KR20210015248A - 전기천공장치 - Google Patents
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Abstract
본 명세서는 전기천공법에 의해 세포 내 도입대상물질을 도입하는 전기천공장치에 관한 것이다.
Description
본 명세서는 전기천공법에 의해 세포 내 도입대상물질을 도입하는 전기천공장치에 관한 것이다.
전기천공법(electroporation)은 세포에 전기장을 가해 세포막의 투과율을 높여 약, 화학물질, DNA 등을 세포 내로 도입하는 방법이다. 동물, 식물, 미생물을 막론하고 여러 세포 종에 적용이 가능하여 널리 사용되고 있다.
세포에 전기장이 가해지면 세포막의 지질(lipid) 일부 분자들이 이동해 위치가 달라지게 되면서 친수성 구멍으로 이루어진 나노 미터 크기의 전도성 길이 생긴다. DNA의 경우 세포를 DNA 용액에 현탁하여 직류고전압의 펄스를 가하면 세포막에 구멍이 뚫림과 동시에 DNA 분자가 전기영동(electrophoresis)의 작용으로 세포 내에 DNA가 도입된다.
화학적 성질이 달라지지 않는다는 장점이 있지만, 일정 역치 이상의 전기장을 가해야 하므로 세포의 생존성을 확보해야 하는 문제가 수반된다.
또한, 온도, 펄스의 반복횟수, 지속시간, 전압, DNA 농도, 버퍼 용액의 종류 등 매우 다양한 변수에 영향을 받으므로 높은 효율을 얻을 수 있는 조건을 찾기 어렵다는 단점이 있다.
특히, 기존 전기천공법에서는 세포가 전기장에 노출되는 면적이 적어 효율을 높이기 어렵다.
세포의 생존성도 확보하면서, 도입물질이 세포에 도입되는 효율을 높일 수 있는 방법 및 장치에 대한 연구가 필요하다.
본 명세서는 전기천공법에 의해 세포 내 도입대상물질을 도입하는 전기천공장치를 제공하고자 한다.
본 명세서는 세포 및 도입대상물질을 포함하는 시료가 유입되는 유입구; 상기 세포 내에 상기 도입대상물질이 도입된 최종물이 배출되는 배출구; 상기 유입구와 일측 단부가 연결되고 상기 배출구에 타측 단부가 연결되며, 내부가 비어있고 나사비틀림구조를 갖는 유로관; 상기 유로관의 나사비틀림방향을 따라 상기 유로관의 표면에 구비된 양극과 음극; 및 상기 양극과 상기 음극에 각각 연결된 전원을 포함하는 것인 전기천공장치를 제공한다.
본 명세서의 전기천공장치를 이용하는 경우, 세포의 생존율이 높아지는 장점이 있다.
도 1은 본 명세서의 일 실시상태에 따른 유로관의 제1 구조이다.
도 2는 본 명세서의 일 실시상태에 따른 유로관의 제1 구조에 구비된 전극구조를 나타낸 것이다.
도 3은 본 명세서의 일 실시상태에 따른 유로관의 제1 구조에서, 전위분포를 나타낸 것이다.
도 4는 본 명세서의 일 실시상태에 따른 유로관의 제1 구조에서, 유로관의 중심축에 수직인 단면의 전기장분포를 나타낸 것이다.
도 5 내지 도 8는 각각 본 명세서의 일 실시상태에 따른 유로관의 수직단면 구조에서 전극의 배치를 나타낸 것이다.
도 2는 본 명세서의 일 실시상태에 따른 유로관의 제1 구조에 구비된 전극구조를 나타낸 것이다.
도 3은 본 명세서의 일 실시상태에 따른 유로관의 제1 구조에서, 전위분포를 나타낸 것이다.
도 4는 본 명세서의 일 실시상태에 따른 유로관의 제1 구조에서, 유로관의 중심축에 수직인 단면의 전기장분포를 나타낸 것이다.
도 5 내지 도 8는 각각 본 명세서의 일 실시상태에 따른 유로관의 수직단면 구조에서 전극의 배치를 나타낸 것이다.
이하에서 본 명세서에 대하여 상세히 설명한다.
본 명세서는 전기천공법에 의해 세포 내 도입대상물질을 도입하는 전기천공장치를 제공한다.
본 명세서는 세포 및 도입대상물질을 포함하는 시료가 유입되는 유입구; 상기 세포 내에 상기 도입대상물질이 도입된 최종물이 배출되는 배출구; 상기 유입구와 일측 단부가 연결되고 상기 배출구에 타측 단부가 연결되며, 내부가 비어있고 나사비틀림구조를 갖는 유로관; 상기 유로관의 나사비틀림방향을 따라 상기 유로관의 표면에 구비된 양극과 음극; 및 상기 양극과 상기 음극에 각각 연결된 전원을 포함하는 것인 전기천공장치를 제공한다.
본 명세서에 있어서, 상기 유입구는 세포 및 도입대상물질을 포함하는 시료가 유로관으로 유입되는 통로 또는 구멍을 의미한다. 상기 시료가 유로관으로 유입되는 것에 문제가 없다면, 상기 유입구의 형태 및 재질은 특별히 한정하지 않는다. 상기 유입구의 형태 및 재질은 당 기술분야에서 일반적으로 사용되는 것을 채용할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 상기 유입구는 1 이상일 수 있다.
상기 시료가 세포 및 도입대상물을 포함하는 혼합물인 경우, 상기 유입구는 하나일 수 있다.
상기 시료가 세포를 포함하는 제1 시료와, 도입대상물을 포함하는 제2 시료를 따로 준비하여, 상기 유입구는 상기 제1 시료가 유입되는 제1 유입구와 상기 제2 시료가 유입되는 제2 유입구를 포함하고, 상기 유입구에서 상기 제1 및 제2 시료가 섞여 혼합 시료를 이루고, 세포 및 도입대상물질을 포함하는 혼합 시료가 유로관으로 유입될 수 있다.
본 명세서에 있어서, 상기 배출구는 상기 세포 내에 상기 도입대상물질이 도입된 최종물이 배출되는 통로 또는 구멍을 의미한다.
트랜스펙션 효율을 높이기 위해서는 전기장이 강해져야 하지만, 전기장이 강해질수록 전기장으로 인해 발생하는 줄열(Joule heating)이 높아져 세포의 생존률이 낮아진다. 세포의 생존률을 확보하기 위해, 일정수준의 전기장을 사용하게 되며, 세포가 전기장에 노출되는 면적이 적어 트랜스펙션 효율을 높이기 어렵다.
그러나, 본 명세서의 전기천공장치를 사용하는 경우, 나사비틀림구조에서 발생된 딘흐름(dean flow)을 통해 세포가 회전하여 보다 넓은 면적이 전기장에 노출되어 더 많은 구멍이 발생하므로 도입물질이 세포에 도입되는 효율을 높일 수 있다.
상기 시료는 세포 및 도입대상물을 포함하는 혼합시료이거나, 세포를 포함하는 제1 시료와 도입대상물을 포함하는 제2 시료를 포함하는 개별시료일 수 있다.
상기 시료의 온도는 대체로 상온(20℃ 이상 25℃ 이하)으로 유지되어 유로관 내로 유입시킬 수 있다. 그러나, 전기장을 여러 번 가해야 하는 등 생존성에 문제가 발생할 수 있는 경우 온도를 4℃ 내외로 낮추어 진행할 수 있다.
상기 세포는 전기천공법으로 트랜스펙션될 수 있는 세포라면 특별히 한정하지 않으며, 동물세포, 식물세포, 미생물 등 제약없이 선택될 수 있다.
상기 도입대상물은 목적에 따라 대상 세포에 도입되어야 할 물질이라면 특별히 한정하지 않으며, 약, 화학물질, DNA 등일 수 있다.
상기 시료에 유동성을 부여하기 위해, 상기 시료는 완충용액(buffer solution)을 더 포함한다. 이때, 완충 용액이란 일반적으로 산이나 염기를 가해도 공통 이온 효과에 의해 그 용액의 수소 이온 농도(pH)가 크게 변하지 않는 용액을 말한다.
상기 완충용액(buffer solution)의 종류는 특별히 한정하지 않으며, 당 기술분야에서 일반적으로 사용되는 것을 채용할 수 있다. 구체적으로, 상기 완충용액(buffer solution)은 인산완충생리식염수(Phosphate Buffered saline), 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진 에탄 술폰산 완충액(HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer) 및 hypoosmolar buffer로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 특별히 세포가 환경에 민감한 경우, 상기 완충용액으로 hypoosmolar buffer를 사용하는 것이 좋다.
본 명세서에 있어서, 상기 유로관은 유입구와 일측 단부가 연결되고 상기 배출구에 타측 단부가 연결된다. 또한, 상기 유로관은 내부가 비어있어, 내부에 유입구로부터 유입된 시료가 흐를 수 있다.
상기 유로관의 재질은 특별히 한정하지 않는다. 상기 유로관의 재질은 당 기술분야에서 일반적으로 사용되는 것을 채용할 수 있다. 예를 들면, 상기 유로관의 재질은 유리, 폴리메틸 메타크릴레이트 등과 같은 아크릴 수지 또는 폴리에틸렌 등과 같은 폴리올레핀 수지일 수 있다.
상기 유로관 내, 시료의 평균 유속은 유동의 쏠림이 일어나지 않는다면, 크게 한정하지 않는다. 상기 유로관 내, 시료의 평균 유속은 0.3 m/s 이하일 수 있으며, 이에 한정되지 않고 시료, 다른 공정조건 등에 따라 조절될 수 있다.
상기 유로관 내, 평균온도는 세포 및 조건에 따라 조절될 수 있다. 동물세포를 사용하는 경우, 상기 유로관 내, 평균온도는 대부분 상온으로 유지된다. 그러나, 펄스를 여러 번 가해야 하는 등 세포의 생존에 위험도가 높다고 판단되면 약 4℃까지 온도를 낮추어 진행할 수 있으며, 이때의 전압은 상온에 비해 약 2배 정도 높여서 진행한다.
본 명세서에 있어서, 상기 유로관은 내부가 비어있고 나사비틀림구조를 가질 수 있다. 상기 유로관의 나사비틀림구조로 인해 유로관 내부로 흐르는 유체에 딘흐름(dean flow)이 발생하여 세포가 회전하여 보다 넓은 면적이 전기장에 노출되어 더 많은 구멍이 발생하므로 도입물질이 세포에 도입되는 효율을 높일 수 있다.
본 명세서에서, 나사비틀림구조는 단면이 사각형인 띠를 나사와 같이 비틀거나 꼬아 생길 수 있는 구조로, 비틀림에 따라 중심축에 대해 나사비틀림방향이 이루는 예각이 바뀐다. 이때, 도 1에는 유로관의 중심축(310)에 대해 나사비틀림방향(400)이 이루는 예각(450)이 도시되어 있다.
본 명세서에 있어서, 상기 유로관의 중심축에 수직인 단면은 직사각형이다. 이 경우, 상기 유로관이 삽입되어 전극을 구비하는 몸체없이, 유로관의 표면에 전극을 구비하기 용이하다.
본 명세서에 있어서, 상기 유로관의 중심축에 수직인 단면인 직사각형의 높이는 0.5 mm 이상 10 mm 이하일 수 있으며, 구체적으로 0.6 mm 이상 5 mm 이하일 수 있고, 더 구체적으로 0.7 mm 이상 4 mm 이하일 수 있다.
여기서, 직사각형의 높이는 직사각형의 마주보는 두 쌍의 변 중 길이가 더 짧은 한 쌍의 변 사이의 거리를 의미하며, 양극과 음극이 직사각형의 마주보는 두 쌍의 변 중 길이가 더 짧은 한 쌍의 변에 구비되는 경우, 직사각형의 높이는 양극과 음극의 거리에 해당할 수 있다.
상기 직사각형의 폭은 0.2 mm 이상 5 mm 이하일 수 있으며, 구체적으로 0.3 mm 이상 4 mm 이하일 수 있고, 더 구체적으로 0.35 mm 이상 2 mm 이하인 것일 수 있다.
여기서, 직사각형의 폭은 직사각형의 마주보는 두 쌍의 변 중 길이가 더 긴 한 쌍의 변 사이의 거리를 의미하며, 양극과 음극이 직사각형의 마주보는 두 쌍의 변 중 길이가 더 긴 한 쌍의 변에 구비되는 경우, 직사각형의 폭은 양극과 음극의 거리에 해당할 수 있다.
상기 유로관의 중심축에 상기 나사비틀림방향이 이루는 예각은 10 ˚ 이상, 20 ˚ 이상, 30 ˚ 이상, 또는 40˚ 이상일 수 있고, 80 ˚이하, 70 ˚이하, 60 ˚이하, 또는 50 ˚이하일 수 있다.
이론적으로는 상기 유로관의 중심축에 상기 나사비틀림방향이 이루는 예각이 커질수록 시료가 더 긴 경로를 지나게 되므로 효과가 커질 수 있다. 실제로는, 유로관의 설계의 용이성을 고려하여 적절한 각을 선택할 수 있다.
도 1은 본 명세서의 일 실시상태에 따른 유로관의 제1 구조로, 도 1과 같이 유로관의 나사비틀림방향을 따라, 도 8와 같이 유로관의 내부면에 양극(350)과 음극(360)을 구비하여, 각각 50V와 0V의 전압을 인가하는 경우, 도 3과 같은 전위분포, 및 도 4와 같은 수직단면의 전기장분포를 나타낸다. 이때, 도 8을 기준으로 유로관의 폭은 0.5 mm이고, 유로관의 높이는 1 mm이다.
본 명세서에 있어서, 상기 양극과 음극은 각각 이격되어 상기 유로관의 나사비틀림방향을 따라, 상기 유로관의 표면에 구비되며, 구체적으로 상기 유로관의 외주면 또는 내부면에 구비될 수 있다.
도 5 내지 도 8을 바탕으로 설명하면, 상기 양극(350)과 음극(360)이 상기 내부면에 구비되는 경우, 도 5 또는 도 8과 같이 양극과 음극이 구비되고, 상기 유로관의 외주면에 구비되는 경우, 도 6 또는 도 7과 같이 양극과 음극이 구비될 수 있다.
본 명세서에 있어서, 상기 양극과 음극이 상기 유로관의 나사비틀림방향을 따라, 상기 유로관의 내부면에 구비되어, 상기 양극과 음극이 시료의 버퍼용액과 접촉하는 경우 유전율이 일정하여 균일한 전기장이 형성된다.
상기 양극과 음극이 상기 유로관의 나사비틀림방향을 따라, 상기 유로관의 내부면에 구비되는 경우, 도 4에 도시한 바와 같이, 균일한 전기장이 형성된다.
본 명세서에 있어서, 상기 양극과 음극이 상기 유로관의 나사비틀림방향을 따라, 상기 유로관의 외부면에 구비되는 경우, 양측 전극 사이에 버퍼용액 외에 유전율이 다른 유로관이 추가되므로, 전기장이 균일하게 분포할 수 있도록 유로관의 폭과 높이의 비율을 조절할 필요가 있다.
이에 따라, 상기 양극과 음극이 상기 유로관의 나사비틀림방향을 따라, 상기 유로관의 외부면에 구비되는 경우, 유로관의 폭과 높이의 비율은, 폭이 1일 때, 높이가 1 이상 2 이하로 조절하는 것이 바람직하다.
상기 유로관의 단면이 직사각형인 경우, 상기 직사각형의 마주보는 두 쌍의 변 중 어느 한 쌍의 변에 각각 상기 양극과 상기 음극이 구비된다. 구체적으로, 상기 직사각형의 마주보는 두 쌍의 변 중 길이가 더 긴 한 쌍의 변에 각각 상기 양극과 상기 음극이 구비되거나, 상기 직사각형의 마주보는 두 쌍의 변 중 길이가 더 짧은 한 쌍의 변에 각각 상기 양극과 상기 음극이 구비될 수 있다.
상기 유로관의 단면이 직사각형인 경우, 상기 직사각형의 마주보는 두 쌍의 변 중 길이가 더 긴 한 쌍의 변에 각각 상기 양극과 상기 음극이 구비되는 경우, 양측 전극의 거리가 짧아 보다 낮은 전위차를 전극에 인가해도 의도한 전기장을 생성할 수 있다.
상기 양극 및 음극 각각의 재질은 특별히 한정하지 않는다. 상기 양극 및 음극 각각의 재질은 당 기술분야에서 일반적으로 사용되는 것을 채용할 수 있다. 예를 들면, 상기 양극의 재질은 백금, 금, 은, 구리 또는 알루미늄일 수 있고, 상기 음극의 재질은 백금, 금, 은, 구리 또는 알루미늄일 수 있다. 바람직하게는, 상기 양극의 재질이 백금이고, 상기 음극의 재질이 백금일 수 있다. 이 경우, 쉽게 산화되지 않는 장점이 있다.
본 명세서에 있어서, 상기 전원은 양극과 음극에 각각 연결된다. 상기 전원은 양극과 음극으로 각각 직류고전압의 펄스를 공급하는 것이다.
상기 양극과 음극의 전위차는 12.5V 이상 150V 이하일 수 있으며, 구체적으로, 20V 이상 100V 이하, 더 구체적으로 40V 이상 60V 이하일 수 있다. 전원에 의해서 양극과 음극에 인가되는 전위차를 조절하여 전기장의 세기를 조절할 수 있다.
상기 양극과 음극에 의해서, 유로관 내 가해지는 펄스의 반복횟수는 세포에 따라 선택될 수 있으며, 1회 이상 6회 이하일 수 있고, 구체적으로 2회 이상 6회 이하일 수 있으며, 바람직하게는 4회일 수 있다.
세포에 가해지는 펄스의 종류는 세포에 따라 선택될 수 있으며, 동물세포에는 사각파(square wave pulse)를, 박테리아나 효모 등에는 Exponential decay wave pulse를 사용할 수 있다.
전체 유로관에서, 세포가 유입되어 배출되기까지의 총 공정시간은 1 초 이상 10 초 이하일 수 있고, 구체적으로 2 초 이상 8 초 이하, 더 구체적으로 2 초 이상 5 초 이하일 수 있다.
본 명세서에 있어서, 하나의 펄스의 지속시간은 수백 마이크로초 이상 수 밀리초 이하일 수 있고, 구체적으로 100 마이크로초 이상 1 밀리초 이하일 수 있다. 이때, 펄스를 4회 반복하는 경우, 펄스의 길이는 400 마이크로초 이상 4 밀리초 이하일 수 있다.
본 명세서의 전기천공장치는 나사비틀림구조에서 발생된 딘흐름(dean flow)을 통해 세포가 회전하여 보다 넓은 면적이 전기장에 노출되어 더 많은 구멍이 발생하므로 도입물질이 세포에 도입되는 효율을 높일 수 있기 때문에, 종래 대비 상대적으로 약한 전기장으로도 동일한 효율을 낼 수 있다. 구체적으로, 상기 유로관 내 평균 전기장은 25 KV/m 이상, 50 KV/m 이상, 또는 80 KV/m 이상일 수 있으며, 2400 KV/m 이하, 1200 KV/m 이하, 500 KV/m 이하, 300 KV/m 이하, 또는 120 KV/m 이하일 수 있다.
상기 유로관 내 개별 전기장은 80 KV/m 이상, 90 KV/m 이상, 100 KV/m 이상, 110 KV/m 이상, 또는 120 KV/m 이상일 수 있다. 이는 전기천공법으로 트랜스펙션할 수 있는 최소 요구 전기장이다.
여기서, 전기장의 평균은 유로부 전체 부피에 대한 전기장 평균값으로 계산될 수 있다.
300: 유로관
310: 유로관의 중심축
320: 유로관의 중심축에 대한 수직단면
330: 유로관의 수직단면의 밑변
340: 유로관의 수직단면의 윗변
350: 양극 360: 음극
370: 유로관의 높이 380: 유로관의 폭
400: 유로관의 나사비틀림방향
450: 유로관의 중심축에 상기 나사비틀림방향이 이루는 예각
320: 유로관의 중심축에 대한 수직단면
330: 유로관의 수직단면의 밑변
340: 유로관의 수직단면의 윗변
350: 양극 360: 음극
370: 유로관의 높이 380: 유로관의 폭
400: 유로관의 나사비틀림방향
450: 유로관의 중심축에 상기 나사비틀림방향이 이루는 예각
Claims (9)
- 세포 및 도입대상물질을 포함하는 시료가 유입되는 유입구;
상기 세포 내에 상기 도입대상물질이 도입된 최종물이 배출되는 배출구;
상기 유입구와 일측 단부가 연결되고 상기 배출구에 타측 단부가 연결되며, 내부가 비어있고 나사비틀림구조를 갖는 유로관;
상기 유로관의 나사비틀림방향을 따라 상기 유로관의 표면에 구비된 양극과 음극; 및
상기 양극과 상기 음극에 각각 연결된 전원을 포함하는 것인 전기천공장치. - 청구항 1에 있어서, 상기 유로관의 단면은 직사각형인 것인 전기천공장치.
- 청구항 2에 있어서, 상기 직사각형의 마주보는 두 쌍의 변 중 어느 한 쌍의 변에 각각 상기 양극과 상기 음극이 구비되는 것인 전기천공장치.
- 청구항 2에 있어서, 상기 직사각형의 마주보는 두 쌍의 변 중 길이가 더 긴 한 쌍의 변에 각각 상기 양극과 상기 음극이 구비되는 것인 전기천공장치.
- 청구항 2에 있어서, 상기 직사각형의 마주보는 두 쌍의 변 중 길이가 더 짧은 한 쌍의 변에 각각 상기 양극과 상기 음극이 구비되는 것인 전기천공장치.
- 청구항 2에 있어서, 상기 직사각형의 높이는 0.5 mm 이상 10 mm 이하인 것인 전기천공장치.
- 청구항 2에 있어서, 상기 직사각형의 폭은 0.2 mm 이상 2 mm 이하인 것인 전기천공장치.
- 청구항 1에 있어서, 상기 유로관 내 평균 전기장은 25 KV/m 이상인 것인 전기천공장치.
- 청구항 1에 있어서, 상기 유로관의 중심축에 상기 나사비틀림방향이 이루는 예각은 10 ˚ 이상 80 ˚이하인 것인 전기천공장치.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020190093805A KR20210015248A (ko) | 2019-08-01 | 2019-08-01 | 전기천공장치 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020190093805A KR20210015248A (ko) | 2019-08-01 | 2019-08-01 | 전기천공장치 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20210015248A true KR20210015248A (ko) | 2021-02-10 |
Family
ID=74560978
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020190093805A KR20210015248A (ko) | 2019-08-01 | 2019-08-01 | 전기천공장치 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20210015248A (ko) |
-
2019
- 2019-08-01 KR KR1020190093805A patent/KR20210015248A/ko not_active Application Discontinuation
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