KR20080028633A - 살모넬라균 및 캠필러박터균의 검출을 위한올리고뉴클레오티드 프라이머, 이를 포함하는 조기진단키트 및 이를 이용한 검출방법 - Google Patents

살모넬라균 및 캠필러박터균의 검출을 위한올리고뉴클레오티드 프라이머, 이를 포함하는 조기진단키트 및 이를 이용한 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 살모넬라균 및 캠필러박터균의 검출을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머, 이를 포함하는 조기진단 키트 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 식중독 원인균인 살모넬라균 및 캠필러박터균의 특이적 유전자를 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머; 이러한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 식중독 원인균을 검출하는 방법; 및 식중독 원인균을 검출할 수 있는 식중독 원인균 검출키트에 관한 것이다.
본 발명의 식중독 원인균의 종 특이적 및 속 특이적 유전자를 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하므로써, 중합효소연쇄반응을 통하여 단시간내에 신속하고 정확하게 식중독 원인균을 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 민감도 분석을 통하여 단리된 콜로니에서 반응 튜브당 100 내지 101 까지의 검출 한계를 확보할 수 있었으며, 음식물 샘플에서의 민감도에서는 101 내지 102의 검출 한계를 확보할 수 있는 바, 보다 우수한 민감도로 신속하게 식중독 원인균을 검출할 수 있다.

Description

살모넬라균 및 캠필러박터균의 검출을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머, 이를 포함하는 조기진단 키트 및 이를 이용한 검출방법{OLIGONUCLEOTIDE PRIMER FOR DETECTION OF SALMONELLA AND CAMPYLOBACTER, DIAGNOSTIC KITS FOR RAPID DETECTION COMPRISING THEM, AND METHOD FOR DETECTING FOODBORN INTOXICATIVE MICROBIAL USING THEM}
도 1은 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머의 증폭 효율을 나타낸 것이다.
도 2는 각 박테리아 종 혼합물에서 Slm1의 프라이머 특이성을 나타낸 것이다.
도 3은 각 박테리아 종 혼합물에서 Slm3의 프라이머 특이성을 나타낸 것이다.
도 4는 각 박테리아 종 혼합물에서 Slt1의 프라이머 특이성을 나타낸 것이다.
도 5는 각 박테리아 종 혼합물에 Slt4의 프라이머 특이성을 나타낸 것이다.
도 6은 각 박테리아 종 혼합물에서 CB1의 프라이머 특이성을 나타낸 것이다.
도 7은 각 박테리아 종 혼합물에서 CB4의 프라이머 특이성을 나타낸 것이다.
도 8은 각 박테리아 종 혼합물에서 CJ1의 프라이머 특이성을 나타낸 것이다.
도 9는 각 박테리아 종 혼합물에서 CJ2의 프라이머 특이성을 나타낸 것이다.
도 10은 PCR 증폭의 민감도를 나타낸 것이다(A: Slm1; B: Slt4; C: CB3; D: CJ1).
도 11a는 살모넬라(Salmonella) 및 S. 티피무리움(S. typhimurium)의 전기영동을 나타낸 사진이다.
도 11b는 캠필로박터(Campylobacter) 및 C. 제주니(C. jejuni)의 전기영동을 나타낸 사진이다.
본 발명은 식중독 원인균인 살모넬라균 및 캠필러박터균의 검출을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머, 이를 포함하는 조기진단 키트 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것이다.
살모넬라종(Salmonella spp.)은 엔테로박터(Enterobacter)과의 간균이며 보통 주모성 편모에 의한 운동성을 가지고 있다. 살모넬라속에 속하는 다수의 살모넬라들은 식중독에서부터 장열, 패혈증, 위장염 등을 일으키는 병원성 균이다. 이중 가장 심각한 살모넬라속으로는 S. 티피무리움(S.typhimurium)과 S. 엔테리티디 스(S. enteritidis)로서, 이들 균주는 숙주 특이성이 없이 사람과 동물 모두에서 식중독이나 만성장염을 일으키는 것으로 알려져 있고, 국내에서 발병빈도가 가장 높다.
살모넬라 균체의 편모(Flagella: H-antigen)는 숙주 세포에 부착성이 있는 병원성 인자로 장관, 장내 상피세포에 침투하여 각종 질병을 유발시킨다.
살모넬라균에 대한 예방과 치료법이 백신과 항감염성 면역에 걸쳐 많은 연구가 진행되어 왔으나 살모넬라균은 현재까지 약 2,000여종 이상 발견되어 백신으로 예방하는 것에는 한계가 있으며, 항생제의 사용은 살모넬라균의 내성을 증가시켜 투약을 중지했을 때 재감염에 대한 감수성을 증가시킨다.
한편, 캠필러박터(Campylobacter) 감염증은 캠필러박터 페터스(Campylobacter fetus) 및 C. 베네레알리스(C. venerealis)의 감염에 의해 소와 양의 불임, 유산 등의 번식장애를 일으키는 질병으로 오래 전부터 중요시되어 왔다. 특히 C. 제주니(C. jejuni)는 사람과 동물에 있어서 세균성 설사증의 주요 원인체라는 것이 밝혀졌고 또한 동물이 사람에 감염원이 된다는 사실이 알려지면서 새로운 인수공통전염병으로서 중요한 위치를 차지하게 되었다.
캠필러박터균은 그램 음성의 만곡된 간균이며 미호기성이고, 양단 또는 일단에 극편모를 가지며, 활발한 선회운동성을 갖는다. C. 페터스 성상에 따라 C. 페터스 아종 페터스(C. fetus subsp. fetus)와 C. 페터스 아종 베네레알리스(C. fetus subsp. venerealis)의 두가지 아종으로 나눈다. 감염경로는 감염된 조직이나 오염된 물질을 섭취하므로써 구강으로도 전염된다.
종래에 살모넬라와 캠필러박터의 진단으로는 현미경 진단과 배양검사가 있으나 민감도가 낮거나 3 내지 4일 이상의 시일이 소요되는 등의 단점이 있다.
최근에는 가검물에서 핵산이나 항원 등을 추출하여 진단에 응용하려는 시도가 많이 진행되어 있으며, 대표적인 것으로는 항원-항체 검출에 기초한 면역-검출법과 PCR에 의한 진단법이 있다.
항원-항체법은 편모에 존재하는 항원에 대한 항체를 제조하여 발색반응을 보는 것으로 별도의 키트를 구성하였을 경우 간단하고 빠르게 검출할 수 있는 장점이 있다. 반면 검출에 대한 민감도는 106 내지 1010 CFU/ml로 임상적 질병유발 균농도가 107 내지 108 CFU/ml인 것을 감안하면 민감도가 떨어지는 단점이 있다.
PCR 진단법은 PCR을 수행하여 확인할 수 있는 별도의 장치가 필요한 단점이 있으나, 항원-항체법과는 달리 핵산 내의 특정 뉴클레오티드 서열(nucleotide sequence)을 증폭하여 진단하는 방법으로 반응용액당 1개의 증폭가능한 뉴클레오티드 서열만 존재해도 진단이 가능하며 시료가 확보되어 있을 경우 2시간 이내에 결과를 확인할 수 있는 장점이 있다.
이러한 PCR 진단에 있어서 가장 중요한 부분은 특이적 유전자를 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 개발에 있으며, 현재 이에 대한 속 특이적(genus specific) 및 종 특이적(species specific) 프라이머에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는 실정이다.
본 발명의 목적은 PCR 진단법을 이용한 식중독 원인균을 검출하기 위한 것으로, 보다 구체적으로 식중독 원인균의 특이적 유전자를 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 중합효소연쇄반응으로 식중독 원인균을 검출할 수 있으며, 식중독 원인균의 진단시간을 종래의 3일 내지 4일에서 2시간 이내로 단축할 수 있는 신속하고 정확한 식중독 원인균을 검출하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 중합효소연쇄반응으로 단시간내에 신속하고 정확하게 식중독 원인균을 검출할 수 있는 식중독 원인균 검출키트를 제공하기 위한 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2에 나타난 유전자 증폭용 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍, 서열번호 3 및 4에 나타난 유전자 증폭용 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍, 서열번호 5 및 6에 나타난 유전자 증폭용 올리 고뉴클레오티드 프라이머쌍, 및 서열번호 7 및 8에 나타난 유전자 증폭용 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍으로 구성된 군으로부터 선택된 1 종 이상의 프라이머쌍을 포함하는 식중독 원인균의 검출을 위한 유전자 증폭용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용한 식중독 원인균의 검출방법에 있어서, 본 발명의 서열번호 1 및 2에 나타난 유전자 증폭용 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍, 서열번호 3 및 4에 나타난 유전자 증폭용 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍, 서열번호 5 및 6에 나타난 유전자 증폭용 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍, 및 서열번호 7 및 8에 나타난 유전자 증폭용 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍으로 구성된 군으로부터 선택된 1 종 이상의 프라이머쌍을 포함하는 식중독 원인균의 검출을 위한 유전자 증폭용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용한 중합효소연쇄반응으로 식중독 원인균을 검출하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 중합효소연쇄반응을 이용하여 식중독 원인균을 검출하도록 본 발명의 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 반응완충액, Taq DNA 중합효소를 포함하는 식중독 원인균의 검출키트를 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명은 식중독 원인균의 특이 유전자를 탐지할 수 있도록 특이 유전자의 증폭용 프라이머쌍을 포함한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에서 식중독 원인균은 통상적으로 인간에게 식중독을 일으키는 병원 성 미생물을 의미하는 것으로, 바람직하게는 살모넬라 속(Salmonella genus), 특히 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium); 및 캠필러박터 속(Campylobacter genus), 특히 캠필러박터 제주니(Campylobacter jejuni)를 포함한다.
본 발명에서는 상기 4종의 식중독 원인균의 특이 유전자를 단독 또는 동시에 탐지할 수 있도록 4쌍의 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 디자인하고 합성한다. 올리고뉴클레오티드 프라이머의 디자인은 살모넬라 균주의 경우 invA와 mdh 부분을 참조하였으며, 그외의 게놈 DNA 서열을 참조하였다. 캠필러박터 균주의 경우 ceuE와 mapA, 16S rRNA 및 게놈 DNA 서열을 참조하여 제작하였다.
본 발명의 첫번째 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트인 Slm1f/Slm1은 살모넬라 속(Salmonella genus)을 특이적으로 탐지할 수 있도록 설계하였고, 증폭 산물의 크기는 389 bp이다. 본 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머의 염기서열은 하기와 같다:
PCR 프라이머 Slm1f: 5'-GCT GCG CGC GAA CGG AGA AG-3' (서열번호 1)
PCR 프라이머 Slm1r: 5'-TCC CGG CAG AGT TCC CAT T-3' (서열번호 2)
본 발명의 두번째 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트인 Slt4f/Slt4r은 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)을 특이적으로 탐지할 수 있도록 설계하였고, 증폭 산물의 크기는 261 bp이다. 본 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머의 염기서열은 하기와 같다:
PCR 프라이머 Slt4f: 5'-TGC CAA CGG AAG TTG AAG TG-3' (서열번호 3)
PCR 프라이머 Slt4r: 5'-ACG ATT CCA CCA CGC CCT TC-3' (서열번호 4)
본 발명의 세번째 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트인 CJ1f/CJ1r은 캠필러박터 속(Campylobacter genus)을 특이적으로 탐지할 수 있도록 설계하였고, 증폭 산물의 크기는 406 bp이다. 본 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머의 염기서열은 하기와 같다:
PCR 프라이머 Slt4f: 5'-GGA GGA TGA CAC TTT TCG GAG C-3' (서열번호 5)
PCR 프라이머 Slt4r: 5'-ATT ACT GAG ATG ACT AGC ACC CC-3' (서열번호 6)
본 발명의 네번째 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트인 CB4f/CB4r은 캠필러박터 제주니(Campylobacter jejuni)를 특이적으로 탐지할 수 있도록 설계하였고, 증폭 산물의 크기는 987 bp이다. 본 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머의 염기서열은 하기와 같다:
PCR 프라이머 Slt4f: 5'-CCT GCT ACG GTG AAA GTT TTG C-3' (서열번호 7)
PCR 프라이머 Slt4r: 5'-GAT CTT TTT GTT TTG TGC TGC-3' (서열번호 8)
또한, 본 발명은 본 발명에서 기술되는 식중독 원인균의 특이 유전자를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용한 다중 중합효소연쇄반응으로 식중독 원인균을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 4쌍의 프라이머 쌍으로 구성되는 군으로부터 선택된 1 종 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 프라미어 세트를 이용한 중합효소연쇄반응으로 하나 이 상의 식중독 원인균, 바람직하게는 살모넬라 속(Salmonella genus), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 캠필러박터 속(Campylobacter genus) 또는 캠필러박터 제주니(Campylobacter jejuni)를 특이적으로 검출할 수 있다. 바람직하게는 상기 프라미어 쌍 중에서 2 종 이상을 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 다중 중합효소연쇄반응으로 2종 이상의 식중독 원인균을 검출할 수 있으며, 최대 4종의 식중독 원인균을 동시에 검출할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에 따르면, 검출방법은 먼저 식중독 원인균에 오염이 되었으리라고 의심되는 식품을 채취, 배양하고, 배양된 미생물로부터 DNA를 열추출한 후, 이를 주형 DNA로 하여 상기 멀티플렉스 프라이머 혼합액을 이용한 다중 중합효소연쇄반응(M-PCR)을 수행한다. M-PCR 반응이 끝나면 증폭된 유전자 산물을 아가로즈 겔상으로 전기영동하여 특이 유전자 증폭 유무에 따라 식품에 어떠한 식중독균 원인균이 오염되었는지를 확인 판정한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 기술된 4쌍의 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머 중에서 선택된 1종 이상의 프라이머쌍을 함유하는 프라이머 세트를 포함하는 식중독 원인균 검출키트를 제공한다.
검출키트는 상기 4쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머(서열번호 1 내지 8)와 PCR을 이용한 미생물 검출키트의 통상적인 구성성분(반응완충액, Taq DNA 중합효소 등)을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서 검출키트는 하기와 같이 구성된다:
(1) 서열번호 1 내지 8의 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍 중에서 선택된 1 종 이상의 프라이머쌍을 함유하는 프라이머 세트,
(2) 반응 완충액(Reaction Buffer),
(3) Taq DNA 중합효소(Taq DNA polymerase).
본 발명에서 반응 완충액 및 Taq DNA 중합효소는 당해 분야에서 사용되는 모든 종류를 사용할 수 있으며, 본 발명에서는 이에 대해 특별히 제한하지 않는다.
본 발명의 구체적인 일예의 검출키트는 하기와 같다.
살모넬라 속 및 살모넬라 티피무리움 종 특이적 검출키트는 하기 표와 같다:
내용물 20개 시험
PCR 마스터믹스, 2X 300 ㎕
대조군 PCR 마커 150 ㎕
살모넬라 속 특이적 Slm1 프라이머 혼합물, 각각 10 pmol/㎕ 50 ㎕
살모넬라 티피무리움 특이적 Slt4 프라이머 혼합물, 각각 10 pmol/㎕ 50 ㎕
PCR 튜브 24 ea
용액 A 24 ml
용액 B 24 ml
제공되지 않지만 요망되는 물질
열적 순환기, 전기영동기기, UV 발광체, 교반 인큐베이터, 미세원심분리기, 배양 매질
키트의 저장 및 만기기간
냉동보관시 2년
이를 이용한 검출방법은 하기와 같다:
● DNA 추출, 주형 DNA 준비
1. 시료 세척액 또는 배양액을 1 내지 1.5 ml 정도 원심분리한다.
2. 상등액은 버리고 침전물에 용액 A 200 ㎕를 넣고 현탁시킨다.
3. 용액 B 200 ㎕를 넣고 10 초간 와류시킨다.
4. 클로로포름 400 ㎕를 넣고 10 초간 와류시킨다.
5. 3분간 원심분리 후 상층을 새 튜브를 옮긴다.
6. 400 ㎕ 이소프로판올을 넣고 10 초간 와류시킨다.
7. 3분간 원심분리한다.
8. 용액은 버리고 펠렛은 70% 500 ㎕ 에탄올을 넣고 튜브를 조심스럽게 두번 뒤집어준 후 펠렛이 떨어지지 않게 따라버린다.
9. 1 분간 원심분리 후 피펫으로 남은 용액을 제거하고 상온에서 펠렛을 5분간 말려준다.
10. 증류수 50 ㎕로 펠렛을 녹인다. 보관은 냉동보관한다.
● PCR
하기와 같은 PCR 튜브에 구성물을 넣어준다.
주형 DNA 5 ㎕; 프라이머 1 ㎕; 증류수 4 ㎕, PCR 마스터 믹스, 2X 10 ㎕.
PCR 사이클 조건은 하기와 같다:
94℃ 10분 1 사이클
94℃ 55℃ 72℃ 30초 30초 30초 35 내지 40 사이클
72℃ 8℃ 5분 반응종결 1 사이클
● 결과의 판독
전기영동시 밴드의 위치가 해당 부위에 나타나면 양성으로 판정한다(도 11a 참조).
또한, 캠필로박터 속 및 캠필로박터 제주니 종 특이적 검출키트는 키트 구성성분 중 캠필로박터 종 특이적 Slm 1 프라이머 혼합물 (각 10 pmol/㎕; 50 ㎕) 및 C. 제주니 특이적 Slt 4 프라이머 혼합물 (각 10 pmol/㎕; 50 ㎕)을 사용하는 것을 제외하고 상기 기술된 것과 동일하다 (도 11b 참조).
본 발명의 검출키트의 장점은 한 단계(One step) PCR 마스터 혼합물을 통한 조작오차를 최소화시킬 수 있으며, 2 시간(전배양과정 포함시 10 시간)의 짧은 진단소요시간에 검출가능하며, 100 CFU/ml(전배양과정 포함시 1 CFU/100 ml)의 우수한 민감도를 나타내며, 99% 이상의 특이성을 나타내며, 광범위한 샘플에 적용가능하다는 것이다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 박테리아 균주
살모넬라와 캠필러박터 균주는 CCARM(항생제 내성균주은행)으로부터 분양받았으며, 그 외의 균주는 생명공학연구원에서 제공받았다(표 1 참조). 각각의 균주는 아가 플레이트(agar plate)상에 배양되어 있는 형태로, 12.5%의 글리세롤이 함유된 LB 배지에 콜로니를 현탁한 후 각각의 현탁액을 냉동 보관하였으며, 이 보관 액을 기준으로 활성 세균수인 CFU/ml(Colony Forming Unit)을 측정하였다.
Figure 112006070388006-PAT00001
* CCARM, 항균 내성 미생물의 배양 수집
실시예 2: 음식 샘플로부터 박테리아 농축 및 DNA 제조
음식 샘플로부터 하기 과정을 수행하여 박테리아 샘플을 수집하였다.
각각 100 CFU의 살모넬라와 캠필러박터 현탁액을 10 g의 쇠고기와 돼지고기 샘플에 혼합하고, 이것을 잘게 썰고 이후 50 ml 증류수에 넣어 세척하였다. 쇠고기와 돼지고기를 제거한 후 수거된 50ml의 세척한 용액을 이후의 실험을 위한 샘플로서 준비하였다.
수거된 샘플 중 25 ml를 원심분리한 후 상등액은 버리고, 펠렛(pellet)을 STE(100mM 염화나트륨, 50mM 트리스-HCl(pH7.0), 1mM EDTA(pH8.0))에 현탁하고, 다시 원심분리한 후 이것을 2 ml 증류수에 녹여 이후의 직접 PCR 분석(direct PCR analysis)에 이용하였다.
수거된 샘플 중 나머지 25 ml에 대해, 살모넬라 혼합군 25 ml를 BPW(완충된 펩톤수(Buffered Peptone Water), 펩톤 1%, NaCl 0.5%, 인산이나트륨 0.35%, 인산일칼륨 0.15%, pH 7.2) 225 ml에 첨가하고 36℃에서 4시간 동안 진탕배양하였다.
또한, 캠필러박터 혼합군 25 ml를 캠필러박터 농축 매질(Nutrient Broth No 2, 옥소이드(Oxoid), 5% 탈피브린화된 양혈액, 옥소이드, 및 캠필러박터-선택적-보충물, Merck)에 약 8시간 동안 42℃에서 무산소 상태로 배양하였다.
살모넬라 및 캠필러박터 배양액은 각각 1/2씩 분리하여 원심분리 후 한 부분은 1 ml의 증류수에 녹여 직접 PCR 분석을 실시하였고, 나머지 1/2 부분은 1 ml 용액 A(2% CTAB, 2% PVP4000, 1.4M NaCl, 20mM EDTA(pH8.0), 100mM 트리스-HCl(pH8.0), 2% 2-메르캅토에탄올)에 현탁한 후 1ml 용액 B(6M 구아니딘 HCl)용액을 첨가하여 보텍스(vortex)를 1분간 수행하고, 2 ml의 클로로포름용액을 넣고 다시 30초간 보텍스를 수행하여 상층액을 수거하고, 2 ml의 이소프로판올을 넣고 30 초간 보텍스를 수행하고, 12,000 rpm에서 5분간 원심분리한 후 펠렛을 70% 에탄올로 세척하였다. 펠렛을 상온에서 10분간 건조한 후 1 ml의 TE(pH8.0)용액으로 녹여 이후의 실험에 이용하였다.
실시예 3: 올리고뉴클레오티드 프라이머의 제작
각각의 PCR(Polymerase Chain Reaction) 과정에 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 ㈜제노텍에서 합성의뢰하여 준비하였으며, 합성된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 각각 100pmol/ul의 농도로 증류수를 이용하여 녹인 후 냉동보관하였다. 합성된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 내역은 하기 표 2와 같다.
올리고뉴클레오티드 프라이머의 디자인은 살모넬라 균주의 경우 invA와 mdh 부분을 참조하였으며, 그외의 게놈 DNA 서열을 참조하였다. 캠필러박터 균주의 경우 ceuE와 mapA, 16S rRNA 및 게놈 DNA 서열을 참조하여 제작하였다.
프라이머 서열(5' 에서 3') 증폭크기(bp) 서열번호
살모넬라
Slm1f GCT GCG CGC GAA CGG AGA AG 389 1
Slm1r TCC CGG CAG AGT TCC CAT T 2
Slm2f CTC ACC AGG AGA TTA CAA CAT GG 284 9
Slm2r AGC TCA GAC CAA AAG TGA CCA TC 10
Slm3f CGC TCT TTC GTC TGG CAT TAT C 408 11
Slm3r CCG CA AAT AAA GTT CAC AAA G 12
S. 티피무리움
Slt1f GTC AGC AGT GTA TGG AGC GA 143 3
Slt1r AGT AGC GCC AGG ACT CGT TA 4
Slt2f ACA GTG CTC GTT TAC GAC CTG AAT 224 13
Slt2r AGA CGA CTG GTA CTG ATC GAT AAT 14
Slt3f GGT CCA GCT CTG TCG CC 444 15
Slt3r CCG GGC AGA TGA TAC CC 16
Slt4f TGC CAA CGG AAG TTG AAG TG 261 17
Slt4r ACG ATT CCA CCA CGC CCT TC 18
캠필러박터
CB1f GGA TGA CAC TTT TCG GAG C 816 19
CB1r CAT TGT AGC ACG TGT GTC 20
CB2f CTG CTT AAC ACA AGT TGA GTA GG 287 21
CB2r TTC TGA GGG TAC CTA AGG AA 22
CB3f CGC ACG GGT GAG TAA GGT A 180 23
CB3r GCG TCA TAG CCT TGG TAA GC 24
CB4f GGA GGA TGA CAC TTT TCG GAG C 406 5
CB4r ATT ACT GAG ATG ACT AGC ACC CC 6
C. 제주니
CJ1f CCT GCT ACG GTG AAA GTT TTG C 987 7
CJ1r GAT CTT TTT GTT TTG TGC TGC 8
CJ2f CTA TTT TAT TTT TGA GTG CTT GTG 589 25
CJ2r GCT TTA TTT GCC ATT TGT TTT ATT A 26
CJ3f ATC TAA TGG CTT AAC CAT TAA AC 857 27
CJ3r GGA CGG TAA CTA GTT TAG TAT T 28
CJ4f TGG TGG TTT TGA AGC AAA GA 413 29
CJ4r GCT TGG TGC GGA TTG TAA A 30
CJ5f ACA ACT TGG TGA CGA TGT TGT A 331 31
CJ5r TAG GCA TTA TTT TTA CCC CTA ATA GAC AG 32
CJ6f CAT CTT CCC TAG TCA AGC CT 774 33
CJ6r AAG ATA TGG CAC TAG CAA GAC 34
실시예 4: 중합효소 연쇄반응
PCR은 바이오메트라(Biometra)사의 T1 Thermal Cycler를 이용하여 수행하였다.
20 ㎕ 반응을 기준으로 0.4 μM의 올리고뉴클레오티드 프라이머와 200 μM의 dNTP 혼합물(Larova사), 1×PCR 완충액(20mM 트리스-HCl(pH8.4), 50 mM KCl), 1.5mM 염화마그네슘, 0.5U Taq DNA 중합효소, 5 ㎕의 샘플 DNA 또는 2 ㎕의 박테리아 현탁액을 주형으로 첨가하였다.
PCR 반응은 다음과 같이 수행하였다.
94℃에서 5분간 사전인큐베이션 과정을 거친 후, 40 주기로 94℃에서 30초, 50℃에서 30초, 72℃에서 30초간 반응시킨 후, 72℃에서 10분간 최종 연장시키고 반응을 종결하였다.
실시예 5: PCR 생성물의 전기영동 검출
10 ㎕의 PCR 생성물을 1.5%의 5 ㎍/ml농도의 에티듐 브로마이드가 포함된 아가로즈 젤(agarose gel)에 로딩한 후 머피드-2플러스 키트(Mupid-2plus kit)를 이용하여 전기영동을 수행하였다. 이것을 다시 UV 투조기에서 밴드 패턴을 분석하였다.
실시예 6: 종 특이적, 속 특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머의 선별
종 특이적 또는 속 특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머를 선별하기 위하여 PCR 과정을 통하여 각각의 박테리아 균주에 대한 증폭 효율을 측정하였다.
도 1은 각각의 올리고뉴클레오티드 프라이머에 대한 증폭 효율을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 살모넬라 속 특이적 프라이머인 Slm1, Slm2, Slm3 (레인 1 내지 3)의 경우, Slm1과 Slm 3에서 각각 389 bp, 408 bp 의 PCR 생성물 밴드가 진하게 형성되었다. 살모넬라 티피무리움 특이적 프라이머인 Slt1 내지 Slt4 (레인 4 내지 7)의 경우, 각각의 생성물 밴드가 진하게 형성되었으나, 크기의 구별을 위하여 Slt1과 Slt4를 이후의 실험을 위해 구별하였다.
캠필러박터 속 특이적 프라이머인 CB1 내지 CB4 (레인 8 내지 11)의 경우, CB1과 CB4에서 비교적 진한 생성물 밴드가 나타났다. 캠필러박터 제주니 특이적 프라이머인 CJ1 내지 CJ 6(레인 12 내지 17)의 경우, CJ1과 CJ2에서 생성물 밴드가 진하게 형성되었다. 반면에 CJ 5와 CJ 6의 생성물 밴드는 육안으로 식별이 불가능한 정도로 희미하게 생성되었다.
따라서 살모넬라 속 특이적 프라이머로는 Slm1과 Slm 3, 살모넬라 티피무리움 특이적 프라이머로는 Slt1과 Slt4, 캠필러박터 속 특이적 프라이머로는 CB1과 CB4, 캠필러박터 제주니 특이적 프라이머로는 CJ1과 CJ2 이렇게 총 8개의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 선별하여 이후의 특이성 분석에 이용하였다.
선별된 8개 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 각 박테리아 균주에 대한 특이성을 판별하였다. 균주는 DNA를 정제하지 않고 박테리아 현탁액을 직접 사용하였으며, 1 ㎕ 당 100 CFU 이상 포함될 수 있도록 하여 반응을 진행시켰다.
도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 살모넬라 속 특이적 프라이머인 Slm1에 대한 분석의 결과, 살모넬라 종에서는 생성물 밴드가 형성되었으나 음성 대조군인 대장균(Eshcherichia coli)과 캠필러박터 종에서는 형성되지 않았으므로 신뢰할 만한 수준의 특이성가 있음을 알 수 있었다. 반면에, 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, Slm3의 경우는 대장균에서 비록 크기는 작지만 생성물 밴드가 형성되었으며 캠필러박터 종에서는 형성이 되지 않았지만, 살모넬라 티피무리움에서 육안으로만 식별될 정도의 밴드를 형성하여 살모넬라 속 특이적 프라이머로 적합하지 않음을 알 수 있었다.
도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 살모넬라 티피무리움 특이적 프라이머 시험에서 Slt1은 S. 티피무리움 CCARM8153, S. 티피무리움 CCARM8107, S. 티피무리움 CCARM8100에서 비교적 뚜렷한 양상의 생성물 밴드가 나타났으나, 다른 살모넬라 종 레인에서도 생성물 밴드를 형성하여 특이성가 없음을 알 수 있다.
또한, 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, Slt4의 경우 S. 티피무리움 CCARM8153, S. 티피무리움 CCARM8107, S. 티피무리움 CCARM8100에서만 밴드 패턴이 나타나고 있으며, 다른 레인에서는 생성물 밴드가 생성되지 않아서 살모넬라 티피무리움 특이적 프라이머로 적합한 것으로 나타났다.
캠필러박터의 경우 속 특이적 프라이머인 CB1과 CB4에 대하여 분석하였다(도 6 및 7 참조). CB1은 살모넬라 종에서 생성물 밴드가 희미하게 생성되었으나(Figure 6), CB4는 캠필러박터 콜라이와 캠필러박터 제주니에서만 생성물 밴드가 형성되어 캠필러박터 속 특이적 프라이머로서 적합한것으로 판별되었다.
도 8 및 9에서 알 수 이쓴 바와 같이, 캠필러박터 제주니 특이적 프라이머인 CJ1과 CJ2의 경우 C. 제주니 CCARM13157, C. 제주니 CCARM13155, C. 제주니 CCARM13150, C. 제주니 CCARM13153, C. 제주니 CCARM13141, C. 제주니 CCARM13118에서 생성물 밴드가 생성되었으며, CJ2의 경우 캠필러박터 콜라이에서도 생성물 밴드가 형성되었으므로, 캠필러박터 제주니 특이적 프라이머로 CJ1이 적합함을 알 수 있었다.
따라서 살모넬라 속 특이적 프라이머로는 Slm1, 살모넬라 티피무리움 특이적 프라이머로는 Slt4, 캠필러박터 속 특이적 프라이머로는 CB4, 캠필러박터 제주니 특이적 프라이머로는 CJ1을 선별하여 이후의 실험을 진행하였다.
실시예 7: PCR 프라이머의 민감도
살모넬라 티피무리움 CCARM 8100과 캠필러박터 제주니 CCARM3155를 각각 2 ㎕당 100, 101, 102, 103이 되도록 희석하여 선별된 올리고뉴클레오티드 프라이머에 대한 민감도 분석을 수행하였다. PCR조건은 상기의 과정을 따랐으며, 20 ㎕ 반응 부피당 2 ㎕이 각각의 박테리아 현탁액을 첨가하여 반응을 진행시켰다.
PCR 프라이머의 민감도의 결과
상기 실시예에서 선별된 각각의 프라이머 세트, Slm1, Slt4, CB4, CJ1에 대한 민감도의 정도를 분석하였다(도 10 참조). Slm1(도 10A)과 Slt4(도 10B)의 경우, 100에서도 뚜렸한 증폭 양상을 보이고 있음을 볼 수 있다. 이는 튜브당 1 박테리아 세포만 존재해도 무난하게 검출할 수 있음을 나타낸다.
CB3(도 10C)와 CJ1(도 10D)는 101부터 검출이 가능한 것으로 나타났으며, 이는 최소한 10 세포 이상이 튜브 내에 존재해야 검출이 가능함을 나타낸다.
음식 샘플에서 PCR 프라이머의 민감도의 결과
쇠고기와 돼지고기에 접종한후 검출한 살모넬라 및 캠필러박터에 대한 PCR 분석의 결과, 하기 표 3에서 알 수 있는 바와 같이 양호한 검출성능이 나타낸다.
농축의 존재 및 부재하에 음식 샘플로 수행된 PCR의 결과
샘플 농축전 농축후
박테리아 현탁액 DNA 용액
Slm1 (서열번호 1 및 2) 쇠고기 ++++ +++ +++
돼지고기 ++ +++ +++
Slt4 (서열번호 3 및 4) 쇠고기 ++ +++ +++
돼지고기 +++ +++ +++
CB4 (서열번호 5 및 6) 쇠고기 + +++ +++
돼지고기 + ++ +++
CJ1 (서열번호 7 및 8) 쇠고기 + +++ +++
돼지고기 + ++ +++
음식물 샘플에서는 민감도가 101 내지 102으로 떨어지는 양상을 보였으며, 이는 샘플 중의 쇠고기나 돼지고기내에 존재하는 헤모글로빈이나 면역글로빈 등의 PCR 억제제의 영향에 의한 것으로 추정된다. 하지만 이전 억제 효과는 상기된 DNA 단리방법에 의해 상쇄되었으며, 4시간 정도의 농축 과정을 통하여 민감도를 더 많이 향상시킬 수 있었다.
또한 농축 과정 후의 PCR 분석에서는 간단한 세척 과정을 거친 샘플과 DNA 단리 과정을 거친 샘플 사이의 큰 차이는 발견할 수 없었으므로, 본래의 박테리아 세포 자체도 PCR 주형으로서 무난하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
결론적으로, 농축하지 않은 경우에도 비교적 검출이 양호하게 나타났으나, 농축한 후에 보다 뚜렷한 검출양상을 볼 수 있었다. 하지만 박테리아 현탁액과 정제된 DNA간의 차이는 그리 크게 나타나지 않았다.
생성물 밴드는 Slm1과 Slt4가 CB4, CJ1보다 진하게 생성되었으며, 샘플간에는 쇠고기에서 돼지고기보다 약간 더 많은 양의 생성물 밴드가 생성됨을 볼 수 있었다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 식중독 원인균의 종 특이적 및 속 특이적 유전자를 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하므로써, 중합효소연쇄반응을 통하여 단시간내에 신속하고 정확하게 식중독 원인균을 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 민감도 분석을 통하여 단리된 콜로니에서 반응 튜브당 100 내지 101 까지의 검출 한계를 확보할 수 있었으며, 음식물 샘플에서의 민감도에서는 101 내지 102의 검출 한계를 확보할 수 있는 바, 보다 우수한 민감도로 신속하게 식중독 원인균을 검출할 수 있다.
<110> <120> OLIGONUCLEOTIDE PRIMER FOR DETECTION OF SALMONELLA AND CAMPYLOBACTER, DIAGNOSTIC KITS FOR RAPID DETECTION COMPRISING THEM, AND METHOD FOR DETECTING FOODBORN INTOXICATIVE MICROBIAL USING THEM <130> 111 <160> 34 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer for PCR <400> 1 gctgcgcgcg aacggagaag 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer for PCR <400> 2 tcccggcaga gttcccatt 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer for PCR <400> 3 gtcagcagtg tatggagcga 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer for PCR <400> 4 agtagcgcca ggactcgtta 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer for PCR <400> 5 ggaggatgac acttttcgga gc 22 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer for PCR <400> 6 attactgaga tgactagcac ccc 23 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer for PCR <400> 7 cctgctacgg tgaaagtttt gc 22 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer for PCR <400> 8 gatctttttg ttttgtgctg c 21 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 9 ctcaccagga gattacaaca tgg 23 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 10 agctcagacc aaaagtgacc atc 23 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 11 cgctctttcg tctggcatta tc 22 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 12 ccgcaaataa agttcacaaa g 21 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 13 acagtgctcg tttacgacct gaat 24 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 14 agacgactgg tactgatcga taat 24 <210> 15 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 15 ggtccagctc tgtcgcc 17 <210> 16 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 16 ccgggcagat gataccc 17 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 17 tgccaacgga agttgaagtg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 18 acgattccac cacgcccttc 20 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 19 ggatgacact tttcggagc 19 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 20 cattgtagca cgtgtgtc 18 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 21 ctgcttaaca caagttgagt agg 23 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 22 ttctgagggt acctaaggaa 20 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 23 cgcacgggtg agtaaggta 19 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 24 gcgtcatagc cttggtaagc 20 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 25 ctattttatt tttgagtgct tgtg 24 <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 26 gctttatttg ccatttgttt tatta 25 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 27 atctaatggc ttaaccatta aac 23 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 28 ggacggtaac tagtttagta tt 22 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 29 tggtggtttt gaagcaaaga 20 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 30 gcttggtgcg gattgtaaa 19 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 31 acaacttggt gacgatgttg ta 22 <210> 32 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 32 taggcattat ttttacccct aatagacag 29 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 33 catcttccct agtcaagcct 20 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 34 aagatatggc actagcaaga c 21

Claims (9)

  1. 서열번호 1 및 2에 나타난 유전자 증폭용 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍, 서열번호 3 및 4에 나타난 유전자 증폭용 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍, 서열번호 5 및 6에 나타난 유전자 증폭용 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍, 및 서열번호 7 및 8에 나타난 유전자 증폭용 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍으로 구성된 군으로부터 선택된 1 종 이상의 프라이머쌍을 포함하는 식중독 원인균의 검출을 위한 유전자 증폭용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
  2. 제 1항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트가 살모넬라 속 특이적, 살모넬라 티피무리움에 대한 종 특이적, 캠필러박터 속 특이적, 또는 캠필러박터 제주니에 대한 종 특이적 유전자 증폭용 올리고뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 서열번호 1 및 2에 나타난 유전자 증폭용 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍을 포함하는 프라이머 세트가 살모넬라 속 특이적 올리고뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 서열번호 3 및 4에 나타난 유전자 증폭용 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍을 포함하는 프라이머 세트가 살모넬라 티피무리움에 대한 종 특이적 올리고뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
  5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 서열번호 5 및 6에 나타난 유전자 증폭용 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍을 포함하는 프라이머 세트가 캠필러박터 속 특이적 올리고뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
  6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 서열번호 7 및 8에 나타난 유전자 증폭용 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍을 포함하는 프라이머 세트가 캠필러박터 제주니에 대한 종 특이적 올리고뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
  7. 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용한 식중독 원인균의 검출방법에 있어서,
    제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트를 이용한 중합효소연쇄반응으로 식중독 원인균을 검출하는 것을 특징으로 하는 식중독 원인균의 검출방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 검출방법이 2종 이상의 상이한 식중독 원인균의 유전자 증폭용 프라이머쌍을 포함하는 프라이머 세트를 이용한 다중 중합효소연쇄반응(Multiplex-Plymerase chain reaction)으로 2종 이상의 식중독 원인균을 동시에 탐지하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  9. 중합효소연쇄반응을 이용하여 식중독 원인균을 검출하도록 PCR 프라이머, 반응완충액, Taq DNA 중합효소를 포함하는 식중독 원인균의 검출키트에 있어서,
    상기 PCR 프라이머가 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트인 식중독 원인균의 검출키트.
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