KR20080053460A - 다중이온용 가역 가능한 전기화학 센서 - Google Patents

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에릭 바커
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어번 유니버시티
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Abstract

본 발명은 다중이온용 가역 가능한 전기화학 센서에 관한 것이다. 센서는 활성 추출 및 이온 분리를 사용하고, 이들은 전기화학적으로 제어된다. 자발적인 다중이온 추출은, 이온-교환 특성이 없는 고 친유성인 전해질을 포함하는 막을 사용함으로써 억제제된다. 다중이온의 가역 가능한 추출은, 막을 가로질러 인가되는 동안 고정된 지속 시간을 가진 전류 펄스에 의해 유도된다. 후속적으로, 다중이온은 일정한 분리 전위를 가함으로써 제거된다. 센서는 뛰어난 안정성과 가역성을 제공하고, 프로타민 적정을 통해 전체 혈액 시료의 헤파린 농도의 측정을 허용한다. 센서는 또한 다중이온 농도와 효소 활성도를 조사하고, 여기서 다중이온 분해는 시료에 있는 효소 활성도에 정비례한다. 게다가, 센서는 효소 억제제 활성도를 조사할 수 있다. 또한, 다중이온 중 하나 및 표시자(markers)로서 효소를 사용함으로써 분석 시료를 감지하기 위해 면역 측정법이 사용될 수 있다.

Description

다중이온용 가역 가능한 전기화학 센서{REVERSIBLE ELECTROCHEMICAL SENSORS FOR POLYSIONS}
본 특허 출원은, 전체가 본 명세서에 참고용으로 병합되어 있는, 2003년 7월 9일에 출원된 미국 가특허 출원 제 60/485,856호, 2004년 7월 8일에 출원된 미국 특허 출원 제 10/887,251호, 및 2003년 7월 9일에 출원된 미국 가특허 출원 제 60/485,856호의 우선권의 이점을 청구하고 있는, 2004년 7월 8일에 출원되고 다중이온용 가역 가능한 전기화학 센서(REVERSIBLE ELECTROCHEMICAL SENSORS FOR POLYIONS)으로 명칭된 미국 특허 출원 제 10/887,251호의 계속-부분 출원이다.
본 특허 출원은 또한, 전체가 본 명세서에 참고용으로 병합되어 있는, 기재로서 다중이온을 사용하는 효소 활성도의 전기 화학적 검출 및 다중이온-선택성 가역 가능한 전기화학 센서(ELECTROCHEMICAL DETECTION OF ENZYME ACTIVITIES USING POLYIONS AS SUBSTRATE AND POLYION-SELECTIVE REVERSIBLE ELECTROCHEMICAL SENSORS)로 명칭되어 있고 2005년 8월 5일에 출원된, 공동 계류중인 미국 가특허 출원 제 60/706,117호의 35 U.S.C. §119(e) 하에 우선권을 청구한다.
본 발명에 기초가 되는 연구는 미국립 보건원(NIH) 인가 GM071623 및 EB002189으로부터 자금을 부분적으로 후원받았다. 미국 정부는 본 발명의 주제에 대해 관심을 가지고 있을 수 있다.
본 발명은 다중이온 센서에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 프로타민(protamine) 및 헤파린(heparin)과 같은 다중이온의 검출에 사용하는 막, 및 전기화학 셀에서 막의 결합을 통한 그러한 검출 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 막을 가로지르는 다중이온의 이동을 통해 다중이온의 검출에 관한 것으로, 다중이온의 이동은 막의 재사용을 허용하도록 가역 가능하다.
지난 십 년간 이온-선택성 전극의 분야에서 새로운 방향이 다중이온 고분자의 검출을 위한 가소된 중합체 막을 구비한 전위차 센서의 개발과 함께 나타났다. 이러한 분야에 있어 초기 작업은 친유성 음이온-교환체를 포함하는 중합체 막 전극을 제안했으며, 상기 막은 다중음이온 헤파린을 검출할 수 있었다. Ma,S.C.,Yang,V.C., 및 Meyerhoff,M.E.Anal.Chem.1992,64,694를 참조하라. 헤파린 선택성 중합체 막 전극은 미국특허출원 제 5,236,570호 및 제 5,453,171에 추가로 기재되어 있다.
헤파린은 평균 전하가 -70이고 평균 분자량이 15,000달톤인 황산화된 다당류이다. 헤파린 화합물의 하나의 유닛에 대한 분자 구조식은 아래에 제공된다.
Figure 112008008720830-PCT00001
헤파린은, 심장-개방 수술, 우회 수술, 및 투석과 같은, 주요 수술용 및 체외의 시술에서 항응혈성 물질로 사용된다. 그러나, 의학 시술에서 헤파린의 과다한 사용은 유해할 수 있어서, 헤파린 투여의 정확한 모니터링이 꼭 필요하다. 혈액 내의 헤파린 농도의 실시간 모니터링은 특히 수술 동안 과도한 출혈의 위험을 예방하고, 수술 후 합병증을 줄여준다. 활성 응고 시간 측정(ACT)은 전체 혈액 내의 헤파린 농도를 측정하는 흔한 방법이다. 비록 이 방법이 널리 사용되지만, 구체적이지도 않고 간접적이며, 그 결과는 많은 변수들에 의해 영향 받는다. ACT와는 대조적으로, 헤파린-선택성 전극은 전체 혈액 또는 플라즈마 시료에서 직접적으로 헤파린 농도를 검출할 수 있다.
유사하게, 다중양이온 프로타민을 검출하는 전극 또한 제안되어 왔다. Yun,J.H., Meyerhoff, M.E., 및 Yang,V.C.Anal Biochem.1995,224,212를 참조하라. 폴리펩티드 프로타민은 일반적으로 헤파린 활성의 중화를 위해 사용된다(즉 응고를 촉진하기 위해). 이하 설명되는 프로타민은 평균 전하가 +20인 다중양이온이고, 아르기닌 잔여물이 풍부하다.
Figure 112008008720830-PCT00002
프로타민의 염기성 구아니디늄기는 헤파린의 항응고제 활성이 효과가 없도록, 헤파린의 술폰산염기와 정전기적으로 합성한다. 그러나, 프로타민의 지나친 사용은 또한 유해할 수 있다. 예를 들어, 프로타민의 사용은 종종, 고혈압, 산소 결핍증, 폐분리증(pulmonary platelet sequestration)을 동반한 혈소판감소증, 및 백혈구감소증과 같은, 해로운 혈역학적(hemodynamic) 및 혈액학적(hematologic) 부작용을 초래한다. 따라서 혈액과 같은 생물학적 유체에 있는 프로타민 농도를 정확하게 검출하고 측정할 수 있는 것이 유용하다.
프로타민의 확실한 검출은 작용제의 신중한 투여를 허용해 주며, 이로 인해 앞서 지적한 관련된 문제를 피할 수 있다. 더욱이, 이온-선택성 전극을 통해 프로타민을 검출하는 능력으로, 프로타민을 함유한 시료의 적정을 통해 시료 내의 헤파린 농도를 검출하는 것 또한 가능하다. 이것은 전술한 특정 헤파린-프로타민 상호 관계로 인해 가능하다. 그러한 작용은 또한 Ramamurthy 등의, Clin. Chem. 1998, 606에 기재되어 있다.
종래 기술에서 헤파린-특정 막 전극의 관찰된 반응은 고전적인 평형 접근법으로는 설명될 수 없었다. 네른스트 식은, 이온의 높은 전하로 인해, 헤파린 및 프로타민 각각에 대해, 1mV/decade 미만 및 2mV/decade의 전극 함수의 기울기를 형성한다. 이러한 생소한 메카니즘을 설명하기 위한 준-정상 상태 모델이 뒤이어 기술되었다. Fu,B. 등의, Anal Chem. 1994, 66, 2250 참조. 전위차 다중이온 센서 반응은 본질적으로 동역학적이다. 다중이온의 강한 플럭스는, 다중이온의 존재 하에 전위 전하를 초래하는, 중합체 막으로의 다중이온의 자발적인 추출 및 상기 막으로부터 친수성 이온과의 교환으로 인해, 수성 용액과 막 상(phase) 모두에서 발생한다.
종래 기술의 헤파린-특정 막 전극을 사용하는 경우, 다중이온의 추출이 비가역적인 프로세스이기 때문에, 강한 전위 드리프트가 일반적으로 관찰된다. 다중이온 용액과 접하는 비교적 짧은 시간 이후에, 센서는 이들의 반응을 잃기 시작한다. 추출된 다중이온은, 농축된 염화나트륨 용액에서와 같이, 센서를 회복시킴으로써 막 상으로부터 제거되어야 한다. 막 표면의 다중이온 농도로 인한 반응 손실을 극복하기 위해 여러 가지 방법이 제시되어 왔다. pH 크로스-센서티브 전위차 헤파린 센서가 제안되어 왔는데, 여기서 상기 센서는 이온-교환체 및 하전된 H+ 이온투과 담체(ionophore)를 포함한다. 이 방법에 따르면, 헤파린 분리는 시료의 pH를 조절함으로써 성취될 수 있다. 손실된 센서 반응 손실을 극복하기 위한 또 다른 접근법은 일회용 센서를 사용하는 것이다.
따라서, 선택성 추출 원리의 존재에도 불구하고, 지금까지는 가역적인 다중이온 센서를 설계하는 것이 불가능했다. 따라서, 다중이온 센서는 위급한 치료 용도에 매우 유리할 수 있는 반면에, 센서 반응의 빠른 손실에 의해 이들의 사용이 제한된다. 일회용 센서는 비용을 증가를 초래하고, 별도의 방법에 의해 센서를 제거하고 센서를 회복해야 하는 필요성은 시간을 과도하게 소비되고 센서의 유용성을 제한한다. 따라서, 완전히 가역적이며, 그러한 가역이 빠르게, 반복적으로, 그리고 분리 용액에 대해서 센서를 제거할 필요없이 수행될 수 있는,다중이온을 검출하기 위한 센서를 갖는 것이 유용하다.
본 발명은 다중이온용 가역 가능한 전기화학 센서를 제공한다. 센서는 다중이온 분석시료(analyte)의 농도를 결정하기 위한 전위차(potentiometric) 반응 메커니즘을 포함하지만, 추출 및 이온 분리(stripping) 방법은 전기화학적으로 제어된다. 자발적인 다중이온 추출은, 이온-교환 특성이 없는 고(highly) 친유성 전해질을 포함하는 막을 사용하여 억제된다. 다중이온의 가역 가능한 추출은, 고정된 지속 시간을 갖는 일정한 전류 펄스가 본 발명의 막 전극을 가로질러 인가되는 경우, 야기된다. 그 다음, 일정한 분리 전위를 가하여 다중이온을 분리한다. 센서를 효과적으로 재생시키는, 다중이온을 분리하는 능력은, 드리프팅하는 경향이 있고 또 다른 측정이 수행되기 이전에 감지하는 막으로부터 다중이온을 분리하기 위해 농축된 염 용액과의 오랜 접촉을 필요로 하는, 앞서 제안된 다중이온 센서에 대응하는 문제를 해결한다.
친유성 전해질을 포함하는 막은, 수리를 위해 전극을 제거하거나 전극을 교체하지 않고서도, 시료 용액 내의 다중이온 농도의 연속 측정을 위해 전기화학 셀과 함께 사용될 수 있다. 따라서, 헤파린과 같은 다중이온의 적정이 가능하다. 예를 들어 전체 혈액 시료 내의 헤파린 농도의 결정은 프로타민 적정을 사용함으로써 가능하다.
본 발명의 하나의 양상에 따르면, 전기화학 셀에서 사용하기 위한 다중이온-선택성 막이 제공되고, 여기서 막은 친유성 양이온 성분과 친유성 음이온 성분을 갖는 친유성 전해질을 포함한다. 바람직하게는, 친유성 양이온 성분 및 친유성 음이온 성분 중 하나는 특정 다중이온에 대해 선택성을 갖는다. 본 발명에 따른 검출을 위해 특히 바람직한 다중이온은 헤파린 및 프로타민이다. 본 발명의 막으로 검출될 수 있는 추가 다중이온은 디옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 부식산, 및 카라기난(carrageenans), 및 다른 다중이온 고분자를 포함한다.
앞서 지적한 바와 같이, 친유성 전해질의 친유성 양이온 성분과 친유성 음이온 성분 중 하나는 특정 다중이온에 대해 선택성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 일실시예에서, 친유성 전해질은 프로타민에 대해 선택성을 갖는 친유성 음이온 성분을 포함한다. 바람직하게는, 이러한 실시예에서, 친유성 전해질은 테트라도데실암모늄 1,3-디노닐나프탈렌-4-술폰산염(TDDA-DNNS)이다. 유사하게는 또 다른 실시예에서, 친유성 전해질은 헤파린에 대해 선택성을 갖는 친유성 양이온 성분을 포함한다. 바람직하게는,이러한 실시예에서, 친유성 전해질은 도데실구아니디늄 테트라키스(p-클로로페닐)붕산염(DDG-TCIPB)이다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 중합체 필름-형성 물질, 가소체, 및 친유성 양이온 성분과 친유성 음이온 성분을 가진 친유성 전해질을 포함하는 다중이온-선택성 막을 제공하는데, 여기서 친유성 양이온 및 친유성 음이온 성분 중 하나는 특정 다중이온에 대해 선택성을 갖는다. 바람직하게는, 중합체 필름-형성 물질은 염화폴리비닐이고 가소체는 2-니트로페닐 옥틸 에테르이다.
본 발명에 따른 또 다른 실시예에서는, 전기화학 셀에서 사용하기 위한 다중이온-선택성 막이 제공되는데, 여기서 막은, 가소체, 및 친유성 양이온 성분 및 친유성 음이온 성분을 가진 친유성 전해질을 포함하는 혼합물이 내부에 분산되어 있는 미세다공성 소수성 기재를 포함한다. 바람직하게는, 친유성 양이온 성분 및 친유성 음이온 성분 중 하나는 특정 다중이온에 대해 선택성을 갖는다.
본 발명의 또 다른 양상에서는, 전기화학 셀에 사용하기 위한 다중이온-선택성 막 전극을 제공한다. 일실시예에서, 다중이온-선택성 막 전극은 하우징, 하우징 내에 함유된 기준 용액, 및 전극이 기준 용액과 접하도록 하우징 내에 작동 가능하게 위치된 전극을 포함한다. 게다가, 이러한 실시예에 따르면, 다중이온-선택성 막은 하우징의 일단부에 위치된다. 막은 하우징 내의 기준 용액과 접하고, 막은 하우징 외부에 있는 시료 용액과 접하도록 하우징 내에 작동 가능하게 위치된다. 막은 친유성 양이온 성분과 친유성 음이온 성분을 갖는 친유성 전해질을 포함하는데, 여기서 친유성 양이온 성분과 친유성 음이온 성분 중 적어도 하나는 특정 다중이온에 대해 선택성을 갖는다.
본 발명의 또 다른 양상에서, 시료 용액에 있는 다중이온 종의 농도를 측정하는 방법을 제공한다. 본 발명의 이러한 양상에 따른 방법은 막을 가로지르는 다중이온 종의 전기화학적으로 제어된 가역 가능한 이동이 가능하다. 따라서, 상기 방법은 생물학적 시료와 같은, 시료 용액에 있는 다중이온 종의 농도의 연속 측정에 유용하다.
상기 방법의 일실시예에 따르면, 다중이온 종을 가진 시료 용액을 제공한다. 바람직하게는, 시료 용액은 바탕(background) 전해질을 더 포함한다. 용액은 전기적으로 연결된 기준 전극 및 막 전극과 접하게 된다. 막 전극의 막은 친유성 양이온 성분과 친유성 음이온 성분을 가진 친유성 전해질로 이루어지는데, 친유성 음이온 성분과 친유성 양이온 성분 중 적어도 하나는 다중이온 종에 대해 선택성을 갖는다. 시료 용액이 전극과 접하는 경우, 외부 전류 펄스는 막 전극과 시료 용액을 포함하는 회로에 인가되고, 인가된 전류는 시료 용액으로부터 막으로 다중이온 종의 이동시킨다. 바람직하게는, 외부 전류 펄스는 지속 시간을 갖는다. 막 전극과 기준 전극 사이의 전위차 반응의 측정은 전류 펄스 동안에 얻어질 수 있다. 다중이온 종의 농도는 그런 다음 전위차 반응의 함수로서 산출될 수 있다.
본 발명의 이러한 양상의 또 다른 실시예에서, 방법은 막 전극과 기준 전극에 외부 전극 전위를 가하는 단계를 추가로 포함하며, 이로 인해 막으로부터 다중이온 종을 이동시킨다. 이러한 실시예에서, 상기 방법은 가역 가능한 센서를 허용하고, 다중이온은 역-추출되고, 따라서 막은 추가로 사용하기 위해 회복된다.
이러한 양상에 따른 본 발명의 또 다른 실시예에서, 시료 용액 내의 다중이온 종의 농도를 측정하는 방법이 제공된다. 방법은 다음의 단계를 포함한다:
a) 다중이온 종과 바탕 전해질을 포함하는 시료 용액을 제공하는 단계;
b) 전기화학 셀 장치를 제공하는 단계로서, ⅰ) 친유성 양이온 성분과 친유성 음이온 성분을 갖는 친유성 전해질을 포함하는 막을 포함하는 다중이온-선택성 막 전극으로서, 여기서 친유성 음이온 성분과 친유성 양이온 성분 중 적어도 하나는 특정 다중이온에 대해 선택성을 갖는, 다중이온-선택성 막 전극, ⅱ) 막 전극에 전기적으로 연결된 기준 전극, ⅲ) 막 전극에 전기적으로 연결된 카운터 전극, ⅳ) 전극에 작동 가능하게 연결된 전기화학 기구, 및 ⅴ) 전기화학 기구와 통신하는 제어 장치를 포함하는, 전기화학 셀 장치를 제공하는 단계;
c) 전기화학 셀 장치의 전극과 시료 용액을 접하는 단계;
d) 막 전극, 카운터 전극, 및 시료 용액을 포함하는 회로에 고정된 지속 시간을 갖는 외부 전류 펄스를 가하는 단계;
e) 전류 펄스 동안 전위차 반응을 측정하는 단계;
f) 전위차 반응의 함수로서 다중이온 종의 농도를 산출하는 단계; 및
g) 막 전극과 기준 전극에 외부 전극 전위를 가하는 단계로서, 이로 인해 막으로부터 다중이온 종을 이동시키는, 막 전극과 기준 전극에 외부 전극 전위를 가하는 단계. 바람직한 실시예에서, 단계 d)~g)는 다중이온 종의 농도의 하나 이상의 추가 측정을 얻기 위해 반복된다.
본 발명의 또 다른 양상에 따르면, 전기화학 셀 장치가 제공된다. 상기 장치는 시료 용액에서 다중이온의 농도를 측정하는데 유용하다. 일실시예에 따른 장치는: 친유성 양이온 성분과 친유성 음이온 성분을 갖는 친유성 전해질을 포함하는 다중이온-선택성 막 전극으로서, 여기서 친유성 음이온 성분과 친유성 양이온 성분 중 적어도 하나는 특정 다중이온에 대해 선택성을 갖는, 다중이온-선택성 막 전극; 막 전극에 전기적으로 연결된 기준 전극; 및 막 전극과 기준 전극에 작동 가능하게 연결된 전기화학 기구를 포함한다.
본 발명의 이러한 양상에 따른 또 다른 실시예에서, 전기화학 셀 장치는 막 전극에 전기적으로 연결된 카운터 전극을 추가로 포함한다.
본 발명의 이러한 양상에 따른 또 다른 실시예에서, 전기화학 셀 장치는 전기화학 기구와 통신하는 제어 장치를 더 포함한다. 바람직한 실시예에서, 제어 장치는 컴퓨터로 처리하는 제어기이다. 그러한 제어기는 전기화학 셀 장치의 부분 또는 전체 자동화를 허용한다.
본 발명의 또 다른 양상에 있어서, 센서가 개시된다. 센서는 하우징 내에 위치된 전극을 포함한다. 막은 하우징의 일단부에 위치되고 하우징 외부의 시료 용액과 접한다. 막은 시료 용액 내의 다중이온 농도를 검출하고, 다중이온 농도의 분해 속도는 시료 용액 내의 효소 활성도에 정비례한다.
전극은 Ag/AgCl 전극일 수 있다. 막의 표면적은 약 10㎟ 내지 약 100㎟이다. 대안적으로 막의 표면적은 약 20㎟ 내지 약 50㎟이다. 막의 평균 두께는 약 10㎛ 내지 약 1000㎛이다. 대안적으로, 막의 평균 두께는 약 20㎛ 내지 약 300㎛이다. 다중이온 농도는 프로타민의 농도일 수 있다. 효소 활성도는 트립신의 활성도일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상에 따르면, 시료 용액 내의 다중이온 농도를 검출하는 방법이 개시된다. 상기 방법은 시료 용액을 제공하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 또한 막과 시료 용액을 접하는 단계로서, 여기서 막은 시료 용액 내의 다중이온 농도를 검출하고, 다중이온 농도의 분해 속도는 시료 용액 내의 효소 활성도에 정비례하는, 막과 시료 용액을 접하는 단계를 포함한다. 상기 시료 용액은 생물학적 성분을 포함할 수 있다. 상기 시료 용액은 혈액을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상에 있어서, 가역 가능한 전기화학 셀 장치가 개시된다. 상기 셀 장치는 막을 포함하는 다중이온-선택성 막 전극을 포함한다. 막은 시료 용액 내의 다중이온 농도를 검출할 수 있고, 다중이온 농도의 분해 속도는 시료 용액 내의 효소 활성도에 정비례한다. 상기 셀 장치는 또한 막을 세척하기 위해 전위를 인가하는 수단을 포함한다. 막을 세척하기 위해 전위를 인가하는 수단은 기준 전극과 다중이온-선택성 막 전극 사이에 인가된 외부 전극 전위일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상에 있어서, 가역 가능한 전기화학 셀 장치가 개시된다. 상기 셀 장치는 막을 포함하는 다중이온-선택성 막 전극을 포함한다. 막은 용액 내의 다중이온 농도를 검출한다. 상기 셀 장치는 또한 막을 세척하기 위해 기준 전극과 다중이온-선택성 막 전극 사이에 전위를 인가하는 수단을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양상에 있어서, 센서가 개시된다. 센서는 하우징 내에 위치된 전극을 포함한다. 센서는 또한 하우징의 일단부에 위치되고 하우징 외부의 시료 용액과 접한다. 막은 시료 용액의 효소 활성도 및 해당 효소 억제제 활성도를 모니터할 수 있다.
해당 효소 억제제 활성도는 α1-안티프로테이나아제 억제제, α2-매크로글로불린, 아프로티닌, 및 콩 억제제 중 하나일 수 있다. 본 발명의 전위 감소는 시료 용액 내의 해당 효소 억제제의 농도에 의존할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상에 있어서, 면역 측정법이 개시된다. 면역 측정은 다중이온 중 하나, 및 표시자(marker)로서 효소를 사용함으로써 분석 시료를 검출할 수 있다.
도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 다중이온-선택성 막을 포함하는 전기화학 셀 장치의 개략도.
도 2는 (A) 본 발명에 따른 다중이온-선택성 막 전극 및 (B) 종래 기술 이온-선택성 전극에 대한, 0.1M의 NaCl, 및 10㎎/L의 프로타민을 함유하는 0.1M의 NaCl 사이에서 교대하는 전극 재생 능력을 설명하는 차트.
도 3은 본 발명에 따른 다중이온-선택성 막 전극을 결합한 측정 방법을 사용하여, 0.1M의 NaCl 용액, 및 10㎎/L의 프로타민을 함유하는 0.1M의 NaCl의 용액의 펄스 갈바노스탯 측정에 의한 전류/시간 및 전위/시간을 설명하는 차트.
도 4는 본 발명에 따른 다중이온-선택성 막 전극을 사용하여, 0.1M의 NaCl 용액, 및 50㎎/L의 프로타민을 함유하는 0.1M의 NaCl 용액의 펄스 갈바노스탯(galvanostatic) 측정에 위한 전류/시간 및 전위/시간을 설명하는 차트.
도 5는 (A) 본 발명에 따른 다중이온-선택성 막 전극 및 (B) 종래 기술 이온-선택성 전극을 사용하고, 펄스 갈바노스탯 측정을 사용하여, 0.1M의 NaCl에서의 프로타민에 대한 보정 곡선을 설명하는 차트.
도 6은 0.1M의 NaCl의 표준 용액(blank solution)에서 그리고 10㎎/L의 프로타민의 존재 하에, -2㎂의 음극 전류를 인가하는 경우, 본 발명에 따른 다중이온-선택성 막 전극의 반응에 대한 교반 효과를 설명하는 차트.
도 7은 프로타민이 없는(아래의 곡선) 그리고 25㎎/L의 프로타민을 첨가하여(위의 곡선) -2㎂의 음극 전류에서 본 발명에 따른 다중이온-선택성 막 전극의 반응에 대한 시료 pH의 영향을 설명하는 차트.
도 8은 NaCl, KCl, MaCl2, CaCl2의 순수한 용액에서, 및 프로타민이 함유된 0.1M의 NaCl 바탕 전해질 용액에서, 본 발명에 따른 다중이온-선택성 막 전극에 대한 보정 곡선을 설명하는 차트.
도 9는 (A) 지지(supporting) 전해질의 상이한 농도(0.01M의 NaCl, 0.03M의 NaCl, 및 0.1M NaCl)의 존재 하에 프로타민의 보정 곡선, 및 (B) 0.01M의 KCl을 함유하거나 함유하지 않은 0.1M의 NaCl에서의 프로타민 보정 곡선에 대한 KCl 농도의 영향을 설명하는 두 개의 차트를 제공하는 도면.
도 10은 본 발명에 따른 다중이온-선택성 막 전극을 사용하여, 전체 혈액의 프로타민 적정을 위한 진폭-시간 활동을 설명하는 차트.
도 11은 (A) 본 발명에 따른 다중이온-선택성 막 전극을 사용하여, 1g/L의 프로타민 용액을 더한 0 mM, 0.25 mM, 0.5 mM, 1 mM, 및 2 mM의 헤파린 농도를 포함하는, 전체 혈액 시료의 적정, 및 (B) 본 발명에 따른 다중이온-선택성 막 전극을 사용하여 전체 혈액 내의 헤파린-프로타민 적정에 대한 해당 보정 곡선을 설명 하는 차트.
도 12A는 트립신 농도의 함수에 따른, 트립신의 첨가 직후 전위 변화(ΔE/Δt)의 반응 속도를 설명하는 차트.
도 12B는 트립신 농도의 함수로서, 트립신의 첨가 직후 프로타민 농도 변화(ΔC/Δt)의 반응 속도를 설명하는 차트.
도 13A는 SI 억제제 농도의 함수로서, 트립신 및 SI 억제제의 첨가 직후 전위 변화(ΔE/Δt)의 반응 속도를 설명하는 차트.
도 13B는 SI 억제제의 농도의 함수로서, 트립신 및 SI 억제제의 첨가 직후 프로타민 농도 변화(ΔC/Δt)의 반응 속도를 설명하는 차트.
본 발명은 이하 더 자세하게 기재될 것이다. 그러나, 본 발명은 매우 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 본 명세서에 설명된 실시예에 한정되어 해석되어서는 안된다; 오히려, 이러한 실시예는 이러한 명세가 적용 가능한 법적 조건을 만족시키도록 하기 위해 제공된다. 발명의 상세한 설명 및 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태의 관사가 문맥상 명확하게 다른 것을 나타내지 않는다면 복수의 대상물을 포함한다.
본 발명은, 일련의 기구 제어 하에 재생하기 위한 후속적인 역-추출을, 측정 동안에 한정된 다중이온 추출을 대량 운송하는 프로세스와 결합시키는 가역 가능한 다중이온 센서를 제공한다. 본 발명은 친유성 전해질을 포함하는 다중이온-선택성 막을 사용한다. 막을 가로지르는 이온 플럭스(flux)를 기구를 사용해 제어하는 것 은 반복적으로 이온을 막 안으로 추출하는 것과 막으로부터 분리(strip)하는 것을 허용하여, 매우 재생산적인 가능한 센서 반응을 산출한다. 게다가, 센서 막을 빠르게 그리고 테스트 절차 동안에 복원하는 능력은, 용액 내의 다중이온 농도에 대한 실용적인 값을 제공하기 위한 연속적 기능성을 허용한다.
이전에 이 분야에서 알려진 전위차 다중이온-선택성 센서는 수동 센서이다. 그러한 센서는 친유성 양이온-교환체 분자(일반적으로 R-Na+로 기재됨)를 포함하는 막 및 수성 전해질 용액을 가지고 있다. 시료와 그러한 센서에 있는 막 사이의 상 경계 전위는 반응식 1에 따라 결정될 수 있다:
Figure 112008008720830-PCT00003
여기서 aNa는 수성 용액에 있는 나트륨 이온의 활성도이고, [Na+]는 이른바 막 상의 상 경계에서 나트륨 이온의 유리 농도이고, E0은 물에서 막 상으로 나트륨의 이동 자유 에너지를 표시한다. 용어 R 및 T는 각각 기체 상수 및 절대 온도이다. 시료에 프로타민(또는 다른 다중양이온)이 없으면, 그리고 이온쌍을 무시하면, 막 상에서의 나트륨 이온의 농도는 친유성 양이온-교환체인 RT의 총 농도에 의해 결정되는데, 이는 반응식 2에 따라 산출될 수 있다.
Figure 112008008720830-PCT00004
그 결과, 상기 막은 이온-교환체를 주원료로 하는 나트륨 전극과 유사하게 행동하고, 네른스트 반응 기울기가 예상된다.
만일 수성 용액에 프로타민이 존재한다면, 프로타민 양이온의 강한 플럭스가표면 및 막 상 모두에서 발생하여, 두 개의 정체된 확산 층을 형성한다. 수성 상의 정체된 층에서의 확산은 속도-제한 단계이기 때문에, 준-정상-상태(quasi-steady-state) 확산은 계면에서 관찰될 수 있다. 프로타민 양이온은 막 상 경계의 나트륨 양이온과 치환된다. 이러한 이온-교환 프로세스는 막 상에서의 나트륨 이온의 농도를 감소시키고, 반응식 1에서 산출된 것과 같은, 관찰된 전위를 증가시킨다. 관찰된 전위의 이러한 증가는, 시스템에서 양이온의 총 농도가 반응식 3으로 기재된 바와 같이 전기중성 조건을 만족시켜야 하기 때문으로 설명될 수 있다.
Figure 112008008720830-PCT00005
여기서 [PAz +]pb는 막 상 경계에서 전하 z를 가진 프로타민의 농도이다. 그 농도는 반응식 4에 따라 산출된 준-정상-상태(pseudo-steady-state) 플럭스 고려를 기준으로, 프로타민 벌크 농도의 함수로서 얻어질 수 있다.
Figure 112008008720830-PCT00006
여기서 Dm, Daq,δm, 및 δaq는 각각 막 상에서 프로타민의 확산 계수, 수성 용액에서 프로타민의 확산 계수 및 최종 확산 층 두께이다. 반응식 4는 반응식 3 및 반응식 1에 삽입되어, 낮은 농도에서의 프로타민 반응을 얻을 수 있다. 최종 반응식 5는 아래에 제공된다.
Figure 112008008720830-PCT00007
위와 같은 계산에서 결정될 수 있는 것처럼, 만일 aNa가 고정값을 가지면, 막의 상 경계 전위는 프로타민에 대한 직접 반응을 나타낸다. 따라서 높은 프로타민 농도에서, 나트륨 이온은 막으로부터 양적으로 교환되고, 프로타민에 대한 거의-네른스트식의 반응 기울기가 예상된다. 그러한 양적 교환은 또한 희석된 프로타민 용액이 발생시키는 반면에, 오랜 노출(24시간)을 필요로 한다. 최종 반응 기울기는 너무 작아서 분석적으로는 유용하지 않다.
그러한 자발적인 이온 추출 센서는, 오래 사용할 때 신호 드리프트 및 대부분의 센서에 대해 단일 사용으로 한정과 같은, 앞서 기술된 문제를 지닌다. 따라서 본 발명 이전에는, 연속 사용을 허용하는 센서를 재조정하는 쉽고, 확실한 방법이 없었다.
이온-추출 프로세스에서 자발적인 이온 교환에 의존하는 앞에서 기술된 수동 전위차 센서와는 대조적으로, 본 발명은 일정한 전류 펄스를 인가함으로써 이온 추출을 전기화학적으로 유도한다. 자발적인 추출을 방지하기 위해, 막은, 일반적으로 식 R+R-에 따라 정의될 수 있고 고유의 이온 교환 특성을 갖지 않는, 높은 친유성의 전해질을 포함한다. 이러한 경우, 막 벌크에서 프로타민 또는 나트륨 양이온의 초기 농도가 0인 것으로 가정된다. 인가된 음극 전류(i)는 막 상의 방향으로 양이온(J)의 네트 플럭스를 유도한다. 최종 반응식을 간략화하기 위해, 단지 나트륨 및 프로타민 이온이 막 상으로 추출될 수 있는 것으로 가정할 수 있다. 따라서, 전류(i)와 나트륨(JNa) 및 프로타민(JPA)의 플럭스 사이의 관계는 반응식 6에 따라 산출될 수 있다.
Figure 112008008720830-PCT00008
여기서 A는 노출된 막 영역이다. 간략화를 위해 선형 농도 그래디언트(gradients)를 가정하고 막 벌크에서 나트륨 농도가 0인 것으로 생각하면, 나트륨 플럭스는, 다음의 반응식 7과 같이, 유기 상 경계에 걸친 농도 그래디언트에 관련될 수 있다.
Figure 112008008720830-PCT00009
만일 프로타민이 존재하지 않는다면, 반응식 6 및 반응식 7은 반응식 1에 삽입되어, 아래 나타낸 반응식 8을 제공할 수 있다.
Figure 112008008720830-PCT00010
나트륨 이온의 막 벌크 보이드(void)를 유지하기 위해 전위차 분리 펄스가 후속되는, 고정 지속 시간 및 크기의 음극 전류 펄스는 거의 네른스트식의 전극 기울기를 제공한다. 만일 시료 용액에 프로타민이 존재하는 경우, 프로타민은 추출 단계에서 나트륨 이온과 효과적으로 경쟁한다. 반응식 6은, 다음의 반응식 9와 같이, 반응식 7과 유사하게 다시 기술될 수 있다.
Figure 112008008720830-PCT00011
인가된 전류가, 단지 다중양이온 확산에 의해 유지될 수 있는 플럭스보다 항상 더 큰 플럭스를 주는 것으로 가정하면, 반응식 4는 여전히 유효하고 반응식 9에 삽입될 수 있다. 결론적으로, 나트륨 플럭스인 JNa가 감소되고, 이는 반응식 1에 따 라 전위를 증가시킨다. 반응식 4를 반응식 9에 삽입하고, [Na+]pb을 구하고, 반응식 1에 치환하여, 저농도의 다중이온에서 예상된 프로타민 반응을 산출하는, 반응식 10이 아래에 제공된다.
Figure 112008008720830-PCT00012
반응식 10과 종래 기술로 알려진 전위차 센서에 대한 반응식 5에 나타낸 프로타민 반응 사이에는 차이점이 있다. 중요하게는, 막 상의 확산 층 두께가 갈바노스탯적으로 지시되고, 펄스 사이의 포텐셔스탯 막의 재생은 펄스로부터 펄스로의 반복 가능한 δm값을 보장한다. 본 발명에 제공된 실시예는 주로 최대 전위 범위를 제공하기 위해 선택된 전류를 사용하지만, 본 발명은 이에 제한되지 않는다. 따라서, 인가된 전류 펄스의 크기가 다중이온 반응에 대한 측정 범위를 조절하기 위해 사용될 수 있다. 이온-교환체가 아닌 인가된 전류가 펄스 크로노전위차 제어된 막으로 나트륨 이온의 추출을 지시하기 때문에, 막 상에서의 확산 계수는 프로타민 반응 범위에 영향을 주지 않는다. 이것은, 프로타민에 의한 나트륨의 경쟁적인 추출과 막 확산 계수 사이의 직접적인 의존성이 존재하는 것으로 알려지는, 반응식 5 에 의해 결정되는 종래 기술 전위차 센서와는 대조적이다.
위의 배경 이론으로 인해, 지금부터 본 발명에 의해 제공되는 이점을 쉽게 알 수 있다. 특히, 본 발명은 전기화학 셀에서 사용하기 위한 다중이온-선택성 막을 제공한다. 게다가, 다중이온-선택성 막은 전기화학 셀 전극의 일체 부분일 수 있다. 다중이온-선택성 막 및 막 전극은 시료 용액에 있는 다중이온 종의 농도를 측정하는 가역 가능한 방법에 사용될 수 있다.
본 발명의 다중이온-선택성 막은 친유성 양이온 성분과 친유성 음이온 성분을 갖는 친유성 전해질을 포함하는 것을 특징으로 하는데, 여기서 친유성 음이온 성분과 친유성 양이온 성분 중 적어도 하나는 특정 다중이온에 대해 선택성을 갖는다. 친유성이라는 용어는 일반적으로 지방에 친화적이며 높은 지방 용해성을 가진 종을 기술하는 것으로 주지된다. 친유성은 물과 섞이지 않는 유기물 사이의 특정 종의 분할(partitioning) 평행을 기술하는 물리화학적 특성이다. 친유성은 또한 수성 상이 또한 존재하는 경우, 지질 상에서 용해되는 종의 능력으로 기술될 수 있다. 이러한 관계(즉, 분할 계수)는 두 개의 상에 있는 종의 농도의 평형 상수로서 정의될 수 있다. 비교의 기준은 일반적으로 1-옥탄올/물 분할 계수이다. 분할 계수는 아래 나타낸 반응식(11)에 따라 측정될 수 있다.
Figure 112008008720830-PCT00013
반응식(11)에 따르면, 높은 친유성을 나타내는 분자는 물보다는 지질에서의 용해가 바람직하게 나타나는 것으로 예측될 것이다.
친유성을 결정하기 위한 하나의 기능 테스트는 50%의 물과 50%의 지질(1-옥탄올과 같은)의 혼합물을 유지하는 용기에 테스트될 화합물을 위치시키는 것이다. 해당 화합물이 용기에 위치될 수 있고, 두 개의 상 모두에 화합물을 분산을 강요하는 혼합하는 힘이 가해질 수 있다. 그런 다음 용기는 화합물이 상 사이에서 농도 평형을 이루도록 그대로 놔두어 질 수 있다. 그런 다음 각각의 상에 있는 화합물의 농도가 측정될 수 있으며, 농도는 친유성을 결정하는 반응식(11)에 사용될 수 있다.
또한 컴퓨터 소프트웨어가 종의 친유성을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 친유성을 결정하는 컴퓨터 프로그램의 한 가지 예는 http://146.107.217.178/lab/alogps에서 온라인 상에서 구할 수 있는 ALOGPS 프로그램이다. 친유성을 둘러싸는 원리는 Bakker, E. 및 Pretsch, E., "Lipophilicity of tetraphenylborate derivatives as anionic sites in neutral carrier-based solvent polymeric membranes and the lifetime of corresponding ion-selective electrochemical and optical sensors" Analytica Chimica Aeta, 1995, 309, 7-17에 기재되어 있으며, 이 문헌은 전체가 본 명세서에 참조문헌으로서 병합되어 있다.
일반적으로, 계산된 P값이 100,000보다 큰 화합물은 매우 친유성인 것으로 고려되어서 본 발명에 따라 유용하다. 그러나 일반적으로 훨씬 높은 P값을 갖는 화 합물의 사용은 수명이 증가된 센서를 초래할 것으로 예측될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라 사용되는 친유성 화합물의 P값은 100,000 초과, 보다 바람직하게는 1,000,000 초과, 가장 바람직하게는 10,000,000 초과이다.
종래 기술로 알려진 다중이온-선택성 막은 친유성 전해질과 친수성 카운터 양이온(즉, R-Na+)을 포함한다. 본 발명에 따르면, 친수성 카운터 이온은 친유성 카운터 이온에 의해 교체된다. 따라서, 본 발명의 다중이온-선택성 막은 친유성 양이온 성분과 친유성 음이온 성분(즉, R-R+)을 갖는 친유성 전해질을 포함한다. 두 개의 친유성 전해질을 사용함으로써, 친유성 카운터 이온은 시료에서 측정되는 다중이온 종과 더 이상 자발적으로 교환을 할 수 없다. 바람직하게는, 친유성 음이온 성분과 친유성 양이온 성분 중 하나는 특정 다중이온에 대해 선택성을 갖고, 그 다중이온의 감지를 용이하게 한다. 감지가 요구되는 특정 다중이온의 예는 프로타민, 헤파린, 부식산, carrageenans, 디옥시리보핵산, 리보핵산, 및 다른 다중이온 고분자를 포함하지만, 이제 한정되지 않는다.
본 발명의 일실시예에서, 친유성 전해질의 친유성 음이온 성분은 프로타민에 대해 선택성을 갖는다. 친유성 음이온 성분의 프로타민 선택성은 음이온의 작용기에 의존한다. 프로타민은 염기성 구아니디늄기(즉, 아르기닌 잔여물)를 포함한다. 따라서, 프로타민에 대한 선택성을 갖도록, 친유성 음이온은 프로타민의 구아닌기와 이온 쌍을 형성할 수 있는 작용기를 포함해야 한다. 바람직한 실시예에서, 카르복실기(COOH), 술포닐기(SO3H), 또는 술푸릴기(OSO3H)를 갖는 친유성 음이온이 프로 타민 선택성을 위해 사용된다. 특히 바람직한 실시예에서, 친유성 전해질의 친유성 음이온 성분은 1,3-디노닐나프탈렌-4-술폰산염, 2,6-디노닐나프탈렌-4-술폰산염, 도데실벤젠술폰산염, 및 3,9-디에틸-6-트리데실황산염으로 구성된 기로부터 선택된다. 이러한 화합물의 화학식은 아래에 도시된다.
Figure 112008008720830-PCT00014
위에 기재된 바와 같이, 기존의 막 전해질 물질의 친수성 카운터 이온은 제 2 친유성 전해질로 대체될 때, 시료로부터 다중이온-선택성 막으로의 이온의 자발적인 추출이 예방된다. 일반적으로, 친수성 카운터 이온은 나트륨인데, 이유는 나트륨이 시료 용액에서 가장 풍부하게 존재하는 카운터 이온이기 때문이다. 나트륨 이온은 화학적 합성에 의해 친유성 카운터 이온으로 대체된다. 다중이온-선택성 음 이온이 프로타민에 대해 선택성을 갖는 경우, 길이가 약 4 내지 약 16인 알킬 잔가지 사슬을 구비한 임의의 친유성 4차 암모늄 양이온이 적절한 카운터 이온이 될 것이다.
바람직한 실시예에서, 프로파인 선택성 친유성 음이온과 쌍을 이룬 친수성 카운터 이온은 테트라도데실암모늄, 트리도데실메틸암모늄, 및 도데실트리메틸암모늄으로 구성된 그룹으로부터 선택된 양이온이다. 이러한 양이온의 화학식은 아래에 도시된다.
Figure 112008008720830-PCT00015
친유성 이온의 상기 기재에 따르면, 시료 용액의 자발적인 이온 교환을 억제하기 위해, 프로타민에 대해 선택성을 갖는 친유성 음이온과 친유성 카운터 양이온의 조합을 선택하는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명에 따른 사용을 위한 프로타민-선택성 친유성 전해질은 앞서 제공된 프로타민-선택성 음이온과 카운터 양이온의 임의의 가능한 조합으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 용액으로부터 프로타민을 선택적으로 추출하기 위해 사용하는 친유성 전해질은 테트라도데실암모늄 1,3-디노닐나프탈렌-4-술폰산염(TDDA-DNNS)이다.
본 발명에 따른 또 다른 실시예에서, 친유성 전해질은 헤파린에 대해 선택성을 갖는 친유성 양이온 성분을 포함한다. 양이온 성분의 헤파린 선택성은 화합물의 작용기에 의존한다. 헤파린은 술포닐기와 카르복실기를 포함한다. 따라서, 헤파린에 대해 선택성을 갖도록, 적합한 양이온은 헤파린의 술포닐기와 카르복실기와 이온 쌍을 형성할 수 있는 하나 이상의 기를 포함해야 한다. 특히 헤파린 선택성을 제공하는데 유용한 것은 구아니디늄기이다. 게다가, 시료로부터(본 발명에 따른 막과 같은) 유기물 감지 상으로 추출된 헤파린은 긴 지방족 가지 사슬 또는 이웃하는 양이온의 방향족 고리를 통해 쌓아 올림으로써 안정화된다. 따라서, 높은 친유성을 지닌 양이온은, 약 4 내지 약 18개의 사슬 길이의 탄소 원자 및/또는 적합한 방향족 작용기를 갖는, 지방족 사슬에 하나 이상의 구아니디늄기를 부착함으로써 제조될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 친유성 전해질의 친유성 양이온 성분은 도데실구아니디늄 및 N,N'-1,10-데칸디일비스(구아니디늄)으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 이러한 양이온을 위한 화학식은 아래에 도시된다.
Figure 112008008720830-PCT00016
또한, 친수성 카운터 이온이 제 2 친유성 전해질로 대체되는 경우, 시료로부터 이온의 자발적인 추출이 예방된다. 일반적으로, 테스트 용액에서 가장 풍부한 음이온인 염소는 친유성 음이온과 화학적 합성을 통해 대체된다. 이러한 실시예에 따른 카운터 이온으로서 유용한 음이온의 한 가지 그룹은, 아래 제공되는 3개의 붕산염과 같은 테트라페닐붕산염 유도체이다.
Figure 112008008720830-PCT00017
음이온의 또 다른 적합한 그룹은 친유성(퍼할로겐화된 또는 알킬화된) 도데카카보네이트이다. 도데카카보네이트는 완전히 치환되지 않은 형태인 화학식 CB11H12인, 20면체(icosahedral) 카보란 음이온을 주성분으로 한다. 1-H-CB11Cl11, 1-H- CB11Br11, 및 1-H-CB11I11과 같은 할로겐화 도데카카보란은 본 발명에 따라 특히 유용하고 Peper, S.등의 "Ion-pairing Ability, Chemical Stability, and Selectivity Behavior of Halogenated Dodecacarborane Cation Exchangers in Neutral Carrier-Based Ion-Selective Electrodes," Analytical Chemistry,(2003)75(9),2131-2139에 보다 자세하게 기술되어 있으며, 이 문헌은 전체가 본 명세서에 참조문헌으로 병합되어 있다. 또한 본 발명에 따라 유용한 것은 알킬화 도데카카보란으로, 여기서 앞서 기재된 할로겐기는 다양한 알킬기로 치환된다. 바람직한 실시예에서, 헤파린-선택성 친유성 양이온과 한 쌍이 된 친유성 카운터 이온은 테트라키스(p-클로로페닐)붕산염 음이온이다.
친유성 이온에 관한 앞선 기술에 따르면, 시료 용액과의 자발적인 이온 교환을 억제하기 위해, 헤파린에 대해 선택성을 갖는 친유성 양이온과 친유성 카운터 이온의 조합을 선택하는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 헤파린-선택성 친유성 전해질은 앞서 제공된 헤파린-선택성 양이온 및 카운터 음이온의 가능한 조합 중 어떤 것으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 일실시예에 따르면, 용액으로부터 헤파린을 선택적으로 추출하는데 사용하는 친유성 전해질은 도데실구아니디늄 테트라키스(p-클로로페닐)붕산염(DDG-TCIPB)이다.
앞서 윤곽이 그려진 원리를 사용하면, 프로타민 또는 헤파린을 제외한 특정 다중이온에 대해 선택성을 갖는, 친유성 양이온 또는 친유성 음이온 성분을 갖는 친유성 전해질을 결정하는 것을 가능하게 해준다. 따라서, 그러한 친유성 전해질과 결합하는 막 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명에 따른 막에 존재하는 친유성 전해질의 양은 막의 물리적 특성에 의존하여 변할 수 있으며, 이는 막에서의 염의 용해성을 제한할 수 있다. 바람직하게는, 친유성 전해질이 막의 총 중량을 기준으로 약 1 내지 약 15중량%로 존재한다. 보다 바람직하게는, 친유성 전해질이 막의 총 중량을 기준으로 약 5 내지 약 12로 존재한다. 바람직한 일실시예에서, 친유성 전해질은 막의 총 중량을 기준으로 약 10중량%로 존재한다.
친유성 전해질 이외에도, 본 발명에 따른 막은 하나 이상의 가소체를 더 포함한다. 가소체는 혼합 균질성을 용이하게 하고 또한 시료 용액으로부터 막의 표면과 막의 벌크로 다중이온의 플럭스의 제어를 돕는다. 다양한 가소체는 본 발명의 막에 사용될 수 있으며, 2-니트로페닐 옥틸 에테르, 디옥틸 프탈산염, 디옥틸 sebacate, 디옥틸 아디프산염, 디부틸 sebacate, 디부틸 프탈산염, 1-데칸올, 5-페닐-1-펜탄올, 테트라운데실 벤즈하이드롤 3,3',4,4'-테트라카르복시산염, 벤질 에테르, 디옥틸페닐 인산염, 트리스(2-에틸헥실)인산염, 및 2-니트로페닐 옥틸 에테르로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 가소체를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명에 따른 바람직한 실시예에서, 막에 사용된 가소체는 2-니트로페닐 옥틸 에테르(NPOE)이다.
본 발명의 막은 친유성 전해질과 가소체에 더하여 막의 벌크 형성 재료로 작용하는 기판 재료를 추가로 포함하는 것이 일반적으로 바람직하다. 침투성 막을 형성하는데 사용하기 위한 다중 기판은 종래 기술의 다중 기판으로, 본 발명은 그러 한 모든 기판을 포함하는 것으로 의도된다.
일실시예에서, 기판 재료는 중합체 필름-형성 물질이다. 이러한 실시예에 따른 중합체 필름-형성 물질은 친유성 전해질과 가소체와 화학적으로 조화되는 임의의 중합체 물질일 수 있다. 게다가, 중합체 물질은 예를 들어 용매 주조를 통해, 필름으로 형성될 수 있어야 한다. 본 발명에 따른 유용한 중합체 물질은 염화 폴리비닐, 폴리우레탄, 셀룰로오스 트리아세테이트, 폴리비닐 알코올, 실리콘 고무, 및 이들의 공중합체 및 삼중합체를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 바람직한 일실시예에서, 중합체 필름-형성 물질은 염화 폴리비닐이다.
본 발명의 일실시예에서, 다중이온-선택성 막은 약 1 내지 약 15중량%의 양으로 친유성 전해질을 포함한다. 이러한 실시예에 따른 막은 약 28 내지 약 49.5중량%의 중합체 필름-형성 물질과 약 42.5 내지 약 66중량%의 가소체를 추가로 포함한다(모든 중량은 막의 총 중량을 기준으로 함). 바람직하게는, 중합체 필름-형성 물질 및 가소체는 중량비로 약 1:1 내지 약 1:2의 비로 존재한다.
바람직한 실시예에서, 다중이온-선택성 막은 약 10중량%의 테트라도데실암모늄 1,3-디노닐나프탈렌-4-술폰산염, 약 30중량%의 염화 폴리비닐, 및 약 60중량%의 2-니트로페닐 옥틸 에테르를 포함한다(모든 중량은 막의 총 중량을 기준으로 함).
앞의 실시예 중 하나에 따른 다중이온-선택성 막은, 테트라하이드로퓨란(THF)과 같은 유기 용매로 용매 주조하여 제조되어, 박막(thin film)에 주조되기에 적합하게 될 수 있다. 바람직하게는, 중합체 필름-형성 물질, 가소체, 및 친유성 전해질이 용매에서 균질한 용액으로서 제조된다. 용액은 그런 다음 박막에 주조 될 수 있다. 일단 박막으로서 제조되면, 이후에 다중이온 센서에서 사용하기 위해, 막은 임의의 특정 크기로 절단될 수 있다. 박막으로 형성되기보다는, 막 용액이 전극과 같은 기판에 도포될 수 있으며, 전극 상에서 건조되는 것이 허용되고, 이로 인해 전극 상에 직접 막을 형성할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 친유성 음이온 성분과 친유성 양이온 성분 중 적어도 하나는 중합체 막-형성 물질의 백본(backbone) 구조에 공유 결합될 수 있다. 예를 들어, 음이온 성분은 비닐기 결합 또는 일부 다른 적합한 형태의 화학적 반응을 통한 공중합화를 통해 중합체에 부착될 수 있다. 게다가, 중합체 구조에 부착 가능한 친유성 양이온 또는 음이온 성분은 다중이온-선택성 성분 또는 카운터 성분이 될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 기판 재료는 미세다공성 소수성 기판이다. 이러한 실시예에 따르면, 가소체 및 친유성 전해질이 혼합물로 형성되고, 그런 다음 미세다공성 소수성 기판상에 분산되는데, 여기서 가소체와 친유성 전해질의 혼합물은 기판의 구멍에 채워지고 경화를 허용한다. 가소체와 친유성 전해질이 분산된 미세다공성 소수성 기판은 그런 다음 다중이온 센서에서의 사용을 위해 처리될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따른 미세다공성 소수성 기판은 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 불화 폴리비닐리덴, 폴리카보네이트, 폴리테트라플루오로에틸렌, 아크릴 공중합체, 폴리에테르 술폰, 및 이들의 공중합체 및 삼중합체로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 일실시예에 따르면, 미세다공성 소수성 기판은 폴리에틸렌이다.특히 바람직한 미세다공성 소수성 기판은, Charlotte, N.C. Celgard사 로부터 판매되는 Celgard®막으로, Celgard®막은 폴리에틸렌을 주성분으로 하는 막으로 편평한 시트 막 및 속이 빈 섬유 막으로서 이용 가능하다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 다중이온-선택성 막은, 친유성 양이온 성분과 친유성 음이온 성분을 포함하는 약 1 내지 약 15중량%의 친유성 전해질, 및 약 85 내지 약 99중량%의 가소체를 포함하는 혼합물과 접하게 되는 미세다공성 소수성 기판을 포함한다(중량은 혼합물의 총 중량을 기본으로 함).
본 발명은 추가로 전기화학 셀에 유용한 다중이온-선택성 막 전극을 제공한다. 본 발명의 일실시예에서, 다중이온-선택성 막 전극은 하우징, 하우징 내에 포함된 기준 용액, 및 하우징 내에 상기 전극이 기준 용액과 접하게 되도록 작동 가능하게 위치된 전극을 포함한다. 게다가, 이러한 실시예에 따르면, 다중이온-선택성 막은 하우징의 일단부에 위치된다. 막은 하우징 내의 기준 용액과 접하고, 막은 하우징 외부에 있는 시료 용액과 접하도록 작동 가능하게 위치된다. 앞서 지적한 바와 같이, 막은, 친유성 양이온 성분과 친유성 음이온 성분을 가지며, 여기서 친유성 음이온과 친유성 양이온 성분 중 적어도 하나가 특정 다중이온에 대해 선택성이 있는, 친유성 전해질을 포함한다.
임의의 표준 전극이, 전극이 앞서 기술된 바와 같이 다중이온-선택성 막에 결합하는 것이 가능한 한, 본 발명의 이러한 실시예에 따라 사용될 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 실시예에서, 막 전극은, Philips electrode body(IS-561, Glasblserei Moller, Zurich, Switzerland)와 같은, 표준 전극에 결합된 다중이온-선택성 막을 포함한다.
전극 하우징에 사용된 기준 전극은 일반적으로 당업자에게 유용한 것으로 알려진 임의의 전해액일 수 있다. 바람직한 일실시예에서, 전해액은 염화 나트륨 용액, 특히 1M의 NaCl 용액이다. 더욱이, 전극 그 자체는 전위 및 전류 값이 아래에 기재되는 것과 같은 전기화학 셀에서 사용 가능한 임의의 유형의 전극일 수 있다. 특히 유용한 것은 Ag/AgCl 전극이다.
바람직한 일실시예에 따른, 막 전극에 결합되는 다중이온-선택성 막은 프로타민에 대해 선택성이 있다. 바람직하게는, 이러한 실시예에 따르면, 다중이온-선택성 막에 사용되는 친유성 전해질이 TDDA-DNNS이다.
막 전극으로 사용되는 경우, 바람직하게는 다중이온-선택성 막의 표면적이 약 10㎟ 내지 약 100㎟이다. 보다 바람직하게는 표면적이 약 20㎟ 내지 약 50㎟이다. 그러한 표면적을 달성하기 위해, 상기 기술된 바와 같은 박막이 제조될 수 있으며, 상기 박막은, 전극과의 결합을 위해, 예를 들어 코크 보러(cork borer)를 사용해서, 원하는 크기로 절단된다. 더 바람직하게는, 다중이온-선택성 막의 평균 두께는 약 10㎛ 내지 약 1000㎛, 보다 바람직하게는 약 20㎛ 내지 약 300㎛이다.
본 발명은 추가로 전기화학 셀 장치에 관한 것이다. 일실시예에서, 전기화학 셀 장치는 앞서 기술된 바와 같은 다중이온-선택성 막 전극, 상기 막 전극에 전기적으로 연결된 기준 전극, 및 상기 막 전극 및 상기 기준 전극에 작동 가능하게 연결된 전기화학 장치를 포함한다.
본 발명에 따른 전기화학 셀 장치의 일실시예는 도 1에 제공되며, 도 1은 시료에 있는 다중이온 종의 측정에 유용한 전기화학 셀 장치(5)를 도시한다. 도 1은 다중이온-선택성 막 전극(10), 기준 전극(30), 및 시료 용액(65)이 위치되어 있는 테스트를 위한 시료 용기(60)에 작동 가능하게 위치된 기준 전극(50)을 도시한다. 막 전극(10)은 전극 하우징(15), 기준 용액(17), 및 기준 전극 와이어(21)를 포함한다. 본 발명에 따른 다중이온-선택성 막(25)이 전극 하우징(15)의 일단부에 위치된다. 도 1에 도시된 바와 같이, 기준 전극(30)은 이중-접합 전극이고, 다른 종류의 기준 전극일지라도 본 발명을 벗어나지 않으면서 사용될 수 있다. 기준 전극(30)은 외부 하우징(33), 내부 하우징(36), 외부 하우징 기준 용액(39), 내부 하우징 기준 용액(41), 및 기준 전극 와이어(43)를 포함한다.
도 1에 도시된 바와 같이, 다중이온-선택성 막 전극(10), 기준 전극(30), 및 기준 전극(50), 카운터 전극(50)은 각각 전기화학적 기구(75)에 작동 가능하게 연결되고, 추가적으로 제어 장치(90)와 통신한다. 상기 전기화학적 기구(75)는 바람직하게는 갈바노스탯-포텐셔스탯(galvanostat-potentiostat)이다. 따라서 상기 전기화학적 기구는 미리 설정된 값으로 전기화학적 셀을 통해 전류를 제어하는 것이 가능하고, 또한 작업 전극{예를 들어 다중이온-선택성 막 전극(10)}과 기준 전극(30) 사이의 전위를 미리 설정된 값으로 제어하는 것이 가능하다. 전위를 제어하는 기능을 수행함에 있어서, 상기 전기화학적 기구(75)는, 원하는 전위를 유지하기 위해 작업 전극{예를 들어 다중이온-선택성 막 전극(10)}과 카운터 전극(50) 사이에 필요한 어떤 전류라도 가하는 것이 가능하다. 바람직한 일실시예에서, 상기 전기화학적 기구(75)는 Pine Instruments(펜실베니아 그로브 시티)로부터 얻을 수 있는 AFCBPI Bipotentiostat과 같은 바이포텐셔스탯이다.
도 1에 도시된 바와 같이, 제어 장치(90)는 바람직하게는, 전류, 전위, 또는 전기화학적으로 바람직한 활성을 제어하는 동안 전기화학적 기구(75)의 기능을 자동적으로 조절하도록 설계된 알고니즘을 수행하는 것이 가능한 컴퓨터이다. 상기 제어 장치(90)는 바람직하게는 또한 전기화학적 기구(75)로부터 데이터를 수집하고, 상기 데이터를 사용자에게 시각적으로 표시하고/표시하거나 데이터를 저장하는 것이 가능하다. 물론, 도 1의 전기화학적 기구(75) 및 제어 장치(90)는 모두 전원(도시되지 않음)에 연결될 것이다.
본 발명은 추가로 시료 용액에 있는 다중이온 종의 농도를 측정하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 일반적으로 다음의 단계를 포함한다 : a) 다중이온 종 및 바탕(background) 전해질을 포함하는 시료 용액을 제공하는 단계; b) 친유성 양이온 성분 및 친유성 음이온 성분을 갖는 친유성 전해질을 포함하는 막을 가진 다중이온-선택성 막 전극과 상기 시료 용액을 접하는 단계로서, 여기서 친유성 음이온 및 친유성 양이온 중 적어도 하나는 다중이온 종에 대해 선택성을 갖는, 다중이온-선택성 막 전극과 상기 시료 용액을 접하는 단계; c) 기준 전극과 상기 시료 용액을 접하는 단계로서, 상기 다중이온-선택성 막 전극 및 기준 전극이 전기적으로 연결되어 있는, 기준 전극과 상기 시료 용액을 접하는 단계; d) 다중이온-선택성 막 전극 및 시료 용액을 포함하는 회로에, 고정 지속 시간의 외부 전류 펄스를 인가하여, 다중이온 종을 시료 용액으로부터 막으로 이동시키는 단계; e) 다중이온-선택성 막 전극과 기준 전극 사이의 전류 펄스 동안 전위차 반응을 측정하는 단계; 및 f) 전위차 반응의 함수로서 다중이온 종의 농도를 산출하는 단계.
고정 지속 시간의 외부 전류 펄스는 바람직하게는 약 0.1초 내지 약 2초의 지속 시간 동안 인가된다. 일반적으로 인가된 전류 펄스의 전체 지속 시간 동안 전위차 반응을 측정할 필요는 없다. 오히려, 인가된 외부 전류 펄스의 지속 시간의 일부 동안만 전위차 반응을 측정하는 것이 바람직하다. 특히 바람직한 실시예에서, 전위차 반응은 외부 전류 펄스의 고정 지속 시간의 마지막 약 100밀리세컨드 동안의 측정된다.
상기 방법으로 측정된 전위 값은 시료에 있는 다중이온의 종류에 의존한다. 예를 들어, 프로타민과 같은 양이온이 존재하는 경우, 셀에 음극 전류{음(negative)}가 인가된다. 상기 전류가 인가되는 경우, 측정된 전위는 보다 더 음이 된다. 헤파린과 같은 음이온이 존재하는 경우, 셀에 양극 전류(양)가 인가된다. 상기 전류가 인가되면, 측정된 전위는 보다 양이 된다.
외부 전류가 인가되는 회로는 일반적으로 다중이온-선택성 막 전극 및 시료 이온을 포함하면서, 상기 회로는 또한 전기화학 셀의 하나 이상의 추가 성분을 포함할 것이다. 예를 들어, 본 발명에 따른 일실시예에서, 회로는 카운터 전극을 추가로 포함한다. 이러한 실시예는 종래적으로 "3-전극"전기화학 셀이라 지칭되는 전기화학 시스템을 포함한다. 더군다나, 또 다른 실시예에서, 상기 회로는 기준 전극을 추가로 포함한다. 이러한 실시예는 종래적으로 "2-전극" 전기화학 셀로 지칭되는 전기화학 시스템을 포함한다. 3-전극 시스템은 통상적으로, 그러한 전극에 외부 전류가 인가되는 경우 발생할 수 있는 기준 전극의 분해(degradation)를 막기 위해 바람직하다.
상기 방법으로 측정된 전위의 절대값은, 막에서의 확산 층 두께의 꾸준한 증가로 인해, 일반적으로 시간이 흐름에 따라 감소할 것으로 예상될 것이다. 전술한 바와 같이, 프로타민과 같은 다중 양이온의 존재에 대한 테스트를 하는 경우, 음극 전류가 인가되고 음전위가 관측된다. 프로타민(또는 또 다른 다중 양이온)이 시료에 존재하는 경우, 측정된 전위는, 다중 양이온이 존재하지 않는 경우보다 훨씬 더 양이다. 반대로, 다중 음이온의 존재에 대한 테스트를 하는 경우, 양극 전류가 인가되고 양전위가 관측된다. 헤파린(또는 또 다른 다중 음이온)이 시료에 존재하는 경우, 측정된 전위는, 다중 음이온이 존재하지 않는 경우보다 훨씬 더 음일 것으로 예상될 것이다. 두 가지의 경우에 있어서, 보다 양 또는 보다 음 전하로의 이동은 시료 용액으로부터 막으로의 다중이온 추출을 나타낸다. 충분한 시간 이후에는, 막에서의 다중이온의 축적으로 인해 측정이 실패하기 시작할 것이다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 막이 회복된다. 이러한 실시예에 따르면, 상기 방법은 다중이온-선택성 막 전극 및 기준 전극에 외부 전극 전위를 인가하여, 막으로부터 다중이온 종을 이동시키는 단계를 추가로 포함한다. 일단 막이 효과적으로 다중이온을 분리하면, 다중이온-선택성 막 전극이 시료 용액에 있는 다중이온의 측정을 위해 다시 사용될 수 있다. 계속적인, 다중이온 종의 역방향이 외부 전류 펄스, 후속적으로 외부 전위 펄스를 포함하는 펄스 시퀀스를 반복하여 인가함으로써 가능해진다.
막으로부터 다중이온을 분리하기 위해 인가된 외부 전극 전위는 베이스라인 전위인 것이 바람직하다. 베이스라인 전위의 값은 전기화학 셀의 대칭에 따라 달라 질 수 있다. 예를 들어, 일실시예에서, 막 전극 및 기준 전극은 동일한 전극을 사용하고, 시료 용액의 조성과 동일한 내부 기준 용액을 갖는다. 그러한 바람직한 실시예에서, 베이스라인 전위는 0V이다. 전극들이 여러 정도로 덜한 대칭성을 보이는, 추가 실시예도 또한 고려된다. 이러한 추가 실시예에서, 베이스라인 전위는 0V부터 다양할 것으로 예상될 수 있다. 최적의 베이스라인 전위는, 전기화학 도구(도 1을 참조)를 분리하고, 막 전극과 기준 전극 사이의 제로 전류 전위를 측정하기 위해 높은 임피던스 전압계로 이를 교체함으로써 결정될 수 있다.
막으로부터 다중이온을 효과적으로 분리하기 위해서, 외부 전위는 바람직하게는, 외부 전류 펄스의 고정된 지속 시간보다 약 10 내지 약 20 배 더 긴 시간의 기간 동안 인가된다.
본 발명의 추가 실시예는 다음의 실험적인 예시에 따라 보다 명백하게 기술된다.
본 발명의 또 다른 양상은, 트립신과 같은 효소 활성도에 대한 직접 관련성에 기초하여, 시료 용액에 있는 프로타민과 같은 다중이온을 검출하는 것이다. 효소 활성도는, 효소가 다중이온을 더 짧은 종으로 쪼갤 수 있는 경우 검출될 수 있는데, 이유는 이러한 짧은 종은 일반적으로 다중이온 센서에 의해 잘 검출되지 않기 때문이다. 본 발명에 개시된 것과 마찬가지인 전기화학 검출은, 투명하지 않고, 착색되고, 또는 흐린(turbid) 시료에서 효소 활성도를 모니터하기 위한 종래의 분광 광도(spectrophotometric) 방법보다 나은 이점을 갖는다.
본 발명의 이러한 양상의 일실시예는 프로타민과 함께 트립신을 사용하는 것 이다. 트립신은 염기성 아미노산 리신 및 아르기닌의 카르복실기 부분에서 단백질을 분해하는 효소이다. 프로타민은 아르기닌 잔여물이 풍부하기 때문에, 트립신은 이러한 접합에서 프로타민을 분해할 것이다. 프로타민 분해의 초기 속도는, 본 발명에 개시된 전기화학 장치 및 프로타민 센서를 사용하여 모니터한 경우, 트립신 활성도에 정비례하는 것으로 밝혀졌다. 시간의 함수로서 센서 신호인 전위의 변화 속도는 트립신에 의한 프로타민의 분해이다. 이러한 관계는 여러 가지의 다중이온 및 이들의 해당 효소로 연장될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예는 효소 활성도, 다중이온 농도, 및 효소 억제제 활성도의 모니터링에 재사용하기 위해, 막을 세척하기 위해 전위를 인가하는 것이다. 본 발명을 이용하여, 다른 생물학적 및 화학적 활성도가 모니터될 수 있다는 것에 주목해야 한다.
더욱이, 본 발명은 시료 용액에서 효소 억제제 활성을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 효소 억제제는 효소에 붙어서, 효소의 반응 속도를 효과적으로 줄여준다. 효소와 효소 억제제의 혼합물의 첨가에 따른 초기 전위 감소는 시료 용액에 포함된 효소 억제제의 농도에 의존한다.
본 발명의 이러한 양상의 일실시예는 효소 트립신 및 다음에 해당하는 효소 중 하나를 위한 것이다 : α1-안티프로테이나아제 억제제, α2-매크로글로불린, 아프로티닌, 및 콩 억제제.
본 발명의 또 다른 양상에서, 전위차 다중이온 센서티브 전극은 비-분리 면역 측정법에서의 용도를 찾아낼 수 있다. 면역 측정법은 분석시료를 검출하는 표시 자로서 라벨링된 다중이온 또는 관련된 효소를 사용하여, 항체에 대한 표시가 없는 분석시료 및 표시된 분석시료의 경쟁 비딩(bidding)을 통한 라벨 역할을 할 수 있다.
실험
본 발명은, 본 발명을 설명하기 위해 나타내지만 본 발명을 한정하지 않는 다음의 예에 의해 보다 자세하게 설명된다. 만일 다르게 나타내지 않는다면, 모든 백분율은 다중이온-선택성 막의 총 중량을 기준으로 하는 중량%를 나타낸다.
예 1
프로타민-선택성 막의 제조
전기화학 셀에서 사용될 본 발명에 따른 다중이온-선택성 막을 포함하는 센서의 능력이 테스트 되었다. 특히 다중양이온 프로타민에 대한 선택성을 가진, 다중양이온-선택성 막이 제조되었다. 상기 막은 10중량%의 TDDA-DNNS와 중량비 2:1의 2-니트로페닐 옥틸 에테르와 폴리비닐 클로라이드의 혼합물에서 제조되었다. 상기 막은 THF를 용매로서 용매 주조(casting)에 제조되었다. 상기 혼합물은 막으로 건조되도록 허용되었고, 약 200㎛ 두께의 프로타민-선택성 막이 제조되었다. 상기 막은, 전극에 결합될 막을 제조하기 위해, 6㎜의 직경을 갖는 콜크 보러(cork borer)로 절단되었다.
예 2
프로타민-선택성 막 전극의 제조
예 1에서 제조된 프로타민-선택성 막은 전극에 결합되었다. 상기 전극은 Philips electrode body(IS-561), 0.1M NaCl의 내부 기준 용액, 및 Ag/AgCl의 전극 도선을 포함했다. 상기 프로타민-선택성 막 전극은, 상기 내부 기준 용액과 동일한 용액에서의 실험적 사용 이전에, 밤새 조절되었다.
앞서 기술한 바와 같이, 10개의 동일한 전극의 한 세트가 제조되었고, 실제 실험 사용에 앞서 0.1M NaCl 용액에서 일관성을 테스트했다. 테스트 결과 0 내지 -10㎂의 범위로 주어진 전류에서 +/-7mV의 내부-전극 변이를 보여줬다.
막 전극은 또한 가역성을 측정하기 위해 테스트 되었다. 상기 막은 두 개의 분리된 용액, 즉 하나는 0.1M의 NaCl을 포함하고, 그리고 다른 하나는 0.1M NaCl과 10㎎/L의 프로타민을 포함하는 용액에 각각 노출되었다. 또한 종래 기술의 이온-선택성 전극을 사용하여 동일한 테스트가 수행되었다. 테스트 결과는 도 2에 나타냈으며, 여기서 본 발명의 프로타민-선택성 전극 막은 곡선 A에 나타내고, 종래 기술 전극은 곡선 B에 나타낸다. 두 개의 곡선에서 알 수 있는 것처럼, 프로타민이 존재하는 경우 더 높은 전위가 관측되었다. 곡선 A에서, 전위 측정은 +/-1mV의 변이로 재현되었다. 그러나 곡선 B에서는, 5개 정도로 적은 사이클 내에서 50mV보다 큰 변이를 보여준다.
예 3
프로타민의 유무에 따른 시료에 대한 크로노전위차 반응
프로타민이 있는 0.1M의 NaCl, 및 프로타민이 없는 0.1M의 NaCl에 있는 크로노포텐셔그램(chronopotentiogram)이 제조되었다. 도 1에 도시된 것과 같은 전기화학 셀은 예 2에 기재된 프로타민-선택성 막 전극을 사용하여 셋업되었다. 기준 전 극은 1M의 LiOAc 가교 전해질을 구비한 이중 접합 Ag/AgCl 전극이었다. 카운터 전극은 백금 도선이었다.
Macintosh computer의 PCI-MIO-16E4 인터페이스 보드 및 LabVIEW 5.0 Software(텍사스, 오스틴, National Instruments)에 의해 제어되는 AFCBP1 Bipotentiostat(펜실베니아, 그로브 시티, Pine Inst.)로 전압전류(voltammetric) 실험이 수행되었다. 실험에 앞서서, 바이포텐셔스탯의 제 1 전극(K1) 출력 장치(output)의 작업이 제 2 작업 전극(K2)의 출력 장치의 포텐셔스탯 제어를 가진 전류 제어로 스위칭된다. 전류 펄스를 인가하기 위하여, 작업 전극은 외부 소프트웨어에 의해 제어되는 아날로그 스위치를 통해 K1 출력 장치에 연결되었다. 전류 펄스 사이의 베이스라인 전위가 인가되는 경우, 작업 전극은 K2 출력 장치에 연결되었다.
크로노전위차(chronopotentiometric) 실험 동안, 각각 인가된 -3㎂(1초 동안)의 일정한 전류 펄스에 이어 0V(10초 동안)에서의 일정한 전위 펄스가 후속된다. 센서 반응을 나타낸, 샘플링(sampled) 전위는 각각의 전류 펄스의 마지막 100㎳ 동안의 평균값으로 획득된다. 모든 실험은 실험실의 주변 온도(21.5 ±0.5℃)에서 수행되었다. 신뢰구간은 95% 레벨에서 추정되었다.
실험은 두 개의 시료로 진행되었다. 제 1 시료는 단지 0.1M의 NaCl을 함유하는 반면에, 제 2 시료는 0.1M의 NaCl 및 농도가 10㎎/L인 프로타민(PA)을 함유했다. -3㎂로 인가된 음극 전류는 막으로의 프로타민의 추출을 초래하고, 프로타민이 있는 시료의 관찰된 전위는 프로타민이 없는 시료와 비교하여 크게 차이가 난다. 크로노전위차 실험에 대한 전류-시간 궤적(trace) 및 전위-시간 궤적은 도 3에서 제공된다.
예 4
증가된 레벨에서의, 프로타민 유무에 따른 크로노전위차 반응
예 2에서 제공된 것과 동일한 셋업(set up)을 사용하여, 프로타민이 있는 0.1M의 NaCl, 및 프로타민이 없는 0.1M의 NaCl에 있는 제 2 크로노포텐셔그램이 제조되었다. 크로노전위차 실험 동안, 각각 인가된 -2㎂(1초 동안)의 일정한 전류 펄스에 이어 0V(15초 동안)에서의 일정한 전위 펄스가 후속되었다. 센서 반응을 나타낸 샘플링 전위는 각각의 전류 펄스의 마지막 100㎳ 동안의 평균값으로서 획득되었다. 모든 실험은 실험실 주변 온도(21.5 ±0.5℃)에서 수행되었다. 신뢰구간은 95% 레벨에서 추정되었다.
실험은 역시 두 개의 시료로 진행되었다. 제 1 시료는 단지 0.1M의 NaCl을 함유하는 반면에, 제 2 시료는 0.1M의 NaCl 및 농도가 50㎎/L인 프로타민을 함유한다. -3㎂로 인가된 음극 전류는 막으로의 프로타민의 추출을 초래하고, 프로타민이 있는 시료의 관찰된 전위는 프로타민이 없는 시료와 비교하여 크게 차이가 난다. 크로노전위차 실험에 대한 전류-시간 궤적 및 전위-시간 궤적은 도 4에 제공된다.
포텐셔스탯 정지 펄스(potentiostatic resting pulse) 동안에, 막으로부터 이온의 역확산이 관찰될 수 있다. 이러한 확산은, 프로타민이 시료에 존재하는 경우, 나트륨과 프로타민 이온 사이의 확산 작용에서 차이를 나타내며, 더 느려진다. 전류가 15초의 전체 안정 펄스에 걸쳐서 적분되는 경우, 계산된 전하는 전류 펄스 동안에 인가된 전하의 90%에 해당한다.
예 5
본 발명의 프로타민-선택성 막 전극과 종래 기술의 다중이온-선택성 막을 비교하는, 프로타민에 대한 보정 곡선
연속적이고, 가역적인 프로타민의 검출은 도 3 및 도 4에 도시된 바와 같이 펄스 시퀀스를 반복적으로 인가함으로써, 그리고 각각의 전류 펄스의 단부에서의 전위를 샘플링함으로써 가능하게 된다. 따라서, 프로타민 보정 곡선을 얻는 것이 가능하다.
0.1M의 NaCl에서 프로타민 보정 곡선을 위한 시간 궤적은 예 3 및 4에서 앞서 기술된 방법을 사용하여 얻었다. 곡선은 예 2에 기재된 프로타민-선택성 막 전극 및 종래 기술 이온-선택성 전극을 사용하여 얻었다. 두 개의 곡선의 비교는 도 5에 제공되는데, 여기서 본 발명의 프로타민-선택성 막 전극을 사용하여 얻어진 곡선은 곡선 A에 나타내고, 종래 기술의 전극은 곡선 B에 나타낸다. 곡선 B에서 관찰되는 강한 전위 드리프트는 상기 막 측의 확산 층 두께의 나쁜 제어에 기인한다. 대수(logarithmic) 프로타민 농도(㎎/L)는 궤적에 나타낸다.
예 6
센서 반응에 대한 교반의 효과
종래 기술의 전위차 다중이온 센서에 대하여, 관찰된 전위는 시료 교반 속도에 크게 영향을 받아, 수성 확산 층 및 따라서 다중이온의 막으로의 플럭스를 변경하는 것으로 알려진다. 실제로, 최근 연구는 회전하는 전극 셋업에서 측정 범위와 회전 속도 사이의 명확한 관계를 확인했다. 갈바노스탯 펄스 실험에서 교반이 본 발명에 따른 다중이온-선택성 막 전극의 반응에 어떠한 영향을 줄 수 있는지를 조사하기 위해, 교반되지 않은 용액 및 100rpm의 교반 속도에서 전위가 측정되었다. 두 개의 비교는 도 6에서 제공된다.
시료 교반의 갑작스런 중단이 약 20mV의 전위 변화를 초래했던, 헤파린 반응성 막의 전위차 결과와는 대조적으로, 본 발명의 펄스 갈바노스탯 센서의 반응은 교반 속도에 크게 영향을 받지 않는 것으로 나타난다. 교반된 시료와 교반되지 않은 시료 사이의 전위차는 2-3Mv를 초과하지 않는다.
예 7
센서 반응에 대한 pH의 영향
비록 프로타민 센서가 생리학적 pH 7.4의 전체 혈액 내에서 작동하도록 의도되지만, 센서 반응에 대한 pH의 영향 또한 조사되었다. 도 7은 -2㎂의 음극 전류에서 관찰된 전위를 제공한다. 아래의 궤적은, 1M NaOH를 사용하여 pH가 조정된, 0.1M의 NaCl, 6.6mmol의 시트르산, 11mmol의 붕산, 및 10mmol의 인산을 포함하는 표준 용액(blank solution)에서 관찰된 전위이다. 위의 궤적은 시료에 25㎎/L의 프로타민이 더해진 동일한 용액에 대해 관찰된 전위이다. 프로타민의 높은 농도로 인해, 두 전위 사이의 차이는 0.1M의 NaCl에서 최대 센서 반응, 또는 전위 윈도우로서 고려될 수 있다.
예 8
막 선택성
막의 선택성은 나트륨, 칼륨, 칼슘 및 마그네슘의 클로라이드 염에 대한 분리된 보정 곡선을 기록함으로써 pH 7.4에서 결정되었다. 전위 대 염 농도의 로그의 곡선은 도 8에 제공된다. 최종 선택성 계수는 추가 이온투과 담체(ionophore) 없이 DNNS를 주성분으로 하는 ISE 막에 대해 사전에 기록된 계수와 우수하게 일치한다. 0.001M-0.1M의 농도 범위에서의 모든 기울기는, 일부 정도에서 선택성 계수를 바이어스하는, 약간 Nemstian을 넘어서는(70-72mV) 것으로 발견되었다. 기울기는, 아직은 단순화된 이론적 모델에서 고려되지 않은 네른스트-플랭크 식(Nernst-Plank equation)에 기초하여 막 계면에서 이온 이동의 기여에 의해서 마찬가지로 설명될 수 있다. 104M 주변에서의 갑작스런 전위 점프는 막 표면에서 소모 과정으로부터 기인한다. 더 높은 전위 리딩은 다른 테스트된 양이온 전부에 걸쳐서 프로타민에 대한 이러한 막의 강한 선호를 증명한다.
예 9
바탕 전해질 농도의 효과
반응 원리는 다중이온과 나트륨 이온 사이의 경쟁적인 추출에 근거하기 때문에, 바탕 전해질 농도는 프로타민 반응 곡선에 영향을 주는 것으로 예상된다. 낮은 나트륨 바탕 농도는, 예를 들어, 프로타민 반응에 대해 더 큰 전위 범위를 제공할 것으로 예상되고(식 10을 참조), 또한 더 낮은 프로타민 농도에 대한 반응의 시프트를 초래할 수 있다(식 10). 도 9a는 3개의 염화 나트륨 농도, 즉 10mM, 30mM, 및 100mM에서 실험적인 프로타민 보정 곡선을 도시한다. 프로타민 전위 범위는 NaCl 농도가 증가함에 따라 감소한다.
프로타민 반응에 대한 칼륨의 미소한 영향은 도 9b에 나타내는데, 여기서 10mM의 KCl의 유무에 따른 0.1M NaCl에서의 두 개의 프로타민 보정 곡선이 도시된다. 낮은 프로타민 농도에서 관찰된 반응의 최대 편차는 실제로 5mV를 초과하지 않는다.
예 10
전체 혈액에 있는 프로타민에 대한 보정 곡선
도 10은 전체 혈액 내의 프로타민에 대한 보정 곡선, 및 -2㎂의 음극 전류에서의 보정 곡선에 해당하는 전위-시간 궤적을 도시한다. 전체 혈액 내에서, 전위 반응 범위는, 전체 혈액 시료 내의 프로타민의 실질적인 결정을 위해 수용할 만큼 큰, 약 60mV에서 발견되었다. 전위의 표준 편차는, 완충된 NaCl 용액에서 관찰된 0.7mV와 비교하여 최대 1.5mV 증가했다. 그 결과는, 0.5㎎/L만큼 낮은 프로타민의 농도가 전류 펄스 크로노전위차 센서로 결정될 수 있다는 것을 나타낸다.
예 11
전체 혈액 시료의 적정
상기 실험적 프로토콜은, 전위차 센서로 한 이전의 작업과 유사하게, 프로타민 적정의 종말점 검출을 통해 혈액 내의 헤파린을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 헤파린의 다른 모델 농도인 0.25 내지 2μM(0.6 내지 4.5 kU/L)의 범위를 얻기 위해, 전체 혈액 시료에 헤파린 원액(2 ×10-5M, 1.5g/L)이 소등분량이 첨가되었고, 1g/L 프로타민으로 적정했다. 결과적인 적정 곡선은 도 11a에 나타낸다.
각각의 점은 1.5mV 미만의 표준 편차를 제공하면서, 10개의 연속적인 전위 리딩의 평균으로 산출되었다. 재현성은, 시료마다 최대 7mV의 초기 및 말기 전위의 편차를 제공하는 반면에 적정 동안의 전위의 총 변화는 동일하게 유지하면서, 각각의 적정을 4번 반복함으로써 측정되었다. 각각의 선택 튜브가 7.2㎎의 EDTA의 칼륨 염을 함유하고, 혈액의 양은 2 내지 4mL에서 달라지는 각각의 튜브에서 선택되었기 때문에, 대부분의 편차는 칼륨 농도의 변이로 인한 것일 수 있다(도 9b를 참조).
관찰된 종말점은, 전체 혈액 헤파린 농도의 함수로서, 도 11b에서 플로팅되고(plotted), 예상된 선형 관계가 발견되었다(연관 계수 0.995). 이러한 보정 곡선의 선형 회귀는 cHeparin=V(6.6 ±0.4) ×10-3M/L - 0.6 μM로 결정되었다.
예 12
수명 및 센서 안정도
센서의 수명 및 안정도는 중요한 파라미터인데, 특히 생리학적 매질에서 행해지는 경우 그러하다. 10㎎/L의 프로타민을 함유하는 pH 완충된 0.1M NaCl에서 3시간 동안 1분의 측정 간격을 가지는 연속적인 펄스 크로노전위차 측정은 전위 드리프트가 보이지 않으며 2mV의 최대 전위 편차를 제공한다. 전체 혈액 시료에 대하여, 도 11b에 도시된 적정 곡선은 동일한 센서로 획득되었고, 혈액에서 측정한 총 시간은 2.5 시간을 초과했다(각각의 점을 위해, 10개의 전위 측정이 수집되었다). 혈액에 노출한 후에, 센서는 완충된 0.1M NaCl에 위치되었고, 베이스라인 전위는 초기 값(각각의 센서에 대해 5mV임)으로 돌아오는 것을 발견했다. 베이스라인 전위 시프트가 20mV를 초과하지 않는 시간으로 정의되는, 센서의 수명은, 희석되지 않은 전체 혈액 시료에 대해 10시간의 총 노출 시간을 갖는 경우 적어도 2주였다.
예 13
프로타민-선택성 막 전극의 제조 및 트립신 활성 및 억제제 활성의 검출
이온-선택성 막(200㎛ 두께)은 중량%로 1:2의 비인 PVC 및 o-NPOE, 및 5중량%의 친유성 염인 TDDA-DNNS을 포함했다. 막은 용매로서 THF를 사용하여, 용매 주조에 의해 제조되었다. 상기 막은 모체 막으로부터 콜크 보러(6-㎜ 직경)로 절단되어서, Philips 전극 몸체(IS-561)에 결합되었다. 내부 충전 용액은 10mM의 트리-HCl 완충용액(pH=7.4)에서 0.1m의 NaCl로 이루어지고, 내부 Ag/AgCl 전극과 접하게 되었다. 상기 전극은 내부 충전 용액과 동일한 용액에서 실험하기 이전에 밤새 조절되었다. 1M의 LiOAc 가교 전해질을 구비한 이중-접합 Ag/AgCl 전극은 외부 기준 전극으로서 사용되었다.
Pulstrode 측정은 3-전극 셀 시스템에서 수행되었는데, 여기서 Philips 몸체 전극(작업 전극으로 작용함), 외부 기준 전극 및 카운터 전극(백금 도선)이 시료에 침지되었다. 펄스 갈바노스탯/포텐셔스탯 기술은 이온-선택성 막의 제어에 사용되었다. 실험하는 동안, 각각 인가된 0.5㎂/㎠(0.5초 동안)의 전류 밀도를 갖는 일정한 전류 펄스에 이어 또 다른 일정한 제로 전류 펄스(0.5초 동안)가 후속되었고, 그런 다음 일정한 전위 펄스(15초 동안)가 추가되었다. 센서 반응을 나타내는, 샘플링 전위는 제 1 전류 펄스의 마지막 50㎳ 동안의 평균값으로서 얻어졌다.
프로타민은, 약 50%가 아르기닌 잔여물을 갖는 높은 함량의 염기성 아미노산을 포함한다. 따라서 프로타민은 트립신 분해 반응을 위해 우수한 기재가 된다. 도 12a 및 도 12b에 나타낸 바와 같이, 고농도의 프로테아제 트립신의 첨가함에 따라 프로타민의 반응은 급격하게 감소했고, 이는 단백질 가수분해 반응의 발생을 나타낸다. 모든 실험은 동일한 전극을 사용하여 수행되었고, 막은 다른 농도의 트립신을 가지고 하는 측정 사이에, 바탕 용액으로서 동일한 완충용액으로 세척된다. 베이스라인의 총 변화는 약 7mV여서, 막을 헹구는데 효과적인 리프레시먼트(refreshment)임을 나타낸다.
프로타민의 트립신 분해 반응 속도는 트립신의 첨가에 따른 초기 전위 감소 기울기로부터 추정될 수 있다. 점점 감소하는 기울기는 트립신의 농도가 증가함에 따라 증가하는 반응 속도를 의미한다. 따라서, 프로타민 분해는 시료에서의 트립신 활성에 정비례하는 것을 보여준다.
프로테아제 억제제의 활성은 전위차 프로타민 센서를 사용하여 직접 검출되고, 트립신-유사 억제제 아프로티닌은 전처리된 플라즈마 시료에서 성공적으로 측정되었다. 트립신 콩 억제제의 활성은 Pulstrode 프로타민 센서로 측정된다. 억제된 반응 속도는, 밀리리터 당 50 유닛인 고정된 트립신 농도로 트립신 및 콩 억제제의 혼합물을 첨가한 후에, 첫 번째 96초의 과정에서 전위와 프로타민 농도의 변화에 의해 평가되었다. 그 결과는 도 13a 및 13b에서 콩 억제제의 농도와 비교하여 도시된다. 도 13a는 전위 변화 대 콩 억제제의 농도를 도시하고, 도 13b는 프로타민 농도 변화 대 콩 억제제의 농도를 도시한다. 반응 속도는 콩 억제제의 농도가 증가함에 따라 감소하는 것으로 나타났다.
본 명세서에서 설명된 본 발명의 많은 변형 및 다른 실시예는, 이러한 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가 앞서 말한 기술에 존재하는 가르침의 이점을 알 수 있게 해줄 것이다. 따라서 본 발명은 기재된 특정 실시예에 한정되는 것이 아니라, 변형 및 다른 실시예가 첨부된 청구항의 범위 내에 포함되도록 의도되는 것으로 주지되어야 한다. 비록 특정 용어가 본 명세서에서 사용되지만, 이들은 한정을 위한 것이 아니라 단지 일반적이고 기술적인 의미로 사용된다.
상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 다중이온 센서, 및 추가로 프로타민(protamin) 및 헤파린(heparin)과 같은 다중이온의 검출에 사용하는 막, 및 전기화학 셀에서 막의 결합을 통한 그러한 검출 방법, 그리고 특히 막을 가로지르는 다중이온의 이동을 통해 다중이온의 검출에 사용된다.

Claims (42)

  1. 센서로서,
    하우징 내부에 위치된 전극; 및
    하우징의 일단부에 위치되고 하우징 외부의 시료 용액과 접한 막을 포함하고, 상기 막은 시료 용액 내에 있는 다중이온 농도를 검출하고, 다중이온 농도의 분해 속도는 시료 용액 내의 효소 활성도와 정비례하는, 센서.
  2. 제 1항에 있어서, 전극은 Ag/AgCl 전극인, 센서.
  3. 제 1항에 있어서, 막의 표면적은 약 10㎟ 내지 약 100㎟인, 센서.
  4. 제 3항에 있어서, 막의 표면적은 약 20㎟ 내지 약 50㎟인, 센서.
  5. 제 1항에 있어서, 막의 평균 두께는 약 10㎛ 내지 약 1000㎛인, 센서.
  6. 제 5항에 있어서, 막의 평균 두께는 약 20㎛ 내지 약 300㎛인, 센서.
  7. 제 1항에 있어서, 다중이온 농도는 프로타민(protamine)의 농도인, 센서.
  8. 제 1항에 있어서, 효소 활성도는 트립신의 활성도인, 센서.
  9. 시료 용액 내의 다중이온 농도를 검출하는 방법으로서,
    시료 용액을 제공하는 단계; 및
    시료 용액과 막을 접하는 단계
    를 포함하고, 상기 막은 시료 용액 내의 다중이온 농도를 검출하고, 다중이온 농도의 분해 속도는 시료 용액 내의 효소 활성도에 정비례하는, 다중이온 농도를 검출하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 다중이온 농도는 프로타민의 농도인, 다중이온 농도를 검출하는 방법.
  11. 제 9항에 있어서, 효소 활성도는 트립신의 활성도인, 다중이온 농도를 검출하는 방법.
  12. 제 9항에 있어서, 시료 용액은 생물학적 성분을 포함하는, 다중이온 농도를 검출하는 방법.
  13. 제 9항에 있어서, 시료 용액은 혈액인, 다중이온 농도를 검출하는 방법.
  14. 가역 가능한 전기화학 셀 장치로서,
    막을 포함하는 다중이온-선택성 막 전극으로서, 상기 막은 시료 용액 내의 다중이온 농도를 검출하고, 다중이온 농도의 분해 속도는 시료 용액 내의 효소 활성도와 정비례하는, 다중이온-선택성 막 전극; 및
    막을 세척하기 위해 전위를 가하는 수단
    을 포함하는, 가역 가능한 전기화학 셀 장치.
  15. 제 14항에 있어서, 다중이온 농도는 프로타민의 농도인, 가역 가능한 전기화학 셀 장치.
  16. 제 14항에 있어서, 효소 활성도는 트립신의 활성도인, 가역 가능한 전기화학 셀 장치.
  17. 제 14항에 있어서, 막을 세척하기 위해 전위를 가하는 수단은 기준 전극과 다중이온-선택성 막 전극 사이에 가해진 외부 전극 전위인, 가역 가능한 전기화학 셀 장치.
  18. 가역 가능한 전기화학 셀 장치로서,
    막을 포함하는 다중이온-선택성 막 전극으로서, 상기 막은 시료 용액 내의 다중이온 농도를 검출하는, 다중이온-선택성 막 전극; 및
    막을 세척하기 위해, 기준 전극과 다중이온-선택성 막 전극 사이에 전위를 가하는 수단
    을 포함하는, 가역 가능한 전기화학 셀 장치.
  19. 가역 가능한 전기화학 셀 장치로서,
    막을 포함하는 다중이온-선택성 막 전극으로서, 상기 막은 시료 용액 내의 다중이온 농도를 검출하고, 다중이온 농도의 분해 속도는 시료 용액 내의 효소 활성도에 정비례하는, 다중이온-선택성 막 전극; 및
    막을 세척하기 위해, 기준 전극과 다중이온-선택성 막 전극 사이에 전위를 가하는 수단
    을 포함하는, 가역 가능한 전기화학 셀 장치.
  20. 제 19항에 있어서, 다중이온 농도는 프로타민의 농도인, 가역 가능한 전기화학 셀 장치.
  21. 제 19항에 있어서, 효소 활성도는 트립신의 활성도인, 가역 가능한 전기화학 셀 장치.
  22. 전기화학 셀 장치를 전환(reversing)하는 방법으로서,
    시료 용액을 제공하는 단계;
    막을 포함하는 다중이온-선택성 막 전극과 시료 용액을 접하는 단계로서, 상기 막은 시료 용액 내의 다중이온 농도를 검출하고, 다중이온 농도의 분해 속도는 시료 용액 내의 효소 활성도에 정비례하는, 다중이온-선택성 막 전극과 시료 용액을 접하는 단계; 및
    막을 세척하기 위해 전위를 가하는 단계
    를 포함하는, 전기화학 셀 장치를 전환하는 방법.
  23. 제 22항에 있어서, 다중이온 농도는 프로타민의 농도인, 전기화학 셀 장치를 전환하는 방법.
  24. 제 22항에 있어서, 효소 활성도는 트립신의 활성도인, 전기화학 셀 장치를 전환하는 방법.
  25. 제 22항에 있어서, 시료 용액은 생물학적 성분을 포함하는, 전기화학 셀 장치를 전환하는 방법.
  26. 제 22항에 있어서, 시료 용액은 혈액인, 전기화학 셀 장치를 전환하는 방법.
  27. 제 22항에 있어서, 막을 세척하기 위한 전위는 기준 전극과 다중이온-선택성 막 전극 사이에 가해지는, 전기화학 셀 장치를 전환하는 방법.
  28. 센서로서,
    하우징 내부에 위치된 전극; 및
    하우징의 일단부에 위치되고 하우징 외부의 시료 용액과 접하는 막
    을 포함하고, 상기 막은 시료 용액에서 효소 활성도 및 해당 효소 억제제 활성도를 모니터링하는, 센서.
  29. 제 28항에 있어서, 전극은 Ag/AgCl 전극인, 센서.
  30. 제 28항에 있어서, 막의 표면적은 약 10㎟ 내지 약 100㎟인, 센서.
  31. 제 30항에 있어서, 막의 표면적은 약 20㎟ 내지 약 50㎟인, 센서.
  32. 제 28항에 있어서, 막의 평균 두께는 약 10㎛ 내지 약 1000㎛인, 센서.
  33. 제 32항에 있어서, 막의 평균 두께는 약 20㎛ 내지 약 300㎛인, 센서.
  34. 제 28항에 있어서, 효소 활성도는 트립신의 활성도인, 센서.
  35. 제 28항에 있어서, 해당 효소 억제제 활성은 α1-안티프로테이나아제 억제제 의 활성도인, 센서.
  36. 제 28항에 있어서, 해당 효소 억제제 활성도는 α2-매크로글로불린의 활성도인, 센서.
  37. 제 28항에 있어서, 해당 효소 억제제 활성도는 아프로티닌의 활성도인, 센서.
  38. 제 28항에 있어서, 해당 효소 억제제 활성도는 콩 억제제의 활성도인, 센서.
  39. 제 28항에 있어서, 전위 감소는 시료 용액에 있는 해당 효소 억제제의 농도에 의존하는, 센서.
  40. 제 28항에 있어서, 표시자(marker)에 의해 라벨링된 분석 시료를 검출하기 위해 면역 측정을 더 포함하는, 센서.
  41. 제 40항에 있어서, 표시자는 다중이온인, 센서.
  42. 제 40항에 있어서, 표시자는 효소인, 센서.
KR1020087002855A 2005-08-05 2006-07-27 다중이온용 가역 가능한 전기화학 센서 KR20080053460A (ko)

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US60/706,117 2005-08-05

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