KR20080033247A - 작은 양을 전류로 처리하는 방법 - Google Patents
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Abstract
미생물(biological material)을 전류를 사용하여 처리하는 방법이 개시되어 있으며, 이 방법에서, 미생물은 상대적으로 높은 이온 세기를 갖는 작은 부피의 완충용액에 담겨진다. 강한 전계가 미리 설정된 기간을 갖는 높은 전압 펄스를 통해 완충용액에서 생성된다. 미생물은 적어도 100mmol/l의 이온 세기를 갖는 최대 50㎕의 완충용액에 담겨진다. 적어도 10㎲의 미리 설정된 기간을 갖는 적어도 하나의 전압 펄스에 의해, 적어도 1kV/cm의 전계 세기를 갖는 전계가 완충용액에 생성된다. 그에 따라, 전압 펄스는 적어도 100㎲ 기간 동안 적어도 1회 중단되고, 그 후 다시 계속된다.
Description
본 발명은 미생물(biological material)을 전류를 사용하여 처리하는 방법에 관한 것이다. 특히, 미생물은 상대적으로 높은 이온 세기를 갖는 작은 부피의 완충용액에 담겨지며, 이 완충용액에서, 미리 설정된 기간 동안 높은 전압 펄스를 통해 강한 전계가 생성된다.
예컨대 DNA, RNA 또는 단백질과 같은 생리활성 분자(biologically active molecules)를 살아있는 세포에 주입하는 것은 이들 분자의 생물학적 기능 분석에 중요한 도구이다. 이질의 분자를 세포에 주입하는 바람직한 방법으로는 전기천공(electroporation) 방법이 있으며, 이 방법은, 화학적 방법과는 대조적으로, 다른 생리활성 분자의 동시 운송에 의존하지 않는다. 전기천공 방법에서, 이질의 분자는 간단한 전류 흐름을 통해 세포배양기로부터나 세포에 적응된 완충용액으로 부터 세포 내로 주입된다. 세포막은 짧은 전기 펄스 작용에 의해 이 이질의 분자에 침투성이 있게 된다. 게다가, 세포부유물은 소위 큐벡(cuvette), 즉 상부가 개방되어 있고, 그 내부는 평행하고 서로 마주보게 배치된 두 개의 측벽 쌍으로 형성된 좁은용기(vessel)에 놓인다. 이 용기의 내부는 세포 부유물, 즉, 일반적으로 수성 완충용액이나 세포 배양기를 받아들일 수 있으며, 이러한 완충용액이나 세포 배양기에서, 처리될 세포가 부유 상태에 놓인다. 그러한 큐벳은 일반적으로 한 쌍의 마주보는 측벽의 하단부에 한 쌍의 전극을 가지며, 이로 인해 전압이 인가된다. 이들 전극에서 전기 방전으로 인해, 전류가 전극 사이에 흐르게 되며, 세포 부유물을 거쳐서, 핵산이나 다른 분자가 세포 내로 운송되게 되거나, 선택된 조건에 따라서, 세포 융합을 초래한다.
강한 전계, 즉 높은 전류 밀도의 짧은 펄스를 간단히 인가한 결과, 세포, 세포 파생물(cell derivatives), 부세포 분자(sub-cellular particles) 및/또는 소포(vesicles)가 또한 융합될 수 있다. 이러한 소위 전기융합 방법에서, 세포는 먼저 예컨대 비균질 교류계를 통해 가까운 막에 접촉된다. 전계 펄스를 순차적으로 인가하면, 막의 일부분이 상호작용하게 되어, 결국 융합하게 된다. 이러한 전기 융합 방법의 경우, 전기천공 방법에 사용된 장치와 비교될 만한 장치가 사용될 수 있다.
전기천공 방법 동안에, 생리활성 분자는 먼저 세포막에 잠시 생성된 '천공'을 통해 세포질 내로 들어간다. 특정한 경우, 이 분자는 이미 세포질 내에서 해당 기능을 수행할 수 있고, 후속해서, 특정한 조건에서, 핵에도 들어갈 수 있다. 특히, 생리활성 분자가 단지 핵에서 해당 기능을 수행할 수 있는 응용의 경우, 예컨대 유전자의 단백질합성과정이 분석되고, 특히 분할 없이 또는 아주 낮은 분할율을 갖는 세포, 예컨대 1차 세포가 사용되는 경우, 생리활성 분자가 핵 내로 직접 운송되는 것이 유리하다.
그 전체 내용이 참조사항으로 본 명세서에 병합된 미국특허출원(US2004014220)에 개시된 전기천공 방법으로부터, 그러한 경우, 높은 트랜스펙션(transfection) 효율을 얻기 위해, 적어도 2kV/cm의 전계 세기를 갖는 강한 전계가 높은 전압 펄스를 통해 적어도 10㎲의 미리 설정된 기간 동안 완충용액에서 생성되어야 한다는 점을 알 수 있다.
미생물을 높은 전류에 의해 처리하는 방법은 또한 미국특허출원(US2005064596)으로부터 알려져 있으며, 이 출원의 전체 내용이 참조사항으로 본 명세서에 병합되어 있다. 여기에 개시된 방법에서, 미생물은, 높은 트랜스펙션 효율을 얻는 동안 낮은 세포 사망률을 보장하기 위해 적어도 200mmol/l의 이온 세기인 완충용액에 담겨진다.
특히 HT(High Throughput) 분석에서, 복수의 반응 회분(reaction batch)이 동시에 가능한 가장 짧은 시간에 테스트되어야 하는, 주로 생화학 및 의약 응용에서, 가능한 많은 수, 예컨대 96개나 384개의 반응실을 제공해야 한다. 이러한 환경에서 사용된 반응 용기는 일반적으로 멀티 웰 플레이트(multi well plate), 미량 적정 플레이트 또는 멀티 웰(multi well)로 지칭된다. 이들 용기의 개별 반응실('웰')은 상대적으로 작으며, 따라서 작은 부피만을 수용할 수 있다. 게다가, 완충용액 및 세포 물질을 절약하기 위해 더 작은 샘플 부피를 사용하는 것이 종종 유리하다. 게다가, 특히 예컨대 1차 세포와 같은 귀중한 세포 물질의 경우, 단지 소량의 세포만이 일반적으로 이용 가능하다. 그러므로, 작은 샘플 부피로 연구하는 것이 종종 바람직하고 특정한 경우 필요하다.
전기 가수분해 방법(electrical hydrolysis)은 액체에 강한 전계를 생성시킬 경우 발생하는 부작용으로 인해서 배제될 필요가 없다. 가장 적은 경우에도, 전극의 표면에 기포 생성을 통해 전기분해를 목격할 수 있으며, 이러한 기포 생성은 다시 거품을 생성시킨다. 극단적인 경우, 폭발할 듯이 많은 기체가 생성되며, 이것은 최종적인 변위 효과로 인해, 전극 사이의 영역으로부터 샘플들을 배출한다(이후 '스패터링(spattering)'이라 함). 이렇게 배출되면, 일반적으로 샘플(들)이 손실되거나, 적어도 샘플은 예상 시간 동안 전계에 남아 있지 않게 된다. 그러므로 샘플의 이러한 스패터링은 정성적으로(qualitatively) 및/또는 정량적으로(quantitatively) 테스트 또는 샘플 처리의 결과를 손상시키며, 게다가 결과의 재현에 부정적인 영향을 미친다. 그에 따라, 생물학적 세포를 전계에서 처리해야 하는 여러 응용에서, 특히 전기천공 방법 동안에, 전기분해는 바람직하지 않은 부작용을 일으킨다.
이론상, 스패터링 확률은 전기 전도도를 줄임으로서 감소할 수 있다. 그러나 단단한 세포벽이 제공되지 않은 더 고차원의 세포는 일반적으로 특정한 오스몰농도의 용액에서만 생존할 수 있다. 일반적으로 전해질은 또한 특히 오스몰 농도 면에서 효율적으로 용해된 물질이며, 결국 다소 높은 전기 전도도의 용액을 얻는다. 예컨대 전기천공 방법을 실행하기 위해, 이온을 세포 부유물 내로 주입하는 것이 일반적으로 필요하며, (그 전체 내용이 참고사항으로서 본 명세서에 병합된) 미국특허출원(US2005064596)에 개시된 바와 같이, 또한 유리하다. 따라서 실제 전기 전도도를 줄임으로써 스패터링 가능성을 감소시키는 데는 한계가 있다. 따라서, 그러한 경우, 가변 전기분해를 예상할 수 있다.
따라서 스패터링의 발생은 확률적 사건이다. 이것이 의미하는 점은, 이러한 사건이 단지 확률로 기재될 수 있다는 것이다. 규정된 조건에 따라, 바람직하지 않은 스패터링의 빈도는 예컨대 5% 이하일 수 있거나, 또한 95%이상일 수 있다. 따라서 스패터링의 확률은, 특히 낮은 부피가 높은 전류 밀도에서 사용될 경우에 높다. 프로세스를 생산단계로까지 발전시키기 위해서, 이러한 문제는 고객에 의해 사용될 수 있는 적절한 방법에 의해 이러한 확률을 예컨대 1% 이하까지 줄이는데 걸림돌이 되었다.
따라서 본 발명에 의해 해결해야 할 문제는 전극 사이의 영역으로부터 샘플의 원치 않는 배출의 빈도를 상당히 줄이는, 앞서 언급한 유형의 방법을 제공하는 것이다.
이러한 문제는 본 발명에 따른 방법에 의해 해결되며, 이 방법에서, 적어도 대략 100mmol/l의 이온 세기를 갖는, 대략 50㎕미만의 완충용액에 미생물(biological material)을 넣으며, 적어도 대략 1kV/cm의 전계 세기를 갖는 전계가 적어도 대략 10㎲의 미리 설정된 기간 동안, 적어도 하나의 전압 펄스를 통해 생성된다. 전압 펄스는 적어도 대략 100㎲의 기간 동안에 적어도 1회 중단되고, 후속해서 계속된다. 전압 펄스의 미리 설정된 기간은 사실상 중단이 없는 펄스 기간, 즉 전류가 실제 흐르는 총 순 시간에 대응한다. 그에 따라, 전압 펄스가 중단된 추가 시간 기간 결과로, 펄스의 총 기간은 그에 따라 증가하며, 따라서 전압 펄스의 시작에서 끝까지의 기간, 즉 미리 설정된 기간에 도달할 때까지의 기간은 미리 설정된 기간보다 더 길다. 본 발명에 따른 방법에서, 전압 펄스는 미리 결정된 기간에 대한 미리 결정된 시간 이후 중단되고, 그 후에 계속된다. 이러한 과정은 전압 펄스의 미리 설정된 기간에 도달해야하는 만큼 자주 반복된다. 따라서 전압 펄스는, 완충용액의 기체 생성이 전극 사이의 영역으로부터 샘플의 배출을 막도록 충분히 감소되기에 충분할 정도로 빈번하게 중단되어야 한다. 게다가, 개별 중단의 기간은 전극 사이의 영역으로부터의 샘플 배출을 막기에 충분히 길어야 한다. 따라서 전압 펄스를 중단시킴으로써, 스패터링 빈도는 규정된 다른 조건 하에서 눈에 띄게 감소될 수 있는 반면, 사용되는 방법의 효율, 특히 트랜스펙션 효율은 유지된다.
원치 않는 스패터링의 빈도는 한편으로는 예컨대 전기천공 방법 동안에, 전류 밀도(전계 세기 x 특정 전기 전도도)와, 전계가 인가되는 시간 기간에 긍정적으로 관련된다. 따라서 전류 밀도 및 시간 기간은 샘플 부피 당 전기분해로 생성된 기체의 양에 직접 관련된다. 전기세기 및 시간 기간은 예컨대 높은 트랜스펙션 효율이나 핵으로의 분자의 직접 운송이 달성될 수 있게 하는 조건을 결정한다. 이들 두 파라미터 중 하나를 최적인 세포 특정 조건에서 멀어지도록 감소시키면, 테스트 결과가 정성적으로 및/또는 정량적으로 하락하게 된다. 그에 따라, 이들 파라미터 중 하나를 감소시키는 것은 가능하지 않거나, 제한된 정도로만 가능하다. 다른 한편, 스패터링 확률은 샘플 부피(mass)에 부정적으로 관련된다. 이러한 관련성은, 더 큰 부피의 더 큰 비활성(inertness)으로 인해 초래된다. 짧은 시간 윈도우(window) 내에서, 아마도 더 큰 부피가 큐벳 간격에 남아 있을 것이다. 따라서 작은 부피의 경우, 다른 등가의 조건에서, 스패터링은 특히 빈번하게 발생한다. 그러므로 스패터링 문제는 HT 분야의 방법에 특정한 영향을 미친다. 그러나 특정한 응용의 경우, 특히 높은 처리율 분야에서, 샘플 부피는 증가할 수 없다. 한편으로, 부피가 증가할수록 더 많은 수의 샘플이 자동 액체 처리 시스템에 의해 처리될 수 없거나, 더 큰 비용으로만 처리될 수 있거나, 다른 한편으로, 이용 가능한 세포 물질(및 가능한 반응물(reagent))의 양은 종종 이 물질과 관련된 비용 면에서 제한된다. 게다가, 큰 부피를 사용하는 것은 또한 다른 이유로 불리할 수 있다. 특정한 포인트에서 더 높은 포인트로의 세포 농도 감소는 예컨대 전기천공 방법 동안의 세포 생존율이나 전기융합 방법 동안의 효율과 관련하여 눈에 띄게 악화된 결과를 초래한다. 그에 따라, 특히 HT 방법을 통해, 부피 증가는 실제 선택 사양이 아니다. 따라서 본 발명에 따른 방법은 미리 결정된 다른 조건 하에서 스패터링의 빈도를 효율적으로 및 신뢰할만하게 눈에 띄게 감소시킨다.
본 발명의 유리한 실시예에서, 전압 펄스는 3, 4, 5, 6, 7, 8 및/또는 9회를 포함해서 2 내지 10회 중단된다. 따라서 이러한 중단의 횟수는 미리 설정된 조건, 특히 이용 가능한 전류 밀도, 펄스 기간 및 부피에 의존한다. 최적의 중단 횟수는 종종 사용된 세포 유형 및/또는 각 응용에 대해 경험적으로 결정되어야 한다. 그러나 그러한 경험적인 결정은 충분히 당업자의 능력 내에 있다.
본 발명에 따라, 적어도 하나의 중단에 대해, 대략 200㎲ 내지 대략 2ms, 바람직하게는 대략 300㎲, 대략 400㎲, 대략 500㎲, 대략 600㎲, 대략 700㎲, 대략 800㎲, 대략 900㎲, 대략 1ms 또는 대략 1.5ms의 기간이 미리 설정될 수 있다. 이러한 중단 간격이 특정한 길이를 초과하지 않는 한, 샘플의 스패터링은 방법의 결과의 품질에 이처럼 부정적인 영향을 미치지 않고도 방지될 수 있다. 그러므로 최적 중단 기간 및/또는 중단은 각각 일반적으로 사용된 세포 유형 및/또는 각 응용에 대해 경험적으로 결정되어야 한다. 그러나 그러한 경험적 결정은 충분히 당업자의 능력 내에서 있다. 스패터링 확률의 감소에 필요한 기간은 또한 특히 미리 설정된 조건, 즉 이용 가능한 전류 밀도, 펄스 기간 및 부피에 의존한다.
미생물을 담은 완충용액의 총 부피는 대략 1㎕ 내지 대략 50㎕ 사이, 바람직하게는 대략 10㎕ 내지 대략 40㎕ 사이, 특히 바람직하게는 대략 15㎕ 내지 대략 25㎕ 사이, 특히 대략 10㎕ 내지 대략 20㎕ 사이에 있다. 게다가, 사용된 부피는 일반적으로 미생물 및/또는 화학 엔지니어링 조건의 이용 가능성에 의존한다.
본 발명의 또 다른 유리한 실시예에서, 전압 펄스는 최고 대략 10kV/cm, 바람직하게는 대략 1kV/cm 내지 대략 8kV/cm, 특히 바람직하게는 2kV/cm 내지 6kV/cm, 특히 대략 2kV/cm 내지 4kV/cm인 전계 세기를 갖는 전계를 생성한다. 그러한 높은 전압 펄스는 진핵 세포의 전기천공 방법, 특히 핵산을 핵에 주입하는 방법에 특히 적합하다.
본 발명의 추가로 유리한 실시예에서, 전압 펄스는 대략 최고 5ms, 바람직하게는 대략 20㎲ 내지 대략 2ms, 특히 바람직하게는 대략 100㎲ 내지 대략 1000㎲, 특히 대략 100㎲ 내지 대략 600㎲인 미리 설정된 기간을 갖는다. 따라서 이 미리 설정된 기간은 중단 없는 전압 펄스의 미리 결정된 길이, 즉 전류가 실제 인가되고, 각각 전류가 흐르는 시간 기간이다. 일반적으로 미리 설정된 기간은 사용된 셀 유형 및/또는 각 응용에 최적인 경험적으로 결정된 값이다. 특히, 본 발명에 따른 방법에 의해 제공된 전압 펄스의 중단으로 인해 효율이 약간 감소할 것으로 예상되는 응용에서, 이러한 감소한 효율은, 특정한 경우에, 예컨대 경험적으로 결정된 값을 초과한 특정한 한계치 내에서 미리 설정된 기간을 초과함으로써, 개선될 수 있다. 이러한 방식으로, 개별 경우에, 전압 펄스를 중단시킬 수 있다는 이러한 부정적인 영향을 보상하는 것이 가능하다.
본 발명의 유리한 실시예에서, 전압 펄스는 대략 5㎲, 대략 10㎲, 대략 20㎲, 대략 30㎲, 대략 40㎲, 대략 50㎲, 대략 60㎲, 대략 100㎲, 또는 200㎲의 전압 간격 이후 대략 중단되는 경우가 추가로 제공된다. 이것은 제 1 전압 간격이나 후속하는 전압 간격 중 하나 이상에 적용된다. 그러므로 전압 간격은 각각 전압이 인가되고, 전계가 완충용액에 생성되는 시간 기간이며, 이 기간 후에는 중단 간격이 오거나, 이 기간 이전에는 중단 간격이 온다. 특정한 조건 하에서, 하나 이상의 전압 간격을 줄임으로써, 스패터링 확률은 추가로 감소되고 및/또는 최소화될 수 있다.
본 발명에 따라, 전계는 두 전극 사이에 생성될 수 있다. 두 전극 사이의 거리는, 본 발명의 특히 유리한 실시예에서, 대략 0.5mm 내지 대략 5mm, 바람직하게는 대략 1mm 내지 대략 4mm, 특히 대략 1.5mm 내지 대략 2mm일 수 있다. 어떤 경우에, 전극 사이의 간격은 사용된 반응 용기의 형태에 따라 정해져야 하며, 그에 따라 이용 가능한 양의 완충용액이 전극 사이의 영역을 충분히 적실 수 있다.
본 발명의 유리한 실시예에서, 미생물이, 실질적으로 정사각형, 직사각형 또는 둥근 단면을 갖는 반응 용기에서 처리되는 경우가 추가로 제공된다. 게다가, 반응 용기는 실질적으로 직사각형 반응실을 가질 수 있으며, 이러한 반응실의 경계는 평행-평면 구성을 갖는 두 개의 전극에 의해 측면방향에서 정해진다.
본 발명은 예컨대 도면을 참조하여 이후에 좀 더 상세하게 기술될 것이다.
도 1은 전압, 높은 처리율의 뉴클리오펙터(Nucleofector)(등록상표)(HT-베타, 아막사 게엠베하(HT-beta, Amaxa GmbH)), 세포 부유물 부피: 2O㎕, 큐벳 간격 폭: 1.5mm, 완충용액의 이온 세기: 203mmol/l(전기 전도도: 11.3mS/cm)에 따른 스패터링 빈도의 막대그래프이며, 검은색 영역은 개별 샘플의 스패터링 빈도를 도시한(n은 샘플의 수), 막대그래프.
도 2는 펄스 기간, 높은 처리율의 뉴클리오펙터(등록상표)(HT-베타, 아막사 게엠베하), 세포 부유물 부피: 2O㎕, 큐벳 간격 폭: 1.5mm, 완충용액의 이온 세기: 129mmol/l(전기 전도도: 7.2mS/cm)에 따른 스패터링 빈도의 막대그래프이며, 검은색 영역은 개별 샘플의 스패터링 빈도를 도시한(n은 샘플의 수), 막대그래프.
도 3은 전압 펄스의 중단 기간, 높은 처리율의 뉴클리오펙터(등록상표)(HT-베타, 아막사 게엠베하), 세포 부유물 부피: 2O㎕, 큐벳 간격 폭: 1.5mm, 완충용액의 이온 세기: 203mmol/l(전기 전도도: 11.3mS/cm)에 따른 스패터링 빈도의 막대그래프이며, 검은색 영역은 개별 샘플의 스패터링 빈도를 도시한(n은 샘플의 수), 막대그래프.
도 4는 중단되지 않은 전압 간격의 최대 기간, 높은 처리율의 뉴클리오펙터 (등록상표)(HT-베타, 아막사 게엠베하), 세포 부유물 부피: 2O㎕, 큐벳 간격 폭: 1.5mm, 완충용액의 이온 세기: 203mmol/l(전기 전도도: 11.3mS/cm)에 따른 스패터링 빈도의 막대그래프이며, 검은색 영역은 개별 샘플의 스패터링 빈도를 도시한(n은 샘플의 수), 막대그래프.
도 5는 완충용액의 전기 전도도 및/또는 이온 세기, 높은 처리율의 뉴클리오펙터(등록상표)(HT-베타, 아막사 게엠베하), 세포 부유물 부피: 2O㎕, 큐벳 간격 폭: 1.5mm, 완충용액의 이온 세기:)에 따른 스패터링 빈도의 막대그래프이며, 검은색 영역은 개별 샘플의 스패터링 빈도를 도시한(n은 샘플의 수, 완충용액 1: 이온 세기(203mmol/l) 및 전기 전도도(11.3mS/cm), 완충용액 2: 이온 세기(129mmol/l) 및 전기 전도도(7.2mS/cm)), 막대그래프.
도 6은 세포 부유물의 부피, 높은 처리율의 뉴클리오펙터(등록상표)(HT-베타, 아막사 게엠베하), 큐벳 간격 폭: 1.5mm, 완충용액의 이온 세기: 129mmol/l(전기 전도도: 7.2mS/cm)에 따른 스패터링 빈도의 막대그래프이며, 검은색 영역은 개별 샘플의 스패터링 빈도를 도시한(n은 샘플의 수), 막대그래프.
도 7은 세포 부유물의 부피, 높은 처리율의 뉴클리오펙터(등록상표)(HT-베타, 아막사 게엠베하), 큐벳 간격 폭: 1.5mm, 완충용액의 이온 세기: 203mmol/l(전기 전도도: 11.3mS/cm)에 따른 스패터링 빈도의 막대그래프이며, 검은색 영역은 개별 샘플의 스패터링 빈도를 도시한(n은 샘플의 수), 막대그래프.
도 8은 트랜스펙션 효율을 검출하기 위한, 전압 펄스의 중단 기간, 높은 처리율의 뉴클리오펙터(등록상표)(HT-베타, 아막사 게엠베하), 큐벳 간격 폭: 1.5mm, 완충용액의 이온 세기: 203mmol/l(전기 전도도: 11.3mS/cm)에 따른 트랜스펙션 효율의 막대그래프이며, 여기서 2x105인 HEK293 셀 각각은 20㎕인 완충용액에 수용되며, 이때 0.1㎍인 pEGFP-C1(인바이트로젠(Invitrogen))이 추가되고 4kV/cm의 전계에 노출된 후, 이들 셀은 100㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin), 100U/㎖ 페니실린(penicillin) 및 10% 말혈청(horse serum)(ATCC)을 가진 최소 필수 배지 이글(Minimum Essential Medium Eagle(ATCC)에 수용되었고, 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 습윤 배양기(humidified incubator)에서 배양되었고, 마지막으로, 이들 샘플들은 유세포분류기(flow cytometry)(FACSCalibur, 벡톤 디킨슨사(Becton Dickinson))에 의해 GFP 단백질합성과정(expression)이 테스트되었고, GFP 단백질합성과정중인 세포의 백분율의 각 이중 값이 도시되며, 막대그래프에 기재된 문구는 전계 노출의 중단에 관한 것이고; 모든 데이터는 ㎲단위이며, 시작 및 끝 부분의 숫자는 중단되지 않은 전압 간격의 기간을 나타내며, 수평 라인 사이의 숫자는 그 사이의 중단 기간을 나타내며(P=중단)인, 막대그래프.
도 9는 트랜스펙션 효율을 검출하기 위한, 전압 펄스의 중단 기간, 높은 처리율의 뉴클리오펙터(등록상표)(HT-베타, 아막사 게엠베하), 큐벳 간격 폭: 1.5mm, 완충용액의 이온 세기: 203mmol/l(전기 전도도: 11.3mS/cm)에 따른 트랜스펙션 효율의 막대그래프이며, 여기서 2x105인 jurkat E6.1 셀 각각은 1㎍ pmaxGFP(아막사)가 더해진 20㎕ 완충용액에 수용되고, 1.25kV/cm의 전계에 노출된 후, 이들 세포는 100㎍/㎖ 스트렙토마이신, 100U/㎖ 페니실린 및 10% FCS(ATCC)를 가진 RPMI-1640 배지(medium)(ATCC)에 수용되었고, 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 습윤 배양기에서 배양되었고, 마지막으로, 이들 샘플들은 유세포분류기(FACSCalibur, 벡톤 디킨슨사)에 의해 GFP 단백질합성과정이 검사되었고, GFP 단백질합성과정 중인 세포의 백분율의 각 이중 값이 도시되며, 막대그래프에 기재된 문구는 전계 노출의 중단에 관한 것이고; 모든 데이터는 ㎲단위이며, 시작 및 끝 부분의 숫자는 중단되지 않은 전압 간격의 기간을 나타내며, 수평 라인 사이의 숫자는 그 사이의 중단 기간을 나타내며(P=중단)인, 막대그래프.
도 1은, 각각 중단되고 및 중단되지 않고 실행되었던 두 개의 서로 다른 전압 펄스의 비교 형태로 전압에 따른 스패터링 빈도의 막대그래프를 도시한다. 제 1 전압 펄스는 800V의 외부 인가 전압에서 100㎲의 미리 설정된 기간을 갖는다. 이것은 전압 및 전극 저항으로부터 계산될 수 있는 대략 4kV/cm의 전계 세기를 제공한다. 제 2 전압 펄스는 또한 100㎲의 미리 설정된 기간을 갖지만, 1000V의 전압이 인가되면, 대략 5kV/cm의 전계 세기가 이 전압으로부터 계산될 수 있다. 두 개의 전압 펄스는 각각 40㎲(T1 최대) 이후 각각 2회 중단되었다. 즉, 펄스는 40㎲이후 중단되었고, 그 후 계속되며, 추가로 40㎲이후, 다시 중단되었고, 최종적으로 20㎲의 전압 간격으로 종료되어, 100㎲의 총 미리 설정된 기간에 도달되었다. 중단의 기간은 각각 800㎲였다(T1 중단). 대체로, 각 전압 펄스는 그러므로 3개의 전압 간격과, 2개의 중단 간격으로 이뤄지며, 펄스의 전체 기간은 총 1700㎲가 된다. 여기 서, 미리 설정된 조건 하에서 더 낮은 전압 및/또는 전계 세기를 갖는 전압 펄스를 인가하면, 결국 샘플의 배출을 초래하지 않음, 즉 이 경우 스패터링(spattering)하지 않음이 분명해 진다. 이와는 대조적으로, 더 높은 전압 및/또는 전계의 전압 펄스는 샘플을 배출시킨다(세 번째 막대). 이 바람직하지 않은 스패터링은 전압 펄스를 2회 중단함으로써 방지될 수 있다(마지막 막대). 그러므로 한편으로, 다른 일정 조건 하에서 스패터링 확률은 전계 세기가 증가할수록 더 높게 되며, 다른 한편으로, 반응용기로부터 샘플 배출은, 심지어 매우 높은 전계 세기에서도, 전압 펄스를 중단함으로써 방지될 수 있음을 알 수 있다. 적어도, 펄스를 중단함으로써, 스패터링의 확률은 상당히 감소한다.
도 2는 펄스 기간에 따라 스패터링 빈도의 막대그래프를 도시하며, 여기서, 각 700V(3.5kV/cm 전계 세기)의 세기와, 200, 350, 400 및 600㎲인 더 큰 미리 설정된 기간을 갖는 전압 펄스가 사용되었다. 스패터링의 백분율 빈도는 펄스 기간이 증가할수록 증가함이 도시되었다. 600㎲의 가장 긴 미리 설정된 기간을 갖는, 본 발명에 따른 전압 펄스를 중단시킴으로써, 샘플의 스패터링은 그러나 효율적으로 방지될 수 있었다. 전압 펄스는, 이 때문에, 200㎲(T1 최대) 이후 각각 2회 중단되었다. 즉, 펄스는 200㎲이후 중단되었고, 그 후 계속되며, 추가로 200㎲이후, 다시 중단되었고, 최종적으로 다시 200㎲의 전압 간격으로 종료되어, 600㎲의 총 미리 설정된 기간을 얻게 되었다. 중단 기간은 각각 2.5ms(T1 중단)였다. 총 각 전압 펄스는 3개의 전압 간격과 2개의 중단 간격으로 이루어지며, 펄스의 총 기간은 총 5.6ms가 된다. 이로 인해, 전압 펄스의 상대적으로 긴 미리 설정된 기간을 통해, 샘플 배출을 초래할 높은 확률이 있음이 분명해 진다(네 번째 막대). 이 원치 않는 스패터링은 전압 펄스를 2회 중단함으로써 방지될 수 있다(마지막 막대). 그에 따라, 한편으로, 다른 일정 조건 하에서 스패터링 확률은 펄스 기간이 증가할수록 더 높게 되며, 다른 한편으로, 반응용기로부터 샘플 배출은, 심지어 전압 펄스를 중단함으로써 상대적으로 긴 미리 설정된 기간에서도 방지될 수 있음을 알 수 있다.
도 3은 전압 펄스의 중단 기간에 따른 스패터링 빈도의 막대그래프를 도시한다. 이 예에서, 적어도 특정 응용 및/또는 조건에 대해, 중단(들)의 기간을 연장함으로써, 샘플 배출의 확률이 추가로 감소될 수 있음이 분명하다. 700V(3.5kV/cm 전계 세기)의 전압과 600㎲의 미리 설정된 기간을 갖는 전압 펄스가 중단되지 않고 사용되었고(첫 번째 막대), 매 400㎲동안 11회 중단되어 사용되었고(두 번째 막대), 또는 매 800㎲동안 11회 중단되어 사용되었다(세 번째 막대). 그러므로 중단된 펄스는 각각 50㎲ 길이의 12개의 전압 간격(T1 최대)과 각각 400㎲나 800㎲의 11개의 중단 간격(T1 중단)으로 이뤄진다. 만약 전압 펄스가 이들 조건 하에서 본 발명에 따라 중단되지 않는다면, 각 테스트 및/또는 각 샘플에서 스패터링이 발생한다. 샘플 중 대략 70%에 대해 400㎲의 중단 기간에 스패터링이 발생하는 반면, 스패터링은 중단 기간을 배가함으로써 이들 조건 하에서 완벽하게 방지될 수 있다. 당연히, 중단 이후 전압 간격 동안, 기체가 더 이상 샘플에서 형성되지 않도록, 완충용액의 물질 간의 관계는, 중단(들)의 기간이 증가함에 따라, '안정되게 된다'.
도 4는 중단되지 않은 전압 간격의 최대 기간에 따라 스패터링 빈도의 막대그래프를 도시한다. 이러한 테스트는 실제로 도 3에 따른 테스트와 동일한 조건 하 에서 실행되었으며, 중단 기간(T1 중단)이 400㎲에서 일정하게 유지되는 반면, 전압 간격의 최대 기간(T1 최대), 즉 전계가 생성된 기간이 변했다는 점만 차이가 난다. T1 최대=10㎲ 및 T1 최대=40㎲인 테스트와 비교할 때, 전압 간격, 즉 전압 펄스가 중단될 때까지의 시간을 줄이면, 스패터링의 확률을 감소시킨다는 점이 분명하다. 게다가, 본 실시예에서, 여러 인자는 여기서 40㎲와 50㎲ 사이의 임계값이 존재한다는 점, 즉 이 경우 T1 최대에서 스패터링 빈도의 비례 관계성이 성립하지 않음을 지시한다.
도 5는 완충용액의 이온 세기 및/또는 전기 전도도에 따라 스패터링 빈도의 막대그래프를 도시한다. 더 높은 이온 세기(완충용액 1: 이온 세기 203mmol/l 및 전기 전도도 11.3 mS/cm)인 완충용액을 사용할 때의 스패터링 위험은 더 낮은 이온 세기(완충용액 2: 이온 세기 129mmol/l 및 전기 전도도 7.2 mS/cm)인 완충용액을 사용할 때보다 실질적으로 더 크다. 도시된 두 실시예에서, 그러나, 스패터링은 본 발명에 따른 전압 펄스의 중단에 의해 방지될 수 있다.
도 6 및 도 7은 세포 부유물의 부피에 따른 스패터링 빈도의 막대그래프를 각각 도시한다. 두 예시로부터, 세포 부유물의 부피 및/또는 완충용액이 더 낮을수록 스패터링 확률이 더 높다는 점이 분명하다. 이러한 관계에서, 도 6에 따른 예로부터, 심지어 매우 낮은 부피만 사용될 수 있는 응용에서도, 스패터링 확률은 실제로 0으로 감소될 수 있음을 알 수 있다.
도 8 및 도 9는 전압 펄스의 중단 기간에 따른 트랜스펙션 효율의 막대그래프를 각각 도시한다. 트랜스펙션 효율은 본 발명에 따른 전압 펄스의 중단에 의해 부정적 영향을 크게 받지 않는다. 이러한 방법의 효율은, 전압 펄스가 중단되거나(이중 막대 2 내지 5) 그렇지 않거나(이중 막대 1 및 6)에 관계없이, 항상 거의 동일한 높은 수준을 유지한다.
그러므로, 전체적으로, 다르게 규정된 조건(전압 펄스의 미리 설정된 기간, 전계 세기 및/또는 전류 밀도, 완충용액의 부피) 하에서, 전압 간격은, 반응용기로부터 샘플이 배출될 확률 및/또는 스패터링 발생을 충분히 방지하기 위해, 중단되지 않는 특정한 길이를 초과하지 않을 수 있음을 알 수 있다. 그에 따라, 이 다르게 규정된 조건 하에서의 스패터링 문제는 중단되지 않는 임계 길이를 초과하지 않는 전압 간격 및/또는 중단된 펄스에 의해 해결될 수 있다. 그러므로 전압 펄스의 중단으로 인해, 방법의 품질, 이 경우 특히 트랜스펙션 효율이 손상되지 않으면서도, 스패터링 확률은 상당히 감소된다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 미생물(biological material)을 전류를 사용하여 처리하는 방법에 이용된다.
Claims (15)
- 미생물(biological material)을 전류에 의해 처리하는 방법으로서,적어도 대략 100mmol/l의 이온 세기를 갖는, 대략 50㎕미만의 완충용액을 제공하는 단계와,미생물을 상기 완충용액에 넣는 단계와,적어도 대략 1kV/cm의 전계 세기를 갖는 전계를 생성하기 위해, 적어도 대략 10㎲의 미리 설정된 기간 동안, 적어도 하나의 전압 펄스를 상기 완충 용액에 인가하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 전압 펄스는 적어도 대략 100㎲의 기간 동안에 적어도 1회 중단되고, 그 이후에 계속되는,미생물을 전류에 의해 처리하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 전압 펄스는 2회 내지 10회 중단되는, 미생물을 전류에 의해 처리하는 방법.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 전압 펄스의 적어도 1회 중단을 위해 대략 200㎲ 내지 대략 2ms의 기간이 미리 설정되는, 미생물을 전류에 의해 처리하는 방법.
- 제 3항에 있어서, 상기 기간은 대략 300㎲, 대략 400㎲, 대략 500㎲, 대략 600㎲, 대략 700㎲, 대략 800㎲, 대략 900㎲, 대략 1ms 또는 대략 1.5ms인, 미생물을 전류에 의해 처리하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 미생물을 담고 있는 상기 완충용액의 총 부피는 대략 1㎕와 대략 50㎕ 사이인, 미생물을 전류에 의해 처리하는 방법.
- 제 5항에 있어서, 상기 부피는 대략 10㎕와 대략 40㎕ 사이, 대략 15㎕와 대략 25㎕ 사이, 또는 대략 10㎕와 대략 20㎕ 사이인, 미생물을 전류에 의해 처리하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 전압 펄스는 대략 최대 10kV/cm인 전계 세기를 갖는 전계를 생성하는, 미생물을 전류에 의해 처리하는 방법.
- 제 7항에 있어서, 상기 전계 세기는 대략 1kV/cm 내지 대략 8kV/cm, 대략 2kV/cm 내지 6kV/cm, 또는 대략 2kV/cm 내지 대략 4kV/cm인, 미생물을 전류에 의해 처리하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 전압 펄스는 대략 최대 5ms의 미리 설정된 기간을 갖는, 미생물을 전류에 의해 처리하는 방법.
- 제 9항에 있어서, 상기 미리 설정된 기간은 대략 20㎲ 내지 대략 2ms, 대략100㎲ 내지 대략 1000㎲, 또는 대략 100㎲ 내지 대략 600㎲인, 미생물을 전류에 의해 처리하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 전압 펄스는 대략 5㎲, 대략 10㎲, 대략 20㎲, 대략 30㎲, 대략 40㎲, 대략 50㎲, 대략 60㎲, 대략 100㎲, 또는 대략 200㎲의 전압차 이후 중단되는, 미생물을 전류에 의해 처리하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 전계는 두 개의 전극 사이에 생성되며, 상기 두 개의 전극 사이의 거리는 대략 0.5mm 내지 대략 5mm인, 미생물을 전류에 의해 처리하는 방법.
- 제 12항에 있어서, 상기 거리는 대략 1mm 내지 대략 4mm, 또는, 대략 1.5mm 내지 대략 2mm인, 미생물을 전류에 의해 처리하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 미생물은 실질적으로 정사각형, 직사각형 또는 둥근 단면을 갖는 반응 용기 내에서 처리되는, 미생물을 전류에 의해 처리하는 방법.
- 제 9항에 있어서, 상기 반응 용기는 실질적으로 직사각형 반응실을 가지며, 상기 반응실의 경계는 평행-평면 구성을 갖는 두 개의 전극에 의해 측면방향에서 정해지는, 미생물을 전류에 의해 처리하는 방법.
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