다.
본원에서 사용될 때, 용어 "TLR7 리간드"는 TLR7 신호전달을 증가시킬 수 있는 임의의 물질 (즉, TLR7의 작용제)를 나타낸다. 이와 관련하여, TLR7 신호전달의 수준은 기존재하는 신호전달 수준을 초과하여 향상될 수 있거나, 신호전달의 배경 수준을 초과하여 유도될 수 있다. TLR7 리간드는 비제한적으로 구아노신 유사체, 예를 들어 C8-치환 구아노신, 본질적으로 G 및 U로 이루어지는 리보뉴클레오시드의 혼합물, 구아노신 리보뉴클레오티드 및 RNA 또는 RNA-유사 분자 (PCT/US03/10406), 및 아데노신계 화합물 (예, 6-아미노-9-벤질-2-(3-히드록시-프로폭시)-9H-퓨린-8-올 (CL-029, 스미토모 (Sumitomo)), 6-아미노-9-벤질-2-부톡시-9H-퓨린-8-올 (도 13D에 도시됨), 및 US 6310070 B1에 기재된 것과 같은 다른 관련 화합물을 포함한다. 또한, TLR7 리간드는 문헌 [Gorden et al. J. Immunol. 2005, 174:1259-1268]에 기재되어 있다 (예, 3M-001, N-[4-(4-아미노-2-에틸-1H-이미다조[4,5-c] 퀴놀린-1-일)부틸]메탄술폰아미드; C17H23N5O2S; mw 361).
본원에서 사용될 때, 용어 "구아노신 유사체"는 구아닌 염기, 구아노신 뉴클레오시드 당, 또는 구아닌 염기와 구아노신 뉴클레오시드 당 모두를 포함하는 화학적 변형을 갖는 구아노신-유사 뉴클레오티드 (구아노신 제외)를 나타낸다. 구아노신 유사체는 구체적으로 7-데아자-구아노신을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
구아노신 유사체는 추가로 C8-치환 구아노신, 예를 들어 7-티아-8-옥소구아노신 (이뮤노신), 8-머캅토구아노신, 8-브로모구아노신, 8-메틸구아노신, 8-옥소-7,8-디히드로구아노신, C8-아릴아미노-2'-데옥시구아노신, C8-프로피닐-구아노신, C8- 및 N7-치환 구아닌 리보뉴클레오시드, 예를 들어 7-알릴-8-옥소구아노신 (록소리빈) 및 7-메틸-8-옥소구아노신, 8-아미노구아노신, 8-히드록시-2'-데옥시구아노신, 8-히드록시구아노신, 및 7-데아자 8-치환 구아노신을 포함한다.
본원에서 사용될 때, 용어 "TLR8 리간드"는 TLR8 신호전달을 증가시킬 수 있는 임의의 물질 (즉, TLR8의 작용제)를 나타낸다. 이와 관련하여, TLR8 신호전달의 수준은 기존재하는 신호전달 수준을 초과하여 향상될 수 있거나, 신호전달의 배경 수준을 초과하여 유도될 수 있다. TLR8 리간드는 본질적으로 G 및 U로 이루어지는 리보뉴클레오시드의 혼합물, 구아노신 리보뉴클레오티드 및 RNA 또는 RNA-유사 분자 (PCT/US03/10406)을 포함한다. 추가의 TLR8 리간드는 또한 문헌 [Gorden et al. J. Immunol. 2005, 174:1259-1268]에 개시되어 있다 (예, 3M-002, 2-프로필티아졸로[4,5-c]퀴놀린-4-아민; C13H13N3S; mw 243).
일부 TLR7/8 리간드는 TLR7 및 TLR8 모두의 리간드이다. 이들은 이미다조퀴놀린, 본질적으로 G 및 U로 이루어지는 리보뉴클레오시드의 혼합물, 구아노신 리보뉴클레오티드, 및 RNA 또는 RNA-유사 분자 (PCT/US03/10406)를 포함한다. 추가의 TLR7/8 리간드는 또한 문헌 [Gorden et al. J. Immunol. 2005, 174:1259-1268에 개시되어 있다 (예, 3M-003, 4-아미노-2-(에톡시메틸)-α,α-디메틸-6,7,8,9-테트라히드로-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-에탄올 수화물; C17H26N4O2; mw 318).
이미다퀴놀린은 몇몇 사이토킨, 예를 들어 인터페론 (예를 들어, IFN-α), TNF-α 및 일부 인터루킨 (예를 들어, IL-1, IL-6 및 IL-12)의 발현을 유도하는 것으로 생각되는 면역 반응 조정제이다. 이미다퀴놀린은 부분적으로 IgG2a 수준의 증가를 유도하는 그들의 능력에 의해 증명되는 바와 같이 Th1 면역 반응을 자극할 수 있다. 이미다퀴놀린 약제는 또한 Th2 사이토킨, 예를 들어 IL-4, IL-5, 및 IL-13의 생산을 억제할 수 있는 것으로 보고되었다. 이미다조퀴놀린에 의해 유도된 사이토킨의 일부는 대식세포 및 수지상 세포에 의해 생산된다. 이미다조퀴놀린의 몇몇 종은 NK 세포 용해 활성을 증가시키고, B 세포 증식 및 분화를 자극하여 항체 생산 및 분비를 유도하는 것으로 보고되었다.
본원에서 사용될 때, 이미다조퀴놀린은 이미다조퀴놀린 아민, 이미다조피리딘 아민, 6,7-융합 시클로알킬이미다조피리딘 아민, 및 1,2 가교된 이미다조퀴놀린 아민을 포함한다. 상기 화합물은 미국 특허 4689338, 4929624, 5238944, 5266575, 5268376, 5346905, 5352784, 5389640, 5395937, 5494916, 5482936, 5525612, 6039969 및 6110929에 설명되어 있다. 이미다조퀴놀린의 특정 종은 R-848 (S-28463); 4-아미노-2-에톡시메틸-α,α-디메틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-에탄올; 1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 (R-837 또는 이미퀴모드), 및 S-27609를 포함한다. 이미퀴모드는 현재 성기 및 항문 사마귀와 같은 사마귀의 국소 치료에 사용되고, 또한 기저 세포 암종의 국소 치료에서 시험되고 있다.
본원에서 사용될 때, 용어 "TLR9 리간드"는 TLR9 신호전달을 증가시킬 수 있는 임의의 물질 (즉, TLR9의 작용제)를 나타낸다. TLR9 리간드는 구체적으로 면역자극성 핵산, 및 특히 CpG 면역자극성 핵산을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용될 때, 용어 "면역자극성 CpG 핵산"은 면역 세포를 활성화할 수 있는 임의의 CpG-함유 핵산을 나타낸다. 적어도 CpG 디뉴클레오티드의 C는 반드시는 아니지만 일반적으로 비메틸화된다. 면역자극성 CpG 핵산은 많은 허여된 특허와 공개된 특허 출원, 예를 들어 미국 특허 6,194,388; 6,207,646; 6,218,371; 6,239,116; 6,339,068; 6,406,705; 및 6,429,199에 설명되어 있다.
일부 실시태양에서, TLR 리간드는 특이적 리간드이다. 본원에서 사용될 때, TLR7 특이적 리간드는 본 발명의 어댑터 올리고뉴클레오티드의 부재 하에 사용될 때, TLR7을 통해 신호를 전달하지만 TLR8 또는 TLR9를 통해 신호를 전달하지 않는 것이다. 유사하게, TLR8 특이적 리간드는 본 발명의 어댑터 올리고뉴클레오티드의 부재 하에 사용될 때 TLR8을 통해 신호를 전달하지만 TLR7 또는 TLR9를 통해 신호를 전달하지 않는 것이다. 바람직하게는, TLR7 특이적 리간드는 어댑터 올리고뉴클레오티드의 부재 하에 사용될 때 TLR7을 통해 신호를 전달하고 다른 TLR을 통해 신호를 전달하지 않고, TLR8 특이적 리간드는 어댑터 올리고뉴클레오티드의 부재 하에 사용될 때 TLR8을 통해 신호를 전달하고 다른 TLR을 통해 신호를 전달하지 않는다.
일부 실시태양에서, TLR 리간드는 RNA가 아니다.
어댑터 올리고뉴클레오티드와 함께 TLR7/8 리간드를 사용하면 TLR8 및 TLR9를 모두 자극할 수 있어서, 두 수용체로부터 동시에 하류 효과를 생성시킨다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드에 의한 TLR9의 자극은 예를 들어 IFN-알파 생산을 일으킬 수 있는 한편, 올리고뉴클레오티드에 의한 TLR8의 자극은 예를 들어 IL-12, TNF-알파 및 IFN-감마 생산을 일으킬 수 있다. 리간드 및 올리고뉴클레오티드는 서로에 대해 컨쥬게이트될 수 있거나, 물리적으로 서로 분리될 수 있다.
어댑터 올리고뉴클레오티드
본 발명에 따라, TLR7/8 리간드는 어댑터 올리고뉴클레오티드와 조합으로 사용된다. 본원에서 사용될 때, 어댑터 올리고뉴클레오티드는 TLR7/8 리간드와 함께 사용될 때, TLR7 리간드에 의한 TLR7 신호전달을 억제하고/하거나, TLR7 리간드에 의한 TLR8 신호전달을 유도하고/하거나 TLR7 및 TLR8 리간드인 리간드에 의한 TLR8 신호전달을 향상시킴으로써 그 리간드의 활성을 조정하는 올리고뉴클레오티드이다.
본원에서 사용될 때, 용어 올리고뉴클레오티드는 용어 핵산과 상호교환가능하게 사용된다. 바람직하게는, 상기 용어는 플라스미드, 벡터 및/또는 안티센스 핵산을 제외한다. 일부 실시태양에서 올리고뉴클레오티드는 면역자극성일 수 있는 한편, 다른 실시태양에서 단독으로 사용할 때 면역자극성이 아닐 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 임의의 길이일 수 있지만, 바람직하게는 7 또는 8 내지 100개 이하의 뉴클레오티드 길이이다.
하나의 넓은 종류의 어댑터 올리고뉴클레오티드는 식 5' X - N4 - X 3' 또는 5' X - N5 - X 3'를 포함하고, 여기서, X는 임의의 뉴클레오티드일 수 있고 존재하거나 부재할 수 있고, N4 및 N5는 N4 또는 N5에서 모든 N이 동일하도록 4 및 5개의 인접 T (티미딘), U (우라실), 또는 A (아데닌)을 나타낸다. 올리고뉴클레오티드는 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17개 이상의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 이는 바람직하게는 뉴클레오티드간 포스포로티오에이트 연결 (완전히 포스포로티오에이트화된 주쇄를 포함하여 그 주쇄까지)을 하나 이상 포함한다.
따라서, 하나의 종류의 어댑터 올리고뉴클레오티드는 식 5' Xa - TTTTT - Xb 3'를 포함하고, 여기서, Xa 및 Xb는 독립적으로 임의의 뉴클레오티드일 수 있고 존재하거나 부재할 수 있다. Xa 및 Xb는 하나 이상의 뉴클레오티드를 나타낼 수 있다 (예를 들어, 1-100개 뉴클레오티드). 올리고뉴클레오티드는 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23개 이상의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 6, 7개 이상의 인접 T를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 어댑터 올리고뉴클레오티드는 dT 단일중합체 (즉, 본원에 인용된 길이의 올리고 dT)이다. 훨씬 더 바람직하게는, 어댑터 올리고뉴클레오티드는 17개 뉴클레오티드 길이의 티미딘 (dT) 단일중합체이다. 가장 바람직하게는, 이는 뉴클레오티드간 포스포로티오에이트화 연결 (완전히 포스포로티오에이트화된 주쇄를 포함하여 그 주쇄까지)을 하나 이상 포함한다.
어댑터 올리고뉴클레오티드는 실시태양에 따라 100％ T, 99％ T, 98％ T, 97％ T, 96％ T, 95％ T, 94％ T, 93％ T, 92％ T, 91％ T, 90％ T, 85％ T, 80％ T, 75％ T, 70％ T, 65％ T, 60％ T, 55％ T, 50％ T, 45％ T 또는 그 이하로 이루어질 수 있다.
다른 종류의 어댑터 올리고뉴클레오티드는 식 5' Xa - UUUUU - Xb 3'를 포함하고, 여기서, Xa 및 Xb는 독립적으로 임의의 뉴클레오티드일 수 있고 존재하거나 부재할 수 있다. Xa 및 Xb는 하나 이상의 뉴클레오티드를 나타낼 수 있다 (예를 들어, 1-100개 뉴클레오티드). 올리고뉴클레오티드는 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23개 이상의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 6, 7개 이상의 인접 U를 포함할 수 있다. 중요한 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드간 포스포로티오에이트화 연결 (완전히 포스포로티오에이트화된 주쇄를 포함하여 그 주쇄까지)을 하나 이상 갖는, 바람직하게는 17개 뉴클레오티드 길이인 dU 단일중합체이다.
어댑터 올리고뉴클레오티드는 실시태양에 따라 100％ U, 99％ U, 98％ U, 97％ U, 96％ U, 95％ U, 94％ U, 93％ U, 92％ U, 91％ U, 90％ U, 85％ U, 80％ U, 75％ U, 70％ U, 65％ U, 60％ U, 55％ U, 50％ U, 45％ U 또는 그 이하로 이루어질 수 있다.
또다른 종류의 어댑터 올리고뉴클레오티드는 식 5' Xa - AAAAA - Xb 3'를 포함하고, 여기서, Xa 및 Xb는 독립적으로 임의의 뉴클레오티드일 수 있고 존재하거나 부재할 수 있다. Xa 및 Xb는 하나 이상의 뉴클레오티드를 나타낼 수 있다 (예를 들어, 1-100개 뉴클레오티드). 올리고뉴클레오티드는 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23개 이상의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 6, 7개 이상의 인접 A를 포함할 수 있다. 중요한 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드간 포스포로티오에이트화 연결 (완전히 포스포로티오에이트화된 주쇄를 포함하여 그 주쇄까지)을 하나 이상 갖는, 바람직하게는 17개 뉴클레오티드 길이인 dA 단일중합체이다.
어댑터 올리고뉴클레오티드는 실시태양에 따라 100％ A, 99％ A, 98％ A, 97％ A, 96％ A, 95％ A, 94％ A, 93％ A, 92％ A, 91％ A, 90％ A, 85％ A, 80％ A, 75％ A, 70％ A, 65％ A, 60％ A, 55％ A, 50％ A, 45％ A 또는 그 이하로 이루어질 수 있다.
다른 종류의 어댑터 올리고뉴클레오티드는 식 5' Cn - Tm - Cp 3'를 포함하고, 여기서, n은 0-100의 정수 (예, 3-7)이고, p는 0-100의 정수 (예, 4-8)이고, m 은 0-100의 정수 (예, 2-10)이다. 바람직하게는, n 및 p의 합은 C 함량이 50％, 50％ 미만, 45％ 미만, 40％ 미만, 35％ 미만, 30％ 미만, 25％ 미만, 20％ 미만, 15％ 미만, 10％ 미만 또는 5％ 미만이도록 m의 값과 동일하거나 그 미만이다. 일부 실시태양에서, 상기 인용된 백분율이 만족된다면 n은 3-7이고, m은 2-10이고, p는 4-8이다. 상기 식의 일부 물질종을 도 8에 도시한다. 그 예는 5' C3T10C4 3'(서열 1), 5' C4T8C5 3' (서열 2), 5' C5T6C6 3' (서열 6), 5' C6T4C7 3' (서열 7) 및 5' C7T2C8 3' (서열 8)을 포함한다.
일부 실시태양에서, 어댑터 올리고뉴클레오티드는 면역자극성 CpG 모티프를 포함한다. 모티프는 메틸화되거나 비메틸화될 수 있다. 후자의 경우에, 전체 올리고뉴클레오티드가 비메틸화될 수 있거나 일부가 비메틸화될 수 있지만, 적어도 5' CG 3'의 C는 비메틸화되어야 한다. 비메틸화된 모티프 및 그의 면역 조정에 대한 효과는 미국 특허, 예를 들어 US 6,194,388 B1; US 6,207,646 B1; US 6,239,116 B1; 및 US 6,218,371 B1; 및 공개된 특허 출원, 예를 들어 PCT/US98/03678, PCT/US98/10408, PCT/US98/04703 및 PCT/US99/09863에 상세히 기재되어 있다. 각각의 상기 특허 및 특허 출원의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
상기한 바와 같이, 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "핵산"은 다중 뉴클레오티드 (즉, 포스페이트기에 및 피리미딘 (예, 시토신 (C), 티미딘 (T) 또는 우라실 (U)) 또는 퓨린 (예, 아데닌 (A) 또는 구아닌 (G))인 교환가능한 유기 염기에 연결된 당 (예, 리보스 또는 데옥시리보스)을 포함하는 분자)를 나타내도록 상호 교환가능하게 사용된다. 따라서, 상기 용어는 DNA와 RNA 올리고뉴클레오티드를 모두 포함한다. 상기 용어는 폴리뉴클레오시드 (즉, 포스페이트를 제외한 폴리뉴클레오티드) 및 임의의 다른 유기 염기 함유 중합체도 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 기존 핵산 원료 (예, 게놈 또는 cDNA)로부터 얻을 수 있지만, 바람직하게는 합성된다 (예, 핵산 합성기에 의해 생산된다).
올리고뉴클레오티드는 이중가닥 또는 단일가닥일 수 있다. 특정 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드가 단일가닥인 경우에는 2차 및 3차 구조를 형성할 수 있다 (예를 들어, 그 자체상에 접힘으로써, 또는 그의 전체를 통해 또는 그의 길이를 따라 선택된 절편에서 자체와 혼성화함으로써). 따라서, 상기 올리고뉴클레오티드의 1차 구조는 단일가닥일 수 있는 한편, 그의 보다 고차 구조는 이중 또는 삼중가닥일 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 길이가 다양할 수 있지만, 바람직하게는 100개 뉴클레오티드 (또는 염기) 길이 또는 그 미만이다. 어댑터 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 플라스미드 또는 벡터가 아니다. 이들은 또한 바람직하게는 안티센스 활성을 가질 수 없거나, 적어도 본 발명에 따라 나타나는 효과는 임의의 안티센스 활성과 관련되지 않는다.
올리고뉴클레오티드는 변형된 주쇄를 가질 수 있다. 예를 들어, 이들은 포스포디에스테르 연결이 아닌 적어도 하나의 뉴클레오티드간 연결을 포함할 수 있다. 상기 연결은 포스포로티오에이트 연결일 수 있다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 키메릭 (chimeric) 주쇄 (즉, 적어도 2개의 상이한 종류의 뉴클레오티드간 연결로 이루어진 주쇄)를 가질 수 있다.
본원에서 사용될 때, 용어 "포스포로티오에이트 주쇄"는 비-가교성 포스페이트 산소가 적어도 하나의 뉴클레오티드간 연결에서 황으로 교체되는 올리고뉴클레오티드의 안정화된 당 포스페이트 주쇄를 나타낸다. 한 실시태양에서, 비-가교성 포스페이트 산소는 각각의 모든 뉴클레오티드간 연결에서 황으로 교체된다.
올리고뉴클레오티드의 원료 및 제조
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 천연 RNA 및 DNA에 비해, 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 다리, β-D-리보스 단위 및/또는 천연 뉴클레오시드 염기 (아데닌, 구아닌, 시토신, 티민, 우라실)을 포함하는 다양한 화학적 변형 및 치환을 포함할 수 있다. 화학적 변형의 예는 숙련자에게 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 ([Uhlmann E et al. (1990) Chem Rev 90:543; "Protocols for Oligonucleotides and Analogs" Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed, Humana Press, Totowa, USA 1993]; [Crooke ST et al. (1996) Annu Rev Pharmacol Toxicol 36:107-29]; 및 [Hunziker J et al. (1995) Mod Synth Methods 7:331-417]에 기재되어 있다. 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형을 가질 수 있고, 여기서 각각의 변형은 천연 DNA 또는 RNA로 이루어진 동일한 서열의 올리고뉴클레오티드에 비해 특정 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 다리 및/또는 특정 β-D-리보스 단위 및/또는 특정 천연 뉴클레오시드 염기 위치에 위치한다.
예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있고, 여기서 각각의 변형은 다음의 것들로부터 독립적으로 선택된다:
a) 뉴클레오시드의 3' 및/또는 5' 말단에 위치한 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 다리의, 변형된 뉴클레오시드간 다리에 의한 교체,
b) 뉴클레오시드의 3' 및/또는 5' 말단에 위치한 포스포디에스테르 다리의, 데포스포 다리에 의한 교체,
c) 당 포스페이트 주쇄로부터 당 포스페이트 단위의, 다른 단위에 의한 교체,
d) β-D-리보스 단위의, 변형된 당 단위에 의한 교체, 및
e) 천연 뉴클레오시드 염기의, 변형된 뉴클레오시드 염기에 의한 교체.
올리고뉴클레오티드의 화학적 변형에 대한 보다 상세한 예는 다음과 같다.
올리고뉴클레오티드는 상기 (a) 또는 (b)에 설명된 것과 같은 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함할 수 있다. 상기 변형 연결은 분해에 대해 부분적으로 저항성일 수 있다 (예를 들어, 안정화된다). "안정화된 올리고뉴클레오티드"는 상기 변형으로부터 생성되는 생체내 분해 (예, 엑소- 또는 엔도-뉴클레아제를 통한)에 대해 비교적 저항성인 올리고뉴클레오티드를 의미할 것이다. 일부 실시태양에서, 포스포로티오에이트 연결을 갖는 올리고뉴클레오티드는 최대 활성을 제공하고 올리고뉴클레오티드를 세포내 엑소- 및 엔도-뉴클레아제에 의한 분해로부터 보호할 수 있다.
뉴클레오시드의 3' 및/또는 5' 말단에 위치하는 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 다리는 변형된 뉴클레오시드간 다리에 의해 교체될 수 있고, 여기서 변형된 뉴클레오시드간 다리는 예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, NR1R2-포스포르아미데이트, 보라노포스페이트, α-히드록시벤질 포스포네이트, 포스페이트-(C1-C21)-O-알킬 에스테르, 포스페이트-[(C6-C12)아릴-(C1-C21)-O-알킬]에스테르, (C1-C8)알킬포스포네이트 및/또는 (C6-C12)아릴포스포네이트 다리, (C7-C12)-알파-히드록시메틸-아릴 (예를 들어, WO 95/01363에 개시됨) 중에서 선택되고, 여기서 (C6-C12)아릴, (C6-C20)아릴 및 (C6-C14)아릴은 할로겐, 알킬, 알콕시, 니트로, 시아노로 임의로 치환되고, 여기서 R1 및 R2는 서로 독립적으로 수소, (C1-C18)-알킬, (C6-C20)-아릴, (C6-C14)-아릴-(C1-C8)-알킬, 바람직하게는 수소, (C1-C8)-알킬, 바람직하게는 (C1-C4)-알킬 및/또는 메톡시에틸이거나, R1 및 R2는 그들을 갖는 질소 원자와 함께, 추가로 O, S 및 N 중에서 선택되는 추가의 헤테로원자를 포함할 수 있는 5-6원 헤테로시클릭 고리를 형성한다.
뉴클레오시드의 3' 및/또는 5' 말단에 위치하는 포스포디에스테르 다리는 데포스포 다리에 의해 교체될 수 있고 (데포스포 다리는 예를 들어 문헌 [Uhlmann E and Peyman A in "Methods in Molecular Biology", Vol. 20, "Protocols for Oligonucleotides and Analogs", S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa 1993, Chapter 16, pp. 355 ff]에 기재되어 있다), 여기서 데포스포 다리는 예를 들어 데포스포 다리 포름아세탈, 3'-티오포름아세탈, 메틸히드록실아민, 옥심, 메틸렌디메틸-히드라조, 디메틸렌술폰 및/또는 실릴기 중에서 선택된다.
당 포스페이트 주쇄 (즉, 당 포스페이트 주쇄는 당 포스페이트 단위로 이루어짐)로부터의 당 포스페이트 단위 (즉, 함께 당 포스페이트 단위를 형성하는 β-D-리보스 및 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 다리)는 다른 단위에 의해 교체될 수 있고, 여기서 다른 단위는 예를 들어 "모르폴리노-유도체" 올리고머 (예를 들어 문헌 [Stirchak EP et al. (1989) Nucleic Acids Res 17:6129-41]에 설명된 바와 같이)를 구성하기 위해 (즉, 예를 들어, 모르폴리노-유도체 단위를 사용하는 교체), 또는 폴리아미드 핵산 ("PNA"; 예를 들어, 문헌 [Nielsen PE et al. (1994) Bioconjug Chem 5:3-7]에 설명된 바와 같이)을 구성하기 위해 (즉, 예를 들어, PNA 주쇄 단위를 사용하는, 예를 들어 2-아미노에틸글라이신에 의한 교체) 적합하다. 올리고뉴클레오티드는 다른 탄수화물 주쇄 변형 및 교체, 예를 들어 포스페이트기를 갖는 펩티드 핵산 (PHONA), 잠금 (locked) 핵산 (LNA), 및 알킬 링커 또는 아미노 링커를 갖는 주쇄 구역을 갖는 올리고뉴클레오티드를 가질 수 있다. 알킬 링커는 분지되거나 분지되지 않고, 치환되거나 치환되지 않고, 키랄상 순수하거나 라세미 혼합물일 수 있다.
β-리보스 단위 또는 β-D-2'-데옥시리보스 단위는 변형된 당 단위로 교체될 수 있고, 여기서 변형된 당 단위는 예를 들어 β-D-리보스, α-D-2'-데옥시리보스, L-2'-데옥시리보스, 2'-F-2'-데옥시리보스, 2'-F-아라비노스, 2'-O-(C1-C6)알킬-리보스, 2'-O-메틸리보스, 2'-O-(C2-C6)알케닐-리보스, 2'-[O-(C1-C6)알킬-O-(C1-C6)알킬]-리보스, 2'-NH2-2'-데옥시리보스, β-D-자일로-푸라노스, α-아라비노푸라노스, 2,4-디데옥시-β-D-에리트로-헥소-피라노스 및 카르복실릭 (예를 들어 문헌 [Froehler (1992) J Am Chem Soc 114:8320]에 기재된) 및/또는 개방쇄 당 유사체 (예를 들어 문헌 [Vandendriessche et al. (1993) Tetrahedron 49:7223]에 기재된) 및/또는 비시클로당 (bicyclosugar) 유사체 (예를 들어 문헌 [Tarkov M et al. (1993) Helv Chim Acta 76:481]에 기재된) 중에서 선택된다.
일부 실시태양에서, 변형된 당은 2' 변형된 리보스이다. 일부 실시태양에서, 당은 특히 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 뉴클레오시드간 연결에 의해 연결된 하나 또는 두 뉴클레오티드 모두에 대해 2'-O-메틸리보스이다.
핵산은 또한 치환 퓨린 및 피리미딘, 예를 들어 C-5 프로핀 피리미딘 및 7-데아자-7-치환 퓨린 변형 염기를 포함한다 (Wagner RW et al. (1996) Nat Biotechnol 14:840-4). 퓨린 및 피리미딘은 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민 및 다른 자연 및 비-자연 발생 핵염기, 치환 및 비치환 방향족 잔기를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
변형 염기는 DNA 및 RNA에서 전형적으로 발견되는 자연 발생 염기, 예를 들어 T, C, G, A 및 U와 화학적으로 구별되지만 상기 자연 발생 염기와 기본 화학 구조를 공유하는 임의의 염기이다. 변형 뉴클레오시드 염기는 예를 들어 히포잔틴, 우라실, 디히드로우라실, 슈도우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-아미노우라실, 5-(C1-C6)-알킬우라실, 5-(C2-C6)-알케닐우라실, 5-(C2-C6)-알키닐우라실, 5-(히드록시메틸)우라실, 5-클로로우라실, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-히드록시시토신, 5-(C1-C6)-알킬시토신, 5-(C2-C6)-알케닐시토신, 5-(C2-C6)-알키닐시토신, 5-클로로시토신, 5-플루오로시토신, 5-브로모시토신, N2-디메틸구아닌, 2,4-디아미노-퓨린, 8-아자퓨린, 치환 7-데아자퓨린, 바람직하게는 7-데아자-7-치환 및/또는 7-데아자-8-치환 퓨린, 5-히드록시메틸시토신, N4-알킬시토신, 예를 들어, N4-에틸시토신, 5-히드록시데옥시시티딘, 5-히드록시메틸데옥시시티딘, N4-알킬데옥시시티딘, 예를 들어, N4-에틸데옥시시티딘, 6-티오데옥시구아노신 및 니트로피롤의 데옥시리보뉴클레오시드, C5-프로피닐피리미딘, 및 디아미노퓨린, 예를 들어, 2,6-디아미노퓨린, 이노신, 5-메틸시토신, 2-아미노퓨린, 2-아미노-6-클로로퓨린, 히포잔틴 또는 천연 뉴클레오시드 염기의 다른 변형 중에서 선택될 수 있다. 상기 염기는 예시적인 것이고, 제한하는 것으로 해석하지 않아야 한다.
본원에 설명된 특정 식에서 변형 염기가 포함될 수 있다. 예를 들어, 시토신은 변형된 시토신으로 교체될 수 있다. 본원에서 사용될 때, 변형된 시토신은 올리고뉴클레오티드의 면역자극 활성을 손상하지 않으면서 상기 염기를 교체할 수 있는 시토신의 자연 발생 또는 비-자연 발생 피리미딘 염기 유사체이다. 변형된 시토신은 5-치환 시토신 (예, 5-메틸-시토신, 5-플루오로-시토신, 5-클로로-시토신, 5-브로모-시토신, 5-요오도-시토신, 5-히드록시-시토신, 5-히드록시메틸-시토신, 5-디플루오로메틸-시토신, 및 비치환 또는 치환 5-알키닐-시토신), 6-치환 시토신, N4-치환 시토신 (예, N4-에틸-시토신), 5-아자-시토신, 2-머캅토-시토신, 이소시토신, 슈도-이소시토신, 축합 고리계를 갖는 시토신 유사체 (예, N,N'-프로필렌 시토신 또는 페녹사진), 및 우라실 및 그의 유도체 (예, 5-플루오로-우라실, 5-브로모-우라실, 5-브로모비닐-우라실, 4-티오-우라실, 5-히드록시-우라실, 5-프로피닐-우라실)을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 일부 바람직한 시토신은 5-메틸-시토신, 5-플루오로-시토신, 5-히드록시-시토신, 5-히드록시메틸-시토신, 및 N4-에틸-시토신을 포함한다. 본 발명의 다른 실시태양에서, 시토신 염기는 범용 염기 (예, 3-니트로피롤, P-염기), 방향족 고리계 (예, 플루오로벤젠 또는 디플루오로벤젠) 또는 수소 원자 (dSpacer)에 의해 치환된다.
또다른 예로서, 구아닌은 변형된 구아닌 염기로 치환될 수 있다. 본원에서 사용될 때, 변형된 구아닌은 올리고뉴클레오티드의 면역자극 활성을 손상하지 않으면서 상기 염기를 교체할 수 있는 구아닌의 자연 발생 또는 비-자연 발생 퓨린 염기 유사체이다. 변형된 구아닌은 7-데아자구아닌, 7-데아자-7-치환 구아닌 (예, 7-데아자-7-(C2-C6)알키닐구아닌), 7-데아자-8-치환 구아닌, 히포잔틴, N2-치환 구아닌 (예, N2-메틸-구아닌), 5-아미노-3-메틸-3H,6H-티아졸로[4,5-d]피리미딘-2,7-디온, 2,6-디아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 퓨린, 인돌, 아데닌, 치환 아데닌 (예, N6-메틸-아데닌, 8-옥소-아데닌), 8-치환 구아닌 (예, 8-히드록시구아닌 및 8-브로모구아닌), 및 6-티오구아닌을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 본 발명의 다른 실시태양에서, 구아닌 염기는 범용 염기 (예, 4-메틸-인돌, 5-니트로-인돌, 및 K-염기), 방향족 고리계 (예, 벤즈이미다졸 또는 디클로로-벤즈이미다졸, 1-메틸-1H-[1,2,4]트리아졸-3-카르복실산 아미드) 또는 수소 원자 (dSpacer)에 의해 치환된다.
본 발명에 사용하기 위해, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 당업계에 잘 공지된 임의의 많은 과정, 예를 들어, β-시아노에틸 포스포르아미다이트 방법 (Beaucage SL et al. (1981) Tetrahedron Lett 22: 1859), 또는 뉴클레오시드 H-포스포네이트 방법 ([Garegg et al. (1986) Tetrahedron Lett 27:4051-4]; [Froehler et al. (1986) Nucleic Acid Res 14:5399-407]; [Garegg et al. (1986) Tetrahedron Lett 27:4055-8]; [Gaffney et al. (1988) Tetrahedron Lett 29:2619-22])을 사용하여 드 노보 (de novo)로 합성할 수 있다. 상기 화학 반응은 상업적으로 이용가능한 다양한 자동화 핵산 합성기에 의해 수행할 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 합성 올리고뉴클레오티드로서 칭한다. 단리된 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 자연에서 정상적으로 결합된 성분으로부터 분리된 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 한 예로서, 단리된 올리고뉴클레오티드는 세포로부터, 핵으로부터, 미토콘드리아로부터, 또는 염색질로부터 분리된 것일 수 있다.
변형된 주쇄, 예를 들어 포스포로티오에이트는 포스포르아미데이트 또는 H-포스포네이트 화학 반응을 이용하는 자동화 기술을 이용하여 합성할 수 있다. 아릴- 및 알킬-포스포네이트는 예를 들어 미국 특허 4,469,863에 기재된 것과 같이 제조할 수 있고; 알킬포스포트리에스테르 (여기서, 전하를 띤 산소 잔기는 미국 특허 5,023,243 및 유럽 특허 092,574에 설명된 바와 같이 알킬화된다)는 상업적으로 이용가능한 시약을 사용하여 자동화 고상 합성에 의해 제조할 수 있다. 다른 DNA 주쇄 변형 및 치환을 행하는 방법들도 설명되었다 ([Uhlmann E et al. (1990) Chem Rev 90:544]; [Goodchild J (1990) Bioconjugate Chem 1: 165]).
단리물
특정 실시태양에서, TLR7/8 리간드 및/또는 어댑터 올리고뉴클레오티드는 단리된다. 단리된 리간드 또는 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 순수하거나, 보통 천연에서 또는 생체내 시스템에서 함께 발견되는 다른 물질이 그의 의도된 용도에 실용적이고 적절한 정도로 없는 리간드 또는 올리고뉴클레오티드이다. 특히, 리간드 또는 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 제약 제제를 제조하기 위해 유용하도록 충분히 순수하고 세포의 다른 생물학적 성분이 충분히 없다. 단리된 리간드 또는 올리고뉴클레오티드는 제약 제제 내에 제약상 허용되는 담체와 혼합될 수 있기 때문에, 리간드 또는 올리고뉴클레오티드는 제제 중량의 작은 비율만을 차지할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 리간드 또는 올리고뉴클레오티드는 살아있는 시스템에서 결합될 수 있는 물질로부터 실질적으로 분리된다는 점에서 단리된 것이다.
컨쥬게이트
본원에서 사용될 때, 용어 "컨쥬게이트"는 임의의 물리화학적 상호작용을 통해 직접 또는 간접적으로 함께 연결된 2개 이상의 성분 부분의 임의의 조합물을 나타낸다. 한 실시태양에서, 컨쥬게이트는 공유결합을 통해 직접 또는 간접적으로 함께 연결된 2개 이상의 성분 부분의 조합물이다.
한 측면에서, 본 발명은 TLR 리간드 및 어댑터 올리고뉴클레오티드의 컨쥬게이트를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 실시태양에서, 컨쥬게이트는 공유결합을 통해 만들어진다. 한 실시태양에서, 컨쥬게이트는 링커를 포함한다.
컨쥬게이트는 하나 이상의 어댑터 올리고뉴클레오티드 및 본 발명의 하나 이상의 TLR7/8 리간드를 포함할 수 있다. 컨쥬게이트는 별법으로 또는 추가로 항원 또는 다른 의약을 포함하지만 이로 제한되지 않는 하나 이상의 다른 분자를 포함할 수 있다.
도 13-15는 리간드 및 올리고뉴클레오티드 모두 상의 부착 지점을 포함한 상기 컨쥬게이트의 많은 특징, 및 상기 컨쥬게이션을 용이하게 하기 위해 선택적인 링커 사용을 예시한다.
한 실시태양에서, 컨쥬게이트는 어댑터 올리고뉴클레오티드 및 특정 TLR7 특이적 리간드, 예를 들어 비제한적으로 이뮤노신 또는 록소리빈의 컨쥬게이트이다. 어댑터 올리고뉴클레오티드는 8-20, 바람직하게는 10-20, 보다 바람직하게는 14-18개 뉴클레오티드 길이의 폴리(dT) 올리고뉴클레오티드일 수 있지만 이로 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 특히 어댑터 올리고뉴클레오티드가 자체가 면역자극성이거나 TLR9를 통해 신호를 전달하는 경우에, 어댑터 올리고뉴클레오티드 및 특정 TLR7/8 리간드, 예를 들어 이미다조퀴놀린 및 C8-치환 구아노신의 컨쥬게이트는 제외된다.
도 13A-C는 이뮤노신 및 컨쥬게이션 과정에 사용될 수 있는 그의 2개의 단량체 변이체의 구조를 예시한다. 도 13B에 도시된 변이체는 내부 위치에서 또는 3' 말단에서 올리고뉴클레오티드에 컨쥬게이트될 수 있다. 따라서, 하나 이상의 상기 변이체가 올리고뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 도 13C에 도시된 변이체는 5' 말단에서 올리고뉴클레오티드에 컨쥬게이트될 수 있다. 도 14는 링커를 사용하는 이뮤노신의 올리고뉴클레오티드에 대한 컨쥬게이션을 예시한다. 도 15는 링커 및/또는 올리고뉴클레오티드가 컨쥬게이트될 수 있는 R-848, CL-029 및 이뮤노신 내의 부착 지점을 예시한다. 본 발명의 컨쥬게이트는 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 링커를 포함할 수 있거나, 별법으로 링커가 결핍될 수 있다. 컨쥬게이트의 예는 폴리(dT)14-L2-IM (여기서, L은 링커를 나타내고, IM은 이뮤노신을 나타내고, 아래첨자는 컨쥬게이트 내의 각각의 단위의 수를 나타낸다)이다 (서열 9). 다른 예는 IM-L2-(dT)14이다 (서열 10). 상기 예들의 차이는 3' 말단 또는 5' 말단에서 이뮤노신 및 링커의 배치이다.
링커는 올리고뉴클레오티드 상의 주쇄 포스페이트기 또는 당 히드록실기를 포함하지만 이로 제한되지 않는 임의의 반응성 잔기에 부착될 수 있다. 예를 들어, 이들을 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및/또는 아미드 연결을 통해 포함될 수 있다.
링커는 성질상 비-뉴클레오티드일 수 있다. 이들은 예를 들어, 염기상실 (abasic) 잔기 (dSpacer), 올리고에틸렌글리콜, 예를 들어 트리에틸렌글리콜 (스페이서 9) 또는 헥사에틸렌글리콜 (스페이서 18), 또는 알칸-디올, 예를 들어 부탄디올을 포함한다. 링커는 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 결합에 의해 서로 부착될 수 있다. 다른 링커는 알킬아미노 링커, 예를 들어 C3, C6, C12 아미노 링커, 및 또한 알킬티올 링커, 예를 들어 C3 또는 C6 티올 링커일 수 있다. 상이한 종류의 링커가 또한 하나의 컨쥬게이트 내에 사용될 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 알킬 또는 치환된 알킬기로 더욱 치환될 수 있는 방향족 잔기에 의해 연결될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 또한 2배 또는 3배 단위를 함유할 수 있고, 이는 하나 또는 상이한 종류의 다중 리간드의 올리고뉴클레오티드에 대한 컨쥬게이션을 허용한다. 올리고뉴클레오티드는 또한 펩티드 변형 시약 또는 올리고뉴클레오티드 변형 시약으로부터 생성되는 링커를 함유할 수 있다. 또한, 이들은 펩티드 (아미드) 연결에 의해 연결되는 하나 이상의 천연 또는 비천연 아미노산 잔기를 함유할 수 있다.
상이한 올리고뉴클레오티드가 확립된 방법에 의해 합성되고, 고상 합성 동안 함께 온라인으로 (on-line) 연결될 수 있다. 별법으로, 이들은 개별 단위의 합성 후 함께 연결될 수 있다.
면역 반응
한 실시태양에서, TLR-매개 면역 반응은 Th1-유사 면역 반응이다. 본원에서 사용될 때, 용어 "Th1-유사"는 Th1 면역 반응의 특징적인 면을 갖는다는 것을 나타낸다. Th1 면역 반응은 특징적으로 특정 사이토킨, 예를 들어 IFN-γ의 유도, IgG2a 면역글로불린의 분비 (마우스에서), 및 대식세포 활성화를 포함한다. 용어 "Th1-유사"는 아래 논의되는 바와 같이 Th2 면역 반응의 특징적인 면을 갖는다는 것을 나타내는 용어 "Th2-유사"에 대조된다.
Th1-유사 면역 반응은 Th1 면역 반응과 특징적으로 연관된 임의의 특정 사이토킨 및 케모카인, 예를 들어 IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNF-α, IL-12, IL-18, IP-10 및 이들의 임의의 조합의 발현을 포함할 수 있다. Th1 면역 반응 및 Th2 면역 반응은 역-조절성인 것으로 생각된다. 일부 실시태양에서, Th1-유사 면역 반응은 특정 Th2-연관 사이토킨, 예를 들어 IL-4, IL-5, IL-10, 및 IL-13의 억제를 포함할 수 있다. Th1-유사 면역 반응은 특정 Th2-연관 항체 이소형, 예를 들어 IgE 및 (마우스에서) IgG1을 억제하거나 억제하지 않으면서 특정 항체 이소형, 예를 들어 (마우스에서) IgG2a의 발현을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, Th1-유사 면역 반응은 Th1 반응이다.
Th2-유사 면역 반응은 Th2 면역 반응과 특징적으로 연관된 임의의 특정 사이토킨 및 케모카인, 예를 들어 IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 및 이들의 임의의 조합의 발현을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, Th2-유사 면역 반응은 특정 Th1-연관 사이토킨의 억제를 포함할 수 있다. Th2-유사 면역 반응은 특정 Th1-연관 항체 이소형, 예를 들어 (마우스에서) IgG2a를 억제하거나 억제하지 않으면서 특정 항체 이소형, 예를 들어 IgE 및 (마우스에서) IgG1의 발현을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, Th2-유사 면역 반응은 Th2 반응이다.
따라서, 한 실시태양에서, 본 발명은 대상에서 Th1-유사 면역 반응을 유도하기 위한 방법을 제공한다. Th1-유사 면역 반응을 유도하는 것은 Th1-유사 면역 반응을 증대 또는 향상시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 대상에서 Th1-유사 면역 반응을 유도하기 위해 대상에게 유효량의 본 발명의 TLR7/8 리간드 및 어댑터 올리고뉴클레오티드를 투여하는 단계를 포함한다.
한 실시태양에서, 본 발명은 대상에서 Th2-유사 면역 반응을 억제하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 대상에서 Th2-유사 면역 반응을 억제하기 위해 대상에게 유효량의 본 발명의 TLR7/8 리간드 및 어댑터 올리고뉴클레오티드를 투여하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 우세한 Th2 특징을 갖는 면역 반응을 특징으로 하는 병태에 걸리거나 걸릴 위험이 있는 대상의 치료에 사용될 수 있다. 상기 상태는 비제한적으로 알레르기 및 천식을 포함한다.
한 실시태양에서, 면역 반응은 면역 세포 활성화의 세포 표면 마커, 예를 들어 CD25, CD80, CD86, 및 CD154의 상향조절을 포함한다. 상기 마커의 세포 표면 발현을 측정하기 위한 방법은 당업계에 잘 공지되어 있고, FACS 분석을 포함한다.
세포 또는 세포의 집단에서 면역 반응의 측정을 위해, 한 실시태양에서 세포 또는 세포의 집단은 TLR7, TLR8, 또는 TLR9의 적어도 하나, 일부 경우에는 바람직하게는 단지 하나만을 발현한다. 세포는 자연적으로 TLR을 발현할 수 있거나, TLR에 대한 적합한 발현 벡터의 세포 내로의 도입을 통해 TLR을 발현하도록 조작될 수 있다. 한 실시태양에서, 세포 또는 세포의 집단은 말초혈 단핵 세포 (PBMC)로서 얻어진다. 한 실시태양에서, 세포 또는 세포의 집단은 TLR을 발현하는 세포주로서 얻어진다. 한 실시태양에서, 세포 또는 세포의 집단은 TLR로 일시적으로 형질감염된 세포주로서 얻어진다. 한 실시태양에서, 세포 또는 세포의 집단은 TLR로 안정적으로 형질감염된 세포주로서 얻어진다.
또한, 세포 또는 세포 집단에서 면역 반응을 측정하는데 사용하기 위해, TLR에 의한 세포내 신호전달에 반응성인 (즉, 그에 의해 조절되는) 리포터 구성체를 세포 또는 세포 집단 내로 도입하는 것이 편리할 수 있다. 한 실시태양에서, 상기 리포터는 NF-κB 프로모터의 제어 하에 놓인 유전자이다. 한 실시태양에서, 프로모터의 제어 하에 놓인 유전자는 루시퍼라제이지만, 녹색 형광 단백질 (GFP), β-갈락토시다제, 알칼리성 포스파타제 등을 포함하는 다른 리포터 유전자가 사용될 수 있다. 한 예로서, 적합한 활성화 조건 하에, 루시퍼라제 리포터 구성체가 발현되고, 발광분석기를 사용하여 정량적으로 측정될 수 있는 검출가능한 광 신호를 방출한다. 상기 및 다른 리포터 구성체는 상업적으로 입수가능하다. 다른 실시태양에서, TLR-매개 면역 반응은 사이토킨, 예를 들어 IFN-알파, TNF-알파, IL-12, IFN-감마 등의 생산 (mRNA 또는 단백질) 또는 분비에 의해 특정될 수 있다. 실시예는 상기 종류의 분석을 증명한다. 본 발명은 또한 TLR 활성화를 검출하는 무세포 방법의 사용을 고려한다.
본 발명은 또한 항원 특이적 면역 반응 (본원에서 더욱 상세히 설명함) 및 비-특이적 선천 면역 활성화 및 감염성 공격 (challenge)에 대한 광범위 저항성을 유도하기 위한 방법을 포함한다. 본원에서 사용될 때, 용어 항원 비-특이적 선천 면역 활성화는 B 세포 이외의 면역 세포, 예를 들어 NK 세포, T 세포 또는 항원 비의존 방식으로 반응할 수 있는 다른 면역 세포, 또는 상기 세포의 일부 조합의 활성화를 나타낸다. 면역 세포는 활성형으로 존재하고 임의의 침입하는 화합물 또는 미생물에 반응하도록 프라이밍되기 때문에, 감염성 공격에 대한 광범위 저항성이 유도된다. 세포는 특정 항원에 대해 특이적으로 프라이밍될 필요가 없다. 이는 생물전쟁 및 상기 설명된 다른 상황, 예를 들어 여행자에게 특히 유용하다.
대상
본원에서 사용될 때, 대상은 인간 또는 비-인간 척추동물을 나타낸다. 비-인간 척추동물은 가축, 반려 동물 및 실험용 동물을 포함한다. 비-인간 대상은 또한 구체적으로 비-인간 영장류와 설치류를 포함한다. 또한, 비-인간 대상은 구체적으로 비제한적으로 닭, 말, 소, 돼지, 염소, 고양이, 기니아 피그, 햄스터, 밍크 및 토끼를 포함한다.
본원에서 사용될 때, 병태를 발병할 위험이 있는 대상은 병태를 유발하거나 연관되는 것으로 알려진 물질에 대한 노출이 알려지거나 의심되는, 또는 병태를 발병할 소인이 알려지거나 의심되는 (예를 들어, 병태에 대한 유전자 마커 또는 가족력) 대상을 나타낸다.
한 측면에서, 본 발명은 면역계 결핍이 있는 대상을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 상기 측면에 따른 방법은 대상을 치료하기 위해 대상에게 유효량의 본 발명의 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 본원에서 사용될 때, 면역계 결핍은 항원에 대한 면역 반응을 불러일으키는 면역계의 비정상적으로 저하된 능력을 나타낸다. 한 실시태양에서, 면역계 결핍은 대상의 면역계가 정상 능력으로 기능하지 않거나, 예를 들어, 대상에서 종양 또는 암 또는 감염을 제거하기 위해 대상의 면역 반응을 증대시키는 것이 유용할 질환 또는 장애이다. 본원에서 사용될 때, 면역 결핍이 있는 대상은 예를 들어 항원에 대한 면역 반응을 불러일으키는 대상의 면역계의 능력이 저하된 대상을 나타낸다. 면역 결핍이 있는 대상은 후천적 면역 결핍이 있는 대상뿐만 아니라 선천적 면역계 결핍이 있는 대상을 포함한다. 후천적 면역 결핍이 있는 대상은 비제한적으로 만성 염증 상태가 있는 대상, 만성 신부전 또는 신장 기능 상실이 있는 대상, 감염에 걸린 대상, 암에 걸린 대상, 면역억제 약물을 투여받는 대상, 다른 면역억제 치료를 받는 대상, 및 영양실조인 대상을 포함한다. 한 실시태양에서, 대상은 억제된 CD4+ T-세포 집단을 갖는다. 한 실시태양에서, 대상은 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)로 감염되거나, 후천적 면역결핍 증후군 (AIDS)에 걸린 상태이다. 따라서, 본 발명의 상기 측면에 따른 방법은 보다 왕성한 면역 반응을 필요로 하는 대상에서 면역 반응을 증대시키거나 면역 반응을 불러일으키는 능력을 증대시키기 위한 방법을 제공한다.
본원에서 사용될 때, 억제하다는 정상에 비해 결과 또는 효과를 감소시키는 것을 의미할 것이다.
본원에서 사용될 때, 질환 또는 상태에 관련하여 사용되는 치료하다는 질환 또는 상태의 발병을 예방 또는 느리게 하거나, 질환 또는 상태의 진행을 예방 또는 느리게 하거나, 질환 또는 상태의 진행을 정지시키거나, 질환 또는 상태를 제거하도록 질환 또는 상태에 개입하는 것을 의미할 것이다. 예를 들어, 암을 치료하는은 암의 발병을 예방하고/하거나 (예를 들어, 전암성 상태로부터), 암의 증상을 감소시키고/시키거나, 확립된 암의 성장을 억제하는 것을 포함한다.
병태
본 발명은 특정 TLR-매개 면역 반응의 억제 및/또는 유도가 유익할 병태를 치료하는 것을 의도한다. 본원에서 사용될 때, TLR7-매개 면역자극 또는 면역 반응과 연관된 병태는 TLR7 신호전달과 연관된 면역 활성화가 존재하고, 상기 활성화가 불리한 대상에서의 임의의 질환 또는 다른 상태를 나타낸다. 상기 병태는 대개 TLR7 리간드와의 접촉에 반응하여 TLR7 신호전달의 활성화를 포함한다.
본원에서 사용될 때, TLR8-매개 면역자극 또는 면역 반응과 연관된 병태는 TLR8 신호전달과 연관된 면역 활성화가 존재하고, 상기 활성화가 불리한 대상에서의 임의의 질환 또는 다른 상태를 나타낸다. 상기 병태는 대개 TLR8 리간드와의 접촉에 반응하여 TLR8 신호전달의 활성화를 포함한다.
본원에서 사용될 때, TLR9-매개 면역자극 또는 면역 반응과 연관된 병태는 TLR9 신호전달과 연관된 면역 활성화가 존재하고, 상기 활성화가 불리한 대상에서의 임의의 질환 또는 다른 상태를 나타낸다. 상기 병태는 일반적으로 TLR9 리간드와의 접촉에 반응하여 TLR9 신호전달의 활성화를 포함한다.
감염
본 발명은 감염과 같은 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 감염은 대상 내에 생육하는 세포내 또는 세포외 미생물의 비정상적인 수집물 또는 집단이 존재하는 임의의 상태를 나타낸다. 상기 미생물은 대상에 내재할 수 있거나, 대상에 외래일 수 있다. 감염에 걸린 대상은 감염성 미생물에 의한 표면상, 국소적으로 또는 전신적으로 대상의 침입으로부터, 또는 대상에서 자연 발생하는 내재 미생물의 비정상적인 상향조절된 성장으로부터 발생하는 장애가 있는 대상이다. 감염성 미생물은 상기 설명된 바와 같은 바이러스, 세균, 진균 또는 기생충일 수 있다. 세균인 미생물, 바이러스인 미생물, 진균인 미생물 및 기생충인 미생물을 포함하는 다양한 종류의 미생물이 감염을 일으킬 수 있다.
세균은 이분법에 의해 무성 증식하는 단세포 유기체이다. 이들은 그들의 형태학, 염색 반응, 영양 및 대사 요구, 항원 구조, 화학 조성, 및 유전적 상동성에 기초하여 분류되고 명명된다. 세균은 그들의 형태학적 형태를 기초로 3개의 군, 즉, 구형 (구균), 직선 막대형 (간균) 및 만곡 또는 나선 막대형 (비브리오, 캄필로박터 (campylobacter), 스피릴륨 (spirillum), 및 스피로헤타 (spirochaete))로 분류될 수 있다. 세균은 또한 보다 일반적으로 그들의 염색 반응을 특징으로 2개 종류의 유기체, 즉, 그람 양성 및 그람 음성으로 분류된다. 그람은 미생물 실험실에서 흔히 수행되는 염색 방법을 나타낸다. 그람 양성 유기체는 염색 과정 이후 염료를 보유하고 심자색을 보인다. 그람 음성 유기체는 염료를 보유하지 않지만 대비염색을 흡수하여, 분홍색으로 보인다.
감염성 세균은 그람 음성 및 그람 양성 세균을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 그람 양성 세균은 파스퇴렐라 (Pasteurella) 종, 포도상구균 (Staphylococci) 종 및 연쇄상구균 (Streptococcus) 종을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 그람 음성 세균은 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 슈도모나스 (Pseudomonas) 종 및 살모넬라 (Salmonella) 종을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 감염성 세균의 구체적인 예는 헬리코박터 파일로리스 (Helicobacter pyloris), 보렐리아 부르그도르페리 (Borelia burgdorferi), 폐렴 레지오넬라 (Legionella pneumophilia), 미코박테리움 (Mycobacterium) 종 (예, 결핵균 (M. tuberculosis), 조류형 결핵균 (M. avium), 세포내형 결핵균 (M. intracellulare), 엠. 칸사이 (M. kansaii), 엠. 고르도내 (M. gordonae)), 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus), 임균 (Neisseria gonorrhoeae), 수막염균 (Neisseria meningitidis), 단구성 리스테리아 (Listeria monocytogenes), 화농연쇄상구균 (Streptococcus pyogenes) (그룹 A 연쇄상구균), 무유성 연쇄상구균 (S. agalactiae) (그룹 B 연쇄상구균), 연쇄상구균 (녹색연쇄구균 (viridans)), 대변연쇄상구균 (S. faecalis), 소연쇄상구균 (S. bovis), 연쇄상구균 (혐기성 종), 폐렴연쇄상구균 (S. pneumoniae), 병원성 캄필로박터 (Campylobacter) 종, 장내구균 (Enterococcus) 종, 헤모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae), 탄저균 (Bacillus antracis), 디프테리아균 (Corynebacterium diphtheriae), 코리네박테리움 종, 단독균 (Erysipelothrix rhusiopathiae), 클로스트리듐 펄프리젠스 (Clostridium perfringens), 파상풍균 (Clostridium tetani), 엔테로박터 에어로게네스 (Enterobacter aerogenes), 폐렴간균 (Klebsiella pneumoniae), 파스투렐라 물토시다 (Pasturella multocida), 박테로이데스 (Bacteroides) 종, 푸소박테륨 뉴클레아툼 (Fusobacterium nucleatum), 모닐리포르미스 연쇄상간균 (Streptobacillus moniliformis), 매독균 (Treponema pallidium), 트레포네마 페르테누 (Treponema pertenue), 렙토스피라, 리켓차 및 악티노마이세스 이즈라엘리 (Actinomyces israelli)를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
세균은 파스퇴렐라 종, 포도상구균 종, 연쇄상구균 종, 에스케리치아 콜라이, 슈도모나스 종 및 살모넬라 종을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 감염성 세균의 구체적인 예는 헬리코박터 파일로리스, 보렐리아 부르그도르페리, 폐렴 레지오넬라, 미코박테리움 종 (예, 결핵균, 조류형 결핵균, 세포내형 결핵균, 엠. 칸사이, 엠. 고르도내), 황색포도상구균, 임균, 수막염균, 단구성 리스테리아, 화농연쇄상구균 (그룹 A 연쇄상구균), 무유성 연쇄상구균 (그룹 B 연쇄상구균), 연쇄상구균 (녹색연쇄구균), 대변연쇄상구균, 소연쇄상구균, 연쇄상구균 (혐기성 종), 폐렴연쇄상구균, 병원성 캄필로박터 종, 장내구균 종, 헤모필루스 인플루엔자, 탄저균, 디프테리아균, 코리네박테리움 종, 단독균, 클로스트리듐 펄프리젠스, 파상풍균, 엔테로박터 에어로게네스, 폐렴간균, 파스투렐라 물토시다, 박테로이데스 종, 푸소박테륨 뉴클레아툼, 모닐리포르미스 연쇄상간균, 매독균, 트레포네마 페르테누, 렙토스피라, 리켓차 및 악티노마이세스 이즈라엘리를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
바이러스는 일반적으로 핵산 코어 및 단백질 외피를 함유하지만 독립적으로 생활하는 유기체가 아닌 작은 감염 물질이다. 바이러스는 또한 단백질이 결핍되는 감염성 핵산 형태로 존재할 수 있다. 바이러스는 그들이 내부에서 복제할 수 있는 살아있는 세포의 부재 하에 생존할 수 없다. 바이러스는 DNA (파지)의 세포내이입 또는 직접 주입에 의해 특이적인 살아있는 세포 내로 들어가고 증식하여, 질환을 일으킨다. 이어서, 증식된 바이러스는 방출되고 추가의 세포를 감염시킬 수 있다. 일부 바이러스는 DNA-함유 바이러스이고, 다른 것은 RNA-함유 바이러스이다. 일부 측면에서, 본 발명은 또한 질환 진행에 프리온이 관여하는 질환, 예를 들어 동물에서 소 해면상 뇌병증 (즉, 광우병, BSE) 또는 면양떨림병 감염, 또는 인간에서 크로이츠펠트-야콥병을 치료하도록 의도된다.
바이러스는 장내바이러스 (피코르나비리대 (Picornaviridae) 과의 바이러스, 예를 들어 소아마비 바이러스, 콕사키 바이러스, 에코 바이러스를 포함하지만 이로 제한되지 않음), 로타바이러스, 아데노바이러스, 간염 바이러스를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 인간에서 발견된 바이러스의 구체적인 예는 다음의 것들을 포함하지만 이로 제한되지 않는다: 레트로비리대 (Retroviridae) (예, 인간 면역결핍증 바이러스, 예를 들어 HIV-1 (HTLV-III, LAV 또는 HTLV-III/LAV, 또는 HIV-III으로도 불림); 및 다른 단리체, 예를 들어 HIV-LP); 피코르나비리대 (예, 소아마비 바이러스, A형 간염 바이러스; 장내바이러스, 인간 콕사키 바이러스, 리노바이러스, 에코바이러스); 칼시비리대 (Calciviridae) (예, 위장염을 일으키는 균주); 토가비리대 (Togaviridae) (예, 말 뇌염 바이러스, 풍진 바이러스); 플라비리대 (Flaviridae) (예, 뎅기 바이러스, 뇌염 바이러스, 황열 바이러스); 코로나비리대 (Coronaviridae) (예, 코로나바이러스); 랍도비리대 (Rhabdoviradae) (예, 수포성 구내염 바이러스, 광견병 바이러스); 필로비리대 (Filoviridae) (예, 에볼라 바이러스); 파라믹소비리대 (Paramyxoviridae) (예, 파라인플루엔자 바이러스, 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스); 오르토믹소비리대 (Orthomyxoviridae) (예, 인플루엔자 바이러스); 분야비리대 (Bunyaviridae) (예, 한탄 바이러스, 분야 바이러스, 플레보바이러스 및 나이로 바이러스); 아레나비리대 (Arenaviridae) (출혈열 바이러스); 레오비리대 (Reoviridae) (예, 레오바이러스, 오르비바이러스 및 로타바이러스); 비르나비리대 (Birnaviridae); 헤파드나비리대 (Hepadnaviridae) (B형 간염 바이러스); 파르보비리대 (Parvoviridae) (파르보바이러스); 파포바비리대 (Papovaviridae) (유두종 바이러스, 폴리오마 바이러스); 아데노비리대 (Adenoviridae) (대부분의 아데노바이러스); 헤르페스비리대 (Herpesviridae) (단순 헤르페스 바이러스 (HSV) 1 및 2, 수두 대상포진 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV)); 폭스비리대 (Poxviridae) (천연두 바이러스, 우두 바이러스, 폭스 바이러스); 이리도비리대 (Iridoviridae) (예, 아프리카 돼지 열 바이러스); 및 미분류 바이러스 (예, 해면상뇌병증의 병인체, 델타 간염의 병인체 (B형 간염 바이러스의 결함있는 위성체인 것으로 생각됨), 비-A형, 비-B형 간염의 병인체 (클래스 1 = 내부로 전염됨; 클래스 2 = 비경구로 전염됨 (즉, C형 간염); 노르워크 (Norwalk) 및 관련 바이러스, 및 아스트로바이러스).
인간에서 발견된 바이러스의 예는 다음의 것들을 포함하지만 이로 제한되지 않는다: 레트로비리대 (예, 인간 면역결핍증 바이러스, 예를 들어 HIV-1 (HTLV-III, LAV 또는 HTLV-III/LAV 또는 HIV-III으로도 불림); 및 다른 단리체, 예를 들어 HIV-LP); 피코르나비리대 (예, 소아마비 바이러스, A형 간염 바이러스; 장내바이러스, 인간 콕사키 바이러스, 리노바이러스, 에코바이러스); 칼시비리대 (예, 위장염을 일으키는 균주); 토가비리대 (예, 말 뇌염 바이러스, 풍진 바이러스); 플라비리대 (예, 뎅기 바이러스, 뇌염 바이러스, 황열 바이러스); 코로나비리대 (예, 코로나바이러스); 랍도비리대 (예, 수포성 구내염 바이러스, 광견병 바이러스); 필로비리대 (예, 에볼라 바이러스); 파라믹소비리대 (예, 파라인플루엔자 바이러스, 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스); 오르토믹소비리대 (예, 인플루엔자 바이러스); 분야비리대 (예, 한탄 바이러스, 분야 바이러스, 플레보바이러스 및 나이로 바이러스); 아레나비리대 (출혈열 바이러스); 레오비리대 (예, 레오바이러스, 오르비바이러스 및 로타바이러스); 비르나비리대; 헤파드나비리대 (B형 간염 바이러스); 파르보비리대 (파르보바이러스); 파포바비리대 (유두종 바이러스, 폴리오마 바이러스); 아데노비리대 (대부분의 아데노바이러스); 헤르페스비리대 (단순 헤르페스 바이러스 (HSV) 1 및 2, 수두 대상포진 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 헤르페스 바이러스)); 폭스비리대 (천연두 바이러스, 우두 바이러스, 폭스 바이러스); 및 이리도비리대 (예, 아프리카 돼지 열 바이러스); 및 미분류 바이러스 (예, 델타 간염의 병인체 (B형 간염 바이러스의 결함있는 위성체인 것으로 생각됨), C형 간염; 노르워크 및 관련 바이러스, 및 아스트로바이러스).
진균은 그 중 몇몇만이 척추 포유동물에서 감염을 유발하는 진핵 유기체이다. 진균은 진핵 유기체이므로 크기, 구조적 조직화, 생활 주기 및 증식 기전이 원핵 세균과 상당히 다르다. 진균은 일반적으로 형태학적 특징, 생식 방식 및 배양 특징을 기준으로 분류된다. 진균은 대상에서 상이한 종류의 질환, 예를 들어 진균 항원의 흡입 후 호흡 알레르기, 독성 물질, 예를 들어 아마니타 팔로이데스 (Amanita phalloides) 독소 및 독버섯에 의해 생산된 팔로톡신 및 아스페르길루스 (Aspergillus) 종에 의해 생산된 아플라톡신의 섭취 후 진균 중독을 유발할 수 있지만, 모든 진균이 감염성 질환을 일으키지는 않는다.
감염성 진균은 전신 또는 표피 감염을 일으킬 수 있다. 일차 전신 감염은 보통의 건강한 대상에서 일어날 수 있고, 기회 감염은 면역손상된 대상에서 가장 빈번하게 발견된다. 일차 전신 감염을 일으키는 가장 흔한 진균 물질은 블라스토마이세스 (Blastomyces), 콕시디오이데스 (Coccidioides), 및 히스토플라스마 (Histoplasma)를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 면역손상 또는 면역억제된 대상에서 기회 감염을 일으키는 흔한 진균은 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 크립토코쿠스 네오포르만스 (Cryptococcus neoformans) 및 다양한 아스페르길루스 종을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 전신 진균 감염은 내부 장기의 침입 감염이다. 유기체는 보통 폐, 위장관 또는 정맥내 카테터를 통해 체내로 들어간다. 상기 종류의 감염은 일차 병원성 진균 또는 기회 진균에 의해 유발될 수 있다.
표재 진균 감염은 내부 조직의 침입 없이 외부 표면 상의 진균의 성장을 포함한다. 전형적인 표재 진균 감염은 피부, 모발 또는 손발톱을 포함하는 피부 진균 감염을 포함한다.
진균 감염과 연관된 질환은 아스페르길루스증, 분아균증, 칸디다증, 색소분아균증, 콕시디오이데스진균증, 효모균증, 진균 눈 감염, 진균 모발, 손발톱 및 피부 감염, 히스토플라스마증, 로보진균증, 진균종, 귀진균증, 파라콕시디오이데스진균증, 파종성 페니실륨 마르네페이 (Penicillium marneffei), 갈색사상균증, 리노스포리듐증, 스포로트릭스증 및 접합균증을 포함한다.
진균은 효모 및 곰팡이를 포함한다. 진균의 예는 아스페르길루스 종, 예를 들어 아스페르길루스 푸미가투스 (A. fumigatus), 블라스토마이세스 더마티디티스 (B. dermatitidis), 칸디다 종, 예를 들어 칸디다 알비칸스, 콕시디오이데스 임미티스 (C. immitis), 크립토코쿠스 네오포르만스, 히스토플라스마 캅술라툼 (H. capsulatum), 뉴모시스티스 카리니 (Pneumocystis carinii), 리조무코르 (Rhizomucor) 종 및 리조푸스 (Rhizopus) 종을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
기생충은 생존하기 위해 다른 유기체에 의존하여, 그들의 생활 주기를 계속하기 위해 다른 유기체에 들어가거나 감염하여야 하는 유기체이다. 감염된 유기체, 즉, 숙주는 기생충에게 영양 및 거주지를 제공한다. 가장 넓은 의미에서 용어 기생충은 모든 감염 물질 (즉, 세균, 바이러스, 진균, 원생동물 및 연충)을 포함할 수 있지만, 일반적으로 상기 용어는 단지 원생동물, 연충 및 외부기생 절지동물 (예를 들어, 진드기, 좀진드기 등)을 나타내도록 사용된다. 원생동물은 세포내 및 세포외에서, 특히 혈액, 장관 또는 조직의 세포외 매트릭스에서 복제할 수 있는 단세포 유기체이다. 연충은 거의 항상 세포외에 존재하는 다세포 유기체이다 (선모충 (Trichinella) 종 제외). 연충은 정상적으로는 복제하기 위해 1차 숙주로부터 빠져나와 2차 숙주로 이동하는 것이 필요하다. 상기 언급된 종류와 반대로, 외부기생 절지동물은 숙주 몸체의 외부 표면과 기생 관계를 형성한다.
기생충은 세포내 기생충 및 세포내 편성 기생충을 포함한다. 기생충의 예는 열대열원충 (Plasmodium falciparum), 난형열원충 (P. ovale), 사일열원충 (P. malariae), 삼일열원충 (P. vivax), 플라스모듐 노울레시 (P. knowlesi), 바베시아 미크로티 (Babesia microti), 바베시아 디베르젠스 (B. divergens), 크루즈파동편모충 (Trypanosoma cruzi), 톡소포자충 (Toxoplasma gondii), 선모충 (Trichinella spiralis), 큰리슈만편모충 (Leishmania major), 내장리슈만편모충 (L. donovani), 피하리슈만편모충 (L. braziliensis), 피부리슈만편모충 (L. tropica), 감비아파동편모충 (Trypanosoma gambiense), 로데시아파동편모충 (T. rhodesiense) 및 만손주혈흡충 (Schistosoma mansoni)를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
다른 감염성 유기체 (즉, 원생생물)는 열원충 종, 예를 들어 열대열원충, 사일열원충, 난형열원충 및 삼일열원충 및 톡소포자충을 포함한다. 혈액감염성 및/또는 조직 기생충은 열원충 종, 바베시아 미크로티, 바베시아 디베르젠스, 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis), 피부리슈만편모충, 리슈만 종, 피하리슈만편모충, 내장리슈만편모충, 감비아파동편모충 및 로데시아파동편모충 (아프리카 수면병), 크루즈파동편모충 (샤가스 (Chagas) 병) 및 톡소포자충을 포함한다.
다른 의학상 관련 미생물은 문헌에 광범하게 기재되어 있다 (예를 들어 그 전체 내용을 본원에 참고로 포함시킨 문헌 [C.G.A Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Great Britain 1983] 참조).
암
한 측면에서, 본 발명은 암에 걸린 대상의 치료 방법을 제공한다.
암에 걸린 대상은 검출가능한 암성 세포를 갖는 대상이다. 암은 악성 또는 비-악성 암일 수 있다. 본원에서 사용될 때, "암"은 신체 장기 및 계통의 정상 기능을 저해하는 세포의 비제어된 성장을 나타낸다. 원래의 위치로부터 이동하여 중요 장기에 도입되는 암은 궁극적으로 침범된 장기의 기능적 퇴화를 통해 대상의 사망을 일으킬 수 있다. 조혈계 암, 예를 들어 백혈병은 대상에서 정상 조혈 구획을 능가할 수 있어서, 조혈 실패 (빈혈, 저혈소판증 및 호중구감소 형태)를 야기하고 결국 사망을 유발한다.
전이는 원발 종양으로부터 신체의 다른 부분으로 암 세포의 전파로부터 생성되는, 원발 종양 위치와 구분되는 암 세포의 구역이다. 원발 종양 덩어리의 진단 시점에, 대상은 전이의 존재에 대해 모니터링될 수 있다. 전이는 특이적 증상의 모니터링에 추가하여, 자기 공명 영상 (MRI) 스캔, 컴퓨터 단층촬영 (CT) 스캔, 혈액 및 혈소판 계수, 간 기능 연구, 흉부 X-선 및 뼈 스캔의 단독 또는 조합 사용을 통해 가장 빈번하게 검출된다.
암은 기저 세포 암종, 담관암; 방광암; 골암; 뇌 및 중추신경계 (CNS) 암; 유방암; 자궁경부암; 융모막암종; 결장 및 직장암; 결합조직암; 소화기계의 암; 자궁내막암; 식도암; 안암; 두경부암; 상피내 신생물; 신장암; 후두암; 백혈병; 간암; 폐암 (예, 소세포 및 비-소세포); 호지킨 및 비-호지킨 림프종을 포함하는 림프종; 흑색종; 골수종; 신경모세포종; 구강암 (예, 입술, 혀, 입 및 인두); 난소암; 췌장암; 전립선암; 망막모세포종; 횡문근육종; 직장암; 호흡기계의 암; 육종; 피부암; 위암; 고환암; 갑상선암; 자궁암; 비뇨기계의 암 및 다른 암종, 선암종 및 육종을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
자가면역 병태
선천 면역 반응 또는 Th1-유사 면역 반응을 포함하는 병태는 염증, 급성 및 만성 동종이식 거부, 이식편-대-숙주 질환 (GvHD), 특정 자가면역 질환 및 패혈증을 포함한다. 본 발명은 본 발명에 따라 달성할 수 있는 TLR 신호전달의 선택적 억제의 면에서 상기 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
자가면역 질환은 일반적으로 항체-매개, T-세포 매개, 또는 항체-매개와 T-세포 매개의 조합으로서 분류될 수 있다. 본 발명의 어댑터 ODN 및 TLR 리간드 조합물은 다양한 종류의 자가면역, 예를 들어 항체-매개 또는 T-세포 매개 면역, 예를 들어 인슐린-의존 (I형) 당뇨병, 류마티스 관절염, 다발 경화증, 전신 홍반 루푸스 (SLE) 및 염증성 장 질환 (즉, 크론 질환 및 궤양 대장염)을 치료하기 위해 유용한 것으로 생각된다. 상기 자가면역 질환에 대한 동물 모델이 이용가능하고, 상기 질환에서 본 발명의 조합물의 효능을 평가하기 위해 유용하다. 다른 자가면역 질환은 비제한적으로 원형탈모증, 후천적 혈우병, 강직 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 간염, 자가면역 용혈빈혈, 베체트 증후군, 심근병증, 비열대성 스프루우 피부염, 만성 피로 면역 기능장애 증후군 (CFIDS), 만성 염증 탈수초성 다발신경병증, 처크-스트라우스 (Churg-Strauss) 증후군, 흉터성 유천포창, CREST 증후군, 저온응집병, 원판상 루푸스, 원발성 혼합 한랭글로불린혈증, 섬유근육통, 섬유근육염, 길랑-바레 (Guillain-Barre) 증후군, 특발성 폐섬유화증, 특발성 혈소판 감소성 자반병, IgA 신장병증, 연소기 관절염, 편평태선, 중증 근무력증, 결절성 다발동맥염, 다발성 연골염, 다분비선 증후군, 피부근육염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 간경변, 건선, 레이노 (Raynaud) 현상, 라이터 (Reiter) 증후군, 사코이드증, 근육강직 증후군, 다까야스 (Takayasu) 관절염, 측두 동맥염/거세포 동맥염, 포도막염, 혈관염 및 백반증을 포함한다.
몇몇 자가면역 질환에서 자가 항원에 대한 항체가 종종 관찰된다. 예를 들어 전신 홍반 루푸스에 대해서, 단일가닥 및 이중가닥 DNA 또는 RNA에 대한 자가항체가 설명되었다 (Vallin H et al. (1999) J Immunol 163:6306-13; Hoet RM et al. (1999) J Immunol 163:3304-12; ven Venrooij (199O) J Clin Invest 86:2154-60). 자가면역 환자의 혈청에서 발견되는 자가항체의 수준은 매우 종종 질병 심도와 상호관련되는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어 인간 SLE에서 일어나는 자가항체의 패턴은 무손상 거대분자 입자, 예를 들어 RNA- 또는 DNA-함유 복합체가 자체가 면역원성일 수 있고, 따라서 항-핵산 항체가 발생할 수 있음을 제안한다 (Lotz M et al. (1992) Mol Biol Rep 16:127; Mohan C et al. (1993) J Exp Med 177:1367-81). 예를 들어, 세포자멸 세포로부터 방출되는 상기 DNA 또는 RNA, 또는 자가면역 환자의 혈청에 존재하는 DNA- 또는 RNA-함유 미생물은 자가면역 질환에 기여하는 염증의 원인일 수 있다 (Fatenejad S (1994) J Immunol 152:5523-31; Malmegrim KC et al. (2002) Isr Med Assoc J 4:706-12; Newkirk MM et al. (2001) Arthritis Res 3:253-8). 실제로, 자가면역 질환의 발병에 기여하는 것으로 생각되는 EFN-α 분비에 의해 지배되는 효율적인 면역 반응을 유도하는 CpG-함유 서열이 SLE 혈청으로부터 확인될 수 있었다 (Magnusson M et al. (2001) Scand J Immunol 54:543-50; Ronnblom L et al. (2001) J Exp Med 194:F59-63). 또한, 항-RNA 항체에 대한 에피토프가 확인될 수 있고 G,U-풍부 서열로 이루어진다 (Tsai DE et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:8864-8; Tsai DE et al. (1993) J Immunol 150:1137-45).
알레르기
"알레르기 질환" 또는 "알레르기"는 특정 물질 (알레르겐)에 대한 후천적인 과민성을 나타낸다. "알레르기 질환이 있는 대상"은 알레르겐에 반응하여 알레르기 반응을 현재 경험하고 있거나 과거에 경험한 대상을 의미한다. 알레르기 질환에는 습진, 알레르기 비염 또는 코감기, 건초열, 알레르기 결막염, 기관지 천식, 담마진 (두드러기) 및 식품 알레르기, 아토피 피부염을 포함한 다른 아토피 질환; 아나필락시스; 약물 알레르기; 및 혈관부종을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
알레르기는 대개 알레르겐에 대한 특정 종류의 면역글로불린, IgE로부터의 항체의 생산과 연관된 발작적 상태이다. 일반적인 공기 알레르겐에 대한 IgE-매개 반응의 발병은 또한 천식의 발병에 대한 소인을 나타내는 인자이다. 알레르겐이 호염기구 (혈액 내에 순환하는) 또는 비만 세포 (고형 조직 전체에 분산된)의 표면에 결합된 IgE Fc 수용체 (FcεR)에 결합된 특이적 IgE에 마주치면, 세포는 활성화되고, 매개체, 예를 들어 히스타민, 세로토닌 및 지질 매개체의 생산 및 방출을 일으킨다.
알레르기 반응은 IgE 형의 조직 감수성 면역글로불린이 외래 알레르겐과 반응할 때 발생한다. IgE 항체는 비만 세포 및/또는 호염기구에 결합하고, 상기 특수화된 세포는 항체 분자의 단부를 연결하는 알레르겐에 의해 자극될 때 알레르기 반응의 화학 매개체 (혈관작용 아민)를 방출한다. 사람에서 알레르기 반응의 가장 잘 알려진 매개체 중에 히스타민, 혈소판 활성화 인자, 아라키돈산 대사체 및 세로토닌이 있다. 히스타민 및 다른 혈관작용 아민은 정상적으로 비만 세포 및 호염기구 백혈구에 저장된다. 비만 세포는 동물 조직 전체에 분산되고, 호염기구는 혈관계 내에서 순환한다. 상기 세포는 IgE 결합에 관련된 일련의 특정 사건이 발생하여 그의 방출을 촉발하지 않으면 세포 내에 히스타민을 제조하고 저장한다.
알레르기 반응의 증상은 IgE가 항원과 반응하는 체내의 위치에 따라 변한다. 반응이 호흡상피를 따라 일어나면, 증상은 일반적으로 재채기, 기침 및 천식 반응이다. 상호작용이 식품 알레르기의 경우에서와 같이 소화관에서 일어나면, 복통 및 설사가 일반적이다. 예를 들어, 알레르기 대상에서 벌에 쏘이거나 페니실린을 투여한 후 전신 알레르기 반응은 심각하고 종종 치명적일 수 있다.
알레르기는 적어도 부분적으로 Th2 사이토킨인 IL-4 및 IL-5, 및 IgE로 전환되는 항체 이소형을 특징으로 하는 Th2형의 면역 반응과 연관된다. Th1 및 Th2 면역 반응은 상호 역-조절성이어서, Th1형의 면역 반응으로 면역 반응이 편향되면 알레르기를 포함하는 Th2형의 면역 반응을 예방하거나 개선할 수 있다.
천식
본원에서 사용될 때, "천식"은 염증, 기도의 협소화 및 흡입된 물질에 대한 기도의 반응성 증가를 특징으로 하는 호흡기계의 장애를 나타낸다. 천식은 전적으로는 아니지만 흔히 아토피 또는 알레르기 상태와 연관된다. 천식 증상은 기류 폐쇄로 인한 천명, 호흡곤란 및 흉부 압박감, 및 기침의 재발 에피소드를 포함한다. 천식과 연관된 기도 염증은 많은 생리학적 변화, 예를 들어 기도 상피의 박피, 기저막 아래의 콜라겐 침착, 부종, 비만 세포 활성화, 호중구, 호산구 및 림프구를 포함한 염증 세포 침윤의 관찰을 통해 검출할 수 있다. 기도 염증의 결과로서, 천식 환자는 종종 기도 과민반응, 기류 제한, 호흡 증상 및 만성 질병을 겪는다. 기류 제한은 급성 기관지 수축, 기도 부종, 점액전 형성, 및 기도 재형성을 포함하고, 상기 특징은 종종 기관지 폐쇄를 일으킨다. 천식의 일부 사례에서, 기저막하 섬유증이 일어날 수 있어서, 폐 기능에서 지속적인 이상을 일으킨다.
지난 수년간의 연구에서는 천식이 아마도 염증 세포, 매개체 및 기도에 체류하는 다른 세포 및 조직 사이의 복합적인 상호작용으로 인한 것임을 밝혔다. 비만 세포, 호산구, 상피 세포, 대식세포 및 활성화된 T 세포가 모두 천식과 연관된 염증 과정에서 중요한 역할을 한다 (Djukanovic R et al. (1990) Am Rev Respir Dis 142:434-457). 상기 세포들은 국소 조직에 직접 또는 간접적으로 작용할 수 있는 기형성된 및 새로 합성된 매개체의 분비를 통해 기도 기능에 영향을 미칠 수 있는 것으로 생각된다. T 림프구의 아집단 (Th2)이 선택적 사이토킨을 방출하고 질병 만성을 확립함으로써 기도에서 알레르기 염증을 조절하는데 있어서 중요한 역할을 하는 것이 또한 인정된다 (Robinson DS et al. (1992) N Engl J Med 326:298-304).
천식은 발병에서 상이한 단계에서 일어나는 복합 장애이고, 증상의 정도를 기준으로 급성, 아급성 또는 만성으로 분류할 수 있다. 급성 염증 반응은 기도로의 세포의 초기 동원과 연관된다. 아급성 염증 반응은 세포의 동원 및 보다 지속적인 패턴의 염증을 일으키는 체류 세포의 활성화를 포함한다. 만성 염증 반응은 지속적인 수준의 세포 손상 및 진행하는 복구 과정을 특징으로 하고, 이는 기도에서 영구적인 이상을 일으킬 수 있다.
"천식에 걸린 대상"은 염증, 기도의 협소화 및 흡입된 물질에 대한 기도의 반응성 증가를 특징으로 하는 호흡기계의 장애가 있는 대상이다. 천식의 개시와 연관된 인자는 알레르겐, 차가운 온도, 운동, 바이러스 감염 및 SO2를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
본원에 언급된 바와 같이, 천식은 적어도 부분적으로 Th2 사이토킨인 IL-4 및 IL-5, 및 IgE로 전환되는 항체 이소형을 특징으로 하는 Th2형의 면역 반응과 연관될 수 있다. Th1 및 Th2 면역 반응은 상호 역-조절성이어서, Th1형의 면역 반응으로 면역 반응이 편향되면 알레르기를 포함하는 Th2형의 면역 반응을 예방하거나 개선할 수 있다.
또한, 본 발명의 TLR7/8 리간드 및 어댑터 올리고뉴클레오티드 조합물은 수지상 세포의 생존, 분화, 활성화 및 성숙을 개선하기 위해 유용하다.
특정 측면에서, 본 발명은 에피토프 스프레딩 (spreading)을 향상시키기 위한 방법을 제공한다. 본원에서 사용될 때, "에피토프 스프레딩"은 자가 또는 외래 단백질에 대해 지정된, 초기에 집중된 우세한 에피토프-특이적 면역 반응으로부터 상기 단백질 (분자내 스프레딩) 또는 다른 단백질 (분자간 스프레딩)에 대한 후속하는 및/또는 잠재적인 에피토프까지의 에피토프 특이성의 다양화를 나타낸다. 에피토프 스프레딩은 다중 에피토프-특이적 면역 반응을 일으킨다.
항미생물제
TLR7/8 리간드 및 어댑터 올리고뉴클레오티드 조합물은 하나 이상의 항미생물제와 함께 사용될 수 있다. 항미생물제 또는 의약은 항균제, 항바이러스제, 항진균제 및 항기생충제를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. "항감염제", "항생제", "항균제", "항바이러스제", "항진균제", "항기생충제" 및 "구충제"와 같은 용어는 당업자에게 잘 확립된 의미를 갖고, 표준 의학 교재에서 규정되어 있다. 간단히 설명하면, 항균제는 세균을 죽이거나 억제하고, 항생제 및 유사한 기능을 갖는 다른 합성 또는 천연 화합물을 포함한다. 항바이러스제는 천연 원료로부터 단리되거나 합성될 수 있고, 바이러스를 죽이거나 억제하는데 유용하다. 항진균제는 표재 진균 감염 및 기회 및 원발성 전신 진균 감염 치료에 사용된다. 항기생충제는 기생충을 죽이거나 억제한다. 많은 항생제는 세포, 예를 들어 미생물에 의해 2차 대사산물로서 생산되는 저분자량 분자이다. 일반적으로, 항생제는 숙주 세포에 존재하지 않는, 미생물에 특이적인 하나 이상의 기능 또는 구조체를 방해한다.
항감염 치료제에 존재하는 문제 중의 하나는 항감염제로 치료되는 대상에서 발생하는 부작용이다. 예를 들어, 많은 항감염제는 광범위한 미생물을 죽이거나 억제할 수 있고, 특정 종류의 종에 특이적이지 않다. 상기 종류의 항감염제로 치료하면 감염성 미생물뿐만 아니라 치료 대상 내의 정상 미생물 군을 죽일 수 있다. 상기 미생물 군이 소실되면, 질병 합병증이 야기되어 대상을 다른 병원체에 의한 감염이 쉬운 상태로 만들 수 있는데, 이것은 상기 미생물 군이 감염성 병원체와 경쟁하고 병원체에 대한 장벽으로서 기능하기 때문이다. 다른 부작용은 대상의 비-미생물 세포 또는 조직에 대한 상기 화학적 잔기의 특이적 또는 비-특이적 효과의 결과로서 발생할 수 있다.
항감염제의 광범한 사용에 따른 다른 문제는 미생물의 항생제-내성 균주의 발생이다. 이미, 반코마이신-내성 장구균, 페니실린-내성 폐렴구균, 다제내성 황색포도상구균, 및 다제내성 결핵 균주가 발생하였고, 주요한 임상 문제가 되고 있다. 항감염제의 광범한 사용은 세균의 많은 항생제-내성 균주를 발생시킬 가능성이 있다. 그 결과, 상기 미생물을 퇴치하기 위해 새로운 항감염 전략이 필요할 것이다.
광범위한 세균을 죽이거나 억제하기 위해 효과적인 항세균성 항생제는 광범위 항생제로 언급된다. 다른 종류의 항세균성 항생제가 그람 양성 또는 그람 음성 세균 종류에 대해 주로 효과적이다. 상기 종류의 항생제는 협범위 항생제로 언급된다. 단일 유기체 또는 질병에 대해서 효과적이지만 다른 종류의 세균에 대해서는 효과적이지 않은 다른 항생제는 제한 범위 항생제로 언급된다.
항균제는 때때로 그의 1차적인 작용 방식을 기초로 하여 분류된다. 일반적으로, 항균제는 세포벽 합성 억제제, 세포막 억제제, 단백질 합성 억제제, 핵산 합성 또는 기능적 억제제, 및 경쟁적 억제제이다. 세포벽 합성 억제제는 세포벽 합성 과정의 단계에서, 일반적으로 세균 펩티도글리칸의 합성의 단계를 억제한다. 세포벽 합성 억제제는 β-락탐 항생제, 천연 페니실린, 반-합성 페니실린, 암피실린, 클라불란산, 세팔로스포린, 및 바시트라신을 포함한다.
β-락탐은 펩티도글리칸 합성의 마지막 단계를 억제하는 4원 β-락탐 고리를 함유하는 항생제이다. β-락탐 항생제는 합성되거나 또는 천연 유래일 수 있다. 페니실륨 (Penicillium)에 의해 생산된 β-락탐 항생제는 천연 페니실린, 예를 들어 페니실린 G 또는 페니실린 V이다. 이들은 페니실륨 크리소게늄 (P. chrysogenum)의 발효에 의해 생산된다. 천연 페니실린은 좁은 활성 범위를 갖고, 일반적으로 연쇄상구균, 임균, 및 포도상구균에 대해 효과적이다. 그람 양성 세균에 대해 또한 효과적인 다른 종류의 천연 페니실린은 페니실린 F, X, K 및 O를 포함한다.
반-합성 페니실린은 일반적으로 곰팡이에 의해 생산된 분자 6-아미노페니실란산의 변형물이다. 6-아미노페니실란산은 천연 페니실린보다 더 광범위한 활성 스펙트럼 또는 다양한 다른 유익한 특성을 갖는 페니실린을 생성시키는 측쇄의 첨가에 의해 변형될 수 있다. 몇몇 종류의 반-합성 페니실린은 그람 양성 및 그람 음성 세균에 대한 넓은 스펙트럼을 갖지만, 페니실리나제에 의해 불활성화된다. 상기 반-합성 페니실린은 암피실린, 카르베니실린, 옥사실린, 아즐로실린, 메즐로실린, 및 피페라실린을 포함한다. 다른 종류의 반-합성 페니실린은 그람 양성 세균에 대해 보다 좁은 활성을 갖지만, 그들이 페니실리나제에 의해 불활성화되지 않도록 하는 특성을 갖는다. 이들은 예를 들어 메티실린, 디클록사실린, 및 나프실린을 포함한다. 일부 넓은 스펙트럼의 반-합성 페니실린은 β-락타마제 억제제, 예를 들어 클라불란산 및 술박탐과 조합으로 사용될 수 있다. β-락타마제 억제제는 항미생물 작용을 갖지 않지만, 페니실리나제를 억제하는 기능을 하여 반-합성 페니실린이 분해되지 않도록 보호한다.
또다른 종류의 β-락탐 항생제는 세팔로스포린이다. 이들은 세균 β-락타마제에 의한 분해에 감수성이고, 따라서 항상 단독으로는 효과를 보이지 않는다. 그러나, 세팔로스포린은 페니실리나제에 내성을 보인다. 이들은 다양한 그람 양성 및 그람 음성 세균에 대해 효과적이다. 세팔로스포린은 세팔로틴, 세파피린, 세팔렉신, 세파만돌, 세파클로르, 세파졸린, 세푸록신, 세폭시틴, 세포탁심, 세프술로딘, 세페타메트, 세픽심, 세프트리악손, 세포페라존, 세프타지딘 및 목살락탐을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
바시트라신은 뮤로펩티드 서브유닛 또는 펩티도글리칸이 상기 서브유닛을 막 외부로 전달하는 분자로부터 방출되는 것을 억제함으로써 세포벽 합성을 억제하는 다른 종류의 항생제이다. 바시트라신이 그람 양성 세균에 대해 효과적이지만, 그의 사용은 그의 높은 독성 때문에 일반적으로 국소 투여로 제한된다.
카르바페넴은 세포벽 합성을 억제할 수 있는 또다른 넓은 스펙트럼의 β-락탐 항생제이다. 카르바페넴의 예는 이미페넴을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 모노박탐도 넓은 스펙트럼의 β-락탐 항생제이고, 유즈트레오남을 포함한다. 스트렙토마이세스 (Streptomyces)에 의해 생산되는 항생제인 반코마이신도 세포막 합성을 억제함으로써 그람 양성 세균에 대해 효과를 보인다.
다른 종류의 항균제는 세포막 억제제인 항균제이다. 상기 화합물은 세균 막의 구조를 붕괴시키거나 기능을 억제한다. 세포막 억제제인 항균제의 한가지 문제점은 세균 및 진핵세포 막 내의 인지질의 유사성 때문에 진핵 세포 및 세균 모두에서 효과를 보일 수 있다는 점이다. 따라서, 상기 화합물은 상기 화합물을 전신적으로 사용하도록 하기에는 특이성이 낮고, 국소 투여를 위해 고투여량을 사용할 수 없다.
임상적으로 유용한 세포막 억제제의 하나는 폴리믹신이다. 폴리믹신은 막 인지질에 결합함으로써 막 기능을 방해한다. 폴리믹신은 주로 그람 음성 세균에 대해 효과적이고, 일반적으로 심한 슈도모나스 감염 또는 독성이 작은 항생제에 내성을 보이는 슈도모나스 감염에 사용된다. 상기 화합물의 전신 투여에 따른 심한 부작용은 신장 및 다른 장기에 대한 손상을 포함한다.
다른 세포막 억제제는 전신 진균 감염 및 칸디다 효모 감염의 치료에 주로 사용되는 항진균제인 암포테리신 B 및 니스타틴을 포함한다. 이미다졸은 세포막 억제제인 항생제의 다른 종류이다. 이미다졸은 항균제 및 항진균제로서, 예를 들어 효모 감염, 피부사상균 감염, 및 전신 진균 감염의 치료를 위해 사용된다. 이미다졸은 클로트리마졸, 미코나졸, 케토코나졸, 이트라코나졸 및 플루코나졸을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
많은 항균제는 단백질 합성 억제제이다. 상기 화합물은 세균이 구조 단백질 및 효소를 합성하는 것을 억제하고, 따라서 세균 세포의 성장 또는 기능을 억제하거나 또는 세포 사멸을 야기한다. 일반적으로, 상기 화합물은 전사 또는 번역 과정을 저해한다. 전사를 차단하는 항균제는 리팜핀 및 에탐부톨을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 효소 RNA 중합효소를 억제하는 리팜핀은 넓은 스펙트럼의 활성을 갖고, 그람 양성 및 그람 음성 세균 및 결핵균에 효과적이다. 에탐부톨은 결핵균에 대해 효과적이다.
번역을 차단하는 항균제는 세균 리보좀을 저해하여 mRNA가 단백질로 번역되는 것을 억제한다. 일반적으로, 상기 종류의 화합물은 테트라사이클린, 클로람페니콜, 마크롤리드 (예를 들어, 에리트로마이신) 및 아미노글리코시드 (예를 들어, 스트렙토마이신)를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
아미노글리코시드는 예를 들어 스트렙토마이신, 카나마이신, 토브라마이신, 아미카신, 및 겐타마이신과 같은, 세균 스트렙토마이세스에 의해 생산되는 항생제 종류이다. 아미노글리코시드는 그람 양성 및 그람 음성 세균에 의해 유발되는 매우 다양한 세균 감염에 대해 사용되어 왔다. 스트렙토마이신은 결핵 치료시에 1차 약물로서 널리 사용되어 왔다. 겐타마이신은 슈도모나스 감염을 포함하여 그람 양성 및 그람 음성 세균의 많은 균주에 대해, 특히 토브라마이신과 조합되어 사용된다. 카나마이신은 페니실린-내성 포도상구균을 포함하여 많은 그람 양성 세균에 대해 사용된다. 그 사용이 임상적으로 제한되는 아미노글리코시드의 부작용 중의 하나는 효능에 필수적인 투여량에서의 장기간 사용은 신장 기능을 손상시키고 청각 신경을 손상시켜 난청을 야기하는 것으로 밝혀졌다.
또다른 종류의 번역 억제제 항균제는 테트라사이클린이다. 테트라사이클린은 다양한 그람 양성 및 그람 음성 세균에 대해 효과적인 넓은 스펙트럼의 항생제 종류이다. 테트라사이클린의 예는 테트라사이클린, 미노사이클린, 독시사이클린, 및 클로르테트라사이클린을 포함한다. 이들은 많은 종류의 세균의 치료에 중요하지만, 라임병의 치료에 특히 중요하다. 그들의 낮은 독성 및 최소의 직접적인 부작용 때문에, 테트라사이클린은 의료 기관에서 남용 및 오용되었고, 이에 의해 문제가 발생하였다. 예를 들어, 남용에 의해 그에 대한 내성이 널리 발생하였다.
마크로리드와 같은 항균제는 50S 리보좀 서브유닛에 가역적으로 결합하고, 펩티딜 트랜스퍼라제에 의한 단백질의 연장을 억제하거나 세균 리보좀으로부터 비하전된 tRNA의 방출을 억제하거나 또는 이 둘을 모두 억제한다. 상기 화합물은 에리트로마이신, 록시트로마이신, 클라리트로마이신, 올레안도마이신 및 아지트로마이신을 포함한다. 에리트로마이신은 대부분의 그람 양성 세균, 나이세리아 (Neisseria), 레지오넬라 (Legionella) 및 헤모필루스 (Haemophilus)에 대해 활성을 보이지만, 장내세균과 (Enterobacteriaceae)에 대해서는 보이지 않는다. 단백질 합성 동안 펩티드 결합 형성을 차단하는 링코마이신 및 클린다마이신은 그람 양성 세균에 대해 사용된다.
또다른 종류의 번역 억제제는 클로람페니콜이다. 클로람페니콜은 70S 리보좀에 결합하여 세균 효소 펩티딜 트랜스퍼라제를 억제하고, 이에 의해 단백질 합성 동안 폴리펩티드 사슬의 성장을 억제한다. 클로람페니콜과 연관된 한가지 심각한 부작용은 재생불량빈혈이다. 재생불량빈혈은 작은 비율 (1/50,000)의 환자에서 세균 치료에 효과적인 클로람페니콜의 투여량에서 발생한다. 널리 처방되는 항생제인 클로람페니콜은 빈혈로 인한 사망 때문에 현재는 거의 사용되지 않는다. 그의 효과 때문에, 치명적인 상황 (예를 들어, 장티푸스)에 대해서는 계속 사용된다.
일부 항균제는 핵산 합성 또는 기능을 붕괴시키고, 예를 들어 DNA 또는 RNA에 결합하여 그의 메시지를 해독될 수 없도록 만든다. 이들은 둘 다 합성 화학물질인 퀴놀론 및 코-트리목사졸, 및 천연 또는 반합성 화학물질인 리파마이신을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 퀴놀론은 그의 환상 DNA를 생산하기 위해 세균이 필요로 하는 효소인 DNA 기라제를 억제함으로써 세균 DNA 복제를 차단한다. 이들은 넓은 스펙트럼을 보이고, 노르플록사신, 시프로플록사신, 에녹사신, 날리딕산 및 테니아플록사신을 포함한다. 날리딕산은 DNA 복제에 필수적이고 수퍼코일이 이완되어 재형성되도록 하는 DNA 기라제 효소 (토포이소머라제)에 결합하여 DNA 기라제 활성을 억제하는 살균제이다. 날리딕산의 주요 용도는 하부요로 감염 (UTI)의 치료이고, 이것은 날리딕산이 몇몇 종류의 그람-음성 세균, 예를 들어 UTI의 통상적인 원인균인 이. 콜라이, 엔테로박터 에어로게네스, 폐렴간균 및 프로테우스 (Proteus) 종에 대해 효과적이기 때문이다. 코-트리목사졸은 술파메톡사졸 및 트리메토프림의 조합물로서, DNA 뉴클레오티드 제조에 필요한 세균의 엽산 합성을 차단한다. 리팜피신은 그람 양성 세균 (결핵균 및 수막염균에 의한 수막염 포함) 및 일부 그람 음성 세균에 대해 활성을 보이는 리파마이신의 유도체이다. 리팜피신은 중합효소의 베타 서브유닛에 결합하고, 중합효소 활성화에 필요한 제1 뉴클레오티드의 부가를 차단하여 mRNA 합성을 차단한다.
다른 클래스의 항균제는 세균 효소의 경쟁적 억제제로서 기능하는 화합물이다. 경쟁적 억제제는 대부분 세균 성장 인자와 구조상 유사하고, 결합을 위해 경쟁하지만, 세포에서 대사 기능을 수행하지 않는다. 상기 화합물은 훨씬 더 크고 더 넓은 항균 활성을 갖는 술폰아미드 및 화학적으로 변형된 형태의 술파닐아미드를 포함한다. 술폰아미드 (예를 들어, 간트리신 및 트리메토프림)는 폐렴연쇄상구균, 베타용혈성 연쇄상구균 및 이. 콜라이의 치료에 유용하고, 이. 콜라이에 의해 유발된 단순 UTI의 치료, 및 수막구균성 수막염의 치료에 사용되어 왔다.
항바이러스제는 바이러스에 의한 세포 감염 또는 세포 내에서 바이러스 복제를 방지하는 화합물이다. 바이러스 복제 과정은 숙주 세포 내의 DNA 복제와 밀접하게 관련되어 비특이적 항바이러스제는 종종 숙주에 독성이기 때문에, 항균 약물보다 항바이러스 약물의 수가 훨씬 더 적다. 바이러스 감염 과정에는 항바이러스제에 의해 차단되거나 억제될 수 있는 몇몇 단계가 존재한다. 이들 단계는 바이러스의 숙주 세포에 대한 부착 (면역글로불린 또는 결합 펩티드), 바이러스의 탈피 (예를 들어, 아만타딘), 바이러스 mRNA의 합성 또는 번역 (예를 들어, 인터페론), 바이러스 RNA 또는 DNA의 복제 (예를 들어, 뉴클레오시드 유사체), 새로운 바이러스 단백질의 성숙 (예를 들어, 프로테아제 억제제), 및 바이러스의 발아 및 방출을 포함한다.
항바이러스제의 다른 범주는 뉴클레오시드 유사체이다. 뉴클레오시드 유사체는 뉴클레오시드에 유사하지만 불완전 또는 비정상 데옥시리보스 또는 리보스 기를 가진 합성 화합물이다. 일단 뉴클레오시드 유사체가 세포 내에 있으면, 이들은 포스포릴화되고, 바이러스 DNA 또는 RNA 내로 혼입을 위해 정상 뉴클레오티드와 경쟁하는 트리포스페이트 형태를 생성한다. 뉴클레오시드 유사체의 트리포스페이트 형태가 일단 성장하는 핵산 사슬 내에 혼입되면, 바이러스 중합효소와 비가역적 결합을 일으키고, 따라서 사슬을 종결시킨다. 뉴클레오시드 유사체는 아시클로버 (단순 헤르페스 바이러스 및 수두 대상포진 바이러스의 치료에 사용됨), 간시클로버 (사이토메갈로바이러스의 치료에 유용함), 이독수리딘, 리바비린 (호흡 융합세포 바이러스의 치료에 유용함), 디데옥시이노신, 디데옥시시티딘 및 지도부딘 (아지도티미딘)을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
항바이러스제의 다른 종류는 사이토킨, 예를 들어 인터페론을 포함한다. 인터페론은 바이러스 감염 세포뿐만 아니라 면역 세포에 의해 분비되는 사이토킨이다. 인터페론은 감염된 세포에 인접한 세포 상의 특이적 수용체에 결합함으로써 작용하여, 세포에서 바이러스에 의한 감염으로부터 보호하는 변화를 일으킨다. α- 및 β-인터페론은 또한 감염된 세포의 표면 상에 클래스 I 및 클래스 II MHC 분자의 발현을 유도하여, 숙주 면역 세포 인식을 위한 항원 제시를 증가시킨다. α- 및 β-인터페론은 재조합 형태로 이용가능하고, 만성 B형 간염 및 C형 간염 감염의 치료에 사용되어 왔다. 항바이러스 요법에 효과적인 투여량에서, 인터페론은 열, 권태감 및 체중 감소와 같은 심각한 부작용이 있다.
면역글로불린 요법은 바이러스 감염의 예방을 위해 사용된다. 바이러스 감염에 대한 면역글로불린 요법은 세균 감염과 상이한데, 그 이유는 면역글로불린 요법제는 항원-특이적이기보다는, 세포외 비리온에 결합하여 비리온이 바이러스 감염에 취약한 세포에 부착된 후 세포 내로 도입되는 것을 방지함으로써 기능하기 때문이다. 면역글로불린 요법은 항체가 숙주에 존재하는 기간 동안 바이러스 감염의 예방에 유용하다. 일반적으로, 2종류의 면역글로불린 요법, 즉 정상적인 면역글로불린 요법 및 과다-면역글로불린 요법이 존재한다. 정상 면역글로불린 요법은 정상 혈액 공여자의 혈청으로부터 제조하여 모은(pooled) 항체 생성물을 이용한다. 상기 모은 생성물은 광범위한 인간 바이러스, 예를 들어 A형 간염, 파르보바이러스, 장내바이러스 (특히 신생아에서)에 대한 낮은 역가의 항체를 포함한다. 과다-면역글로불린 요법은 특정 바이러스에 대한 높은 역가의 항체를 갖는 개체의 혈청으로부터 제조한 항체를 이용한다. 이어서, 상기 항체를 특이적 바이러스에 대해 사용한다. 과다-면역글로불린의 예는 대상포진 면역글로불린 (면역손상된 아동 및 신생아에서 수두 예방에 유용), 인간 광견병 면역글로불린 (광견병 동물에 물린 대상의 노출후 예방에 유용), B형 간염 면역글로불린 (특히 바이러스에 노출된 대상에서 B형 간염 바이러스의 예방에 유용), 및 RSV 면역글로불린 (호흡 융합세포 바이러스 감염의 치료에 유용)을 포함한다.
항진균제는 감염성 진균의 치료 및 예방에 유용하다. 항진균제는 때때로 그 작용 메카니즘에 의해 분류된다. 일부 항진균제는 글루코스 합성효소를 억제함으로써 세포벽 억제제로서 작용한다. 이들은 바시운긴/ECB를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 다른 항진균제는 막 통합성을 불안정화함으로써 작용한다. 이들은 이미다졸, 예를 들어 클로트리마졸, 세르타콘졸, 플루코나졸, 이트라코나졸, 케토코나졸, 미코나졸 및 보리코나콜뿐만 아니라 FK463, 암포테리신 B, BAY 38-9502, MK991, 프라디미신, UK 292, 부테나핀 및 테르비나핀을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 다른 항진균제는 키틴을 분해하거나 (예, 키티나제) 또는 면역억제 (501 크림)에 의해 작용한다.
구충제는 기생충을 직접 죽이는 물질이다. 상기 화합물은 당업계에 공지되어 있고, 일반적으로 상업적으로 입수가능하다. 인간 투여에 유용한 구충제의 예는 알벤다졸, 암포테리신 B, 벤즈니다졸, 비티오놀, 클로로퀸 HCl, 클로로퀸 포스페이트, 클린다마이신, 데히드로에메틴, 디에틸카르바마진, 딜록사니드 푸로에이트, 에플로니틴, 푸라졸리다온, 글루코코르티코이드, 할로판트린, 요오도퀴놀, 이베르멕틴, 메벤다졸, 메플로퀸, 메글루민 안티모니에이트, 멜라르소프롤, 메트리포네이트, 메트로니다졸, 니클로사미드, 니푸르티목스, 옥삼니퀸, 파로모마이신, 펜타미딘 이세티오네이트, 피페라진, 프라지쿠안텔, 프리마퀸 포스페이트, 프로구아닐, 피란텔 파모에이트, 피리메탄민-술폰아미드, 피리메탄민-술파독신, 퀴나크린 HCl, 퀴닌 술페이트, 퀴니딘 글루코네이트, 스피라마이신, 스티보글루코네이트 나트륨 (나트륨 안티몬 글루코네이트), 수라민, 테트라사이클린, 독시사이클린, 티아벤다졸, 티니다졸, 트리메트로프림-술파메톡사졸 및 트리파르사미드를 포함한다.
항암 치료
본 발명의 TLR7/8 리간드 및 어댑터 올리고뉴클레오티드 조합물은 항암 치료와 함께 사용될 수 있다.
항암 치료는 항암제, 방사선 치료 및 외과적 수술을 포함한다. 본원에서 사용될 때, "항암제"는 암 치료 목적으로 대상에게 투여되는 약제를 나타낸다. 다양한 종류의 암 치료용 의약이 본원에 설명되어 있다. 본 명세서의 목적에서, 항암제는 화학치료제, 면역치료제, 암 백신, 호르몬 요법 및 생물학적 반응 조정제로서 분류된다.
화학치료제는 메토트렉세이트, 빈크리스틴, 아드리아마이신, 시스플라틴, 당 비함유 클로로에틸니트로소우레아, 5-플루오로우라실, 미토마이신 C, 블레오마이신, 독소루비신, 다카르바진, 탁솔, 프라길린, 메글라민 GLA, 발루비신, 카르무스타인 및 폴리페르포산, MMI270, BAY 12-9566, RAS 파르네실 트랜스퍼라제 억제제, 파르네실 트랜스퍼라제 억제제, MMP, MTA/LY231514, 알림타, LY264618/로메텍솔, 글라몰렉, CI-994, TNP-470, 하이캄틴/토포테칸, PKC412, 발스포다르/PSC833, 노반트론/미트록산트론, 메타레트/수라민, 바티마스타트, E7070, BCH-4556, CS-682, 9-AC, AG3340, AG3433, 인셀/VX-710, VX-853, ZD0101, ISI641, ODN 698, TA 2516/마르미스타트, BB2516/마르미스타트, CDP 845, D2163, PD183805, DX8951f, 레모날 DP 2202, FK 317, 피시바닐/OK-432, AD 32/발루비신, 메타스트론/스트론튬 유도체, 테모달/테모졸로미드, 에바세트/리포좀 독소루비신, 예탁산/파클리탁셀, 탁솔/파클리탁셀, 젤로아드/카페시타빈, 푸르톨론/독시플루리딘, 시클로팍스/경구 파클리탁셀, 경구 탁소이드, SPU-077/시스플라틴, HMR 1275/플라보피리돌, CP-358 (774)/EGFR, CP-609 (754)/RAS 종양유전자 억제제, BMS-182751/경구 백금, UFT (테가푸르/우라실), 에르가미솔/레바미솔, 에닐우라실/776C85/5FU 증강제, 캄프토/레바미솔, 캄프토사르/이리노테칸, 투모덱스/랄리트렉세드, 류스타틴/클라드리빈, 팍섹스/파클리탁셀, 독실/리포좀 독소루비신, 카엘릭스/리포좀 독소루비신, 플루다라/플루다라빈, 파르마루비신/에피루비신, DepoCyt, ZD1839, LU 79553/비스-나프탈리미드, LU 103793/돌라스타인, 카에틱스/리포좀 독소루비신, 겜자르/겜시타빈, ZD 0473/아노르메드, YM 116, 요오드 씨드, CDK4 및 CDK2 억제제, PARP 억제제, D4809/덱시포사미드, 이페스/메스넥스/이포사미드, 부몬/테니포시드, 파라플라틴/카르보플라틴, 플란티놀/시스플라틴, 베페시드/에토포시드, ZD 9331, 탁소테레/도세탁셀, 구아닌 아라비노시드의 전구약물, 탁산 유사체, 니트로소우레아, 알킬화제, 예를 들어 멜펠란 및 시클로포스파미드, 아미노글루테티미드, 아스파라기나제, 부술판, 카르보플라틴, 클로롬부실, 시타라빈 HCl, 닥티노마이신, 다우노루비신 HCl, 에스트라무스틴 포스페이트 나트륨, 에토포시드 (VP16-213), 플록스우리딘, 플루오로우라실 (5-FU), 플루타미드, 히드록시우레아 (히드록시카르바미드), 이포스파미드, 인터페론 알파-2a, 알파-2b, 류프롤리드 아세테이트 (LHRH-방출 인자 유사체), 로무스틴 (CCNU), 메클로르에타민 HCl (질소 머스타드), 머캅토퓨린, 메스나, 미토탄 (o.p'-DDD), 미톡산트론 HCl, 옥트레오티드, 플리카마이신, 프로카르바진 HCl, 스트렙토조신, 타목시펜 시트레이트, 티오구아닌, 티오테파, 빈블라스틴 술페이트, 암사크린 (m-AMSA), 아자시티딘, 에르트로포이에틴, 헥사메틸멜라민 (HMM), 인터루킨 2, 미토구아존 (메틸-GAG; 메틸 글리옥살 비스-구아닐히드라존; MGBG), 펜토스타틴 (2'데옥시코포르마이신), 세무스틴 (메틸-CCNU), 테니포시드 (VM-26) 및 빈데신 술페이트로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있고, 이로 제한되지 않는다.
면역치료제는 3622W94, 4B5, ANA Ab, 항-FLK-2, 항-VEGF, 아트라겐, 아바스틴 (베바치주맙; 제넨테크 (Genentech)), BABS, BEC2, 벡사 (토시투모맙; 글락소스미스클라인 (GlaxoSmithKline)), C225, 캄파스 (알렘투주맙; 젠자임 코퍼레이션 (Genzyme Corp.)), 세아시드, CMA 676, EMD-72000, 에르비툭스 (세툭시맙; 임클론 시스템즈, 인크. (ImClone Systems, Inc.)), 글리오맙-H, GNI-250, 헤르셉틴 (트라추주맙; 제넨테크), IDEC-Y2B8, ImmuRAIT-CEA, ior c5, ior egf.r3, ior t6, LDP-03, 림포시드, MDX-11, MDX-22, MDX-210, MDX-220, MDX-260, MDX-447, 멜리뮨-1, 멜리뮨-2, 모노팜 (Monopharm)-C, NovoMAb-G2, 온콜림, OV103, 오바렉스, 파노렉스, 프레타겟, 콰드라메트, 리부탁신, 리툭산 (리툭시맙; 제넨테크), 스마트 1D10 Ab, 스마트 ABL 364 Ab, 스마트 M195, TNT, 및 제나팍스 (다클리주맙; 로슈 (Roche))로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있고, 이로 제한되지 않는다.
암 백신은 EGF5 항-개별특이형 암 백신, Gp75 항원, GMK 흑색종 백신, MGV 강글리오시드 컨쥬게이트 백신, Her2/neu, 오바렉스, M-Vax, O-Vax, L-Vax, STn-KHL 테라토프 (theratope), BLP25 (MUC-1), 리포좀 개별특이형 백신, 멜라신, 펩티드 항원 백신, 독소/항원 백신, MVA-계 백신, PACIS, BCG 백신, TA-HPV, TA-CIN, DISC-바이러스 및 ImmuCyst/TheraCys로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있고, 이로 제한되지 않는다.
항알레르기 의약
본 발명의 TLR7/8 리간드 및 어댑터 올리고뉴클레오티드는 항알레르기 의약과 함께 사용될 수 있다.
알레르기를 치료하거나 예방하기 위한 통상적인 방법은 알레르기 의약 또는 탈감작 치료의 사용을 포함하였다. 알레르기를 치료하거나 예방하기 위한 일부 요법은 항-IgE 항체 중화의 사용을 포함한다. 항히스타민제 및 알레르기 반응의 화학 매개체의 효과를 차단하는 다른 약물은 알레르기 증상의 심도를 조절하는 것을 돕지만, 알레르기 반응을 예방하지 않고 후속적인 알레르기 반응에 효과가 없다. 탈감작 치료는 알레르겐에 대해 IgG형 반응을 유도하기 위해 보통 피부 아래 주사에 의해 소용량의 알레르겐을 제공함으로써 수행한다. IgG 항체의 존재는 IgE 항체의 유도로 생성되는 매개체의 생산을 중화시키는 것을 돕는 것으로 생각된다. 초기에, 대상은 심한 반응을 유도하는 것을 피하기 위해 매우 저용량의 알레르겐으로 치료받고, 용량을 서서히 증가시킨다. 상기 종류의 요법은 대상에게 알레르기 반응을 유발하는 화합물을 실제로 투여하기 때문에 위험하고, 심한 알레르기 반응이 일어날 수 있다.
알레르기 의약은 항히스타민제, 코르티코스테로이드 및 프로스타글란딘 유도제를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 항히스타민제는 비만 세포 또는 호염기구에서 방출되는 히스타민에 길항하는 화합물이다. 이들 화합물은 당업계에 잘 알려져 있고 알레르기 치료를 위해 흔히 사용된다. 항히스타민제는 아크리바스틴, 아스테미졸, 아자타딘, 아젤라스틴, 베타타스틴, 브롬페니라민, 부클리진, 세테리진, 세티리진 유사체, 클로르페니라민, 클레마스틴, CS 560, 시프로헵타딘, 데스로라타딘, 덱스클로르페니라민, 에바스틴, 에피나스틴, 펙소페나딘, HSR 609, 히드록시진, 레보카바스틴, 로라티딘, 메트스코폴라민, 미졸라스틴, 노라스테미졸, 페닌다민, 프로메타진, 피릴아민, 테르페나딘 및 트라닐라스트를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
코르티코스테로이드는 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손, 베클로메타손, 부데소니드, 덱사메타손, 플루니솔리드, 플루티카손 프로피오네이트 및 트리암시놀론을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 덱사메타손은 소염 작용을 갖는 코르티코스테로이드이지만, 흡입 형태로 알레르기 또는 천식의 치료를 위해 규칙적으로 사용되지 않고, 이는 유효 용량에서 고도로 흡수되고 장기간 억제 부작용이 있기 때문이다. 그러나, 덱사메타손은 본 발명에 따라 알레르기 또는 천식의 치료를 위해 사용될 수 있고, 이는 본 발명의 핵산과 조합으로 투여될 때, 부작용을 감소시키기 위해 저용량으로 투여될 수 있기 때문이다. 코르티코스테로이드와 연관된 일부 부작용은 기침, 발성장애, 아구창 (칸디다증)을 포함하고, 보다 고용량에서 전신 효과, 예를 들어 부신 억제, 글루코스 불내성, 골다공증, 무균성 골 괴사, 백내장 형성, 성장 억제, 고혈압, 근 쇠약, 피부 박화 및 쉽게 멍드는 것을 포함한다 ([Barnes & Peterson (1993) Am Rev Respir Dis 148:S1-S26]; 및 [Kamada AK et al. (1996) Am J Respir Crit Care Med 153:1739-48]).
항천식 의약
본 발명의 TLR7/8 리간드 및 어댑터 올리고뉴클레오티드 조합물은 항천식 의약과 함께 사용될 수 있다.
천식 치료용 의약 (즉, 항천식 의약)은 일반적으로 2개의 카테고리, 즉, 신속 회복 의약 및 장기 제어 의약으로 나누어진다. 천식 환자는 지속적인 천식의 제어를 달성하고 유지하기 위해 장기 제어 의약을 일 단위로 투여한다. 장기 제어 의약은 소염제, 예를 들어 코르티코스테로이드, 크로몰린 나트륨 및 네도크로밀; 지속성 기관지 확장제, 예를 들어 지속성 β2-작용제 및 메틸잔틴; 및 류코트리엔 조절제를 포함한다. 신속 회복 의약은 속효성 β2 작용제, 항콜린제 및 전신 코르티코스테로이드를 포함한다. 각각의 상기 약물과 연관된 많은 부작용이 존재하고, 단독으로 또는 조합으로 천식을 예방하거나 완전히 치료할 수 있는 약물은 없다.
천식 의약은 PDE-4 억제제, 기관지 확장제/베타-2 작용제, K+ 채널 개방제, VLA-4 길항제, 뉴로킨 길항제, 트롬복산 A2 (TXA2) 합성 억제제, 잔틴, 아라키돈산 길항제, 5-리폭시게나제 억제제, TXA2 수용체 길항제, TXA2 길항제, 5-리폭스 활성화 단백질의 억제제, 및 프로테아제 억제제로 이루어지는 군 중에서 선택되지만 이로 제한되지 않는다.
기관지 확장제/β2 작용제는 기관지 확장 또는 평활근 이완을 야기하는 화합물 클래스이다. 기관지 확장제/β2 작용제는 살메테롤, 살부타몰, 알부테롤, 테트부탈린, D2522/포르모테롤, 페노테롤, 비톨테롤, 피르부에롤 메틸잔틴 및 오르시프레날린을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 지속성 β2 작용제 및 기관지 확장제는 소염 치료에 추가로 증상의 장기간 예방에 사용되는 화합물이다. 지속성 β2 작용제는 살메테롤 및 알부테롤을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 상기 화합물은 보통 코르티코스테로이드와 조합으로 사용되고, 일반적으로 임의의 염증 치료제와 함께 사용되지 않는다. 이들은 빈맥, 골격근 진전, 저칼륨혈증, 및 과량에서 QTc 간격의 연장과 같은 부작용과 연관되었다.
예를 들어 테오필린을 포함하는 메틸잔틴은 증상의 장기 제어 및 예방을 위해 사용되고 있다. 상기 화합물은 포스포디에스테라제 억제 및 아마도 아데노신 길항작용으로 인해 기관지 확장을 일으킨다. 용량-관련 급성 독성은 이들 종류의 화합물에 관련된 특정 문제이다. 그 결과, 대사 청소율에서 개인 차이로 인해 발생하는 독성 및 좁은 치료 범위를 해결하기 위해 일상적인 혈청 농도를 모니터링해야 한다. 부작용은 빈맥, 부정빈맥, 구역질 및 구토, 중추 신경계 자극, 두통, 발작, 토혈, 고혈당증 및 저칼륨혈증을 포함한다. 속효성 β2 작용제는 알부테롤, 비톨테롤, 피르부테롤 및 테르부탈린을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 속효성 β2 작용제의 투여와 연관된 일부 이상 작용은 빈맥, 골격근 진전, 저칼륨혈증, 증가된 락트산, 두통 및 고혈당증을 포함한다.
크로몰린 나트륨 및 네도크로밀은 주로 운동으로 발생하는 천식 증상 또는 알레르겐으로부터 발생하는 알레르기 증상을 예방하기 위해 장기 제어 의약으로서 사용된다. 상기 화합물은 클로라이드 채널 기능을 저해함으로써 알레르겐에 대한 초기 및 후기 반응을 차단하는 것으로 생각된다. 이들은 또한 비만 세포막을 안정화하고, 호산구 및 상피 세포로부터 매개체의 활성화 및 방출을 억제한다. 최대 이익을 달성하기 위해 4 내지 6주의 투여 기간이 일반적으로 요구된다.
항콜린제는 일반적으로 급성 기관지연축의 경감을 위해 사용된다. 상기 화합물은 무스카린 콜린성 수용체의 경쟁적 억제에 의해 작용하는 것으로 생각된다. 항콜린제는 이프라트로퓸 브로마이드를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 상기 화합물은 콜린 매개 기관지연축만을 역전시키고, 항원에 대한 임의의 반응을 변형시키지 않는다. 부작용은 입 및 호흡 분비의 건조, 몇몇 개인에서 천명 증가, 및 눈에 분무하는 경우 시야의 흐려짐을 포함한다.
또한, 본 발명의 조성물은 기도 재형성 (airway remodeling) 치료에도 유용할 수 있다. 기도 재형성은 기도에서 평활근 세포 증식 및/또는 점막하 비후화 (thickening)에 의해 발생하고, 최종적으로 기도 협소화를 야기하여 기류 제한을 발생시킨다. 본 발명의 조성물은 추가의 재형성을 방지할 수 있고, 심지어 재형성 과정에서 발생하는 조직 축적을 감소시킬 수도 있다.
어쥬번트
본 발명의 TLR7/8 리간드 및 어댑터 올리고뉴클레오티드는 어쥬번트와 같은 다른 물질과 조합되어 사용될 수 있다. 본원에서 사용될 때, 어쥬번트는 항원에 대한 반응, 예를 들어 체액성 및/또는 세포성 면역 반응에서 면역 세포 활성화를 향상시키는, 항원, TLR7/8 리간드 및 어댑터 올리고뉴클레오티드 이외의 다른 물질을 의미한다. 어쥬번트는 항원-특이적 면역 반응을 향상시키는 보조 세포의 축적 및/또는 활성화를 촉진시킨다. 어쥬번트는 백신, 즉, 항원에 대한 보호 면역성을 유도하기 위해 사용되는 항원-함유 조성물의 효능을 향상시키기 위해 사용된다.
어쥬번트는 일반적으로 데포 (depot) 효과를 생성시키는 어쥬번트, 면역-자극 어쥬번트, 및 데포 효과를 생성시키고 면역계를 자극하는 어쥬번트를 포함한다. 본원에서 사용될 때, 데포 효과를 생성시키는 어쥬번트는 항원을 체내에서 서서히 방출시켜 항원에 대한 면역 세포의 노출을 연장시키는 어쥬번트이다. 상기 종류의 어쥬번트는 백반 (예를 들어, 수산화알루미늄, 인산알루미늄); 에멀젼-계 제제, 예를 들어 광유, 비-광유, 유중수 또는 유중수중유 에멀젼, 수중유 에멀젼, 예를 들어 몬타나이드 어쥬번트의 Seppic ISA 시리즈 (예를 들어, 몬타나이드 ISA 720; 에어리퀴드 (AirLiquide, 프랑스 파리)); MF-59 (Span 85 및 Tween 80으로 안정화된 수중 스쿠알렌 에멀젼; 키론 코퍼레이션 (Chiron Corporation, 미국 캘리포니아주 에머리빌); 및 PROVAX (안정화 세제 및 미셀-형성제를 함유하는 수중유 에멀젼; 아이디이시 파마슈티칼스 코퍼레이션 (IDEC Pharmaceuticals Corporation, 미국 캘리포니아주 샌디에고))를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
면역-자극 어쥬번트는 면역계 세포의 활성화를 야기하는 어쥬번트이다. 이것은 예를 들어 면역 세포가 사이토킨을 생산하여 분비하도록 유도할 수 있다. 상기 종류의 어쥬번트는 키라야 사포나리아 (Q. saponaria) 나무의 껍질로부터 정제된 사포닌, 예를 들어 QS21 (HPLC 분획의 21번째 피크에서 용출된 당지질; 아퀼라 바이오파마슈티칼스, 인크. (Aquila Biopharmaceuticals, Inc., 미국 매사추세츠주 워세스터)); 폴리[디(카르복실아토페녹시)포스파젠 (피시피피 폴리머 (PCPP polymer); 바이러스 리서치 인스티튜트 (Virus Research Institute, 미국)); 지질다당체의 유도체, 예를 들어 모노포스포릴 지질 A (MPL; 리비 이뮤노켐 리서치, 인크. (Ribi ImmunoChem Research, Inc., 미국 몬타나주 해밀턴)), 무라밀 디펩티드 (MDP; 리비) 및 트레오닐-무라밀 디펩티드 (t-MDP; 리비); OM-174 (지질 A에 관련된 글루코사민 이당류; 옴 파르마 에스에이 (OM Pharma SA, 스위스 메이린)); 및 리슈만편모충 신장 인자 (정제된 리슈만편모충 단백질; 코릭사 코퍼레이션 (Corixa Corporation, 미국 와싱턴주 시애틀))를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 상기 종류의 어쥬번트는 또한 CpG DNA를 포함한다.
데포 효과를 생성시키고 면역계를 자극하는 어쥬번트는 상기 확인된 두 기능을 모두 갖는 화합물이다. 상기 종류의 어쥬번트는 ISCOMS (혼합된 사포닌, 지질을 포함하고 항원을 유지할 수 있는 세공을 갖는 바이러스 크기의 입자를 형성하는 면역자극 복합체; 시에스엘 (CSL, 호주 멜버른)); SB-AS2 (MPL 및 QS21을 함유하는 수중유 에멀젼인 스미스클라인 비참 어쥬번트 (SmithKline Beecham) 시스템 #2: 스미스클라인 비참 바이얼라지컬스 (SmithKline Beecham Biologicals [SBB], 벨기에 릭센사트); SB-AS4 (백반 및 MPL을 함유하는 스미스클라인 비참 어쥬번트 시스템 #4; SBB); 미셀을 형성하는 비-이온계 블록 공중합체, 예를 들어 CRL 1005 (이들은 폴리옥시에틸렌 사슬이 인접하는 소수성 폴리옥시프로필렌의 선형 사슬을 포함한다; 박셀, 인크. (Vaxcel, Inc., 미국 조지아주 노크로스)); 및 신텍스 (Syntex) 어쥬번트 제제 (SAF, Tween 80 및 비-이온계 블록 공중합체를 함유하는 수중유 에멀젼; 신텍스 케미칼스, 인크. (Syntex Chemicals, Inc., 미국 콜로라도주 보울더)를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
어쥬번트는 또한 지질펩티드, 예를 들어 Pam3Cys, 양이온성 다당류, 예를 들어 키토산, 또는 양이온성 펩티드, 예를 들어 프로타민일 수 있다.
사이토킨
또한, 본 발명의 TLR7/8 리간드 및 어댑터 올리고뉴클레오티드 조합물은 사이토킨과 함께 사용될 수 있다. 사이토킨은 염증 및 면역 반응을 매개하는 많은 종류의 세포에 의해 생산되는 가용성 단백질 및 당단백질이다. 사이토킨은 면역계의 세포 사이의 커뮤니케이션을 매개하고, 세포를 동원하고 그의 기능 및 증식을 조절하기 위해 국소 및 전신적으로 작용한다. 사이토킨의 범주에는 선천 면역성의 매개인자 및 조절인자, 적응 면역성의 매개인자 및 조절인자, 및 조혈 자극인자가 포함된다. 사이토킨에는 인터루킨 (예를 들어, 특히 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-1O, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, 및 인터루킨 19-32 (IL-19 - IL-32)), 케모카인 (예를 들어, 특히 P-1O, RANTES, MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, 에오탁신, I-TAC, 및 BCA-1), 및 다른 사이토킨, 예를 들어 타입 1 인터페론 (예를 들어, IFN-α 및 IFN-β), 타입 2 인터페론 (예를 들어, IFN-γ), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α), 전환 성장 인자-베타 (TGF-β), 및 다양한 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어 GM-CSF, G-CSF, 및 M-CSF가 포함된다.
항원
본 발명의 TLR7/8 리간드 및 어댑터 올리고뉴클레오티드 조합물은 임의로 백신 제제에서 항원과 함께 사용될 수 있다. "항원"은 본원에서 사용될 때 T-세포 항원 수용체 또는 B-세포 항원 수용체에 의해 인식될 수 있는 임의의 분자를 의미한다. 상기 용어는 넓게는 숙주 면역계에 의해 외래 물질로서 인식되는 임의의 종류의 분자를 포함한다. 항원은 일반적으로 세포, 세포 추출물, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 다당류, 다당류 컨쥬게이트, 다당류 및 다른 분자의 펩티드 및 비-펩티드 모방체, 소분자, 지질, 지질단백질, 당지질, 다당류, 탄수화물, 바이러스 및 바이러스 추출물, 및 다세포 유기체, 예를 들어 기생충, 및 알레르겐을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드인 항원에 대해서, 상기 항원은 그 항원을 코딩하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 항원은 보다 구체적으로 암 세포 및 암 세포에서 발현되거나 암 세포 상의 분자를 포함하는 암 항원; 미생물 및 미생물에서 발현되거나 미생물 상의 분자를 포함하는 미생물 항원; 및 알레르겐을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 따라서, 특정 실시태양에서, 본 발명은 암, 감염 물질, 및 알레르겐에 대한 백신을 제공한다.
다양한 실시태양에서, 항원은 미생물 항원, 암 항원, 또는 알레르겐이다. "미생물 항원"은 본원에서 사용될 때 미생물의 항원이고, 바이러스, 세균, 기생충, 및 진균을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 상기 항원은 무손상 미생물 및 천연 단리물 및 그의 단편 또는 유도체 및 천연 미생물 항원에 동일하거나 유사한 합성 화합물을 포함하고, 미생물에 특이적인 면역 반응을 유도한다. 화합물은 천연 미생물 항원에 대해 면역 반응 (체액성 및/또는 세포성)을 유도할 경우 천연 미생물 항원과 유사한 것이다. 상기 항원은 당업계에서 통상적으로 사용되고 있고, 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명은 본원에 기재된 임의의 감염 물질로부터 유도된 항원을 포함하고자 의도한다.
본원에서 사용될 때, 용어 "암 항원" 및 "종양 항원"은 주조직 적합 복합체 (MHC) 분자의 맥락에서 항원 제시 세포의 표면 상에 발현된 경우에 면역 반응을 일으킬 수 있고, 종양 또는 암 세포 표면과 연합된 화합물, 예를 들면 펩티드, 단백질, 지질단백질 또는 당단백질을 의미하기 위해 상호 교환가능하게 사용된다. 암 항원은 암 세포에 의해 차등적으로 발현됨으로써 암 세포를 표적화하기 위해 활용될 수 있는 항원을 지칭한다. 암 항원은 명백히 종양 특이적 면역 반응을 강력하게 자극할 수 있는 항원이다. 이들 항원 중의 몇몇은 정상 세포에 의해 코딩되지만, 반드시 정상 세포에 의해 발현되는 것은 아니다. 이들 항원은 정상세포에서는 통상적으로 침묵(즉, 발현되지 않음)인 항원, 일정한 분화 단계에서만 발현되는 항원, 및 배아 및 태아 항원과 같이 일시적으로 발현되는 항원으로 특징지을 수 있다. 기타 암 항원은 돌연변이체 세포성 유전자, 예를 들어 종양형성 유전자 (예: 활성화된 ras 종양형성 유전자), 억제인자 유전자 (예: 돌연변이체 p53), 내부 결실 또는 염색체 전위로부터 비롯된 융합 단백질에 의해 코딩된다. 또한, 기타 암 항원은 바이러스 유전자, 예를 들면, RNA 및 DNA 종양 바이러스 상에 수반된 유전자에 의해 코딩될 수 있다.
암 항원은 예를 들어 문헌 [Cohen PA et al. (1994) Cancer Res 54: 1055-8]에 기재된 바와 같이 암 세포의 조 추출물을 제조하거나, 항원을 부분적으로 정제하거나, 재조합 기술에 의해, 또는 공지된 항원의 드 노보 합성에 의해 암 세포로부터 제조될 수 있다. 암 항원에는 재조합적으로 발현되는 항원, 그의 면역원성 부분, 또는 완전한 종양 또는 암 세포가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 항원은 재조합적으로, 또는 당업계에 공지된 기타 모든 수단에 의해 단리 또는 제조될 수 있다.
종양 항원의 예에는 다음이 포함된다: MAGE, MART-1/Melan-A, gp1OO, 디펩티딜 펩티다제 IV (DPPIV), 아데노신 데아미나제-결합 단백질 (ADAbp), 시클로필린 b, 결장직장 연관 항원 (CRC)-C017-1A/GA733, 암배아 항원 (CEA) 및 그의 면역원성 에피토프 CAP-1 및 CAP-2, etv6, aml1, 전립선 특이적 항원 (PSA) 및 그의 면역원성 에피토프 PSA-1, PSA-2, 및 PSA-3, 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), T-세포 수용체/CD3-제타 사슬, 종양 항원의 MAGE-패밀리 (예를 들어, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5), 종양 항원의 GAGE-패밀리 (예를 들어, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9), BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, 티로시나제, p53, MUC 패밀리, HER2/neu, p21ras, RCAS1, α-태아단백질, E-카드헤린, α-카테닌, β-카테닌 및 γ-카테닌, p120ctn, gp1OOPmel117, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, 선종성 결장폴립증 단백질 (APC), 포드린, 코넥신 37, Ig-개별특이형, p15, gp75, GM2 및 GD2 강글리오시드, 바이러스 산물, 예를 들어 인간 유두종 바이러스 단백질, 종양 항원의 Smad 패밀리, lmp-1, P1A, EBV-코딩 핵 항원 (EBNA)-1, 뇌 글리코겐 포스포릴라제, SSX-1, SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1 및 CT-7, 및 c-erbB-2. 상기 나열한 항원의 예는 제한적인 의미로 제시되는 것이 아니다.
본원에서 사용될 때, "알레르겐"은 IgE의 생산이라는 특징을 갖는 면역 반응을 촉발시킬 수 있는 분자이다. 또한, 알레르겐은 감수성 대상에서 알레르기 또는 천식 반응을 유도할 수 있는 물질이다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, 용어 알레르겐은 IgE 항체에 의해 매개되는 알레르기 반응을 촉발시킬 수 있는 특이적 종류의 항원을 의미한다.
알레르겐의 목록은 무궁무진하고, 꽃가루, 곤충독, 동물 비듬 먼지, 진균 포자 및 약물 (예, 페니실린)을 포함한다. 천연 동물 및 식물 알레르겐의 예는 다음 속에 특이적인 단백질을 포함하지만 이로 제한되지 않는다: 개속 (Canis) (개 (C. familiaris)); 더마토파고이데스속 (Dermatophagoides) (예, 집먼지진드기 (D. farinae)); 고양이속 (Felis) (고양이 (F. domesticus)); 돼지풀속 (Ambrosia) (돼지풀 (A. artemiisfolia); 호밀풀속 (Lolium) (예, 호밀풀 (L. perenne) 또는 쥐보리 (L. multiflorum)); 삼나무속 (Cryptomeria) (삼나무 (C. japonica)); 알터나리아 (Alternaria) (검은 무늬병 (A. alternata)); 오리나무; 오리나무속 (Alnus) (알누스 굴티노아사 (A. gultinoasa)); 자작나무속 (Betula) (자작나무 (B. verrucosa)); 참나무속 (Quercus) (미국백참나무 (Q. alba)); 올리브나무속 (Olea) (올리브나무 (O. europa)); 쑥속 (Artemisia) (쑥 (A. vulgaris)); 질경이속 (Plantago) (예, 참질경이 (P. lanceolata)); 개물통이속 (Parietaria) (예, 파리에타리아 오피시날리스 (P. officinalis) 또는 파리에타리아 주다이카 (P. judaica)); 바퀴속 (Blattella) (예, 바퀴 (B. germanica)); 꿀벌속 (Apis) (예, 아피스 멀티플로룸 (A. multiflorum)); 실측백나무속 (Cupressus) (예, 사이프러스 (C. sempervirens), 쿠프레수스 아리조니카 (C. arizonica) 및 윌마 (C. macrocarpa)); 향나무속 (Juniperus) (예, 주니페루스 사비노이데스 (J. sabinoides), 연필향나무 (J. virginiana), 곱향나무 (J. communis) 및 시더우드 (J. ashei)); 측백나무속 (Thuya) (예, 측백나무 (T. orientalis)); 편백속 (Chamaecyparis) (예, 편백 (C. obtusa)); 페리플라네타 (Periplaneta) (예, 미국 바퀴 (P. americana)); 개밀속 (Agropyron) (예, 구주개밀 (A. repens)); 호밀속 (Secale ) (예, 호밀 (S. cereale)); 밀속 (Triticum) (예, 밀 (T. aestivum)); 오리새속 (Dactylis) (예, 오리새 (D. glomerata)); 김의털속 (Festuca) (예, 큰김의털 (F. elatior)); 포아풀속 (Poa) (예, 왕포아풀 (P. pratensis) 또는 좀포아풀 (P. compressa)); 귀리속 (Avena) (예, 귀리 (A. sativa)); 흰털새속 (Holcus) (예, 흰털새 (H. lanatus)); 향기풀속 (Anthoxanthum) (예, 향기풀 (A. odoratum)); 개나래새속 (Arrhenatherum) (예, 개나래새 (A. elatius)); 겨이삭속 (Agrostis) (예, 흰겨이삭 (A. alba)); 산조아재비속 (Phleum) (예, 큰조아재비 (P. pratense)); 갈풀속 (Phalaris) (예, 갈풀 (P. arundinacea)); 참새피속 (Paspalum) (예, 바이하그라스 (P. notatum)); 수수속 (Sorghum) (예, 시리아수수새 (S. halepensis)); 및 참새귀리속 (Bromus) (예, 좀참새귀리 (B. inermis)).
항체 및 ADCC
또한, 본 발명의 TLR7/8 리간드 및 어댑터 올리고뉴클레오티드 조합물은 천연 세포 용해 활성 및 항체-의존성 세포의 세포독성 (ADCC)을 증가시킨다. ADCC는 세포 표적, 예를 들어 암 세포에 특이적인 항체와 조합 사용하여 대상의 면역계가 종양 세포를 치사시키도록 함으로써 수행할 수 있다. ADCC 과정에 유용한 항체는 체내의 세포와 상호작용하는 항체를 포함한다. 세포 표적에 특이적인 많은 상기 항체는 선행 기술 문헌에 기재되어 있고, 많은 항체가 상업적으로 입수가능하다. 한 실시태양에서, 항체는 IgG 항체이다.
본 발명에서 유용한 치료 항체는 미생물 항원 (예를 들어, 세균, 바이러스, 기생충 또는 진균 항원), 암 또는 종양-연관 항원 및 자가 항원에 특이적일 수 있다. 바람직한 항체는 세포 상에 또는 세포 내에 존재하는 항원을 인식하여 결합하는 것이다. 적합한 항체의 예는 리툭산™ (리툭시맙, 항-CD20 항체), 헤르셉틴 (트라추주맙), 콰드라메트, 파노렉스, IDEC-Y2B8, BEC2, C225, 온콜림, 스마트 M195, 아트라겐, 오바렉스, 벡사, LDP-03, ior t6, MDX-210, MDX-11, MDX-22, OV103, 3622W94, 항-VEGF, 제나팍스, MDX-220, MDX-447, 멜리뮨-2, 멜리뮨-1, 세아시드, 프레타겟, NovoMAb-G2, TNT, 글리오맙-H, GNI-250, EMD-72000, 림포시드, CMA 676, 모노팜-C, 4B5, ior egf.r3, ior c5, BABS, 항-FLK-2, MDX-260, ANA Ab, 스마트 1D10 Ab, 스마트 ABL 364 Ab, CC49 (mAb B72.3), ImmuRAIT-CEA, 항-IL-4 항체, 항-IL-5 항체, 항-IL-9 항체, 항-Ig 항체, 항-IgE 항체, 혈청-유래 B형 간염 항체, 재조합 B형 간염 항체 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는다..
본 발명에 유사하게 유용한 다른 항체는 알렘투주맙 (B 세포 만성 림프성 백혈병), 겜투주맙 오조가미신 (CD33+ 급성 골수성 백혈병), hP67.6 (CD33+ 급성 골수성 백혈병), 인플릭시맙 (염증성 장 질환 및 류마티스 관절염), 에타네르셉트 (류마티스 관절염), 토시투모맙, MDX-210, 오레고보맙, 항-EGF 수용체 mAb, MDX-447, 항-조직 인자 단백질 (TF), (Sunol); ioR-c5, c5, 에드레콜로맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 강글리오시드 GD3 에피토프의 항-개별특이형 mAb 모방체 (mimic), 항-HLA-Dr10 mAb, 항-CD33 인간화 mAb, 항-CD52 humAb, 항-CD1 mAb (ior t6), MDX-22, 셀로고밥, 항-17-1A mAb, 베바치주맙, 다클리주맙, 항-TAG-72 (MDX-220), 고분자량 프로테오글리칸 (I-Mel-1)의 항-개별특이형 mAb 모방체, 고분자량 프로테오글리칸 (I-Mel-2)의 항-개별특이형 mAb 모방체, 항-CEA Ab, hmAbH11, 항-DNA 또는 DNA-회합 단백질 (히스톤) mAb, 글리오맙-H mAb, GNI-250 mAb, 항-CD22, CMA 676), GD2 강글리오시드에 대한 항-개별특이형 인간 mAb, ior egf/r3, 항-ior c2 당단백질 mAb, ior c5, 항-FLK-2/FLT-3 mAb, 항-GD-2 이중특이적 mAb, 항핵 (antinuclear) 자가항체, 항-HLA-DR Ab, 항-CEA mAb, 팔리비주맙, 베바치주맙, 알렘투주맙, BLyS-mAb, 항-VEGF2, 항-Trail 수용체; B3 mAb, mAb BR96, 유방암; 및 Abx-Cbl mAb를 포함한다.
면역글로불린 요법
본 발명의 물질은 또한 정상적인 및 과다-면역글로불린 요법과 함께 사용될 수 있다. 정상적인 면역글로불린 요법은 정상 혈액 공여자의 혈청으로부터 제조하여 모은 항체 생성물을 이용한다. 상기 모은 생성물은 감염성 병원체 (예를 들어, 세균, 바이러스, 예를 들어 A형 간염, 파르보바이러스, 장내바이러스, 진균 및 기생충)와 같은 광범위한 항원에 대한 낮은 역가의 항체를 포함한다. 과다-면역글로불린 요법은 특정 항원에 대한 높은 역가의 항체를 갖는 개체의 혈청으로부터 제조한 항체를 이용한다. 과다-면역글로불린의 예는 대상포진 면역글로불린 (면역손상된 아동 및 신생아에서 수두 예방에 유용), 인간 광견병 면역글로불린 (광견병 동물에 물린 대상의 노출후 예방에 유용), B형 간염 면역글로불린 (특히 바이러스에 노출된 대상에서 B형 간염 바이러스의 예방에 유용), 및 RSV 면역글로불린 (호흡 융합세포 바이러스 감염의 치료에 유용)을 포함한다.
투여량 및 투여
리간드 및 올리고뉴클레오티드는 목적하는 효과를 달성하기 위해 함께 사용되는 별개의 조성물로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 어댑터 올리고뉴클레오티드 및 TLR7/8 리간드는 함께 혼합되고 대상에게 투여되거나, 또는 조합물로서 실질적으로 동시에 세포와 접촉하게 할 수 있다. 다른 예로서, 어댑터 올리고뉴클레오티드 및 TLR7/8 리간드는 상이한 시점에 대상에게 투여되거나 세포와 접촉할 수 있다. 또다른 예로서, 어댑터 올리고뉴클레오티드 및 TLR7/8 리간드는 상이한 부위에서 대상에게 투여될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 용어 "유효량"은 일반적으로 원하는 생물학적 효과를 달성하기 위해 필요하거나 충분한 양을 나타낸다. 본원에 제공된 교시내용과 함께, 다양한 활성 화합물 및 가중 인자, 예를 들어 효력, 상대적 생체이용률, 환자 체중, 유해한 부작용의 심도 및 바람직한 투여 방식을 선택함으로써, 실질적인 독성을 유발하지 않으면서 특정 대상을 치료하기 위해 효과적인 예방적 또는 치료적 처리 방법을 계획할 수 있다. 임의의 특정 용도에 대한 유효량은 치료되는 질병 또는 병태, 투여되는 특정 올리고뉴클레오티드, 대상의 체격, 또는 질병 또는 병태의 심도와 같은 인자에 따라 변할 수 있다. 당업자는 과도한 실험을 하지 않고도 특정 어댑터 올리고뉴클레오티드 및 TLR7/8 리간드 및/또는 항원 및/또는 다른 치료제의 유효량을 경험적으로 결정할 수 있다.
본원에 기재된 화합물의 전신 또는 국소 전달을 위한 용량은 일반적으로 투여당 약 10 ng 내지 10 mg이고, 이것은 적용 용도에 따라 매일 1회, 1주 1회, 또는 1개월마다 1회 투여되거나, 또는 그 사이에 임의의 다른 시간 간격으로 또는 달리 필요한 만큼 투여될 수 있다. 보다 일반적으로는, 전신 또는 국소 용량은 투여당 약 1 ㎍ 내지 1 mg이고, 가장 일반적으로는 약 10 ㎍ 내지 100 ㎍이고, 2 - 4회의 투여를 수일 또는 수주 간격으로 시행한다. 보다 고용량이 비경구 투여에 필요할 수 있다. 그러나, 일부 실시태양에서, 상기 목적을 위한 비경구 용량은 상기한 일반적인 용량보다 5 내지 10,000배 더 많은 용량으로 사용될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 화합물에 대해, 치료 유효량은 초기에 동물 모델로부터 결정할 수 있다. 적용되는 용량은 투여된 화합물의 상대적 생체이용률 및 효력을 기초로 조정할 수 있다. 상기 설명된 방법 및 다른 방법을 기초로 하여 최대 효능을 달성하기 위해 용량을 조정하는 것은 당업계에 공지되어 있고, 보통의 숙련자가 쉽게 수행할 수 있다.
투여 경로
임상 용도를 위해, 본 발명의 TLR7/8 리간드 및 어댑터 올리고뉴클레오티드 조합물은 단독으로 투여되거나 또는 목적하는 치료 결과의 달성에 효과적인 임의의 적합한 투여 경로를 통한 전달 복합체로서 제제화될 수 있다. 투여 경로는 소화관내 및 비경구 투여 경로를 포함한다. 소화관내 투여 경로의 예는 경구, 위장, 내장, 및 직장을 포함한다. 비경구 투여 경로의 비제한적인 예는 정맥내, 근육내, 피하, 복강내, 경막내, 국소 주사, 국소, 비강내, 점막, 및 폐내를 포함한다.
전달 비히클
어댑터 올리고뉴클레오티드 및 TLR7/8 리간드 및/또는 항원 및/또는 다른 치료제는 단독으로 (예를 들어, 염수 또는 버퍼 중에서) 또는 당업계에 공지된 임의의 전달 비히클을 사용하여 투여할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 TLR7/8 리간드 및 어댑터 올리고뉴클레오티드 조합물은 직접 대상에게 투여될 수 있거나 또는 핵산 전달 복합체와 함께 투여될 수 있다. 핵산 전달 복합체는 표적화 수단 (예를 들어, 표적 세포에 결합하는 보다 큰 친화도를 생성시키는 분자)와 연합된 (예를 들어, 이온 또는 공유결합된; 또는 그 내부에 봉입된) 핵산 분자를 의미한다. 핵산 전달 복합체의 예는 스테롤 (예를 들어, 콜레스테롤), 지질 (예를 들어, 양이온성 지질, 비로좀 또는 리포좀), 또는 표적 세포 특이적 결합제 (예를 들어, 표적 세포 특이적 수용체에 의해 인식되는 리간드)와 연합된 핵산을 포함한다. 바람직한 복합체는 표적 세포에 의한 내재화 전에 유의한 커플링 해제 (uncoupling)를 방지하기 위해 생체 내에서 충분히 안정할 수 있다. 그러나, 복합체는 올리고뉴클레오티드가 기능적 형태로 방출되도록 세포 내에서 적절한 조건 하에 절단될 수 있다.
본 발명에 기재되고 본 발명에 따라 사용될 수 있는 다른 전달 비히클은 다음을 포함한다: 코크리트 (cochleate) (Gould-Fogerite et al., 1994, 1996); 에멀좀 (Vancott et al., 1998, Lowell et al., 1997); ISCOM (Mowat et al., 1993, Carlsson et al., 1991, Hu et., 1998, Morein et al., 1999); 리포좀 (Childers et al., 1999, Michalek et al., 1989, 1992, de Haan 1995a, 1995b); 살아있는 세균 벡터 (예, 살모넬라, 에스케리치아 콜라이, 바실러스 칼메트-구에린 (bacillus Calmette-Guerin), 시겔라 (Shigella), 락토바실러스 (Lactobacillus)) (Hone et al., 1996, Pouwels et al., 1998, Chatfield et al, 1993, Stover et al., 1991, Nugent et al., 1998); 살아있는 바이러스 벡터 (예, 박시니아, 아데노바이러스, 단순 헤르페스) (Gallichan et al., 1993, 1995, Moss et al., 1996, Nugent et al., 1998, Flexner et al., 1988, Morrow et al., 1999); 미세구 (Gupta et al., 1998, Jones et al., 1996, Maloy et al., 1994, Moore et al., 1995, O'Hagan et al., 1994, Eldridge et al., 1989); 핵산 백신 (Fynan et al., 1993, Kuklin et al., 1997, Sasaki et al., 1998, Okada et al., 1997, Ishii et al., 1997); 중합체 (예, 카르복시메틸셀룰로스, 키토산) (Hamajima et al., 1998, Jabbal-Gill et al., 1998); 중합체 고리 (Wyatt et al., 1998); 프로테오좀 (Vancott et al., 1998, Lowell et al., 1988, 1996, 1997); 불화나트륨 (Hashi et al., 1998); 트랜스제닉 (transgenic) 식물 (Tacket et al., 1998, Mason et al., 1998, Haq et al., 1995); 비로좀 (Gluck et al., 1992, Mengiardi et al., 1995, Cryz et al., 1998); 및 바이러스-유사 입자 (Jiang et al., 1999, Leibl et al., 1998). 다른 전달 비히클은 당업계에 공지되어 있다.
제약 조성물
본 발명의 TLR7/8 리간드 및 어댑터 올리고뉴클레오티드 조합물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 제약 조성물로서 제제화될 수 있다. 제약상 허용되는 담체는 인간 또는 다른 척추동물에게 투여하기 적합한 하나 이상의 상용성 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 봉입 물질을 의미한다. 담체는 천연 또는 합성의 유기 또는 무기 성분을 나타내고, 목적하는 효과의 달성을 용이하게 하기 위해 활성 성분이 담체와 조합된다. 또한, 제약 조성물의 성분은 요구되는 제약 효능을 실질적으로 손상시키는 상호작용이 존재하지 않는 방식으로 혼합된다.
경구 투여를 위해, 화합물 (즉, 어댑터 올리고뉴클레오티드 및 TLR7/8 리간드, 항원 및/또는 다른 치료제)은 활성 화합물(들)을 당업계에 공지된 제약상 허용되는 담체와 함께 배합함으로써 쉽게 제제화할 수 있다. 상기 담체는 본 발명의 화합물을 치료되는 대상에 의한 경구 섭취를 위해 정제, 환제, 당의정제, 캡슐, 용액제, 겔제, 시럽, 슬러리 및 현탁액제 등으로 제제화되도록 만들 수 있다. 경구 사용을 위한 제약 제제는 고체 부형제와 혼합하고, 임의로 생성되는 혼합물을 연마하고, 원하는 경우 적합한 보조제를 첨가한 후, 과립 혼합물을 가공하여 정제 또는 당의정제 코어를 얻음으로써 제조할 수 있다. 적합한 부형제는 특히 충전제, 예를 들어 당, 예를 들어 락토스, 수크로스, 만니톨 또는 소르비톨; 셀룰로스 제제, 예를 들어 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸트검, 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸-셀룰로스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈 (PVP)이다. 원하는 경우, 붕해제, 예를 들어 가교결합된 폴리비닐 피롤리돈, 아가 또는 알긴산 또는 그의 염, 예를 들어 알긴산나트륨을 첨가할 수 있다. 임의로, 경구 제제는 내부 산성 상태를 중화시키기 위해 염수 또는 완충액 중에 제제화될 수 있거나, 임의의 담체 없이 투여될 수 있다.
당의정제 코어에는 적합한 코팅이 제공된다. 이를 위해, 진한 당 용액을 사용할 수 있고, 이 용액은 임의로 아라비아검, 활석, 폴리비닐 피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜, 및/또는 이산화티탄, 래커 (lacquer) 용액, 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 포함할 수 있다. 활성 화합물 용량의 상이한 조합을 확인하거나 특성화하기 위해 염료 또는 안료를 정제 또는 당의정제 코팅에 첨가할 수 있다.
경구로 사용될 수 있는 제약 제제는 젤라틴으로 제조된 푸쉬-핏 (push-fit) 캡슐, 및 젤라틴 및 가소제, 예컨대 글리세롤 또는 소르비톨로 제조된 연질 밀봉 캡슐을 포함한다. 푸쉬-핏 캡슐은 활성 성분을 락토스와 같은 충전제, 전분과 같은 결합제 및/또는 활석 또는 스테아르산마그네슘과 같은 윤활제 및 임의로 안정화제와의 혼합물로 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서는, 활성 화합물은 적절한 액체, 예를 들어 지방 오일, 액체 파라핀, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜에 용해되거나 현탁될 수 있다. 또한, 안정화제를 첨가할 수 있다. 경구 투여용으로 제제화된 미세구가 사용될 수도 있다. 상기 미세구는 당업계에서 잘 규정되어 있다. 경구 투여용의 모든 제제는 상기 투여에 적합한 투여형으로 존재해야 한다.
구강 투여를 위해, 조성물은 통상적인 방식으로 제제화된 정제 또는 로젠지 형태를 취할 수 있다.
화합물은 표준 흡입 장치를 사용하여 폐관 (pulmonary tract), 특히 기관지, 보다 특히 폐 심부의 폐포 내로 흡입에 의해 투여될 수 있다. 화합물은 적합한 추진제, 예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여 가압 팩 또는 네뷸라이저 (nebulizer)로부터 에어로졸 스프레이 제공 형태로 편리하게 전달될 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투여 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 흡입 장치를 사용하여 화합물을 대상에게 전달할 수 있다. 본원에서 사용될 때, 흡입 장치는 에어로졸, 예를 들어 화합물의 건조 분말 형태를 투여하기 위한 임의의 장치이다. 상기 종류의 장치는 당업계에 공지되어 있고, 문헌에 상세하게 기재되어 있다 (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, 1995, Mac Publishing Company, Easton, Pennsylvania, pages 1676-1692). 많은 미국 특허, 예를 들어 미국 특허 6,116,237에도 흡입 장치가 기재되어 있다.
"분말"은 본원에서 사용될 때 미분산된 고체 입자로 구성된 조성물을 의미한다. 바람직하게는, 화합물은 비교적 자유롭게 유동하고, 흡입 장치에서 분산된 후, 화합물이 폐에 도달하여 폐포 내로 투과되도록 대상에 의해 흡입될 수 있다. "건조 분말"은 에어로졸을 형성하기 위해 입자가 흡입 장치에서 쉽게 분산가능하도록 하는 수분 함량을 갖는 분말 조성물을 의미한다. 수분 함량은 일반적으로 약 10 중량％ (wt％) 미만, 일부 실시태양에서 약 5 wt％ 미만, 바람직하게는 약 3 wt％ 미만의 물이다. 분말은 중합체와 함께 제제화될 수 있거나, 또는 임의로 리포좀, 알부민 및/또는 다른 담체와 같은 다른 물질과 함께 제제화될 수 있다.
에어로졸 투여 및 전달 시스템은 예를 들어 문헌 [Gonda, I. "Aerosols for delivery of therapeutic and diagnostic agents to the respiratory tract," in Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 6:273-313 (1990), 및 Moren, "Aerosol dosage forms and formulations," in Aerosols in Medicine. Principles, Diagnosis and Therapy, Moren, et al., Eds., Elsevier, Amsterdam, 1985]에 기재된 바와 같이 특정 치료 용도를 위해 당업자에 의해 선택될 수 있다.
전신 전달이 바람직한 경우, 화합물은 주사, 예를 들어, 볼러스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여를 위해 제제화될 수 있다. 주사용 제제는 보존제가 첨가된 단위 투여 형태, 예를 들어, 앰플 또는 다중 투여 용기 내에 제공될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중 현탁액, 용액 또는 에멀젼과 같은 형태일 수 있고, 제제화제, 예를 들어 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다.
비경구 투여용 제약 제제는 수용성 형태의 활성 화합물의 수용액을 포함한다. 추가로, 활성 화합물의 현탁액이 적절한 유성 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 비히클은 지방 오일, 예를 들어 참기름, 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트 또는 트리글리세리드, 또는 리포좀을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예를 들어 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 임의로, 현탁액은 또한 화합물의 용해도를 증가시켜 고농축 용액의 제조를 가능하게 하는 적합한 안정화제 또는 물질을 함유할 수 있다.
별법으로, 활성 화합물은 사용하기 전에 적합한 비히클, 예를 들어, 멸균 무발열원의 물에 재구성하는 분말 형태일 수 있다.
화합물은 또한 예를 들어 코코아 버터 또는 다른 글리세리드와 같은 통상의 좌제 베이스를 함유하는 좌제 또는 정체 관장제와 같은 직장 또는 질내 조성물로 제제화할 수 있다.
상기 설명한 제제에 추가하여, 화합물은 또한 데포 제제로서 제제화될 수 있다. 상기 지속성 제제는 적합한 중합체 또는 소수성 물질 (예를 들어 허용되는 오일 중의 에멀젼으로서) 또는 이온 교환 수지를 사용하여, 또는 난용성 유도체, 예를 들어 난용성 염으로서 제제화될 수 있다.
또한, 제약 조성물은 적합한 고체 또는 겔상 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 상기 담체 또는 부형제의 예는 탄산칼슘, 인산칼슘, 다양한 당, 전분, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 및 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
적합한 액체 또는 고체 제약 제제 형태는 예를 들어 흡입용 수용액 또는 염수 용액, 미세캡슐화, 달팽이껍질화 (encochleated), 초소형 금 입자 상에 코팅된, 리포좀 내에 함유된, 분무된, 에어로졸, 피부 이식용 펠렛, 또는 피부를 긁기 위한 날카로운 물체 상에 건조된 형태가 있다. 제약 조성물은 또한 과립, 분말, 정제, 코팅 정제, (미세)캡슐, 좌제, 시럽, 에멀젼, 현탁액, 크림, 점적제 또는 활성 화합물을 지속 방출시키는 제제를 포함하며, 상기 제제에 부형제 및 첨가제 및/또는 보조제, 예를 들어 붕해제, 결합제, 코팅제, 팽창제, 윤활제, 향미제, 감미제 또는 가용화제를 상기 설명된 바와 같이 통상적으로 사용한다. 제약 조성물은 다양한 약물 전달 시스템에서 사용하기에 적합하다. 약물 전달 방법에 대한 간단한 검토를 위해 본원에 참고로 포함시킨 문헌 [Langer R (1990), Science 249:1527-1533]을 참조한다.
본 발명의 물질 및 임의로 다른 치료제 및/또는 항원은 그 자체로 (순수), 또는 제약상 허용되는 염 형태로 투여될 수 있다. 의약으로 사용되는 경우, 염은 제약상 허용되는 것이어야 하지만, 그의 제약상 허용되는 염을 제조하기 위해 제약상 허용되지 않는 염을 편리하게 사용할 수 있다. 이러한 염으로는 하기 산으로부터 제조되는 것들이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다: 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 말레산, 아세트산, 살리실산, p-톨루엔 술폰산, 타르타르산, 시트르산, 메탄술폰산, 포름산, 말론산, 숙신산, 나프탈렌-2-술폰산, 및 벤젠술폰산. 이러한 염은 또한 알칼리 금속염 또는 알칼리토금속염, 예를 들어 카르복실산기의 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염으로서 제조할 수 있다.
적합한 완충제에는 다음의 것들이 포함된다: 아세트산 및 그의 염 (1-2％ w/v); 시트르산 및 그의 염 (1-3％ w/v); 붕산 및 그의 염 (0.5-2.5％ w/v); 및 인산 및 그의 염 (0.8-2％ w/v). 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드 (0.003-0.03％ w/v); 클로로부탄올 (0.3-0.9％ w/v); 파라벤 (0.01-0.25％ w/v) 및 티메로살 (0.004-0.02％ w/v) 등이 있다.
본 발명의 제약 조성물은 임의로 제약상 허용되는 담체 중에 포함된 본 발명의 물질 및/또는 임의로 항원 및/또는 다른 치료제를 포함한다. 용어 제약상 허용되는 담체는 인간 또는 다른 척추동물에게 투여하기 적합한 하나 이상의 상용성 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 봉입 물질을 의미한다. 용어 담체는 천연 또는 합성의 유기 또는 무기 성분을 나타내고, 그 적용을 용이하게 하기 위해 활성 성분이 담체와 조합된다. 또한, 제약 조성물의 성분은 요구되는 제약 효능을 실질적으로 손상시키는 상호작용이 존재하지 않는 방식으로 본 발명의 화합물과 서로 혼합될 수 있다.
스크리닝 방법
본 발명은 또다른 측면에서 TLR7/8 리간드 및/또는 어댑터 올리고뉴클레오티드를 확인하는 방법을 제공한다. 이 방법 단계는 확인되는 물질 (즉, 리간드 대 올리고뉴클레오티드), 리간드가 TLR7, TLR8 또는 TLR7/8 리간드인지의 여부, 사용되는 세포의 종류 등에 따라 상이하다.
본원에 제시된 교시 내용을 기초로 하여, TLR7 리간드는 단독으로 TLR7 신호전달을 자극하는 능력, 어댑터 올리고뉴클레오티드의 존재 하에 TL8 신호전달 (배경 수준으로부터 출발하여)을 자극하는 능력, 및/또는 어댑터 올리고뉴클레오티드의 존재 하에 TLR7 자극의 억제에 의해 확인될 수 있다. TLR8 리간드는 어댑터 올리고뉴클레오티드와 조합 사용될 때 향상된 TLR8 신호전달 (배경 수준 위로부터 출발하여)에 의해 확인될 수 있다. TLR7 및 8을 모두 자극하는 리간드 (단독으로 사용할 때)는 상기 활성의 임의의 조합에 의해 확인될 수 있다. 어댑터 올리고뉴클레오티드는 TLR7 리간드에 의한 TLR7 자극을 억제하는 능력, TLR7 리간드에 의한 TLR8 자극을 유도하는 능력, 및/또는 TLR8 리간드로부터 TLR8 자극을 향상시키는 능력에 의해 확인될 수 있다.
방법은 생체 내에서 또는 시험관 내에서 수행할 수 있다. 시험관내 분석은 실시예에서 설명된다. 적합한 판독은 TLR8 자극에 대한 IL-12, TNF-α 및/또는 IFN-감마, 및 TLR7 자극에 대한 IFN-α를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 분석은 별법으로 TLR7 및/또는 TLR8 신호전달에 반응성인 전사 조절 성분 (예를 들어, NF-κB 반응 성분)에 연결된 리포터 유전자를 갖는 리포터 구성체를 사용할 수 있다. 상기 구성체는 실시예에서 설명한다. 분석은 전사 상향조절 또는 하향조절, 번역 상향조절 또는 하향조절, 단백질 발현 및/또는 분비 등을 측정할 수 있다.
한 예로서, TLR8 리간드 분석은 TLR8 발현 세포 (또는 세포 집단)을 어댑터 올리고뉴클레오티드의 존재 및 부재 하에 시험 리간드와 접촉시키는 것을 수반할 수 있다. 세포는 바람직하게는 TLR7 또는 TLR9는 발현하지 않고 TLR8을 발현하는 것이다. TLR8 신호전달은 올리고뉴클레오티드의 존재 및 부재 하에 시험 리간드에 반응하는 세포로부터 측정한다. 이어서, 올리고뉴클레오티드의 부재 하의 경우에 비해 올리고뉴클레오티드의 존재 하에 향상되는 TLR8 신호전달 프로필을 갖는 시험 리간드를 TLR8 리간드로서 확인한다. 또한, 분석은 TLR8 또는 TLR9를 발현하지 않는 TLR7 발현 세포를 사용하는 TLR7 신호전달의 분석을 포함할 수 있다. 이 분석은 리간드가 올리고뉴클레오티드의 존재 하에 TLR8 신호전달로 전환하는 TLR7 리간드일 가능성을 배제하기 위해 사용될 수 있다.
공지된 리간드를 사용한 유사한 분석에 의한 결과를 도 12에 도시한다. 록소리빈과 이뮤노신 (TLR7 특이적 리간드)은 모두 ODN 6056의 존재 하에 TLR8 신호전달을 자극한다. 추정되는 TLR7 특이적 리간드는 정성적으로 유사한 프로필을 갖는 것으로 예상된다. R-848 (TLR7 및 TLR8 리간드)에 의한 TLR8 신호전달은 ODN 6056의 존재 하에 향상된다. 추정되는 TLR8 리간드는 정성적으로 유사한 프로필을 갖는 것으로 예상된다. TLR7 리간드도 아니고 TLR8 리간드도 아닌 리바비린은 ODN 6056의 존재 또는 부재 하에 TLR8 신호전달을 자극하지 않았고, 이것은 TLR7/8 리간드에 대한 분석의 특이성을 나타낸다.
어댑터 올리고뉴클레오티드 분석은 TLR8 발현 세포 (또는 세포 집단)을 TLR7, TLR8 또는 TLR7/8 리간드의 존재 및 부재 하에 시험 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 리간드가 TLR7 리간드일 경우 (단독으로 사용할 때), 분석은 올리고뉴클레오티드가 리간드와 함께 사용될 때 TLR7 신호전달 억제 및/또는 유도된 TLR8 신호전달을 측정할 수 있다. 리간드가 TLR8 리간드일 경우 (단독으로 사용할 때), 분석은 올리고뉴클레오티드가 리간드와 함께 사용될 때 리간드 단독의 경우의 효과에 비해 향상된 TLR8 신호전달을 측정할 수 있다. 리간드가 TLR7 및 TLR8을 모두 자극할 경우 (단독으로 사용할 때), 분석은 하나 이상의 상기한 판독을 측정할 수 있다. 분석 결과는 양성 대조군 분석 (예를 들어, 공지된 어댑터 올리고뉴클레오티드를 사용한 분석) 등과 비교할 수 있다. 상기 방법은 또한 올리고뉴클레오티드가 TLR7 및/또는 TLR8 리간드 자체인지를 결정하기 위한 분석을 포함할 수 있다.
상기 방법은 단독으로 사용할 때는 자극성이 약하지만, 올리고뉴클레오티드와 조합될 경우에는 새로운 및/또는 향상된 신호전달 프로필을 갖는 리간드를 확인하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명을 하기 실시예를 통해 추가로 예시하지만, 실시예가 본 발명을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예
물질 및 방법
올리고데옥시뉴클레오티드 및 시약
모든 올리고뉴클레오티드는 바이오스프링 (Biospring, 독일 프랑크푸르트)으로부터 구입하였거나 또는 콜리 파마슈티칼 게엠베하 (Coley Pharmaceutical GmbH, 독일 랑겐펠트)로부터 제공받았고, 그 종류 및 순도는 콜리 파마슈티칼 게엠베하에 의해 통제되었고, 리물루스 (Limulus) 분석 (바이오휘태커 (BioWhittaker, 벨기에 베어비어스))에 의해 측정시에 검출가능하지 않은 내독소 수준 (<0.1 EU/ml)을 보였다. 올리고뉴클레오티드를 멸균된 내독소 미함유 Tris-EDTA (시그마 (Sigma, 독일 다이젠호펜))에 현탁시키고, 미생물 및 내독소 오염 모두를 방지하기 위해 무균 조건 하에서 저장 및 취급하였다. 모든 희석은 내독소 미함유 Tris-EDTA를 사용하여 수행하였다. 올리고뉴클레오티드의 서열은 표 1 및 2에 제시하였다. 록소리빈 (7-알릴-7,8-디히드로-8-옥소-구아노신) (시그마)을 먼저 1N NaOH에 용해시키고, RPMI-배지로 희석한 후, pH를 1N HCl로 7.4로 조정하였다 (19). R-848 (1-(2-히드록시-2-메틸프로필)-2-메틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민)은 지엘신테시스 (GLSynthesis, 미국 매사추세츠주 워세스터)에서 합성한 것을 구입하여 10％ DMSO 중에 용해시켰다. 7-데아자-구아노신 (켐진스 (ChemGenes, 미국 매사추세츠주 윌밍톤))을 1N NaOH 중에 1M로 용해시켰다. 이노신 (시그마)을 H2O에 용해시켰다. 모든 희석은 내독소 미함유 Tris-EDTA로 수행하였다.
TLR 분석
인간 TLR9, TLR8 또는 TLR7을 발현하는 안정적으로 형질감염된 HEK293 세포는 이전에 설명된 바 있다 (16,20). 간단히 설명하면, HEK293 세포를 전기천공에 의해 각각의 인간 TLR을 발현하는 벡터 및 6xNF-κB-루시퍼라제 리포터 플라스미드로 형질감염시켰다. 안정한 형질감염체 (3x104 세포/웰)를 록소리빈 또는 R-848과 함께 ODN의 부재 또는 존재 하에 16시간 동안 37℃에서 가습 인큐베이터 내에서 인큐베이션하였다. 각각의 데이타 점은 3회 수행되었다. 세포를 용해시키고, 루시퍼라제 유전자 활성에 대해 분석하였다 (퍼킨-엘머 (Perkin-Elmer, 벨기에 자벤템)의 브라이트라이트 (BriteLite) 키트 사용). 자극 지수는 올리고뉴클레오티드를 첨가하지 않은 배지의 리포터 유전자 활성을 참고로 하여 계산하였다.
세포 정제
건강한 인간 공여자로부터의 말초혈 연층 제제를 독일 뒤셀도르프 대학 (University of Duesseldorf)의 혈액 은행 (Blood Bank)으로부터 입수하고, PBMC를 Ficoll-Hypaque (시그마)로 원심분리에 의해 정제하였다. 세포를 가습 인큐베이터에서 37℃에서 5％ (v/v) 열 불활성화된 인간 AB 혈청 (바이오휘태커) 또는 10％ (v/v) 열 불활성화된 FCS, 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 (모두 시그마 제품)으로 보충된 RPMI 1640 배지에 배양하였다.
사이토킨 검출 및 유동 세포 측정 분석
PBMC를 5x106 세포/ml의 농도로 재현탁시키고, 96웰 둥근 바닥 플레이트 (250 ㎕/웰)에 첨가하였다. PBMC를 상이한 ODN 및/또는 록소리빈 농축액과 함께 인큐베이션하고, 배양 상등액 (SN)을 표시된 시점 후에 수거하였다. 즉시 사용하지 않을 경우, SN을 필요할 때까지 -2O℃에서 보관하였다. SN 내의 사이토킨의 양은 상업적으로 입수가능한 ELISA 키트 (IL-12p40에 대한 비디 바이오사이언시스 (BD Biosciences, 독일 하이델베르크) 제품), IFN-γ 및 TNF-α (디아클론 (프랑스 베사콘) 제품) 또는 IFN-γ에 대해 상업적으로 입수가능한 항체 (PBL, 미국 뉴저지주 뉴 브룬스윅)를 사용하여 개발한 사내 ELISA를 사용하여 평가하였다.
세포내 염색을 위해, PBMC를 표시된 양의 올리고뉴클레오티드 및/또는 록소리빈 농축액과 함께 96웰 둥근 바닥 플레이트 (250 ㎕/웰)에서 5x106 세포/ml로 인큐베이션하고, 브레펠딘 (Brefeldin) A 용액 (비디 바이오사이언시스)을 첨가하였다. PBMC를 6시간 동안 인큐베이션하였다. 세포내 IFN-γ 염색을 위해, 세포를 브레펠딘 A 용액 첨가 전에 16시간 동안 올리고뉴클레오티드 및/또는 록소리빈과 함께 인큐베이션하였다. 세포를 수거하고, 제조사 (베크만-코울터 (Beckman-Coulter, 독일 노이스))의 지시에 따라 Intraprep 시약을 사용하여 세포내 염색을 수행하였다. 단핵구 (CD14+), B 세포 (CD19+), 및 NK 세포 (CD56+, CD3-)의 확인을 위해 적절한 항체로 세포를 염색하였다. 유동 세포 측정 데이타를 FACSCalibur로 얻고, 컴퓨터 프로그램 CellQuest를 사용하여 분석하였다 (둘 모두 비디 바이오사이언시스 제품). 유동 세포 측정 분석을 위한 모든 모노클로날 항체 (mAb)를 비디 바이오사이언시스로부터 구입하되, CD11c는 디아클론으로부터, CD14는 이뮤노테크 (Immunotech, 프랑스 마르세유)로부터, CD123은 밀테니이 (Miltenyi, 독일 베르기쉬 글리트바흐)로부터 구입하였다. 인간 단핵구는 제조사 (밀테니이)가 지시한 바와 같이 CD14 세포 단리 키트를 사용하여 전체 PBMC로부터 단리하였다. 순도를 결정하기 위해, 세포를 CD11c 및 CD14에 대한 mAb로 염색하고, 유동 세포 측정에 의해 확인하였다. 모든 실험에서, 단핵구의 순도는 95％ 초과이었다. 정제된 단핵구 (4x106 세포/ml)를 증가하는 농도의 ODN과 함께 24시간 동안 인큐베이션하였다. PDC를 제조사 (밀테니이)가 지시한 바와 같이 BDCA-4 pDC 단리 키트를 사용하여 농축하였다. PDC 정제는 CD123 (밀테니이 제품), HLA-DR 및 CD11c (비디 바이오사이언시스 제품)에 대한 mAb를 사용한 염색에 의해 확인하였다. 순도는 약 85％이었다. 세포 (5x1O5 세포/ml, 250 ㎕/웰)를 올리고뉴클레오티드 및 록소리빈과 함께 또는 이들의 부재 하에 24시간 동안 배양하였다. SN 중의 IFN-α 또는 IL-12p40을 상기한 바와 같이 측정하였다.
결과
단일중합체 올리고뉴클레오티드와의 동시 인큐베이션에 의한 TLR8 -매개 신호전달의 서열-선택적인 향상
hTLR8 및 NF-κB-루시퍼라제 리포터 구성체를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포를 올리고뉴클레오티드의 존재 또는 부재 하에 R-848 (1-(2-히드록시-2-메틸프로필)-2-메틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민)과 함께 인큐베이션하였다. 이어서, TLR8-매개 NF-κB 활성화에 대한 상이한 올리고뉴클레오티드와의 동시 인큐베이션의 영향을 분석하였다.
R-848에 의해 자극된 NF-κB 활성화의 수준을 현저하게 증가시키는, 포스포로티오에이트 주쇄를 갖는 올리고(dT)17 단일중합체 ODN인 ODN 6056이 확인되었다 (도 1B). ODN 6056 단독은 TLR8 발현 세포에서 25 μM 이하의 농도에서 상당한 NF-κB 활성화를 자극하지 않았다 (배경보다 2.5배 이하) (데이타 미발표). 시험된 모든 올리고뉴클레오티드가 균등하게 TLR8 신호전달을 향상시키는 것은 아니기 때문에 (예를 들어, 비관련된 이종중합체 (ODN 1982)는 R-848에 의한 NF-κB 활성화에 대해 큰 영향을 주지 않음), 그 효과는 올리고뉴클레오티드-의존성인 것으로 보인다.
R-848과 ODN 6056의 동시 인큐베이션은 TLR8 활성화의 효능뿐만 아니라 효력을 유의하게 증가시켰다. R-848의 EC50은 0.1 μM ODN 6056의 존재 하에 이미 크게 감소하였다 (0.1 μM ODN 6056: EC50 (R-848) = 4.9 μM, 3회 실험의 평균; EC50 (R-848) 단독 > 30 μM). 그러나, 보다 높은 농도의 ODN 6056은 EC50을 훨씬 더 크게 감소시켰다 (1 μM ODN 6056: EC50 (R-848) = 1.4 μM; 5 μM ODN: EC50 (R-848) = 0.4 μM). 상기 효과는, EC50의 감소가 ODN 1982에 대해서는 상당히 작았기 때문에 (5 μM 1982: EC50 (R-848) = 19.0 μM), ODN 6056에 대해 특이적이었다. TLR8에 대한 자극 효과와 달리, hTLR9 발현 HEK293 세포에서 ODN 6056 (또는 ODN 1982)과 TLR9 리간드 CpG ODN 2006의 동시 인큐베이션은 CpG-매개 NF-κB 자극에 영향을 주지 않았다 (데이타 미발표).
관찰된 향상 효과를 위한 효능있는 서열 요건을 조사하고, 복수의 상이한 포스포로티오에이트 단일중합체를 시험하였다 (표 1). 올리고(dT)17 (ODN 6056)이 가장 강한 향상 특성을 보였고, 그 다음으로 올리고(dU)17 (서열 11), 이어서 올리고(dA)17 (서열 12) 순으로 향상 특성을 보였다. 유의하게 보다 작은 향상이 올리고(dC)17 (서열 13) 및 무작위화된 올리고(dN)15에서 검출되었다. 이종중합체 ODN 1982는 단지 미약한 향상 활성만을 보였고, 올리고(dG)24 (서열 14)는 활성을 향상시키지 않았고, 오히려 R-848-매개 NF-κB 자극을 억제하였다. 포스포디에스테르 주쇄를 갖는 ODN 6056의 서열은 TLR8-매개 자극에 영향을 주지 않았다. 올리고뉴클레오티드의 길이도 영향을 주는 것으로 보였다: 올리고(dA)24 (서열 15)는 보다 짧은 올리고(dA)17 (서열 12)보다 R-848과 함께 보다 작은 상승 효과를 보였다.
단일중합체 T 올리고뉴클레오티드의 존재 하에 TLR7 -특이적 리간드에 의한 TLR8 발현 세포의 자극
R-848은 hTLR8뿐만 아니라 hTLR7에 대한 리간드이고 (16), 록소리빈 (7-알릴-7,8-디히드로-8-옥소-구아노신)은 TLR7-특이적 리간드로서 문헌에 설명되었다 (18). 10 mM 이하의 록소리빈의 농축액은 hTLR8 또는 hTLR9로 형질감염된 HEK293 세포에서 NF-κB 신호전달을 활성화시키지 않았지만, hTLR7-매개 신호전달을 활성화시켰다 (도 2A). TLR7 리간드이지만, hTLR8 발현 HEK293 세포와 록소리빈 및 올리고뉴클레오티드의 동시 인큐베이션은 NF-κB 신호전달을 활성화시켰다 (도 2B). 상기 농도-의존 효과는 ODN 6056의 존재 하에서만 관찰되었고, ODN 1982의 존재 하에서는 관찰되지 않았다 (도 2B). 다른 TLR7 리간드인 7-데아자-구아노신을 사용하여 유사한 관찰을 수행하였다 (18). 7-데아자-구아노신 단독은 ODN 6056의 부재 하에서는 5 mM 이하의 농도에서 hTLR8 발현 세포에 대해 활성을 보이지 않았지만, ODN 6056의 존재 하에 TLR8-매개 NF-κB 활성화를 자극하였다. HEK293 세포에서 NF-κB 신호전달을 비특이적으로 활성화시키는 것으로 보이는 화합물인 이노신 (데이타 미발표)도 hTLR8 발현 HEK293 세포에서 ODN 6056과 함께 동시 인큐베이션하였다 (도 2C). ODN 6056의 존재 하에 이노신에 의한 NF-κB 활성화는 1O mM 이하의 농도에서 이노신의 비특이적 활성화에 비해 변경되지 않았다.
아데노신계 화합물인 6-아미노-9-벤질-2-부톡시-9H-퓨린-8-올을 사용하여 유사한 효과를 관찰하였다. 단독으로 사용될 때, 상기 화합물은 TLR7 리간드이지만, TLR8 리간드는 아니다 (도 9A 및 9B). 폴리(dT)17 어댑터 올리고뉴클레오티드의 존재 하에 사용될 때, 상기 화합물은 TLR8 신호전달을 자극할 수 있다 (도 9B).
TLR7 신호전달의 서열- 비의존적 억제
상기 데이타는 소분자 TLR7 리간드가 특정 올리고뉴클레오티드의 존재 하에 TLR8-의존성 NF-κB 신호전달을 유도함을 보여준다. 그럼에도 불구하고, TLR7 발현 HEK293 세포에서 상기 효과는 역전되었다. 올리고뉴클레오티드는 도 1A, 3 및 9A에 도시된 바와 같이 실제로 TLR7 특이적 리간드 및 TLR7/8 리간드에 의한 TLR7-매개 NF-κB 활성화를 억제하였다. 이 효과는, 지금까지 시험된 모든 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드가 hTLR7 활성화를 억제하였기 때문에 (데이타 미발표), 서열-비특이적인 것으로 여겨졌다.
RNA 어댑터 올리고뉴클레오티드의 TLR8 리간드 신호전달의 향상
TLR7/8 리간드로서의 R-848 및 RNA-계 어댑터 올리고뉴클레오티드를 사용하여 유사한 실험을 수행하였다. 도 10은 혼합된 서열 올리고뉴클레오티드 및 폴리(rU)18 올리고뉴클레오티드에 의한 hTLR8-LUC-293 세포에서의 NF-κB 자극에 대한 효과를 보여준다. 단독으로 사용할 때, 폴리(rU)18 올리고뉴클레오티드 (rU*rU*rU*rU*rU*rU*rU*rU*rU*rU*rU*rU*rU*rU*rU*rU*rU*rU*; 서열 5)는 상기 올리고뉴클레오티드 사용시의 NF-κB의 경미한 활성화에 의해 제시되는 바와 같이 TLR8을 통해 신호를 전달한다 (도 10). 혼합된 서열 RNA 올리고뉴클레오티드 (rG*rC*rC*rA*rC*rC*rG*rA*rG*rC*rC*rG*rA*rA*rG*rG*rC*rA*rC*rC; 서열 16)는 단독으로 사용할 때, TLR8을 통해 신호를 전달하지 않는다.
도 11에서, hTLR8-LUC-HEK293 세포를 (a) TE 및 50 ㎍/ml DOTAP, 또는 (b) 50 ㎍/ml DOTAP의 존재 하의 5 μM의 표시된 ORN의 존재 하에 증가량의 R-848과 함께 인큐베이션하였다. NF-κB의 자극을 16시간 후에 루시퍼라제 활성을 결정하여 측정하였다. 자극 지수는 배지 단독의 존재 하의 배경을 참고로 하여 계산하였다. 도면은 폴리(rU)18 올리고뉴클레오티드가 R-848과 조합될 때 TLR8 신호전달에 대한 폴리(rU)18 올리고뉴클레오티드의 효과가 매우 크게 향상됨을 보여준다 (도 11). TLR7 리간드도 아니고 TLR8 리간드도 아닌 혼합된 서열 RNA 올리고뉴클레오티드도 도 11에 도시된 바와 같이 R-848에 의한 TLR8 신호전달을 향상시킨다. 데이타는 RNA-계 올리고뉴클레오티드도 어댑터로서 기능할 수 있음을 보여준다.
록소리빈과 올리고(dT) 17 ODN 의 동시 인큐베이션은 인간 PBMC 에 의해 생산되는 사 이토킨 프로필을 변경시킨다.
인간 면역 세포에 대한 록소리빈과 ODN 6056 및 1982의 동시 인큐베이션의 효과를 조사하였다. 록소리빈만을 사용한 인큐베이션은 IFN-α를 생산하도록 인간 PBMC를 자극하였다 (도 4A). 그러나, 증가하는 농도의 ODN의 존재 하에, 록소리빈-유도된 IFN-α는 배경 수준으로 감소하였다. 두 ODN 모두에서 효과가 관찰되었지만, ODN 6056이 보다 강한 억제 효과를 갖는 것으로 보였다.
다른 사이토킨의 생산도 연구하였다. 록소리빈 단독은 인간 PBMC로부터 단지 소량의 IL-12p40 분비만을 유도하였다 (도 4B). 이와 대조적으로, ODN 6056의 존재 하에, IL-12p40은 유의한 양으로 생산된 반면에, 록소리빈과 함께 동일한 농도의 ODN 1982는 IL-12p40을 배지 단독시의 배경을 능가한 수준으로 유도하지 않았다. IL-12p70 (데이타 미발표) 및 IFN-γ (도 4C)에 대해 유사한 결과를 얻었다. TNF-α 생산은 록소리빈 및 ODN 6056을 동시 인큐베이션한 경우에도 자극되었다. 그러나, TNF-α 생산은 ODN 1982를 록소리빈과 동시 인큐베이션한 경우에도 관찰되었지만, ODN 6056과의 동시 인큐베이션에 의해 달성되는 것보다 상당히 더 작았다. ODN 또는 록소리빈 단독의 경우 모두 유의한 수준의 TNF-α 분비를 유도하지 않았다 (도 4D).
IL -12 p40 및 TNF -α는 록소리빈 및 올리고(dT) 17 ODN 으로 동시 자극할 때 단핵구에 의해 생산된다.
록소리빈 및 ODN의 조합물은 TLR8 발현 HEK293 세포를 활성화하지만, TLR7-매개 신호전달을 억제한다. 인간 TLR8-양성 면역 세포는 IL-12 및 TNF-α의 1차 공급원이고, TLR7-양성 pDC는 IFN-α의 1차 공급원인 것으로 가정되었다. 세포내 FACS 염색은 인간 PBMC를 록소리빈 및 ODN 6056과 동시 인큐베이션할 때 대부분의 CD 14+ 세포가 TNF-α를 생산함을 보여주었다 (도 5A). 록소리빈 단독 또는 록소리빈과 ODN 1982의 조합물은 단지 소수의 TNF-양성 단핵구만을 생성시켰다. IL-12-양성 단핵구의 비율은 TNF-α에 대한 비율보다 작았다. 그럼에도 불구하고, 록소리빈과 ODN 6056의 조합물의 상승 효과는 세포내 IL-12에 대해서도 분명하게 검출될 수 있었다 (도 5B). 상기 어느 실험에서도 ODN 및 록소리빈으로 자극할 때 세포내 IL-12 또는 TNF-α가 CD 19+ B 세포에서 검출될 수 없었다 (데이타 미발표). IFN-γ의 세포 공급원도 조사하였다. 록소리빈과 ODN의 조합물은 높은 IL-12 수준을 자극하였고, 이전의 연구는 IL-12가 NK 세포에서 IFN-γ 분비를 유도함을 보여주었다 (21-23). 따라서, IFN-γ 생산을 인간 NK 세포에서 평가하였다 (도 6). 실제로, NK 세포에서 IFN-γ 생산은 인간 PBMC를 록소리빈 및 ODN 6056과 동시 인큐베이션할 때 관찰될 수 있었지만, 인간 PBMC의 상등액으로부터의 IFN-γ 단백질 ELISA에 의해 이미 입증된 바와 같이, 단독 자극시에는 상당한 IFN-γ 생산이 유도되지 않았다.
록소리빈 및 ODN 6056에 반응한 단핵구의 직접적인 TLR-매개 자극을 입증하기 위해, 인간 PBMC로부터 단핵구를 정제하고, ODN 6056 또는 1982의 존재 또는 부재 하에 록소리빈과 함께 인큐베이션하였다. 단리된 단핵구는 록소리빈 및 ODN 6056의 두 자극의 조합물에만 반응하여 IL-12p40 (도 7A) 또는 TNF-α (데이타 미발표)을 생산하였다.
R-848 또는 록소리빈과 같은 작은 면역조절 화합물과 함께 인간 PBMC의 인큐베이션은 pDC에 의한 IFN-α 생산을 유도하였다 (도 7B 및 (24, 25)). 따라서, 록소리빈에 의해 자극된 IFN-α 생산에 대한 ODN 6056의 억제 효과는 pDC에서 TLR7-매개 신호전달 억제의 직접적인 결과일 수 있었다. 그 가능성을 조사하기 위해서, 인간 pDC를 단리하고, 올리고(dT)17 단일중합체 또는 이종중합체 ODN의 존재 하에 록소리빈으로 자극하였다 (도 7B). 농축된 인간 pDC는 록소리빈 단독과 함께 인큐베이션할 때 다량의 IFN-α를 생산하였다. 이와 대조적으로, ODN 6056 또는 ODN 1982와 동시 인큐베이션한 경우에는 IFN-α 생산이 차단되었다. 다시, ODN 6056의 억제 효과는 IFN-α 생산을 차단하기 위해서 보다 낮은 ODN 농도가 필요하였기 때문에 ODN 1982보다 더 강한 것으로 나타났다.
도 8은 TLR8-LUC-293 세포를 사용하여 생성한 데이타를 보여준다. 일정한 농도의 R-848 (50 마이크로몰) 및 증가량의 특정 ODN을 사용하였다. R-848 단독의 루시퍼라제 판독치를 표준화를 위해 100％로 설정하였다. 결과를 좌측 패널에 나타낸다. 도 8의 우측 패널은 증가량의 R-848의 존재 하에 1 마이크로몰의 17mer 폴리 C 올리고뉴클레오티드 내의 증가하는 T 함량의 효과를 보여준다. 활성은 티미딘이 2개인 경우에도 향상되고, 티미딘이 6개 이상인 경우에는 매우 크게 증가한다.
논의
본 데이타는 hTLR8의 활성을 특정 포스포로티오에이트 ODN의 존재에 의해 조절할 수 있음을 입증한다. hTLR8은 hTLR7 및 hTLR8을 모두 활성화시키는 작은 면역 자극성 화합물 R-848의 능력에 의해 반영되는 바와 같이 (16), hTLR7 (26)에 가장 밀접하게 관련된다. 그러나, 보다 낮은 농도의 R-848이 TLR7 활성화에 필요하기 때문에, hTLR7은 hTLR8보다 R-848을 사용한 자극에 상당히 더 크게 민감하다. R848과 포스포로티오에이트 올리고(dT)17의 동시 인큐베이션은, 이 T 단일중합체가 그 단독으로는 상기 두 TLR에 대해 상당한 효과를 갖지 않는다는 사실에도 불구하고, TLR8을 R-848을 사용한 자극에 보다 더 민감하게 만들고, TLR7 활성화를 억제하였다.
단일중합체가 다른 자극에 의한 TLR 활성화에 영향을 주는지를 결정하기 위해, TLR8을 자극하지 않는 두개의 TLR7 리간드, 즉 록소리빈 및 7-데아자-구아노신 (18)에 대한 그의 효과를 연구하였다. 놀랍게도, 두 리간드에 대해, 올리고(dT)17의 존재는 TLR7-의존성 NF-κB 활성화를 TLR8-의존성 NF-κB 활성화로 완전히 전환시켰고, TLR7-매개 신호전달이 올리고(dT)17에 의해 억제되었다. 인간 TLR8은 록소리빈에 대한 약한 결합 친화도를 가질 수 있고, 상기 친화도는 아마도 이용가능한 생물학적 분석으로 검출이 불가능할 수 있다. 특정 올리고뉴클레오티드의 존재는 아직 알려지지 않은 기전에 의해 록소리빈의 TLR8에 대한 친화도를 향상시켜, 안정적으로 형질감염된 세포에서 TLR8의 록소리빈-매개 자극을 검출할 수 있다.
일반적인 신호전달 경로 또는 흡수 기전에 대한 올리고뉴클레오티드의 영향이 존재할 가능성을 배제할 수 없다. 그러나, 올리고(dT)17이 hTLR7 (NF-κB 신호전달의 억제), hTLR9 (효과 없음) 또는 hTLR8 (신호전달의 강한 향상)로 형질감염된 HEK293 세포에 대한 상이한 작용 방식을 갖는다는 사실은 상기 가능성을 강하게 부정한다. 관찰된 상승 효과는 이소에서 TLR8을 발현하는 세포로 제한되지 않는다. 인간 TLR7은 pDC 및 B 세포에서 주로 발현된다. 상기 세포는 TLR8을 발현하지 않는 반면, TLR8은 골수양 세포에서 발현된다 (27-30). 실제로, 사이토킨 생산 (IL-12 및 TNF-α)에 대한 록소리빈 및 ODN의 상승 효과는 내인성 TLR8을 발현하는 인간 면역 세포, 예를 들어 단핵구에서 측정되었다. 이와 대조적으로, 대다수의 록소리빈 및 R-848 유도 IFN-α는 인간 pDC에서 TLR7의 활성화에 의해 생산된다 (본 발명자들의 데이타 및 (4, 24, 25)). 상기 TLR7 자극에 의한 pDC에서 IFN-α 생산의 활성화는 포스포로티오에이트 ODN과의 인큐베이션에 의해 완전히 억제되었고, 이것은 TLR7-형질감염된 세포에서 관찰된 억제 효과와 일치하였다. TLR8에서 관찰된 서열-선택적 자극 효과와는 대조적으로, 형질감염된 세포 또는 pDC에서 포스포로티오에이트 ODN에 의한 TLR7-매개 신호전달의 억제에 분명한 서열-의존성이 존재하지 않았다. ODN과 록소리빈의 조합물은 pDC-유래 IFN-α를 단핵구-유래 IL-12 및 TNF-α로 전환시킬 뿐만 아니라, NK 세포로부터 IFN-γ를 분비시킨다. 인간 NK 세포에는 TLR7 및 TLR8 발현이 결핍되고 (31), 따라서 NK 세포-유래 IFN-γ의 자극은 아마도 IL-12에 의해 매개되는 간접적인 효과인 것으로 보인다 (32). 종합적으로 살펴볼 때, 록소리빈-매개 면역 효과의 프로필의 완전한 변경은 단순히 특정 올리고뉴클레오티드를 첨가할 때 관찰되었다. 또한, 상기 데이타는 다소 서열-의존성의 효과를 나타내고, 포스포로티오에이트 T-풍부 ODN은 TLR8을 활성화시키기 위해 TLR7-특이적 리간드와 조합될 수 있는 가장 효율적인 ODN이다.
일부 연구 보고서는 골수양 수지상 세포 및 단핵구가 mRNA 수준에서 TLR7 및 TLR8을 모두 발현한다고 언급하였다 (27-29). 상기 세포에서 실제적인 TLR 단백질 발현을 보여주는 어떠한 데이타도 이용가능하지 않다. 록소리빈에 의한 단핵구의 직접적인 자극은 상기 실험에서 검출되지 않았다. 이와 대조적으로, 록소리빈과 올리고뉴클레오티드의 조합물은 단핵구-유래 사이토킨 생산을 유도하였다. 상기 결과는 단핵구에서 TLR7의 기능적 발현을 부정하고, TLR8이 올리고뉴클레오티드 및 록소리빈에 의해 표적화되는 수용체임을 나타낸다. 또한, 록소리빈 단독은 유의한 양의 IL-12를 유도하지 않았지만, 인간 PBMC에서 IL-12의 생산이 R-848에 의해 유도됨이 보고되었고 (29), 이것은 두 TLR을 자극하는 R-848의 능력과 일치한다 (16). TLR7 및 TLR8을 모두 발현할 수 있는 세포에서 어느 TLR이 두 수용체를 자극하는 화합물로 활성화되는 지에 대해 분명히 식별하는 것은 매우 어렵다. 이토 (Ito) 등 (33)은 R-848로 자극할 때 mDC가 IL-12를 생산하지만 IFN-α를 생산하지 않는다고 보고하였다. 이와 대조적으로, pDC는 R-848 또는 다른 TLR 리간드로 자극할 때 IL-12를 생산하지 않지만 IFN-α는 생산하고 (25), 이것은 mDC에서 IL-12의 TLR8-매개 유도 및 pDC에서 IFN-α의 TLR7-매개 유도를 나타낸다. 심지어, R-848 또는 록소리빈과 올리고(dT)17 ODN의 동시 인큐베이션도 인간 pDC에 의한 IL-12의 생산을 유도하지 않았고, 이것은 상기 신호가 pDC에서 적절한 경로를 활성화시키기에 충분하지 않음을 시사한다.
올리고뉴클레오티드가 그에 대해 결합하여 효과기 분자로서 기능할 수 있는 (가능하게는 알로스테리 (allosteric)) 조절 부위를 특정 TLR이 보유할 수 있는 모델을 현재 가설로 제시하고 있다. TLR7의 경우에, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 길항제로서 작용하는 것으로 보인다. 따라서, TLR7에 대한 올리고뉴클레오티드 결합은 예를 들어 수용체 내에서 적절한 입체형태적 변화를 심화시킴으로써 TLR7 리간드의 그의 결합 포켓에 대한 적절한 결합 또는 적절한 하류 신호전달을 억제할 수 있다. 다른 한편으로, T-풍부 올리고뉴클레오티드의 TLR8에 대한 결합은 R-848 또는 다른 소분자 리간드, 예를 들어 록소리빈이 활성 TLR8 결합 포켓에 대한 결합을 증가시키거나 하류 신호전달을 증가시키는 (알로스테리) 활성화제로서 기능할 수 있다. 관련되는 두개의 결합 도메인이 존재할 수 있는지 또는 소분자 리간드 및 효과기 ODN의 결합이 동일한 부위에서 발생할 수 있는지의 여부는 현재 결정할 수 없다. 알로스테리 인핸서가 복수의 상이한 패밀리로부터의 수용체에 대해 알려져 있다. 예를 들어, 크노플라치 (Knoflach) 등 (34)은 G 단백질-커플링된 수용체 패밀리의 멤버인 향대사성 (metabotropic) 글루타메이트 수용체에 대한 알로스테리 인핸서로서 작용하는 두 종류의 소분자를 확인하였음을 보고한 바 있다. 수용체 구조의 상세한 분석을 통해 인핸서 결합부위는 막횡단 도메인 내에 편재하는 것으로 밝혀졌다. 다른 연구는 소분자가 무스카린 아세틸콜린 수용체에 대한 알로스테리 인핸서로서 작용할 수 있음을 보여주었다 (35). 특정 2-아미노티오펜은 리간드-수용체-G-단백질 3원 복합체를 안정화시키고 비커플링된 수용체 및 G-단백질의 결합을 증가시켜 (38), 아데노신 수용체 A1의 알로스테리 인핸서로서 작용한다 (36, 37). 흥미롭게도, 가오 (Gao) 등 (39)은 일련의 이미다조퀴놀린 유도체가 인간 A3 아데노신 수용체에 결합하는 작용제의 알로스테리 인핸서로서 작용함을 밝혀내었다. 최근에, 루츠 (Rutz) 등 (40)은 SPR 바이오센서 분석을 사용하여 소분자 클로로퀸 및 퀴나크린에 의한, 정제된 TLR9 단백질에 대한 CpG ODN 결합의 직접적인 차단을 입증하였다. 이들의 발견은 TLR9-매개 신호전달의 길항제로서 작용하는, TLR9의 세포외 도메인에 대한 상기 분자의 직접적인 결합을 보여준다. 따라서, 설명된 올리고뉴클레오티드 및 소분자는 TLR7 및 8에 직접 결합할 수 있다. 단리된 단백질 및 각각의 수용체 리간드를 사용한 결합 연구를 통해, TLR7 또는 TLR8에 대한 소분자 TLR 리간드와 올리고뉴클레오티드 조합물의 정확한 작용 기전에 대한 추가의 정보를 확보할 수 있을 것이다. 상기 발견은 TLR의 분자 신호전달 기전의 이해를 위해서뿐만 아니라 제약학적 연구 및 약물 개발을 위해서도 중요한 의미를 가질 수 있다. 본 발명에 따라, TLR 패밀리의 두 멤버, 즉 TLR8 및 TLR7의 신호전달 활성이 특정 올리고뉴클레오티드의 존재 또는 부재에 의해 조정될 수 있음이 입증되었다. 종합적으로, 상기 결과는 록소리빈 (또는 다른 소분자)을 특정 올리고뉴클레오티드와 조합 사용하여 면역 반응을 변경시키는 새로운 방법을 제시한다. 상기 분자의 조합에 의해, 그의 신호전달 활성을 상이한 TLR에 대해 재지정함으로써 TLR 소분자 리간드의 사이토킨 프로필을 변경시킬 수 있다. 변경 또는 강화된 면역 반응은 다양한 질병의 치료에 유익할 수 있다.
Figure 112008029727830-PCT00001
hTLR8 및 NF-κB 리포터 구성체를 발현하는 HEK293 세포를 5 μM의 표시된 ODN의 부재 또는 존재 하에 50 μM의 R-848과 함께 인큐베이션하였다. ODN의 부재 하에서 R-848에 의한 NF-κB 자극을 100％로 설정하고, 이를 기준으로 하여 R-848 활성에 대한 효과를 계산하였다. 값은 2-4회 실험의 평균 (±SD)을 나타낸다. "N"은 무작위적인 순서로 A, C, G 또는 T를 나타내고, "*"는 포스포로티오에이트 주쇄를 나타내고, "_"는 포스포디에스테르 주쇄를 나타낸다.
Figure 112008029727830-PCT00002
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균등물:
상기 상세한 설명은 당업자가 본 발명을 실시할 수 있기에 충분한 것으로 간주된다. 실시예는 단지 본 발명의 한 측면에 대한 일례로서 의도되고 다른 기능적으로 균등한 실시태양이 본 발명의 범위 내에 포함되기 때문에, 본 발명은 실시예에 의해 그 범위가 제한되지 않아야 한다. 제시되고 본원에서 설명된 것에 추가하여 당업자는 상기 상세한 설명을 통해 본 발명의 다양한 변형을 분명하게 알 수 있을 것이고, 상기 변형은 첨부된 청구의 범위에 포함된다. 본 발명의 잇점이 본 발명의 각각의 실시태양에 의해 포함될 필요는 없다.
본원에서 인용된 모든 참조 문헌, 특허, 특허 공개는 그 전부가 본원에 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Coley Pharmaceutical Group, Inc. Coley Pharmaceutical GmbH Jurk, Marion Vollmer, Jorg Krieg, Arthur M Uhlmann, Eugen Noll, Bernhard O <120> MODULATION OF TLR-MEDIATED IMMUNE RESPONSES USING ADAPTOR OLIGONUCLEOTIDES <130> C1041.70051WO00 <140> Unassigned <141> Herewith <150> US 60/720,981 <151> 2005-09-27 <160> 20 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 1 cccttttttt tttcccc 17 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 2 cccctttttt ttccccc 17 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 3 tttttttttt ttttttt 17 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 4 tccaggactt ctctcaggtt 20 <210> 5 <211> 18 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 5 uuuuuuuuuu uuuuuuuu 18 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 6 cccccttttt tcccccc 17 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 7 cccccctttt ccccccc 17 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 8 cccccccttc ccccccc 17 <210> 9 <211> 15 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is linker-linker-immunosine <400> 9 tttttttttt ttttn 15 <210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is immunosine-linker-linker <400> 10 nttttttttt ttttt 15 <210> 11 <211> 17 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 11 uuuuuuuuuu uuuuuuu 17 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 12 aaaaaaaaaa aaaaaaa 17 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 13 cccccccccc ccccccc 17 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 14 gggggggggg gggggggggg gggg 24 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 15 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 24 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 16 gccaccgagc cgaaggcacc 20 <210> 17 <211> 17 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 17 tttttttttt ttttttt 17 <210> 18 <211> 10 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 18 tttttttttt 10 <210> 19 <211> 12 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 19 tttttttttt tt 12 <210> 20 <211> 14 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 20 tttttttttt tttt 14

Claims (42)

  1. TLR8-매개 면역 반응의 자극을 필요로 하는 대상에게 TLR7/8 리간드 및 어댑터(adaptor) 올리고뉴클레오티드를, TLR8-매개 면역 반응을 자극하기 위해 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함하는, TLR8-매개 면역 반응을 자극하기 위한 방법.
  2. TLR7-매개 면역 반응을 겪는 대상에게 어댑터 올리고뉴클레오티드를, TLR7-매개 면역 반응을 TLR8-매개 면역 반응으로 재지정하기 위해 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함하는, TLR7-매개 면역 반응을 TLR8-매개 면역 반응으로 재지정하기 위한 방법.
  3. 제1 또는 2항에 있어서, TLR7/8 리간드가 TLR7 특이적 리간드인 방법.
  4. 제1 또는 2항에 있어서, TLR7 특이적 리간드가 C8-치환 구아노신인 방법.
  5. 제4항에 있어서, C8-치환 구아노신이 7-알릴-7,8-디히드로-8-옥소-구아노신 (록소리빈), 7-티아-8-옥소구아노신 (이뮤노신), 8-머캅토구아노신, 8-브로모구아노신, 8-메틸구아노신, 8-옥소-7,8-디히드로구아노신, C8-아릴아미노-2'-데옥시구아노신, C8-프로피닐-구아노신, C8- 및 N7-치환 구아닌 리보뉴클레오시드, 7-메틸-8-옥소구아노신, 8-아미노구아노신, 8-히드록시-2'-데옥시구아노신, 7-데아자-8-치 환 구아노신, 또는 8-히드록시구아노신인 방법.
  6. 제4항에 있어서, C8-치환 구아노신이 록소리빈인 방법.
  7. 제3항에 있어서, TLR7 특이적 리간드가 7-데아자-구아노신인 방법.
  8. 제3항에 있어서, TLR7 특이적 리간드가 6-아미노-9-벤질-2-(3-히드록시-프로폭시)-9H-퓨린-8-올 또는 6-아미노-9-벤질-2-부톡시-9H-퓨린-8-올인 방법.
  9. 제1 또는 2항에 있어서, TLR7/8 리간드가 TLR8 특이적 리간드인 방법.
  10. 제1 또는 2항에 있어서, TLR7/8 리간드가 TLR7 리간드 및 TLR8 리간드인 방법.
  11. 제10항에 있어서, TLR7/8 리간드가 이미다조퀴놀린인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 이미다조퀴놀린이 이미다조퀴놀린 아민, 이미다조피리딘 아민, 6,7-융합 시클로알킬이미다조피리딘 아민, 1,2 가교된 이미다조퀴놀린 아민, R-848 (S-28463 또는 레시퀴모드), 4-아미노-2-에톡시메틸-α,α-디메틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-에탄올, 1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 (R-837 또는 이미퀴모드), 또는 S-27609인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 이미다조퀴놀린이 R848인 방법.
  14. 제1 또는 2항에 있어서, 어댑터 올리고뉴클레오티드가 비메틸화된 CpG 모티프를 포함하는 것인 방법.
  15. 제1 또는 2항에 있어서, 어댑터 올리고뉴클레오티드가 비메틸화된 CpG를 포함하지 않는 것인 방법.
  16. 제1 또는 2항에 있어서, 어댑터 올리고뉴클레오티드가 5' N-TTTTT-N 3' (여기서, N은 임의의 뉴클레오티드임)을 포함하는 것인 방법.
  17. 제1 또는 2항에 있어서, 어댑터 올리고뉴클레오티드가 5' N-TTTTTT-N 3' (여기서, N은 임의의 뉴클레오티드임)을 포함하는 것인 방법.
  18. 제1 또는 2항에 있어서, 어댑터 올리고뉴클레오티드가 dT 단일중합체인 방법.
  19. 제1 또는 2항에 있어서, 어댑터 올리고뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 주쇄 변형을 포함하는 것인 방법.
  20. 제1 또는 2항에 있어서, TLR7/8 리간드 및 어댑터 올리고뉴클레오티드가 별개로 투여되는 것인 방법.
  21. 제1 또는 2항에 있어서, TLR7/8 리간드 및 어댑터 올리고뉴클레오티드가 서로 컨쥬게이트(conjugate)되는 것인 방법.
  22. 제1 또는 2항에 있어서, 어댑터 올리고뉴클레오티드가 DNA인 방법.
  23. 제1 또는 2항에 있어서, 어댑터 올리고뉴클레오티드가 RNA인 방법.
  24. 제1 또는 2항에 있어서, 대상에게 항원을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  25. 제1 또는 2항에 있어서, 대상인 감염된 것인 방법.
  26. 제1 또는 2항에 있어서, 대상이 암에 걸린 것인 방법.
  27. 제1 또는 2항에 있어서, 대상이 알레르기 또는 천식에 걸린 것인 방법.
  28. 6-아미노-9-벤질-2-(3-히드록시-프로폭시)-9H-퓨린-8-올 및 6-아미노-9-벤질-2-부톡시-9H-퓨린-8-올로 이루어진 군 중에서 선택되는 TLR7 특이적 리간드, 및 어댑터 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
  29. TLR8 특이적 리간드 및 어댑터 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
  30. 제28 또는 29항에 있어서, 어댑터 올리고뉴클레오티드가 비메틸화된 CpG 모티프를 포함하는 것인 조성물.
  31. 제28 또는 29항에 있어서, 어댑터 올리고뉴클레오티드가 비메틸화된 CpG를 포함하지 않는 것인 조성물.
  32. 제28 또는 29항에 있어서, 어댑터 올리고뉴클레오티드가 5' N-TTTTT-N 3' (여기서, N은 임의의 뉴클레오티드임)을 포함하는 것인 조성물.
  33. 제28 또는 29항에 있어서, 어댑터 올리고뉴클레오티드가 5' N-TTTTTT-N 3' (여기서, N은 임의의 뉴클레오티드임)을 포함하는 것인 조성물.
  34. 제28 또는 29항에 있어서, 어댑터 올리고뉴클레오티드가 dT 단일중합체인 조 성물.
  35. 제28 또는 29항에 있어서, 어댑터 올리고뉴클레오티드가 뉴클레오티드간 포스포로티오에이트 연결을 하나 이상 포함하는 것인 조성물.
  36. 제28 또는 29항에 있어서, 어댑터 올리고뉴클레오티드가 DNA인 조성물.
  37. 제28 또는 29항에 있어서, 어댑터 올리고뉴클레오티드가 RNA인 조성물.
  38. 제28 또는 29항에 있어서, 어댑터 올리고뉴클레오티드 및 TLR7 특이적 리간드 또는 TLR8 특이적 리간드가 서로 컨쥬게이트되는 것인 조성물.
  39. 제28 또는 29항에 있어서, 항원을 추가로 포함하는 조성물.
  40. 제28 또는 29항에 있어서, 제약 제제인 조성물.
  41. TLR8 발현 세포를 어댑터 올리고뉴클레오티드의 존재 및 부재 하에 시험 리간드와 접촉시키고,
    어댑터 올리고뉴클레오티드의 존재 및 부재 하에서의 시험 리간드에 대한 반응으로 TLR8 발현 세포의 자극을 측정하는 것을 포함하며,
    여기서 TLR8 리간드는 어댑터 올리고뉴클레오티드의 존재 하에 증가된 자극에 의해 확인되는 것인, TLR8 리간드를 확인하기 위한 방법.
  42. TLR8 발현 세포를 시험 어댑터 올리고뉴클레오티드의 존재 및 부재 하에 TLR7 리간드와 접촉시키고,
    시험 어댑터 올리고뉴클레오티드의 존재 및 부재 하에서의 TLR7 리간드에 대한 반응으로 TLR8 발현 세포의 자극을 측정하는 것을 포함하며,
    여기서 어댑터 올리고뉴클레오티드는 어댑터 올리고뉴클레오티드의 존재 하에 TLR8 발현 세포의 증가된 자극에 의해 확인되는 것인, 어댑터 올리고뉴클레오티드를 확인하기 위한 방법.
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