KR20080058022A - １기 폐암 환자의 병기 구분용 마커, 상기 마커에 대한프라이머를 포함하는 키트, 상기 마커 또는 상기 마커에대한 항체를 포함하는 마이크로어레이, 및 １기 폐암환자의 병기를 구분하는 방법 - Google Patents

１기 폐암 환자의 병기 구분용 마커, 상기 마커에 대한프라이머를 포함하는 키트, 상기 마커 또는 상기 마커에대한 항체를 포함하는 마이크로어레이, 및 １기 폐암환자의 병기를 구분하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 1기 폐암 환자의 병기 구분용 마커, 상기 마커의 센스 및 안티센스 프라이머를 포함하는 1기 폐암 환자의 병기를 구분하기 위한 키트, 및 상기 마커 또는 상기 마커에 의해 코딩되는 단백질을 인식하는 항체를 포함하는 마이크로어레이 및 1기 폐암 환자의 병기를 구분하는 방법을 제공한다.

Description

１기 폐암 환자의 병기 구분용 마커, 상기 마커에 대한 프라이머를 포함하는 키트, 상기 마커 또는 상기 마커에 대한 항체를 포함하는 마이크로어레이, 및 １기 폐암 환자의 병기를 구분하는 방법{Marker for classifying substage of stage 1 lung cancer patient, kit comprising primer for the marker, microarray comprising the marker or antibody against the marker, and method for classifying substage of stage 1 lung cancer patient}
도 1은 프로브 세트 수에 따른 오차율을 나타낸다.
도 2a 및 도 2b는 각각 268개 및 66개 프로브 세트를 이용하여 39개의 시료에 대해 계층적 클러스터링을 수행한 결과이다.
도 3은 KNN을 적용하여 1기 폐암 환자를 서브그룹한 위험군에 대한 생존분석 결과이다.
본 발명은 1기 폐암 환자의 병기 구분용 마커, 상기 마커에 대한 프라이머를 포함하는 키트, 상기 마커 또는 상기 마커에 대한 항체를 포함하는 마이크로어레이, 및 1기 폐암 환자의 병기를 구분하는 방법에 관한 것이다.
폐암은 전 세계적으로 암으로 인한 사망 중 가장 큰 부분을 차지하는 질병이다. 전체 암 사망자의 1/6 정도는 폐암으로 사망한다. 폐암은 소세포 폐암 (small cell lung cancer)과 비소세포 폐암 (nonsmall cell lung cancer)으로 나누어진다. 그 중에서 비소세포 폐암은 폐암의 약 80%에 해당하는 가장 대표적인 암으로, 선암 (adenocarcinoma), 편평상피세포암 (squamous cell carcinoma), 대세포 폐암 (large cell carcinoma)으로 나누어진다. 폐암 종류에 따라 조직학적 특성이 차이가 날뿐 아니라 예후와 치료 방법에서도 차이가 보이므로 정확한 진단이 중요하다. 비소세포 암의 경우, 최근의 암 치료법의 발달에도 불구하고 10년 생존률이 10% 이하로 매우 낮다. 이는 대부분의 비소세포 암이 발달 단계(advanced stage) 까지 진단이 어려운데 원인이 있다. 현재로서는 조기 진단이 환자의 생존 가능성을 높이는 가장 좋은 방법이다.
이에, 마커를 이용하여 폐암을 진단하기 위한 다양한 시도들이 진행되었다. 제한적인 숫자의 표적 유전자와 단백질의 발현을 조사함으로써 폐암 진단 마커를 발굴한 연구는 이미 보고되었다 (Hibi et al., Am. J. Pathol. 1999, 155: 711-715). 마이크로어레이 기술을 이용하여 폐암 마커 유전자를 발굴한 연구 보고도 있었다.
1기 폐암 환자는 대부분 예후가 좋을 것으로 예상하여 외과 수술만 받게 되나, 1기 폐암 환자의 35-50%는 5년 이내에 사망하는 고위험군 환자에 속한다. 현재 폐암의 진단 및 치료법을 결정하는 표준으로 적용되는 TNM 스테이징으로는 조기에 예후가 나쁜 환자를 확인하여 개별 치료를 적용하는 것은 어려운 실정이다. 따 라서, 조기에 환자별 위험을 예측할 수 있는 분자 마커, 예를 들면, 수술 전 마이크로 스케일의 생검 과정에서 검출이 가능한 분자 마커에 대한 요구가 여전히 존재한다. 그러나, 현재까지 밝혀진 폐암 진단 마커를 이용하여 1기 폐암을 세분할 수 있는 마커는 개발되어 있지 않다.
한국특허공개 제2006-87977호에는 폐암 진단용 마커가 기재되어 있으나, 1기 폐암을 세분할 수 있는 마커에 대한 기재는 없다.
이러한 배경하에서, 본 발명자는 1기 폐암을 세분할 수 있는 마커를 개발하기 위하여, DNA 칩을 이용하여 1기 폐암 환자의 시료에서 저 위험군, 중간 위험군 및 고 위험군 간에 발현율의 차이를 많이 나타내는 214개의 유전자를 발굴하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 1기 폐암 환자를 위험군에 따라 세분할 수 있는 1기 폐암 환자의 병기 구분용 마커에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 1기 폐암 환자를 위험군에 따라 세분할 수 있는 키트에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 1기 폐암 환자를 위험군에 따라 세분할 수 있는 마이크로어레이에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 1기 폐암 환자를 위험군에 따라 세분할 수 있는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 표 1에 기재된 폴리뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 1기 폐암 환자의 병기 구분용 마커를 제공한다.
본 발명은 유전자 마커를 이용하여 초기 폐암을 보다 세분화된 병기로 구분하고, 수술 이외에 다른 항암 치료 병용에 사용할 수 있는 기준을 제공한다. 따라서, 폐암 1기를 위험에 따라 세분화하여 병기를 구분할 수 있는 분자 마커를 제공하며, 병리학자들이 수술에 의해 판단할 수 있는 초기 폐암의 크기를 비수술적 기법에 의해 채취된 소량의 시료로도 구분할 수 있는 특징이 있다.
환자의 조직에서 RNA를 분리하여 cDNA를 합성한 후 시험관 내 전사를 통해 cRNA를 제조하는데, 이때 제조된 RNA의 우라실 염기의 일부는 바이오틴으로 변형되어 있다. 이를 마이크로어레이 상의 유전자 프로브와 혼성화시킨 후, 프로브와 혼성화하는 강도를 피코에리트린(phycoerythrin)으로 표지된 스트렙트아비딘이 바이오틴에 결합하여 나타내는 형광 값으로 측정하여, 위험군에 따른 저 위험군, 중간 위험군 및 고 위험군에서 발현 차이가 많이 나는 유전자를 선별하였다. 본 발명의 발현 분석에 이용한 플랫폼은 Affymetrix HG-U133PLUS2.0 이다.
본 발명에서 저 위험군은 종양 크기가 3cm 미만인 환자로서, 16명이 해당되며, 중간 위험군은 종양 크기가 3~5cm인 환자로서 18명이 해당되며, 고 위험군은 종양 크기가 5cm 초과한 환자로서 5명이 해당되었다. 상기 3가지 위험군에서 발현 차이가 많이 나는 유전자를 선별하였으며, 상기 선별된 유전자는 표 1에 기재하였으며, 총 214개의 유전자를 선별하였다. 상기 선별된 유전자는 주로 세포 분화(조 절), 생물 자극(biotic stimulus)에 대한 반응, 당단백질 대사 및 세포 이동에 관여한다.
1기 폐암 환자를 3가지 위험군으로 세분하기 위해서는 표 1에 기재된 폴리뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 이용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 표 1에 기재된 214개의 폴리뉴클레오티드 세트를 이용하면 더욱 정확하게 1기 폐암 환자의 병기를 구분할 수 있다. 본 발명의 마커는 1기 폐암을 위험군에 따라 저 위험군, 중간 위험군 및 고 위험군으로 구분하기 위한 마커이다.
본 발명에서, 용어 "폐암 (lung cancer)"은 폐에 발생하는 악성 종양을 의미하며, 소세포 폐암과 선암, 편평상피세포암, 대세포 폐암 등의 비소세포 폐암을 모두 포함한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 표 1에 기재된 폴리뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 포함하는, 1기 폐암 환자의 병기를 구분하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는, 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다.
본 발명의 "프라이머"는 유리 3' 히드록실기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형과 염기쌍을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반 응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자 특이적인 프라이머로 7개 내지 100개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 바람직하게는, 상기 프라이머의 길이는 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 7개 내지 30개의 뉴클레오타이드, 더 더욱 바람직하게는 7개 내지 20개의 뉴클레오타이드이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.
본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, 캡핑, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들면, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들면, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들면, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-라이신 등), 삽입제(예를 들면, 아크리딘 등), 킬레이트화제(예를 들면, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.
바람직하게는, RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트에 관한 것이다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오티드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp의 길이이다. 그 외에, RT-PCR 키트는 시험관 또는 다른 적절한 용기, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 키트는 표 1에 기재된 폴리뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 상보적인 프로브를 포함할 수 있다. 상기 키트는 단독으로 상기 프로브를 포함할 수도 있고, 상기 센스 및 안티센스 프라이머 외에 프로브를 추가로 포함할 수도 있다. 프로브의 길이는 7개 내지 100개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는, 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 7개 내지 30개의 뉴클레오타이드, 더 더욱 바람직하게는 7개 내지 20개의 뉴클레오타이드이다.
"혼성화 프로브" 또는 "프로브"는 핵산의 부분적으로 또는 완전히 상보적인 가닥에 염기 특이적인 방식으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드이다. 상기 프로브는 펩티드 핵산뿐만 아니라, 모든 기타 유형의 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
혼성화는 스트린전트 조건하에 통상적으로 수행된다. 스트린전트 조건은 서열 의존적이며 환경에 의존하여 변할 수 있다. 일반적으로, 스트린전트 조건은 지정된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 열 융점(Tm)보다 약 5℃ 낮도록 선택된다. 상기 Tm은 표적 서열에 상보적인 프로브의 50%가 평형 상태의 표적 서열에 혼성화하는 온도 (지정된 이온 강도, pH, 및 핵산 농도 하의)이다. Tm에서 표적 서열이 일반적으로 과량으로 존재할 때, 프로브의 50%는 평형에서 차지된다. 전형적으로, 스트린전트 조건은 pH 7.0 내지 8.3에서 적어도 약 0.01 내지 1.0 M Na 이온 농도 (또는 기타 염)의 염 농도를 포함하며, 온도는 짧은 프로브 (예를 들면, 10 내지 50 뉴클레오티드)에 대해 적어도 약 25℃이다. 스트린전트 조건은 또한 포름아미드와 같은 불안정화제의 첨가로 달성될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 키트는 표 1에 기재된 폴리뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질을 인식하는 항체를 포함할 수 있다. 상기 키트는 단독으로 상기 항체를 포함할 수도 있고, 상기 센스 및 안티센스 프라이머, 및 상기 프로브 외에 항체를 추가로 포함할 수도 있다.
본 발명에서, "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커에 의해 발현되는 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.
상기한 바와 같이 폐암 마커가 규명되었으므로 이를 이용하여 항체를 생성하 는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.
다클론 항체는 상기한 폐암 마커에 대한 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.
단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법 또는 파지 항체 라이브러리 기술을 이용하여 제조될 수 있다.
하이브리도마 방법은 마커 단백질 항원을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터의 세포를 이용하고, 나머지 하나의 집단으로는 암 또는 골수종 세포주를 이용한다. 이러한 두 집단의 세포들을 폴리에틸렌 글리콜과 같은 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 융합시키고 나서 항체-생산 세포를 표준적인 조직 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 수득한 후, 폐암 진단오염 마커 단백질에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 표준 기술에 따라 시험관 내에서 또는 생체 내에서 대량으로 배양한다. 상기 하이브리도마가 생산하는 단클론 항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 고순도로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다.
파지 항체 라이브러리 방법은 세포 내에 존재하는, 다양한 폐암 마커에 대한 항체 유전자(Single chain fragment variable, scFv 형태)를 획득하여 이를 파아지의 표면에 융합 단백질 형태로 발현함으로서 항체 라이브러리를 시험관 내에서 제 작하고, 이 라이브러리로부터 폐암 단백질과 결합하는 모노크로날 항체를 분리, 제작하는 방법이다.
상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리한다.
또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 키트는 1기 폐암 환자의 병기를 저 위험군, 중간 위험군 및 고 위험군으로 구분할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 마커를 포함하는, 1기 폐암 환자의 병기를 구분하기 위한 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명의 마이크로어레이에 있어서, "마이크로어레이"란 기판 상에 폴리뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있는 마이크로어레이를 의미한다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이에 관하여는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있으며, 이들 특허의 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 포함되어진다.
용어 "기판"은 혼성화 특성을 보유하고, 혼성화의 배경 수준이 낮게 유지되 는 조건하에 폴리뉴클레오티드 프로브가 커플링될 수 있는 임의의 기판을 말한다. 통상적으로, 상기 기판은 미세역가(microtiter) 플레이트, 막(예를 들면, 나일론 또는 니트로셀룰로오스) 또는 미세구(비드) 또는 칩일 수 있다. 막에 적용 또는 고정 전에, 핵산 프로브를 변형시켜 고정화를 촉진시키거나 혼성화 효율을 개선시킬 수 있다. 상기 변형은 단독중합체 테일링(homopolymer tailing), 지방족기, NH2 기, SH 기 및 카르복실기와 같은 상이한 반응성 작용기와의 커플링, 또는 바이오틴, 합텐 또는 단백질과의 커플링을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 마커에 의해 코딩되는 단백질을 인식하는 항체를 포함하는, 1기 폐암 환자의 병기를 구분하기 위한 마이크로어레이를 제공한다.
마이크로어레이에 고정되는 마커에 의해 코딩되는 단백질을 인식하는 항체 및 마이크로어레이는 전술한 바와 같다. 본 발명의 마이크로어레이는 항원-항체 복합체 형성에 의해 마커에 의해 코딩되는 단백질을 검출한다.
본 발명에서, 용어 "항원-항체 복합체"란 폐암 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 신호의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.
이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미립자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우에, 이용 가능 한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코스 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코스 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스포에놀피루베이트 데카복실라제 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다.
형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다. 미립자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다. 방사선 동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1기 폐암 환자로부터 폐암 시료를 수득하는 단계;
상기 시료로부터 표 1에 기재된 폴리뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 발현을 검출하는 단계; 및
상기 검출 결과에 기초하여 폐암 환자를 구체적인 병기로 구분하는 단계를 포함하는, 1기 폐암 환자의 병기를 구분하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 1기 폐암 환자로부터 폐암 시료를 수득하는 단계를 포함한 다. 폐암 시료는 혈액, 전혈, 혈장, 혈청, 소변, 조직, 세포, 기관, 골수, 타액, 객담 및 뇌척수액 등으로부터 수득할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서는 1기 폐암 환자의 선암 조직으로부터 시료를 분리하였다.
본 발명의 방법은 상기 시료로부터 표 1에 기재된 폴리뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 발현을 검출하는 단계를 포함한다. 생물학적 시료 중의 유전자의 발현 수준은 mRNA 또는 단백질의 양을 확인함으로써 알 수 있다.
본 발명에서 "mRNA 발현수준 측정"이란 1기 폐암 병기를 구분하기 위하여 생물학적 시료에서 폐암 마커 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블롯팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. mRNA 발현수준 측정은 바람직하게는, 폐암 마커로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하는 RT-PCR법을 이용하는 것이다.
본 발명에서 "단백질 발현수준 측정"이란 1기 폐암 병기를 구분하기 위하여 생물학적 시료에서의 폐암 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블롯(Western blot), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분 석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
단백질 발현수준 측정은 바람직하게는, ELISA법을 이용하는 것이다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지를 하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 폐암 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 1기 폐암의 병기를 구분할 수 있다.
또한, 바람직하게는, 상기 폐암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블롯을 이용하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여, 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀룰로스 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 1기 폐암의 병기를 구분할 수 있다.
본 발명의 방법은 상기 검출 결과에 기초하여 폐암 환자를 구체적인 병기로 구분하는 단계를 포함한다. 본 발명의 마커 유전자들의 상대적인 발현 프로필을 측정하여 상기 프로필에 따라 환자의 구체적인 병기를 저 위험군, 중간 위험군 및 고 위험군으로 구분할 수 있는 것이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 마커 세트 선정
1기 폐암을 위험군에 따라 저 위험군, 중간 위험군 및 고 위험군으로 구분하는 268개 프로프 세트로 이루어진 마커 세트를 선정하였다. 상기 마커 세트는 최대 정확도가 89.5% 이었으며, 상기 프로브 세트는 214개의 유전자에 해당한다. 66개의 프로브 세트로 이루어진 최소 마커 세트 적용시 정확도는 87.8%이었다. 정확도는 ROC(Receiver Operating Characteristic) 정확도이며, AUC(Area Under Curve)로 측정하였다. 도 1은 프로브 세트 수에 따른 오차율을 나타낸다. 도 1에서 보여주는 바와 같이, 프로브 세트 수가 268개일 때, 오차율이 가장 낮다는 것을 알 수 있 다.
상기 프로브 세트 268개에 해당하는 유전자를 하기 표 1에 기재하였다. 프로브 세트 아이디(ID)는 Affymetrix HG-U133 Plus 2.0 칩의 아이디인데, 이에 상응하는 유전자 아이디는 affymetrix 사에서 제공하는 대표적인 public id로서 affymetrix사에서 프로브 세트을 추출할 당시 사용된 public sequence의 아이디이다. 따라서 프로브 세트 아이디에 상응하는 유전자 아이디는 하기 표 1의 유전자 리스트에 한정되는 것은 아니다.
Figure 112006095104649-PAT00001
Figure 112006095104649-PAT00002
Figure 112006095104649-PAT00003
Figure 112006095104649-PAT00004
Figure 112006095104649-PAT00005
Figure 112006095104649-PAT00006
하기 표 2는 예측 모델과 종양 크기와의 관계를 나타낸 것이다.
pStage detail 종양 크기 CO (중간 위험군) C1 (저 위험군) C2 (고 위험군) 합계
1A 3cm 미만 1 15 0 16
1B 5cm 초과 1 0 4 5
3-5cm 14 4 0 18
합계 16 19 4 39
상기 표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 예측 모델과 종양 크기는 상당히 유사한 연관 관계가 있음을 알 수 있었다. 즉, 종양 크기가 3cm 미만인 경우에는 저 위험군에 해당하는 시료 수가 15로 가장 높았으며, 종양 크기가 3-5cm인 경우에는 중간 위험군에 해당하는 시료 수가 14로 가장 높았으며, 종양 크기가 5cm 초과인 경우에는 고 위험군에 해당하는 시료 수가 4로 가장 높다는 것을 알 수 있었다.
실시예 2: 마커 세트를 이용한 계층적 클러스터링(hierarchical clustering)
본 발명의 마커 세트를 이용하여 계층적 클러스터링(hierarchical clustering)을 수행하였다. 도 2a 및 도 2b는 각각 268개 및 66개 프로브 세트를 이용하여 39개의 시료에 대해 계층적 클러스터링을 수행한 결과이다. 도 2a 및 도 2b에서 적색은 유전자 발현율이 상대적으로 높은 것을 나타내며, 청색은 유전자 발현율이 상대적으로 낮은 것을 나타낸다.
도 2a에서 알 수 있는 바와 같이, 268개 프로브 세트는 예후를 기준으로 양호한 예후(good prognosis), 중간 예후(moderate prognosis) 및 불량 예후(poor prognosis)와 연관된 3개의 유전자 클러스터로 구분되며, 3가지 예후에 따라 프로브 세트의 발현 패턴이 다르다는 것을 알 수 있었다. 즉, 종양 크기가 3cm 미만인 양호한 예후를 보이는 환자 시료는 양호한 예후와 연관된 유전자 클러스터 1의 유전자들의 발현율이 상대적으로 높으며, 종양 크기가 3-5cm인 중간 예후를 보이는 환자 시료는 중간 예후와 연관된 유전자 클러스터 2의 유전자들의 발현율이 상대적으로 높으며, 종양 크기가 5cm 초과인 불량한 예후를 보이는 환자 시료는 불량한 예후와 연관된 유전자 클러스터 3의 유전자들의 발현율이 상대적으로 높다는 것을 알 수 있다.
따라서, 1기 폐암 환자 시료로부터 상기 프로브 세트를 이용하여 214개 유전자의 상대적 발현율을 측정하면 환자 시료의 병기를 구체적으로 세분할 수 있는 것이다.
실시예 3: 마커 세트의 성능 평가(생존 예측)
본 발명의 마커 세트를 이용하여 폐암 환자의 1기, 특히 1B 내 고 위험군을 구분할 수 있는지를 알아보았다. 1B 그룹은 TNM 스테이징으로는 구별이 어려운데, 본 발명의 마커 세트로 구분이 가능한지를 알아보았다. 본 발명의 마커 세트를 이용하여 SOM(Self Organizing Map)과 KNN(K-Nearest Neighbor) 모델을 이용하여 폐암 환자 1기를 3개 클러스터로 분류하고, 질병 예후 예측 정도를 확인하기 위해 생존 분석(survival analysis)을 이용하여 분석하였다. 도 3은 생존 분석 방법을 이용하여 1기 폐암 환자의 생존 확률을 예측한 것이다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 종양 크기와 유사한 성능으로 예후를 예측할 수 있다는 것을 알 수 있으며, 1기 폐암 환자의 5년 생존율을 25%~80%로 세분할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
본 발명에 따르면, 비수술 또는 덜 침습(less-invasive) 분자 스테이징 마커를 이용하여 1B 그룹 중에서 종양 크기에 의존한 T 스테이징보다 더 세부적인 암의 진행상황 및 예후 예측을 초기에 알 수 있으므로, 생존율이 급격하게 감소하는 고위험군을 분류할 수 있다. 또한, 정확한 스테이징이 가능하므로, 1기 환자를 예후 기준으로 보다 균일한 그룹으로 계층화(stratification)할 수 있으며, 이를 통해 환자별 치료 방법의 선택(맞춤 치료 계획)이 가능한데, 예를 들면, 예후가 안 좋은 그룹에 속하는 경우 항암치료를 병행할 수 있다. 또한, 예후 예측에 따라 환자별 재발 여부 모니터링 시점을 조정할 수 있으며, 소량의 생검 시료를 대상으로 사용할 수 있다.

Claims (13)

  1. 표 1에 기재된 폴리뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 1기 폐암 환자의 병기 구분용 마커.
  2. 제1항에 있어서, 표 1에 기재된 214개 폴리뉴클레오티드 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 마커.
  3. 제1항에 있어서, 1기 폐암 환자의 병기는 저 위험군, 중간 위험군 및 고 위험군으로 구분되는 것을 특징으로 하는 마커.
  4. 표 1에 기재된 폴리뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 포함하는, 1기 폐암 환자의 병기를 구분하기 위한 키트.
  5. 제4항에 있어서, 표 1에 기재된 폴리뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 상보적인 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  6. 제4항에 있어서, 표 1에 기재된 폴리뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택 되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질을 인식하는 항체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  7. 제4항에 있어서, 상기 1기 폐암 환자의 병기는 저 위험군, 중간 위험군 및 고 위험군으로 구분되는 것을 특징으로 하는 키트.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 마커를 포함하는, 1기 폐암 환자의 병기를 구분하기 위한 마이크로어레이.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 마커에 의해 코딩되는 단백질을 인식하는 항체를 포함하는, 1기 폐암 환자의 병기를 구분하기 위한 마이크로어레이.
  10. 1기 폐암 환자로부터 폐암 시료를 수득하는 단계;
    상기 시료로부터 표 1에 기재된 폴리뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 발현을 검출하는 단계; 및
    상기 검출 결과에 기초하여 폐암 환자를 구체적인 병기로 구분하는 단계를 포함하는, 1기 폐암 환자의 병기를 구분하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 폐암 시료는 혈액, 전혈, 혈장, 혈청, 소변, 조직, 세포, 기관, 골수, 타액, 객담 및 뇌척수액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 을 특징으로 하는 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 검출 단계는 mRNA 또는 폴리펩티드를 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 1기 폐암 환자의 병기는 저 위험군, 중간 위험군 및 고 위험군으로 구분되는 것을 특징으로 하는 방법.
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